CN117402787B - 一种降低抗生素抗性基因含量的修复材料及方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于土壤修复技术领域，公开了一种降低抗生素抗性基因含量的修复材料及方法和应用。本发明的降低抗生素抗性基因含量的修复材料包括改良材料和微生物菌剂；所述改良材料包括蚕粪、泥炭、市政污泥、粉煤灰、大豆肥、蘑菇渣中的至少一种；所述微生物菌剂包括质量比为(1～3):2的梭菌和脱硫杆菌。本发明将所述的修复材料、所述的修复方法在金属矿业废弃地生态修复中应用。本发明可以实现金属矿业废弃地土壤的原位修复，在源头上解决矿山酸化和重金属污染问题的同时，降低修复后土壤中抗生素抗性基因的含量，降低其对人体和生态系统的健康风险，为提升修复后矿区土壤的利用价值提供安全保障。

Description

一种降低抗生素抗性基因含量的修复材料及方法和应用

技术领域

本发明涉及土壤修复技术领域，具体涉及一种降低抗生素抗性基因含量的修复材料及方法和应用。

背景技术

抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes,ARGs)是广泛存在于环境中的一类污染物，细菌可通过基因突变或ARGs的水平转移进化为新的耐药菌株。抗生素抗性的演变成为对人类健康的最大威胁之一，而人类活动明显加速了其传播过程。其传播过程受到多种因素的影响，除抗生素残留外，还包括重金属、消毒剂及其副产物、抗生素抗性菌、可移动遗传元件以及环境参数等。其中抗生素和重金属是影响环境中ARGs传播重要的选择性压力。重金属在某些情况下可能为抗生素耐药性的环境选择提供更强、更持久的选择性压力，重金属含量以及抗生素含量和重金属含量的交互作用对ARGs的传播也具有显著影响。

在金属矿业废弃地当中，重金属元素种类丰富、浓度大，超过土壤环境质量标准中的要求，是一类极端环境的退化生态系统。当金属废弃物暴露在空气中时，在微生物的作用下会快速氧化，氧化过程中形成的可溶性重金属离子，随雨水的冲刷形成酸性废水，在这过程中抗生素抗性基因也随其传播，影响到周边人们的健康与安全。现有的矿山修复方法有覆土/隔离覆土技术、物理化学改良技术等。覆土/隔离覆土技术存在较大的局限性，如成本高、管理不便、取土困难等问题，该方法只能在条件允许的矿区中实现。物理化学改良技术通过如挖松紧实土壤、整理土壤表面等物理措施，同时施加有机肥料进行改良，但停止施肥后，植被覆盖度、生物量都有明显下降；因此需要长期的人力、物力投入，较难管理，效果持续时间短。传统生态修复方法施加了大量有机肥料，因肥料来源不清，大多通过动物粪便、作物秸秆、生活垃圾、工业废弃物堆肥而来，其中往往引入了大量的抗生素抗性基因，并在矿山修复过程引入到生态系统中，对生态系统的功能与安全造成潜在威胁，并影响修复后土地利用价值的提升。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种降低抗生素抗性基因含量的修复材料及方法和应用，可从源头上解决金属矿山酸化和重金属污染问题的同时，降低修复后土壤中抗生素抗性基因的含量。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种降低抗生素抗性基因含量的修复材料，包括改良材料和微生物菌剂；所述改良材料包括蚕粪、泥炭、市政污泥、粉煤灰、大豆肥、蘑菇渣中的至少一种；所述微生物菌剂包括质量比为(1～3):2的梭菌和脱硫杆菌。

本发明的修复材料通过特定微生物的硫酸盐还原和矿化作用，将矿业废弃地中的重金属离子钝化，不再参与微生物的生命活动，减缓抗生素抗性基因在土壤环境中的富集。采用低抗生素抗性基因的改良材料进行生态修复，减少外源抗生素抗性基因的输入，并与微生物协同将低抗生素抗性基因材料中的纤维素等大分子降解为小分子有机物，为前述硫酸盐还原和矿化微生物提供碳源。通过引入特定微生物菌群，改变原先矿渣中微生物群落组成，减少耐抗生素宿主菌群比例，从而控制抗性基因在微生物间的水平转移，减少抗性基因在土壤中的富集。通过化学、物理、微生物和植物的协同作用，控制矿渣酸化和重金属溶出，改善土壤物理性质，固化重金属，建立稳定的生态系统，在实现生态修复的同时，还可以大幅度减少土壤中抗性基因的含量。

作为本发明所述的修复材料的优选实施方式，所述改良材料和微生物菌剂的质量比为(400～600):1。

作为本发明所述的修复材料的优选实施方式，所述微生物菌剂还包括布拉氏菌、弗兰克氏菌、诺卡氏菌、假单胞菌、芽孢杆菌中的至少一种。

作为本发明所述的修复材料的优选实施方式，所述微生物菌剂为质量比为(1～3):2:(1～3)的梭菌、脱硫杆菌和假单胞菌。

作为本发明所述的修复材料的优选实施方式，所述微生物菌剂为质量比为(1～3):2:(0.5～1)的梭菌、脱硫杆菌和诺卡氏菌。

第二方面，本发明提供了一种降低金属矿业废弃地中抗生素抗性基因含量的修复方法，包括以下步骤：

(1)翻耕所述金属矿业废弃地，调节土壤pH值至6～8；

(2)施加所述修复材料中的所述改良材料，翻耕；

(3)施加所述修复材料中的所述微生物菌剂，翻耕；

(4)施加生态土，即成。

本发明修复方法通过各步骤间相互作用，既协同改善了矿区废弃地易产生酸性废水、污水中重金属含量高的问题，同时解决了传统修复方法大量引入或富集ARGs的问题。

作为本发明所述的修复方法的优选实施方式，在步骤(1)中，采用碱性材料调节土壤pH值；所述碱性材料为烧碱、草木灰、生石灰、熟石灰、碱渣、磷石膏中的至少一种。

作为本发明所述的修复方法的优选实施方式，在步骤(2)中，所述改良材料的施加量为1～5吨/100m²；在步骤(3)中，所述微生物菌剂的施加量为5～20g/m²；所述翻耕的深度为10～20cm。

作为本发明所述的修复方法的优选实施方式，在步骤(4)中，所述所述生态土为植物种子和植物栽培土的混合物；所述植物种子和植物栽培土的配比为10g植物种子/kg植物栽培土；所述植物种子为禾本科、豆科、菊科中的至少一种；所述植物栽培土为田园表土。

优选的，在步骤(4)中，施加生态土后，再种植植物。所述植物为乔灌幼苗，所述乔灌幼苗为樟科、松科、柏科或当地本土植物中的至少一种，所述乔灌幼苗的种植密度为1～2株/m²。采取间作种植。

第三方面，本发明将所述的修复材料、所述的修复方法在金属矿业废弃地生态修复中应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明可以实现金属矿业废弃地土壤的原位修复，在源头上解决矿山酸化和重金属污染问题的同时，降低修复后土壤中抗生素抗性基因的含量，降低其对人体和生态系统的健康风险，为提升修复后矿区土壤的利用价值提供安全保障。

2、本发明的修复材料与传统有机肥材料相比，含抗生素抗性基因极低的改良材料所含的营养成分与传统材料可以取得相似的修复效果，同时能大量降低抗生素抗性基因的含量。可改善土壤理化性质，增强土壤肥力，提高土壤孔隙率，减少雨水侵蚀，有效防止有色金属矿业废弃地高渗透土壤导致的水环境污染，从源头降低有色金属矿业废弃地中重金属对于地下水污染的可能性。可持续对重金属造成的环境污染进行修复，保持生态稳定，不易退化，有长期性，修复一年后植被覆盖度可达90％以上。对矿业废弃地进行修复后，可以有效控制抗生素抗性基因等安全风险，为提升土地利用价值提供条件。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例的修复地点为广东某地矿山排土场边坡，该排土场具有强酸性、重金属污染严重、土地极端贫瘠、生态完全退化的特点。

设施实验组：降低抗生素抗性基因含量的修复材料，由市政污泥和微生物菌剂组成；微生物菌剂为质量比为3：2：2的梭菌、脱硫杆菌、假单胞菌；市政污泥的pH为6-8，有机质的质量分数(以烘干基计)≥30％，总养分(N+P₂O5+K₂O)的质量分数(以烘干基计)≥4.0％，水分(鲜样)的质量分数≤30％，机械杂质的质量分数≤0.5％；市政污泥的施用量为1吨/100m²；微生物菌剂的施用量为10g/m²。对照组：传统修复材料，由有机肥和传统微生物菌剂组成；有机肥来源于当地农产品市场，由鸡粪熟成，C含量约为152g/kg，N含量约为9.4g/kg，P含量约为4.5g/kg；传统微生物菌剂为质量比为2：1：1的地杆菌、根瘤菌、圆褐固氮菌；有机肥的施用量为1吨/100m²；传统微生物菌剂的施用量为10g/m²。

设置修复区域A和修复区域B，修复面积均为200m²。所用生态土为植物种子和植物栽培土的混合物(配比为10g植物种子/kg植物栽培土)，其中，植物种子为质量比为1：1：1的禾本科、豆科、菊科的植物种子，植物栽培土为田园表土。

本实施例探究降低抗生素抗性基因含量的修复材料对修复区域的土壤理化性质、生物多样性、土壤微生物群落结构、地表水水质以及抗生素抗性基因含量的影响，评价该修复材料应用于金属矿山废弃地的生态修复效能，并与传统修复材料与菌剂修复性能对比，具体包括如下步骤：

(1)对修复地的土壤进行初步分析测试，测量两块实验区土壤下方出水的pH值、营养元素含量、水浸态重金属的含量以及抗生素抗性基因含量；

(2)对修复区域A和修复区域B进行场地平整，除去大块石头矿渣，修筑排水沟；

(3)施加石灰，将修复区域A和修复区域B的土壤pH调整在7～8范围内；

(4)分别对步骤(3)处理后修复区域A和修复区域B的土壤分别施加实验组修复材料中的市政污泥和对照组传统修复材料中的有机肥；然后翻耕表面20cm深度土层，浇水；

(5)分别对步骤(4)处理后修复区域A和修复区域B的土壤分别施加实验组修复材料中的微生物菌剂和对照组传统修复材料中的传统微生物菌剂；然后翻耕表面20cm深度土层；

(6)分别对步骤(5)处理后修复区域A和修复区域B翻耕后的土壤分别施加生态土；随后分别种植乔灌幼苗，乔灌幼苗种类为朱槿、三角梅、乌桕，采取间作种植，密度为1株/m²，覆盖稻草秸秆，完成修复。

(7)工期养护以及采样测试。

检测土壤指标，具体如下：

在修复前对两地块进行修复前土样采样，修复三月后，再次进行采样，各区域各采集5个土壤样品及5个地表水样品。

土壤理化指标包括：土壤容重、孔隙度、pH、NAG-pH、NAG、EC、总有机碳、总氮、总磷、有效磷、凯氏氮和重金属(Fe、Cu、Zn、Pb、Cr、Cd)浸出态。

地表水理化指标包括：pH、COD_Cr、S^2-、SO₄ ^2-、总有机碳、总氮、总磷、氨氮、总大肠菌群和重金属(Fe、Cu、Zn、Pb、Cr、Cd)。测定抗生素抗性基因的绝对定量含量。

结果如表1和2所示：

表1.修复后3个月后土壤理化测试结果

由表1可看出，修复后修复区域A和修复区域B土壤的pH、NAG-pH、都呈现中性，与修复前相比已不产酸；从营养含量上看，两区域的总氮、凯氏氮、总磷、有效磷在修复后，都呈现明显上升的趋势，证明修复后两区域土壤肥力都有所上升，表现出实验组修复材料在营养元素方面与传统有机肥相似的修复效果；土壤容重和孔隙率用于评估土壤质量、土壤透水、透气与蓄水保墒能力，反映土壤松紧程度及结构状态的好坏。修复后，两区域土壤容重有所下降，孔隙率上升，说明两区域的修复对土壤结构有了很大的改善提高，土壤保湿持水能力增加。在重金属修复方面上，修复后，两区域土壤水浸出液重金属含量大幅下降，下降幅度达90％以上，其中Fe元素下降幅度最大；尤其是，实验组处理的修复区域A的土壤中Cu、Pb、Cd元素已无法检出。

表2.修复后3个月后地表水理化测试结果

由表2可看出，修复前修复区域的地表水呈酸性，修复三月后两区域均呈中性；化学需氧量COD是一个重要的而且能较快测定的有机物污染参数，两区域的COD值在修复后都有所下降，证明水体的有机物污染程度有了明显的下降；同样的，从营养元素来看，修复后，地表水所含的营养元素都有不同程度的下降，即两种修复材料在地表水方面都有较好的修复效果，并不会出现地表水富营养化现象出现。

在地表水重金属含量方面上看，修复前地表水重金属含量较高，其中Fe元素含量最高，达到了107.06mg/L。修复后，两区域地表水重金属含量同样大幅下降，同样的Fe元素下降幅度最大，实验组处理的区域A中有三种重金属元素已检出不出，而对照组处理的区域B有两种，下降幅度均达90％以上，两区域地表水重金属含量均已符合地表水重金属含量国家标准。

在重金属修复固定表现中，实验组和对照组处理的区域同样无明显差异，均表现出对重金属元素固定明显的修复效果。

各主要类型抗生素抗性基因绝对丰度见表3。

表3.主要抗生素抗性基因种类及绝对丰度

通过对土壤抗生素抗性基因进行检测，发现在修复前的矿渣中，ARG的绝对丰度为3.29×10⁷，修复区域A的绝对丰度为1.04×10⁷，修复区域B的绝对丰度为2.47×10⁸。采用实验组处理的区域，ARG含量较修复前可以降低68.3％，相对传统修复技术下降95.8％。

综上，由实验组与对照组处理的区域各项指标对比可以得出，实验组修复处理表现出良好的修复效果，在土壤理化性质、重金属固定等方面表现出优于对照组的修复效果。而且实验组的修复材料几乎不引入抗生素抗性基因，并且在微生物菌剂的作用下，甚至能抑制抗生素抗性基因的富集，达到了对抗生素抗性基因降低的修复效果。

实施例2

本实施例的修复地点为江西某地的废弃尾矿库，该尾矿库pH低达2.5左右，酸化情况十分严重。

设施实验组：降低抗生素抗性基因含量的修复材料，由蚕粪泥炭混合物和微生物菌剂组成；蚕粪泥炭混合物中蚕粪、泥炭的质量比为1:1，微生物菌剂为质量比为1：2：1的梭菌、脱硫杆菌、诺卡氏菌；蚕粪泥炭混合物的施用量为1吨/100m²；微生物菌剂的施用量为10g/m²。

所用生态土为植物种子和植物栽培土的混合物(配比为10g植物种子/kg植物栽培土)，其中，植物种子为质量比为1：1：1的禾本科、豆科、菊科的植物种子，植物栽培土为田园表土。

本实施例探究降低抗生素抗性基因含量的修复材料对修复区域的土壤理化性质和抗生素抗性基因含量等的影响，评价该修复材料应用于废弃尾矿库的生态修复效能，具体包括如下步骤：

(1)对原始矿渣进行初步分析测试，包含pH值、营养元素含量、水浸态重金属的含量以及抗生素抗性基因含量等；

(2)对修复区进行场地平整，除去大块石头矿渣，修筑排水沟；

(3)施加石灰，将土壤pH调整在7～8范围内。

(4)对步骤(3)处理后的土壤施加蚕粪泥炭混合物，然后翻耕表面20cm深度土层，浇水；

(5)对步骤(4)处理后的区域施加微生物菌剂，然后翻耕表面20cm深度土层；

(6)对步骤(5)翻耕后的土壤施加生态土，覆盖稻草秸秆，完成修复。

(7)植物养护以及采样测试。

在修复一年后，共采集12个土壤样品，每个样品类型6个。

土壤理化参数包括pH、电导率(EC)、净产酸能力(NAG)、硫酸根(SO₄ ^2-)、二价铁(Fe^{2 +})、三价铁(Fe³⁺)、总有机碳(TOC)、总氮、总磷、有效磷、含水率。

检测结果如表4和5所示：

表4.修复前/后土壤理化数据

从表4中得出，修复前样地土壤呈现酸性，营养元素低，土壤物理结构差、重金属含量高等特点；修复后，土壤pH呈现中性、电导率EC下降、营养元素大幅上升、C/N比增加、重金属Fe²⁺含量上升、重金属Fe³⁺含量大幅下降、有效磷增加，含水率上升等特点。说明修复后的土壤物理化学性能均得到大幅改善，重金属被固定，植物生长稳定，修复后生态趋向稳定，并不会出现退化现象。

表5.修复前/后抗生素抗性基因总丰度

从表5可看出，土壤修复后显著降低了总ARG丰度，从未修复的305(覆盖率,×/Gb)降至修复后土壤的11(覆盖率,×/Gb)，平均消除率达到90％以上，在实验组修复材料的作用下，能有效去除废弃尾矿库土壤中的抗生素抗性基因，对矿区ARG的去除效果非常明显。

对比例

本实施例的修复地点为广东某地矿山排土场边坡，该排土场土壤酸化严重、重金属含量高、植物难以生长等特点。

设施对比组A：实施例1的降低抗生素抗性基因含量的修复材料中的市政污泥；市政污泥的施用量为1吨/100m²；对比组B：实施例1的降低抗生素抗性基因含量的修复材料中的微生物菌剂；微生物菌剂为质量比为3：2：2的梭菌、脱硫杆菌、假单胞菌；微生物菌剂的施用量为10g/m²；对比组C：实施例1的传统修复材料中的有机肥；有机肥来源于当地农产品市场，由鸡粪熟成，C含量约为152g/kg，N含量约为9.4g/kg，P含量约为4.5g/kg；有机肥的施用量为1吨/100m²；对比组D：实施例1的传统修复材料中的传统微生物菌剂；传统微生物菌剂为质量比为2：1：1的地杆菌、根瘤菌、圆褐固氮菌；传统微生物菌剂的施用量为10g/m²。

设置修复区域A、修复区域B、修复区域C、修复区域D，修复面积均为200m²。所用生态土为植物种子和植物栽培土的混合物(配比为10g植物种子/kg植物栽培土)，其中，植物种子为质量比为1：1：1的禾本科、豆科、菊科的植物种子，植物栽培土为田园表土。

本实施例探究降低抗生素抗性基因含量的修复材料对修复区域的土壤理化性质的影响，评价该修复材料应用于金属矿山废弃地的生态修复效能，具体包括如下步骤：

(1)对原始矿渣进行初步分析测试，包含pH值、营养元素含量、重金属的含量以及抗生素抗性基因含量等；

(2)对修复区域进行场地平整，除去大块石头矿渣，修筑排水沟；

(3)施加石灰，将修复区域的土壤pH调整在7～8范围内；

(4)分别对步骤(3)处理后修复区域A和修复区域C的土壤分别施加对比组A的市政污泥和对比组C的有机肥；修复区域B和修复区域D添加等量的石英砂；然后翻耕表面20cm深度土层，浇水；

(5)分别对步骤(4)处理后修复区域B和修复区域D的土壤分别施加对比组B微生物菌剂和对比组D传统微生物菌剂；然后翻耕表面20cm深度土层；

(7)分别对步骤(5)处理后修复区域A、修复区域B、修复区域C、修复区域D翻耕后的土壤施加生态土；随后覆盖稻草秸秆，完成修复。

(7)植物养护以及采样测试。

检测土壤指标，具体如下：

在修复一年后，采集修复前与修复一年后四区域的土壤样品各5个，共采集25个土壤样品。

土壤理化参数包括pH、电导率(EC)、净产酸能力(NAG)、NAG-pH、硫酸根(SO₄ ^2-)、总有机碳(TOC)、总氮、总磷、有效磷、总铜、总铁、总锌。

检测结果如表6和7所示：

表6.修复前与修复一年后四区域理化数据

由表6数据分析可得，修复前土壤贫瘠、重金属含量高；修复一年后，B、D区域为只添加菌剂修复区域，其修复效果表现出与修复前相差无异的效果，土壤仍然表现为酸性，重金属含量高等特点，证明了只使用微生物菌剂，不添加修复材料的这种修复方法不可行，在原本营养贫乏、重金属含量高的土壤中，微生物菌剂无法正常生长，导致修复失败。同样的，A、C区域为只添加市政污泥或有机肥，并无添加菌剂，其修复一年后表现出：土壤呈酸性、重金属含量高、营养元素较修复前略微升高的特点，而区域C添加有机肥后重金属含量反而有所上升。证明了只添加市政污泥或有机肥，不添加菌剂的修复方法同样不可行，而根据采样时现场的情况观察得出，植物在这四个区域均无生长，表现出与修复前同样的环境特点，此四块修复区域均修复失败。

表7.修复前与修复一年后各区域抗生素抗性基因总丰度

从表7可看出，修复前，土壤中抗生素抗性基因含量高，修复一年后A、B、D区域表现出与修复前相似的抗生素抗性基因丰度，而C区域甚至带来了新的污染导致了丰度的增加。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (5)

1.一种降低抗生素抗性基因含量的修复材料，其特征在于，由市政污泥和微生物菌剂组成；所述微生物菌剂为质量比为3：2：2的梭菌、脱硫杆菌、假单胞菌；

以烘干基计，所述市政污泥的有机质的质量分数≥30%，总养分N+P₂O₅+K₂O的质量分数≥4.0%；

所述市政污泥的pH为6-8，鲜样水分的质量分数≤30%，机械杂质的质量分数≤0.5%；

所述市政污泥的施用量为1吨/100m²；所述微生物菌剂的施用量为10 g/m²。

2.一种降低抗生素抗性基因含量的修复材料，其特征在于，由蚕粪泥炭混合物和微生物菌剂组成；

所述蚕粪泥炭混合物中蚕粪、泥炭的质量比为1:1；

所述微生物菌剂为质量比为1：2：1的梭菌、脱硫杆菌、诺卡氏菌；

所述蚕粪泥炭混合物的施用量为1吨/100m²；所述微生物菌剂的施用量为10 g/m²。

3.一种降低金属矿业废弃地中抗生素抗性基因含量的修复方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）翻耕所述金属矿业废弃地，采用石灰调节土壤pH值至7~8；

（2）施加权利要求1所述修复材料中的所述市政污泥，翻耕；

所述翻耕的深度为20cm；

（3）施加权利要求1所述修复材料中的所述微生物菌剂，翻耕；

（4）施加生态土，即成；

所述生态土为植物种子和植物栽培土的混合物；

所述植物种子和植物栽培土的配比为10g植物种子/kg植物栽培土；

所述植物种子为质量比为1:1:1的禾本科、豆科、菊科的植物种子；

所述植物栽培土为田园表土。

4.一种降低金属矿业废弃地中抗生素抗性基因含量的修复方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）翻耕所述金属矿业废弃地，采用石灰调节土壤pH值至7~8；

（2）施加权利要求2所述修复材料中的所述蚕粪泥炭混合物，翻耕；

所述翻耕的深度为20cm；

（3）施加权利要求2所述修复材料中的所述微生物菌剂，翻耕；

（4）施加生态土，即成；

所述生态土为植物种子和植物栽培土的混合物；

所述植物种子和植物栽培土的配比为10g植物种子/kg植物栽培土；

所述植物种子为质量比为1:1:1的禾本科、豆科、菊科的植物种子；

所述植物栽培土为田园表土。

5.权利要求1或2所述的修复材料、权利要求3或4所述的修复方法在金属矿业废弃地生态修复中的应用。