CN109529092A - 一种细菌纤维素基湿性抗菌敷料及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医用抗菌材料技术领域，具体涉及一种细菌纤维素基湿性抗菌敷料，并进一步公开其制备方法。本发明所述的细菌纤维素湿性抗菌敷料，利用原位发酵法和静电纺丝法将具有良好抑菌功效的生物防腐剂ε‑聚赖氨酸加入至细菌纤维素中，在有效保持了细菌纤维素原有的三维纳米结构的基础上，制得的细菌纤维素湿性敷料具有较好的抗菌功效，同时所述湿性抗菌敷料的生物相容性较好，且不影响BC膜的吸水和保水性能，赋予该敷料抗菌、阻菌、保湿、吸水及可缝合性能，可很好地控制伤口上的细菌并防止细菌扩散，可广泛用于慢性不愈性创伤、亚急性难治性创伤、烧伤及大面积软组织缺损和/或感染的治疗治愈。

Description

一种细菌纤维素基湿性抗菌敷料及制备方法
技术领域
本发明属于医用抗菌材料技术领域，具体涉及一种细菌纤维素基湿性抗菌敷料，并进一步公开其制备方法。
背景技术
细菌纤维素(Bacterial Cellulose，简称BC)是一种天然高分子材料，其具有良好的生物相容性、生物可降解性，以及较强的持水能力和较高的力学性能等优良特性。与植物纤维相比，细菌纤维素具有高结晶度、高亲水性、高持水性、高杨氏模量、高纯度、以及良好的透气、吸水、透水性能。因此，细菌纤维素在医用敷料等生物医学材料、食品、造纸、纺织等领域有着广阔的应用。目前，国外已有以细菌纤维素作为敷料的报道，并已产业化用于临床。细菌纤维素敷料因其良好的吸水性能，不仅可以持续有效地吸收伤口渗出液及代谢产物，同时其为伤口提供了湿润的环境以促进伤口更好地愈合，这使得以细菌纤维素为基本材料的敷料在用于伤口或创伤敷料领域具有很好的发展前景。
但是，由于伤口或创伤愈合是一个连续动态的过程，是细胞间、细胞与基质及可溶介质间相互作用的过程，随着“湿疗法”的普及，湿性敷料在医疗卫生领域中获得日益重视。但在潮湿温暖的环境下，细菌的繁殖会加快，进而使伤口成为病区内交叉感染的重要来源。然而，由于细菌纤维素本身并没有抗菌性能，也使得细菌纤维素敷料在湿性敷料中的应用受到限制。
目前，国内在开发细菌纤维素基敷料主要集中于开发一些复合性材料来改善BC膜的性能，如在发酵培养基中添加羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、壳聚糖或芦荟多糖等，制备得到羧甲基纤维素/BC海绵、海藻酸钠/BC海绵、壳聚糖/BC海绵和芦荟多糖/BC海绵等改性膜，这些复合材料均具有良好的生物相容性；也有研究者将银纳米粒子吸附于BC膜上，制得具有抗菌活性的敷料，该敷料对大肠杆菌和葡萄球菌均具有很强的抗菌能力，开创了BC基新型抗菌活性伤口敷料的新领域。然而，现有的复合方法往往会破坏细菌纤维素本身的三维纳米网络结构，导致复合后的材料由于细菌纤维素结构的破坏造成力学强度、吸水性能、透气性能等下降，使得细菌纤维素材料在敷料尤其是湿性敷料领域的应用受到极大的限制。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种细菌纤维素基湿性抗菌敷料，以解决现有技术中细菌纤维素基敷料不具有抗菌性能的问题；制备得到的细菌纤维素湿性抗菌敷料具有抗菌、阻菌、保湿及可缝合性能，可用于慢性不愈性创伤、亚急性难治性创伤、烧伤及大面积软组织缺损和/或感染的治疗治愈；
本发明所要解决的第二个技术问题在于提供上述细菌纤维素基抗菌敷料的制备方法，所述制备方法简单易行、操作方便，且生产成本低。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种制备细菌纤维素基湿性抗菌敷料的方法，包括如下步骤：
(1)采用发酵法制得细菌纤维素发酵液，并将所得纤维素发酵液进行纯化处理，制得细菌纤维素膜材，备用；
(2)将所述细菌纤维素膜材浸渍于导电溶液中，制得含有导电溶液的细菌纤维素湿态膜片，备用；
(3)取ε-聚赖氨酸溶于有机溶剂中，制得ε-聚赖氨酸纺丝溶液，并采用静电纺丝法将所述ε-聚赖氨酸纺丝溶液从喷丝头射出，射出的ε-聚赖氨酸溶液细流喷射到所述细菌纤维素湿态膜片的表面，得到静电纺丝复合材料；
(4)将得到的复合材料干燥并洗涤至中性，随后经压水处理得到所需细菌纤维素基湿性抗菌敷料。
所述步骤(1)中，所述发酵法制得细菌纤维素发酵液的步骤包括将能分泌细菌纤维素的菌株活化后制备种子醪液的步骤，以及将所述种子醪液加入发酵培养基中，于20-40℃进行发酵培养1-6d的步骤。
所述种子醪液的接种量为1-10％，所述发酵培养基置于培养容器中，并控制所述发酵培养基液面到培养容器底面的距离为5-50mm。
所述步骤(1)中，所述纤维素发酵液纯化步骤包括以0.5-2wt％的冰醋酸溶液浸泡所得发酵产物8-12h并洗涤至中性的步骤、用0.5-2wt％的氢氧化钠溶液浸泡所得发酵产物8-12h并洗涤至中性的步骤，以及经压水处理得到含水30-50％的细菌纤维素膜材的步骤。
所述步骤(2)中，所述细菌纤维素湿态膜片为含有50-90w/v％无水乙醇和/或水的细菌纤维素膜材。
所述步骤(3)中，所述有机溶剂包括醋酸水溶液和/或三氟乙酸。
所述步骤(3)中，所述ε-聚赖氨酸纺丝溶液的浓度为0.1-5w/v％。
在制备所述ε-聚赖氨酸纺丝溶液时，可选用一种或两种上述溶剂作为混合溶剂，在机械搅拌作用下使ε-聚赖氨酸溶解；一般溶解温度为室温，亦可适当升温以加快溶解速率。
所述步骤(3)中，所述ε-聚赖氨酸的分子量为3500-5000。
本发明所述的静电纺丝法采用现有技术中常规使用的静电纺丝设备和技术即可，具体操作包括：所述制得的细菌纤维素湿态膜片平铺固定于接收板或包裹在旋转滚筒表面，并与静电纺丝装置的负极相连，喷丝针头与静电发生器的正极相连，且将细菌纤维素湿态膜片的上层(即发酵液面与空气接触层)为静电纺丝时的接收面。在静电纺丝时，针头与细菌纤维素膜片之间产生电场，ε-聚赖氨酸溶液细流在电场力的作用下均匀覆盖在细菌纤维素表面。同时ε-聚赖氨酸溶液细流与细菌纤维素内的导电溶液相互作用，喷射至所述细菌纤维素膜片表面的ε-聚赖氨酸溶液会扩散入细菌纤维素溶液中，进而促进ε-聚赖氨酸纤维成型。
所述步骤(3)中，所述静电纺丝步骤中，控制所述ε-聚赖氨酸喷射于所述细菌纤维素湿态膜片表面形成的网状纤维直径为100-1000nm。所述ε-聚赖氨酸纤维喷射成网状均匀覆盖于细节纤维素膜材上层。
所述步骤(4)中，所述干燥步骤温度为30-80℃。
所述步骤(4)中，干燥并洗涤后的敷料经压水处理得到含水30-50％(w/w)的细菌纤维素复合ε-聚赖氨酸抗菌敷料。
本发明还公开了由所述方法制备得到的细菌纤维素基湿性抗菌敷料。
本发明所述的细菌纤维素湿性抗菌敷料，利用原位发酵法和静电纺丝法将具有良好抑菌功效的生物防腐剂ε-聚赖氨酸加入至细菌纤维素中，首先，采用原位发酵法，经发酵并纯化制备获得细菌纤维素膜材；并采用静电纺丝法，将细菌纤维素膜材与ε-聚赖氨酸复合得到细菌纤维素复合ε-聚赖氨酸抗菌敷料。整个制备过程中，在有效保持了细菌纤维素原有的三维纳米结构的基础上，制得的细菌纤维素湿性敷料具有较好的抗菌功效，同时所述湿性抗菌敷料的生物相容性较好，且不影响BC膜的吸水和保水性能，赋予该敷料抗菌、阻菌、保湿、吸水及可缝合性能，可很好地控制伤口上的细菌并防止细菌扩散，可广泛用于慢性不愈性创伤、亚急性难治性创伤、烧伤及大面积软组织缺损和/或感染的治疗治愈。
具体实施方式
实施例1种子醪液的配制
选取现有技术中能够分泌产生细菌纤维素的解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens ZF-7(已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.6266，保藏日期2012年6月21日)，经常规活化后接种至种子培养基中，得到种子醪液。
所述种子培养基碳源用量为10-50g/L，氮源用量为5-25g/L，无机盐用量为0.1-10g/L，其余为水。所述碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、无水乙醇和淀粉水解液中的一种或几种；所述氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆粕粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4和NH4Cl中的一种或几种；所述无机盐为钠盐、磷酸盐和磷酸二氢盐中的一种或几种。
具体的，本实施例中采用的所述种子培养基包括如下组分：糖蜜25g/L、果糖25g/L、牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、Na2HPO40.5g/L、玉米浆10g/L、无水乙醇2.0％，pH7.0。将活化后的菌株接种于装有40ml种子培养基的250ml三角瓶中，于25℃静置培养2d，得到种子醪液。
实施例2发酵培养基的配制
本实施例利用所述解淀粉芽孢杆菌ZF-7菌株生产细菌纤维素的方法是将该菌株接种于含碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中进行静置发酵产生细菌纤维素。
所述发酵培养基碳源用量为10-200g/L，氮源用量为5-80g/L，无机盐用量为0.1-20g/L，其余为水。所述碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、无水乙醇和淀粉水解液中的一种或几种；所述氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆粕粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4和NH4Cl中的一种或几种；所述无机盐为钠盐、磷酸盐和磷酸二氢盐中的一种或几种。
具体的，本实施例中采用的所述发酵培养基包括如下组分：果糖50g/L、牛肉膏5g/L、蛋白胨12g/L、Na2HPO420g/L、玉米浆15g/L、无水乙醇1.5％，pH7.0。
实施例3
取实施例1中制备得到的种子醪液，然后以1％的接种浓度接入装有实施例2配制的无菌发酵培养基的培养容器中，其中，控制所述发酵培养基液面到培养容器底面的距离为15mm，并控制培养温度为20℃，发酵时间为6d，得到发酵产物。
将所得发酵产物经1％(v/v)的冰醋酸溶液浸泡8h后用双蒸水反复冲洗至中性；再用1％(w/v)的氢氧化钠溶液浸泡8h后用双蒸水反复冲洗至中性，经压水处理即得到细菌纤维素膜材(含水率50％)。并将所得细菌纤维素膜材浸渍于无水乙醇中，得到含有70w/w％无水乙醇导电溶液的湿态膜片。
将ε-聚赖氨酸(分子量3500-5000)溶解于醋酸水溶液中，制备成0.1％(w/v)的ε-聚赖氨酸纺丝溶液。
将制得的细菌纤维素湿态膜片平铺在接收装置的接收板上，或者将其包裹在旋转滚筒表面，并与所述静电纺丝装置的负极连接，并将喷丝针头与静电发生器的正极相连，且设置细菌纤维素膜材的上层(发酵时发酵液面与空气接触层)为静电纺丝时的接收面。在静电纺丝时，采用静电纺丝法将ε-聚赖氨酸溶液从喷头射出，射出的细流在电场力的作用下均匀覆盖在细菌纤维素膜片的表面，得到直径为200nm的ε-聚赖氨酸纤维状均匀覆盖于细菌纤维素膜材上层，得到细菌纤维素复合材料。将得到的复合材料经50℃高温干燥处理，并用重蒸水反复冲洗至中性以除去多余溶剂。然后经压水处理得到含水50％(w/w)的细菌纤维素复合ε-聚赖氨酸抗菌敷料。
实施例4
取实施例1中制备得到的种子醪液，然后以10％的接种浓度接入装有实施例2配制的无菌发酵培养基的培养容器中，其中，控制所述发酵培养基液面到培养容器底面的距离为50mm，并控制培养温度为30℃，发酵时间为5d，得到发酵产物。
将所得发酵产物经2％(v/v)的冰醋酸溶液浸泡12h后用双蒸水反复冲洗至中性，再用2％(w/v)的氢氧化钠溶液浸泡12h后用双蒸水反复冲洗至中性，经压水处理即得到细菌纤维素膜材(含水率30％)。并将所得细菌纤维素膜材浸渍于无水乙醇中，得到含有50w/w％无水乙醇导电溶液的湿态膜片。
将ε-聚赖氨酸(分子量3500-5000)溶解于三氟乙酸水溶液中，制备成1.5％(w/v)的ε-聚赖氨酸纺丝溶液。
将制得的细菌纤维素湿态膜片平铺在接收装置的接收板上，或者将其包裹在旋转滚筒表面，并与所述静电纺丝装置的负极连接，并将喷丝针头与静电发生器的正极相连，且设置细菌纤维素膜材的上层(发酵时发酵液面与空气接触层)为静电纺丝时的接收面。在静电纺丝时，采用静电纺丝法将ε-聚赖氨酸溶液从喷头射出，射出的细流在电场力的作用下均匀覆盖在细菌纤维素膜片的表面，得到直径为100nm的ε-聚赖氨酸纤维状均匀覆盖于细菌纤维素膜材上层，得到细菌纤维素复合材料。将得到的复合材料经60℃高温干燥处理，并用重蒸水反复冲洗至中性以除去多余溶剂。然后经压水处理得到含水30％(w/w)的细菌纤维素复合ε-聚赖氨酸抗菌敷料。
实施例5
取实施例1中制备得到的种子醪液，然后以5％的接种浓度接入装有实施例2配制的无菌发酵培养基的培养容器中，其中，控制所述发酵培养基液面到培养容器底面的距离为5mm，并控制培养温度为40℃，发酵时间为3d，得到发酵产物，经检测，得到的细菌纤维素的产量为10.6g/L。
将所得发酵产物经0.5％(v/v)的冰醋酸溶液浸泡10h后用双蒸水反复冲洗至中性，再用0.5％(w/v)的氢氧化钠溶液浸泡10h后用双蒸水反复冲洗至中性，经压水处理即得到细菌纤维素膜材(含水率40％)。并将所得细菌纤维素膜材浸渍于无水乙醇中，得到含有90w/w％无水乙醇导电溶液的湿态膜片。
将ε-聚赖氨酸(分子量3500-5000)溶解于三氟乙酸水溶液中，制备成5％(w/v)的ε-聚赖氨酸纺丝溶液。
将制得的细菌纤维素湿态膜片平铺在接收装置的接收板上，或者将其包裹在旋转滚筒表面，并与所述静电纺丝装置的负极连接，并将喷丝针头与静电发生器的正极相连，且设置细菌纤维素膜材的上层(发酵时发酵液面与空气接触层)为静电纺丝时的接收面。在静电纺丝时，采用静电纺丝法将ε-聚赖氨酸溶液从喷头射出，射出的细流在电场力的作用下均匀覆盖在细菌纤维素膜片的表面，得到直径为1000nm的ε-聚赖氨酸纤维状均匀覆盖于细菌纤维素膜材上层，得到细菌纤维素复合材料。将得到的复合材料经40℃高温干燥处理，并用重蒸水反复冲洗至中性以除去多余溶剂。然后经压水处理得到含水40％(w/w)的细菌纤维素复合ε-聚赖氨酸抗菌敷料。
实验例
利用LB平板法对实施例3-5制备得到的细菌纤维素复合ε-聚赖氨酸抗菌敷料进行抗菌活性测试。
选用革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌作为测试菌落，将以上实施例3-5中所获得的细菌纤维素复合聚赖氨酸抗菌膜制成直径为6mm的膜片，并进行无菌处理。然后将膜片置于涂有菌液的固体培养基表面上，于37℃恒温培养箱中培养24h后，观察抑菌圈大小反映抑菌情况。
观察结果显示，本发明实施例3-5中制备得到的细菌纤维素复合聚赖氨酸抗菌膜对大肠杆菌的抑菌圈大小分别为：7.8mm、10.4mm、12.5mm；对金黄色葡萄球菌的抑菌圈大小分别为：8.5mm、11.7mm、13.3mm。
可见，本发明所述细菌纤维素复合ε-聚赖氨酸抗菌敷料具有较好的抗菌性能。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种制备细菌纤维素基湿性抗菌敷料的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)采用发酵法制得细菌纤维素发酵液，并将所得纤维素发酵液进行纯化处理，制得细菌纤维素膜材，备用；
(2)将所述细菌纤维素膜材浸渍于导电溶液中，制得含有导电溶液的细菌纤维素湿态膜片，备用；
(3)取ε-聚赖氨酸溶于有机溶剂中，制得ε-聚赖氨酸纺丝溶液，并采用静电纺丝法将所述ε-聚赖氨酸纺丝溶液从喷丝头射出，射出的ε-聚赖氨酸溶液细流喷射到所述细菌纤维素湿态膜片的表面，得到静电纺丝复合材料；
(4)将得到的复合材料干燥并洗涤至中性，随后经压水处理得到所需细菌纤维素基湿性抗菌敷料。
2.根据权利要求1所述的制备细菌纤维素基湿性抗菌敷料的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述发酵法制得细菌纤维素发酵液的步骤包括将菌株活化后制备种子醪液的步骤，以及将所述种子醪液加入发酵培养基中，于20-40℃进行发酵培养1-6d的步骤。
3.根据权利要求2所述的制备细菌纤维素基湿性抗菌敷料的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述纤维素发酵液纯化步骤包括以0.5-2wt％的冰醋酸溶液浸泡所得发酵产物8-12h并洗涤至中性的步骤、用0.5-2wt％的氢氧化钠溶液浸泡所得发酵产物8-12h并洗涤至中性的步骤，以及经压水处理得到含水30-50％的细菌纤维素膜材的步骤。
4.根据权利要求1-3任一项所述的制备细菌纤维素基湿性抗菌敷料的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述细菌纤维素湿态膜片为含有50-90w/v％无水乙醇和/或水的细菌纤维素膜材。
5.根据权利要求1-4任一项所述的制备细菌纤维素基湿性抗菌敷料的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述有机溶剂包括醋酸水溶液和/或三氟乙酸。
6.根据权利要求5所述的制备细菌纤维素基湿性抗菌敷料的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述ε-聚赖氨酸纺丝溶液的浓度为0.1-5w/v％。
7.根据权利要求5或6所述的制备细菌纤维素基湿性抗菌敷料的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述ε-聚赖氨酸的分子量为3500-5000。
8.根据权利要求5-7任一项所述的制备细菌纤维素基湿性抗菌敷料的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述静电纺丝步骤中，控制所述ε-聚赖氨酸喷射于所述细菌纤维素湿态膜片表面形成的网状纤维直径为100-1000nm。
9.根据权利要求1-8任一项所述的制备细菌纤维素基湿性抗菌敷料的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述干燥步骤温度为30-70℃。
10.由权利要求1-9任一项所述方法制备得到的细菌纤维素基湿性抗菌敷料。
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