CN112056215A - 一种铁皮石斛快繁组织培养基及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及培养基技术领域，尤其是一种铁皮石斛快繁组织培养基及其制备方法，经丛生芽诱导培养基中添加60‑100g/L的树皮粉和生根培养基中添加5‑20g/L树皮粉，使得树皮粉在1/2MS培养基中的相对含量发生变化，保障了对铁皮石斛快繁组培苗丛生芽诱导阶段和铁皮石斛组培苗生根阶段的促进作用，使得在分别在丛生芽诱导阶段和铁皮石斛组培苗生根阶段促进阶段达到优化，提高了铁皮石斛苗的出苗数量，提高了出苗率和移栽成活率；同时也缩短了铁皮石斛苗转移到不同培养基中的黄化适应过程。

Description

一种铁皮石斛快繁组织培养基及其制备方法

技术领域

本发明涉及培养基技术领域，尤其是一种铁皮石斛快繁组织培养基及其制备方法。

背景技术

铁皮石斛，又称黑节草，一年生草本植物，是一种珍稀药用植物。《本草纲目》记载：石斛补内脏虚劳赢瘦，强阴益精，久服，厚肠胃，补内绝不足，来眉气，长肌肉，益智除惊，轻身延年。《道藏》中记载：铁皮石斛名列中华“九大仙草”之首。铁皮石斛药用部分是新鲜或干燥茎。现代医学表明，铁皮石斛能显著提高机体免疫功能，抗衰老，抗疲劳，耐缺氧，具有辅助抑制肿瘤等功效。

铁皮石斛种子细如粉尘，缺乏胚乳，需要与真菌共生才能萌发。在自然条件下，铁皮石斛种子萌发率非常低，致使铁皮石斛自然繁殖能力极低，常规繁殖困难，而多年来对铁皮石斛的采集量远大于其生长量，致使野生铁皮石斛濒临灭绝。因此，人工栽培铁皮石斛，以达到满足铁皮石斛用药的市场需求，成为了当前所发展的重点。

目前，就铁皮石斛组织培养、人工栽培的技术文献报道较多，但大多存在组织培养移栽成活率，所需要的成本过高，成苗周期长等技术问题，致使铁皮石斛难以产业化大生产，使得铁皮石斛生产产量依然较高，用药成本依然较大。

鉴于此，有研究者针对上述技术缺陷，开展了铁皮石斛快繁成苗的相关研究，例如：专利号为201310699964.5的由铁皮石斛类原球茎快速繁殖成苗的培养基系列及组培方法，其开展了萌发培养基A、增殖诱导培养基B、分化培养基C、壮苗培养基D或E和生根培养基F，首先将种子在萌发培养基中培养，种子萌发形成原球茎后，在增殖诱导培养基中诱导产生愈伤组织，愈伤组织进一步形成类原球茎，类原球茎经过分化形成小苗，将小苗移栽至壮苗培养基中形成大苗，大苗在生根培养基中经过培养成为至少有3-4条发达健壮根系，株高6-8cm的铁皮石斛成苗，缩短了铁皮石斛培养周期，保障了铁皮石斛移栽成活率达到90％以上。再例如：201510395987.6的利用稀土元素促进铁皮石斛丛生芽的诱导和生根的培养基及培养方法，诱导培养基是向1/2MS培养基中加入一定量的花宝二号、硝酸钐、香蕉汁、土豆汁、活性炭、琼脂、白砂糖；生根培养基为向1/2MS培养基中加入一定量的花宝二号、硝酸铕、香蕉汁、土豆汁、活性炭、琼脂、白砂糖；经增加适量的稀土元素，增加植物体内源激素的含量，使得各种酶的活性增强，呼吸作用提高，有效清除组织内的双氧水，促进组培苗的生物量增加，获得更多根系粗壮的组培苗，缩短了生根时间，根系发达，有助于提高组培苗的移栽成活率。

可见，现有技术中虽然在一定程度上解决了铁皮石斛人工育苗成本高，周期长，移栽成活率低等缺陷，但是其在培养基中所添加的原料成分复杂，采用的原料成分成本较高，致使铁皮石斛苗培育成本依然较低。

鉴于此，本研究者结合多年来从事铁皮石斛组织培养研究的实践经验，开展铁皮石斛培养基原料成分研究，在传统的1/2MS培养基基础上，经过补充铁皮石斛培养基原料成分，以代替传统补充土豆汁、香蕉汁、钼酸钠、硼酸、烟酸等成分，解决传统培养基成本较高，而且所得培养基培养所得的铁皮石斛苗品质不理想，移栽时成活率依然维持在93％以下等缺陷，为铁皮石斛育苗培养基提供了新思路。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种铁皮石斛快繁组织培养基及其制备方法。

具体是通过以下技术方案得以实现的：

本发明创造目的之一在于提供铁皮石斛快繁组织培养基，包括丛生芽诱导培养基和生根培养基，所述丛生芽诱导培养基和所述生根培养基均是在1/2MS培养基中添加树皮粉，其中所述丛生芽诱导培养基中添加量为60-100g/L，所述生根培养基中添加量为5-20g/L；所述树皮粉是将树皮烘干后，经破碎，研磨，过200目筛所得。

优选，所述的树皮是柏树树皮、松树树皮、杜仲树树皮中至少一种。

更优选，所述的树皮取自地面至树干1m高之间。

优选，所述的树皮是柏树树皮与杜仲树皮按照1:1等质量混合而成。

优选，所述的树皮烘干是在温度为40-50℃烘烤至含水率＜8％。

本发明创造的目的之二在于提供上述的铁皮石斛快繁组织培养基制备方法，包括以下步骤：

(1)将树皮烘干，粉碎，研磨，过200目筛，得到树皮粉；

(2)向1/2MS培养基中添加树皮粉，以1000r/min搅拌速度搅拌10min，经高温消毒灭菌，即得。

本发明创造的目的之三在于提供一种使用上述铁皮石斛快繁组织培养基快繁成苗的方法，包括以下步骤：

(1)将铁皮石斛组培苗从培养瓶中取出，插入到诱导丛生培养基中，在温度为22-26℃，光照强度为2200-2800lx，光暗交替15h/9h，经35d诱导生长，得到诱导生长苗；

(2)在诱导生长苗中选取长势整齐的组培苗插入到生根培养基中，在温度为22-26℃，光照强度为2200-2600lx，光暗交替13h/11h，经30d诱导生根培养，得到成苗；

(3)将成苗放置在自然光下炼苗10d，取出成苗，移栽至泥炭土和苔藓等质量混合的基质中。

与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：

①采用树皮粉加入到1/2MS培养基中制备成生根培养基和丛生芽诱导培养基，经消毒灭菌后，促进了丛生芽生长，促进组培苗生根，有效增加铁皮石斛组培苗出苗数量，提高了出苗率和移栽成活率；而且树皮粉制作原料易得，成本低，使得铁皮石斛生根培养基和丛生芽诱导培养基制备成本低，铁皮石斛培养成本低，适宜工厂化推广应用。

②经丛生芽诱导培养基中添加60-100g/L的树皮粉和生根培养基中添加5-20g/L树皮粉，使得树皮粉在1/2MS培养基中的相对含量发生变化，保障了对铁皮石斛快繁组培苗丛生芽诱导阶段和铁皮石斛组培苗生根阶段的促进作用，使得在分别在丛生芽诱导阶段和铁皮石斛组培苗生根阶段促进阶段达到优化，提高了铁皮石斛苗的出苗数量，提高了出苗率和移栽成活率；同时也缩短了铁皮石斛苗转移到不同培养基中的黄化适应过程。

③采用柏树树皮与杜仲树皮按照1:1等质量混合而成，且树皮取自地面至树干1m高之间，使得诱导出苗数量较高，生根培养的根系发达，极大程度提高了铁皮石斛苗的出苗率。

具体实施方式

下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。

以下实施例中所采用的树皮粉是将树皮在温度维持在40-50℃之间烘烤至含水率＜8％，再经粉碎，研磨，过200目筛而得。树皮均采自距离地面1m高以下的，培养基制备方法，包括以下步骤：

(1)将树皮烘干，粉碎，研磨，过200目筛，得到树皮粉；

(2)向1/2MS培养基中添加树皮粉，以1000r/min搅拌速度搅拌10min，经高温消毒灭菌，即得。

实施例1

丛生芽诱导培养基：1/2MS培养基+树皮粉，且树皮粉添加量为60g/L；

生根培养基：1/2MS培养基+树皮粉，且树皮粉添加量为5g/L；

上述采用的树皮为柏树树皮。

实施例2

丛生芽诱导培养基：1/2MS培养基+树皮粉，且树皮粉添加量为100g/L；

生根培养基：1/2MS培养基+树皮粉，且树皮粉添加量为20g/L；

上述采用的树皮为杜仲树树皮。

实施例3

丛生芽诱导培养基：1/2MS培养基+树皮粉，且树皮粉添加量为80g/L；

生根培养基：1/2MS培养基+树皮粉，且树皮粉添加量为10g/L；

上述采用的树皮为松树树皮。

实施例4

丛生芽诱导培养基：1/2MS培养基+树皮粉，且树皮粉添加量为90g/L；

生根培养基：1/2MS培养基+树皮粉，且树皮粉添加量为15g/L；

上述采用的树皮为柏树树皮。

实施例5

丛生芽诱导培养基：1/2MS培养基+树皮粉，且树皮粉添加量为70g/L；

生根培养基：1/2MS培养基+树皮粉，且树皮粉添加量为8g/L；

上述采用的树皮为杜仲树树皮。

实施例6

丛生芽诱导培养基：1/2MS培养基+树皮粉，且树皮粉添加量为50g/L；

生根培养基：1/2MS培养基+树皮粉，且树皮粉添加量为30g/L；

上述采用的树皮为杜仲树树皮。

实施例7

丛生芽诱导培养基：1/2MS培养基+树皮粉，且树皮粉添加量为110g/L；

生根培养基：1/2MS培养基+树皮粉，且树皮粉添加量为1g/L；

上述采用的树皮为柏树树皮。

实施例8

丛生芽诱导培养基：1/2MS培养基+树皮粉，且树皮粉添加量为55g/L；

生根培养基：1/2MS培养基+树皮粉，且树皮粉添加量为25g/L；

上述采用的树皮为松树树皮。

实施例9

丛生芽诱导培养基：1/2MS培养基+树皮粉，且树皮粉添加量为20g/L；

生根培养基：1/2MS培养基+树皮粉，且树皮粉添加量为60g/L；

上述采用的树皮为柏树树皮。

实施例10

在实施例1基础上，采用柏树树皮与松树树皮等质量混合而成，树皮采自距离地面1m高以下。

实施例11

在实施例1基础上，采用柏树树皮与杜仲树树皮等质量混合而成，树皮采自距离地面1m高以下。

实施例12

在实施例1基础上，采用杜仲树树皮与松树树皮等质量混合而成，树皮采自距离地面1m高以下。

实施例13

在实施例1基础上，采用柏树树皮与松树树皮、杜仲树树皮等质量混合而成，树皮采自距离地面1m高以下。

实施例14

在实施例1基础上，柏树树皮采自距离地面1.5m高以上的树皮。

实施例15

在实施例11基础上，柏树树皮与松树树皮均采自距离地面1.5m高以上的树皮。

实施例16

在实施例13基础上，柏树树皮与松树树皮均采自距离地面1.5m高以上的树皮。

实施例17

在实施例1基础上，将树皮采用80℃的温度烘烤至含水率低于8％之后粉碎，研磨，过200目筛。

实施例18

在实施例11基础上，将树皮采用80℃的温度烘烤至含水率低于8％之后粉碎，研磨，过200目筛。

实施例19

在实施例16基础上，将树皮采用80℃的温度烘烤至含水率低于8％之后粉碎，研磨，过200目筛。

实施例20

在实施例1基础上，将树皮研磨过200目筛之后，向树皮粉中按照1g/kg加入对硝基苯酚钠搅拌均匀。

实施例21

在实施例11基础上，将树皮研磨过200目筛之后，向树皮粉中按照10g/kg加入对硝基苯酚钠搅拌均匀。

试验1：树皮粉添加量筛选试验

试验方法：

(1)将铁皮石斛组培苗从培养瓶中取出，取出时采用消毒夹子夹取出来，此时夹取出来的铁皮石斛组培苗长度在0.8-1.5cm之间，并挑选长势均一的幼苗，插入到实施例1-9的诱导丛生培养基中，按照每个实施例组接种20株，在温度为22-26℃，光照强度为2200-2800lx，光暗交替15h/9h，经35d诱导生长，得到诱导生长苗；每组随机选取35株，测定每株的株高，计算平均值，待培养35d后，统计各实施例组组培苗的数量以及转入之后的黄化适应时间，其结果见表1。

(2)在诱导生长苗中选取长势整齐的组培苗，将组培苗根部缠绕部分剪断，留下1cm长，插入到生根培养基中，按照每个实施例组接种20株，在温度为22-26℃，光照强度为2200-2600lx，光暗交替13h/11h，经30d诱导生根培养，得到成苗；数出每组实施例中铁皮石斛成苗的总根数，计算平均每株的根数；测量每组实施例中铁皮石斛成苗根直径，并计算平均每个根直径，统计组培苗转入之后的黄化适应时间，其结果见表2。

(3)将上述各实施例组所得的成苗放置在自然光下炼苗10d，取出成苗，移栽至泥炭土和苔藓等质量混合的基质中，移栽1个月后，统计移栽成活率，结果见表2。

表1丛生芽诱导培养基试验结果

从表1数据显示可见，树皮粉加入到1/2MS培养基中制备成丛生诱导培养基，其树皮粉的添加量不同，将会极大程度影响铁皮石斛组培苗转移到丛生诱导培养基中后的黄化适应时间和丛生诱导出苗率，进而影响铁皮石斛苗培育过程的出苗率；经数据显示可见：①对于树皮粉在1/2MS培养基添加量维持在60-100g/L之间时，其对铁皮石斛丛生诱导培育效果较佳，其黄化适应时间较短，能够使得铁皮石斛苗快速适应丛生诱导培养基，促进铁皮石斛苗快速生长发育，提高出苗率，缩短出苗周期；②单纯采用柏树树皮作为树皮粉制作原材料时，其添加之后，丛生诱导培养基对铁皮石斛苗黄化适应时间较短，而对于单纯采用松树树皮作为树皮粉制作原材料时，其添加之后，其铁皮石斛苗丛生诱导出苗率较高，丛生诱导出苗增长率达到了115％，大幅提高了出苗数量，改善了铁皮石斛丛生诱导出苗率。

表2生根培养基和移栽成活率试验结果

由表2数据显示可见，树皮粉加入到1/2MS培养基中制备成生根培养基，树皮粉添加量不同，将会影响铁皮石斛苗生根效果，同时还会影响铁皮石斛后期移栽成活率；经数据显示可见：①树皮粉添加量维持在5-20g/L之间时，铁皮石斛苗生根效果较佳，根际生长状况良好，且转移丛生诱导苗在生根培养基中的黄化适应时间较短，生根培育成成苗之后的移栽成活率较高，达到了90％以上；②单独采用柏树树皮、松树树皮作为树皮粉制作原料，添加在1/2MS培养基中制备成生根培养基后，铁皮石斛从本发明创造的丛生诱导培养基转入到生根培养基中的黄化适应时间较短，且所得铁皮石斛苗在炼苗之后移栽的成活率较高，达到了93％以上。

试验1结论分析：对于本发明创造所能够达到的技术效果：①对于采用柏树树皮、松树树皮组制备的丛生诱导培养基、生根培养基等对铁皮石斛苗培育过程丛生诱导、生根培养效果均较佳，而对于单纯采用杜仲树皮添加，其效果较差，其中原因：也许是树皮粉中的营养元素含量和营养元素种类有关，使得不同种类的树皮粉添加在培养基后，其对培养基中补充了养分，实现了养分复合，促进了铁皮石斛苗出苗和适应能力，进而提高出苗率；而对于不同添加量，导致铁皮石斛苗生长性能不同，其原因：也许是各种营养组分在不同添加量的基础上，对铁皮石斛苗存在一定的抑制或促进作用，也就是说：对于树皮粉添加时，应当根据树皮粉种类进行合理的添加，否则将会产生抑制作用，也或许是不同树皮种类中的营养成分添加在培养基中后，其与1/2MS培养基的养分发生了某种化学作用，实现了铁皮石斛苗生长性能影响；对于树皮粉添加在1/2MS培养基中，为何能够使得铁皮石斛苗在丛生诱导生长过程中发生上述技术效果，本研究者人员也不得知，目前也无法研究透彻，故在此无法详尽述说；但是对于不同种类的树皮粉，按照合理的添加量添加在1/2MS培养基中制备成丛生诱导培养基和生根培养基，能够给铁皮石斛苗生长带来明显的促进效果，已经得到了研究，并记载如上，在此不再赘述。

试验2：树皮种类筛选试验

试验方法：以实施例10-16制备的培养基作为试验材料，按照试验1的试验方法进行试验，其结果如表3、表4所示：

表3丛生芽诱导培养基试验结果

从表3数据显示可见，采用距离地面1m以下树皮作为树皮粉制作原料，采用柏树树皮+杜仲树皮混合制备成树皮粉，用于添加在1/2MS培养基中制备成丛生诱导培养基，其对铁皮石斛丛生诱导出苗率大幅度提高，且将铁皮石斛组培苗转移到丛生诱导培养基后的黄化适应时间缩短，缩短了出苗周期。

表4生根培养基和移栽成活率试验结果

由表4数据显示可见，采用柏树树皮+杜仲树皮混合制备成树皮粉添加在1/2MS培养基中制备成生根培养基，能够缩短铁皮石斛苗转移到生根培养基中的黄化适应时间，提高移栽成活率。

试验2结论分析：从试验2中得出，对于采用柏树树皮+杜仲树皮混合制备成树皮粉添加在1/2MS培养基中制备成丛生诱导培养基和生根培养基，将有助于提高铁皮石斛的出苗率和缩短培养基转移过程黄化适应时间，缩短组培周期，而且有助于提高移栽之后的成活率。结合试验1中的数据显示可见，对于柏树树皮+杜仲树皮混合制备成树皮粉，其并不是简单的柏树树皮+杜仲树皮的效果叠加，其经混合制备成树皮粉之后，其所得的效果明显高于柏树树皮、杜仲树皮单独作为树皮粉添加时候的效果，其中产生该技术效果的原因：也许是两种树皮中所含的养分不完全相同，实现了各种养分之间的互补，进而完善了添加在培养基中的养分较完善，使得对铁皮石斛苗生长促进作用达到了协同增效目的。

试验3：树皮粉制作工艺筛选试验

试验方法：以实施例17-21制备的培养基作为试验材料，按照试验1的试验方法进行试验，其结果如表5、表6所示：

表5丛生芽诱导培养基试验结果

由表5数据显示可见，对于树皮粉在制作过程中，其烘干温度不宜过高，当采用80℃，甚至以上温度进行烘干时，容易导致树皮表面部分被碳化，影响树皮整体养分含量，致使按照本发明创造的添加量添加在1/2MS培养基中制备成丛生诱导培养基时，其对铁皮石斛丛生诱导出苗率较低，且还会影响黄化适应时间，致使培育周期较长；对于在树皮粉制作过程中，加入适量的对硝基苯酚钠拌入，将会有助于增强丛生诱导效果，提高出苗率和缩短黄化适应时间，提高出苗效率。

表6生根培养基和移栽成活率试验结果

从表6数据显示可见，对于树皮粉在制作过程中，其烘干温度不宜过高，当采用80℃，甚至以上温度进行烘干时，容易导致树皮表面部分被碳化，影响树皮整体养分含量，致使按照本发明创造的添加量添加在1/2MS培养基中制备成生根培养基时，其对铁皮石斛生根影响较大，致使生根根数降低，根系生长状况较差，且还会影响黄化适应时间，致使培育周期较长；对于在树皮粉制作过程中，加入适量的对硝基苯酚钠拌入，将会有助于增强根系生长状况，使得根系茁壮，缩短黄化适应时间，提高移栽成活率，使得移栽成活率达到98％以上。

本发明创造其他未尽事宜参照现有技术，或者本领域技术人员所熟知的公知常识或者常规技术手段加以实施即可。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种铁皮石斛快繁组织培养基，其特征在于，包括丛生芽诱导培养基和生根培养基，所述丛生芽诱导培养基和所述生根培养基均是在1/2MS培养基中添加树皮粉，其中所述丛生芽诱导培养基中添加量为60-100g/L，所述生根培养基中添加量为5-20g/L；所述树皮粉是将树皮烘干后，经破碎，研磨，过200目筛所得。

2.如权利要求1所述的铁皮石斛快繁组织培养基，其特征在于，所述的树皮是柏树树皮、松树树皮、杜仲树树皮中至少一种。

3.如权利要求1或2所述的铁皮石斛快繁组织培养基，其特征在于，所述的树皮取自地面至树干1m高之间。

4.如权利要求2所述的铁皮石斛快繁组织培养基，其特征在于，所述的树皮是柏树树皮与杜仲树皮按照1:1等质量混合而成。

5.如权利要求1所述的铁皮石斛快繁组织培养基，其特征在于，所述的树皮烘干是在温度为40-50℃烘烤至含水率＜8％。

6.一种如权利要求1-5任一项所述的铁皮石斛快繁组织培养基制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将树皮烘干，粉碎，研磨，过200目筛，得到树皮粉；

(2)向1/2MS培养基中添加树皮粉，以1000r/min搅拌速度搅拌10min，经高温消毒灭菌，即得。

7.一种使用如权利要求1-5任一项所述铁皮石斛快繁组织培养基或如权利要求6所述方法制备的铁皮石斛快繁组织培养基快繁成苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将铁皮石斛组培苗从培养瓶中取出，插入到诱导丛生培养基中，在温度为22-26℃，光照强度为2200-2800lx，光暗交替15h/9h，经35d诱导生长，得到诱导生长苗；

(2)在诱导生长苗中选取长势整齐的组培苗插入到生根培养基中，在温度为22-26℃，光照强度为2200-2600lx，光暗交替13h/11h，经30d诱导生根培养，得到成苗；

(3)将成苗放置在自然光下炼苗10d，取出成苗，移栽至泥炭土和苔藓等质量混合的基质中。