CN110507842A - 一种细菌纤维素/透明质酸/ε-聚赖氨酸功能型敷料及其制备方法 - Google Patents

一种细菌纤维素/透明质酸/ε-聚赖氨酸功能型敷料及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种细菌纤维素/透明质酸/ε‑聚赖氨酸功能型敷料及其制备方法，所述ε‑聚赖氨酸和透明质酸通过静电力结合，固定在细菌纤维素网络结构中。本发明的功能型敷料安全性高，生物相容性好并具有广谱抗菌性；制备方法对ε‑聚赖氨酸和透明质酸的需求量少，简单高效，绿色环保并且不会破坏细菌纤维素的三维网络结构，具有良好的应用前景。

Description

一种细菌纤维素/透明质酸/ε-聚赖氨酸功能型敷料及其制备 方法
技术领域
本发明属于生物复合材料领域，特别涉及一种细菌纤维素/透明质酸/ε-聚赖氨酸功能型敷料及其制备方法。
背景技术
近年来，创伤已成为继心血管疾病、癌症之后的第三大致死病因，而皮肤创伤作为创伤的重要分支，其有效治愈问题日益突出。敷料是临床上广泛使用的一种用以治疗皮肤创伤的医用材料。传统使用的敷料主要包括纱布、绷带、水凝胶类敷料、泡沫类敷料等。敷料如果能为创伤部位提供一个无菌的环境将降低感染率，加快创伤的愈合。因此，具有抗菌功能的敷料受到了人们关注，并开发出了一些新型抗菌敷料，如复合银离子和天然有机抗菌剂等。但这些抗菌敷料具有一定的局限性，如重金属对人体有毒害作用，而其他抗菌剂不具广谱抗菌性等。
细菌纤维素(Bacterial cellulose,BC)是指在一定条件下，由醋酸菌属、土壤杆菌属、根瘤菌属和八叠球菌属等中的某种微生物合成的纤维素的统称。与植物纤维素相比，细菌纤维素有许多特点，主要包括：纯度高，结晶度高，聚合度高，网状结构的超细纤维,属纳米级纤维，弹性模量和抗张强度高，良好的生物相容性等。目前细菌纤维素在食品、造纸和医用材料等领域有广泛应用。基于其良好的性质，细菌纤维素非常适合作为敷料的基材。
透明质酸(Hyaluronic Acid,HA)是由两个双糖单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的大型多糖类。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。透明质酸具有较高临床价值的生化药物,广泛应用于各类眼科手术,如晶体植入、角膜移植和抗青光眼手术等，还可用于治疗关节炎和加速伤口愈合。目前透明质酸主要应用于化妆品中。
ε-聚赖氨酸(ε-Poly-L-Lysine,ε-PL)是由细菌产生的一种含有25-30个赖氨酸残基的同型单体聚合物。这种聚合物是通过赖氨酸残基的α-氨基和α-羧基形成的酞胺键连接而成，故称为ε-聚赖氨酸。聚赖氨酸具有强大的广谱抑菌性，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌以及一些病原体均由抑制作用。通过小鼠实验，也验证了聚赖氨酸的安全性和可食性。美日韩等多个国家已经将聚赖氨酸作为天然食品添加剂使用，主要是起到抑菌防腐作用。
目前，以BC为基材制备复合材料当敷料的方法主要有物理浸渍法和化学交联法。中国专利CN106344954A公开了一种生物抗菌细菌纤维素敷料及其制备方法，使用细菌纤维素浸渍抑菌剂ε-聚赖氨酸，再使用原花青素交联固定ε-聚赖氨酸，得到一种具有抗菌效果的细菌纤维素复合材料。细菌纤维素膜内的纤维三维结构虽是纳米级结构，但是对于小分子多肽来说，孔隙仍然过大。通过物理浸渍法多肽能轻易进入膜内的三维结构，但是不能将多肽固定在膜纤维结构之间，在漂洗过程中膜内的多肽会损失。而化学交联法需要用到交联剂，存在破坏纤维素的结构的问题，而且化学交联剂多数是具有毒性的，会对人体造成危害。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种细菌纤维素/透明质酸/ε-聚赖氨酸功能型敷料及其制备方法，利用透明质酸在水溶液中，分子链上大量的羧基解离成负离子，呈现出聚阴离子态，以及ε-聚赖氨酸在水溶液中，分子链上氨基带正电荷，呈现聚阳离子态的特性，使细菌纤维膜吸附透明质酸水溶液后，再通过静电力作用结合ε-聚赖氨酸，制备出功能型敷料；复合方法简单高效，细菌纤维素膜中透明质酸和ε-聚赖氨酸稳定结合，且各自的性质保留完好。
本发明提供了一种细菌纤维素/透明质酸/ε-聚赖氨酸功能型敷料，具有三维网状结构，所述ε-聚赖氨酸和透明质酸通过静电力结合，固定在细菌纤维素网络结构中。
本发明还提供了一种细菌纤维素/透明质酸/ε-聚赖氨酸功能型敷料的制备方法，包括：
将部分脱水的细菌纤维素膜浸泡入透明质酸水溶液中，吸附透明质酸至细菌纤维素膜溶胀；将浸泡完透明质酸溶液的细菌纤维素膜浸泡入ε-聚赖氨酸水溶液中，完成静电自组装反应，取出漂洗，得到细菌纤维素/透明质酸/ε-聚赖氨酸功能型敷料。
所述细菌纤维素膜是通过以木醋杆菌为菌种，经液体培养基恒温静置培养后，置于1％(m/v)氢氧化钠溶液中，在80℃下处理4h后取出，用去离子水漂洗至中性后获得。
所述部分脱水的细菌纤维素膜是通过无菌滤纸吸附，除去纯化后的细菌纤维素膜中50％的水分后获得。
所述透明质酸水溶液是通过将透明质酸粉末(MW<10000)溶解到无菌去离子水中，制成1～3mg/mL的透明质酸溶液，再经过滤获得，于4℃冷藏。
所述ε-聚赖氨酸水溶液是通过将聚赖氨酸粉末(MW<5000)于去离子水中溶解，制成1～3mg/mL的ε-聚赖氨酸水溶液，然后在0.08～0.1MPa压力下蒸汽灭菌20～30min，冷却后获得。
有益效果
(1)本发明制备方法简单易行，对于ε-聚赖氨酸和透明质酸的用量要求少。一方面透明质酸通过静电力作用将ε-聚赖氨酸固定在细菌纤维素网络中，另一方面ε-聚赖氨酸与透明质酸结合解决透明质酸易被细菌分解的问题；复合方法中无需交联剂，不会破坏细菌纤维素的三维网络结构，环保安全。
(2)本发明主要原料为细菌纤维素、ε-聚赖氨酸和透明质酸，均为绿色天然产物，获得方法简单，细菌纤维素、ε-聚赖氨酸可以通过发酵获得，而透明质酸可以从动物组织中提取。制备的细菌纤维素/透明质酸/ε-聚赖氨酸功能型敷料，保留了三种成分各自的特性，具有良好的力学性能、广谱抑菌性和生物相容性，可对敷料形状进行裁剪以贴合伤口，不与组织发生粘连，对皮肤无刺激性，是一种兼具广谱抑菌性和促进伤口愈合的功能型敷料，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1-3的细菌纤维素/透明质酸/ε-聚赖氨酸复合膜和对比例1的细菌纤维素的SEM扫描电镜(10000×)微观图；其中，A：对比例1；B：实施例1；C：实施例2；D：实施例3。
图2为实施例1-3的细菌纤维素/透明质酸/ε-聚赖氨酸复合膜和对比例1的细菌纤维素的抗菌效果测试结果图；其中，A：对比例1；B：实施例1；C：实施例2；D：实施例3。上面一排为金黄色葡萄球菌，下面一排为大肠杆菌。
图3为实施例1-3的细菌纤维素/透明质酸/ε-聚赖氨酸复合膜和对比例1的细菌纤维素的全血凝固实验图；其中，A：对比例1；B：实施例1；C：实施例2；D：实施例3。
图4为小鼠成纤维细胞L929在实施例1-3的细菌纤维素/透明质酸/ε-聚赖氨酸复合膜和对比例1的细菌纤维素培养72h后的CCK-8实验结果；其中，A：对比例1；B：实施例1；C：
实施例2；D：实施例3。
图5为小鼠成纤维细胞L929在实施例1-3的细菌纤维素/透明质酸/ε-聚赖氨酸复合膜和对比例1的细菌纤维素培养72h后的细胞荧光染色观察图；其中，A：对比例1；B：实施例1；C：实施例2；D：实施例3。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)以木醋杆菌为菌种，经液体培养基30℃恒温静置培养后，收集后置于1％(m/v)氢氧化钠溶液中，在80℃下处理4h，重复多次置膜成透明白色，再用去离子水漂洗至中性后获得细菌纤维素膜；
(2)将5mg透明质酸粉末溶于5mL经灭菌处理的去离子水中，经0.2～0.25μm滤膜过滤得到1mg/mL透明质酸水溶液；
(3)将5mgε-聚赖氨酸粉末溶于5mL去离子水中，得到1mg/mL的ε-聚赖氨酸水溶液，0.8MPa压力下蒸汽灭菌30min，冷却后使用；
(4)将步骤(1)得到的细菌纤维素膜用无菌滤纸除去50％的水分，浸泡入步骤(2)得到的透明质酸溶液中，至细菌纤维素膜恢复至蓬松状态；
(5)将步骤(4)处理得到的细菌纤维素取出，放入步骤(2)得到的ε-聚赖氨酸水溶液中，完成静电结合，当膜表面可观察到絮状物时，取出漂洗，得到细菌纤维素/透明质酸/ε-聚赖氨酸素复合膜。
实施例2
(1)以木醋杆菌为菌种，经液体培养基30℃恒温静置培养后，收集后置于1％(m/v)氢氧化钠溶液中，在80℃下处理4h，重复多次置膜成透明白色，再用去离子水漂洗至中性后获得细菌纤维素膜；
(2)将10mg透明质酸粉末溶于5mL经灭菌处理的去离子水中，经0.2～0.25μm滤膜过滤得到2mg/mL透明质酸水溶液；
(3)将10mgε-聚赖氨酸粉末溶于5mL去离子水中，得到2mg/mL的ε-聚赖氨酸水溶液，0.8MPa压力下蒸汽灭菌30min，冷却后使用；
(4)将步骤(1)得到的细菌纤维素膜用无菌滤纸除去50％的水分，浸泡入步骤(2)得到的透明质酸溶液中，至细菌纤维素膜恢复至蓬松状态；
(5)将步骤(4)处理得到的细菌纤维素取出，放入步骤(3)得到的ε-聚赖氨酸水溶液中，完成静电结合，当膜表面可观察到絮状物时，取出漂洗，得到细菌纤维素/透明质酸/ε-聚赖氨酸复合膜。
实施例3
(1)以木醋杆菌为菌种，经液体培养基30℃恒温静置培养后，收集后置于1％(m/v)氢氧化钠溶液中，在80℃下处理4h，重复多次置膜成透明白色，再用去离子水漂洗至中性后获得细菌纤维素膜；
(2)将15mg透明质酸粉末溶于5mL经灭菌处理的去离子水中，经0.2～0.25μm滤膜过滤得到3mg/mL透明质酸水溶液；
(3)将15mgε-聚赖氨酸粉末溶于5mL去离子水中，得到3mg/mL的ε-聚赖氨酸水溶液，0.8MPa压力下蒸汽灭菌30min，冷却后使用；
(4)将步骤(1)得到的细菌纤维素膜用无菌滤纸除去50％的水分，浸泡入步骤(2)得到的透明质酸溶液中，至细菌纤维素膜恢复至蓬松状态；
(5)将步骤(4)处理得到的细菌纤维素取出，放入步骤(3)得到的ε-聚赖氨酸水溶液中，完成静电结合，当膜表面可观察到絮状物时，取出漂洗，得到细菌纤维素/透明质酸/ε-聚赖氨酸复合膜。
对比例1
以木醋杆菌为菌种，经液体培养基30℃恒温静置培养后，收集后置于1％(m/v)氢氧化钠溶液中，在80℃下处理4h，重复多次置膜成透明白色，再用去离子水漂洗至中性后获得细菌纤维素膜。
分别对实施例1-3制得的细菌纤维素/透明质酸/ε-聚赖氨酸功能型敷料和对比例1细菌纤维素膜进行抗菌效果测试，其测试结果如下表所示：
由上表可知，细菌纤维素膜不具有抑菌作用，而本发明制备的细菌纤维素/透明质酸/ε-聚赖氨酸功能型敷料具有广谱抑菌性，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有抑菌效果，抑菌率均在90％以上。抑菌效果跟ε-聚赖氨酸的浓度呈现正相关。
从图1中可以观察到透明质酸和ε-聚赖氨酸(1:1)在通过静电力作用结合形成微球并且附着在细菌纤维素的纤维上，形成的微球的尺寸大小及数量随着透明质酸和ε-聚赖氨酸的两者浓度等比例提高而增加。
由图2可知，琼脂上的细菌纤维素膜周围无抑菌圈出现，说明细菌纤维素膜不具备抑菌效果。而细菌纤维素/透明质酸/ε-聚赖氨酸功能型敷料的周围均出现了抑菌圈，说明对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑菌效果。根据抑菌圈的大小可以看出，细菌纤维素/透明质酸/ε-聚赖氨酸功能型敷料对金黄色葡萄球菌的抑菌效果要优于大肠杆菌，而且随着敷料中ε-聚赖氨酸浓度的增加，表现出更好的抑菌效果。
由图3可知，细菌纤维素的无凝血效果，而本发明制备的细菌纤维素/透明质酸/ε-聚赖氨酸功能型敷料的凝血时间短，具有良好的止血作用，主要是由于透明质酸能够吸收血液促进血液凝结。细菌纤维素/透明质酸/ε-聚赖氨酸功能型敷料具有良好的凝血效果，且与透明质酸的浓度呈正相关。
由图4和图5可知，在72h时候，实施例1-3获得敷料上的细胞浓度均高于对比例1，说明细菌纤维素/透明质酸/ε-聚赖氨酸功能型敷料具有优异的生物相容性，主要原因是细菌纤维素/透明质酸/ε-聚赖氨酸功能型敷料中的透明质酸具有促进细胞增殖的效果。本发明利用静电力和氢键的作用使细菌纤维素、透明质酸和ε-聚赖氨酸三者稳定结合，并且不破坏细菌纤维素的纤维结构，三者特性保留完好，形成一种兼具抗菌、止血和高生物相容性等特点的功能型敷料，有在敷料领域应用的潜力。

Claims (6)

1.一种细菌纤维素/透明质酸/ε-聚赖氨酸功能型敷料，其特征在于：所述ε-聚赖氨酸和透明质酸通过静电力结合，固定在细菌纤维素网络结构中。
2.一种细菌纤维素/透明质酸/ε-聚赖氨酸功能型敷料的制备方法，包括：
将部分脱水的细菌纤维素膜浸泡入透明质酸水溶液中，吸附透明质酸至细菌纤维素膜溶胀；将浸泡完透明质酸溶液的细菌纤维素膜浸泡入ε-聚赖氨酸水溶液中，完成静电自组装反应，取出漂洗，得到细菌纤维素/透明质酸/ε-聚赖氨酸功能型敷料。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述细菌纤维素膜是通过以木醋杆菌为菌种，经液体培养基恒温静置培养后，置于氢氧化钠溶液中，在80℃下处理4h后取出，用去离子水漂洗至中性后获得。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述部分脱水的细菌纤维素膜是通过无菌滤纸吸附，除去纯化后的细菌纤维素膜中50％的水分后获得。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述透明质酸水溶液是通过将透明质酸粉末溶解到无菌去离子水中，制成1～3mg/mL的透明质酸溶液，再经过滤获得，于4℃冷藏。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述ε-聚赖氨酸水溶液是通过将聚赖氨酸粉末于去离子水中溶解，制成1～3mg/mL的ε-聚赖氨酸水溶液，然后在0.08～0.1MPa压力下蒸汽灭菌20～30min，冷却后获得。
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