CN109076957A - 一种龙氏报春苣苔的瓶外生根方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体的是一种龙氏报春苣苔的瓶外生根方法。一种龙氏报春苣苔的瓶外生根方法，包括以下步骤：(1)外植体的消毒灭菌、(2)不定芽的诱导、(3)增殖培养、(4)幼株的选取以及预处理、(5)基质配制、(6)种植和(7)移栽后管理。本发明的方法缩短了龙氏报春苣苔育苗周期，节约成本、节约室内培养空间，具有组培苗生根率高，成活率高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体的是一种龙氏报春苣苔的瓶外生根方法。
背景技术
龙氏报春苣苔(Primulina longii)为苦苣苔科报春苣苔属的多年生草本植物。主要分布在广西的融安、永福，常见于石灰岩石山岩壁或山洞，海拔约350m。花期为3-4月。龙氏报春苣苔株型优美，花朵硕大，花朵数量多，具有很高的观赏价值。由于人为对原生境的破坏，该种的部分居群已基本消亡，虽然现存的居群更新良好，但根据国际自然保护联盟红色名录标准，该种的保护现状仍被认为濒危。组织培养是物种种质资源保存的关键技术，也是种苗规模化生产的有效途径，对保护和开发利用龙氏报春苣苔的意义十分重大。目前有关龙氏报春苣苔的组织培养研究尚未有相关报道。
组织培养的关键技术主要包括外植体的获得、不定芽的诱导、不定芽的增殖培养、不定芽的生根培养、炼苗移栽，通过5个步骤方可获得完整的植株。瓶外生根把生根过程与炼苗移栽过程相结合，将增殖获得的组培芽直接在瓶外栽种直至生根的过程。相对于瓶内生根的生产成本高、育苗周期长、占用室内空间大的缺点，瓶外生根则具有节约成本、缩短育苗周期，节约室内培养空间的优点。瓶外生根技术虽然常应用在难以生根的植物种类中，但由于组培程序的简化，减少了培养基的配制和组培苗放的转瓶，节约了人力物力的同时也有效控制了生产成本，对于易生根的植物的种苗规模化生产极具意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种龙氏报春苣苔的瓶外生根方法，解决了常规龙氏报春苣苔组培苗以试管内生根为主，但生产成本高、育苗周期长、占用室内空间大的问题。
本发明所提供的技术方案是：
一种龙氏报春苣苔的瓶外生根方法，包括以下步骤：
(1)外植体的消毒灭菌：取经过驯化栽培的龙氏报春苣苔的成熟叶片，用自来水冲洗25-30min，在超净工作台上，在0.01-0.05％高锰酸钾溶液中浸泡15-20min，无菌水冲洗3-5次，然后将其叶柄切成1-2cm长，用75％酒精中浸泡5-15s，无菌水冲洗3-5次，再用0.1％升汞浸泡8-12min，无菌水冲洗3-5次，叶柄灭菌后备用；
(2)不定芽的诱导：将经过灭菌的叶柄下部斜插入诱导培养基中培养50-60d培养温度22-24℃，光照：10-12h/d，光照强度1000-1500lx；
(3)增殖培养：将从叶柄上诱导得到的不定芽切取下来，接入增殖培养基中培养50-60d，培养温度22-24℃，光照：10-12h/d，光照强度1000-1500lx；
(4)幼株的选取以及预处理：将经过增殖培养的瓶苗在室温下封盖炼苗3-5d，光照为10-12h/d，光照强度2000-2500lx；在超净工作台上切取具有2对以上叶片的组培苗用于瓶外生根，而未达到瓶外生根要求的小苗则继续进行增殖培养；将切取下来的组培苗基部放在生根液中速蘸2-3s，生根液为0.3-0.5％等量IBA和NAA混合溶液；
(5)基质配制：以泥炭、生产食用菌的下脚料、珍珠岩、细河沙、蛭石和稻壳炭为成分配制基质，将基质的pH值调节为7.5-8.5；基质混合均匀后采用0.01-0.05％的高锰酸钾溶液浇灌淋透，分装入50孔或者72孔的穴盘中；
(6)种植：事先在已经浇好水的移栽基质上用镊子戳成一个0.5-1.0cm深的小孔，然后用镊子夹住把小苗插入孔中，左手扶苗，右手把小苗基部的基质压实，浇透定根水，并根据基质的流失情况适当添加相应的基质；
(7)移栽后管理：将种植好的穴盘苗放在有遮阳网的荫棚下，遮光率在60-70％，保持良好的通风；采用间歇性喷雾系统控制空气湿度，每天从上午9时开始至下午17时，每隔2小时喷雾10-15s，保持空气湿度在75-85％；小苗的浇水根据基质的干湿程度进行，当基质面发白时，表明需要补水，每次补水都要求浇透基质；移栽后在第7、14、21d进行一次叶面肥的喷施，叶面肥5000-6000倍液；移植后管理期间，温度为20-30℃，光照强度2000-2500lx；移栽35-40d即可生根；待植株叶面铺满一个穴盘孔时，即可进行上盆移栽。
作为优选，步骤(1)中0.1％升汞中加入2-3滴吐温20。
作为优选，步骤(2)中所述的诱导培养基为B5+TDZ 1.0-3.0mg/L+NAA0.1-1.0mg/L，pH7.0-7.5。
作为优选，步骤(3)中所述的增殖培养基为B5+6-BA3.0-5.0mg/L+ZT1.0-3.0mg/L+IBA0.5-1.5mg/L，pH7.0-7.5。
作为优选，步骤(4)中0.3-0.5％等量IBA和NAA混合溶液：由相等质量的IBA和NAA混合配制而成。
作为优选，步骤(5)中的基质是以泥炭、生产食用菌的下脚料、珍珠岩、细河沙、蛭石、稻壳炭构成，采用泥炭、珍珠岩、蛭石、稻壳炭，体积比为2:1:1:1，或生产食用菌的下脚料、细河沙、蛭石、稻壳炭，体积比为1:1:2:1，或者生产食用菌的下脚料、珍珠岩、蛭石、稻壳炭，体积比为1:2:2:1。
作为优选，步骤(7)中的叶面肥中N:P2O5:K2O＝10:30:20。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果如下：
本发明的方法缩短了龙氏报春苣苔的育苗周期，既节约成本又节约室内培养空间，经该方法得到的组培苗生根率高，成活率高。
具体实施方式
下面结合具体例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1：
一种龙氏报春苣苔的瓶外生根方法，包括以下步骤：
(1)外植体的消毒灭菌：取经过驯化栽培的龙氏报春苣苔的成熟叶片，用自来水冲洗25min，在超净工作台上，在0.01％高锰酸钾溶液中浸泡15min，无菌水冲洗3次，然后将其叶柄切成1cm长，用75％酒精中浸泡5s，无菌水冲洗3次，再用0.1％升汞浸泡8min，无菌水冲洗3次，叶柄灭菌后备用；所述的0.1％升汞中加入2滴吐温20；
(2)不定芽的诱导：将经过灭菌的叶柄下部斜插入诱导培养基中培养50d培养温度22℃，光照：10h/d，光照强度1000lx；所述的诱导培养基为B5+TDZ1.0mg/L+NAA 0.1mg/L，pH7.0；
(3)增殖培养：将从叶柄上诱导得到的不定芽切取下来，接入增殖培养基中培养50d，培养温度22℃，光照：10h/d，光照强度1000lx；所述的增殖培养基为B5+6-BA 3.0mg/L+ZT 1.0mg/L+IBA0.5mg/L，pH7.0；
(4)幼株的选取以及预处理：将经过增殖培养的瓶苗在室温下封盖炼苗3d，光照为10h/d，光照强度2000lx；在超净工作台上切取具有3-5对叶片的组培苗用于瓶外生根，而未达到瓶外生根要求的小苗则继续进行增殖培养；将切取下来的组培苗基部放在生根液中速蘸2-3s，生根液为0.3％等量IBA和NAA混合溶液；所述的0.3％等量IBA和NAA混合溶液：由相等质量的IBA和NAA混合配制而成；
(5)基质配制：以泥炭、生产食用菌的下脚料、珍珠岩、细河沙、蛭石和稻壳炭为成分配制基质，将基质的pH值调节为7.5；基质混合均匀后采用0.01％的高锰酸钾溶液浇灌淋透，分装入50孔或者72孔的穴盘中；所述的基质是以泥炭、生产食用菌的下脚料、珍珠岩、细河沙、蛭石、稻壳炭构成，采用泥炭、珍珠岩、蛭石、稻壳炭，体积比为2:1:1:1；
(6)种植：事先在已经浇好水的移栽基质上用镊子戳成一个0.5cm深的小孔，然后用镊子夹住把小苗插入孔中，左手扶苗，右手把小苗基部的基质压实，浇透定根水，并根据基质的流失情况适当添加相应的基质；
(7)移栽后管理：将种植好的穴盘苗放在有遮阳网的荫棚下，遮光率在60％，保持良好的通风；采用间歇性喷雾系统控制空气湿度，每天从上午9时开始至下午17时，每隔2小时喷雾10-15s，保持空气湿度在75％；小苗的浇水根据基质的干湿程度进行，当基质面发白时，表明需要补水，每次补水都要求浇透基质；移栽后在第7、14、21d进行一次叶面肥的喷施，叶面肥5000倍液；移植后管理期间，温度为20℃，光照强度2000lx；移栽35d即可生根；待植株叶面铺满一个穴盘孔时，即可进行上盆移栽；所述的叶面肥中N:P2O5:K2O＝10:30:20。
实施例2：
一种龙氏报春苣苔的瓶外生根方法，包括以下步骤：
(1)外植体的消毒灭菌：取经过驯化栽培的龙氏报春苣苔的成熟叶片，用自来水冲洗28min，在超净工作台上，在0.02％高锰酸钾溶液中浸泡18min，无菌水冲洗4次，然后将其叶柄切成1cm长，用75％酒精中浸泡10s，无菌水冲洗4次，再用0.1％升汞浸泡10min，无菌水冲洗4次，叶柄灭菌后备用；所述的0.1％升汞中加入3滴吐温20；
(2)不定芽的诱导：将经过灭菌的叶柄下部斜插入诱导培养基中培养55d培养温度23℃，光照：11h/d，光照强度1200lx；所述的诱导培养基为B5+TDZ 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L，pH7.2；
(3)增殖培养：将从叶柄上诱导得到的不定芽切取下来，接入增殖培养基中培养52d，培养温度24℃，光照：11h/d，光照强度1300lx；所述的增殖培养基为B5+6-BA4.0mg/L+ZT2.0mg/L+IBA1.0mg/L，pH7.2；
(4)幼株的选取以及预处理：将经过增殖培养的瓶苗在室温下封盖炼苗4d，光照为11h/d，光照强度2200lx；在超净工作台上切取具有3-4对叶片的组培苗用于瓶外生根，而未达到瓶外生根要求的小苗则继续进行增殖培养；将切取下来的组培苗基部放在生根液中速蘸2-3s，生根液为0.4％等量IBA和NAA混合溶液；所述的0.4％等量IBA和NAA混合溶液：由相等质量的IBA和NAA混合配制而成；
(5)基质配制：以泥炭、生产食用菌的下脚料、珍珠岩、细河沙、蛭石和稻壳炭为成分配制基质，将基质的pH值调节为8.0；基质混合均匀后采用0.03％的高锰酸钾溶液浇灌淋透，分装入50孔或者72孔的穴盘中；所述的基质是以生产食用菌的下脚料、细河沙、蛭石、稻壳炭，体积比为1:1:2:1；
(6)种植：事先在已经浇好水的移栽基质上用镊子戳成一个0.8cm深的小孔，然后用镊子夹住把小苗插入孔中，左手扶苗，右手把小苗基部的基质压实，浇透定根水，并根据基质的流失情况适当添加相应的基质；
(7)移栽后管理：将种植好的穴盘苗放在有遮阳网的荫棚下，遮光率在65％，保持良好的通风；采用间歇性喷雾系统控制空气湿度，每天从上午9时开始至下午17时，每隔2小时喷雾12s，保持空气湿度在80％；小苗的浇水根据基质的干湿程度进行，当基质面发白时，表明需要补水，每次补水都要求浇透基质；移栽后在第7、14、21d进行一次叶面肥的喷施，叶面肥6000倍液；移植后管理期间，温度为25℃，光照强度2200lx；移栽38d即可生根；待植株叶面铺满一个穴盘孔时，即可进行上盆移栽；所述的叶面肥中N:P2O5:K2O＝10:30:20。
实施例3：
一种龙氏报春苣苔的瓶外生根方法，包括以下步骤：
(1)外植体的消毒灭菌：取经过驯化栽培的龙氏报春苣苔的成熟叶片，用自来水冲洗30min，在超净工作台上，在0.05％高锰酸钾溶液中浸泡20min，无菌水冲洗5次，然后将其叶柄切成2cm长，用75％酒精中浸泡15s，无菌水冲洗5次，再用0.1％升汞浸泡12min，无菌水冲洗5次，叶柄灭菌后备用；所述的0.1％升汞中加入2-3滴吐温20；
(2)不定芽的诱导：将经过灭菌的叶柄下部斜插入诱导培养基中培养60d培养温度24℃，光照：12h/d，光照强度1500lx；所述的诱导培养基为B5+TDZ 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L，pH7.5；
(3)增殖培养：将从叶柄上诱导得到的不定芽切取下来，接入增殖培养基中培养60d，培养温度24℃，光照：12h/d，光照强度1500lx；所述的增殖培养基为B5+6-BA5.0mg/L+ZT3.0mg/L+IBA1.5mg/L，pH7.5；
(4)幼株的选取以及预处理：将经过增殖培养的瓶苗在室温下封盖炼苗5d，光照为12h/d，光照强度2500lx；在超净工作台上切取具有4-5对叶片的组培苗用于瓶外生根，而未达到瓶外生根要求的小苗则继续进行增殖培养；将切取下来的组培苗基部放在生根液中速蘸2-3s，生根液为0.5％等量IBA和NAA混合溶液；所述的0.5％等量IBA和NAA混合溶液：由相等质量的IBA和NAA混合配制而成；
(5)基质配制：以泥炭、生产食用菌的下脚料、珍珠岩、细河沙、蛭石和稻壳炭为成分配制基质，将基质的pH值调节为8.5；基质混合均匀后采用0.05％的高锰酸钾溶液浇灌淋透，分装入50孔或者72孔的穴盘中；所述的基质是以生产食用菌的下脚料、珍珠岩、蛭石、稻壳炭构成，体积比为1:2:2:1；
(6)种植：事先在已经浇好水的移栽基质上用镊子戳成一个0.5-1.0cm深的小孔，然后用镊子夹住把小苗插入孔中，左手扶苗，右手把小苗基部的基质压实，浇透定根水，并根据基质的流失情况适当添加相应的基质；
(7)移栽后管理：将种植好的穴盘苗放在有遮阳网的荫棚下，遮光率在70％，保持良好的通风；采用间歇性喷雾系统控制空气湿度，每天从上午9时开始至下午17时，每隔2小时喷雾15s，保持空气湿度在85％；小苗的浇水根据基质的干湿程度进行，当基质面发白时，表明需要补水，每次补水都要求浇透基质；移栽后在第7、14、21d进行一次叶面肥的喷施，叶面肥6000倍液；移植后管理期间，温度为30℃，光照强度2500lx；移栽40d即可生根；待植株叶面铺满一个穴盘孔时，即可进行上盆移栽；所述的叶面肥中N:P2O5:K2O＝10:30:20。
对实施例1-3中不定芽的诱导、不定芽的继代增殖及瓶外生根情况进行调查和统计，详见表1-3。
表1不定芽的诱导
表2不定芽的继代增殖
表3瓶外生根
由表1-3可知，本发明的方法得到龙氏报春苣苔不定芽诱导率均为100％；不定芽的继代增殖情况良好，新芽数芽点非常多，具2对以上叶片的组培芽数均在212以上；瓶外生根苗移栽生根率均在85％以上，生根时间为35-40天之间。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (7)
1.一种龙氏报春苣苔的瓶外生根方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)外植体的消毒灭菌：取经过驯化栽培的龙氏报春苣苔的成熟叶片，用自来水冲洗25-30min，在超净工作台上，在0.01-0.05％高锰酸钾溶液中浸泡15-20min，无菌水冲洗3-5次，然后将其叶柄切成1-2cm长，用75％酒精中浸泡5-15s，无菌水冲洗3-5次，再用0.1％升汞浸泡8-12min，无菌水冲洗3-5次，叶柄灭菌后备用；
(2)不定芽的诱导：将经过灭菌的叶柄下部斜插入诱导培养基中培养50-60d培养温度22-24℃，光照：10-12h/d，光照强度1000-1500lx；
(3)增殖培养：将从叶柄上诱导得到的不定芽切取下来，接入增殖培养基中培养50-60d，培养温度22-24℃，光照：10-12h/d，光照强度1000-1500lx；
(4)幼株的选取以及预处理：将经过增殖培养的瓶苗在室温下封盖炼苗3-5d，光照为10-12h/d，光照强度2000-2500lx；在超净工作台上切取具有2对以上叶片的组培苗用于瓶外生根，而未达到瓶外生根要求的小苗则继续进行增殖培养；将切取下来的组培苗基部放在生根液中速蘸2-3s，生根液为0.3-0.5％等量IBA和NAA混合溶液；
(5)基质配制：以泥炭、生产食用菌的下脚料、珍珠岩、细河沙、蛭石和稻壳炭为成分配制基质，将基质的pH值调节为7.5-8.5；基质混合均匀后采用0.01-0.05％的高锰酸钾溶液浇灌淋透，分装入50孔或者72孔的穴盘中；
(6)种植：事先在已经浇好水的移栽基质上用镊子戳成一个0.5-1.0cm深的小孔，然后用镊子夹住把小苗插入孔中，左手扶苗，右手把小苗基部的基质压实，浇透定根水，并根据基质的流失情况适当添加相应的基质；
(7)移栽后管理：将种植好的穴盘苗放在有遮阳网的荫棚下，遮光率在60-70％，保持良好的通风；采用间歇性喷雾系统控制空气湿度，每天从上午9时开始至下午17时，每隔2小时喷雾10-15s，保持空气湿度在75-85％；小苗的浇水根据基质的干湿程度进行，当基质面发白时，表明需要补水，每次补水都要求浇透基质；移栽后在第7、14、21d进行一次叶面肥的喷施，叶面肥5000-6000倍液；移植后管理期间，温度为20-30℃，光照强度2000-2500lx；移栽35-40d即可生根；待植株叶面铺满一个穴盘孔时，即可进行上盆移栽。
2.根据权利要求1所述的龙氏报春苣苔的瓶外生根方法，其特征在于，步骤(1)中0.1％升汞中加入2-3滴吐温20。
3.根据权利要求1所述的龙氏报春苣苔的瓶外生根方法，其特征在于，步骤(2)中所述的诱导培养基为B5+TDZ1.0-3.0mg/L+NAA0.1-1.0mg/L，pH7.0-7.5。
4.根据权利要求1所述的龙氏报春苣苔的瓶外生根方法，其特征在于，步骤(3)中所述的增殖培养基为B5+6-BA3.0-5.0mg/L+ZT1.0-3.0mg/L+IBA0.5-1.5mg/L，pH7.0-7.5。
5.根据权利要求1所述的龙氏报春苣苔的瓶外生根方法，其特征在于，步骤(4)中0.3-0.5％等量IBA和NAA混合溶液：由相等质量的IBA和NAA混合配制而成。
6.根据权利要求1所述的龙氏报春苣苔的瓶外生根方法，其特征在于，步骤(5)中的基质是以泥炭、生产食用菌的下脚料、珍珠岩、细河沙、蛭石、稻壳炭构成，采用泥炭、珍珠岩、蛭石、稻壳炭，体积比为2:1:1:1，或生产食用菌的下脚料、细河沙、蛭石、稻壳炭，体积比为1:1:2:1，或者生产食用菌的下脚料、珍珠岩、蛭石、稻壳炭，体积比为1:2:2:1。
7.根据权利要求1所述的龙氏报春苣苔的瓶外生根方法，其特征在于，步骤(7)中的叶面肥中N:P2O5:K2O＝10:30:20。
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