CN111194692A

CN111194692A - 一种新疆紫草组培快繁方法和新疆紫草组培快繁培养基

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Publication number: CN111194692A
Application number: CN201811388029.6A
Authority: CN
Inventors: 张利; 胡佳; 姜媛媛; 倪苏; 佘启惠; 王龙; 魏良益; 侯世勇
Original assignee: Sichuan Yiliyuan Technology Co ltd; Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Yiliyuan Technology Co ltd; Sichuan Agricultural University
Priority date: 2018-11-19
Filing date: 2018-11-19
Publication date: 2020-05-26
Anticipated expiration: 2038-11-19
Also published as: CN111194692B

Abstract

本发明提供了一种新疆紫草组培快繁培养基，它包括芽诱导培养基、扶壮培养基和生根培养基；所述芽诱导培养基是在改良LS培养基的基础上，每升还包含：萘乙酸0.08‑0.12mg、6‑糠氨基嘌呤1.8‑2.2mg、6‑苄氨基嘌呤0.4‑0.6mg、硝酸银0.07‑0.1mg、蔗糖29‑51g和琼脂5‑9g；所述扶壮培养基是在改良LS培养基的基础上，每升还包含：萘乙酸0.1‑0.3mg、6‑糠氨基嘌呤0.4‑0.6mg、硝酸银0.07‑0.1mg、蔗糖9‑31g和琼脂5‑9g；所述生根培养基是在改良1/2LS培养基的基础上，每升还包含：吲哚丁酸0.4‑0.6mg、萘乙酸0.4‑0.6mg、活性炭0.8‑1.2g、蔗糖9‑31g和琼脂5‑9g；所述改良LS培养基，是LS培养基硝酸铵用量减少825m/L的培养基。本发明能同时适应新疆紫草芽尖和下胚轴为外植体的快繁，在新疆紫草快繁领域具有较好的应用前景。

Description

一种新疆紫草组培快繁方法和新疆紫草组培快繁培养基

技术领域

本发明涉及一种新疆紫草快繁方法和新疆紫草组培快繁培养基，属于药用植物组织培养技术领域。

背景技术

新疆紫草〔Arnebia euchroma(Royle)Johnst〕又称软紫草，为紫草科(Boraginaceae Juss.)，软紫草属(Arnebia Forsk.)多年生草本植物，在我国分布于新疆的天山南北坡和西藏的西部。属于中国二级保护植物，为传统的中药材，以根入药，为中医临床常用清热解毒、凉血止血药物。现代药理研究表明新疆紫草具有抑菌抗炎、抗病毒、护肝、抗HIV、抗肿瘤、抗生育延缓衰老以及免疫调节等药理作用。同时还是世界上常用的天然植物红色素中性能最好的一种，已被联合国食品添加剂法典委员会列入食品、化妆品、药品添加剂范围。

但随着需求量的大幅提高以及市场价格的提高，近年来新疆紫草遭受疯狂采挖，生态环境被严重破坏。此外，新疆紫草存在对生境要求严格，结籽率低，种子发芽率低，苗期枯萎，幼苗移栽困难，且生长周期长，五年开花结果等问题。因此保护新疆紫草种质资源、提供稳定、可持续利用的药材资源刻不容缓。对新疆紫草进行人工快速繁殖是解决资源缺乏的重要途径之一。

新疆紫草组织培养再生体系的建立，主要有两种途径：间接器官发生途径和直接器官发生途径。间接器官发生途径通过选取外植体先诱导愈伤，再由愈伤分化成苗；其优点是材料利用率高，缺点是诱导率低、培养周期长、变异率高。直接器官发生途径则是选取外植体，使其直接诱导出芽和根，成为新苗；优点是诱导率高、培养周期短、变异率低，缺点是目前的材料利用率低——仅见茎尖作为外植体的报道。

发明内容

本发明为了提高新疆紫草快繁直接器官发生途径的材料利用率，提供了一套新疆紫草的快繁体系，其中包括新疆紫草组培快繁培养基及一种新疆紫草组培快繁方法。该体系可以普适性地利用新疆紫草无菌苗的下胚轴和芽尖作为外植体。

本发明提供了一种新疆紫草组培快繁培养基，它包括芽诱导培养基、扶壮培养基和生根培养基；

所述芽诱导培养基是在改良LS培养基的基础上，每升还包含：萘乙酸0.08-0.12mg、6-糠氨基嘌呤1.8-2.2mg、6-苄氨基嘌呤0.4-0.6mg、硝酸银0.07-0.1mg、蔗糖29-51g和琼脂5-9g；

所述扶壮培养基是在改良LS培养基的基础上，每升还包含：萘乙酸0.1-0.3mg、6-糠氨基嘌呤0.4-0.6mg、硝酸银0.07-0.1mg、蔗糖9-31g和琼脂5-9g；

所述生根培养基是在改良1/2LS培养基的基础上，每升还包含：吲哚丁酸0.4-0.6mg、萘乙酸0.4-0.6mg、活性炭0.8-1.2g、蔗糖9-31g和琼脂5-9g；

所述改良LS培养基，是LS培养基硝酸铵用量减少825m/L的培养基。

进一步地，所述芽诱导培养基，每1L包含：氯化钙332.02mg、磷酸二氢钾170mg、硝酸钾1900mg、硫酸镁180.54mg、硝酸铵825mg、六水氯化钴0.025mg、五水硫酸铜0.025mg、FeNaEDTA 36.7mg、硼酸6.2mg、碘化钾0.83mg、一水硫酸锰16.9mg、二水钼酸钠0.25mg、七水硫酸锌8.6mg、肌醇100mg、硫胺HCl 0.4mg、萘乙酸0.1mg、6-糠氨基嘌呤2mg、6-苄氨基嘌呤0.5mg、硝酸银0.08mg、蔗糖40g和琼脂7g。

进一步地，所述扶壮培养基，每1L包含：氯化钙332.02mg、磷酸二氢钾170mg、硝酸钾1900mg、硫酸镁180.54mg、硝酸铵825mg、六水氯化钴0.025mg、五水硫酸铜0.025mg、FeNaEDTA 36.7mg、硼酸6.2mg、碘化钾0.83mg、一水硫酸锰16.9mg、二水钼酸钠0.25mg、七水硫酸锌8.6mg、肌醇100mg、硫胺HCI 0.4mg、萘乙酸0.2mg、6-糠氨基嘌呤0.5mg、硝酸银0.08mg、蔗糖20g和琼脂7g。

进一步地，所述生根培养基，每1L包含：氯化钙166.01mg、磷酸二氢钾85mg、硝酸钾950mg、硫酸镁90.27mg、硝酸铵412.5mg、六水氯化钴0.0125mg、五水硫酸铜0.0125mg、FeNaEDTA 18.35mg、硼酸3.1mg、碘化钾0.415mg、一水硫酸锰8.45mg、二水钼酸钠0.0125mg、七水硫酸锌4.3mg、肌醇50mg、硫胺HCl 0.2mg、吲哚丁酸0.5mg、萘乙酸0.5mg、活性炭1g、蔗糖20g和琼脂6g。

前述的快繁培养基，它还包括用于无菌苗培养的无菌苗培养基。

进一步地，所述无菌苗培养基为：每升含有5.5g琼脂粉和1g活性炭的1/2MS培养基。

本发明还提供了一种新疆紫草组培快繁方法，它是取新疆紫草无菌苗，使用前述的快繁培养基作为培养基的组培方法。

进一步地，前述新疆紫草组培快繁方法，包括以下步骤：

1)丛生芽诱导：从无菌苗上切取外植体，接种于前述芽诱导培养基上，诱导出芽。

2)壮苗：将丛生芽切分成单株的无根组培苗，转入前述扶壮培养基中，进行壮苗。

3)生根：经扶壮的组培苗接入前述生根培养基中，诱导生根。

进一步地，步骤1)的外植体是芽尖或下胚轴中的一种或两种。

更进一步地，所述外植体是通过前述无菌苗培养基培养得到的。

本发明由于优化了LS培养基中硝酸铵的用量，结合合适的植物激素配比，能同时适应新疆紫草芽尖和下胚轴为外植体的快繁。

本发明增殖效果佳，平均每个外植体在芽诱导培养基培养30天可生成10.5个芽，丛生芽切下的单芽再次诱导，其增殖倍数可达5倍。

另外，本发明利用了直接器官发生途径，进一步缩短培养周期，并降低了紫草材料的变异率。

本发明可以克服目前新疆紫草快繁不能使用芽尖和下胚轴同时作为外植体的问题，为新疆紫草的快繁提供了比现有技术更优的方法，在新疆紫草资源开发利用上具有较好的前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为由带根下胚轴诱导形成的丛芽。

图2为由茎尖增殖的丛芽。

图3为经过扶壮培养后的苗。

图4为生根后的再生植株。

具体实施方式

培养基注释：

1.LS培养基为：每1L含有氯化钙332.02mg、磷酸二氢钾170mg、硝酸钾1900mg、硫酸镁180.54mg、硝酸铵1650mg、六水氯化钴0.025mg、五水硫酸铜0.025mg、FeNaEDTA 36.7mg、硼酸6.2mg、碘化钾0.83mg、一水硫酸锰16.9mg、二水钼酸钠0.25mg、七水硫酸锌8.6mg、肌醇100mg、硫胺HCI 0.4mg的培养基。

2.MS培养基为：在LS培养基的基础上，加上甘氨酸2mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L和烟酸0.5mg/L。

3.1/2LS或1/2MS培养基即为上述各种成分用量减半的LS或MS培养基。

下面结合实施例对本发明的具体实施方法作进一步说明。

实施例1新疆紫草组培快繁培养基配制

1.芽诱导培养基的配制

以配制1L的培养基为例。

1.1混合

取：氯化钙332.02mg、磷酸二氢钾170mg、硝酸钾1900mg、硫酸镁180.54mg、硝酸铵825mg、六水氯化钴0.025mg、五水硫酸铜0.025mg、FeNaEDTA 36.7mg、硼酸6.2mg、碘化钾0.83mg、一水硫酸锰16.9mg、二水钼酸钠0.25mg、七水硫酸锌8.6mg、肌醇100mg、硫胺HCl0.4mg、萘乙酸(NAA)0.1mg、6-糠氨基嘌呤(KT)2.0mg、6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.5mg、硝酸银0.08mg和蔗糖40g放入容器中，加水溶解，定容至1L；再加入7g琼脂粉。

1.2加热

将上述混合物加热并不停搅拌，使得琼脂融化

1.3灭菌

将上述混合物分装转入2个1L三角瓶，加封口膜，放入高压灭菌锅中，121℃灭菌20分钟。

1.4分装

培养基灭菌后冷却至60℃上下，超净工作台上分装至小三角瓶中，加盖封口膜备用。

2.扶壮培养基的配制

以配制1L的培养基为例。

2.1混合

取：氯化钙332.02mg、磷酸二氢钾170mg、硝酸钾1900mg、硫酸镁180.54mg、硝酸铵825mg、六水氯化钴0.025mg、五水硫酸铜0.025mg、FeNaEDTA 36.7mg、硼酸6.2mg、碘化钾0.83mg、一水硫酸锰16.9mg、二水钼酸钠0.25mg、七水硫酸锌8.6mg、肌醇100mg、硫胺HCl0.4mg、萘乙酸(NAA)0.2mg、6-糠氨基嘌呤(KT)0.5mg、硝酸银0.08mg和蔗糖20g放入容器中，加水溶解，定容至1L；再加入7g琼脂粉。

2.2加热

同1.2。

2.3灭菌

同1.3。

2.4分装

同1.4。

3.生根培养基的配制

以配制1L的培养基为例。

3.1称量

称取：氯化钙166.01mg、磷酸二氢钾85mg、硝酸钾950mg、硫酸镁90.27mg、硝酸铵412.5mg、六水氯化钴0.0125mg、五水硫酸铜0.0125mg、feNaEDTA 18.35mg、硼酸3.1mg、碘化钾0.415mg、一水硫酸锰8.45mg、二水钼酸钠0.0125mg、七水硫酸锌4.3mg、肌醇50mg、硫胺HCl0.2mg、吲哚丁酸(IBA)0.5mg、萘乙酸(NAA)0.5mg、活性炭1.0g和蔗糖20g放入容器中，加水溶解，定容至1L；再加入6g琼脂粉。

3.2加热

同1.2。

3.3灭菌

同1.3。

3.4分装

同1.4。

4.无菌苗培养基的配制

以配制1L的培养基为例。

4.1称量

称取：氯化钙166.01mg、磷酸二氢钾85mg、硝酸钾950mg、硫酸镁90.27mg、硝酸铵825mg、六水氯化钴0.0125mg、五水硫酸铜0.0125mg、FeNaEDTA 18.35mg、硼酸3.1mg、碘化钾0.415mg、一水硫酸锰8.45mg、二水钼酸钠0.0125mg、七水硫酸锌4.3mg、肌醇50mg、硫胺HCI0.2mg、甘氨酸2mg、盐酸吡哆醇0.5mg、烟酸0.5mg、活性炭1.0g放入容器中，加水溶解，定容至1L；再加入5.5g琼脂粉。

4.2加热

同1.2。

4.3灭菌

同1.3。

4.4分装

同1.4。

实施例2新疆紫草组培快繁方法

一、方法

使用实施例1中配制的培养基，按照以下步骤进行：

1.种子消毒灭菌处理：选取饱满健康的新疆紫草种子，清洗后进行消毒灭菌处理，具体是先将清洗过的种子在无菌操作工作台内使用体积浓度为75％乙醇浸泡处理10s，浸泡结束后，无菌水冲洗2～3次，然后再用质量浓度15％过氧化氢浸摇23min，最后用无菌水冲洗5～7次，得到无菌种子。

2.获得无菌苗：将无菌种子接种于培养无菌苗培养基中，待培养3～5d，种子破壳露出子叶转至光下，LED全光谱植物灯，光照强度40001x，14h/10h(光照/黑暗)，25℃培养，直至真叶长出。

3.外植体切取：待无菌种子萌发长出真叶后，切取茎尖，在子叶下方约5mm处下刀，切取得到带根下胚轴；茎尖和带根下胚轴都是要用到的外植体。

4.芽诱导：将上述步骤3的外植体转入芽诱导培养基中，先黑暗培养一周，再转入光照环境培养13-18天。

5.芽继代增殖：上述步骤4形成丛生芽(图1，图2)后，将健壮的单芽切取下来或者将较弱小的芽留作小群体的丛芽，继续在芽诱导培养基上继续培养。

6.壮苗：经过继代增殖后的丛生芽，切成单芽，转入壮苗培养基中，30d天壮苗培养(图3)，期间，光照时间增为16h/8h(光照/黑暗)，光照强度40001x，光照时培养温度为25℃，黑暗培养时温度为18℃。

7.生根：将壮苗后的幼苗转入生根培养基中，生根成功后即得到新疆紫草的再生苗(图4)。优选的，诱导生根前，将无根组培苗转入未加激素的培养基中(其他成分与壮苗培养基一样)，空白培养30d。

二、结果

1.诱导出芽的时间：20-25天。

2.30天诱导平均出芽率：10.5个。

3.诱导芽继代一次后增殖倍数：5倍(单个外植体产芽达到52.5个)。

Claims

1.新疆紫草组培快繁培养基，其特征在于：它包括芽诱导培养基、扶壮培养基和生根培养基；

2.如权利要求1所述的快繁培养基，其特征在于：所述芽诱导培养基，每1L包含：氯化钙332.02mg、磷酸二氢钾170mg、硝酸钾1900mg、硫酸镁180.54mg、硝酸铵825mg、六水氯化钴0.025mg、五水硫酸铜0.025mg、FeNaEDTA 36.7mg、硼酸6.2mg、碘化钾0.83mg、一水硫酸锰16.9mg、二水钼酸钠0.25mg、七水硫酸锌8.6mg、肌醇100mg、硫胺HCl 0.4mg、萘乙酸0.1mg、6-糠氨基嘌呤2mg、6-苄氨基嘌呤0.5mg、硝酸银0.08mg、蔗糖40g和琼脂7g。

3.如权利要求1所述的快繁培养基，其特征在于：所述扶壮培养基，每1L包含：氯化钙332.02mg、磷酸二氢钾170mg、硝酸钾1900mg、硫酸镁180.54mg、硝酸铵825mg、六水氯化钴0.025mg、五水硫酸铜0.025mg、FeNaEDTA 36.7mg、硼酸6.2mg、碘化钾0.83mg、一水硫酸锰16.9mg、二水钼酸钠0.25mg、七水硫酸锌8.6mg、肌醇100mg、硫胺HCl 0.4mg、萘乙酸0.2mg、6-糠氨基嘌呤0.5mg、硝酸银0.08mg、蔗糖20g和琼脂7g。

4.如权利要求1所述的快繁培养基，其特征在于：所述生根培养基，每1L包含：氯化钙166.01mg、磷酸二氢钾85mg、硝酸钾950mg、硫酸镁90.27mg、硝酸铵412.5mg、六水氯化钴0.0125mg、五水硫酸铜0.0125mg、FeNaEDTA 18.35mg、硼酸3.1mg、碘化钾0.415mg、一水硫酸锰8.45mg、二水钼酸钠0.0125mg、七水硫酸锌4.3mg、肌醇50mg、硫胺HCl 0.2mg、吲哚丁酸0.5mg、萘乙酸0.5mg、活性炭1g、蔗糖20g和琼脂6g。

5.如权利要求1所述的快繁培养基，其特征在于：它还包括用于无菌苗培养的无菌苗培养基。

6.如权利要求5所述的快繁培养基，其特征在于：所述无菌苗培养基为：每升含有5.5g琼脂粉和1g活性炭的1/2MS培养基。

7.一种新疆紫草组培快繁方法，其特征在于：它是取新疆紫草无菌苗，使用权利要求1～6任一所述的快繁培养基作为培养基的组培方法。

8.如权利要求7所述的新疆紫草组培快繁方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)丛生芽诱导：从无菌苗上切取外植体，接种于权利要求2所述芽诱导培养基上，诱导出芽。

2)壮苗：将丛生芽切分成单株的无根组培苗，转入权利要求3所述扶壮培养基中，进行壮苗。

3)生根：经扶壮的组培苗接入权利要求4所述生根培养基中，诱导生根。

9.如权利要求8所述的新疆紫草组培快繁方法，其特征在于：步骤1)的外植体是芽尖或下胚轴中的一种或两种。

10.如权利要求8所述的快繁方法，其特征在于：所述外植体是通过权利要求5或6所述无菌苗培养基培养得到的。