CN113016618A - 莺歌属凤梨的组织培养快繁方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物育苗技术领域，莺歌属凤梨的组织培养快繁的方法。包括如下步骤：1)无菌外植体的制备：将莺歌属凤梨外植体采用水清洗后，然后消毒得无菌外植体。2)无菌苗的制备：将无菌外植体接种于启动培养基上，培养得到无菌苗；3)组培苗的制备：将无菌苗接种于增殖培养基上，培养得到组培苗；4)生根苗组培苗的制备：将获得的组培苗的丛生芽分株，选择丛生芽≥1.5cm的植株，接种于生根培养基上，即可得组培生根苗。

Description

莺歌属凤梨的组织培养快繁方法

技术领域

本发明属于植物育苗技术领域，莺歌属凤梨的组织培养快繁的方法。

背景技术

观赏凤梨为凤梨科多年生草本植物，原产于中、南美洲的热带、亚热带地区，以附生种类为主，一般附生于树干或石壁上，性喜温暖、潮湿的半遮阴环境。

常见的种类和品种，主要是属于凤梨科的珊瑚凤梨属(Aech-mea)、水塔花属(Billbergia)、果子蔓属(Guzmania)、彩叶凤梨属(Neo-regelia)、铁兰属(Tillandsia)和莺歌属(Vriesea)这6个类群。它们以观花为主，也有观叶的种类，其中还有不少种类花叶并貌，既可观花又可观叶。莺歌属凤梨花茎笔直细长，苞片鲜艳，红黄两色华丽夺目，玲珑可爱，并能很好用途地净化室内空气，常布置于书桌茶几花架上，是高档的插花受人们欢迎。

目前国内针对凤梨莺歌属品种的组织培养技术研究还比较少。

1、发明《一种空气凤梨的组织培养快繁方法》，专利号CN 105028194公开了一种空气凤梨的组织培养快繁方法，包括步骤：种子无菌处理，诱导丛生芽，增殖培养，壮苗培养制备得到空气凤梨壮苗，解决了空气凤梨诱导愈伤组织和消毒获得无菌苗的问题。

2、专利号为CN 103461120的专利，公开了一种空气凤梨组织培养基及组培快繁空气凤梨的方法，培养基的配方如下：1/2MS+IAA0.5mg·L-1+蔗糖3％+琼脂0.6％，pH5.6～5.8。该发明指出，其需在培养室内培养长达9个月，方可出瓶进行栽培。

凤梨科观赏型凤梨株型优美，市场前景广阔。但是由于其多为杂交种或选育的品种，种子的遗传稳定性差，获取难度大，扦插等方式速度慢，不利于大规模的生产。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中的不足，提出了一种莺歌属凤梨的组织培养快繁方法。本发明采用凤梨的外植体侧芽作为取材对象，消毒诱导愈伤组织，获取无菌苗。经过大量产品的验证，该系列培养基配方的使用有效地解决了凤梨组培中变异率高的问题。同时简化了培养的步骤，缩短了培养周期，极大地节约了培养基，减少了人工操作的内容。是一种极适合工厂化生产的方法。

本发明是通过如下技术方案实现上述目的的，一种莺歌属凤梨的组织培养快繁方法，包括如下步骤：

2)无菌外植体的制备：

将莺歌属凤梨外植体采用水清洗后，然后消毒得无菌外植体。

2)无菌苗的制备：将无菌外植体接种于启动培养基上，培养得到无菌苗；培养条件为：在温度为22-28℃，光照强度1800-2200lux下，光照培养12h之后暗培养12h，连续培养8周得到无菌苗。

3)组培苗的制备：将无菌苗接种于增殖培养基上，培养得到组培苗；培养条件为：在温度22-28℃，光照强度1800-2200lux下，光照培养12h之后暗培养12h，连续培养16周，得到可用于生根的组培苗。

4)生根苗组培苗的制备：将获得的组培苗的丛生芽分株，选择丛生芽中≥1.5cm的植株，接种于生根培养基上，即可得组培生根苗。

优选的，所述步骤1)的具体步骤为：

将莺歌属凤梨外植体采用水进行清洗，之后先采用乙醇水溶液浸泡，再采用次氯酸钠水溶液浸泡，最后用柠檬酸水浸洗，获得无菌外植体。进一步优选为：将莺歌属凤梨外植体采用水进行清洗，之后先采用70V％的乙醇水溶液浸泡1min，再采用3wt％的次氯酸钠水溶液浸泡10min，最后用0.15wt％的柠檬酸水浸洗3次，获得无菌外植体。

优选的，步骤2)所述启动培养基组分为：

二水合氯化钙220mg/L，磷酸二氢钾85mg/L，硝酸钾950mg/L,七水合硫酸镁185mg/L，硝酸铵825mg/L，六水合氯化钴0.025g/L，五水合硫酸铜0.025g/L，EDTA钠铁盐36.6mg/L，硼酸6.2mg/L，碘化钾0.83mg/L，一水合硫酸锰16.6mg/L，二水合钼酸钠0.25mg/L，七水合硫酸锌8.6mg/L，磷酸二氢钠192mg/L，盐酸硫胺素0.4mg/L，硫酸盐腺嘌呤80mg/L，肌醇100mg/L，柠檬酸150mg/L，蔗糖20g/L，结冷胶2.2g/L，6-BA 0.09mg/L，NAA0.05mg/L，200mg/LZ抗坏血酸素。

优选的，步骤3)所述增殖培养基组分为：二水合氯化钙220mg/L，磷酸二氢钾85mg/L，硝酸钾950mg/L,七水合硫酸镁185mg/L，硝酸铵825mg/L，六水合氯化钴0.025g/L，五水合硫酸铜0.025g/L，EDTA钠铁盐36.6mg/L，硼酸6.2mg/L，碘化钾0.83mg/L，一水合硫酸锰16.6mg/L，二水合钼酸钠0.25mg/L，七水合硫酸锌8.6mg/L；磷酸二氢钠192mg/L，盐酸硫胺素0.4mg/L，硫酸盐腺嘌呤80mg/L，肌醇100mg/L，柠檬酸150mg/L，蔗糖20g/L，结冷胶2.2g/L，6-BA 0.09mg/L,NAA0.05mg/L；

优选的，步骤4)所述的生根培养基成分如下：

二水合氯化钙220mg/L，磷酸二氢钾85mg/L，硝酸钾950mg/L,七水合硫酸镁185mg/L，硝酸铵825mg/L，六水合氯化钴0.025g/L，五水合硫酸铜0.025g/L，EDTA钠铁盐36.6mg/L，硼酸6.2mg/L，碘化钾0.83mg/L，一水合硫酸锰16.6mg/L，二水合钼酸钠0.25mg/L，七水合硫酸锌8.6mg/L，盐酸硫胺素0.4mg/L，肌醇100mg/L，IBA 0.45mg/L,IAA 2.5mg/L,NAA 0.2mg/L，蔗糖20g/L，结冷胶2.2g/L，活性炭粉2g/L。

优选的，步骤2)中培养时间为8周；步骤3)培养时间为16周；步骤4)中培养时间为培养6周。

目前缺乏针对某个属的凤梨工厂化生产的研究还比较少。本发明与已有研究成果相比，本发明具有如下优点：

1、本发明的室内培养周期为22周(一般步骤2)，启动培养，只在制备无菌苗过程中做一次，工厂化生产，只包含增殖培养16周+生根培养6周)，且完成生根培养，与之相比，效率明显提高。

2、外植体的获取方法更高效；组培快繁稳定性高，解决了大规模生产的难题。

3、本发明具有节约成本，缩短周期，减少人为操作，适应规模化生产的优点。

4、针对莺歌属，具有广泛的品种适用性。

附图说明

图1为本发明方法流程图；

图2为培养0周组培苗结果；

图3为培养4周组培苗结果；

图4为培养8周组培苗结果；

图5为培养12周组培苗结果；

图6为组培苗培养0周的组培生根苗的整体视图；

图7为组培苗培养0周的组培生根苗的整体视图的根部局部视图；

图8为组培苗培养6周的组培生根苗的整体视图；

图9为组培苗培养6周的组培生根苗的整体视图的根部局部视图。

具体实施方式

试剂缩写：6-BA为6-苄氨基嘌呤；NAA为萘乙酸；IBA为3-吲哚丁酸；IAA为吲哚-3-乙酸。

莺歌属凤梨的组织培养快繁方法(记为方法A)，包括以下步骤：

1.无菌外植体的制备：用植株老叶鞘作为外植体，将莺歌属凤梨的外植体进行采用水清洗5min，将其切成带芽点的小块；清洗之后先采用70V％的乙醇水溶液浸泡1min，转移到超净工作台内，再用采用3wt％的次氯酸钠水溶液浸泡10min，最后用0.15wt％的柠檬酸水浸洗3遍，晾干后得到无菌外植体。

2.无菌苗的制备：将凤梨无菌外植体接种于启动培养基上，在温度为22-28℃，光照强度1800-2200lux下，光照培养12h之后暗培养12h，连续培养8周得到无菌苗。

3.组培苗的制备：将丛生芽分株成单株，将单株切取成1cm长度，接种于增殖培养基上，在温度22-28℃，光照强度1800-2200lux下，光照培养12h之后暗培养12h，连续培养16周，得到可用于生根的组培苗；其增殖系数为1:4，且增殖后的平均株高约2-2.5cm(10片以上真叶)，增殖成活合格率大于99％。

分别培养0周、4周、8周和12周获得的组培苗结果分别见图2-5，结果表明实施的增殖培养，植株成活率达100％，且生长指标良好、增殖系数达到技术标准。

该步骤制得的组培苗还可用于继代培养组培苗，其培养方法与组培苗的方法相同。

4生根苗组培苗的制备：将组培苗的丛生芽分取≥1.5cm的植株单株，接种于生根培养基上，在温度22-28℃，光照强度1800-2200lux下，光照培养12h之后暗培养12h，连续培养6周即可得组培生根苗；得到的组培生根苗生根率为100％，成活率大于99％。

生根苗组培苗培养0周和6周的组培生根苗见图6-9，其中6为整体视图，7为6的根部局部视图；8为6周的整体视图，9为8的根部局部视图；结果表明实施的生根培养，幼苗成活率、成长性、生根结果，都达到技术标准。

基础培养基成分如下：

二水合氯化钙220mg/L，磷酸二氢钾85mg/L，硝酸钾950mg/L,七水合硫酸镁185mg/L，硝酸铵825mg/L，六水合氯化钴0.025g/L，五水合硫酸铜0.025g/L，EDTA钠铁盐36.6mg/L，硼酸6.2mg/L，碘化钾0.83mg/L，一水合硫酸锰16.6mg/L，二水合钼酸钠0.25mg/L，七水合硫酸锌8.6mg/L。

启动培养基成分如下：

基础培养基，磷酸二氢钠192mg/L，盐酸硫胺素0.4mg/L，硫酸盐腺嘌呤80mg/L，肌醇100mg/L，柠檬酸150mg/L，蔗糖20g/L，结冷胶2.2g/L，6-BA 0.09mg/L，NAA0.05mg/L，200mg/LZ抗坏血酸素。

增殖培养基成分如下：

基础培养基,磷酸二氢钠192mg/L，盐酸硫胺素0.4mg/L，硫酸盐腺嘌呤80mg/L，肌醇100mg/L，柠檬酸150mg/L，蔗糖20g/L，结冷胶2.2g/L，6-BA 0.09mg/L,NAA0.05mg/L，

生根培养基成分如下：

基础培养基，盐酸硫胺素0.4mg/L，肌醇100mg/L，IBA 0.45mg/L,IAA 2.5mg/L,NAA0.2mg/L，蔗糖20g/L，结冷胶2.2g/L，活性炭粉2g/L。

一、无菌操作步骤的优化过程

在莺歌属凤梨无菌外植体的制备中，其中清洗消毒方法中避免使用剧毒试剂升汞作为清洗消毒试剂，保障消毒效果的同时，提高了成活率和后期成苗质量，其采用的方法是采用70V％酒精浸泡30s，之后再用3wt％次氯酸钠浸泡10min，最后用无菌柠檬酸水清洗3次，对于此清洗消毒步骤做了优选方案的筛选,以启动培养基培养得到的无菌苗的污染数、褐化率、成活率为评估指标，结果见表1。

表1无菌外植体制备的实验

由上表可以看出，70V％的酒精，3wt％的次氯酸钠溶液和0.15wt％的无水柠檬酸水溶液对凤梨外植体进行消毒和清洗处理后污染数，褐化率都控制在较低范围，且成活率最高，效果最佳。

酒精和次氯酸钠处理时间对无菌苗的污染数、褐化率、成活率的影响，见表2所示：

表2处理时间对无菌外植体制备的影响

由上表可以看出，对外植体进行消毒和清洗处理时，用70％的酒精浸泡1min，3％的次氯酸钠溶液浸泡10min和0.15％的无水柠檬酸水溶液浸洗，最终的效果最好。

凤梨无菌苗的制备方法，对后续以此为母本的增殖和继代培养，有关键影响。

二、

本发明在对启动培养后获得无菌苗进行优化后，无菌苗经过增殖培养，获得组培苗，数量放大后，我们有条件开展最优增殖培养基的实验优化。

按莺歌属凤梨的组织培养快繁方法(方法A)，研究增殖/继代(步骤3))成分对莺歌属凤梨组培苗继代培养的生长状况的影响：

增殖/继代培养基激素实验水平，细胞分裂素使用6-BA 0.05mg/L-0.15mg/L；生长素使用NAA0-0.1mg/L和IBA0-0.1mg/L，具体如表3所示：

表3不同生长激素水平

按照上述的培养方法，改变增殖/继代培养基成分比例对莺歌属凤梨增殖/继代培养正交实验，各处理结果如下表4所示：

表4不同生长激素水平对凤梨增殖培养状况的影响

增殖系数是指：增殖系数是指切割接种的符合要求的单株(按要求切取的凤梨小芽株)，在完成一次继代培养后，从最初那个单株的培养结果上，能切取出符合要求的有效单株的数量。

最终选择处理：0.1mg/L6-BA+0.05mg/L NAA；继代培养平均增殖系数为4。

三、

按莺歌属凤梨的组织培养快繁方法(方法A)，对凤梨的生根及育苗方法进行优化筛选过程，其中对生根培养基的激素的种类及浓度进行筛选，其中，不同激素的浓度对生根率及幼苗的生长状况有明显的差异，不同激素水平见表5，对应筛选结果如下表6所示：

表5不同生长激素水平

表6不同生长激素水平下的生根率和幼苗表现

在添加IBA的基础上，在本实验范围内，当添加IAA时，生根率较高，生根数量随IBA浓度高而减少，根的长度随IAA浓度升高而增长；当添加NAA时，生根率较低，在本实验范围内，生根数量随IBA浓度高而减少，根的长度随NAA浓度升高而变短；当同时添加IAA和NAA时，生根率极高，且有生根多且长粗的上佳表现。故根据对比，选择IBA 0.45mg/L,IAA2.5mg/L,NAA 0.2mg/L浓度组合作为最佳方案。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种莺歌属凤梨的组织培养快繁方法，包括如下步骤：

1)无菌外植体的制备：

将莺歌属凤梨外植体采用水清洗后，然后消毒得无菌外植体；

2)无菌苗的制备：将无菌外植体接种于启动培养基上，培养得到无菌苗；

3)组培苗的制备：将无菌苗接种于增殖培养基上，培养得到组培苗；

4)生根苗组培苗的制备：将获得的组培苗的丛生芽分株，选择丛生芽中≥1.5cm的植株，接种于生根培养基上，即可得组培生根苗。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)的具体步骤为：

将莺歌属凤梨外植体采用水进行清洗，之后先采用乙醇水溶液浸泡，再采用次氯酸钠水溶液浸泡，最后用柠檬酸水浸洗，获得无菌外植体。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：将莺歌属凤梨外植体采用水进行清洗，之后先采用70V％的乙醇水溶液浸泡1min，再采用3wt％的次氯酸钠水溶液浸泡10min，最后用0.15wt％的柠檬酸水浸洗3次，获得无菌外植体。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)所述启动培养基组分为：

二水合氯化钙220mg/L，磷酸二氢钾85mg/L，硝酸钾950mg/L,七水合硫酸镁185mg/L，硝酸铵825mg/L，六水合氯化钴0.025g/L，五水合硫酸铜0.025g/L，EDTA钠铁盐36.6mg/L，硼酸6.2mg/L，碘化钾0.83mg/L，一水合硫酸锰16.6mg/L，二水合钼酸钠0.25mg/L，七水合硫酸锌8.6mg/L，磷酸二氢钠192mg/L，盐酸硫胺素0.4mg/L，硫酸盐腺嘌呤80mg/L，肌醇100mg/L，柠檬酸150mg/L，蔗糖20g/L，结冷胶2.2g/L，6-BA 0.09mg/L，NAA0.05mg/L，200mg/LZ抗坏血酸素。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)所述增殖培养基组分为：二水合氯化钙220mg/L，磷酸二氢钾85mg/L，硝酸钾950mg/L,七水合硫酸镁185mg/L，硝酸铵825mg/L，六水合氯化钴0.025g/L，五水合硫酸铜0.025g/L，EDTA钠铁盐36.6mg/L，硼酸6.2mg/L，碘化钾0.83mg/L，一水合硫酸锰16.6mg/L，二水合钼酸钠0.25mg/L，七水合硫酸锌8.6mg/L；磷酸二氢钠192mg/L，盐酸硫胺素0.4mg/L，硫酸盐腺嘌呤80mg/L，肌醇100mg/L，柠檬酸150mg/L，蔗糖20g/L，结冷胶2.2g/L，6-BA 0.09mg/L,NAA0.05mg/L。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4)所述的生根培养基成分如下：

二水合氯化钙220mg/L，磷酸二氢钾85mg/L，硝酸钾950mg/L,七水合硫酸镁185mg/L，硝酸铵825mg/L，六水合氯化钴0.025g/L，五水合硫酸铜0.025g/L，EDTA钠铁盐36.6mg/L，硼酸6.2mg/L，碘化钾0.83mg/L，一水合硫酸锰16.6mg/L，二水合钼酸钠0.25mg/L，七水合硫酸锌8.6mg/L，盐酸硫胺素0.4mg/L，肌醇100mg/L，IBA 0.45mg/L,IAA 2.5mg/L,NAA 0.2mg/L，蔗糖20g/L，结冷胶2.2g/L，活性炭粉2g/L。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中培养时间为8周；步骤3)培养时间为16周；步骤4)中培养时间为培养6周。

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