CN112772282B - 一种蛹虫草的培育方法 - Google Patents

Abstract

一种蛹虫草的培育方法，涉及食药用菌培育技术领域。本发明的目的是要解决现有蛹虫草培育技术存在僵化率低、出草率低以及虫草素含量低的问题。方法：无菌条件下，将液体生产种子接种于活体蚕蛹蛹皮表面，然后避光培养20～30d；在僵化的蚕蛹的第一对小翅处进行开口处理，进行光照和温差刺激，持续5～10d后，将原基萌发阶段的蚕蛹进行光照和温度刺激，持续5～6d后，将子实体初期阶段的蚕蛹进行光照和温度刺激，持续10～15d后，将子实体成长阶段的蚕蛹进行第4次光照和温度刺激，持续3～7d后，得到成熟的子实体，进行采收。本发明可获得一种蛹虫草的培育方法。

Description

一种蛹虫草的培育方法

技术领域

本发明涉及食药用菌培育技术领域，具体涉及一种蛹虫草的培育方法。

背景技术

蛹虫草(Cordyceps militaris)又称北冬虫夏草、北虫草。野生的蛹虫草其宿主由鳞翅目等昆虫的蛹从寄生虫蛹体顶端长出，状似垒于棒，长0.8-3cm，橙黄色。野生的蛹虫草主产自辽宁、吉林、河北、陕西、安徽、云南、广东和广西等地。

柞蚕属于鳞翅目昆虫，是我国的特色产业，现分布于辽宁、吉林、黑龙江、内蒙古、河北、山东、河南、贵州、四川和湖北等10多个省区。我国柞蚕茧(蛹)的年产量占世界产量的90％，柞蚕蛹营养丰富、安全。以柞蚕蛹为寄主，完全符合源自自然、接近自然的人工虫草培养法则，做到了不与人争粮、不与粮争地、不与地争肥、不与农争时以及不与其他产业争资源，可将过去养蚕-缫丝的单一生产模式转变为养蚕-缫丝-功能食品、制药等新的生产模式，既为养蚕业提供了新的市场，又为营养食品和制药等行业提供了新的资源。国内外学者实验数据及产业化结果表明，柞蚕蛹虫草有效成分及利润远远高于代料栽培(谷物培养基)的蛹虫草。

在当下从业者众多、产品市场竞争激烈、柞蚕蛹价格持续上涨和劳动力价格居高的大环境下，应当尽最大努力采用轻简的培育方法，提高蛹虫草的生物转换效率，使蛹虫草更加优质高产，这不仅是挖掘柞蚕蛹本身价值，更是生产链中附加支出成本的节约，增产增质综合措施应用才能有效提高培育蛹虫草收益。

因此，从接种方式和出草方式等核心关键技术方面入手，解决现有蛹虫草培育技术存在操作复杂、僵化率和出草率低以及有效成分少等问题，筛选出合适的优质轻简高效培育方法具有重要的实际意义。

发明内容

本发明的目的是要解决现有蛹虫草培育技术存在僵化率低、出草率低以及虫草素含量低的问题，而提供一种蛹虫草的培育方法。

一种蛹虫草的培育方法，按以下步骤进行：

一、将油莎豆粕水解液、葡萄糖酸钙母液和维生素C母液加入到去离子水中，充分搅拌后，灭菌，冷却至室温，得到灭菌后的液体培养基；无菌条件下，将蛹虫草母种接种于灭菌后的液体培养基中，接种量为5～10块/0.5cm³，并在18～22℃的温度条件和140～160r/min的转速条件下培养5～7d，得到液体生产种子；

二、无菌条件下，将液体生产种子接种于活体蚕蛹蛹皮表面，接种量为0.4～0.6mL/个蚕蛹个体；将接种后的活体蚕蛹在16～20℃的温度条件下，避光培养20～30d，得到僵化的蚕蛹；在僵化的蚕蛹的第一对小翅处进行开口处理，然后进行第1次光照和温差刺激，持续5～10d后，得到原基萌发阶段的蚕蛹；将原基萌发阶段的蚕蛹进行第2次光照和温度刺激，持续5～6d后，得到子实体初期阶段的蚕蛹；将子实体初期阶段的蚕蛹进行第3次光照和温度刺激，持续10～15d后，得到子实体成长阶段的蚕蛹；将子实体成长阶段的蚕蛹进行第4次光照和温度刺激，持续3～7d后，得到成熟的子实体，进行采收。

本发明的有益效果：

(1)本发明一种蛹虫草的培育方法，采用外感法进行接种，即菌丝在蛹体表面攀爬，从柞蚕蛹的气孔、关节和体壁入侵，模拟野生蛹虫草自然侵染过程，使蛹、菌及微生物有充裕的时间合成有效物。本发明不采用注射接种法，因为注射接种法直接跳过菌丝入侵蛹皮等过程，直接削弱活蛹、虫草菌和微生物之间的斗争和生存，以至有效物生存不全，应有的药效下降。通过大量实验证明，本发明采用外感法接种的蛹虫草僵化率在95％以上，比注射接种法高5％左右，蛹虫草的虫草素含量是注射接种法的2倍以上。

本发明采用在柞蚕蛹的第一对小翅处进行开口出草处理，使僵化蛹种的虫草菌丝完全暴露，充分接触空气，进行有氧呼吸，缩短原基萌发时间，均在蚕蛹的小翅集中出草，保证出草率，且每个蚕蛹的子实体为4～6根，更粗壮和美观。本发明不采用自然出草法(蛹体不采取任何处理，让其自然出草)，是因为自然出草法出草率低，周期长。通过大量实验证明，本发明采用小翅开口处理的柞蚕蛹原基萌发周期比自然出草的柞蚕蛹原基萌发周期缩短了3～5d，出草率在95％以上，比自然出草法高5％左右，并且大幅度减少人工接种成本。

(2)本发明一种蛹虫草的培育方法，以油莎豆粕水解液、葡萄糖酸钙母液和维生素C母液为原料制备液体菌种，油莎豆粕水解液作为液体菌种的碳源，葡萄糖酸钙母液提供钙离子，维生素C母液提供维生素C；该液体培养基简单且来源广泛、投资少、能耗低以及技术较简单，方法具有可行性，增加了油莎豆和玉米淀粉的附加值等优势，对油莎豆产业和玉米深加工产业等具有很好的经济效益和社会效益。

本发明可获得一种蛹虫草的培育方法。

附图说明

图1为柞蚕蛹平铺在育苗箱内；

图2为将活体蚕蛹采用外感法进行接种；

图3为避光培养初期的蚕蛹状态；

图4为避光培养结束时的蚕蛹状态；

图5为僵化后的蚕蛹进行开口处理；

图6为开口后的蚕蛹垂直放入穴盘；

图7为柞蚕蛹的原基萌发状态；

图8为1～2cm的小子实体；

图9为2～4cm的小子实体；

图10为即将进入成熟阶段的蛹虫草；

图11为成熟的蛹虫草；

图12为采收的柞蚕蛹虫草鲜品。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式一种蛹虫草的培育方法，按以下步骤进行：

一、将油莎豆粕水解液、葡萄糖酸钙母液和维生素C母液加入到去离子水中，充分搅拌后，灭菌，冷却至室温，得到灭菌后的液体培养基；无菌条件下，将蛹虫草母种接种于灭菌后的液体培养基中，接种量为5～10块/0.5cm³，并在18～22℃的温度条件和140～160r/min的转速条件下培养5～7d，得到液体生产种子；

二、无菌条件下，将液体生产种子接种于活体蚕蛹蛹皮表面，接种量为0.4～0.6mL/个蚕蛹个体；将接种后的活体蚕蛹在16～20℃的温度条件下，避光培养20～30d，得到僵化的蚕蛹；在僵化的蚕蛹的第一对小翅处进行开口处理，然后进行第1次光照和温差刺激，持续5～10d后，得到原基萌发阶段的蚕蛹；将原基萌发阶段的蚕蛹进行第2次光照和温度刺激，持续5～6d后，得到子实体初期阶段的蚕蛹；将子实体初期阶段的蚕蛹进行第3次光照和温度刺激，持续10～15d后，得到子实体成长阶段的蚕蛹；将子实体成长阶段的蚕蛹进行第4次光照和温度刺激，持续3～7d后，得到成熟的子实体，进行采收。

本实施方式的有益效果：

(1)本实施方式一种蛹虫草的培育方法，采用外感法进行接种，即菌丝在蛹体表面攀爬，从柞蚕蛹的气孔、关节和体壁入侵，模拟野生蛹虫草自然侵染过程，使蛹、菌及微生物有充裕的时间合成有效物。本实施方式不采用注射接种法，因为注射接种法直接跳过菌丝入侵蛹皮等过程，直接削弱活蛹、虫草菌和微生物之间的斗争和生存，以至有效物生存不全，应有的药效下降。通过大量实验证明，本实施方式采用外感法接种的蛹虫草僵化率在95％以上，比注射接种法高5％左右，蛹虫草的虫草素含量是注射接种法的2倍以上。

本实施方式采用在柞蚕蛹的第一对小翅处进行开口出草处理，使僵化蛹种的虫草菌丝完全暴露，充分接触空气，进行有氧呼吸，缩短原基萌发时间，均在蚕蛹的小翅集中出草，保证出草率，且每个蚕蛹的子实体为4～6根，更粗壮和美观。本实施方式不采用自然出草法(蛹体不采取任何处理，让其自然出草)，是因为自然出草法出草率低，周期长。通过大量实验证明，本实施方式采用小翅开口处理的柞蚕蛹原基萌发周期比自然出草的柞蚕蛹原基萌发周期缩短了3～5d，出草率在95％以上，比自然出草法高5％左右，并且大幅度减少人工接种成本。

(2)本实施方式一种蛹虫草的培育方法，以油莎豆粕水解液、葡萄糖酸钙母液和维生素C母液为原料制备液体菌种，油莎豆粕水解液作为液体菌种的碳源，葡萄糖酸钙母液提供钙离子，维生素C母液提供维生素C；该液体培养基简单且来源广泛、投资少、能耗低以及技术较简单，方法具有可行性，增加了油莎豆和玉米淀粉的附加值等优势，对油莎豆产业和玉米深加工产业等具有很好的经济效益和社会效益。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同点是：步骤一中将油莎豆粕水解液、葡萄糖酸钙母液和维生素C母液加入到去离子水中，充分搅拌后，在121℃下灭菌30min，冷却至室温，得到灭菌后的液体培养基，所述油莎豆粕水解液、葡萄糖酸钙母液和维生素C母液与去离子水的体积比为10mL：2mL：1.5mL：1000mL。

其他步骤与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同点是：所述油莎豆粕水解液按以下步骤制备：将油莎豆粕加入到浓度为1.2％的硫酸溶液中，固液比为1：8，然后在123℃的温度条件下反应2h，固液分离后，得到初始水解液；将初始水解液经碳酸钙乳液中和至pH为3.5，再经1.0％活性炭脱色30min后，得到油莎豆粕水解液，油莎豆粕水解液中可溶性固形物的质量分数为10.0％，总还原糖的质量分数为8.0％；总还原糖由80％葡萄糖、15％阿拉伯糖和5％木糖组成。

其他步骤与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同点是：所述葡萄糖酸钙母液中可行性固形物的含量为4.5％、粗蛋白的含量为0.6％、粗脂肪的含量为0.4％、总糖的含量为0.85％、还原糖的含量为0.7％和葡萄糖酸钙的含量为3％，余量为水。

其他步骤与具体实施方式一至三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同点是：所述维生素C母液中维生素C的含量为0.8～1.0％，古龙酸的含量为0.5～0.6％，余量为水。

其他步骤与具体实施方式一至四相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同点是：步骤二中采用数控定量接种机将液体生产种子接种于化蛹2～4d的活体蚕蛹蛹皮表面。

其他步骤与具体实施方式一至五相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同点是：步骤二中所述的第1次光照刺激为：每天不少于10h的光照；温差刺激为：昼夜温差5℃，白天20℃，晚上15℃，湿度为75％左右。

其他步骤与具体实施方式一至六相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同点是：步骤二中所述的第2次、第3次和第4次的光照刺激为：每天不少于10h的光照；温度刺激为：温度为20℃，湿度为75％左右。

其他步骤与具体实施方式一至七相同。

采用以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例1：一种蛹虫草的培育方法，按以下步骤进行：

一、液体种子制备：

1.液体培养基

油莎豆粕水解液10mL，葡萄糖酸钙母液2mL，维生素C母液1.5mL，去离子水1L。

(1)油莎豆粕水解液制备过程及成分组成：

所述油莎豆粕水解液按以下步骤制备：将油莎豆粕加入到浓度为1.2％的硫酸溶液中，固液比为1：8，然后在123℃的温度条件下反应2h，固液分离后，得到初始水解液；将初始水解液经碳酸钙乳液中和至pH为3.5，再经1.0％活性炭脱色30min后，得到油莎豆粕水解液，油莎豆粕水解液中可溶性固形物的质量分数为10.0％，总还原糖的质量分数为8.0％；总还原糖由80％葡萄糖、15％阿拉伯糖和5％木糖组成。

(2)葡萄糖酸钙母液成分：

所述葡萄糖酸钙母液中可行性固形物的含量为4.5％、粗蛋白的含量为0.6％、粗脂肪的含量为0.4％、总糖的含量为0.85％、还原糖的含量为0.7％和葡萄糖酸钙的含量为3％，余量为水。

(3)维生素C母液成分：

所述维生素C母液中维生素C的含量为0.9％，古龙酸的含量为0.55％，余量为水。

2.培养基灭菌

按液体菌种培养基的配方精确称取各物质，充分搅拌后分装于培养瓶中，装液量为500mL，瓶口用聚丙烯塑料薄膜封好，在121℃下灭菌30min，冷却至常温，得到灭菌后的液体培养基，备用。

3.种子培养

无菌条件下，用接种铲取蛹虫草斜面母种0.5cm³菌种块6块，接种于装有灭菌后的液体培养基的培养瓶中，于恒温摇床中在20℃的温度条件和150r/min的转速条件下培养6d，得到澄清透明、菌丝均匀一致的液体生产种子，备用。

二、柞蚕蛹的选择与处理：

柞蚕茧现剥现用，一般选择化蛹2～4d的蚕蛹，不要超过化蛹7d。剔除受伤蛹、败血蛹、僵蛹等不良蚕蛹，蛹体表面无需消毒。

三、接种：

1.培养容器、接种工具的选择及处理

(1)培养容器：

采用育苗箱为培养容器，总体尺寸为34×25×14cm，其中底盘材质为聚丙烯，高5cm，盖子为聚丙烯材质，高9cm，盖子带有旋转式透气孔，气孔直径为1cm。

接种前，将育苗箱放置在0.3％的高锰酸钾溶液中浸泡10分钟，用无菌水冲洗干净，凉干备用。

(2)接种工具：

采用液体食用菌数控定量接种机，体积小巧，操作灵活方便，接种速度快、效率高，安全无污染。接种前，用75％的乙醇溶液冲洗接种机管道1～2遍，再用无菌水冲洗干净。

2.接种

采用外感法，即活体蚕蛹蛹皮外感染虫草真菌的接种方法，与野生蛹虫草自然感染的方式一致。

具体操作过程：在无菌室条件下，将活体柞蚕蛹平铺在育苗箱的底盘中(如图1所示)，每个育苗箱的蚕蛹数为60个，将数控定量接种机的吸料管插到装有蛹虫草液体种子的培养瓶中，开启电源进行接种，每个育苗箱接种30mL，即每个蚕蛹个体接种0.5mL液体种子，如图2所示。接种完毕，将育苗箱的盖子扣在育苗箱下方的底盘上，将盖子上的通气孔关闭。

四、避光培养：

将接种完毕的育苗箱放置在已消毒完毕的栽培室培养架上，在18℃的温度条件下，避光培养25d。

菌丝首先在蛹体表面攀爬，蚕蛹的早期状态(避光培养第10天时)可通过蛹体环纹判断，由于蚕蛹自主活动而导致菌丝在环纹处断裂，如图3所示。避光培养结束时(第25天时)蚕蛹完全僵硬，用手捏柞蚕蛹，感觉非常硬实，环纹处被菌丝完全覆盖，如图4所示。本实施例采用外感法接种的蛹虫草僵化率在95％以上，比传统注射接种法高5％左右。

五、出草管理：

1.开口处理

避光培养结束时，在僵化的蚕蛹第一对小翅处进行开口处理，如图5所示。

具体操作过程：避光培养结束后，在僵化的蚕蛹第一对小翅出开口，将开口处理后的蚕蛹垂直放在育苗穴盘中，穴盘的上口径24mm，底部10mm深度36mm，单个穴15mL，如图6所示。

2.原基阶段

原基萌发周期：开口处理后进行见光培养，至开口处出现原基，这一时期为柞蚕蛹的原基萌发阶段。

具体操作过程：每天不少于10小时的光照；控制栽培室的昼夜温差5℃，即白天20℃，晚上15℃，栽培室内湿度控制在75％左右。经过7天的时间，原基萌发，其顶端即呈白色，顶端以下呈橙黄、橙色或红色的尖锥状小子实体，绝大多数呈单生，少数分枝生长，如图7所示。本实施例采用小翅开口处理的柞蚕蛹原基萌发周期比自然出草的柞蚕蛹原基萌发周期缩短了3～5d，出草率在95％以上，比自然出草法高5％左右，并且大幅度减少人工接种成本。

3.小子实体阶段

小子实体阶段周期：从原基萌发起，至小子实体高2～4cm，这一时期为柞蚕蛹的小子实体阶段。

具体操作过程：每天不少于10小时的光照；控制栽培室的温度20℃，栽培室内湿度控制在75％左右。经过3天的时间，原基变粗变长，顶端白色消失，小子实体高为1～2cm(如图8所示)，长圆锥型，呈橙色、橙黄、橙红色，再培养2～3天后，子实体高2～4cm(如图9所示)，进人子实体正常稳定的成长阶段。

4.子实体稳定成长阶段

子实体成长阶段周期：小子实体继续培养10～15天。

具体操作过程：每天不少于10小时的光照；控制栽培室的温度20℃，栽培室内湿度控制在75％左右。经过10～15天，子实体不再增粗伸长，头部膨大呈棒形，顶端呈钝圆或扁圆形或呈叶尖形的。子实体的上部略小，呈长圆柱形或扁圆形，有的柄中间具明显纵陷纹，全株呈橙色或橙红色。株高4～10cm(一般高5～8cm)，头部粗2～3mm，中部粗3～3mm(一般粗3～6mm)，基部粗4～10mm(一般粗4～7mm)，全株呈橙色或橙红色。从此子实体即进人成熟阶段，如图10所示。

5.子实体成熟阶段

子实体成熟阶段周期：子实体继续培养5天。

具体操作过程：每天不少于10小时的光照；控制栽培室的温度20℃，栽培室内湿度控制在75％左右。经过5天，子实体柄一般不再增粗伸长，顶端出现乳头状小突起并出现龟背状花纹，至此，子实体完全成熟(如图11所示)，全株呈橙色或橙红色，即可采收(如图12所示)。经高效液相色谱法对蛹虫草子实体的虫草素含量进行测定，蛹虫草的虫草素含量是采用注射接种法虫草素含量的2倍以上。

Claims (8)

1.一种蛹虫草的培育方法，其特征在于该培育方法按以下步骤进行：

一、将油莎豆粕水解液、葡萄糖酸钙母液和维生素C母液加入到去离子水中，充分搅拌后，灭菌，冷却至室温，得到灭菌后的液体培养基；无菌条件下，将蛹虫草母种接种于灭菌后的液体培养基中，接种量为5～10块/0.5cm³，并在18～22℃的温度条件和140～160r/min的转速条件下培养5～7d，得到液体生产种子；

二、无菌条件下，将液体生产种子接种于活体蚕蛹蛹皮表面，接种量为0.4～0.6mL/个蚕蛹个体；将接种后的活体蚕蛹在16～20℃的温度条件下，避光培养20～30d，得到僵化的蚕蛹；在僵化的蚕蛹的第一对小翅处进行开口处理，然后进行第1次光照和温差刺激，持续5～10d后，得到原基萌发阶段的蚕蛹；将原基萌发阶段的蚕蛹进行第2次光照和温度刺激，持续5～6d后，得到子实体初期阶段的蚕蛹；将子实体初期阶段的蚕蛹进行第3次光照和温度刺激，持续10～15d后，得到子实体成长阶段的蚕蛹；将子实体成长阶段的蚕蛹进行第4次光照和温度刺激，持续3～7d后，得到成熟的子实体，进行采收。

2.根据权利要求1所述的一种蛹虫草的培育方法，其特征在于步骤一中将油莎豆粕水解液、葡萄糖酸钙母液和维生素C母液加入到去离子水中，充分搅拌后，在121℃下灭菌30min，冷却至室温，得到灭菌后的液体培养基，所述油莎豆粕水解液、葡萄糖酸钙母液和维生素C母液与去离子水的体积比为10mL：2mL：1.5mL：1000mL。

3.根据权利要求1或2所述的一种蛹虫草的培育方法，其特征在于所述油莎豆粕水解液按以下步骤制备：将油莎豆粕加入到浓度为1.2％的硫酸溶液中，固液比为1：8，然后在123℃的温度条件下反应2h，固液分离后，得到初始水解液；将初始水解液经碳酸钙乳液中和至pH为3.5，再经1.0％活性炭脱色30min后，得到油莎豆粕水解液，油莎豆粕水解液中可溶性固形物的质量分数为10.0％，总还原糖的质量分数为8.0％；总还原糖由80％葡萄糖、15％阿拉伯糖和5％木糖组成。

4.根据权利要求1或2所述的一种蛹虫草的培育方法，其特征在于所述葡萄糖酸钙母液中可行性固形物的含量为4.5％、粗蛋白的含量为0.6％、粗脂肪的含量为0.4％、总糖的含量为0.85％、还原糖的含量为0.7％和葡萄糖酸钙的含量为3％，余量为水。

5.根据权利要求1或2所述的一种蛹虫草的培育方法，其特征在于所述维生素C母液中维生素C的含量为0.8～1.0％，古龙酸的含量为0.5～0.6％，余量为水。

6.根据权利要求1所述的一种蛹虫草的培育方法，其特征在于步骤二中采用数控定量接种机将液体生产种子接种于化蛹2～4d的活体蚕蛹蛹皮表面。

7.根据权利要求1所述的一种蛹虫草的培育方法，其特征在于步骤二中所述的第1次光照刺激为：每天不少于10h的光照；温差刺激为：昼夜温差5℃，白天20℃，晚上15℃，湿度为75％左右。

8.根据权利要求1所述的一种蛹虫草的培育方法，其特征在于步骤二中所述的第2次、第3次和第4次的光照刺激为：每天不少于10h的光照；温度刺激为：温度为20℃，湿度为75％左右。

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