CN106942065B

CN106942065B - 一种套叶兰离体培养快繁方法

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Publication number: CN106942065B
Application number: CN201710333894.XA
Authority: CN
Inventors: 梁钧淞; 杨业容; 韦敏
Original assignee: Yulin Normal University
Current assignee: Yulin Normal University
Priority date: 2017-05-12
Filing date: 2017-05-12
Publication date: 2018-11-27
Anticipated expiration: 2037-05-12
Also published as: CN106942065A

Abstract

本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种套叶兰离体培养快繁方法，包括依次进行的如下步骤：获取套叶兰植株的外植体、外植体诱导培养、根状茎的增殖培养、根状茎的分化培养、壮苗培养、炼苗和移栽；所述的外植体诱导培养操作的外植体诱导培养基包括：KC培养基、0.5～1.0mg/L 6‑BA、0.01～0.05mg/L ZT、0.1～1.0mg/L IBA、15～25g/L蔗糖、3.5～5.0g/L琼脂、30～50ml/L椰子汁，pH为5.4～5.8，本发明选择套叶兰新生营养芽为外植体，经诱导培养、增殖培养、分化培养、壮苗培养、炼苗和移栽等步骤，其诱导率达到了68％以上，成活率达到了94％以上，实现了套叶兰的组培快繁，从而实现了本发明的目的。

Description

一种套叶兰离体培养快繁方法

技术领域

本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种套叶兰离体培养快繁方法。

背景技术

“竹有节而啬花。梅有花而啬叶，松有叶而啬香。惟兰独并有之。”，这是人们对有“君子花”之称的兰花人格化评价。兰花不仅有自然美的欣赏上达到了至高无上的境界，而且涵盖了所有花卉的优秀品格而成为最瑧完美的“人格花”，但近年来，由于人们的无度采挖，导致其数量锐减，包括套叶兰(Hippeophyllum sinicum)在内多种兰花植物已处于濒危状态。套叶兰为兰科(Orchidaceae)套叶兰属(Hippeophy Schltr.)的一种附生兰。套叶兰属约有6种，分布于马来西亚、印度尼西亚、菲律宾、新几内亚岛、所罗门群岛以及我国亚热带地区，我国产有2种，分别为套叶兰(H.sinicum)和宝岛套叶兰(H.pumilum)，分别分布于甘肃南部白龙江流域和台湾中部。

套叶兰与春兰等国兰属于长苞组，均为附生草本，具长的横走根状茎，根茎上以一定的距离着生叶簇，茎较短，包于叶基之内。花期11月，花形与春兰相似，呈黄金色，其香味幽远，开花时节十里飘香，深受人们喜爱，具有有较高的园艺观赏价值。目前套叶兰以分株繁殖为主，繁殖效率低，种苗匮乏，导致其未得到广泛开发应用，绝大部分套叶兰处于野生状态，但常被无度采挖和交易，加之生境地的恶化，数量锐减，处于近濒危状态，因此很有必要建立套叶兰的离体培养快繁体系。

发明内容

本发明的目的是提供一种套叶兰离体培养快繁方法，本发明选择套叶兰新生营养芽为外植体，经诱导培养、增殖培养、分化培养、壮苗培养、炼苗和移栽等步骤，其诱导率达到了68％以上，成活率达到了94％以上，实现了套叶兰的组培快繁，从而实现了本发明的目的。

本发明提供的技术方案为：一种套叶兰离体培养快繁方法，包括依次进行的如下步骤：获取套叶兰植株的外植体、外植体诱导培养、根状茎的增殖培养、根状茎的分化培养、壮苗培养、炼苗和移栽；

所述的外植体诱导培养操作的外植体诱导培养基包括：KC培养基、0.5～1.0mg/L6-BA、0.01～0.05mg/L ZT、0.1～1.0mg/L IBA、15～25g/L蔗糖、3.5～5.0g/L琼脂、30～50ml/L椰子汁，pH为5.4～5.8。

在上述的套叶兰离体培养快繁方法中，所述的外植体诱导培养操作的方法为：将采集得到的作为外植体的叶兰植株消毒后纵向切成0.3～0.5cm的芽点，接种到诱导培养基中暗培养90～120天即可诱导形成长度为2～3cm的根状茎。

在上述的套叶兰离体培养快繁方法中，所述的根状茎的增殖培养操作所用到的增殖培养基包括：MS、0.1～0.5mg/L 6-BA、0.05～0.1mg/L NAA、0.01～0.05mg/L KT、15～25g/L蔗糖、3.5～4.5g/L琼脂、0.1～0.2g/L活性炭、10～20ml/L椰子汁，pH为5.4～5.8。

在上述的套叶兰离体培养快繁方法中，所述的根状茎的增殖培养操作具体为：将外植体诱导培养操作得到的根状茎切成长0.5～1.0的茎段并接种到增殖培养基中培养40～50天即可获得长度为4～6cm的根状茎。

在上述的套叶兰离体培养快繁方法中，所述的根状茎的分化培养操作所用到的分化培养基包括：MS、0.5～2.0mg/L NAA、0.1～0.5mg/L 6-BA、30～35g/L蔗糖、3.5～4.0g/L琼脂、0.05～0.1g/L活性炭，pH为5.4～5.8。

在上述的套叶兰离体培养快繁方法中，所述的根状茎的分化培养操作的方法为：从根状茎的增殖培养得到增殖后的根状茎切成长度为1.5～2.0cm的茎段并接种到分化培养基中培养50～60天即能分化出试管小苗。

在上述的套叶兰离体培养快繁方法中，所述的壮苗培养所用到的壮苗培养基包括：1/2MS、0.5～1.0mg/L NAA、0.1～0.5mg/L GGR-6、15～20g/L蔗糖、3.5～4.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。

在上述的套叶兰离体培养快繁方法中，所述的壮苗培养操作的方法为：将经过根状茎的分化培养操作得到的试管小苗根部粘连的根状茎切除并将小苗转接至壮苗培养基中培养30～45天即可获得高3～5cm的套叶兰试管苗。

在上述的套叶兰离体培养快繁方法中，所述的炼苗和移栽的具体操作为：将经壮苗培养操作所得的套叶兰试管苗在温室的自然光下打开组培瓶盖子炼苗1～2天，洗净根部的培养基后在温室自然晾干至根系发白，在体积比为2:2:1的树皮、兰石、泥岩的混合基质中栽培成苗即为套叶兰种苗。

在上述的套叶兰离体培养快繁方法中，根状茎的增殖培养操作、根状茎的分化培养操作、壮苗培养操作中培养条件均为：培养温度为25～28℃，光照强度为1500～2000lx，光照时间为12～15小时/天；

外植体诱导培养操作中培养温度为25～28℃。

有益效果：

本发明采用植物组织培养技术建立了套叶兰的组培快繁，本发明具有周期短、成本低廉、成活率高等特点，可直接用于套叶兰种苗的工厂化生产，对于促进套叶兰的植物资源开发具有重要的现实意义。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例一

(1)外植体采集：2013年春季，当新芽萌动时，在野外选择无明显病害的健壮套叶兰植株，用解剖刀从基部切取叶鞘未打开的新生营养芽，进行简单的保水保湿处理后及时带回实验室进行消毒处理。

(2)根状茎的诱导：将外植体在自来水下冲洗过夜，剥去外面的叶鞘至仅剩下两层叶鞘并置于超净工作台中于0.1％的升汞溶液中消毒5分钟，无菌水冲洗2次后剥去一层叶鞘，再置于0.1％的升汞溶液中消毒1分钟。用无菌水漂洗3次后剥去最后一层叶鞘并用无菌水漂洗5次后用无菌滤纸吸干外植体表面的水分，用无菌解剖刀将外植体纵向切成0.3～0.5cm左右的芽点，接种到诱导培养基中暗培养90天即可诱导形成长度约为2～3cm的根状茎，污染率低于15％，诱导率达到71.9％。所述的诱导培养基为：KC培养基+1.0mg/L6-BA(6-benzylaminopurine)+0.05mg/L ZT(zeatin)+1.0mg/L IBA(3-indolebutyric acid)+15g/L蔗糖+3.5g/L琼脂+30ml/L椰子汁，pH为5.4。

(3)根状茎的增殖：将步骤(2)获得的根状茎用无菌解剖刀切成长度约为0.5～1.0cm的茎段并接种到增殖培养基中培养40天即可获得长度为4～6cm、粗壮的根状茎，增殖系数为4.7。根据需要，可将新获得的根状茎再次切成后0.5～1.0cm的茎段作为增殖材料，并在增殖培养基中进行材料的增殖培养，所述的增殖培养基为：MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/LNAA(1-Naphthylacetic acid)+0.05mg/L KT(kinetin)+15g/L蔗糖+3.5g/L琼脂+0.1g/L活性炭+10ml/L椰子汁，pH为5.4。

(4)分化培养：将步骤(3)获得的根状茎切成长度为1.5～2.0cm的茎段并接种到分化培养基中培养50天即能分化出试管小苗，分化率达到79.6％。所述的分化培养基为：MS+2.0mg/L NAA(1-Naphthylacetic acid)+0.5mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂+0.05g/L活性炭，pH为5.4。

(5)壮苗培养：切除与步骤(4)所得的试管小苗根部粘连的根状茎并将小苗转接至壮苗培养基中培养30天即可获得高约3～5cm的套叶兰试管苗，所述的壮苗培养基为：1/2MS+1.0mg/L NAA+0.5mg/L GGR-6(中国林业科学研究院研制的双吉尔GGR-6)+15g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.4。

(6)炼苗和移栽：将步骤(5)所得健壮的、高约5～7cm的组培苗在温室的自然光下打开组培瓶盖子炼苗1天，洗净根部的培养基后在温室自然晾干至根系发白，在体积比为2:2:1的树皮、兰石、泥岩的混合基质中栽培成苗即为套叶兰种苗，移栽种植30天后成活率达到94.5％。

上述步骤(2)的培养条件为：培养温度为25℃；

上述步骤(3)～(5)的培养条件为：培养温度为25℃，光照强度为1500lx，光照时间为12小时/天。

实施例二

(1)外植体采集：2014年春季，当套叶兰新芽萌动时，在野外选择无明显病害的健壮植株，用解剖刀从基部切取叶鞘未打开的新生营养芽，进行保水保湿处理后及时带回实验室进行消毒处理。

(2)根状茎的诱导：将外植体在自来水下冲洗过夜，剥去外面的叶鞘至仅剩下两层叶鞘并置于超净工作台中于0.1％的升汞溶液中消毒8分钟，无菌水冲洗2次后剥去一层叶鞘，再置于0.1％的升汞溶液中消毒2分钟。用无菌水漂洗4次后剥去最后一层叶鞘并用无菌水漂洗6次后用无菌滤纸吸干外植体表面的水分，用无菌解剖刀将外植体纵向切成0.3～0.5cm左右的芽点，接种到诱导培养基中暗培养105天即可诱导形成长度约为2～3cm的根状茎，污染率低于10％，诱导率达到79.8％。所述的诱导培养基为：KC培养基+0.7mg/L6-BA(6-benzylaminopurine)+0.03mg/L ZT(zeatin)+0.5mg/L IBA(3-indolebutyric acid)+20g/L蔗糖+4.0g/L琼脂+40ml/L椰子汁，pH为56。

(3)根状茎的增殖：将步骤(2)获得的根状茎用无菌解剖刀切成长度约为0.5～1.0cm的茎段并接种到增殖培养基中培养45天即可获得长度为4～6cm、粗壮的根状茎，增殖系数为4.71。根据需要，可将新获得的根状茎再次切成后0.5～1.0cm的茎段作为增殖材料，并在增殖培养基中进行材料扩繁，所述的增殖培养基为：MS+0.3mg/L6-BA+0.07mg/L NAA(1-Naphthylacetic acid)+0.03mg/L KT(kinetin)+20g/L蔗糖+4.0g/L琼脂+0.15g/L活性炭+15ml/L椰子汁，pH为5.6。

(4)分化培养：将步骤(3)获得的根状茎切成长度为1.5～2.0cm的茎段并接种到分化培养基中培养56天即能分化出试管小苗，分化率达到81.9％。所述的分化培养基为：MS+1.3mg/L NAA(1-Naphthylacetic acid)+0.3mg/L 6-BA+33g/L蔗糖+3.7g/L琼脂+0.07g/L活性炭，pH为5.6。

(5)壮苗培养：切除与步骤(4)所得的试管小苗根部粘连的根状茎并将小苗转接至壮苗培养基中培养37天即可获得高约3～5cm的套叶兰试管苗，所述的壮苗培养基为：1/2MS+0.7mg/L NAA+0.3mg/L GGR-6(中国林业科学研究院研制的双吉尔GGR-6)+17g/L蔗糖+3.70g/L琼脂，pH为5.6。

(6)炼苗和移栽：将步骤(5)所得健壮的、高约5～7cm的组培苗在温室的自然光下打开组培瓶盖子炼苗1天，洗净根部的培养基后在温室自然晾干至根系发白，在体积比为2:2:1的树皮、兰石、泥岩的混合基质中栽培成苗即为套叶兰种苗，移栽30后成活率达到95％以上。

上述步骤(2)的培养条件为：培养温度为27℃；

上述步骤(3)～(5)的培养条件为：培养温度为27℃，光照强度为1700lx，光照时间为14小时/天。

实施例三

(1)外植体采集：2015年春季，当套叶兰新芽萌动时，在野外选择无明显病害的健壮植株，用解剖刀从基部切取叶鞘未打开的新生营养芽，进行保水保湿处理后及时带回实验室进行消毒处理。

(2)根状茎的诱导：将外植体在自来水下冲洗过夜，剥去外面的叶鞘至仅剩下两层叶鞘并置于超净工作台中于0.1％的升汞溶液中消毒10分钟，无菌水冲洗3次后剥去一层叶鞘，再置于0.1％的升汞溶液中消毒3分钟。用无菌水漂洗5次后剥去最后一层叶鞘并用无菌水漂洗7次后用无菌滤纸吸干外植体表面的水分，用无菌解剖刀将外植体纵向切成0.3～0.5cm左右的芽点，接种到诱导培养基中暗培养120天即可诱导形成长度约为2～3cm的根状茎，污染率低于5％以下，诱导率为68.5％。所述的诱导培养基为：KC培养基+1.0mg/L 6-BA(6-benzylaminopurine)+0.05mg/L ZT(zeatin)+1.0mg/L IBA(3-indolebutyric acid)+25g/L蔗糖+5.0g/L琼脂+50ml/L椰子汁，pH为5.8。

(3)根状茎的增殖：将步骤(2)获得的根状茎用无菌解剖刀切成长度约为0.5～1.0cm的茎段并接种到增殖培养基中培养50天即可获得长度为4～6cm、粗壮的根状茎，增殖系数为4.73。根据需要，可将新获得的根状茎再次切成后0.5～1.0cm的茎段作为增殖材料，并在增殖培养基中进行材料扩繁，所述的增殖培养基为：MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA(1-Naphthylacetic acid)+0.05mg/L KT(kinetin)+25g/L蔗糖+4.5g/L琼脂+0.2g/L活性炭+20ml/L椰子汁，pH为5.8。

(4)分化培养：将步骤(3)获得的根状茎切成长度为1.5～2.0cm的茎段并接种到分化培养基中培养60天即能分化出试管小苗，分化率为80.5％。所述的分化培养基为：MS+2.0mg/L NAA(1-Naphthylacetic acid)+0.5mg/L 6-BA+35g/L蔗糖+4.0g/L琼脂+0.1g/L活性炭，pH为5.8。

(5)壮苗培养：切除与步骤(4)所得的试管小苗根部粘连的根状茎并将小苗转接至壮苗培养基中培养45天即可获得高约3～5cm的套叶兰试管苗，所述的壮苗培养基为：1/2MS+1.0mg/L NAA+0.5mg/L GGR-6(中国林业科学研究院研制的双吉尔GGR-6)+20g/L蔗糖+4.0g/L琼脂，pH为5.8。

(6)炼苗和移栽：将步骤(5)所得健壮的、高约5～7cm的组培苗在温室的自然光下打开组培瓶盖子炼苗2天，洗净根部的培养基后在温室自然晾干至根系发白，在体积比为2:2:1的树皮、兰石、泥岩的混合基质中栽培成苗即为套叶兰种苗，移栽30后成活率达100％。

上述步骤(2)的培养条件为：培养温度为28℃；

上述步骤(3)～(5)的培养条件为：培养温度为28℃，光照强度为2000lx，光照时间为15小时/天。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种套叶兰离体培养快繁方法，其特征在于：包括依次进行的如下步骤：获取套叶兰植株的外植体、外植体诱导培养、根状茎的增殖培养、根状茎的分化培养、壮苗培养、炼苗和移栽；其中，所述的外植体诱导培养操作的外植体诱导培养基包括：KC培养基、0.5～1.0mg/L 6-BA、0.01～0.05mg/L ZT、0.1～1.0mg/L IBA、15～25g/L蔗糖、3.5～5.0g/L琼脂、30～50ml/L椰子汁，pH为5.4～5.8；所述的根状茎的增殖培养操作所用到的增殖培养基包括：MS、0.1～0.5mg/L 6-BA、0.05～0.1mg/L NAA、0.01～0.05mg/L KT、15～25g/L蔗糖、3.5～4.5g/L琼脂、0.1～0.2g/L活性炭、10～20ml/L椰子汁，pH为5.4～5.8；所述的根状茎的分化培养操作所用到的分化培养基包括：MS、0.5～2.0mg/L NAA、0.1～0.5mg/L 6-BA、30～35g/L蔗糖、3.5～4.0g/L琼脂、0.05～0.1g/L活性炭，pH为5.4～5.8；所述的壮苗培养所用到的壮苗培养基包括：1/2MS、0.5～1.0mg/L NAA、0.1～0.5mg/L GGR-6、15～20g/L蔗糖、3.5～4.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。

2.根据权利要求1所述的套叶兰离体培养快繁方法，其特征在于：所述的外植体诱导培养操作的方法为：将采集得到的作为外植体的叶兰植株消毒后纵向切成0.3～0.5cm的芽点，接种到诱导培养基中暗培养90～120天即可诱导形成长度为2～3cm的根状茎。

3.根据权利要求1所述的套叶兰离体培养快繁方法，其特征在于：所述的根状茎的增殖培养操作具体为：将外植体诱导培养操作得到的根状茎切成长0.5～1.0cm的茎段并接种到增殖培养基中培养40～50天即可获得长度为4～6cm的根状茎。

4.根据权利要求1所述的套叶兰离体培养快繁方法，其特征在于：所述的根状茎的分化培养操作的方法为：从根状茎的增殖培养得到增殖后的根状茎切成长度为1.5～2.0cm的茎段并接种到分化培养基中培养50～60天即能分化出试管小苗。

5.根据权利要求1所述的套叶兰离体培养快繁方法，其特征在于：所述的壮苗培养操作的方法为：将经过根状茎的分化培养操作得到的试管小苗根部粘连的根状茎切除并将小苗转接至壮苗培养基中培养30～45天即可获得高3～5cm的套叶兰试管苗。

6.根据权利要求1所述的套叶兰离体培养快繁方法，其特征在于：所述的炼苗和移栽的具体操作为：将经壮苗培养操作所得的套叶兰试管苗在温室的自然光下打开组培瓶盖子炼苗1～2天，洗净根部的培养基后在温室自然晾干至根系发白，在体积比为2:2:1的树皮、兰石、泥岩的混合基质中栽培成苗即为套叶兰种苗。

7.根据权利要求1-6任一所述的套叶兰离体培养快繁方法，其特征在于：根状茎的增殖培养操作、根状茎的分化培养操作、壮苗培养操作中培养条件均为：培养温度为25～28℃，光照强度为1500～2000lx，光照时间为12～15小时/天；外植体诱导培养操作中培养温度为25～28℃。