CN103583364B - 一种霍山石斛种苗无激素快速培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种霍山石斛种苗无激素快速培养方法，本方法从霍山采摘生长100天左右尚未完全成熟的霍山石斛果荚，以果荚里乳白色粉末状的幼胚为外植体。采用优化的新型培养基，与经典的MS培养基相比，无机盐等化学物、糖的用量少，针对培养的不同阶段在培养基中分别添加山芋泥、麸皮糊、香蕉皮匀浆液等食用或废弃物，碳源采用市售食用白糖，不添加激素。培养6个月种苗健壮，每棵苗高3-4厘米、具有3-4个节、6-8片叶、4-5条根、根长2-4厘米，移栽成活率达95%以上。之后转入原产地自然环境中栽培，可以保持野生石斛品质。幼胚繁殖率高，种苗繁殖周期缩短，培养基成本低，提高了山芋、麸皮、香蕉皮（废弃物）的利用价值，优化的培养基适用于大规模工厂化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种霍山石斛种苗无激素快速培养方法，属于植物生物技术领域。
背景技术
霍山石斛是属于国家一级保护珍稀中药材。《本草纲目》记载：霍山石斛具有强阴益精，厚胃肠，补内绝不足，平胃气，长肌肉，益智除惊，轻身延年之功效。霍山石斛富含多糖、生物碱、氨基酸等物质。现代药理研究表明：霍山石斛具有抗肿瘤、降血糖，能提高肌体免疫力，兼有药用与营养保健作用，老少皆宜。
霍山石斛生长环境条件要求苛刻，自然繁殖缓慢，种子极小、无胚乳，自然状态下很难萌发，野生资源濒临灭绝。已有许多学者对霍山石斛进行组织培养技术研究，培育出种苗。在现有技术中，多采用MS、1/2MS培养基或改良的培养基，并添加一定量的激素。外源激素影响石斛的品质，种苗繁殖周期长（需8个月左右），种苗成本高，每棵售价1元。因此，研究霍山石斛种苗快速培养方法，优化出不加激素，繁殖速度又快、价格低，能保持野生石斛品质的培养基，是解决霍山石斛产业化的重要课题。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种霍山石斛种苗无激素快速培养方法，该方法不添加激素，能保持野生石斛品质，且繁殖速度又快、价格低。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种霍山石斛种苗无激素快速培养方法，包括以下步骤：
（1）原球茎培养
①选择外植体
从霍山采摘生长100天左右尚未完全成熟的霍山石斛果荚，先用1%的洗洁精浸泡10-15min，然后用流水刷洗干净；
②灭菌
将洗净的果荚放入超净工作台无菌烧杯中，先用75%的酒精浸泡30-60s，无菌水冲洗1次，再用5%的次氯酸钠溶液浸泡20-30min，无菌水冲洗2-3次。
③接种培养
严格无菌操作，解剖刀沿果荚纵向切开，乳白色粉末状的幼胚直接接种在1号培养基:营养元素母液100ml/L+山芋泥100g/L+麸皮糊10g/L+白糖10g/L+琼脂8g/L，幼胚在培养基的表面分散均匀，密而不成团，一个果荚可以接种4瓶。培养条件：室内温度24-28℃，第一周暗培养，以后每天自然光照，培养10天，幼胚变成乳黄色开始胀大，培养20天发育成黄绿色的颗粒状，培养30天顶端长出很小的绿色的叶原基，培养45天发育成基部有丝状物翠绿的原球茎；
（2）分化叶培养
在超净工作台的无菌区，接种铲从母瓶取出原球茎（不要铲到培养基）接入2号培养基：营养元素母液100ml/L+山芋泥100g/L +麸皮糊10g/L +白糖20g/L +琼脂8g/L中培养分化芽，1个母瓶可以接种5-6瓶，每瓶接种1铲，原球茎在培养基的表面分散均匀，彼此间距2mm。培养条件：室内温度24-28℃，自然光照，培养15天长出第一片叶，培养30天长出第二片叶，培养45天发育为高1.0-1.5cm健壮翠绿的小苗；
（3）继代培养
用无菌圆头镊子轻轻取出小苗接入3号培养基:营养元素母液100ml/L+山
芋泥50g/L+麸皮糊10g/L+香蕉皮匀浆液100g/L +白糖10g/L+琼脂8g/L，1个母瓶可以接种9-10瓶，小芽在培养基的表面分散均匀，彼此间距5mm，培养条件同上，培养45天左右，长成苗高2-2.5cm、3-4片叶、2个节的大苗；
（4）分化根培养
从母瓶里取出大苗先放在培养皿中，轻轻剔除基部附着的培养基并分散开，接入4号培养基:营养元素母液50ml/L+山芋泥50g/L+麸皮糊10g/L+香蕉皮匀浆液80g/L+白糖10g/L+琼脂8g/L，进行生根培养，250 ml三角瓶接种20-22棵，650 ml组培瓶接种25-26棵，每棵间距1 cm，轻按苗基部接触培养基即可。每个母瓶可以接种12-15瓶。培养条件同上，培养12天就有根萌发，培养50天左右，生长成健壮的完整植株，生根率为100%，每棵苗高3-3.5cm，6-8片叶，3-5条根，根长2-3cm，根粗壮；
（5）炼苗与移栽
①炼苗
选取苗高3-3.5cm，具有6-8片叶、3-5条根的健壮试管苗，打开封口膜，在温度20-30℃室内自然光下炼苗5-7天；
②移栽
取出试管苗，洗净根部附着的培养基，将根部浸入0.5%KMnO4溶液中浸泡4-6min，取出等根表面水分晾干；
栽培基质为：水苔、小石子、栗粉，栽培容器小塑料杯，水苔用1%KMnO4溶液浸泡20-30min后用洗衣机甩干，石子提前用水浸泡3-5h；
1-2棵石斛为一簇将根捋顺，用一小缕水苔将其根部包裹，水苔以此为中心缠绕，每缠绕1.5cm包裹进1-2棵石斛，茎基部不能包裹，松紧适中，包裹的大小与小塑料杯直径相当，放进塑料杯前杯底部先放少许的栗粉，上面用已浸泡好的小石子固定，放入室内，保持环境温度为20-30℃，自然光照射，第一周不能浇水，每天用喷雾器喷雾2-3次，前两周保持湿度为60-70%，以后逐渐降低湿度、每周浇水一次、一次性浇透，一个月后统计苗的成活率。
所述营养元素母液的制备方法如下：称取10-12g硝酸钾、8-10g硝酸钙、1.5-2g磷酸二氢钾、 2-2.5g硫酸镁，先分别用少量超纯水充分溶解后混合，然后用1000ml容量瓶定容即可。
所述山芋的预处理如下：将山芋削去皮，称取400-500g，切成4cm*2cm*1cm的小片，加入1000-1500ml水煮熟，冷却后用组织匀浆机在5000-6000r/min速度下匀浆3-5min，加水定容到2000ml即得山芋泥；每克山芋相当于4-5毫升的山芋泥。
所述麸皮的预处理如下：将麸皮先在干燥箱60-70℃下干燥1-2h后，用固体粉碎机在10000-15000r/min速度下粉碎5-10min，过50-60目不锈钢面粉筛，称取100-200g加600-800ml水一起放在不锈钢锅中煮，先高温煮沸再低温闷20-30min，加水定容到1000ml即得麸皮糊；每克麸皮相当于5-10毫升的麸皮糊。
所述香蕉皮的预处理如下：称取香蕉皮100-200g加入300-500ml水，用组织匀浆机在4000-5000r/min速度下匀浆5-8min，将香蕉皮匀浆液用4层纱布过滤，匀浆液收集于1000m1烧杯中，加水至800ml即得香蕉皮匀浆液，每克香蕉皮相当于4-8毫升的香蕉皮匀浆液。
所述培养基的配制方法如下：
（1）按培养基配方称取琼脂条、白糖，量取山芋泥、麸皮糊、香蕉皮匀浆液、营养元素母液备用；
（2）用搪瓷缸量取200-250ml纯水在电磁炉上加热至沸腾，加入琼脂，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状，加入白糖，搅拌至溶解；加入山芋泥、麸皮糊、香蕉皮匀浆液，边加热边用玻璃棒搅拌均匀；最后加入营养元素母液，充分混合均匀；
（3）用1mol的NaOH或HCl溶液调pH值，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，使其充分混合，pH调节至6.2-6.5，，然后加纯水在锥形瓶中定容到1000ml；
（4）溶化的培养基趁热分装。用玻璃棒引流倒入锥形瓶中，不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上，100ml锥形瓶中培养基的量为40-50ml，每1L培养基可分装20-25瓶，用封口膜封口外加一层牛皮纸，扎好绳子，用碳素墨水笔标注培养基编号；
（5）培养基采用高压蒸汽灭菌，在120-125℃下灭菌15-20min；灭菌后的培养基趁热平放在实验台上，自然冷却，3-4天后即可接种。
本发明的有益效果：
本方法从霍山采摘生长100天左右尚未完全成熟的霍山石斛果荚，以果荚里乳白色粉末状的幼胚为外植体。采用优化的新型培养基，与经典的MS培养基相比，无机盐、糖的用量少，针对培养的不同阶段在培养基中分别添加山芋泥、麸皮糊、香蕉皮匀浆液等，碳源采用市售食用白糖，不添加激素，培养6个月种苗健壮，每棵苗高3-4厘米、具有3-4个节、6-8片叶、4-5条根、根长2-4厘米，移栽成活率达95%以上。之后转入原产地自然环境中栽培，可以保持野生石斛品质。幼胚繁殖率高，种苗繁殖周期缩短，培养基成本低，提高了山芋、麸皮、香蕉皮（废弃物）的利用价值，优化的培养基适用于大规模工厂化生产。
附图说明
图1为霍山石斛幼胚发育形成原球茎显微拍照图，其中（1）为培养20天的原球茎，（2）为培养30天的原球茎，（3）为培养40天的原球茎。
图2为原球茎分化形成的叶，其中（1）为培养20天的原球茎分化，（2）为培养40天原球茎分化发育的小苗。
图3为继代培养后的大苗。
图4为培养生根后的完整植株。
具体实施方式
一种霍山石斛种苗无激素快速培养方法，包括以下步骤：
（1）原球茎培养
①选择外植体
从霍山采摘生长100天左右尚未完全成熟的霍山石斛果荚，先用1%的洗洁精浸泡10min，然后用流水刷洗干净；
②灭菌
将洗净的果荚放入超净工作台无菌烧杯中，先用75%的酒精浸泡30s，无菌水冲洗1次，再用5%的次氯酸钠溶液浸泡20min，无菌水冲洗2次。
③接种培养
严格无菌操作，解剖刀沿果荚纵向切开，乳白色粉末状的幼胚直接接种在1号培养基:营养元素母液100ml/L+山芋泥100g/L+麸皮糊10g/L+白糖10g/L+琼脂8g/L，幼胚在培养基的表面分散均匀，密而不成团，一个果荚可以接种4瓶。培养条件：室内温度26℃，第一周暗培养，以后每天自然光照，培养10天，幼胚变成乳黄色开始胀大，培养20天发育成黄绿色的颗粒状，培养30天顶端长出很小的绿色的叶原基，培养45天发育成基部有丝状物翠绿的原球茎（图1）；
（2）分化叶培养
在超净工作台的无菌区，接种铲从母瓶取出原球茎（不要铲到培养基）接入2号培养基：营养元素母液100ml/L+山芋泥100g/L +麸皮糊10g/L +白糖20g/L +琼脂8g/L中培养分化叶，1个母瓶可以接种6瓶，每瓶接种1铲，原球茎在培养基的表面分散均匀，彼此间距2mm。培养条件：室内温度26℃，自然光照，培养15天长出第一片叶，培养30天长出第二片叶，培养45天发育为高1cm 健壮翠绿的小苗（图2）；
（3）继代培养
用圆头镊子轻轻取出小苗接入3号培养基:营养元素母液100ml/L+山芋泥50g/L+麸皮糊10g/L+香蕉皮匀浆液100g/L +白糖10g/L+琼脂8g/L，1个母瓶可以接种10瓶，小苗在培养基的表面分散均匀，彼此间距5mm，培养条件同上，培养45天长成苗高2cm，4片叶、2个节的大苗（图3）；
（4）分化根培养
从母瓶里取出大苗先放在培养皿中，轻轻剔除基部附着培养基并分散开，接入4号培养基:营养元素母液50ml/L+山芋泥50g/L+麸皮糊10g/L+香蕉皮匀浆液80g/L+白糖10g/L+琼脂8g/L，进行生根培养，250 ml三角瓶接种20棵，650 ml组培瓶接种25棵，每棵间距1 cm，轻按苗基部接触培养基即可。培养条件同上，培养12天就有根萌发，培养50天生长成健壮完整植株（图4），生根率为100%，每棵苗高3cm，6片叶， 3-5条根，根长2-3cm，根粗壮；
（5）炼苗与移栽
①炼苗
选取苗高约4cm，具有6片叶、平均有4条根的健壮试管苗，打开封口膜，在温度22-30℃室内自然光下炼苗6天；
②移栽
取出试管苗，洗净根部附着的培养基，将根部浸入0.5%KMnO4溶液中浸泡5min，取出等根表面水分晾干；
栽培基质为：水苔、小石子、栗粉，栽培容器为小塑料杯（底有排水筛孔），水苔用1%KMnO4溶液浸泡30min后用洗衣机甩干，石子提前用水浸泡4h；
2棵石斛为一簇将根捋顺，用一小缕水苔将其根部包裹，水苔以此为中心缠绕，每缠绕1.5cm包裹进2棵石斛，茎基部不能包裹，松紧适中，包裹的大小与小塑料杯直径相当，放进塑料杯前杯底部先放2g栗粉，上面用已浸泡好的小石子固定，放入室内，保持环境温度为20-30℃，自然光照射，第一周不能浇水，每天用喷雾器喷雾2次，前两周保持湿度为65%，以后逐渐降低湿度、每周浇水一次、一次性浇透，一个月后统计苗的成活率达95%以上。
上述营养元素母液的制备方法如下：用感量为0.01g的电子天平称取10g硝酸钾、8g硝酸钙、1.6g磷酸二氢钾、 2g硫酸镁，先分别用少量超纯水充分溶解后混合，然后用1000ml容量瓶定容即可。
上述山芋的预处理如下：将山芋削去皮，称取500g，切成4cm*2cm*1cm的小片，加入1500ml水煮熟，冷却后用组织匀浆机在5000r/min速度下匀浆5min，加水定容到2000ml即得山芋泥；每克山芋相当于4毫升的山芋泥。
上述麸皮的预处理如下：将麸皮先在干燥箱70℃下干燥1h后，用固体粉碎机在15000r/min速度下粉碎5min，过60目不锈钢面粉筛，称取100g加600ml水一起放在不锈钢锅中煮，先高温煮沸再低温闷20min，加水定容到1000ml即得麸皮糊；每克麸皮相当于10毫升的麸皮糊。
上述香蕉皮的预处理如下：称取香蕉皮200g加入500ml水，用组织匀浆机在5000r/min速度下匀浆5min，将香蕉皮匀浆液用4层纱布过滤，匀浆液收集于1000m1烧杯中，加水至800ml即得香蕉皮匀浆液，每克香蕉皮相当于4毫升的香蕉皮匀浆液。
上述培养基的配制方法如下：
（1）按培养基配方称取琼脂条、白糖，量取山芋泥、麸皮糊、香蕉皮匀浆液、营养元素母液备用；
（2）用搪瓷缸量取200ml纯水在电磁炉上加热至沸腾，加入琼脂，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状，加入白糖，搅拌至溶解；加入山芋泥、麸皮糊、香蕉皮匀浆液，边加热边用玻璃棒搅拌均匀；最后加入营养元素，充分混合均匀；
（3）用1mol的NaOH或HCl溶液调pH值，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，使其充分混合，pH调节至6.2-6.5，然后加纯水在锥形瓶中定容到1000ml；
（4）溶化的培养基趁热分装。用玻璃棒引流倒入锥形瓶中，不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上，100ml锥形瓶中培养基的量为40-50ml，每1L培养基可分装20-25瓶，用封口膜封口外加一层牛皮纸，扎好绳子，用碳素墨水笔标注培养基编号；
（5）培养基采用高压蒸汽灭菌，在121℃下灭菌19min；灭菌后的培养基趁热平放在实验台上，自然冷却，3天后即可接种。
Claims (4)
1.一种霍山石斛种苗无激素快速培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）原球茎培养
①选择外植体
从霍山采摘生长100天左右尚未完全成熟的霍山石斛果荚，先用1%的洗洁精浸泡10-15min，然后用流水刷洗干净；
②灭菌
将洗净的果荚放入超净工作台无菌烧杯中，先用75%的酒精浸泡30-60s，无菌水冲洗1次，再用5%的次氯酸钠溶液浸泡20-30min，无菌水冲洗2-3次；
③接种培养
严格无菌操作，解剖刀沿果荚纵向切开，乳白色粉末状的幼胚直接接种在1号培养基上，所述1号培养基为：营养元素母液100ml/L+山芋泥100g/L+麸皮糊10g/L+白糖10g/L+琼脂8g/L，幼胚在培养基的表面分散均匀，密而不成团，一个果荚接种4瓶；培养条件：室内温度24-28℃，第一周暗培养，以后每天自然光照，培养10天，幼胚变成乳黄色开始胀大，培养20天发育成黄绿色的颗粒状，培养30天顶端长出很小的绿色的叶原基，培养45天发育成基部有丝状物翠绿的原球茎；
（2）分化叶培养
在超净工作台的无菌区，用接种铲从母瓶取出原球茎接入2号培养基：营养元素母液100ml/L+山芋泥100g/L+麸皮糊10g/L +白糖20g/L +琼脂8g/L中培养分化芽，不要铲到培养基，1个母瓶接种5-6瓶，每瓶接种1铲，原球茎在培养基的表面分散均匀，彼此间距2mm；培养条件：室内温度24-28℃，自然光照，培养15天长出第一片叶，培养30天长出第二片叶，培养45天长成高1.0-1.5cm健壮翠绿的小苗；
（3）继代培养
用无菌圆头镊子轻轻取出小苗接入3号培养基：营养元素母液100ml/L+山芋泥50g/L+麸皮糊10g/L+香蕉皮匀浆液100g/L+白糖10g/L+琼脂8g/L，1个母瓶接种9-10瓶，小芽在培养基的表面分散均匀，彼此间距5mm，培养条件：室内温度24-28℃，自然光照，培养45天左右，长成苗高2-2.5cm、3-4片叶、2个节的大苗；
（4）分化根培养
从母瓶里取出大苗先放在培养皿中，轻轻剔除基部附着的培养基并将大苗分散开，接入4号培养基：营养元素母液50ml/L+山芋泥50g/L+麸皮糊10g/L+香蕉皮匀浆液80g/L+白糖10g/L+琼脂8g/L，进行生根培养，250 ml三角瓶接种20-22棵，650 ml组培瓶接种25-26棵，每棵间距1 cm，轻按苗基部接触培养基即可；每个母瓶接种12-15瓶；培养条件：室内温度24-28℃，自然光照，培养12天就有根萌发，培养50天左右，生长成健壮的完整植株，生根率为100%，每棵苗高3-3.5cm，6-8片叶，3-5条根，根长2-3cm，根粗壮；
（5）炼苗与移栽
①炼苗
选取苗高3-3.5cm，具有6-8片叶、3-5条根的健壮试管苗，打开封口膜，在温度20-30℃室内自然光下炼苗5-7天；
②移栽
取出试管苗，洗净根部附着的培养基，将根部浸入0.5%KMnO4溶液中浸泡4-6min，取出等根表面水分晾干；
栽培基质为：水苔、小石子、栗粉，栽培容器为小塑料杯，水苔用1%KMnO4溶液浸泡20-30min后用洗衣机甩干，小石子提前用水浸泡3-5h；
1-2棵石斛为一簇将根捋顺，用一小缕水苔将其根部包裹，水苔以此为中心缠绕，每缠绕1.5cm包裹进1-2棵石斛，茎基部不能包裹，松紧适中，包裹的大小与小塑料杯直径相当，放进塑料杯前杯底部先放少许的栗粉，上面用已浸泡好的小石子固定，放入室内，保持环境温度为20-30℃，自然光照射，第一周不能浇水，每天用喷雾器喷雾2-3次，前两周保持湿度为60-70%，以后逐渐降低湿度、每周浇水一次、一次性浇透，一个月后统计苗的成活率；
所述营养元素母液的制备方法如下：称取10-12g硝酸钾、8-10g硝酸钙、1.5-2g磷酸二氢钾、 2-2.5g硫酸镁，先分别用少量超纯水充分溶解后混合，然后用1000ml容量瓶定容即可。
2.根据权利要求1所述的一种霍山石斛种苗无激素快速培养方法，其特征在于，山芋的预处理如下：将山芋削去皮，称取400-500g，切成4cm×2cm×1cm的小片，加入1000-1500ml水煮熟，冷却后用组织匀浆机在5000-6000r/min速度下匀浆3-5min，加水定容到2000ml即得山芋泥；每克山芋相当于4-5毫升的山芋泥。
3.根据权利要求1所述的一种霍山石斛种苗无激素快速培养方法，其特征在于，麸皮的预处理如下：将麸皮先在干燥箱60-70℃下干燥1-2h后，用固体粉碎机在10000-15000r/min速度下粉碎5-10min，过50-60目不锈钢面粉筛，称取100-200g加600-800ml水一起放在不锈钢锅中煮，先高温煮沸再低温闷20-30min，加水定容到1000ml即得麸皮糊；每克麸皮相当于5-10毫升的麸皮糊。
4.根据权利要求1所述的一种霍山石斛种苗无激素快速培养方法，其特征在于，香蕉皮的预处理如下：称取香蕉皮100-200g加入300-500ml水，用组织匀浆机在4000-5000r/min速度下匀浆5-8min，将香蕉皮匀浆液用4层纱布过滤，匀浆液收集于1000m1烧杯中，加水至800ml即得香蕉皮匀浆液，每克香蕉皮相当于4-8毫升的香蕉皮匀浆液。
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| CN102835317A (zh) * | 2012-09-28 | 2012-12-26 | 安徽省华信生物药业股份有限公司 | 一种硒化霍山石斛培养物的生产方法 |
-
2013
- 2013-11-14 CN CN201310566691.7A patent/CN103583364B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1656884A (zh) * | 2005-01-27 | 2005-08-24 | 合肥工业大学 | 石斛原球茎无激素培养方法 |
| CN102835317A (zh) * | 2012-09-28 | 2012-12-26 | 安徽省华信生物药业股份有限公司 | 一种硒化霍山石斛培养物的生产方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 霍山石斛组织培养及快速克隆繁殖技术;李蕤等;《药物生物技术》;20111231;第18卷(第1期);第11-15页 * |
| 霍山石斛细胞悬浮培养及条件优化;李蕤等;《中草药》;20110228;第42卷(第2期);第358-362页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103583364A (zh) | 2014-02-19 |
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