CN115413581B - 植物增殖培养基及其促进植物组培苗不定根再生的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物组织培养技术领域，具体为植物增殖培养基及其促进植物组培苗不定根再生的方法，植物增殖培养基，以1/2MS培养基为基础培养基，1/2MS培养基中包括以下浓度的组分：0.1～1.0ug/LKarrikins、28‑32g/L蔗糖、8‑10g/L琼脂及1.2‑1.8g/L活性炭，解决了赤霞珠葡萄组培苗继代增殖不定根发生困难的技术问题，优化了不定根的生长。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及植物增殖培养基及其促进植物组培苗不定根再生的方法。
背景技术
组织培养技术就是将植物体的细胞、组织、器官采用无菌操作的方法，使其在人工条件及外源激素的作用下继续生长，并分化发育成完整的小植株。该技术可用于新品种的快速繁殖，老品种的培养复壮，不受季节、地区、气候、病虫等因素影响，可周年进行生产。组织培养可快速提供生长整齐一致、无病虫害的优质种苗，是实现无性繁殖作物快速育苗的有效途径。
葡萄(Vitis viniferaL.)为葡萄科(VitaceaeJuss.)葡萄属(VitisL.)木质藤本植物，因其品种较多、口感极佳、营养丰富，所以在世界范围内广泛种植。近年来，随着葡萄种植面积不断扩大，人们对葡萄苗木的数量需求与品质要求日益提高，而利用传统方法繁殖葡萄苗木具有成苗率低、种条质量良莠不齐、存在病毒隐患等缺点，越来越不适应葡萄产业的健康可持续发展。随着植物组织培养技术的不断成熟，通过植物组织培养繁殖葡萄，不会受到季节的约束，且繁殖的数量和速度可观，对葡萄的大规模生产应用具有积极的作用。
葡萄组织培养最早始于1944年，morel.G进行葡萄的离体培养，我国曹孜义等先后开展了葡萄组织培养研究(李国树，邱璐，徐成东，等.葡萄组织培养快速繁殖体系研究[J].北方园艺，2011(9):134－136.毛明珍，田海山，吕昌文.葡萄试管苗繁殖技术研究[J].新疆农业科学，1984，21(4):22-23，50.徐庆玉，张秀清，王春英，等.葡萄的组织培养及其应用[J].山东农业科学，1987，19(4):23-24)，其目的在于加快优良品种繁殖；之后国内普遍开展了葡萄茎尖(或茎段)组织培养的研究工作，甘肃农业大学葡萄试管繁殖研究组经过一系列研究，于1985年正式通过鉴定，实现了葡萄小型化育苗；黄贞光等通过对葡萄离体培养接种、继代繁殖、生根等研究，筛选出适合多个品种生长的广谱培养基-B5培养基(黄贞光，谭素英，李四俊，等.葡萄组织培养快速繁殖及微茎尖培养研究[J].果树科学，1990，7(1):13-18)；李国树等研究表明，外植体以茎尖为最佳，并对茎尖愈伤组织诱导、茎叶分化以及生根培养进行了研究(李国树，邱璐，徐成东，等.葡萄组织培养快速繁殖体系研究[J].北方园艺，2011(9):134－136)。
葡萄主要通过无性繁殖保持其优良性状，不定根的形成对葡萄茎段的成活率有决定作用。不定根是植物的茎或叶等非中柱鞘组织产生的根，多数木本植物不定根发生难度较大，从而阻碍了无性繁殖技术的应用，尤其是制约了诸多果树、林木和木本花卉的工厂化育苗。目前，不定根发生困难是诸多木本植物无性繁殖和工厂化育苗的瓶颈问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种植物增殖培养基及其促进植物组培苗不定根再生的方法。
植物增殖培养基，以1/2MS培养基为基础培养基，1/2MS培养基中包括以下浓度的组分：0.1～1.0ug/LKarrikins、28-32g/L蔗糖、8-10g/L琼脂及1.2-1.8g/L活性炭。
优选的，所述Karrikins用无菌水或5％甲醇溶液溶解，并于-20℃保存。
优选的，以1/2MS培养基为基础培养基，1/2MS培养基中包括以下浓度的组分：1.0ug/LKarrikins、30g/L蔗糖、9g/L琼脂及1.5g/L活性炭。
一种利用植物增殖培养基促进植物组培苗不定根再生的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取植物的茎段进行初代培养，得到无菌苗；
(2)将步骤(1)得到的无菌苗转接到权利要求1-3任一项所述的植物增殖培养基中，进行继代增殖培养；
(3)继代增殖后管理。
优选的，步骤(1)中的植物为赤霞珠葡萄。
优选的，初代培养的步骤为：
(1)以植物的茎段为外植体；
(2)将所述茎段消毒处理后，接种到芽启动培养基上培养25～30天获得无菌苗。
优选的，芽启动培养基以1/2MS为基础培养基，还包括以下浓度的组分：0.2～1.0mg/L 6-BA、0.2～1.0mg/L IBA、28～32g/L蔗糖、8～10g/L琼脂、1.2～1.8g/L活性炭。
优选的，步骤(2)中所述继代增殖培养的条件为：培养温度为26℃，照度2500lux-3000lux、每日16h光照、8h黑暗。
优选的，步骤(3)中所述继代增殖后管理具体为：控制组培室的温度和光照时间，使组培室温度为26℃，照度2500lux、每日16h光照、8h黑暗。
在本发明中，所述继代增殖培养基，包含0.1～1.0ug/L Karrikins(KARS)，这个浓度范围是最优的，低于0.1ug/LKarrikins，对不定根的促进作用不明显；高于1.0ug/LKarrikins，则对不定根的生长反而有抑制作用。
在本发明中，增殖培养基，以1/2MS培养基为基础培养基，包含2.215g/L MS。MS的特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，用于诱导愈伤组织，也可用于胚、茎段、茎尖及花药的培养。蔗糖不仅作为培养基中的碳源和能源，还起着维持培养基渗透压的作用。琼脂化学结构稳定，在96℃时融化成液体，冷却到45℃以下即重新凝固，在培养基中起凝固剂的作用。优点是用琼脂配制的固体培养基清晰透明，便于观察和记录不定根的生长情况。培养基中活性炭的加入可以促进或抑制离体生长。活性炭给培养物创造了暗环境，产生了对生长抑制物的吸附作用，对生长调节剂及其他有机物的吸附作用，还有对其所吸附的生长促进物质的释放作用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：针对赤霞珠葡萄组培苗继代增殖困难及不定根生根困难的技术问题，通过用Karrikins替代市场中继代增殖培养基组分中的外源植物激素组成，优化了赤霞珠葡萄组培苗不定根生长不良的技术难题，首次获得了赤霞珠葡萄组培苗高效增殖。本发明的方法可用于赤霞珠葡萄优系工厂化试管育苗，可为生产用苗快速提供优质苗木，具有很好的实际开发和应用前景。
附图说明
图1为赤霞珠葡萄茎段在对比例1、对比例2与实施例中的增殖情况；
A、B为赤霞珠葡萄组培苗在继代增殖培养基1/2MS+30g/L蔗糖+9g/L琼脂+1.5g/L活性炭上的增殖生长，C、D1/2MS+0.2mg/LIBA+0.2mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+9g/L琼脂+1.5g/L活性炭上的增殖生长；
E、F为赤霞珠葡萄组培苗在继代增殖培养基1/2MS+0.1ug/LKarrikins+30g/L蔗糖+9g/L琼脂+1.5g/L活性炭上的增殖生长，G、H为1/2MS+1.0ug/LKarrikins+30g/L蔗糖+9g/L琼脂+1.5g/L活性炭上的增殖生长。葡萄组培苗的不定根在添加了Karrikins的继代增殖培养基上生长效果更好。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
在本发明中，1/2MS培养基组成如表1
实施例1
植物增殖培养基的成分为1/2MS+0.1ug/L Karrikins+30g/L蔗糖+9g/L琼脂+1.5g/L活性炭；所述Karrikins用无菌水溶解，配置好母液并于-20℃保存。
利用该植物增殖培养基促进植物组培苗不定根再生的方法，包括以下步骤：
(1)取赤霞珠葡萄苗的茎段进行初代培养，茎段的长度为1cm，且留有1个芽眼、1片叶，进行初代培养，得到无菌苗，初代培养的步骤：1)以选取的茎段为外植体；2)将所述茎段消毒处理后，接种到芽启动培养基上培养25～30天获得无菌苗；消毒处理包括依次进行的酒精浸泡和次氯酸钠溶液浸泡：体积浓度为65％的酒精浸泡0.5min，有效氯含量为4％的次氯酸钠溶液浸泡8min，在消毒过程中可以选用体积浓度为65％～75％的酒精浸泡0.5～1.5min，有效氯含量为4～6％的次氯酸钠溶液浸泡8～10min；
初代培养的条件：控制组培室的温度和光照时间，使组培室温度为26℃，照度2500lux、每日16h光照、8h黑暗；
芽启动培养基以1/2MS为基础培养基，还包括以下浓度的组分：0.2mg/L 6-BA、0.2mg/L IBA、30g/L蔗糖、9g/L琼脂、1.5g/L活性炭；
(2)将步骤(1)得到的无菌苗转接到成分为1/2MS+0.1ug/L Karrikins+30g/L蔗糖+9g/L琼脂+1.5g/L活性炭的植物增殖培养基中，在温度为26℃，照度2500lux、每日16h光照、8h黑暗的条件下进行继代增殖培养；
(3)控制组培室的温度和光照时间，使组培室温度为26℃，照度2500lux、每日16h光照、8h黑暗，培养2周后不定根开始萌发，4周后获得伸长生长的绿色无菌苗。
实施例2
植物增殖培养基的成分为1/2MS+1.0ug/L Karrikins+30g/L蔗糖+9g/L琼脂+1.5g/L活性炭；所述Karrikins用无菌水溶解，配置好母液并于-20℃保存。
利用该植物增殖培养基促进植物组培苗不定根再生的方法，包括以下步骤：
(1)取赤霞珠葡萄苗的茎段进行初代培养，茎段的长度为2cm，且留有1个芽眼、1片叶，进行初代培养，得到无菌苗，初代培养的步骤：1)以选取的茎段为外植体；2)将所述茎段消毒处理后，接种到芽启动培养基上培养25～30天获得无菌苗；消毒处理包括依次进行的酒精浸泡和次氯酸钠溶液浸泡：体积浓度为70％的酒精浸泡1min，有效氯含量为5％的次氯酸钠溶液浸泡9min；
初代培养的条件：控制组培室的温度和光照时间，使组培室温度为26℃，照度2500lux、每日16h光照、8h黑暗；
芽启动培养基以1/2MS为基础培养基，还包括以下浓度的组分：0.5mg/L 6-BA、0.5mg/L IBA、30g/L蔗糖、9g/L琼脂、1.5g/L活性炭；
(2)将步骤(1)得到的无菌苗转接到成分为1/2MS+0.1ug/L Karrikins+30g/L蔗糖+9g/L琼脂+1.5g/L活性炭的植物增殖培养基中，在温度为26℃，照度2500lux、每日16h光照、8h黑暗的条件下进行继代增殖培养；
(3)控制组培室的温度和光照时间，使组培室温度为26℃，照度2500lux、每日16h光照、8h黑暗，培养2周后不定根开始萌发，4周后获得伸长生长的绿色无菌苗。
实施例3
植物增殖培养基的成分为1/2MS+0.8ug/L Karrikins+30g/L蔗糖+9g/L琼脂+1.5g/L活性炭；所述Karrikins提前用5％甲醇溶液溶解用于配置母液，配置好母液并于-20℃保存。
利用该植物增殖培养基促进植物组培苗不定根再生的方法，包括以下步骤：
(1)取赤霞珠葡萄苗的茎段进行初代培养，茎段的长度为3cm，且留有2个芽眼、2片叶，进行初代培养，得到无菌苗，初代培养的步骤：1)以选取的茎段为外植体；2)将所述茎段消毒处理后，接种到芽启动培养基上培养25～30天获得无菌苗；消毒处理包括依次进行的酒精浸泡和次氯酸钠溶液浸泡：体积浓度为75％的酒精浸泡1.5min，有效氯含量为6％的次氯酸钠溶液浸泡10min；
初代培养的条件：控制组培室的温度和光照时间，使组培室温度为26℃，照度2500lux、每日16h光照、8h黑暗；
芽启动培养基以1/2MS为基础培养基，还包括以下浓度的组分：1.0mg/L 6-BA、1.0mg/L IBA、30g/L蔗糖、9g/L琼脂、1.5g/L活性炭；
(2)将步骤(1)得到的无菌苗转接到成分为1/2MS+0.1ug/L Karrikins+30g/L蔗糖+9g/L琼脂+1.5g/L活性炭的植物增殖培养基中，在温度为26℃，照度2500lux、每日16h光照、8h黑暗的条件下进行继代增殖培养；
(3)控制组培室的温度和光照时间，使组培室温度为26℃，照度2500lux、每日16h光照、8h黑暗，培养2周后不定根开始萌发，4周后获得伸长生长的绿色无菌苗。
实施例4
植物增殖培养基的成分为1/2MS+1.0ug/L Karrikins+30g/L蔗糖+9g/L琼脂+1.5g/L活性炭；所述Karrikins提前用5％甲醇溶液溶解用于配置母液，配置好母液并于-20℃保存。
利用该植物增殖培养基促进植物组培苗不定根再生的方法，包括以下步骤：
(1)取赤霞珠葡萄苗的茎段进行初代培养，茎段的长度为1cm，且留有1个芽眼、1片叶，进行初代培养，得到无菌苗，初代培养的步骤：1)以选取的茎段为外植体；2)将所述茎段消毒处理后，接种到芽启动培养基上培养25～30天获得无菌苗；消毒处理包括依次进行的酒精浸泡和次氯酸钠溶液浸泡：体积浓度为65％的酒精浸泡0.5min，有效氯含量为4％的次氯酸钠溶液浸泡8min；
初代培养的条件：控制组培室的温度和光照时间，使组培室温度为26℃，照度2500lux、每日16h光照、8h黑暗；
芽启动培养基以1/2MS为基础培养基，还包括以下浓度的组分：0.2mg/L 6-BA、0.2mg/L IBA、30g/L蔗糖、9g/L琼脂、1.5g/L活性炭；
(2)将步骤(1)得到的无菌苗转接到成分为1/2MS+0.1ug/L Karrikins+30g/L蔗糖+9g/L琼脂+1.5g/L活性炭的植物增殖培养基中，在温度为26℃，照度2500lux、每日16h光照、8h黑暗的条件下进行继代增殖培养；
(3)控制组培室的温度和光照时间，使组培室温度为26℃，照度2500lux、每日16h光照、8h黑暗，培养2周后不定根开始萌发，4周后获得伸长生长的绿色无菌苗。
对比例1
(1)培养基：1/2MS+30g/L蔗糖+9g/L琼脂+1.5g/L活性炭，调节pH范围在5.8～5.9。
(2)无菌组培苗的继代增殖
将赤霞珠葡萄组培苗转移到步骤(1)中的培养基上进行继代增殖。
(3)继代后管理
控制组培室的温度和光照时间，使组培室温度为26℃，照度2500lux、每日16h光照、8h黑暗。
对比例2
对比例2与对比例1的不同之处在于，培养基为1/2MS+0.2mg/L IBA、0.2mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+9g/L琼脂+1.5g/L活性炭，其他步骤与条件均与对比例1相同。
生长结果：对单株苗不定根生长情况进行扫描统计，取平均值，结果如表3所示。
表3培养基组成对葡萄组培苗不定根生长状况的影响
由上表可知，使用本发明提供的继代增殖培养基，赤霞珠葡萄的不定根生长在根系长度、根系表面积、根系投影面积、根系体积、根尖数以及根系分叉数上都有了很大程度的改良。
需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (8)
1.一种利用植物增殖培养基促进葡萄组培苗不定根再生的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取葡萄的茎段进行初代培养，得到无菌苗；
（2）将步骤（1）得到的无菌苗转接到植物增殖培养基中，进行继代增殖培养；
所述植物增殖培养基以1/2MS培养基为基础培养基，1/2MS培养基中包括以下浓度的组分：0.1～1.0ug/L Karrikins、28-32 g/L蔗糖、8-10 g/L琼脂及1.2-1.8 g/L活性炭；
所述Karrikins用无菌水或5%甲醇溶液溶解，并于-20℃保存；
（3）继代增殖后管理。
2.根据权利要求1所述的促进葡萄组培苗不定根再生的方法，其特征在于，以1/2MS培养基为基础培养基，1/2MS培养基中包括以下浓度的组分：1.0ug/L Karrikins、30g/L蔗糖、9g/L琼脂及1.5g/L活性炭。
3.根据权利要求1所述促进葡萄组培苗不定根再生的方法，其特征在于，步骤（1）中的葡萄为赤霞珠葡萄。
4.根据权利要求3所述促进葡萄组培苗不定根再生的方法，其特征在于，所述茎段的长度为1-3cm，保留1~2个芽眼以及1~2片叶。
5.根据权利要求1所述促进葡萄组培苗不定根再生的方法，其特征在于，初代培养的步骤为：
（1）以葡萄的茎段为外植体；
（2）将所述茎段消毒处理后，接种到芽启动培养基上培养25～30天获得无菌苗。
6.根据权利要求5所述促进葡萄组培苗不定根再生的方法，其特征在于，芽启动培养基以1/2MS为基础培养基，还包括以下浓度的组分：0.2～1.0mg/L 6-BA、0.2～1.0mg/L IBA、28～32g/L蔗糖、8~10g/L琼脂、1.2~1.8g/L活性炭。
7.根据权利要求1所述促进葡萄组培苗不定根再生的方法，其特征在于，步骤（2）中所述继代增殖培养的条件为：培养温度为26℃，照度2500lux-3000lux、每日16h光照、8h黑暗。
8.根据权利要求1所述促进葡萄组培苗不定根再生的方法，其特征在于，步骤（3）中所述继代增殖后管理具体为：控制组培室的温度和光照时间，使组培室温度为26℃，照度2500lux、每日16 h光照、8 h黑暗。
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