CN114946529A - 一种紫陀螺菌液体菌种的培养基及培养方法 - Google Patents
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Abstract
一种紫陀螺菌液体菌种的培养基包括去皮马铃薯、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、水组成，pH值5.5～7.0；一种紫陀螺菌液体菌种的培养方法包括制作培养基、接种、液体静置培养、一级发酵、二级发酵。本发明的优点是，能快速实现紫陀螺菌液体菌种培养的培养基及培养方法，为紫陀螺菌的菌种规模化生产和驯化栽培及其工业化生产（即液体深层培养）奠定了良好的基础，应用前景十分广阔。
Description
技术领域
本发明涉及一种紫陀螺菌液体菌种的培养基及培养方法。
背景技术
紫陀螺菌（Gomphus purpuraceus）是一种夏秋季生长在阔叶混交林地的外生菌根菌，人工培育的难度远远超过常规腐生菌类。然而，紫陀螺菌的开发利用，无论是通过人工驯化栽培获得其子实体还是通过液体发酵培养获得其菌丝体，都离不开优质的紫陀螺菌菌种及菌种的繁育技术。本发明通过各种试验研究了紫陀螺菌菌种的扩大繁殖技术，摸清了菌丝体生长发育所需的各种营养和环境条件，探究了人工繁育液体菌种的工艺流程及关键控制技术，突破了当前人工培育菌丝体生长缓慢的瓶颈，为后期紫陀螺菌子实体的驯化栽培和菌丝体的工业化生产（液体发酵）奠定了良好的基础。
发明内容
本发明提供一种能快速实现紫陀螺菌液体菌种培养的培养基及培养方法，为紫陀螺菌的菌种规模化生产和驯化栽培及其工业化生产（即液体深层培养）奠定了良好的基础，应用前景十分广阔。
实现本发明的技术方案是，一种紫陀螺菌液体菌种的培养基包括去皮马铃薯、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、水组成，pH值5.5～7.0。
进一步讲，所述培养基由去皮马铃薯、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、水组成，去皮马铃薯、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、水的重量份量比为25～30:2～3:9～12:0.05～0.12：0～0.12:0～0.06:100～120；
进一步讲，所述的培养基还包括干松针；
所述培养基由去皮马铃薯、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、干松针、水组成，去皮马铃薯、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、干松针、水的重量份量比为25～30:2～3:9～12:0.05～0.12:0～0.12:0～0.06: 5～7:100～120；
一种紫陀螺菌液体菌种的培养方法包括制作培养基、接种、液体静置培养、一级发酵、二级发酵；
1)所述制作培养基，用去皮马铃薯、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、水的重量份量比为25～30:2～3:9～12:0.05～0.12：0～0.12:0～0.06:100～120制作培养基，pH值5.5～7.0；
2）所述接种，按第一培养瓶体积的10%～15%装入培养基并经高温高压灭菌后、冷却，在无菌条件下，将活化后的紫陀螺菌斜面菌种切分成2～4mm2大小，按每100ml液体培养基添加3～5块菌种的量接入第一培养瓶中；
3）所述液体静置培养，接种后的第一培养瓶在20～25℃条件下静置避光培养50～60天，至菌丝体布满培养基表面70%以上；
4）所述一级发酵，按第二培养瓶体积（最好为500ml）的40%～50%装入培养基并经高温高压灭菌后、冷却，在无菌条件下，将所述液体静置培养中的纯菌丝体切碎为每块0.5～1mm2大小后，全部接入第二培养瓶的培养基中，再将接种后的第二培养瓶放入摇床，转速设置为150～180rpm，在20～25℃条件下恒温振荡培养15～20d，至菌液浓稠为止；
5）所述二级发酵，按第三培养瓶体积的40%～50%装入培养基并经高温高压灭菌后、冷却，将所述一级发酵中培养的浓稠菌液用大功率搅拌器高速搅拌24～48小时呈均匀的菌浆后，按第三培养瓶培养基体积的10%～15%的比例接入菌浆，接种后将第三培养瓶放入摇床，转速设置为150～180rpm，在20～25℃条件下恒温振荡培养10～15天，至菌液浓稠为止；
通过以上步骤完成紫陀螺菌液体菌种培养。
一种紫陀螺菌液体菌种的培养方法包括制作培养基、接种、液体静置培养、一级发酵、二级发酵；
1)所述制作第一培养基，用去皮马铃薯、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、水的重量份量比为25～30:2～3:9～12:0.05～0.12:0～0.12:0～0.06:100～120制作培养基，pH值5.5～7.0；
所述制作第二培养基，用去皮马铃薯、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、干松针、水的重量份量比为25～30:2～3:9～12:0.05～0.12:0～0.12:0～0.06: 5～7:100～120制作培养基，pH值5.5～7.0；
2）所述接种，按第一培养瓶体积的10%～15%装入第一培养基并经高温高压灭菌后、冷却，在无菌条件下，将活化后的紫陀螺菌斜面菌种切分成2～4mm2大小，按每100ml液体培养基添加3～5块菌种的量接入第一培养瓶中；
3）所述液体静置培养，接种后的第一培养瓶在20～25℃条件下静置避光培养50～60天，至菌丝体布满培养基表面70%以上；
4）所述一级发酵，按第二培养瓶体积（最好为500ml）的40%～50%装入第二培养基并经高温高压灭菌后、冷却，在无菌条件下，将所述液体静置培养中的纯菌丝体切碎为每块0.5～1mm2大小后，全部接入第二培养瓶的培养基中，再将接种后的第二培养瓶放入摇床，转速设置为150～180rpm，在20～25℃条件下恒温振荡培养12～13d，至菌液浓稠为止；
5）所述二级发酵，按第三培养瓶体积的40%～50%装入第二培养基，同时配备切分搅拌设备（以便打碎第三培养瓶中的菌球），并经高温高压灭菌后、冷却，将所述一级发酵中培养的浓稠菌液用大功率搅拌器高速搅拌24～48小时呈均匀的菌浆后，按第三培养瓶培养基体积的10%～15%的比例接入菌浆，接种后将第三培养瓶放入摇床，转速设置为150～180rpm，在20～25℃条件下恒温振荡培养8～9天，振荡培养期间可通过切分搅拌设备将第三培养瓶中的菌球打碎，直至瓶中菌液浓稠为止；
通过以上步骤完成紫陀螺菌液体菌种培养。
本发明的优点是，1）紫陀螺菌液体菌种培养速度提高，相比于最初的培养基及培养方法缩短10天以上。
2）菌种的准备创新为液体静置培养：解决了平板或斜面培养菌丝长速慢、长势弱和培养基易干缩、易污染的问题。
3）紫陀螺菌液体培养基配方：原料来源广，成本低，制作方法简单易行。
4）培养方法简单，菌丝体生长快、活力强，繁殖效率高。本发明解决了菌根型食用菌紫陀螺菌菌种的快速繁殖问题，为紫陀螺菌的菌种规模化生产和驯化栽培及其工业化生产（即液体深层培养）奠定了良好的基础，应用前景十分广阔。
紫陀螺菌母种：2017年6月自行采集野生子实体分离得到并进行分子生物学鉴定。于2021年4月14日由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC M 2021376，培养物名称为紫陀螺菌Gomphus purpuraceus，培养物指定名称为Gp01，保藏人为湖北三峡职业技术学院谭爱华。
具体实施方式
开始培养时紫陀螺菌液体菌种选用了最常用的基础培养基：去皮马铃薯、葡萄糖、水，并选用各种配比，发现紫陀螺菌液体菌种无法实现扩繁，主要表现在液体静置培养过程中菌丝生长量极少，改变各种条件，菌丝表面覆盖不超过5%，扩繁失败。
随后在基础培养基上增加了磷酸二氢钾、蛋白胨，可以突破了液体静置培养过程中菌丝生长量极少技术瓶径，在液体静置培养过程中菌丝生长量超过50%最高达到80%，但静止培养时间需要90天以上。
根据磷酸二氢钾特性，同时增加了磷酸氢二钾、硫酸镁，使液体静置培养过程中菌丝生长量超过70%，静止培养时间50～60天。
一种紫陀螺菌液体菌种的培养基由去皮马铃薯、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、水组成，pH值5.5～7.0，其中去皮马铃薯250～300g，葡萄糖20～30g，蛋白胨9～12g，磷酸二氢钾0.5～1.2g，磷酸氢二钾0～1.2g，硫酸镁0～0.6g，水1000ml；
用磷酸二氢钾或磷酸氢二钾调节pH值。
具体培养方法为：一种紫陀螺菌液体菌种的培养方法包括制作培养基、接种、液体静置培养、一级发酵、二级发酵；
1)所述制作培养基，用去皮马铃薯250～300g、葡萄糖20～30g、蛋白胨9～12g、磷酸二氢钾0.5～1.2g、磷酸氢二钾0～1.2g、硫酸镁0～0.6g、水1000ml制作培养基，pH值5.5～7.0；
2）所述接种，按第一培养瓶体积的10%～15%装入培养基并经高温高压灭菌后、冷却，在无菌条件下，将活化后的紫陀螺菌斜面菌种切分成2～4mm2大小，按每100ml液体培养基添加3～5块菌种的量接入第一培养瓶中；
3）所述液体静置培养，接种后的第一培养瓶在20～25℃条件下静置避光培养50～60天，至菌丝体布满培养基表面70%以上；
4）所述一级发酵，按第二培养瓶体积（最好为500ml）的40%～50%装入培养基并经高温高压灭菌后、冷却，在无菌条件下，将所述液体静置培养中的纯菌丝体切碎为每块0.5～1mm2大小后，全部接入第二培养瓶的培养基中，再将接种后的第二培养瓶放入摇床，转速设置为150～180rpm，在20～25℃条件下恒温振荡培养15～20d，至菌液浓稠为止；
5）所述二级发酵，按第三培养瓶体积的40%～50%装入培养基并经高温高压灭菌后、冷却，将所述一级发酵中培养的浓稠菌液用大功率搅拌器高速搅拌24～48小时呈均匀的菌浆后，按第三培养瓶培养基体积的10%～15%的比例接入菌浆，接种后将第三培养瓶放入摇床，转速设置为150～180rpm，在20～25℃条件下恒温振荡培养10～15天，至菌液浓稠为止；
通过以上步骤完成紫陀螺菌液体菌种培养。
在一级发酵与二级发酵过程发现菌种大小不一，在培养基中分布不均匀，菌种生长速度与预想的生长速度相差较大，经过反复对比发现，其一次发酵过程中培养基在恒温振荡培养过程中培养基用量越少紫陀螺菌生长速度越快，随着培养基用量增加，紫陀螺菌生长速度越来越慢，与传统的菌种生长理论培养基用量增加菌种繁殖速度增加不相同，考虑紫陀螺菌生长特性，通过增加培养基组分干松针、用大功率高速搅拌设备打散菌球增加菌丝萌发点、在发酵容器内放入自制的切分搅拌设备增加透气性等措施，使菌丝萌发点增多，菌丝生长速度加快，与培养基用量实现正相关，加快了紫陀螺菌菌种繁殖。通过实验比较发现，技术改进后，可以使一级发酵与二级发酵时间在相同条件下分别缩短3～7天、2～6天，达到实现紫陀螺菌工业化生产的目的。
切分搅拌设备优选的为自制的简易“打菌器”。“打菌器”是用5～7根直径0.1～0.5mm的不锈钢细丝作为搅拌头且由电机驱动搅拌头旋转，类似于“人工打蛋器”的结构，置于培养容器内，通过发酵液的撞击增加透气性，同时可切断菌丝增加菌丝生长点，从而加快菌丝生长速度，缩短发酵时间。
优选的，一种紫陀螺菌液体菌种的培养基由去皮马铃薯、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、干松针、水组成，用去皮马铃薯250～300g、葡萄糖20～30g、蛋白胨9～12g、磷酸二氢钾0.5～1.2g、磷酸氢二钾0～1.2g、硫酸镁0～0.6g、干松针50～70g、水1000ml制作培养基，pH值5.5～7.0。
一种紫陀螺菌液体菌种的培养方法包括制作培养基、接种、液体静置培养、一级发酵、二级发酵；
1)所述制作第一培养基，用去皮马铃薯、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、水的重量份量比为25～30:2～3:9～12:0.05～0.12：0～0.12:0～0.06:100～120制作培养基，pH值5.5～7.0；
所述制作第二培养基，用去皮马铃薯、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、干松针、水的重量份量比为25～30:2～3:9～12:0.05～0.12：0～0.12:0～0.06: 5～7:100～120制作培养基，pH值5.5～7.0；
2）所述接种，按第一培养瓶体积的10%～15%装入第一培养基并经高温高压灭菌后、冷却，在无菌条件下，将活化后的紫陀螺菌斜面菌种切分成2～4mm2大小，按每100ml液体培养基添加3～5块菌种的量接入第一培养瓶中；
3）所述液体静置培养，接种后的第一培养瓶在20～25℃条件下静置避光培养50～60天，至菌丝体布满培养基表面70%以上；
4）所述一级发酵，按第二培养瓶体积（最好为500ml）的40%～50%装入第二培养基并经高温高压灭菌后、冷却，在无菌条件下，将所述液体静置培养中的纯菌丝体切碎为每块0.5～1mm2大小后，全部接入第二培养瓶的培养基中，再将接种后的第二培养瓶放入摇床，转速设置为150～180rpm，在20～25℃条件下恒温振荡培养12～13d，至菌液浓稠为止；
5）所述二级发酵，按第三培养瓶体积的40%～50%装入第二培养基，同时配备切分搅拌设备（以便打碎第三培养瓶中的菌球，菌丝在生长的过程当中相互缠绕成为菌球），并经高温高压灭菌后、冷却，将所述一级发酵中培养的浓稠菌液用大功率搅拌器高速搅拌24～48小时呈均匀的菌浆后，按第三培养瓶培养基体积的10%～15%的比例接入菌浆，接种后将第三培养瓶放入摇床，转速设置为150～180rpm，在20～25℃条件下恒温振荡培养8～9天，振荡培养期间可通过切分搅拌设备将第三培养瓶中的菌球打碎，直至瓶中菌液浓稠为止；
通过以上步骤完成紫陀螺菌液体菌种培养。
Claims (5)
1.一种紫陀螺菌液体菌种的培养基，其特征是：所述的培养基包括去皮马铃薯、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、水组成，pH值5.5～7.0。
2.根据权利要求1所述的一种紫陀螺菌液体菌种的培养基，其特征是：所述培养基由去皮马铃薯、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、水组成，去皮马铃薯、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、水的重量份量比为25～30:2～3:9～12:0.05～0.12:0～0.12:0～0.06:100～120。
3.根据权利要求1所述的一种紫陀螺菌液体菌种的培养基，其特征是：所述的培养基还包括干松针；
所述培养基由去皮马铃薯、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、干松针、水组成，去皮马铃薯、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、干松针、水的重量份量比为25～30:2～3:9～12:0.05～0.12:0～0.12:0～0.06: 5～7:100～120，pH值5.5～7.0；
用磷酸二氢钾或磷酸氢二钾调节pH值。
4.一种紫陀螺菌液体菌种的培养方法，其特征是：所述的方法包括制作培养基、接种、液体静置培养、一级发酵、二级发酵；
1) 所述制作培养基，用去皮马铃薯、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、水的重量份量比为25～30:2～3:9～12:0.05～0.12：0～0.12:0～0.06:100～120制作培养基，pH值5.5～7.0；
2）所述接种，按第一培养瓶体积的10%～15%装入培养基并经高温高压灭菌后、冷却，在无菌条件下，将活化后的紫陀螺菌斜面菌种切分成2～4mm2大小，按每100ml液体培养基添加3～5块菌种的量接入第一培养瓶中；
3）所述液体静置培养，接种后的第一培养瓶在20～25℃条件下静置避光培养50～60天，至菌丝体布满培养基表面70%以上；
4）所述一级发酵，按第二培养瓶体积的40%～50%装入培养基并经高温高压灭菌后、冷却，在无菌条件下，将所述液体静置培养中的纯菌丝体切碎为每块0.5～1mm2大小后，全部接入第二培养瓶的培养基中，再将接种后的第二培养瓶放入摇床，转速设置为150～180rpm，在20～25℃条件下恒温振荡培养15～20d，至菌液浓稠为止；
5）所述二级发酵，按第三培养瓶体积的40%～50%装入培养基并经高温高压灭菌后、冷却，将所述一级发酵中培养的浓稠菌液用大功率搅拌器高速搅拌24～48小时呈均匀的菌浆后，按第三培养瓶培养基体积的10%～15%的比例接入菌浆，接种后将第三培养瓶放入摇床，转速设置为150～180rpm，在20～25℃条件下恒温振荡培养10～15天，至菌液浓稠为止；
通过以上步骤完成紫陀螺菌液体菌种培养。
5.一种紫陀螺菌液体菌种的培养方法，其特征是：所述的方法包括制作培养基、接种、液体静置培养、一级发酵、二级发酵；
1)所述制作第一培养基，用去皮马铃薯、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、水的重量份量比为25～30:2～3:9～12:0.05～0.12:0～0.12:0～0.06:100～120制作培养基，pH值5.5～7.0；
所述制作第二培养基，用去皮马铃薯、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、干松针、水的重量份量比为25～30:2～3:9～12:0.05～0.12:0～0.12:0～0.06: 5～7:100～120制作培养基，pH值5.5～7.0；
所述接种，按第一培养瓶体积的10%～15%装入第一培养基并经高温高压灭菌后、冷却，在无菌条件下，将活化后的紫陀螺菌斜面菌种切分成2～4mm2大小，按每100ml液体培养基添加3～5块菌种的量接入第一培养瓶中；
所述液体静置培养，接种后的第一培养瓶在20～25℃条件下静置避光培养50～60天，至菌丝体布满培养基表面70%以上；
4）所述一级发酵，按第二培养瓶体积的40%～50%装入第二培养基，经高温高压灭菌后、冷却，在无菌条件下，将所述液体静置培养中的纯菌丝体切碎为每块0.5～1mm2大小后，全部接入第二培养瓶的培养基中，再将接种后的第二培养瓶放入摇床，转速设置为150～180rpm，在20～25℃条件下恒温振荡培养12～13d，至菌液浓稠为止；
5）所述二级发酵，按第三培养瓶体积的40%～50%装入第二培养基，同时配备切分搅拌设备，并经高温高压灭菌后、冷却，将所述一级发酵中培养的浓稠菌液用大功率搅拌器高速搅拌24～48小时呈均匀的菌浆后，按第三培养瓶培养基体积的10%～15%的比例接入菌浆，接种后将第三培养瓶放入摇床，转速设置为150～180rpm，在20～25℃条件下恒温振荡培养8～9天，振荡培养期间可通过切分搅拌设备将第三培养瓶中的菌球打碎，直至瓶中菌液浓稠为止；
通过以上步骤完成紫陀螺菌液体菌种培养。
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