CN102577954B - 一种宽叶香蒲根尖诱导愈伤组织并分化成苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种宽叶香蒲根尖诱导愈伤组织并分化成苗的方法，将宽叶香蒲的种子干燥、消毒、发芽生根；对生根后的根尖诱导愈伤组织并分化成苗，具体方法为从生根后的苗根上获取2-3mm的根尖，转接到愈伤组织诱导培养基上无光条件下培养9周；将愈伤组织转接到愈伤组织分化培养基上，在25℃、连续光照的条件下分化培养4周；将分化培养后得到的苗转接到生根培养基上培养4周；将生根培养后的苗转移到含有花肥的小花盆中，将苗置于25℃的温室中生长，在第一周的时候苗的上方要覆盖一层塑料薄膜，防止水分的蒸发，3天浇水一次，培养40天后转移到更大的花盆中并保持3～5cm的水。
Description
技术领域
本发明涉及一种高效的宽叶香蒲根尖诱导愈伤组织并分化成苗的方法。
背景技术
宽叶香蒲是一种天然存在于池塘，湖泊和沼泽的大型植物。它广泛分布于热带和亚热带地区。它具有发达的根系和高效的光合作用系统，一次能够高效利用非结构态碳水化合物。因此，香蒲广泛用于自然或人工湿地污水处理系统中，用于处理城市生活污水、工业废水、农田污水、开矿污水等。
更重要的是宽叶香蒲对重金属如镉，砷，锌以及铅等有较高的耐受性。这些重金属能够在宽叶香蒲的根部进行富集，却不会造成明显的伤害。有研究者通过快速培养宽叶香蒲的根去除重金属的污染。由于重金属蓄积在根部而难以从根部转移到香蒲茎、叶。所以，培养根这个过程显然是高能耗、高成本的过程，要利用宽叶香蒲来治理重金属污染，只能通过转基因的方式才能够解决。所以构建高效的宽叶香蒲转化体系十分重要。Rogers等(Rogers et al.，1998)开发了一种宽叶香蒲愈伤组织分化成苗的方法。其用于诱导愈伤组织的外植体材料是成熟种子生成的幼苗。原因在于宽叶香蒲的种子过小，难以去壳和分离出胚。不能像其他单子叶植物一样从胚进行诱导愈伤组织(Valk et al.，1992；Schaik et al.，1996；Rogers et al.，1998；Thomas and Yoichiro，2011；Pérez-N′unez et al.，2009)。所以，根和芽是较好用于诱导愈伤组织的外植体材料。然而对于通常的单子叶植物来说，从根尖诱导愈伤组织比从芽诱导要难(Kerbauy，1984)。近年有报道从Orchidaceae(Park et al.，2003)和Doritaenopsis(Flachsland et al.，2011；Kerbauy，1984)的根尖成功诱导出愈伤组织。宽叶香蒲的根部十分发达，当种子在培养基中萌发10天后，根的数量远多于苗的数量。这为从根尖诱导愈伤组织提供了便利。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种宽叶香蒲根尖诱导愈伤组织并分化成苗的方法，以提供更为高效的愈伤组织诱导、分化系统。即从根尖诱导愈伤组织的形成，并通过添加植物激素，提高愈伤组织形成效率，生长速度以及出苗效率和加快苗的生长速度。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种宽叶香蒲根尖诱导愈伤组织并分化成苗的方法，该方法包括如下步骤：
(1)将宽叶香蒲的种子干燥、消毒、发芽生根；
(2)对步骤(1)生根后的根尖诱导愈伤组织并分化成苗：
(2a)从步骤(1)中生根后的苗根上获取2-3mm的根尖，转接到愈伤组织诱导培养基上无光条件下培养9周；所述的愈伤组织诱导培养基是外加2g·L-1植物凝胶、30g·L-1蔗糖和2.5～20μM毒莠定的MS培养基；
(2b)将步骤(2a)得到的愈伤组织转接到愈伤组织分化培养基上，在25℃、连续光照、光照强度是30μmol·m-2·s-1的条件下分化培养4周；所述的愈伤组织分化培养基为添加了2.5～5mg·L-1细胞分裂素(BA)、0～2.5mg·L-1激动素(kinetin)、0～0.05mg·L-1萘乙酸(NAA)和0～0.05mg·L-1吲哚乙酸(IAA)的MS培养基；所述的愈伤组织分化培养基优选表1中的三种配方之一；
表1愈伤组织分化培养基为MS培养基基础上添加的植物激素(mg·L-1)
(2c)将步骤(2b)分化培养后得到的苗转接到生根培养基上培养4周；所述的生根培养基为添加了2mg·L-1IBA、2g·L-1植物凝胶和30g·L-1蔗糖的1/4MS基本培养基；
(2d)将步骤(2c)生根培养后的苗转移到含有普通商用花肥的小花盆中，将苗置于25℃的温室中生长，在第一周的时候苗的上方要覆盖一层塑料薄膜，防止水分的蒸发，温室中的光照强度约为230μmol·m-2·s-1，3天浇水一次，培养40天后转移到更大的花盆，该更大的花盆中含有普通商用花肥并保持3～5cm深度的水。
步骤(1)中所述的干燥条件为42℃下干燥24小时。
步骤(1)中所述的消毒，包括如下步骤：
(1a)将种子用灭过菌的蒸馏水浸泡两次，每次浸泡5min，倒干水；
(1b)步骤(1a)处理后的种子用75％(v/v)的乙醇溶液浸泡90秒，倾去乙醇溶液；
(1c)步骤(1b)处理后的种子加入2.5％(w/w)的次氯酸钠溶液中消毒15分钟，在消毒时不断摇晃，重复一次，倾去次氯酸钠溶液；
(1d)步骤(1c)处理后的种子用无菌水浸泡3次，每次浸泡5分钟，倒掉无菌水。
步骤(1)中所述的发芽生根，将种子转移到添加了30g L-1的蔗糖、pH5.8的液体MS培养液中，置于25℃连续光照下2天发芽，然后将发芽的种子转接到生根培养基中生根培养5～7天。所述的生根培养基为添加了2mg·L-1IBA、2g·L-1植物凝胶和30g·L-1蔗糖的1/4MS基本培养基。生根后的苗的继代培养条件为将生根后的苗转接到固体MS培养基，培养3-5周。
有益效果：宽叶香蒲的根系十分发达，根部的分生组织也生长更快。所以，在萌发的过程中，宽叶香蒲的根系生长发达，数量远多于叶片。因此从根尖诱导愈伤组织比直接从芽诱导产生更多的愈伤组织。每粒萌发的种子最终能够产生的愈伤组织数是12.7，远大于从芽诱导产生的愈伤组织数量，后者仅0.31。
附图说明
图1为宽叶香蒲愈伤组织培养基分化。其中，A：宽叶香蒲种子；B：宽叶香蒲萌发；C：宽叶香蒲生根；D：宽叶香蒲愈伤组织；E：愈伤组织分化；F：愈伤组织分化成苗。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
一种宽叶香蒲根尖诱导愈伤组织并分化成苗的方法，该方法包括如下步骤：
(1)将宽叶香蒲的种子干燥、消毒、发芽生根；
宽叶香蒲的花絮采集自南京仙林地区的洋山公园。种子分离方法参加参考文献(Rogers et al.，1998)。
所述的干燥条件为42℃下干燥24小时。
所述的消毒，包括如下步骤：
(1a)将种子用灭过菌的蒸馏水浸泡两次，每次浸泡5min，倒干水；
(1b)步骤(1a)处理后的种子用75％(v/v)的乙醇溶液浸泡90秒，倾去乙醇溶液；
(1c)步骤(1b)处理后的种子加入2.5％(w/w)的次氯酸钠溶液中消毒15分钟，在消毒时不断摇晃，重复一次，倾去次氯酸钠溶液；
(1d)步骤(1c)处理后的种子用无菌水浸泡3次，每次浸泡5分钟，倒掉无菌水。
所述的发芽生根，将种子转移到添加了30g L-1的蔗糖、pH5.8的液体MS培养液中，置于25℃连续光照下2天发芽，然后将发芽的种子转接到生根培养基中生根培养5～7天。所述的生根培养基为添加了2mg·L-1IBA、2g·L-1植物凝胶和30g·L-1蔗糖的1/4MS基本培养基。生根后的苗的继代培养条件为将生根后的苗转接到固体MS培养基，培养3-5周。
(2)对步骤(1)生根后的根尖诱导愈伤组织并分化成苗，包括如下步骤：
(2a)从步骤(1)中生根后的苗根上获取2-3mm的根尖，转接到愈伤组织诱导培养基上无光条件下培养9周；所述的愈伤组织诱导培养基是外加2g·L-1植物凝胶、30g·L-1蔗糖和2.5、或5、或10、或20μM毒莠定的MS培养基；
(2b)将步骤(2a)得到的愈伤组织转接到愈伤组织分化培养基上，在25℃、连续光照、光照强度是30μmol·m-2·s-1的条件下分化培养4周；所述的愈伤组织分化培养基为MS培养基基础上添加了植物激素，植物激素的具体配方为表1中的三种配方之一。
(2c)将步骤(2b)分化培养后得到的苗转接到生根培养基上培养4周；所述的生根培养基为添加了2mg·L-1IBA、2g·L-1植物凝胶和30g·L-1蔗糖的1/4MS基本培养基；
(2d)将步骤(2c)生根培养后的苗转移到含有商用花肥的小花盆中，将苗置于25℃的温室中生长，在第一周的时候苗的上方要覆盖一层塑料薄膜，防止水分的蒸发，温室中的光照强度约为230μmol·m-2·s-1，3天浇水一次，培养40天后转移到更大的花盆，花盆中有商用花肥并保持3～5cm深度的水。
实施例2：测试方法及数据统计分析。
9周大的愈伤组织42℃干燥2天，然后称重。由于愈伤组织较小，为了避免误差，所以，称重时每5个愈伤组织算一份。表2种就是愈伤组织的重量。愈伤组织诱导苗3周的时候，记录每块愈伤组织出苗数量。测定9周后的苗的长度。以上所有测定设定3个重复。数据采用ANOVA和Tukey测试。置信区间是95％。分析软件是R。
实施例3：愈伤组织诱导方法的确立。
消毒后的种子在添加了30g L-1的蔗糖、pH5.8的MS培养液中萌发，在连续光照下能够全部萌发，而在黑暗条件下则仅有不到1％的种子能够萌发，且在愈伤组织诱导培养机上难以形成愈伤组织。实验表明，3天大的芽具有很好的愈伤组织诱导成功率。而2天，3天大的芽用于诱导根则都比1天大的苗好。随着苗的生长，愈伤组织诱导效率会下降。综上，2天大的芽用来诱导根。在生根培养基上90％以上的芽能够生成健康的根。生根培养5-7天，切取2-3mm的根尖，转接到愈伤组织诱导培养基上。实验发现，未有添加植物激素的培养基上无法诱导出愈伤组织，而且对照实验中，2，4-D诱导愈伤组织效率低于毒莠定。在含有2，4-D的培养基上培养7天后，只有67％的根尖诱导出了愈伤组织。而相应的，在含有毒莠定的培养基上，100％的根尖能够诱导出愈伤组织。诱导出愈伤组织的部位位于离根尖顶端1-2mm的分生组织位置。毒莠定的浓度对于愈伤组织诱导数量没有显著影响。不同浓度的毒莠定条件下愈伤组织的生长速度不同。5μM左右的毒莠定对愈伤组织的生长最有利。该浓度的毒莠定下，5块9周龄愈伤组织的重量为2.57mg。2.5μM毒莠定下，5块愈伤组织的重量为2.12mg，10μM时为1.26mg，20μM时为1.02mg(表2)所以最终在诱导培养基中加入的毒莠定浓度为5μM。
表2毒莠定浓度对愈伤组织诱导的影响
从根尖诱导的愈伤组织产量远多于从芽诱导的愈伤组织。每粒发芽的种子诱导出的愈伤组织数量为12.7，而从芽诱导出的愈伤组织数量仅为0.31(p＜0.01)。两种外植体诱导出的愈伤组织生长速度上没有明显差别(p＞0.5)。5块9周大的愈伤组织的干重分别是：2.57mgL-1(从根尖诱导)和2.61mgL-1(从芽诱导)(表3)。故，从根尖诱导愈伤组织产量远大于从芽诱导。当然，在本研究中，从根尖诱导愈伤组织比从芽诱导多了一步根部诱导的过程。即便如此，从根诱导愈伤组织的效率也远高于从芽诱导。且，生根培养可以省略，因为发芽的步骤中就包含了根的形成。无非时间会延长1-2周时间。而增加根培养的步骤能够有效提高根的产量和生长速度。
表3从根尖诱导愈伤组织和从芽诱导的愈伤组织数量和生长速度的差别
表4不同培养基上分化成苗的数量和生长速度
实施例4：愈伤组织分化，幼苗培养条件的确立。
BA，KT，NAA以及IAA用来诱导宽叶香蒲愈伤组织分化成苗。BA比KT诱导分化效果要好，但是KT对单子叶植物的细胞分化有利。而NAA和IAA有利于细胞分裂和增殖以及根的形成(Shan et al.，2000；George et al.，1992；Samantaray et al.，1995；Nikam)。培养基A中添加5mg·L-1BA；培养基B添加5mg·L-1BA和0.05mg·L-1NAA及IAA；培养基C添加2.5mg·L-1BA及KT，0.05mg·L-1NAA及IAA(表1)。连续光照培养下，1周后愈伤组织出绿。在培养基A上19％的愈伤组织产生芽，在培养基B上23％成芽，在培养基C上则有27％成芽(p＜0.05)。BA对于愈伤组织分化成苗的影响是正相关关系，随着BA浓度的升高，成苗率上升。但是KT浓度的升高没有显著影响。但是，KT和BA同时存在的条件下有利于愈伤组织分化。
从表4中可以看到，NAA和IAA对于分化成苗的数量有显著影响(p＜0.05)。在培养基1上，每块愈伤组织上的芽的数量是5.3，在培养基2上是6.2，在培养基3上是6.1。KT对于愈伤组织成苗数量没有显著影响。同样的，对苗的生长的影响上，NAA和IAA促进了苗的生长(p＜0.01)。在培养基1上，5周龄的苗长度平均为0.55cm，在培养基2上是0.76cm，而在培养基3上则是0.76cm(p＜0.05)。所以最终选择培养基2作为分化培养基。5周大的苗转接到生根培养基上进行生根，4周后转移到花盆中，第一周培养上覆薄膜以防止水分蒸发。苗成活率为99％。
总而言之，我们开发了一种高效的宽叶香蒲愈伤组织诱导，分化体系。该体系可以用于快速繁殖，和产生转基因材料。
Claims (6)
1.一种宽叶香蒲根尖诱导愈伤组织并分化成苗的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)将宽叶香蒲的种子干燥、消毒、发芽生根；
(2)对步骤(1)生根后的根尖诱导愈伤组织并分化成苗：
(2a)从步骤(1)中生根后的苗根上获取2-3mm的根尖，转接到愈伤组织诱导培养基上无光条件下培养9周；所述的愈伤组织诱导培养基是外加2g·L-1植物凝胶、30g·L-1蔗糖和2.5～20μM毒莠定的MS培养基；
(2b)将步骤(2a)得到的愈伤组织转接到愈伤组织分化培养基上，在25°C、连续光照、光照强度是30μmol·m-2·s-1的条件下分化培养4周；所述的愈伤组织分化培养基为添加了2.5～5mg·L-1细胞分裂素BA、0～2.5mg·L-1激动素、0～0.05mg·L-1萘乙酸和0～0.05mg·L-1吲哚乙酸的MS培养基；
(2c)将步骤(2b)分化培养后得到的苗转接到生根培养基上培养4周；所述的生根培养基为添加了2mg·L-1IBA、2g·L-1植物凝胶和30g·L-1蔗糖的1/4MS基本培养基；
(2d)将步骤(2c)生根培养后的苗转移到含有花肥的小花盆中，将苗置于25°C的温室中生长，在第一周的时候苗的上方要覆盖一层塑料薄膜，防止水分的蒸发，温室中的光照强度约为230μmol·m-2·s-1，3天浇水一次，培养40天后转移到更大的花盆中，花盆中含有花肥并保持3～5cm深度的水。
2.根据权利要求1所述的宽叶香蒲根尖诱导愈伤组织并分化成苗的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的干燥条件为42°C下干燥24小时。
3.根据权利要求1所述的宽叶香蒲根尖诱导愈伤组织并分化成苗的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的消毒，包括如下步骤：
(1a)将种子用灭过菌的蒸馏水浸泡两次，每次浸泡5min，倒干水；
(1b)步骤(1a)处理后的种子用75%(v/v)的乙醇溶液浸泡90秒，倾去乙醇溶液；
(1c)步骤(1b)处理后的种子加入2.5%(w/w)的次氯酸钠溶液中消毒15分钟，在消毒时不断摇晃，重复一次，倾去次氯酸钠溶液；
(1d)步骤(1c)处理后的种子用无菌水浸泡3次，每次浸泡5分钟，倒掉无菌水。
4.根据权利要求1所述的宽叶香蒲根尖诱导愈伤组织并分化成苗的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的发芽生根，将种子转移到添加了30g·L-1的蔗糖、pH5.8的液体MS培养液中，置于25°C连续光照下2天发芽，然后将发芽的种子转接到生根培养基中生根培养5～7天。
5.根据权利要求4所述的宽叶香蒲根尖诱导愈伤组织并分化成苗的方法，其特征在于，所述的生根培养基为添加了2mg·L-1IBA、2g·L-1植物凝胶和30g·L-1蔗糖的1/4MS基本培养基。
6.根据权利要求4所述的宽叶香蒲根尖诱导愈伤组织并分化成苗的方法，其特征在于，步骤（1）中，生根后的苗的继代培养条件为将生根后的苗转接到固体MS培养基，培养3-5周。
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| Shoot regeneration and plant acclimatization of the wetland monocot Cattail (Typha latifolia);S. Dethier Rogers et al.;《Plant Cell Reports》;19981231;第18卷;第71页的左栏摘要部分第6-9行，第71页右栏倒数第18行至末行，第72页第1-4段 * |
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| 花叶香蒲的组织培养和植株再生;林鸿等;《园林科技》;20071231(第105期);第9页右栏第1段 * |
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