CN101911913B - 一种霍山石斛类原球茎快速增殖的简易培养基及其制备方法 - Google Patents
一种霍山石斛类原球茎快速增殖的简易培养基及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种霍山石斛类原球茎快速增殖的简易培养基及其制备方法。该培养基的配方为：改良的1/2MS培养基+食品级白砂糖+土豆。霍山石斛类原球茎在该简易培养基种生长良好，培养35天其平均生长量为0.672g/d，达到实验室中所用的经典MS培养基的1.37倍。该培养基的主要原料白砂糖和土豆价廉易得，其他成分用量小，制作方法简易，成本低廉，可以广泛用于霍山石斛类原球茎研究、开发和生产中的各个领域，尤其适合霍山石斛类原球茎的工业化大规模培养。本发明进一步促进了土豆的开发利用，具有显著的经济和社会意义。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种霍山石斛类原球茎快速增殖的简易培养基及其制备方法。
背景技术
石斛是一种常用的名贵中草药，具有滋阴清热、生津止渴、润肺止咳、久服厚肠胃、轻身延年等功效。而霍山石斛(Dendrobium huoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng)则被认为是石斛中的上品，这在《本草纲目》、《名医别录》、《本草纲目拾遗》、《证类本草》等古书籍中就有记载。现代药理研究证明，霍山石斛具有抗氧化、抗肿瘤、提高免疫功能以及显著的抗白内障活性。
霍山石斛，又名霍斛、米斛，产于安徽霍山及大别山区，对生长条件要求十分苛刻，繁殖能力低，生长周期长，加之生态环境破坏和人工过度采掘，目前野生霍山石斛资源已濒临灭绝。为了保护这一珍贵中药品种，许多学者对霍山石斛进行了无性快繁技术的研究，采用组织培养的方法已获得成功，这对于缓解野生资源紧张的局面、满足药材市场需求都有很重要的意义。
霍山石斛类原球茎是霍山石斛的体细胞胚，可由植株的不同部位诱导产生，具有和植株同样的物质代谢和形态发育潜能，可用来代替原药材生产相关的活性物质。由于，霍山石斛类原球茎的组织培养离不开培养基，因此，研究高效、廉价的霍山石斛类原球茎快速增殖的培养基至关重要。在现有技术中，霍山石斛类原球茎的培养基是MS培养基或改良的MS培养基。霍山石斛类原球茎在MS培养中虽然生长较好，但存在的问题是MS培养基价格较高，不适合规模化生产引用。因此，寻找一种价格低廉、快速增殖的霍山石斛类原球茎培养基是发展霍山石斛产业急需解决的课题。
发明内容
为了保证霍山石斛类原球茎在其中生长良好，增殖的霍山石斛类原球茎可代替原药材生产相关的活性物质；实现霍山石斛的规模化生产，缓解野生资源紧张的局面、满足药材市场的需求；本发明采用组织培养的方法保护霍山石斛，提供一种霍山石斛类原球茎快速增殖的简易培养基及其制备方法。
本发明的目的是基于以下构思实现的。首先，霍山石斛的培养条件要求苛刻，因此，培养基应含有较高的营养成分；其次，要适合大规模生产需要，因此，培养基成本要低。本发明人经过研究发现，在改良的1/2MS培养基中添加土豆汁是比较适合的原料。根据中国食物成分表，土豆营养十分丰富，100g土豆中含淀粉9～20g，蛋白质1.5～2.3g，脂肪0.1～1.1g，粗纤维0.6～0.8g，热量66～113J，钙11～60mg，磷15～68mg，铁0.4～4.8mg，硫胺素0.03～0.07mg，核黄素0.03～0.11mg，尼克酸0.4～1.1mg以及胡萝卜素和抗坏血酸。此外，土豆种植面广、产量大。本发明以土豆的加工利用和霍山石斛类原球茎的增殖为目标，研制出了一种简易培养基。
为了确定简易培养基的组成，本发明采用了正交试验法确定最佳配方组成。考虑蔗糖价格较高，选择食品级白砂糖代替蔗糖，表1中的基础培养基指MS、1/2MS中除蔗糖、琼脂以外的成分，因素水平设计见表1，正交试验安排见表2。
按照表2的安排配制培养基，每瓶分装45mL，每瓶接种5g霍山石斛类原球茎后，放置25℃培养间培养35天，收集霍山石斛类原球茎并进行霍山石斛类原球茎生长量和多糖含量测定，结果见表3，方差分析见表3。从表3可知，A2B3C1是实验最优组合，理论最优组合是A2B3C3。表3结果显示，白砂糖和土豆含量对霍山石斛类原球茎的生长有显著影响，而基础培养基的影响不显著。最后以MS培养基为对照，将实验最优组合A2B3C1、理论最优组合A2B3C3及组合A2B3C2做验证试验，结果分别为18.06、24.07、20.82、24.75g/瓶。
表1L9(33)正交试验的因素水平
表2正交试验安排、结果及分析
表3正交试验方差分析表
经以上试验结果得出，一种霍山石斛类原球茎快速增殖的简易培养基的组成为：
硝酸钾(KNO3)950mg/L、硝酸铵(NH4NO3)825mg/L、硫酸镁(MgSO4·7H2O)185mg/L、氯化钙(CaCl2·2H2O)220mg/L、磷酸二氢钾(KH2PO4)85mg/L、硫酸锰(MnSO4·H2O)8.45mg/L、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)4.3mg/L、硼酸(H3BO3)3.1mg/L、碘化钾(KI)0.415mg/L、钼酸钠(Na2MoO4.2H2O)0.125mg/L、硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.0125mg/L、氯化钴(CoCl2·6H2O)0.0125mg/L、乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA·2H2O)18.625mg/L、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)13.925mg/L、肌醇50mg/L、甘氨酸1mg/L、盐酸吡哆醇(VB6)0.25mg/L、烟酸(VB5)0.25mg/L、盐酸硫胺素(VB1)0.05mg/L、食品级白砂糖10～30g/L、土豆60～100g/L、琼脂5～6g/L；
其中硝酸钾、硝酸铵、硫酸镁、氯化钙、磷酸二氢钾为大量元素；硫酸锰、硫酸锌、硼酸、碘化钾、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴为微量元素；乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁为铁盐；肌醇、甘氨酸、盐酸吡哆醇、烟酸、盐酸硫胺素为有机元素；
pH值为6.0～6.2。
本发明简易培养基按以下操作步骤制备：
(1)配制母液
①大量元素母液的配制：分别称量上述大量元素10倍的量，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1L，得母液I；
②微量元素母液的配制：分别称量上述微量元素1000倍的量，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1L，得母液II；
③铁盐母液配制：分别称量上述铁盐100倍的量，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将乙二胺四乙酸二钠溶液加入到硫酸亚铁溶液中，边加边搅拌，最后定容到1L，得母液III；
④有机元素母液配制：分别称量上述有机元素100倍的量，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1L，得母液IV；
(2)制备土豆浆液
取去皮土豆，切成约2cm×2cm×2cm的小块，加适量水，煮熟后捣碎成土豆浆液；控制60～100g土豆制得460-500mL的土豆浆液；
(3)制备简易培养基
量取土豆浆液，煮沸后，加入琼脂，继续煮沸2分钟，然后加入适量母液I、母液II、母液III、母液IV和食品级白砂糖，定容至所需体积后，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.0～6.2，分装后灭菌即制得霍山石斛类原球茎快速增殖的简易培养基。
与现有技术相比：本发明具有如下优势：①霍山石斛类原球茎在本发明简易培养基中生长良好，培养35天其平均生长量为0.672g/d，达到实验室中所用的经典MS培养基的1.37倍；②该培养基的主要原料白砂糖和土豆价廉易得，其他成分用量小，制作方法简易，成本低廉，成本仅为MS培养基的60％左右；③该广泛培养基可用于霍山石斛类原球茎研究、开发和生产中的各个领域，尤其适合霍山石斛类原球茎的工业化大规模培养。
具体实施方式
以下实施例仅仅用来说明本发明，并不对本发明的范围构成任何限制。
实施例1：
霍山石斛类原球茎快速增殖的简易培养基由下列物质组成：
硝酸钾(KNO3)950mg/L、硝酸铵(NH4NO3)825mg/L、硫酸镁(MgSO4·7H2O)185mg/L、氯化钙(CaCl2·2H2O)220mg/L、磷酸二氢钾(KH2PO4)85mg/L、硫酸锰(MnSO4·H2O)8.45mg/L、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)4.3mg/L、硼酸(H3BO3)3.1mg/L、碘化钾(KI)0.415mg/L、钼酸钠(Na2MoO4.2H2O)0.125mg/L、硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.0125mg/L、氯化钴(CoCl2·6H2O)0.0125mg/L、乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA·2H2O)18.625mg/L、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)13.925mg/L、肌醇50mg/L、甘氨酸1mg/L、盐酸吡哆醇(VB6)0.25mg/L、烟酸(VB5)0.25mg/L、盐酸硫胺素(VB1)0.05mg/L、食品级白砂糖10g/L、土豆60g/L、琼脂6g/L。
其中硝酸钾、硝酸铵、硫酸镁、氯化钙、磷酸二氢钾为大量元素；硫酸锰、硫酸锌、硼酸、碘化钾、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴为微量元素；乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁为铁盐；肌醇、甘氨酸、盐酸吡哆醇、烟酸、盐酸硫胺素为有机元素；
发明中使用的琼脂为粉状琼脂；
简易培养基pH值为6.2。
霍山石斛类原球茎快速增殖简易培养基的制备方法如下：
步骤1：配制母液
①制大量元素母液(母液I)：按上述大量元素含量的10倍分别称量，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1L，贮存于试剂瓶中；
②配制微量元素母液(母液II)：按上述微量元素含量的1000倍分别称量，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1L，贮存于试剂瓶中；
③配制铁盐母液(母液III)：按上述铁盐含量的100倍分别称量，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将Na2-EDTA·2H2O溶液加入到FeSO4·7H2O溶液中(边加边搅拌)，最后定容到1L，贮存于棕色试剂瓶中；
④配制有机元素母液(母液IV)：按上述有机元素含量的100倍分别称量，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1L，贮存于试剂瓶中；
步骤2：制备土豆浆液
取去皮土豆60g，切成约2cm×2cm×2cm的小块，加入300mL水，煮熟，再加入100mL冷水后转入组织捣碎机捣碎成土豆浆液，得土豆浆液460mL；
步骤3：制备简易培养基
取460mL土豆浆液，煮沸后加入6g琼脂，继续煮沸2分钟(边煮边搅拌)，然后加入100mL母液I、1mL母液II、10mL母液III、10mL母液IV和10g食品级白砂糖，搅拌使其溶解后，用水定容至1000mL，最后用0.1mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液调节pH至6.2，分装后灭菌即制得简易培养基。
实施例2
霍山石斛类原球茎快速增殖的简易培养基由下列物质组成：食品级白砂糖20g/L、土豆80g/L、琼脂5.5g/L、其它成分同实施例1；
简易培养基pH值为6.2。
霍山石斛类原球茎快速增殖简易培养基的制备方法如下：
步骤1：配制母液
同实施例1。
步骤2：制备土豆浆液
取去皮土豆80g，切成约1-2cm厚薄片，放入豆浆机中，再加入400mL水，边加热边捣碎，得土豆浆液475mL；
步骤3：制备简易培养基
取475mL土豆浆液，煮沸后加入5.5g琼脂，继续煮沸2分钟，边煮边搅拌，然后加入100mL母液I、1mL母液II、10mL母液III、10mL母液IV和20g食品级白砂糖，搅拌使其溶解后，用水定容至1000mL，最后用0.1mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液调节pH至6.2，分装后灭菌即制得简易培养基。
实施例3：
霍山石斛类原球茎快速增殖的简易培养基由下列物质组成：食品级白砂糖30g/L、土豆100g/L、琼脂5.0g/L、其它成分同实施例1；
简易培养基pH值为6.0。
霍山石斛类原球茎快速增殖的简易培养基的制备方法如下：
步骤1：配制母液
同实施例1。
步骤2：制备土豆浆液
取去皮土豆100g，切成约2cm×2cm×2cm的小块，加入300mL水，煮熟，再加入100mL冷水后转入组织捣碎机捣碎成土豆浆液，得土豆浆液490mL；
步骤3：制备简易培养基
取490mL土豆浆液，煮沸后加入5g琼脂，继续煮沸2分钟，边煮边搅拌，然后加入100mL母液I、1mL母液II、10mL母液III、10mL母液IV和30g食品级白砂糖，搅拌使其溶解后，用水定容至1000mL，最后用0.1mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液调节pH至6.0，分装后灭菌即制得简易培养基。
Claims (1)
1.一种霍山石斛类原球茎快速增殖的简易培养基，其特征在于：由下列重量份的物质组成：硝酸钾950mg/L、硝酸铵825mg/L、硫酸镁185mg/L、氯化钙220mg/L、磷酸二氢钾85mg/L、硫酸锰8.45mg/L、硫酸锌4.3mg/L、硼酸3.1mg/L、碘化钾0.415mg/L、钼酸钠0.125mg/L、硫酸铜0.0125mg/L、氯化钴0.0125mg/L、乙二胺四乙酸二钠18.625mg/L、硫酸亚铁13.925mg/L、肌醇50mg/L、甘氨酸1mg/L、盐酸吡哆醇0.25mg/L、烟酸0.25mg/L、盐酸硫胺素0.05mg/L、白砂糖10～30g/L、土豆60～100g/L、琼脂5～6g/L；
其中硝酸钾、硝酸铵、硫酸镁、氯化钙、磷酸二氢钾为大量元素；硫酸锰、硫酸锌、硼酸、碘化钾、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴为微量元素；乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁为铁盐；肌醇、甘氨酸、盐酸吡哆醇、烟酸、盐酸硫胺素为有机元素；
简易培养基pH值为6.0～6.2；
霍山石斛类原球茎快速增殖的简易培养基的制备方法包括以下操作步骤：
(1)配制母液
①大量元素母液的配制：分别称量上述大量元素10倍的量，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1L，得母液I；
②微量元素母液的配制：分别称量上述微量元素1000倍的量，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1L，得母液II；
③铁盐母液配制：分别称量上述铁盐100倍的量，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将乙二胺四乙酸二钠溶液加入到硫酸亚铁溶液中，边加边搅拌，最后定容到1L，得母液III；
④有机元素母液配制：分别称量上述有机元素100倍的量，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1L，得母液IV；
(2)制备土豆浆液
取去皮土豆，切成约2cm×2cm×2cm的小块，加适量水，煮熟后捣碎成土豆浆液；控制60～100g土豆制得460-500mL的土豆浆液；
(3)制备简易培养基
量取土豆浆液，煮沸后，加入琼脂，继续煮沸2分钟，然后加入适量母液I、母液II、母液III、母液IV和食品级白砂糖，定容至所需体积后，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.0～6.2，分装后灭菌即制得霍山石斛类原球茎快速增殖的简易培养基。
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