CN110079518A - 纤维素酶高产菌的选育方法 - Google Patents

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朱荣荣
何锋
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Abstract

本发明公开了一种纤维素酶高产菌的选育方法，该选育方法包括：1)将绿色木霉、里氏霉于第一培养基中进行培养，接着进行60Co‑γ射线进行照射以得到突变混合霉株；2)将克氏热解纤维素梭菌于第二培养基中进行培养，接着采用紫外线照射以得到突变菌株；3)将上述突变混合霉株、突变菌株于MS培养基进行培养以得到纤维素酶高产菌；其中，第一培养基中含有亚硝基胍和硫酸二乙酯；第二培养基中含有甲基磺酸乙酯和硫酸二乙酯。通过该方法选育出的纤维素酶高产菌具有抗退化的特点。

Description

纤维素酶高产菌的选育方法
技术领域
本发明涉及纤维素酶菌，具体地，涉及一种纤维素酶高产菌的选育方法。
背景技术
纤维素酶，是由多种水解酶组成的一个复杂酶系，自然界中很多真菌都能分泌纤维素酶。纤维素酶是酶的一种，在分解纤维素时起生物催化作用；可以将纤维素分解成寡糖或单糖的蛋白质。
纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中。细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。一般用于生产的纤维素酶来自于真菌，比较典型的有木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)。虽然产纤维素酶的霉菌的种类较多，但是，这些霉菌均存在一个严重的缺陷：菌种容易退化，导致产酶能力降低。
发明内容
本发明的目的是提供一种纤维素酶高产菌的选育方法，通过该方法选育出的纤维素酶高产菌具有抗退化的特点。
为了实现上述目的，本发明提供了一种纤维素酶高产菌的选育方法，包括：
1)将绿色木霉、里氏霉于第一培养基中进行培养，接着进行60Co-γ射线进行照射以得到突变混合霉株；
2)将克氏热解纤维素梭菌于第二培养基中进行培养，接着采用紫外线照射以得到突变菌株；
3)将上述突变混合霉株、突变菌株于MS培养基进行培养以得到纤维素酶高产菌；
其中，第一培养基中含有亚硝基胍和硫酸二乙酯；第二培养基中含有甲基磺酸乙酯和硫酸二乙酯。
在上述技术方案中，本发明通过亚硝基胍、硫酸二乙酯和60Co-γ射线对绿色木霉、里氏霉进行物理诱变，通过甲基磺酸乙酯和硫酸二乙酯、紫外线对克氏热解纤维素梭菌进行物理诱变，最后将两步诱变得到的霉菌进行混合培养便得到纤维素酶高产菌；该纤维素酶高产菌能够抗退化，进而持续地保持产酶能力；同时，该方法还具有步骤简单和操作简便的优点。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明提供了一种纤维素酶高产菌的选育方法，包括：
1)将绿色木霉、里氏霉于第一培养基中进行培养，接着进行60Co-γ射线进行照射以得到突变混合霉株；
2)将克氏热解纤维素梭菌于第二培养基中进行培养，接着采用紫外线照射以得到突变菌株；
3)将上述突变混合霉株、突变菌株于MS培养基进行培养以得到纤维素酶高产菌；
其中，第一培养基中含有亚硝基胍和硫酸二乙酯；第二培养基中含有甲基磺酸乙酯和硫酸二乙酯。
在上述选育方法的步骤1)中，霉菌的数量可以在宽的范围内选择，但是为了使得选育出的霉菌具有更优异的抗退化的能力，优选地，在步骤1)中，绿色木霉、里氏霉的菌落数比为1：1.8-2.2。
在上述选育方法的步骤1)中，亚硝基胍、硫酸二乙酯的浓度可以在宽的范围内选择，但是为了使得选育出的霉菌具有更优异的抗退化的能力，优选地，在第一培养基中，亚硝基胍的浓度为25-37mg/L，硫酸二乙酯的浓度为42-46mg/L。
在上述选育方法的步骤1)中，60Co-γ射线的射时间可以在宽的范围内选择，但是为了使得选育出的霉菌具有更优异的抗退化的能力，优选地，60Co-γ射线的射时间为10-20min。
在上述选育方法的步骤1)中，60Co-γ射线的强度可以在宽的范围内选择，但是为了使得选育出的霉菌具有更优异的抗退化的能力，优选地，60Co-γ射线的强度为60eV-100eV。
在上述选育方法的步骤2)中，甲基磺酸乙酯、硫酸二乙酯的浓度可以在宽的范围内选择，但是为了使得选育出的霉菌具有更优异的抗退化的能力，优选地，在第二培养基中，甲基磺酸乙酯的浓度为12-18mg/L，硫酸二乙酯的浓度为20-25mg/L。
在上述选育方法的步骤2)中，紫外线的照射时间可以在宽的范围内选择，但是为了使得选育出的霉菌具有更优异的抗退化的能力，优选地，紫外线的照射时间为18-25min。
在上述选育方法的步骤2)中，紫外线的强度可以在宽的范围内选择，但是为了使得选育出的霉菌具有更优异的抗退化的能力，优选地，紫外线由500-600w的紫外发生器提供。
在上述选育方法的步骤3)中，霉菌的数量可以在宽的范围内选择，但是为了使得选育出的霉菌具有更优异的抗退化的能力，优选地，突变混合霉株、突变菌株的菌落数比为1：1-1.5。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
实施例1
1)将绿色木霉、里氏霉按照1：1.8的菌落数比于第一培养基(含有25mg/L亚硝基胍、42mg/L硫酸二乙酯)中进行培养8h(可以是4-8h)，接着进行60Co-γ射线(强度为60eV)进行照射20min以得到突变混合霉株；
2)将克氏热解纤维素梭菌于第二培养基(含有12mg/L甲基磺酸乙酯、20mg/L硫酸二乙酯)中进行培养4h(可以是1.5-4h)，接着采用紫外线(由500w的紫外发生器提供)照射25min以得到突变菌株；
3)将上述突变混合霉株、突变菌株按照菌落数比为1：1于MS培养基进行培养以得到纤维素酶高产菌。
实施例2
1)将绿色木霉、里氏霉按照1：2的菌落数比于第一培养基(含有33mg/L亚硝基胍、44mg/L硫酸二乙酯)中进行培养5h(可以是4-8h)，接着进行60Co-γ射线(强度为80eV)进行照射15min以得到突变混合霉株；
2)将克氏热解纤维素梭菌于第二培养基(含有16mg/L甲基磺酸乙酯、22mg/L硫酸二乙酯)中进行培养2h(可以是1.5-4h)，接着采用紫外线(由55w的紫外发生器提供)照射20min以得到突变菌株；
3)将上述突变混合霉株、突变菌株按照菌落数比为1：1.3于MS培养基进行培养以得到纤维素酶高产菌。
实施例3
1)将绿色木霉、里氏霉按照1：2.2的菌落数比于第一培养基(含有37mg/L亚硝基胍、46mg/L硫酸二乙酯)中进行培养4h(可以是4-8h)，接着进行60Co-γ射线(强度为100eV)进行照射10min以得到突变混合霉株；
2)将克氏热解纤维素梭菌于第二培养基(含有18mg/L甲基磺酸乙酯、25mg/L硫酸二乙酯)中进行培养1.5h(可以是1.5-4h)，接着采用紫外线(由600w的紫外发生器提供)照射18min以得到突变菌株；
3)将上述突变混合霉株、突变菌株按照菌落数比为1：1.5于MS培养基进行培养以得到纤维素酶高产菌。
对比例1
按照实施例1的方法进行，所不同的是，未进行步骤2)和3)。
对比例2
按照实施例1的方法进行，所不同的是，未进行步骤1)和3)。
检测例1
检测上述实施例和对比例选育出的菌种的第1天的纤维素酶活(记为1)，然后分别统计20天、40天后的相对纤维素酶活(相对于第1天的纤维素酶活)，具体结果见表1。
表1
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (9)

1.一种纤维素酶高产菌的选育方法，其特征在于，包括：
1)将绿色木霉、里氏霉于第一培养基中进行培养，接着进行60Co-γ射线进行照射以得到突变混合霉株；
2)将克氏热解纤维素梭菌于第二培养基中进行培养，接着采用紫外线照射以得到突变菌株；
3)将上述突变混合霉株、突变菌株于MS培养基进行培养以得到纤维素酶高产菌；
其中，所述第一培养基中含有亚硝基胍和硫酸二乙酯；所述第二培养基中含有甲基磺酸乙酯和硫酸二乙酯。
2.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于，在步骤1)中，所述绿色木霉、里氏霉的菌落数比为1：1.8-2.2。
3.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于，在所述第一培养基中，所述亚硝基胍的浓度为25-37mg/L，所述硫酸二乙酯的浓度为42-46mg/L。
4.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于，所述60Co-γ射线的射时间为10-20min。
5.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于，所述60Co-γ射线的强度为60eV-100eV。
6.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于，在所述第二培养基中，所述甲基磺酸乙酯的浓度为12-18mg/L，所述硫酸二乙酯的浓度为20-25mg/L。
7.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于，所述紫外线的照射时间为18-25min。
8.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于，所述紫外线由500-600w的紫外发生器提供。
9.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于，所述突变混合霉株、突变菌株的菌落数比为1：1-1.5。
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