CN105325301A - 一种心叶小花苣苔两步成苗组培快速繁殖的方法 - Google Patents
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Abstract
一种心叶小花苣苔两步成苗组培快速繁殖的方法，包括如下步骤：(1)以心叶小花苣苔叶片为外植体进行消毒；(2)将消毒后的外植体置于MS基本培养中培养诱导出不定芽；(3)将不定芽置于MS基本培养基中，经继代增殖培养后获得大量丛生芽；(4)将丛生芽剪切成单芽置于添加不同生长素的MS基本培养基中进行培养，得到生根苗。利用本发明的方法，外植体消毒培养7d便开始长出不定芽，出芽率为86.9％，增殖系数为6.1，生根率为89.5％。本发明能在短期内提供大量优质种苗，对进一步保护和利用苦苣苔科植物资源、拯救物种具有十分重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物两步成苗组培快速繁殖的方法，具体是一种心叶小花苣苔两步成苗组培快速繁殖的方法。
背景技术
心叶小花苣苔(ChiritopsiscordifoliaD.FangetW.T.Wang)，为苦苣苔科小花苣苔属草本植物。多数苦苣苔科植物具有清热解毒、祛痰、止咳、平喘、活血散结、消肿止痛、除湿等功效，全草可用于治疗跌打损伤，烫伤，疮疖，对于各种炎症、咳喘、疮疖、风湿、跌打、烫伤、蛇虫咬伤及妇科疾病有较好的疗效。主要分布于我国广西柳江、融安等县，为广西特有植物，既可观赏，又是民间草药。生于海拔100～260米的石灰岩山陡崖上，分布范围小、繁殖困难，资源量极少，再加上近年来南方喀斯特地貌地区石漠化日益严重，全球变暖导致很多地区长期干旱，以及洞穴旅游的不合理开发使得苦苣苔植物赖以生存的环境严重受到破坏，地方种已处于濒危状态，甚至已经灭绝，对小花苣苔属植物资源的保护和合理开发利用已刻不容缓。
发明内容
本发明的目的是提供一种心叶小花苣苔两步成苗组培快速繁殖的方法，能够实现心叶小花苣苔的两步成苗和快速繁殖，缩短心叶小花苣苔种苗生产周期，降低生产成本，提高种苗质量，为心叶小花苣苔大规模生产提供技术支持，对进一步保护和利用苦苣苔科植物资源、拯救物种具有十分重要的意义。
本发明通过以下技术方案达到上述目的：一种心叶小花苣苔两步成苗组培快速繁殖的方法，包括以下步骤：
(1)外植体的消毒：取无病虫害心叶小花苣苔的幼嫩叶片，用软纱布擦拭表面污垢，流水冲洗2min，然后在超净工作台内用75v/v％的乙醇消毒15s，无菌水冲洗1次，再用0.1v/v％HgCl2消毒6min，无菌水浸泡2次，每次约1min，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，获得外植体，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水；
(2)无菌芽的诱导：将步骤(1)得到的外植体剪切成1～1.5cm2的叶片，接种于外植体诱导培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行培养7～12d开始萌发，随后长出不定芽，所述外植体诱导培养基是以MS为基本培养基，还加入0.1～2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.05～1.0mg/L萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(3)不定芽的增殖培养：将步骤(2)中得到的不定芽或芽丛置于MS增殖培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行培养50d，长出更多的丛生芽，所述增殖培养基是以MS为基本培养基，还加入0.3～2.0mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、0.1-1.0mg/L的萘乙酸NAA，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(4)不定芽的生根：将步骤(3)中得到的丛生芽剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行生根培养10～15d便开始生根，所述1/2MS生根培养基是以1/2MS为基本培养基，还加入0.1～1.0mg/L的萘乙酸NAA、0.05～1.0mg/L的吲哚丁酸IBA，0.5～1.5g/L的活性炭，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
本发明的突出优点在于：
(1)利用组织培养方法实现了心叶小花苣苔的两步成苗和快速繁殖。缩短了心叶小花苣苔种苗生产周期，降低生产成本，提高种苗质量，为心叶小花苣苔大规模生产提供技术支持。
(2)采用本发明所述的两步成苗及组培快速繁殖的方法，外植体消毒培养7d便开始长出不定芽，30d出芽率为86.9％，生根率为89.5％，培养50d增殖系数为6.1。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。
实施例1
本发明所述的心叶小花苣苔两步成苗组培快速繁殖的方法一个实例，包括如下步骤：
(1)外植体的消毒：取无病虫害心叶小花苣苔的幼嫩叶片，用软纱布擦拭表面污垢，流水冲洗2min，然后在超净工作台内用75v/v％的乙醇消毒15s，无菌水冲洗1次，再用0.1v/v％HgCl2消毒6min，无菌水浸泡2次，每次约1min，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，获得外植体，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水。
(2)无菌芽的诱导：将步骤(1)得到的外植体剪切成1～1.5cm2的叶片，接种于外植体诱导培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行培养12d开始萌发，随后长出不定芽。所述外植体诱导培养基是以MS为基本培养基，还加入0.1mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、1.0mg/L萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d诱导率为68.4％。
(3)不定芽的增殖培养：将步骤(2)中得到的不定芽置于MS增殖培养基中，在培养温度为23±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行培养50d，长出更多的丛生芽。所述增殖培养基是以MS为基本培养基，还加入0.3mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、0.5mg/L的萘乙酸NAA，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养50d增殖系数为3.8。
(4)不定芽的生根：将步骤(3)中得到的丛生芽剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行生根培养，培养15d便开始生根。所述1/2MS生根培养基是以1/2MS为基本培养基，还加入0.1mg/L的萘乙酸NAA、0.05mg/L的吲哚丁酸IBA，0.5g/L的活性炭，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d生根率为76.3％。
实施例2
本发明所述的心叶小花苣苔两步成苗组培快速繁殖的方法另一个实例，包括如下步骤：
(1)外植体的消毒：取无病虫害心叶小花苣苔的幼嫩叶片，用软纱布擦拭表面污垢，流水冲洗2min，然后在超净工作台内用75v/v％的乙醇消毒15s，无菌水冲洗1次，再用0.1v/v％HgCl2消毒6min，无菌水浸泡2次，每次约1min，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，获得外植体，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水。
(2)无菌芽的诱导：将步骤(1)得到的外植体剪切成1～1.5cm2的叶片，接种于外植体诱导培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行培养，培养8d开始萌发，随后长出不定芽。所述外植体诱导培养基是以MS为基本培养基，还加入0.8mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d诱导率为84.2％。
(3)不定芽的增殖培养：将步骤(2)中得到的不定芽置于MS增殖培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行培养50d，长出更多的丛生芽。所述增殖培养基是以MS为基本培养基，还加入0.8mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、0.1mg/L的萘乙酸NAA，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养50d增殖系数为5.4。
(4)不定芽的生根：将步骤(3)中得到的丛生芽剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中，在培养温度为23±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行生根培养10d便开始生根。所述1/2MS生根培养基是以1/2MS为基本培养基，还加入0.5mg/L的萘乙酸NAA、0.3mg/L的吲哚丁酸IBA，1.5g/L的活性炭，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d生根率为89.5％。
实施例3
本发明所述的心叶小花苣苔两步成苗组培快速繁殖的方法再一个实例，包括如下步骤：
(1)外植体的消毒：取无病虫害心叶小花苣苔的幼嫩叶片，用软纱布擦拭表面污垢，流水冲洗2min，然后在超净工作台内用75v/v％的乙醇消毒15s，无菌水冲洗1次，再用0.1v/v％HgCl2消毒6min，无菌水浸泡2次，每次约1min，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，获得外植体，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水。
(2)无菌芽的诱导：将步骤(1)得到的外植体剪切成1～1.5cm2的叶片，接种于外植体诱导培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行培养，培养7d开始萌发，随后长出不定芽。所述外植体诱导培养基是以MS为基本培养基，还加入1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1mg/L萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d诱导率为86.9％。
(3)不定芽的增殖培养：将步骤(2)中得到的不定芽置于MS增殖培养基中，在培养温度为23±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行培养50d，长出更多的丛生芽。所述增殖培养基是以MS为基本培养基，还加入1.5mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、0.8mg/L的萘乙酸NAA，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养50d增殖系数为6.1。
(4)不定芽的生根：将步骤(3)中得到的丛生芽剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行生根培养13d便开始生根。所述1/2MS生根培养基是以1/2MS为基本培养基，还加入0.8mg/L的萘乙酸NAA、0.5mg/L的吲哚丁酸IBA，1.0g/L的活性炭，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d生根率为86.8％。
实施例4
本发明所述的心叶小花苣苔两步成苗组培快速繁殖的方法又一个实例，包括如下步骤：
(1)外植体的消毒：取无病虫害心叶小花苣苔的幼嫩叶片，用软纱布擦拭表面污垢，流水冲洗2min，然后在超净工作台内用75v/v％的乙醇消毒15s，无菌水冲洗1次，再用0.1v/v％HgCl2消毒6min，无菌水浸泡2次，每次约1min，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，获得外植体，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水。
(2)无菌芽的诱导：将步骤(1)得到的外植体剪切成1～1.5cm2的叶片，接种于外植体诱导培养基中，在培养温度为23±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行培养11d开始萌发，随后长出不定芽。所述外植体诱导培养基是以MS为基本培养基，还加入2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.05mg/L萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d诱导率为73.6％。
(3)不定芽的增殖培养：将步骤(2)中得到的不定芽置于MS增殖培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行培养50d，长出更多的丛生芽。所述增殖培养基是以MS为基本培养基，还加入2.0mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、1.0mg/L的萘乙酸NAA，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养50d增殖系数为4.9。
(4)不定芽的生根：将步骤(3)中得到的丛生芽剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行生根培养，培养12d便开始生根。所述1/2MS生根培养基是以1/2MS为基本培养基，还加入1.0mg/L的萘乙酸NAA、1.0mg/L的吲哚丁酸IBA，1.5g/L的活性炭，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d生根率为81.6％。
Claims (1)
1.一种心叶小花苣苔两步成苗组培快速繁殖的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
(1)外植体的消毒：取无病虫害心叶小花苣苔的幼嫩叶片，用软纱布擦拭表面污垢，流水冲洗2min，然后在超净工作台内用75v/v％的乙醇消毒15s，无菌水冲洗1次，再用0.1v/v％HgCl2消毒6min，无菌水浸泡2次，每次约1min，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，获得外植体，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水；
(2)无菌芽的诱导：将步骤(1)得到的外植体剪切成1～1.5cm2的叶片，接种于外植体诱导培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行培养7～12d开始萌发，随后长出不定芽，所述外植体诱导培养基是以MS为基本培养基，还加入0.1～2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.05～1.0mg/L萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(3)不定芽的增殖培养：将步骤(2)中得到的不定芽或芽丛置于MS增殖培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行培养50d，长出更多的丛生芽，所述增殖培养基是以MS为基本培养基，还加入0.3～2.0mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、0.1-1.0mg/L的萘乙酸NAA，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(4)不定芽的生根：将步骤(3)中得到的丛生芽剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中，在培养温度23±2℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行生根培养10～15d便开始生根，所述1/2MS生根培养基是以1/2MS为基本培养基，还加入0.1～1.0mg/L的萘乙酸NAA、0.05～1.0mg/L的吲哚丁酸IBA，0.5～1.5g/L的活性炭，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160217 |