CN109967519A - 一种尾矿库重金属污染的微生物修复方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种利用多种硫酸盐还原菌EM2、SRB‑4和铁离子还原菌Biometek‑A进行尾矿库微生物修复的方法，通过向尾矿中接种上述菌种并添加微生物生长所需的营养来搭建一套尾矿库微生物修复的体系。添加到尾矿中的一些营养物及还原菌的生长会抑制尾矿中固有氧化菌的生长，明显抑制多种重金属离子的氧化溶出，提高了尾矿pH，降低了氧化还原电势，同时大大降低了尾矿的通透性，所以，该修复方法能够对尾矿库起到修复作用。

Description

一种尾矿库重金属污染的微生物修复方法
技术领域
本发明属于生物修复领域，具体地涉及将多种硫酸盐还原菌和铁离子还原菌应用到尾矿重金属污染的一种尾矿库重金属污染的微生物修复方法。
背景技术
目前尾矿库重金属污染修复方法主要分为三大类：物理法，化学法和生物法。由于国外重金属污染面积较小，因此主要采取异位化学固化后再填埋的化学-物理相结合的方式处理，这一修复方式成本很高。目前国内主要采用原位化学固化技术，最大的问题在于成本过高、易改变土壤性质、造成植物减产等后果。还需要特别强调的是以上这些方法只针对已被重金属污染的场地(无新的重金属污染源)，难以应用于治理重金属源源不断溶出的污染场地(有色金属矿尾矿)。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种尾矿重金属污染的微生物修复技术，利用硫酸盐还原菌EM2、SRB-4和铁离子还原菌Biometek-A进行尾矿库重金属污染微生物修复，成本低，修复效果好，对环境及土壤结构破坏小，有利于生态恢复。
为了实现上述目的，本发明提供一种尾矿库重金属污染的微生物修复方法，包括如下步骤：
1)将硫酸盐还原菌EM2、SRB-4的菌种分别接种到富集培养基I中，35℃静止培养2-7天；
2)将铁离子还原菌Biometek-A的菌种接种到富集培养基II中35℃静止培养2-7天；
3)将富集培养的多种硫酸盐还原菌EM2、SRB-4和铁离子还原菌Biometek-A各按1％的比例接种到扩大培养基中35℃下进行静止培养2-10天，得到混合菌液；
4)将混合菌液接种到尾矿库中，反应4-6周。
其中，所述硫酸盐还原菌EM2的分类命名为：Desulfovibrio vulgaris EM2，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2017年11月1日，保藏编号为：CCTCC No.M2017645。
所述硫酸盐还原菌SRB-4的分类命名为Uncultured sulfate-reducingbacterium SRB-4，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2015年9月14日，保藏编号为：CCTCC No.M2015535。
所述铁还原菌Biometek-A的分类命名为：脂环酸杆菌(Alicyclobacillus sp.)Biometek-A(保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为：2012年12月26日，保藏编号为：CGMCC No.7038。
优选地，步骤1)所述富集培养基I的配方为：(NH4)2SO4 0.45g/L，MgSO4·7H2O0.50g/L，KCl 0.05g/L，Ca(NO3)2·5H2O 0.02g/L，葡萄糖2.50g/L，KH2PO4 10.00g/L，Na2HPO4 1.00g/L。
优选地，步骤1)所述富集培养基II的配方为：溶液A：MgSO4·7H2O 0.50g/L，(NH4)2SO4 0.40g/L，K2HPO4 0.20g/L，K2S4O6 0.15g/L，KCl 0.10g/L，MnSO4·H2O0.01g/L，Yeastextract 0.20g/L，调整pH值到1.8-2.5，湿热121℃灭菌30min；溶液B：FeSO4·7H2O 20.00g溶解到0.2mol/LH2SO4溶液中，定容到100ml，0.2μm的硝酸纤维素滤膜过滤除菌；将灭菌的溶液A冷却到50℃和除菌后的溶液B等体积混合。
优选地，步骤3)所述扩大培养基的配方为：(NH4)2SO4 1-5g/L，KCl 0.1-0.5g/L，K2HPO4 0.5-5g/L，MgSO4·7H2O 0.5-5g/L，Ca(NO3)2 0.01-1g/L，葡萄糖0-5g/L。
上述富集培养基I和II及扩大培养基是为了保证多种微生物种群结构相对稳定做的特有配方。
尾矿库的微生物修复是一种较为理想的方式，不仅成本低，环境友好，而且适用于治理重金属源源不断溶出的污染场地。本发明使用不同的硫酸盐还原菌的混合菌，是由于不同的硫酸盐还原菌所具有的生长特性有差异，有些需要丰富的营养，有些对营养的要求不高，并且还原能力也有差异，将不同的硫酸盐还原菌混合，可以适应不同尾矿库环境，从而扩大尾矿库微生物修复的适用范围。增加铁还原菌，可将三价铁还原成二价铁，由于三价铁在尾矿库重金属污染过程中起到类似催化剂的作用，能够加速尾矿库重金属氧化溶出，铁还原菌的引入能够将降低三价铁的含量，降低或停止重金属氧化溶出的进程，会将重金属污染的恶性循环转化成良性循环。本发明提供的修复对大部分尾矿库都有效果，对低pH值含硫的尾矿效果最好。
本发明的有益效果在于：
本发明提供一种尾矿重金属污染的微生物修复技术，该技术不仅适宜于已被重金属污染土壤的修复也适宜于重金属离子不断溶出的尾矿库的修复，而且还具有成本低，修复效果好，对环境及土壤结构破坏小，有利于生态恢复，因此，微生物修复相比而言具有更大的发展空间和应用前景，是一种比较有效的尾矿库重金属污染治理方式。
附图说明
图1为本发明提供的尾矿重金属污染的微生物修复技术的优选实施例中微生物修复实验的修复组和对照组样品理化性质结果差异比较图。
图2为为本发明提供的尾矿重金属污染的微生物修复技术的优选实施例中微生物种群结构图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明。
本发明所涉及硫酸盐还原菌EM2的分类命名为：Desulfovibrio vulgaris EM2，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2017年11月1日，保藏编号为：CCTCC No.M2017645。
硫酸盐还原菌SRB-4的分类命名为Uncultured sulfate-reducing bacteriumSRB-4，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2015年9月14日，保藏编号为：CCTCC No.M2015535。
铁还原菌Biometek-A的分类命名为：脂环酸杆菌(Alicyclobacillus sp.)Biometek-A(保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为：2012年12月26日，保藏编号为：CGMCC No.7038。
硫酸盐还原菌的富集培养：将硫酸盐还原菌EM2、SRB-4菌种分别接种到富集培养基I中，35℃培养5天。
富集培养基I配方为：(NH4)2SO4 0.45g/L，MgSO4·7H2O 0.50g/L，KCl 0.05g/L，Ca(NO3)2·5H2O 0.02g/L，葡萄糖2.50g/L，KH2PO4 10.00g/L，Na2HPO4 1.00g/L，121℃灭菌30min。
铁离子还原菌的富集培养：将铁离子还原菌Biometek-A菌种接种到富集培养基II中35℃培养5天；
富集培养基II配方为：
溶液A：MgSO4·7H2O 0.50g/L，(NH4)2SO4 0.40g/L，K2HPO4 0.20g/L，K2S4O60.15g/L，KCl 0.10g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，Yeast extract 0.20g/L，调整pH值到1.8-2.5，121℃灭菌30min
溶液B：FeSO4·7H2O 20.00g溶解到0.2mol/LH2SO4溶液中，定容到100ml，0.2μm的硝酸纤维素滤膜过滤除菌。
将灭菌的溶液A冷却到50℃和除菌后的溶液B等体积混合即可。
扩大培养：将富集培养的EM2、SRB-4和Biometek-A各按1％的比例加入到扩大培养基中35℃下进行培养8天，得到混合菌液.
扩大培养基的配方为：(NH4)2SO4 5g/L，KCl 0.3g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O5g/L，Ca(NO3)2 1g/L，葡萄糖5g/L。
实施例1实验室规模的修复
实验设置修复组和对照组，修复组中将120L放大培养的硫酸盐还原菌EM2、SRB-4和铁离子还原菌Biometek-A混合菌培养液(约5×107CFU/mL)喷洒在约0.5吨尾矿表面，而对照组只喷洒等体积的水。将两组放置在30℃环境中60天，收集渗出液，最后进行理化和微生物检测。
用pH计和氧化还原电势电极测定渗液的pH值和氧化还原电势值，渗液用超级滤膜(孔隙尺寸0.2μM)过滤后采用ICP-OES技术分析可溶性元素。
通过高通量测序分析微生物种群结构。将待测样品通过离心收集菌体，用E.Z.N.A.bacterial DNA kit(OMEGA,D3350-01)按照说明书操作步骤提取微生物全基因组DNA。用340F/805R引物通过高通量测序法测定细菌和古菌的16S rDNA的V3+V4区，测序结果用FLASH软件将片段拼接，根据末端携带的条码序列将测序结果分到指定的样品组，用Chimera Slayer tool软件来检测剔除嵌合体序列，用QIIME软件和mothur软件进行序列分析，用pick_de_novo_otus.py进行OUT分析，获得修复前后微生物种群结构变化。其中分析菌群结构均基于属水平进行分析。
尾矿重金属污染微生物修复实验的修复组和对照组样品理化性质结果差异如图1A-D所示。
从图1A可以看出对照组渗出液的pH为3.6，修复组渗出液的pH提高到7.5，氧化还原电位由对照组的574mV减少到修复组的386mV，重金属的溶出与pH，氧化还原电势息息相关，pH越低，溶液越酸重金属越容易溶出；氧化还原电势越高，硫化物和重金属越容易氧化，硫化物和重金属越容易溶出，而提高pH和降低氧化还原电位都有利于阻止重金属污染物的溶出。
从图1B可以看出，对照组的渗透时间约为3h，修复组的渗透时间增加到72小时，而渗透时间的增加说明尾矿的通透性降低，证明尾矿的微生物修复过程中能显著降低尾矿的通透性。由于尾矿库的污染是因为氧气，雨水等渗入尾矿库将尾矿中的重金属溶出，修复产生的金属硫化物沉淀将尾矿内部空隙堵住后，渗透性大大下降，会导致渗进尾矿中的雨水和空气大大减少，那么溶出的重金属会大大减少，产生的含重金属的酸性废水也会大大减少。
从图1B、C和D可以看出，修复组中Fe，S，Cu、Zn和Pb的浓度也比对照组大幅降低，分析其原因在于重金属的污染是因为重金属溶于水后能够被动物，植物，微生物等生物利用，若硫和重金属被沉淀，不溶于水，那么被生物利用的量会大大减少，所以硫和重金属浓度的降低说明污染性和危害性在降低，从而说明尾矿的微生物修复能够有助于各种元素的固化和稳定化，有助于尾矿的修复。而硫主要以硫酸盐的形式存在于溶液中，若溶液中的硫减少说明硫酸盐减少，可以作为硫酸盐还原生成金属硫化物的一个标志。
尾矿重金属污染微生物修复实验的对照组和实验组相比关键微生物也不同(图2)。在对照组中铁、硫氧化微生物(Acidithiobacillus，Thiobacillus，Leptospirillim)为尾矿固有微生物的优势种群，因此，尾矿内固有的微生物会促进尾矿溶出含重金属离子的酸性废水。在修复组中，铁、硫氧化微生物被明显的抑制，硫酸盐还原微生物是修复组尾矿样品中的优势微生物。
本申请添加的菌是硫酸盐还原菌Desulfovibrio vulgaris EM2、Unculturedsulfate-reducing bacterium SRB-4和铁离子还原菌Alicyclobacillus sp.Biometek-A，硫酸盐还原菌作用是将硫酸盐还用成硫负离子，硫负离子可以将重金属沉淀，铁还原菌能够将三价铁还原成二价铁，三价铁在尾矿库重金属污染过程中起到类似催化剂的作用，能够加速尾矿库重金属氧化溶出，铁还原菌的引入能够将重金属污染的恶性循环转化成良性循环。
从上述实施例中可以看出，本发明提供的尾矿库重金属污染的微生物修复方法，不仅可以将溶出重金属污染物重新固化下来，还可以抑制尾矿中原氧化菌种群的生长，逆转尾矿库的微环境。

Claims (7)

1.一种尾矿库重金属污染的微生物修复方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将硫酸盐还原菌EM2、SRB-4的菌种分别接种到富集培养基I中，35℃静止培养2-7天；
2)将铁离子还原菌Biometek-A的菌种接种到富集培养基II中35℃静止培养2-7天；
3)将富集培养的多种硫酸盐还原菌EM2、SRB-4和铁离子还原菌Biometek-A各按1％的比例接种到扩大培养基中35℃下进行静止培养2-10天，得到混合菌液；
4)将混合菌液接种到尾矿库中，反应4-6周。
2.如权利要求1所述的尾矿库重金属污染的微生物修复方法，其特征在于，所述硫酸盐还原菌EM2的分类命名为：Desulfovibrio vulgaris EM2，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2017年11月1日，保藏编号为：CCTCCNo.M2017645；
所述硫酸盐还原菌SRB-4的分类命名为Uncultured sulfate-reducing bacteriumSRB-4，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2015年9月14日，保藏编号为：CCTCC No.M2015535。
3.如权利要求1所述的尾矿库重金属污染的微生物修复方法，其特征在于，所述铁还原菌Biometek-A的分类命名为：脂环酸杆菌(Alicyclobacillus sp.)Biometek-A(保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为：2012年12月26日，保藏编号为：CGMCCNo.7038。
4.如权利要求1所述的尾矿库重金属污染的微生物修复方法，其特征在于，步骤1)所述富集培养基I的配方为：(NH4)2SO4 0.45g/L，MgSO4·7H2O 0.50g/L，KCl 0.05g/L，Ca(NO3)2·5H2O 0.02g/L，葡萄糖2.50g/L，KH2PO4 10.00g/L，Na2HPO4 1.00g/L。
5.如权利要求1所述的尾矿库重金属污染的微生物修复方法，其特征在于，步骤2)所述富集培养基II的配方为：溶液A：MgSO4·7H2O 0.50g/L，(NH4)2SO4 0.40g/L，K2HPO4 0.20g/L，K2S4O6 0.15g/L，KCl 0.10g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，Yeast extract 0.20g/L，调整pH值到1.8-2.5，湿热121℃灭菌30min；溶液B：FeSO4·7H2O 20.00g溶解到0.2mol/LH2SO4溶液中，定容到100ml，0.2μm的硝酸纤维素滤膜过滤除菌；将灭菌的溶液A冷却到50℃和除菌后的溶液B等体积混合。
6.如权利要求1所述的尾矿库重金属污染的微生物修复方法，其特征在于，步骤3)所述扩大培养基的配方为：(NH4)2SO4 1-5g/L，KCl 0.1-0.5g/L，K2HPO4 0.5-5g/L，MgSO4·7H2O0.5-5g/L，Ca(NO3)2 0.01-1g/L，葡萄糖0-5g/L。
7.如权利要求1所述的尾矿库重金属污染的微生物修复方法，其特征在于，步骤4)所述混合菌液喷洒量为100-500L/t。
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