CN104230566B - 一种快速培养黄绿蜜环菌菌丝体的培养基及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速培养黄绿蜜环菌菌丝体的培养基及培养方法，以解决现有黄绿蜜环菌菌丝体培养方法存在的菌丝生长速度极慢的问题。该培养基包括新鲜黄绿蜜环菌子实体，该方法包括黄绿蜜环菌菌丝体培养基制作方法以及黄绿蜜环菌接种与菌丝体培养。采用此方法培养的黄绿蜜环菌菌丝体生长良好，菌丝生长速度快。
Description
技术领域
本发明属于菌株培养领域，具体涉及黄绿蜜环菌菌丝体的培养方法。
背景技术
黄绿蜜环菌又名黄蘑菇、黄环菇、黄金菇等。属菌物界，担子菌门，伞菌纲，伞菌亚纲，伞菌目，伞菌科。学名：Armillaria luteo-virens。为青藏高原真菌资源宝库中的代表种之一。黄绿蜜环菌具有较高的食用、营养和药用价值，被誉为最具开发利用前景的珍稀名菌之一， 黄绿蜜环菌味道鲜美、营养丰富、价格昂贵，过度采摘使其濒临灭绝。目前不能进行人工栽培。
为了有效的保护传统珍稀真菌资源，人们进行了黄绿蜜环菌菌丝体分离及培养研究。黄绿蜜环菌菌丝体培养虽有报道，但菌丝生长速度极慢，需4个月之久。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速培养黄绿蜜环菌菌丝体的培养基，以解决现有黄绿蜜环菌菌丝体培养方法存在的菌丝生长速度极慢的问题。
本发明的另一个目的是提供一种快速培养黄绿蜜环菌菌丝体的培养方法。
本发明技术方案如下：一种快速培养黄绿蜜环菌菌丝体的培养基，由下述重量份的原料制成：马铃薯150.0份-200.0份、葡萄糖5.0份-10.0份、麦芽糖2.5份-5.0份、酵母浸膏1.0份-2.0份、蛋白胨1.0份-2.0份、KH2PO4 1.0份-2.0份、K2HPO4 1.0份-2.0份、MgSO4 0.5份-1.0份、黄绿蜜环菌子实体100.0份- 200.0份、琼脂15.0份-20.0份，加水1000.0ml，pH值为6.9。
优选的，一种快速培养黄绿蜜环菌菌丝体的培养基，由下述重量份的原料制成：马铃薯200.0份、葡萄糖10.0份、麦芽糖5.0份、酵母浸膏2.0份、蛋白胨2.0份、KH2PO4 1.0份、K2HPO4 1.0份、MgSO4 0.5份和黄绿蜜环菌子实体200.0份、琼脂20.0份，加水1000.0ml，pH值为6.9。
用上述黄绿蜜环菌菌丝体培养基培养黄绿蜜环菌菌丝体的方法，它包括如下步骤：A、黄绿蜜环菌菌丝体培养基制作：
a.黄绿蜜环菌滤液的制备：先将新鲜黄绿蜜环菌子实体或风干黄绿蜜环菌子实体加水打成糊状，过滤，汁液留用；滤渣再次加水打浆，过滤,汁液留用；合并2次汁液备用；
b. 马铃薯滤液的制备：马铃薯洗净去皮、去芽眼，切片，加水煮至酥而不烂，滤液备用；
c.将琼脂粉用冷水调成糊状，加水调匀，煮至琼脂粉全部溶化，制成琼脂液；d.将琼脂液与黄绿蜜环菌滤液和马铃薯滤液混合，加水至1000ml,加入培养基配方中剩余成分，搅拌煮沸溶化，成为黄绿蜜环菌菌丝体培养基。
B、黄绿蜜环菌接种与菌丝体培养:
将黄绿蜜环菌子实体放入体积浓度为0.1%的升汞溶液中浸泡10-20秒，灭菌，用无菌水冲洗，用灭菌接种刀切取菌柄与菌盖结合处的组织块，以无菌操作方式接种于灭菌后的黄绿蜜环菌菌丝体培养基平皿上,18-28℃条件下培养；30h后组织块上有菌丝萌发，3-6天菌丝开始生长；培养8-10天，菌丝在培养基上定植；无菌操作方法移出组织块，让菌丝体继续在原培养基上生长，培养25天，菌落有2cm时转接到试管黄绿蜜环菌菌丝体培养基上；22-28℃培养1个月，菌丝体可长满试管，成为黄绿蜜环菌母种。
优选的，上述步骤B中灭菌后的黄绿蜜环菌菌丝体培养基平皿的制作过程如下：e.将步骤c中的黄绿蜜环菌菌丝体培养基倒入三角瓶或试管中，塞入塞子密封；
f.将上述盛有培养基的三角瓶或试管进行高压蒸汽灭菌；0.05mpa时放冷气，继续升温到56℃，压力0.017mpa，维持30min，自然降温，压力降到0mpa时，打开灭菌器盖；取出三角瓶或试管，置于37℃温箱中孵化24h；再次重复上述灭菌程序，如此重复三次，完成黄绿蜜环菌菌丝体培养基灭菌工作；
g.黄绿蜜环菌菌丝体培养基平皿制作：将灭菌的平皿放入无菌操作台，将步骤f灭菌后的黄绿蜜环菌菌丝体培养基无菌操作倒入灭菌的平皿中，冷却，培养基凝固后倒置放置；
h.黄绿蜜环菌菌丝体培养基试管制作：将盛有培养基的试管趁热放置成斜面，斜面长度约为试管长度的2/3,冷却，培养基凝固后进行无菌检验。
新鲜黄绿蜜环菌（Armillaria luteo-virens) 子实体的来源:采摘于中国青海省海北州刚察县哈尔盖镇贡贡吗村金银滩草地。
本发明优点如下：1.本发明黄绿蜜环菌菌丝体培养基组方中加入了黄绿蜜环菌子实体，菌丝体培养效果特别好，生长速度快，做为进一步研究的试验材料和栽培试验的目种用；2.黄绿蜜环菌菌丝体培养基灭菌方法独特、巧妙、灭菌效果可靠；3.黄绿蜜环菌接种与菌丝体培养方法简单。
附图说明
图1是黄绿蜜环菌在本发明培养基上20天菌丝体生长情况图；
图2是黄绿蜜环菌在PDA培养基上20天菌丝体生长情况图。
具体实施方式
实施例1
培养基组成如下：马铃薯200.0g、葡萄糖10.0g、麦芽糖5.0g、酵母浸膏2.0g、蛋白胨2.0g、KH2PO4 1.0g、K2HPO4 1.0g、MgSO4 0.5g、黄绿蜜环菌子实体200.0g、琼脂20.0g，加水1000.0ml，pH值为6.9。
黄绿蜜环菌接种与菌丝体培养：将新鲜黄绿蜜环菌子实体放入体积浓度为0.1%的升汞溶液中浸泡10秒灭菌，无菌水冲洗，无菌纱布吸干多余水分。用灭菌接种刀切取菌柄与菌盖结合处的组织块，以无菌操作方式接种于黄绿蜜环菌菌丝体培养基平皿上,18℃条件下培养。30h后组织块上有菌丝萌发，3-6天菌丝开始生长。培养8天，菌丝在培养基上定植。无菌操作方法移出组织块，让菌丝体继续在原培养基上生长，培养25天，菌落有2cm时转接到试管黄绿蜜环菌菌丝体培养基上。22℃培养1个月，菌丝体可长满试管，成为黄绿蜜环菌母种，留作深层培养或进一步研究之用。
实施例2
培养基组成如下：马铃薯150.0g、葡萄糖5.0g、麦芽糖2.5g、酵母浸膏1.0g、蛋白胨1.0g、KH2PO4 2.0g、K2HPO4 2.0g、MgSO4 1.0g、黄绿蜜环菌子实体100.0g、琼脂15.0g，加水1000.0ml，pH值为6.9。
黄绿蜜环菌接种与菌丝体培养：将新鲜黄绿蜜环菌子实体放入体积浓度为0.1%的升汞溶液中浸泡20秒灭菌，无菌水冲洗，无菌纱布吸干多余水分。用灭菌接种刀切取菌柄与菌盖结合处的组织块，以无菌操作方式接种于黄绿蜜环菌菌丝体培养基平皿上,28℃条件下培养。30h后组织块上有菌丝萌发，3-6天菌丝开始生长。培养10天，菌丝在培养基上定植。无菌操作方法移出组织块，让菌丝体继续在原培养基上生长，培养25天，菌落有2cm时转接到试管黄绿蜜环菌菌丝体培养基上。28℃培养1个月，菌丝体可长满试管，成为黄绿蜜环菌母种，留作深层培养或进一步研究之用。
实施例3
培养基组成如下：马铃薯180.0g、葡萄糖8.0g、麦芽糖3.5g、酵母浸膏1.5g、蛋白胨1.5g、KH2PO4 1.5g、K2HPO4 1.5g、MgSO4 0.8g、黄绿蜜环菌子实体100.0g、琼脂18.0g，加水1000.0ml，pH值为6.9。
黄绿蜜环菌接种与菌丝体培养：将新鲜黄绿蜜环菌子实体放入体积浓度为0.1%的升汞溶液中浸泡15秒灭菌，无菌水冲洗，无菌纱布吸干多余水分。用灭菌接种刀切取菌柄与菌盖结合处的组织块，以无菌操作方式接种于黄绿蜜环菌菌丝体培养基平皿上,23℃条件下培养。30h后组织块上有菌丝萌发，3-6天菌丝开始生长。培养9天，菌丝在培养基上定植。无菌操作方法移出组织块，让菌丝体继续在原培养基上生长，培养25天，菌落有2cm时转接到试管黄绿蜜环菌菌丝体培养基上。25℃培养1个月，菌丝体可长满试管，成为黄绿蜜环菌母种，留作深层培养或进一步研究之用。
上述实施例1-3中黄绿蜜环菌菌丝体培养基制作如下：
a.黄绿蜜环菌滤液的制备：先将新鲜黄绿蜜环菌子实体或风干黄绿蜜环菌子实体加水用打浆机打成糊状，过滤，汁液留用。滤渣再次加入200ml水打浆，过滤,汁液留用。合并2次汁液备用。
b. 马铃薯滤液的制备：马铃薯洗净去皮、去芽眼，切成0.5×2×3的薄片，加水500ml煮至酥而不烂，滤液备用；
c.将琼脂粉用冷水调成糊状，加水调匀，文火或水浴煮至琼脂粉全部溶化，制成琼脂液。将琼脂液与黄绿蜜环菌滤液和马铃薯滤液混合，加水至1000ml,加入培养基配方中剩余成分，搅拌煮沸溶化，成为黄绿蜜环菌菌丝体培养基。
d.将上述黄绿蜜环菌菌丝体培养基倒入三角瓶，塞上棉塞，2层牛皮纸包裹。或倒入试管中，塞入棉塞或硅胶胶塞。
黄绿蜜环菌菌丝体培养基平皿的制作过程如下：
e.黄绿蜜环菌菌丝体培养基灭菌方法：将上述盛有培养基的三角瓶或试管进行高压蒸汽灭菌。0.05mpa时放冷气，继续升温到56℃（0.017mpa），维持30min，自然降温，压力降到0mpa时，打开灭菌器盖。取出三角瓶或试管，置于37℃温箱中孵化24h。再次重复上述灭菌程序，如此重复三次，完成黄绿蜜环菌菌丝体培养基灭菌工作。
f.黄绿蜜环菌菌丝体培养基平皿制作：将灭菌的平皿放入无菌操作台，将黄绿蜜环菌菌丝体培养以基无菌操作倒入灭菌平皿，冷却，培养基凝固后倒置放置。无菌检验合格后方可使用。
g.黄绿蜜环菌菌丝体培养基试管制作：将盛有培养基的试管趁热放置成斜面，斜面长度约为试管长度的2/3,冷却，培养基凝固后进行无菌检验，合格后方可使用。
实施例培养物的效果试验如下：
图1示出了黄绿蜜环菌在本发明培养基上菌丝体20天的生长情况，菌落直径为2.0cm。图2示出了黄绿蜜环菌在PDA培养基上菌丝体生长20天的情况,接种块未萌发，菌丝体未生长。结果表明：用本发明方法培养的菌丝体生长效果特别好，生长速度快，菌丝体粗壮、洁白、生长有力，可做为进一步研究的试验材料和栽培试验的目种用。
Claims (4)
1.一种快速培养黄绿蜜环菌菌丝体的培养基，其特征在于其由下述重量份的原料制成：
马铃薯150.0份-200.0份、葡萄糖5.0份-10.0份、麦芽糖2.5份-5.0份、酵母浸膏1.0份-2.0份、蛋白胨1.0份-2.0份、KH2PO4 1.0份-2.0份、K2HPO4 1.0份-2.0份、MgSO4 0.5份-1.0份、黄绿蜜环菌（Armillaria luteo-virens) 子实体100.0份- 200.0份、琼脂15.0份-20.0份，加水1000.0ml，pH值为6.9。
2.根据权利要求1所述的一种快速培养黄绿蜜环菌菌丝体的培养基，其特征在于其由下述重量份的原料制成：
马铃薯200.0份、葡萄糖10.0份、麦芽糖5.0份、酵母浸膏2.0份、蛋白胨2.0份、KH2PO41.0份、K2HPO4 1.0份、MgSO4 0.5份和黄绿蜜环菌子实体200.0份、琼脂20.0份，加水1000.0ml，pH值为6.9。
3.用权利要求1的黄绿蜜环菌菌丝体培养基培养黄绿蜜环菌菌丝体的方法，其特征在于它包括如下步骤：
A、黄绿蜜环菌菌丝体培养基制作：
a.黄绿蜜环菌滤液的制备：先将新鲜黄绿蜜环菌子实体或风干黄绿蜜环菌子实体加水打成糊状，过滤，汁液留用；滤渣再次加水打浆，过滤,汁液留用；合并2次汁液备用；
b. 马铃薯滤液的制备：马铃薯洗净去皮、去芽眼，切片，加水煮至酥而不烂，滤液备用；
c.将琼脂粉用冷水调成糊状，加水调匀，煮至琼脂粉全部溶化，制成琼脂液；d.将琼脂液与黄绿蜜环菌滤液和马铃薯滤液混合，加水至1000ml,加入培养基配方中剩余成分，搅拌煮沸溶化，成为黄绿蜜环菌菌丝体培养基；
B、黄绿蜜环菌接种与菌丝体培养:
将黄绿蜜环菌子实体放入体积浓度为0.1%的升汞溶液中浸泡10-20秒，灭菌，用无菌水冲洗，用灭菌接种刀切取菌柄与菌盖结合处的组织块，以无菌操作方式接种于灭菌后的黄绿蜜环菌菌丝体培养基平皿上,18-28℃条件下培养；30h后组织块上有菌丝萌发，3-6天菌丝开始生长；培养8-10天，菌丝在培养基上定植；无菌操作方法移出组织块，让菌丝体继续在原培养基上生长，培养25天，菌落有2cm时转接到试管黄绿蜜环菌菌丝体培养基上；22-28℃培养1个月，菌丝体长满试管，成为黄绿蜜环菌母种。
4.根据权利要求3所述的黄绿蜜环菌菌丝体培养基培养黄绿蜜环菌菌丝体的方法，其特征在于：步骤B中所述的灭菌后的黄绿蜜环菌菌丝体培养基平皿的制作过程如下：
e.将步骤c中的黄绿蜜环菌菌丝体培养基倒入三角瓶或试管中，塞入塞子密封；
f.将上述盛有培养基的三角瓶或试管进行高压蒸汽灭菌；0.05MPa时放冷气，继续升温到56℃，压力0.017MPa，维持30min，自然降温，压力降到0MPa时，打开灭菌器盖；取出三角瓶或试管，置于37℃温箱中孵化24h；再次重复上述灭菌程序，如此重复三次，完成黄绿蜜环菌菌丝体培养基灭菌工作；
g.黄绿蜜环菌菌丝体培养基平皿制作：将灭菌的平皿放入无菌操作台，将步骤f灭菌后的黄绿蜜环菌菌丝体培养基无菌操作倒入灭菌的平皿中，冷却，培养基凝固后倒置放置；
h.黄绿蜜环菌菌丝体培养基试管制作：将盛有培养基的试管趁热放置成斜面，斜面长度为试管长度的2/3,冷却，培养基凝固后进行无菌检验。
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