CN111548967A - 一株恶臭假单胞菌x14及其应用方法 - Google Patents

一株恶臭假单胞菌x14及其应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，涉及一株促进羊肚菌菌丝生长的恶臭假单胞菌X14及其应用方法。恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)X14，保藏编号为：CGMCC No.19720。添加本发明菌株X14能够提高羊肚菌试管种和原种的菌丝生长速率，缩短羊肚菌制种周期，本菌株的发酵条件简单，应用方便，适合羊肚菌菌种的规模化生产。

Description

一株恶臭假单胞菌X14及其应用方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及到一株促进羊肚菌菌丝生长的恶臭假单胞菌X14及其应用方法。
背景技术
羊肚菌(Morchella esculenta)在分类学上属于子囊菌门，盘菌纲，盘菌目，羊肚菌科，羊肚菌属，因其外表凹陷状似羊肚而得名。羊肚菌肉质鲜美脆嫩，营养和药用价值极高，是久负盛名的食补良品，具有增强肌体免疫力、促进副肾皮激素的分泌、降低胆固醇、预防动脉硬化、抗疲劳、抗病毒、抗肿瘤等作用。
羊肚菌市场价格显著高于常规食用菌品种，近年来羊肚菌栽培进入商业化高速发展阶段。2012年全国羊肚菌种植面积仅约3000亩，2017年达到7万亩，2018年已达14万亩，2019年约10-12万亩，相比2018年，栽培面积稳中有降。羊肚菌主要种植范围由四川、云南、贵州逐渐向河南、河北、湖北、新疆、湖南等地区扩展。由于栽培技术还不完善，羊肚菌人工种植产量不高，市场上供不应求。
覆土是羊肚菌人工栽培中的重要环节，羊肚菌菌丝只有在适宜的土壤环境下才能完成出菇。关于羊肚菌的覆土机理，有研究发现覆土中的微生物，特别是细菌对于原基形成具有重要作用，羊肚菌生长土壤的细菌数量显著高于非羊肚菌生长土壤。目前土壤细菌与羊肚菌的互作机理仍然不清楚，有待深入研究。菌种制作是羊肚菌人工栽培中首要环节，大部分菇农采用试管种-原种-栽培种传统扩大培养方法制作羊肚菌菌种，制种周期长，导致生产成本高。
发明内容
本发明的首要目的是提供一株恶臭假单胞菌X14保藏编号为：CGMCC No.19720。该菌具有促进羊肚菌菌丝生长的作用。
本菌株X14是从羊肚菌菌基土壤中分离筛选获得，在羊肚菌试管种中添加X14菌液，羊肚菌菌丝生长速率提高了23.7-28.8％，在羊肚菌原种中添加X14菌液，羊肚菌菌丝生长速率提高了13.8％。通过生理生化特征试验与16S rDNA序列分析，初步鉴定菌株X14为恶臭假单胞菌。
本发明的第二个目的是提供恶臭假单胞菌X14的应用。具体是指恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)X14在促进羊肚菌菌丝生长中的应用。
进一步的，所述的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)X14促进羊肚菌试管种菌丝生长中的应用。
进一步的，把羊肚菌接种在PDA平板培养基中培养，菌丝长满平皿待用；把X14菌株接种在营养肉汤培养基中，振荡培养过夜待用；把麦粒浸泡过夜或用开水煮沸，过滤水分晾干后装入试管，进行高温高压灭菌制作成麦粒试管培养基；用打孔器接种羊肚菌圆形菌饼于麦粒试管种，同时接种X14菌液，静置培养。
进一步的，把羊肚菌接种在PDA平板培养基中，在16-20℃培养5-7d，菌丝长满平皿待用；把X14菌株接种在营养肉汤培养基中，在25-28℃振荡培养14-18h待用；把麦粒浸泡过夜，用开水煮沸，过滤水分晾干后装入20x 200mm试管，麦粒装量18-22g，进行高温高压灭菌制作成麦粒试管培养基；用打孔器接种直径为10mm的羊肚菌圆形菌饼1-2个于麦粒培养基上，同时接种1-2ml的X14菌液，16-20℃静置培养。
优选：把羊肚菌接种在PDA平板培养基中，在20℃培养5-7d，菌丝长满平皿待用；把X14菌株接种在营养肉汤培养基中，在26℃振荡培养14h待用；把麦粒浸泡过夜，用开水煮沸，过滤水分晾干后装入20x 200mm试管，麦粒装量20g，进行高温高压灭菌制作成麦粒试管培养基；用打孔器接种直径为10mm的羊肚菌圆形菌饼1-2个于麦粒培养基上，同时接种1ml的X14菌液，20℃静置培养。实验结果表明：分别在第4，第6，第7天测量羊肚菌菌丝长度，结果显示添加X14菌液，羊肚菌菌丝长度比对照增加了23.7-28.8％。
进一步的，所述的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)X14促进羊肚菌原种菌丝生长，缩短羊肚菌制备周期中的应用。
进一步的，用麦粒制作羊肚菌原种培养基，用打孔器接种的羊肚菌圆形菌饼于麦粒原种培养基上(原种瓶)，同时接种X14菌液，16-20℃静置培养。
进一步的，用麦粒制作羊肚菌原种培养基，培养基配方为：小麦70％、木屑18％、腐殖土10％、生石灰1％、石膏1％，培养基装量580-620g，玻璃瓶容积500mL，用打孔器接种4-5个直径为10mm的羊肚菌圆形菌饼于原种培养基上，同时接种4-5ml的X14菌液(即把X14菌株接种在营养肉汤培养基中，在26℃振荡培养14h获得)，16-20℃静置培养。实验结果表明：在原种瓶中添加X14菌液，培养5天羊肚菌菌丝长度没有显著性差异，培养10天后菌丝长度比对照增加13.8％，培养11天菌丝发满瓶，培养17-19天菌种成熟，菌核变成金黄色或浅褐色颗粒，比对照提前5-7天完成。
添加本发明菌株X14能够显著提高羊肚菌试管种和原种的菌丝生长速率，缩短羊肚菌原种制备周期5-7天，本菌株的发酵条件简单，应用方便，适合羊肚菌菌种的规模化生产。
本发明的第三个目的是提供所述的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)X14的发酵培养基配方和培养条件。
所述的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)X14的优化发酵培养基配方：蛋白胨8.0-12.0g/L、牛肉膏4.0-6.0g/L、酵母膏4.0-6.0g/L、葡萄糖4.0-6.0g/L、磷酸氢二钾0.05-0.15g/L、氯化钠4.0-6.0g/L。优选：蛋白胨10.0g/L、牛肉膏5.0g/L、酵母膏5.0g/L、葡萄糖5.0g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、氯化钠5.0g/L。
所述的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)X14的适宜发酵培养条件为发酵条件为25-28℃、200-220rpm、pH 6.5-7.5、14-18h。优选：26℃、220rpm、pH 7.0、14h。
本发明证明采用优化培养基配方培养菌株X14的OD600nm值比优化前(营养肉汤培养基)提高了28.2％。
本发明的优点：
1、本发明所述的菌株X14是首次报道能显著促进羊肚菌菌丝生长的细菌，有利于缩短羊肚菌制种周期，减少生产成本。
2、本发明优化了菌株X14扩大培养方法，发酵条件简单，发酵成本低，发酵液直接使用，无需后处理，操作过程简便，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1：羊肚菌土壤微生物分离纯化(A)、拮抗筛选(B)、促生筛选(C)
图2：菌株X14的菌落形态(A)、菌体显微图像(B)和系统发育树(C)；
图3：菌株X14促进羊肚菌试管种菌丝生长的作用；
图4：菌株X14促进羊肚菌原种菌丝生长的作用；
图5：菌株X14液体发酵培养基优化，碳源(A)、氮源(B)和无机盐(C)筛选，生长曲线比较(D)。
具体实施方式：
以下将结合实施例对本发明做进一步说明，而不会形成对本发明的限制。
实施例1促羊肚菌菌丝生长菌株X14的筛选与鉴定
1.分离纯化细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基，配方为：牛肉膏3.0g/L、蛋白胨10.0g/L、氯化钠5.0g/L、琼脂20g/L，pH 7.5。
2.收集羊肚菌正出菇时菌基土壤，从每个羊肚菌子实体正下方取2cm3土壤，将10份土样混匀捏碎后过100目筛，取10g土样添加到90ml含玻璃珠的无菌水中，摇床100rpm振荡30min，待样品分散后，静置5min，吸取0.5ml土壤悬液至4.5ml无菌水振荡混匀，得到10-2稀释度悬液，依次按10倍稀释法稀释至10-6，取10-4，10-5，10-6三个梯度。
3.分别吸取0.l ml至分离纯化培养基平板，于30℃恒温培养3-4d，在分离纯化平板上挑取不同形态单菌落划线保存(图1A)，经初步分离纯化，得到35个羊肚菌土壤细菌菌株。
4.将分离得到的菌株和羊肚菌同时接种到PDA培养基平板，20℃培养3d后发现有12个菌株与羊肚菌存在拮抗作用(图1B)。
5.将其他无拮抗作用的菌株液体振荡培养过夜，取0.1ml均匀涂布在培养基上，然后在平板中央位置打孔接种直径5mm的羊肚菌圆形菌饼，20℃培养3d后发现有4个菌株对羊肚菌菌丝生长有促进作用，其中X14菌株效果最显著(图1C)。
6.X14菌种鉴定：X14菌株在营养琼脂平板上形成光滑、湿润、边缘整齐的菌落，产生的水溶性色素使培养基被染成黄绿色(图2A)，且培养时间过长会产生腥臭味。显微照片显示X14为短杆状或卵圆形(图2B)。提取菌株基因组总DNA，用细菌16S rDNA通用引物27F/1492R扩增，将测序结果与GeneBank数据库中进行Blast比对，结果表明本发明菌株X14与恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida strain:MUFP69,GenBank:AB621834.1)16S rDNA的序列同源性为99.58％，选取假单胞菌属的8个代表性菌种与X14一起构建系统发育进化树(图2C)，结果显示X14与恶臭假单胞菌进化关系最接近，结合生理生化特征试验结果(表1)初步鉴定X14菌株为恶臭假单胞菌。于2020年04月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCC No.19720，保藏单位地址：中国，北京，中科院微生物研究所。
表1菌株X14生理生化特征试验结果
Figure BDA0002511166570000071
实施例2恶臭假单胞菌X14对羊肚菌菌丝促生效果测定
把羊肚菌接种在PDA平板培养基中，在20℃培养5-7d，菌丝长满平皿待用；把X14菌株接种在营养肉汤培养基中，在26℃振荡培养14h待用；把麦粒浸泡过夜，用开水煮沸，过滤水分晾干后装入20x 200mm试管(每支试管装入20g麦粒)，进行高温高压灭菌制作成麦粒试管培养基；用打孔器接种直径为10mm的羊肚菌圆形菌饼1-2个于麦粒培养基上，同时接种1ml的X14菌液(对照CK为1ml灭菌的营养肉汤)，20℃静置培养，分别在第4，第6，第7天测量羊肚菌菌丝长度(图3B)，结果显示添加X14菌液，羊肚菌菌丝长度比对照增加了23.7-28.8％(图3A)。
用麦粒制作羊肚菌原种培养基，培养基配方为：小麦70％、木屑18％、腐殖土10％、生石灰1％、石膏1％，培养基装量600g，玻璃瓶容积500mL；用打孔器接种4个直径为10mm的羊肚菌圆形菌饼于原种培养基上，同时接种4ml在营养肉汤培养基26℃振荡培养14h后获得的X14菌液(对照CK为4ml灭菌的营养肉汤培养基)，20℃静置培养，分别在第4和第8天测量羊肚菌菌丝长度(图4B)。结果显示在原种瓶中添加X14菌液，培养5天羊肚菌菌丝长度没有显著性差异，培养10天后比对照增加13.8％(图4A)，培养11天菌丝发满瓶，培养17-19天菌种成熟，菌核变成金黄色或浅褐色颗粒，比对照提前5-7天完成。
实施例3恶臭假单胞菌X14发酵培养工艺优化
X14菌株划线接种在牛肉膏蛋白胨培养基上，26℃培养24h，挑取单菌落接种于营养肉汤培养基(NB)中，26℃振荡培养过夜，作为种子液备用。
分别以0.5％葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、甘油作为培养基碳源进行X14菌株发酵培养对比试验，结果显示使用葡萄糖作为碳源时X14菌体浓度最高，OD600nm值为3.12；其次为蔗糖、麦芽糖，OD600nm值为2.60-2.76；以甘油为碳源时，X14生长菌液浓度最低，OD600nm值为2.22。因此，选择葡萄糖作为培养基最佳碳源(图5A)。
分别以2.0％蛋白胨、牛肉膏、酵母膏以及各组合作为培养基氮源进行X14菌株发酵培养对比试验，结果显示以蛋白胨+牛肉膏+酵母膏作为复合氮源时X14菌株浓度最高，OD600nm值为3.24；以蛋白胨+牛肉膏或蛋白胨+酵母膏作为氮源时，X14菌株浓度次之，OD600nm值为2.73-2.74；以蛋白胨、牛肉膏、酵母膏单独氮源或牛肉膏+酵母膏作为氮源时，X14菌株浓度较低，OD600nm值为2.34-2.41。因此，选择复合氮源(蛋白胨+牛肉膏+酵母膏)作为培养基最佳氮源(图5B)。
分别以0.1％磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠作为培养基无机盐组分进行X14菌株发酵培养对比试验，结果显示以磷酸氢二钾作为培养基无机盐组分时，X14菌株浓度最高，OD600nm值为3.12；以磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠作为无机盐组分时，X14菌株浓度没有显著性差异，OD600nm值为2.60-2.76。因此，选择磷酸氢二钾作为培养基最佳无机盐(图5C)。
通过试验分析碳源、氮源、无机盐用量，获得优化培养基配方：蛋白胨10.0g/L、牛肉膏5.0g/L、酵母膏5.0g/L、葡萄糖5.0g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、氯化钠5.0g/L；在26℃、220rpm，pH 7.0条件下培养14h，与营养肉汤(NB)培养基比较，采用优化培养基菌体OD600nm值提高28.2％(图5D)。

Claims (10)

1.一株恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)X14，保藏编号为：CGMCC No.19720。
2.权利要求1所述的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)X14在促进羊肚菌菌丝生长中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)X14在促进羊肚菌试管种菌丝生长中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，把羊肚菌接种在PDA平板培养基中培养，菌丝长满平皿待用；把X14菌株接种在营养肉汤培养基中，振荡培养过夜待用；把麦粒浸泡过夜或用开水煮沸，过滤水分晾干后装入试管，进行高温高压灭菌制作成麦粒试管培养基；用打孔器接种羊肚菌圆形菌饼于麦粒试管种，同时接种X14菌液，静置培养。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，把羊肚菌接种在PDA平板培养基中，在16-20℃培养5-7d，菌丝长满平皿待用；把X14菌株接种在营养肉汤培养基中，在25-28℃振荡培养14-18h待用；把麦粒浸泡过夜，用开水煮沸，过滤水分晾干后装入20x 200mm试管，麦粒装量18-22g，进行高温高压灭菌制作成麦粒试管培养基；用打孔器接种直径为10mm的羊肚菌圆形菌饼1-2个于麦粒培养基上，同时接种1-2ml的X14菌液，16-20℃静置培养。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)X14在促进羊肚菌原种菌丝生长，缩短羊肚菌原种制备周期中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，用麦粒制作羊肚菌原种培养基，用打孔器接种的羊肚菌圆形菌饼于麦粒原种培养基上，同时接种X14菌液，16-20℃静置培养。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，用麦粒制作羊肚菌原种培养基，培养基配方为：小麦70％、木屑18％、腐殖土10％、生石灰1％、石膏1％，培养基装量580-620g，玻璃瓶容积500mL，用打孔器接种4-5个直径为10mm的羊肚菌圆形菌饼于麦粒原种培养基上，同时接种4-5ml的X14菌液，16-20℃静置培养。
9.权利要求1所述的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)X14的发酵培养基配方，其特征在于，蛋白胨8.0-12.0g/L、牛肉膏4.0-6.0g/L、酵母膏4.0-6.0g/L、葡萄糖4.0-6.0g/L、磷酸氢二钾0.05-0.15g/L、氯化钠4.0-6.0g/L。
10.权利要求1所述的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)X14的发酵培养条件，其特征在于，发酵条件为25-28℃、200-220rpm、pH 6.5-7.5、14-18h。
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CN114921344A (zh) * 2022-05-11 2022-08-19 河南君升农业科技有限公司 利用人工内共生化技术选育羊肚菌优质品种的方法
CN114921344B (zh) * 2022-05-11 2023-09-26 四川菌益侬农业科技有限公司 利用人工内共生化技术选育羊肚菌优质品种的方法

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