CN115777536B

CN115777536B - 一种利用白花前胡的茎建立高效再生体系的方法

Info

Publication number: CN115777536B
Application number: CN202211527243.1A
Authority: CN
Inventors: 何东林; 张宗铭; 谭艳平; 邹家辉; 李欣芳
Original assignee: Hubei Eda Biotechnology Co ltd; South Central University for Nationalities
Current assignee: Hubei Eda Biotechnology Co ltd; South Central Minzu University
Priority date: 2022-11-30
Filing date: 2022-11-30
Publication date: 2023-08-18
Anticipated expiration: 2042-11-30
Also published as: CN115777536A

Abstract

本发明属于植物组织培养快速繁殖技术领域，特别涉及一种利用白花前胡的茎建立高效再生体系的方法，步骤包括茎的切割处理，外植体的诱导、继代培育，愈伤组织的分化培养和丛生芽的生根培养。本发明旨在以白花前胡的茎为外植体，提供建立愈伤诱导、愈伤分化、丛生苗生根等再生体系的详细过程与方法。

Description

一种利用白花前胡的茎建立高效再生体系的方法

技术领域

本发明属于植物组织培养快速繁殖技术领域，特别涉及一种利用白花前胡的茎建立高效再生体系的方法。

背景技术

由于长期的人工栽培导致前胡种资源退化、前胡根部从之前的单根转变为较多分叉的多根，不仅品质下降还难以切割形成饮片。种子繁殖萌发率低，出苗不整齐，生长周期长。另外，前胡栽培品种一般次年就出现抽薹现象，这些问题严重制约了前胡的可持续发展，既难满足中草药市场需求，又增大了种植成本。利用植物组织培养技术可以保持母本的优良性状，避免遗传变异和种性退化，高繁殖率为前胡工厂化育苗提供可能。

现有研究均认为白花前胡的叶片最适合作为快速繁育的部位，例如“《宁前胡愈伤组织诱导初探》，吴沿胜等，种子，2017年第9期”中就对白花前胡的根、茎、叶在不同激素组合下的诱导情况进行了公开，最终得出结论为“白花前胡叶片的诱导效果最好，其次分别是茎段和根”。然而，通过实验重现发现叶的实际诱导效果并不好、远远低于茎的诱导效果，随后经过分析发现了叶作为外植体的明显缺陷：由于放入培养基中的叶需要切成0.25cm²大小，培养时叶的边沿容易翘起，一方面叶自身厚度较薄，边沿创口处的水分容易丧失，另一方面叶翘起离开培养基表面，进而影响边沿创口的愈伤诱导，导致的结果是叶片很容易丧失水分变干、如果不时刻注意进行补水则叶片诱导形成愈伤组织的成功率非常低，但进行补水会改变培养基的成分浓度导致数据不准且培养步骤复杂。相比之下，茎呈杆状、很容易贴合培养基表面，既利于保持本身组织水分又利于营养吸收，整个快速繁育过程中都不需要补水，茎的培养难度明显低于叶片、更适合工厂化育苗。

因此，本发明旨在以白花前胡的茎为外植体，提供建立愈伤诱导、愈伤分化、丛生苗生根等再生体系的详细过程与方法。

发明内容

为了实现上述目的，本发明提供了一种利用白花前胡的茎建立高效再生体系的方法，包括以下步骤：

步骤1.茎的切割处理：选出白花前胡的茎，消毒后切成长度1.0cm的茎段，在茎段外切割2～4条纵向的创口，所述创口整体均匀环绕着茎段切割；每条创口的深度大于茎表皮的厚度，每条创口的深度小于茎段直径的三分之一，每条创口的长度小于茎段长度的四分之一；

步骤2.诱导、继代培育：将经过步骤1切割处理后的茎段放入愈伤组织诱导培养基，所述愈伤组织诱导培养基为1/2MS+NAA0.4mg/L+TDZ 0.1mg/L+植物凝胶3.5g/L+蔗糖35g/L，光照条件为黑暗或弱光，培养3周后进行继代培养，继代培养基为1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2 mg/L+植物凝胶3.5g/L+蔗糖40g/L，光照条件为黑暗或弱光，继代培养时间为1～2周，得到白花前胡愈伤组织；

步骤3.分化培养：将经过步骤2培养形成的愈伤组织切分为0.5cm³的小方块，再接种到分化培养基，所述分化培养基为1/2MS+6-BA0.8 mg/L+NAA0.2 mg/L+植物凝胶3.5g/L+蔗糖40g/L，光照条件为时长为12h/d，培养时间为4～5周，得到白花前胡丛生芽；

步骤4.生根培养：将经过步骤3培养形成的丛生芽的芽苗长至2-3cm时、从基部切下成为单芽，再接种到生根培养基，所述生根培养基为1/2MS+NAA0.2 mg/L+植物凝胶3g/L+蔗糖40g/L，光照条件为时长为12h/d，培养时间为5～6周，得到生根的白花前胡无菌组培苗。

而且，步骤1中消毒是先用75％乙醇消毒10min、无菌水冲洗3～5次，再用8％次氯酸钠消毒15min、无菌水冲洗3～5次。

而且，步骤1中每条创口均延伸至茎段的端部，即每条创口均将茎段的端部切开；所述纵向是从茎段的一端到茎段的另一端的方向。

而且，步骤2中培养基的pH为5.8～6.0，1/2MS是指基础培养基为1/2MS培养基。

而且，步骤3中培养基的pH为5.8～6.0，温度为25℃，空气相对湿度为40％～60％，光照强度为1500～2000lx。

而且，步骤4中培养基的pH为5.8～6.0，温度为25℃，空气相对湿度为40％～60％，光照强度为1500～2000lx。

而且，步骤4中基部是茎与根交界的部分。

与现有技术相比，本技术方案的有益效果在于：1、打破用叶作为外植体的固有思想，提供了以白花前胡的茎为外植体，优化茎的处理方式、各培养基成分与配方，使得愈伤活性、出愈伤率均高于同条件下的叶，并且分化能力强、生根效果好；2、茎段进行特殊切割处理，对茎段纵向切开多道创口，通过创口处提高细胞活性缩短愈伤诱导时间、增加愈伤诱导的初始表面积，对创口位置、数量、深度、长度均提供了最佳方案；3、利用茎呈杆状、很容易贴合培养基表面的特点，整个培育过程不需要进行补水，简化了培养步骤、降低了培养难度；4、优化了各培养基成分与配方，诱导与继代的培养基成分不同，经对比实验验证，诱导培养基的诱导率高达96.00％，继代培养基的增殖系数为4.98，通过诱导、再继代培育所获得愈伤组织生长状态和体积显著由于仅经过诱导培育所得的愈伤组织，更利用后面进行分化培养和生根培养；5、愈伤组织的诱导、继代培育的总时间4～5周，生根时间5～6周，所用时间相比现有技术有显著缩短，降低了培养用时的周期；6、消毒过程采用次氯酸钠代替含汞的溶液，降低了对环境的潜在污染，对环境更友好，并提供了最优的次氯酸钠浓度。

附图说明

图1为本发明实施例利用茎诱导的愈伤组织；

图2为本发明实施例愈伤组织的分化结果；

图3为本发明实施例丛生芽的增殖结果；

图4为本发明实施例丛生芽的生根结果；

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细具体说明，本发明的内容不局限于以下实施例。

一、外植体灭菌：以长势良好的白花前胡植株的茎为外植体材料，分别用75％乙醇消毒10min，无菌水冲洗3～5次；然后用不同溶度的次氯酸钠分别对茎消毒15min，无菌水冲洗3～5次后，用无菌滤纸吸干表面的水分，无菌手术刀将茎切成长度为1.0cm的小段。

本实施例中用75％乙醇+不同浓度次氯酸钠对茎消毒，是通过消毒剂筛选实验，得到茎消毒的结果而确定的；结果如下。

表1不同浓度的次氯酸钠对前胡茎段的影响

由表1可知，本实施例的75％乙醇消毒10min+8％次氯酸钠对宁前胡茎外植体消毒效果好、成活率高。

二、茎的切割处理：在茎段外切割2～4条纵向的创口(所述纵向即从茎段的一端到茎段的另一端的方向)，所述创口整体均匀环绕着茎段切割，每条创口将茎段的端部切开，每条创口的深度大于茎表皮的厚度，每条创口的深度小于茎段直径的三分之一，每条创口的长度小于茎段长度的四分之一。上述切割方法与限制条件既能保证创口处细胞活性缩短愈伤诱导的时间，又能增加愈伤诱导的初始表面积。

创口的深度限制条件和长度限制条件是为了在切开表皮增加愈伤诱导的初始表面积的同时不能切的过深。创口整体均匀环绕着茎段切割，且每条创口将茎段的端部切开则是利用茎呈杆状的特点、即使端部翘起也是朝向多个方向、不可能全部离开培养基表面，而不是像叶翘起方向单一导致叶片边沿全部离开培养基表面。

切割处理后茎所需愈伤诱导的时间与叶所需愈伤诱导的时间基本相同，且诱导率明显高于叶。

三、外植体的诱导、继代培育：将处理后的茎作为外植体接种到诱导培养基中，黑暗或者弱光条件下培养，通过不同激素组合筛选不同外植体愈伤组织诱导和继代的最佳条件，培养时间4～5周。

每个培养基处理外植体30个，重复三次实验，记录其诱导率、首次出愈时间以及愈伤生长状态。

实施例中最优的外植体愈伤诱导培养基组合如下：

表2不同激素组合对外植体愈伤组织诱导的影响

由表2可知，茎作为外植体的最佳诱导培养基为：1/2MS+NAA 0.4mg/L+TDZ0.1mg/L+植物凝胶3.5g/L+蔗糖35g/L，最高诱导率达96.00％；pH为5.8～6.0。培养时间为3周。

作为对比例，本方案也用白花前胡的叶按照表2完全相同的条件进行了对比实验，实验发现叶作为外植体的最佳诱导培养基也为：1/2MS+NAA0.4mg/L+TDZ 0.1mg/L+植物凝胶3.5g/L+蔗糖35g/L，但诱导率仅为90.13％，没有茎的效果好。不仅如此，每一组对比例中叶的诱导率都低于茎，其核心原因就是:叶自身厚度较薄，边沿创口处的水分容易丧失导致叶的边沿容易翘起；叶翘起离开培养基表面，进而影响边沿创口的愈伤诱导。

随后进行继代培养：

表3不同外植体诱导愈伤组织的比较

表4不同激素组合对愈伤组织继代的影响

由表4可知，本发明实施例的白花前胡愈伤组织的最佳继代培养基为，1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2 mg/L+植物凝胶3.5g/L+蔗糖40g/L，pH为5.8～6.0对白花前胡愈伤组织增殖效果最好，愈伤生长状态较好，体积较大，增殖系数为4.98。继代培养时间为1～2周。即诱导、继代所需的总时间为4～5周。

四、愈伤组织的分化培养：将愈伤组织团块切分为体积约0.5cm³的小方块、接种到分化培养基上，在温度为25℃，空气相对湿度保持在40％～60％，光照时长为12h/d，光照强度为1500～2000lx植物组织培养室内培养，培养出株高为3～4cm的白花前胡丛生芽，培养时间4～5周。

本发明实施例通过激素组合对不定芽分化影响的实验，见表5可知，最佳分化培养基为：1/2MS+6-BA0.8 mg/L+NAA0.2 mg/L+植物凝胶3.5g/L+蔗糖40g/L，pH为5.8～6.0。此分化培养基对不定芽的分化效果最明显，诱导出的不定芽芽体数量多且壮实、长势好、叶色浓绿。

每种不同激素和不同浓度的培养基接入30个愈伤组织块，3次实验重复。接种30天后，观察其状态、颜色、分化及生长情况。

表5不同激素组合对愈伤组织分化的影响

五、丛生芽的生根培养：选取生长健壮的白花前胡丛生芽，将其切成单芽转接到生根培养基中，即芽苗长至2-3cm时自基部切下，保持植物组织培养室内培养条件不变，培养5～6周，得到生根的白花前胡无菌组培苗。

通过不同激素组合对白花前胡生根影响的实验，观察记录生根情况，于20d时统计生根率。见表6可知，本发明实施例的白花前胡植株再生体系中，白花前胡丛生芽的最佳生根培养基为1/2MS+NAA0.2 mg/L+植物凝胶3g/L+蔗糖40g/L。pH为5.8～6.0。

表6不同激素组合对丛生芽生根的影响

Claims

1.一种利用白花前胡的茎建立高效再生体系的方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤1.茎的切割处理：选出白花前胡的茎，消毒后切成长度1.0cm的茎段，在茎段外切割2～4条纵向的创口，所述纵向是从茎段的一端到茎段的另一端的方向，所述创口整体均匀环绕着茎段切割，每条创口均延伸至茎段的端部；每条创口的深度大于茎表皮的厚度，每条创口的深度小于茎段直径的三分之一，每条创口的长度小于茎段长度的四分之一；

步骤2.诱导、继代培育：将经过步骤1切割处理后的茎段放入愈伤组织诱导培养基，所述愈伤组织诱导培养基为1/2MS+NAA 0.4mg/L+TDZ 0.1mg/L+植物凝胶3.5g/L+蔗糖35g/L，光照条件为黑暗或弱光，培养3周后进行继代培养，继代培养基为1/2MS+6-BA 1.0mg/L+NAA0.2mg/L+植物凝胶3.5g/L+蔗糖40g/L，光照条件为黑暗或弱光，继代培养时间为1～2周，得到白花前胡愈伤组织；

步骤3.分化培养：将经过步骤2培养形成的愈伤组织切分为0.5cm³的小方块，再接种到分化培养基，所述分化培养基为1/2MS+6-BA 0.8mg/L+NAA 0.2mg/L+植物凝胶3.5g/L+蔗糖40g/L，光照时长为12h/d，培养时间为4～5周，得到白花前胡丛生芽；

步骤4.生根培养：经过步骤3培养形成的丛生芽的芽苗长至2-3cm时、将其从基部切下成为单芽，再接种到生根培养基，所述生根培养基为1/2MS+NAA 0.2mg/L+植物凝胶3g/L+蔗糖40g/L，光照时长为12h/d，培养时间为5～6周，得到生根的白花前胡无菌组培苗。

2.根据权利要求1所述的利用白花前胡的茎建立高效再生体系的方法，其特征在于：步骤1中消毒是先用75％乙醇消毒10min、无菌水冲洗3～5次，再用8％次氯酸钠消毒15min、无菌水冲洗3～5次。

3.根据权利要求1所述的利用白花前胡的茎建立高效再生体系的方法，其特征在于：步骤2中培养基的pH为5.8～6.0，1/2MS是指基础培养基为1/2MS培养基。

4.根据权利要求1所述的利用白花前胡的茎建立高效再生体系的方法，其特征在于：步骤3中培养基的pH为5.8～6.0，温度为25℃，空气相对湿度为40％～60％，光照强度为1500～2000lx。

5.根据权利要求1所述的利用白花前胡的茎建立高效再生体系的方法，其特征在于：步骤4中培养基的pH为5.8～6.0，温度为25℃，空气相对湿度为40％～60％，光照强度为1500～2000lx。

6.根据权利要求1所述的利用白花前胡的茎建立高效再生体系的方法，其特征在于：步骤4中基部是茎与根交界的部分。