CN110663557B - 一种远志的生根及育苗方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种远志的生根及育苗方法，包括以下步骤：1)无菌外植体的制备；2)无菌苗的制备；3)组培苗的制备；4)生根苗组培苗的制备；5)炼苗。本发明提供的远志的生根剂育苗方法，培养周期短，增殖和生根的总周期在10周左右；且增殖系数较高可达1:4‑4.5，增殖后的株高约3.5cm，增殖后的成活合格率大于98％；生根率100％，且生根后的成活率大于99％；移栽后的成活率大于98％，适合远志的大规模工厂化育苗。
Description
技术领域
本发明属于植物培育领域，涉及一种生根及育苗方法，具体涉及一种远志的生根及育苗方法。
背景技术
远志(学名：Polygala tenuifolia Willd)，又名葽绕、蕀蒬等。产东北、华北、西北和华中以及四川；生于草原、山坡草地、灌丛中以及杂木林下，海拔200-2300米。主根粗壮，韧皮部肉质。具有安神益智、祛痰、消肿的功能，可用于心肾不交引起的失眠多梦、健忘惊悸，神志恍惚，咳痰不爽，疮疡肿毒，乳房肿痛。临床应用于肾虚阳萎、早泄等性功能减退症以及心悸怔忡，肾虚咳喘，宫寒带下等症状。远志还具有明显的抗疲劳、抗缺氧作用，能提高机体的抗应激能力，增强体力并使机体适应各种不良刺激的影响。从本属植物中分离得到的主要成分为三萜皂苷类化合物、咕吨酮苷类化合物、寡糖脂类化合物、生物碱及其他有机成分和无机物。其中主要化学成分之一的三萜皂苷类化合物被证明具有显著的补肾助阳的雄性激素类作用。由于极具药用价值，人们过渡采挖，已经造野生资源的严重枯竭，甚至濒临绝迹。而人工种植长期缺乏统一的优质种源，生产的药材品质明显下降，直接影响到临床疗效。
公开号为CN105532458的专利公开了一种西南远志的组织培养方法，其主要步骤是：1、外植体的选择；2、外植体的消毒；3、初始诱导培养；4、原球茎增殖培养；5、原球茎分化培养；6、壮苗和生根培养。只是用原球茎，且分两步进行增殖和分化，操作比较繁琐，不利于工厂化的生产。且培养基配方中使用了马铃薯汁，培养基成分的不稳定性因素增加。
因此研究一种操作简单、成本低廉、成活率高、生根率高的远志的生根及培养方法，适合工厂化育苗具有重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题，是提供一种远志的生根及育苗方法，充分利用了远志各个部位的增殖分生特点，提高了材料的利用率，操作简单、成本低廉、成活率高、生根率高的，适合工厂化育苗的方法。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
一种远志的生根及育苗方法，包括以下步骤：
1)无菌外植体的制备：将远志的外植体进行清洗，之后先采用70％-75％的乙醇浸泡，再采用2-5％的次氯酸钠浸泡，最后用0.1-0.2％的柠檬酸水浸洗，得到远志无菌外植体；
2)无菌苗的制备：将远志无菌外植体接种于启动培养基上，培养50-60天得到无菌苗；
3)组培苗的制备：将无菌苗接种于增殖培养基上，培养40-50天得到生根苗；
4)生根苗组培苗的制备：将生根苗切取≥2cm的植株，接种于生根培养基上，培养25-35天即可得组培生根苗；
5)炼苗：将组培生根苗移栽炼苗，得到远志种植苗。
作为本发明的一种限定，所述步骤2)的培养方法为在温度为22-28℃，光照强度1200-1800lux下，光照培养14h之后暗培养10h，连续培养。
作为本发明的另一种限定，所述步骤3)制备得到的组培苗还可用于继代培养组培苗。
作为上述限定的进一步限定，所述步骤3)组培苗及继代培养组培苗的方法包括：选取1.0-1.5cm的顶芽，选取0.5-0.8cm的基部丛芽，选取至少带2个芽点0.8-1.2cm的茎段，接种于增殖培养基上，在温度22-28℃，光照强度1200-1800lux下，光照培养16h之后暗培养8h，连续培养。
作为本发明的另一种限定，所述步骤2)中的启动培养基、步骤3)中的增殖培养基和步骤4)中的生根培养基中均包括基础培养基。
作为上述限定的进一步限定，所述基础培养基包括：二水合氯化钙280.5～379.5mg/L,四水合硝酸钙382.5～517.5mg/L,氯化钾318.75～431.25mg/L,磷酸二氢钾216.75～293.25mg/L,硝酸钾、701.25～948.75mg/L,七水合硫酸镁956.25～1293.75mg/L,硝酸铵262.65～355.35mg/L,六水合氯化钴0.02125～0.02875mg/L,五水合硫酸铜0.2125～0.2875mg/L,EDTA钠铁盐31.195～42.205mg/L,硼酸10.54～14.26mg/L,碘化钾0.7055～0.9545mg/L,一水合硫酸锰14.365～19.435mg/L,二水合钼酸钠0.2125～0.2875mg/L,七水合硫酸锌12.155～16.445mg/L。
作为上述限定的进一步限定，所述启动培养基包括：基础培养基、盐酸硫胺素0.34～0.46mg/L,肌醇85～115mg/L,烟酸0.425～0.575mg/L,盐酸吡哆辛0.425～0.575mg/L,甘氨酸1.7～2.3mg/L,蔗糖20～40g/L,植物琼脂4.5～6.5g/L,6-BA 2.55～3.45mg/L,IBA0.085～0.115mg/L。
作为上述限定的进一步限定，所述增殖培养基包括：基础培养基、盐酸硫胺素0.34～0.46mg/L,肌醇85～115mg/L,烟酸0.425～0.575mg/L,盐酸吡哆辛0.425～0.575mg/L,甘氨酸1.7～2.3mg/L,蔗糖20～40g/L,植物琼脂4.5～6.5g/L,6-BA 1.275～1.725mg/L,IBA0.085～0.115mg/L。
作为上述限定的进一步限定，所述生根培养基包括：基础培养基、盐酸硫胺素0.425～0.575mg/L,肌醇85～115mg/L,烟酸4.25～5.75mg/L,盐酸吡哆辛0.425～0.575mg/L,甘氨酸1.7～2.3mg/L,叶酸0.425～0.575mg/L,生物素0.0425～0.0575mg/L,蔗糖20～40g/L,植物琼脂4.5～6.5g/L,IBA 0.425～0.575mg/L,IAA 2.125～2.875mg/L,NAA0.2125～0.2875mg/L。
本发明还有一种限定，所述步骤4)生根苗组培苗的制备方法为在温度22-28℃，光照强度1200-1800lux下，光照培养16h之后暗培养8h，连续培养。
由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
本发明提供的远志的生根及育苗方法，充分利用了远志各个部位的增殖分生特点，培养周期短，增殖和生根的总周期在10周左右；且增殖系数较高可达1:4-4.5，增殖后的株高约3.5cm，增殖后的成活合格率大于98％；生根率100％，且生根后的成活率大于99％；移栽后的成活率大于98％，适合远志的大规模工厂化育苗。本发明采用的培养基配方，直接使用有机物的高纯度化学试剂，避免了前述研究中直接使用生物组织液的情况，降低了成分不确定性的风险，更有利于实际生产的管控。
本发明适用于远志的生根培养及育苗培养。
本发明下面将结合具体实施例作进一步详细说明。
具体实施方式
实施例1
一种远志的生根及育苗方法，包括以下步骤：
1)无菌外植体的制备：用带腋芽的茎段的远志作为外植体，将远志的外植体进行清洗5min，将茎段切成3cm的小段，之后再进行清洗；清洗之后先采用70％的乙醇浸泡1min，转移到超净工作台内，再采用3％的次氯酸钠浸泡10min，最后用0.15％的柠檬酸水浸洗3遍，晾干后得到带腋芽茎段的远志无菌外植体；本实施例提供的无菌外植体的制备方法避免了现有技术中使用升汞消毒，对远志外植体不会产生影响，不会对其本身的药用价值产生影响。
2)无菌苗的制备：将远志无菌外植体接种于启动培养基上，在温度为22-28℃，光照强度1200-1800lux下，光照培养14h之后暗培养10h，连续培养56天得到无菌苗；
3)组培苗的制备：选取1.0-1.5cm的顶芽，选取0.5-0.8cm的基部丛芽，选取至少带2个芽点0.8-1.2cm的茎段，接种于增殖培养基上，在温度22-28℃，光照强度1200-1800lux下，光照培养16h之后暗培养8h，连续培养45天得到生根苗；其增殖系数为1:4.5，且增殖后的株高约3.5cm，增殖成活合格率大于98％。该步骤制得的组培苗还可用于继代培养组培苗，其培养方法与组培苗的方法相同。
4)生根苗组培苗的制备：将生根苗切取≥2cm的植株，基部小叶去除，基部得到第一个腋芽处留0.5cm的茎段，接种于生根培养基上，在温度22-28℃，光照强度1200-1800lux下，光照培养16h之后暗培养8h，连续培养28天即可得组培生根苗；得到的组培生根苗生根率为100％，成活率大于99％。
5)炼苗：将组培生根苗清洗根部，移栽炼苗，得到远志种植苗，移栽后的成活率大于98％。
其中，步骤2)中的启动培养基、步骤3)中的增殖培养基和步骤4)中的生根培养基中均包括基础培养基。
基础培养基包括：二水合氯化钙280.5mg/L,四水合硝酸钙382.5mg/L,氯化钾318.75g/L,磷酸二氢钾216.75mg/L,硝酸钾、701.25mg/L,七水合硫酸镁956.25mg/L,硝酸铵262.65mg/L,六水合氯化钴0.02125g/L,五水合硫酸铜0.2125g/L,EDTA钠铁盐31.195mg/L,硼酸10.54mg/L,碘化钾0.7055mg/L,一水合硫酸锰14.365mg/L,二水合钼酸钠0.2125mg/L,七水合硫酸锌12.155mg/L。
启动培养基包括：基础培养基、盐酸硫胺素0.34mg/L,肌醇85mg/L,烟酸0.425mg/L,盐酸吡哆辛0.425mg/L,甘氨酸1.7g/L,蔗糖20g/L,植物琼脂4.5g/L,6-BA 2.55mg/L,IBA0.085mg/L。
增殖培养基包括：基础培养基、盐酸硫胺素0.34mg/L,肌醇85mg/L,烟酸0.425mg/L,盐酸吡哆辛0.425mg/L,甘氨酸1.7g/L,蔗糖20g/L,植物琼脂4.5～g/L,6-BA 1.275mg/L,IBA 0.085mg/L。
生根培养基包括：基础培养基、盐酸硫胺素0.425mg/L,肌醇85mg/L,烟酸4.25mg/L,盐酸吡哆辛0.425mg/L,甘氨酸1.7mg/L,叶酸0.425mg/L,生物素0.0425g/L,蔗糖20g/L,植物琼脂4.5g/L,IBA 0.425mg/L,IAA 2.125mg/L,NAA 0.2125mg/L。
其中，上述培养基配方，直接使用有机物的高纯度化学试剂，避免了前述研究中直接使用生物组织液的情况，降低了成分不确定性的风险，更有利于实际生产的管控。
本实施例提供的方法，培养周期短，增殖和生根的总周期在10周左右；且增殖系数较高可达1:4-4.5，增殖后的株高约3.5cm，增殖后的成活合格率大于98％；生根率100％，且生根后的成活率大于99％；移栽后的成活率大于98％，适合远志的大规模工厂化育苗。
实施例2-6
实施例2-6分别为一种远志的生根及育苗方法，其步骤与实施例1相似，不同之处仅在于其中涉及的技术参数不同，具体详见下表：
实施例2-6中所涉及的基础培养基的成分如下所示：
实施例2-6中所涉及的启动培养基的成分如下所示：
实施例2-6中所涉及的增殖培养基的成分如下所示：
实施例2-6中所涉及的生根培养基的成分如下所示：
通过上述实施例2-6方法制得远志育苗，培养周期短，增殖和生根的总周期在10周左右；且增殖系数较高可达1:4-4.5，增殖后的株高约3.5cm，增殖后的成活合格率大于98％；生根率100％，且生根后的成活率大于99％；移栽后的成活率大于98％，适合远志的大规模工厂化育苗。
对比例1
一)在远志的生根及育苗方法中无菌外植体的制备，其中清洗消毒方法中避免使用升汞作为清洗消毒试剂，确保了远志的药用价值，其采用的方法是采用酒精浸泡，之后再用次氯酸钠浸泡，最后用无菌柠檬酸水清洗，对于此清洗消毒步骤做了优选方案的筛选，选取25个外植体样本，具体详见下表：
| 序号 | 处理方法 | 污染数(个) | 褐化率(％) | 成活率(％) |
| 1 | 酒精清洗 | 24 | 0 | 4 |
| 2 | 次氯酸钠清洗 | 21 | 28 | 0 |
| 3 | 无菌柠檬酸水清洗 | 25 | 0 | 0 |
| 4 | 酒精+次氯酸钠清洗 | 10 | 32 | 36 |
| 5 | 酒精+无菌柠檬酸水清洗 | 21 | 0 | 16 |
| 6 | 次氯酸钠+无菌柠檬酸水清洗 | 15 | 20 | 20 |
| 7 | 酒精+次氯酸钠+无菌柠檬酸水清洗 | 8 | 20 | 48 |
由上表可以看出，综合使用酒精、次氯酸钠和无菌柠檬酸水进行外植体消毒，污染数，褐化率都控制在较低范围，且成活率最高，效果最佳。
由上表可以看出，70-75％的酒精，2-5％的次氯酸钠溶液和0.1-0.15％的无水柠檬酸水溶液对外植体进行消毒和清洗处理后污染数，褐化率都控制在较低范围，且成活率最高，效果最佳。
由上表可以看出，对外植体进行消毒和清洗处理时，用70-75％的酒精浸泡1min，3-5％的次氯酸钠溶液浸泡10min和0.1-0.2％的无水柠檬酸水溶液浸洗，最终的效果最好。
二)在远志的生根及培养方法中所使用的增殖培养基中激素的种类及用量进行筛选，对远志的生长状况有直接的影响，筛选样本为接种顶芽的数量为50个，筛选结果如下表所示：
| 序号 | 6-BA mg/L | IBA mg/L | NAA mg/L | 增殖数/个 | 增殖系数/倍 | 平均株高/cm | 生长状况 |
| 1 | 1.0 | - | 0.1 | 148 | 2.96 | 3.65 | 较健壮 |
| 2 | 1.0 | - | 0.2 | 138 | 2.76 | 3.9 | 较健壮，有落叶 |
| 3 | 1.0 | 0.08 | - | 188 | 3.76 | 2.79 | 较健壮 |
| 4 | 1.0 | 0.085 | - | 188 | 3.76 | 2.86 | 较健壮 |
| 5 | 1.0 | 0.1 | - | 178 | 3.56 | 3.55 | 较健壮 |
| 6 | 1.0 | 0.115 | - | 175 | 3.5 | 3.56 | 较健壮 |
| 7 | 1.0 | 0.12 | - | 168 | 3.36 | 3.58 | 较健壮 |
| 8 | 1.0 | 0.2 | - | 155 | 3.1 | 3.65 | 较健壮 |
| 9 | 1.275 | - | 0.1 | 151 | 3.02 | 3.60 | 较健壮 |
| 10 | 1.275 | - | 0.2 | 139 | 2.78 | 3.85 | 较健壮 |
| 11 | 1.275 | 0.08 | - | 195 | 3.9 | 2.81 | 较健壮 |
| 12 | 1.275 | 0.085 | - | 195 | 3.9 | 2.85 | 较健壮 |
| 13 | 1.275 | 0.1 | - | 181 | 3.62 | 3.51 | 较健壮 |
| 14 | 1.275 | 0.115 | - | 178 | 3.56 | 3.56 | 较健壮 |
| 15 | 1.275 | 0.12 | - | 175 | 3.5 | 3.58 | 较健壮 |
| 16 | 1.275 | 0.2 | - | 158 | 3.16 | 3.65 | 较健壮 |
| 17 | 1.5 | - | 0.1 | 198 | 3.96 | 2.95 | 轻微玻璃化 |
| 18 | 1.5 | - | 0.2 | 145 | 2.98 | 3.65 | 轻微玻璃化 |
| 19 | 1.5 | 0.08 | - | 218 | 4.36 | 2.81 | 较健壮 |
| 20 | 1.5 | 0.085 | - | 218 | 4.36 | 2.85 | 较健壮 |
| 21 | 1.5 | 0.1 | - | 215 | 4.3 | 3.48 | 较健壮 |
| 22 | 1.5 | 0.115 | - | 188 | 3.76 | 3.55 | 较健壮 |
| 23 | 1.5 | 0.12 | - | 185 | 3.7 | 3.58 | 较健壮 |
| 24 | 1.5 | 0.2 | - | 165 | 3.3 | 3.81 | 较健壮 |
| 25 | 1.725 | - | 0.1 | 198 | 3.96 | 2.95 | 轻微玻璃化 |
| 26 | 1.725 | - | 0.2 | 145 | 2.98 | 3.65 | 轻微玻璃化 |
| 27 | 1.725 | 0.08 | - | 225 | 4.5 | 2.71 | 较健壮 |
| 28 | 1.725 | 0.085 | - | 220 | 4.4 | 2.78 | 较健壮 |
| 29 | 1.725 | 0.1 | - | 210 | 4.2 | 3.45 | 较健壮 |
| 30 | 1.725 | 0.115 | - | 195 | 3.9 | 3.55 | 较健壮 |
| 31 | 1.725 | 0.12 | - | 190 | 3.8 | 3.58 | 较健壮 |
| 32 | 1.725 | 0.2 | - | 158 | 3.16 | 3.65 | 较健壮 |
| 33 | 1.75 | 0.1 | - | 235 | 4.7 | 2.69 | 较细弱 |
由上表可以看出，当添加IBA时，增殖系数随浓度增高而降低，苗高随之增加，苗株都比较健壮，当添加NAA时，增殖系数和苗高也有类似的变化，但生长状况出现一些不理想状况，综合考虑增殖系数，苗株高度对继代增殖的效果，选择6-BA 1.275-1.725mg/L,IBA0.085-0.115mg/L作为最佳方案。
三)在远志的生根及育苗方法中，接种部位和培养周期的筛选对验证接种后的结果有直接影响，筛选最佳培养周期将最适于的增殖周期筛选出，节省大规模生产过程的增殖时间，时间利用率较高。
由上表可知，各部位接种后的育苗生长状况均良好，因此，在进行增殖过程中选取的接种部位均可以进行接种，生长状况在培育45天之后生长缓慢，因此增殖周期为45天，不仅能够确保增殖倍数最佳，株高也能够达到育苗标准。
四)对远志的生根及育苗方法进行优化筛选，其中对生根培养基的成分进行筛选，不同的培养基对生根率及远志苗的状况影响较大，筛选结果如下：
其中MS培养基的成分包括：二水合氯化钙440mg/L,磷酸二氢钾170mg/L,硝酸钾950mg/L,七水合硫酸镁370mg/L,硝酸铵825mg/L,六水合氯化钴0.025mg/L,五水合硫酸铜0.025mg/L,EDTA钠铁盐36.7mg/L,硼酸6.2mg/L,碘化钾0.83mg/L,一水合硫酸锰16.3mg/L,二水合钼酸钠0.25mg/L,七水合硫酸锌8.6mg/L。
由上表可知，在相同条件下，选用实施例1中所提供的培养基，生根率达到100％，根系发达，移栽成活率高。
五)对远志的生根及育苗方法进行优化筛选，其中对生根培养基的激素的种类及浓度进行筛选，其中，不同激素的浓度对生根率及幼苗的生长状况有明显的差异，筛选结果如下表所示：
由上表可以看出，在添加IBA的基础上，当添加IAA时，生根率较高，且在本实验添加的浓度范围内，生根数量随IBA浓度高而减少，根的长度随IAA浓度升高而增长；当添加NAA时，生根率较低，且在本实验添加的浓度范围内，生根数量随IBA浓度高而减少，根的长度随NAA浓度升高而变短；当同时添加IAA和NAA时，生根率极高，且有生根多且长粗的上佳表现。故根据对比，选择IBA 0.425～0.575mg/L,IAA 2.125～2.875mg/L,NAA 0.2125～0.2875mg/L浓度组合作为最佳方案，而对于三种成分的组合效果，详见实施例1-6中的列举。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述技术内容作为启示加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作出的简单修改，等同变化与改型，仍属于本发明权利要求的保护范围。
Claims (4)
1.一种远志的生根及育苗方法，其特征在于它由以下步骤组成：
1)无菌外植体的制备：将远志的外植体进行清洗，之后先采用70％-75％的乙醇浸泡，再采用2-5％的次氯酸钠浸泡，最后用0.1-0.2％的柠檬酸水浸洗，得到远志无菌外植体；
2)无菌苗的制备：将远志无菌外植体接种于启动培养基上，培养50-60天得到无菌苗；
3)组培苗的制备：将无菌苗接种于增殖培养基上，培养40-50天得到生根苗；
4)生根苗组培苗的制备：将生根苗切取≥2cm的植株，接种于生根培养基上，培养25-35天即可得组培生根苗；
5)炼苗：将组培生根苗移栽炼苗，得到远志种植苗；
其中，所述步骤2)的培养方法为在温度为22-28℃，光照强度1200-1800lux下，光照培养14h之后暗培养10h，连续培养；
所述步骤2)中的启动培养基、步骤3)中的增殖培养基和步骤4)中的生根培养基中均包括基础培养基；
所述基础培养基包括：二水合氯化钙280.5～379.5mg/L,四水合硝酸钙382.5～517.5mg/L,氯化钾318.75～431.25mg/L,磷酸二氢钾216.75～293.25mg/L,硝酸钾、701.25～948.75mg/L,七水合硫酸镁956.25～1293.75mg/L,硝酸铵262.65～355.35mg/L,六水合氯化钴0.02125～0.02875mg/L,五水合硫酸铜0.2125～0.2875mg/L,EDTA钠铁盐31.195～42.205mg/L,硼酸10.54～14.26mg/L,碘化钾0.7055～0.9545mg/L,一水合硫酸锰14.365～19.435mg/L,二水合钼酸钠0.2125～0.2875mg/L,七水合硫酸锌12.155～16.445mg/L；
所述启动培养基包括：基础培养基、盐酸硫胺素0.34～0.46mg/L,肌醇85～115mg/L,烟酸0.425～0.575mg/L,盐酸吡哆辛0.425～0.575mg/L,甘氨酸1.7～2.3mg/L,蔗糖20～40g/L,植物琼脂4.5～6.5g/L,6-BA 2.55～3.45mg/L,IBA 0.085～0.115mg/L；
所述增殖培养基包括：基础培养基、盐酸硫胺素0.34～0.46mg/L,肌醇85～115mg/L,烟酸0.425～0.575mg/L,盐酸吡哆辛0.425～0.575mg/L,甘氨酸1.7～2.3mg/L,蔗糖20～40g/L,植物琼脂4.5～6.5g/L,6-BA 1.275～1.725mg/L,IBA 0.085～0.115mg/L；
所述生根培养基包括：基础培养基、盐酸硫胺素0.425～0.575mg/L,肌醇85～115mg/L,烟酸4.25～5.75mg/L,盐酸吡哆辛0.425～0.575mg/L,甘氨酸1.7～2.3mg/L,叶酸0.425～0.575mg/L,生物素0.0425～0.0575mg/L,蔗糖20～40g/L,植物琼脂4.5～6.5g/L,IBA0.425～0.575mg/L,IAA 2.125～2.875mg/L,NAA 0.2125～0.2875mg/L。
2.根据权利要求1所述的远志的生根及育苗方法，其特征在于：所述步骤3)制备得到的组培苗还可用于继代培养组培苗。
3.根据权利要求2所述的远志的生根及育苗方法，其特征在于：所述步骤3)组培苗及继代培养组培苗的方法包括：选取1.0-1.5cm的顶芽，选取0.5-0.8cm的基部丛芽，选取至少带2个芽点0.8-1.2cm的茎段，接种于增殖培养基上，在温度22-28℃，光照强度1200-1800lux下，光照培养16h之后暗培养8h，连续培养。
4.根据权利要求1所述的远志的生根及育苗方法，其特征在于：所述步骤4)生根苗组培苗的制备方法为在温度22-28℃，光照强度1200-1800lux下，光照培养16h之后暗培养8h，连续培养。
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