CN109280650B - 一株噬菌体及其在土壤修复中的应用 - Google Patents

Abstract

一株噬菌体及其在土壤修复中的应用，噬菌体φYSZPK，于2018年08月01日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M 2018516，分类命名为 Pseudomonas aeruginosa andKlebsiella phage φYSZPK。将生物质炭与筛分出的噬菌体联用回接到污染土壤中可协同阻控并深度追踪灭活土壤‑蔬菜体系中抗性致病细菌和抗性基因的传播与扩散；生物质炭与噬菌体联用对土壤‑蔬菜体系中微生物群落功能稳定性具有积极促进作用；同时有效缓解土壤‑蔬菜体系中抗性致病细菌的扩散，防止其二次污染，为我国抗生素抗性致病细菌污染农田土壤生物修复治理提供一种新的解决方法。

Description

一株噬菌体及其在土壤修复中的应用

技术领域

本发明属于多种抗生素抗性致病细菌及其相关抗性基因复合污染土壤修复技术领域，尤其涉及一株噬菌体φYSZPK及其在阻控灭活土壤-蔬菜体系中抗生素抗性致病细菌中的应用。

背景技术

近年来由于抗生素类兽药的滥用、畜禽粪便安全化处理技术的不足及环境管理的缺失，中国及世界范围内许多国家的城郊畜牧业养殖厂周边农田土壤-蔬菜系统，常成为残留和滋生抗生素抗性细菌（Antibiotic Resistance Bacteria，ARB）和抗性基因（Antibiotic Resistance Genes，ARGs）的高风险热点“源”和“汇”，尤其是在大量环境中可移动基因元件（质粒、整合子、转座子）水平转移或垂直转导的促进作用下，一些人畜共患抗生素抗性致病细菌的扩散传播风险更会大大增加，同时给人体健康和生态安全带来了极为严重的潜在威胁。因而，开展生物质炭阻控与噬菌体疗法靶向灭活土壤-蔬菜体系中抗生素抗性致病细菌的技术发明十分必要和迫切 。

生物质炭（Biochar）是由植物（作物）及其废弃物在部分或完全缺氧的情况下经高温烧制产生的一类多孔隙、比表面积大、吸附能力强、可提供土著微生物着床的环境友好型功能材料。有研究表明，在畜禽养殖场周边农田土壤、医疗废弃物处理厂和垃圾填埋场周边覆土中，添加生物质炭可高效广谱性协同阻控多种ARB和ARGs在土壤-植物体系中的传播路径、传播频率和传播距离，环境中ARB和ARGs的扩散风险在生物质炭的阻隔、吸附、促消减作用下得到有效降低，同时施加生物质炭有助于保持土壤肥力，改善作物品质，提高作物产量。

细菌噬菌体（简称噬菌体）是一类专属性捕食活体宿主细菌而存活的生物体，在土壤、水、空气乃至人和动物体表或肠道内均广泛分布，据估算其总量达到10³¹数量级；噬菌体疗法（Phage Therapy）是指通过分离、筛选、纯化和富集宿主细菌的噬菌体之后，筛选出高效价、裂解期短、抗逆性强的多价态噬菌体，然后向污染土壤-植物体系中添加特定噬菌体菌液，定向侵染并灭活致病细菌的修复方式。

通过相关文献查阅和专利检索，并未发现有关生物质炭与噬菌体疗法对复合高丰度抗生素抗性致病细菌和抗性基因污染土壤-蔬菜体系生物修复技术的公开发表和受理，与本发明最接近的现有方法是生物质炭单独或配施菌剂吸附去除大肠杆菌并防治土传病害以及噬菌体疗法特异性灭活铜绿假单胞菌或是预防作物青枯病的相关应用。中国发明申请号：CN201310256154.2、CN201710345239.6、CN201710558388.0、CN201710089442.1、CN201580008049.4和CN201510008569.7分别是改性生物质炭吸附水体中大肠杆菌、生物质炭与飞灰联用去处土壤地下水系统中有机/无机污染物、生物质炭复合生物菌剂防治西瓜枯萎病、高特异性噬菌体攻击灭活铜绿假单胞菌/大肠杆菌以及噬菌体疗法防治烟草青枯病青枯菌；目前现有的主要是单独使用生物质炭或噬菌体疗法吸附去除治病细菌预防植物/作物病害的研究方法，然而针对生物质炭与噬菌体疗法联用消减土壤-蔬菜体系中ARB和ARGs复合污染的修复技术几乎没有，申请号：CN201310256154.2提供一种铝改性秸秆生物质炭在去除水体中大肠杆菌的应用，该发明将生物质炭与0.6 mol/L铝液混合加入水体中，待反应达到饱和时，滤除生物质炭高温煅烧灭活大肠杆菌；申请号：CN201710558388.0提供一种防治西瓜枯萎病的生物质炭及微生物菌剂的制备方法，该发明用生物质炭、西瓜枯萎病生防菌、凹凸棒土、过磷酸钙等混合制粒，改复合材料可有效预防西瓜枯萎病同时提高作物产量；申请号：CN201710558388.0提供一种用飞灰和生物质炭处理污染土壤及地下水的修复方法，该发明使用飞灰和生物质炭两者的混合物，对工农业污染用地的表层土、深层土和地下水进行综合土壤修复处理，并通过土著微生物群落生长情况以及有机/污染物种类与分布表征去除效果。申请号：CN201580008049.3/CN201580008049.4分别提供一种噬菌体组合药剂对铜绿假单胞菌/大肠埃希氏杆菌感染的治疗方法，该发明用特定的致病细菌为宿主菌大量筛分环境样品中噬菌体，并选取高活性噬菌体组合作为药剂制备原材料，可对铜绿假单胞菌/大肠埃希氏杆菌进行“多对一”的高效灭活；申请号：CN201510008569.7提供了一种用噬菌体疗法防治烟草青枯病的技术方法，该方法主要是用无菌注射器将配置好的噬菌体悬液注射到烟草茎杆，并在外侧使用矿物油覆盖。

这几种方法将都指出生物质炭和噬菌体都可以阻控甚至灭活致病细菌，还可同步预防作物病害，但是普遍缺少对土壤-作物（蔬菜）体系协同去除ARB和ARGs的整体修复效果。此外，现有专利更是未曾涉及使用生物质炭与噬菌体联用灭活土壤-蔬菜体系中携带抗生素抗性基因的致病细菌的介绍。

现有技术存在的主要缺陷是：现有关于生物质炭专利研究大多是作为吸附材料去除污染土壤中有机、无极、重金属等污染物，或是应用在土壤性质改良、调节土壤肥力提高作物品质与产量，但对广谱型吸附去除土壤中抗生素抗性致病细菌的研究则较少，同时对接种后土壤-蔬菜体系中微生物群落功能稳定性和多样性的相关生态风险评估相对匮乏；而现有噬菌体疗法应用大多是选择性强、特异性高的噬菌体作为初材料，缺少对土壤-蔬菜体系中多种抗生素抗性致病细菌复合污染同步灭活的生物防治技术，同时对接种后土壤-蔬菜体系中微生物群落功能稳定性和多样性的相关生态风险评估几乎没有受到重视。

缺陷产生的主要原因有：近年来，学术界逐渐认知到土壤-蔬菜体系是多种抗生素抗性细菌和抗性基因累积赋存的“源”和“汇”，并且此类新型抗性致病细菌和基因会通过食物链的传递作用严重威胁人体健康和生态环境安全；而现有修复研究大多是水体中大肠杆菌/铜绿假单胞菌的灭火修复或是对引起作物青枯病—青枯菌的研究，对土壤-蔬菜中具有高风险致病威胁的细菌（如：肺炎克雷伯氏菌、绿脓杆菌等）缺少关注。对土壤-蔬菜系统中高丰度复合抗性致病细菌和抗性基因的污染关注更少，因而，亟待开展针对性阻控和消除土壤-蔬菜体系中抗ARB和ARGs积累风险的生物靶向灭活技术研发工作。

发明内容

解决的技术问题：本发明针对上述现有技术缺陷，提供一株噬菌体及其在土壤修复中的应用，该应用向污染土壤-植物体系中添加生物质炭和特定的噬菌体菌液，阻控和靶向灭活污染土壤体系中抗性致病细菌复合污染协同去除抗性基因的修复方式，修复结束后，土壤生态环境功能多样性与稳定性得到显著恢复，是一种兼具环境友好性的生物修复技术。

技术方案：一株噬菌体φYSZPK，于2018年08月01日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M 2018516，分类命名为 Pseudomonas aeruginosa and Klebsiellaphage φYSZPK。保藏地址为湖北省武汉市武昌珞珈山，武汉大学中国典型培养物保藏中心。

上述噬菌体φYSZPK在同时裂解肺炎克雷伯氏菌和铜绿假单胞菌PAO1中的应用。

上述噬菌体φYSZPK在阻控灭活土壤-蔬菜体系中抗生素抗性致病细菌中的应用。

上述噬菌体φYSZPK在与生物质炭联合阻控灭活土壤-蔬菜体系中抗生素抗性致病细菌中的应用。

上述生物质炭是以小麦秸秆为原料，450 ℃高温烧制而成，基本理化性质为：全碳548.4 g/kg，全氮13.4 g/kg，C/N 33.6 ，灰分175.5 g/kg，全磷2.1 g/kg，全钾10.3 g/kg，pH 8.5。

上述噬菌体φYSZPK与生物质炭按质量比1：1000混合后回接污染土壤中。

上述噬菌体φYSZPK在制备同时裂解肺炎克雷伯氏菌和铜绿假单胞菌PAO1产品中的应用。

上述噬菌体φYSZPK在制备阻控灭活土壤-蔬菜体系中抗生素抗性致病细菌产品中的应用。

一种阻控灭活土壤-蔬菜体系中抗生素抗性致病细菌的产品，含有上述噬菌体φYSZPK和生物质炭。

本发明的工作原理是：1、生物质炭是一类孔隙度发达、比表面积高、化学结构稳定、表面官能团丰富且含有大量C、N、P、Ca、Mg等元素的环境友好型材料；2、生物质炭可以对土壤或水体中污染物（包括农药残留、有机溶剂、重金属离子、多环芳烃等）进行吸附阻控，降低环境风险，同时土壤中施加生物质炭可以起到保水保肥、改良土壤理化性质、提高作物产量的效果；3、噬菌体是一类特异性侵染宿主菌而存活的细菌病毒，可分为裂解性和溶源性两种；4、裂解性噬菌体会在环境迁移过程中识别宿主细菌细胞膜表面特异性结合位点并进行配对吸附，随后噬菌体尾鞘收缩，核酸通过空心的尾部将自身DNA注入宿主细菌体内，执行侵入过程，接着噬菌体DNA将利用宿主体内的核酸碱基对和能量物质，快速完成自身核酸复制和蛋白质合成，进而在细菌体内装配和增殖大量子代噬菌体，并释放细胞壁溶壁酶，致使宿主细菌破裂死亡，破坏细菌内部结构，最终完成裂解释放的过程；5、噬菌体疗法所选用的噬菌体是根据其原位污染土壤环境条件（温度、pH、离子浓度等 ）模拟选取高效价、裂解周期短、抗逆能力强裂解性噬菌体作为噬菌体疗法的优选菌株；在环境中会优先“捕食”其特异性较高的致病细菌，当此类致病细菌下降到一定水平后会改向攻击特异性较弱的宿主菌，在一定水平上维持其存活状态，同时可以预防致病细菌的二次污染；6、在土壤环境中每个细菌周围存在十几或几十个噬菌体，部分噬菌体会随植物根部渗透作用及叶表蒸腾作用传递到蔬菜体内，同步追踪灭活蔬菜中抗性致病细菌，阻控其传播扩散间接阻断其通过食物链传递作用影响人体健康；7、选用的噬菌体“来源于土壤回归土壤”不进行任何改造，环境友好；8、对噬菌体疗法应用后的生态风险进行评估，确保其微生物生态功能多样性和稳定性。

有益效果：本发明针对生物质炭与噬菌体疗法联用阻控灭活土壤-蔬菜体系中复合高丰度抗性致病细菌的方法，提供了一种快速修复技术。其具有的主要优点是：1、生物质炭可以广谱性阻控污染土壤中复合抗性致病细菌和抗性基因；2、施加生物质炭有利于土壤保水保肥，改善作物品质，提高作物产量；3、噬菌体可以靶向灭活污染土壤中抗性致病细菌并同步消减其相关抗性基因丰度；4、生物质炭与噬菌体成本制备低廉，便于储存、方便运输、使用操作简便，同时可以做到广谱性阻控、精准靶向灭活、可防止回复后二次污染、易于推广；4、生物质炭与噬菌体联用对土壤微生物生态功能多样性和稳定性有积极促进作用，环境友好。该方法对于我国大批畜禽养殖场周边复合高浓度抗生素抗性致病细菌污染场地土壤的修复工作具有广泛的运用前景。

附图说明

图1为生物质炭扫描电镜图片；

图2为噬菌体φYSZPK的透射电镜图；

图3为噬菌体φYSZPK的噬菌斑形态平板图片。

图4为使用本发明技术方案，在污染土壤上种植胡萝卜时，对江苏省南京市横梁奶牛养殖场粪便堆积地污染土壤-蔬菜体系肺炎克雷伯氏菌和铜绿假单胞菌阻控灭活效果的验证图；

图5为使用本发明技术方案，在污染土壤上种植朝天椒时，对江苏省南京市横梁奶牛养殖场粪便堆积地污染土壤-蔬菜体系肺炎克雷伯氏菌和铜绿假单胞菌阻控灭活效果的验证图；

图6为使用本发明技术方案，在污染土壤上种植生菜时，对江苏省南京市横梁奶牛养殖场粪便堆积地污染土壤-蔬菜体系肺炎克雷伯氏菌和铜绿假单胞菌阻控灭活效果的验证图。

具体实施方式

以下具体实施方式不以任何形式限制本发明的技术方案，凡是采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案均落在本发明的保护范围。

上述生物质炭B是指采用小麦秸秆为原料，450℃高温烧制，pH呈碱性。

上述噬菌体φYSZPK其保藏号为：CCTCC M 2018516，电镜图片可见到椭圆形头部及可收缩的尾鞘，头长径约110 nm，横径约80 nm，尾长约120 nm，培养皿上的噬菌斑中间透明、四周无晕环、直径约2～3 mm。

上述抗性基因ampC是指铜绿假单胞菌PAO1细胞内的质粒上携带氯霉素的抗性基因。

上述抗性基因tetW是指肺炎克雷伯氏菌细胞内的质粒上携带四环素类抗生素的抗性基因。

上述盆栽用土是在采集的原土壤中分别加入相同丰度的致病细菌铜绿假单胞菌PAO1、肺炎克雷伯氏菌。

实施例1：

供试盆栽用土采自江苏省南京市横梁奶牛场粪便堆积池周围污染土壤。种土壤基本理化性质：沙粒23.8 %，壤粒45.4 %，粘粒31.8 %，pH 7.7，全氮1.7 g·kg^-1，水溶性氮1.7g·kg^-1，全磷1.3 g·kg^-1，全钾17.5 g·kg^-1，CEC 19.4 cmol·kg^-1。

取新鲜土壤样品5 g，加入50 mL无菌水中，28℃，150 rpm振荡培养5 h，10 000rpm 离心5 min，上清液经0.22 μm滤膜除菌，取9 mL滤液与1 mL生长到对数期的铜绿假单胞菌PAO1悬液加入40 mL LB液体培养基，加氯化钙固体至溶液终浓度1 mmol·L^-1，30℃，150 rpm摇床培养12 h，所得培养液10 000 rpm 离心5 min，再经0.22 μm滤膜除菌，即获得噬菌体原液；采用双层平板法筛选噬菌体并提纯，取上述滤液100 μL与100 μL的肺炎克雷伯氏菌悬液混匀，室温静置15 min，加入3 mL的 0.7% LB琼脂培养基，混匀后平铺倒入LB固体平板上，30 ℃培养10～12 h，观察噬菌斑，待出现噬菌斑，挑取单个边缘清晰透明的噬菌斑到含有宿主菌的LB液体中纯化，4℃冷藏保存。取600 μL保存的噬菌体原液，分别与200mL PAO1和200 μL 肺炎克雷伯氏菌混合菌悬液，共同加入99 mL LB液体培养基中，再加入氯化钙固体调至终浓度为1 mmol·L^-1，37℃，150 rpm振荡培养96 h，每隔8 h取样，将离心过滤获得的噬菌体与PAO1倒双层平板验证，观察噬菌斑，若出现噬菌斑则证明定向进化成功，获得多价噬菌体φYSZPK，挑取单个清晰透明的噬菌斑富集，与50%甘油1:1体积混合，-80℃低温保存，待用。

生物质炭制备原材料选用小麦秸秆，称取小麦秸秆10 kg放入粉碎机初步粉碎，将粉碎的秸秆过筛，称量过筛100目后的小麦秸秆2 kg置于陶瓷柑祸中，在马弗炉中于450℃，高温炭化8h后，取出，降温，干燥处储藏，待用。测定其理化性质为：测定其基本理化性质：全碳548.4 g/kg，全氮13.4 g/kg，C/N 33.6 ，灰分175.5 g/kg，全磷2.1 g/kg，全钾10.3 g/kg，pH 8.5。

实施例2：

供试盆栽用土采自江苏省南京市横梁奶牛场粪便堆积池周围污染土壤。种植蔬菜为胡萝卜汉城六寸（Daucus L.），北京中农天腾蔬菜种子公司。土壤基本理化性质：沙粒23.8 %，壤粒45.4 %，粘粒31.8 %，pH 7.7，全氮1.7 g·kg^-1，水溶性氮1.7 g·kg^-1，全磷1.3 g·kg^-1，全钾17.5 g·kg^-1，CEC 19.4 cmol·kg^-1。

实验共设置四组处理：①对照组（CK）：每盆种植3棵胡萝卜（在种子上覆土0.5~1cm，室温20±2℃）；②生物质炭处理（B）：在对照组基础上施加生物质炭（1 g/kg）；③噬菌体φYSZPK处理（P）：在对照组基础上接种100 mL浓度为10⁶ pfu·mL^-1的噬菌体φYSZPK；④生物质炭与噬菌体φYSZPK联用处理（BP）：在对照组基础上施加生物质炭（1 g/kg）并接种100mL浓度为10⁶ pfu mL^-1的噬菌体φYSZPK。在胡萝卜生长第70天后对土壤和胡萝卜进行现场采样，测定CK、B、P、BP四组处理下污染土壤中铜绿假单胞菌PAO1的数量分别为：5.1×10⁷ cfu·g^-1、1.5×10⁵ cfu·g^-1、8.3×10⁵ cfu·g^-1、1.2×10³ cfu·g^-1；氯霉素抗性基因ampC的丰度分别为：1.4×10⁹ copies·g^-1、2.5×10⁶ copies·g^-1、1.3×10⁷ copies·g^-1、7.8×10⁵ copies·g^-1。B、P、BP三组处理下污染土壤中铜绿假单胞菌PAO1数量较对照组分别下降了2.3、1.9、4.3个数量级，抗性基因ampC丰度分别下降了：2.8、2.1、3.8个数量级。测定胡萝卜根块中相关肺炎克雷伯氏菌的数量在CK、B、P、BP四组处理中分别为：6.2×10⁴ cfu·g^-1、9.2×10² cfu·g^-1、3.3×10² cfu·g^-1、4.1×10¹ cfu·g^-1，抗性基因ampC丰度分别下降到：1.6×10⁶ copies·g^-1、1.4×10⁴ copies·g^-1、3.2×10³ copies·g^-1、8.4×10² copies·g^-1；胡萝卜叶片内B、P、BP三组处理中K12丰度较对照组分别下降了1.7、2.3、3.2个数量级，抗性基因ampC丰度分别下降了：2.1、2.9、3.4个数量级。其中生物质炭与噬菌体联用对抗性致病细菌和抗性基因的阻控灭活效果显著高于单独施加生物质炭或接种噬菌体φYSZPK（p < 0.05）。

分析发现CK、B、P、BP四组处理下土壤环境微生物生态多样性指标，AWCD指数分别为0.61±0.1、0.64±0.2、0.58±0.2、0.68±0.2，施加生物质炭土壤微生物多样性较对照相比出现了一定程度的上升，但接种噬菌体φYSZPK处理后土壤微生物多样性较对照相比出现一定程后度的下降，然而生物质炭与噬菌体φYSZPK联用后修复后对土壤微生物功能多样性和稳定性促进效果最为显著（p＜0.05），说明该修复技术对修复抗性细菌的扩散具有显著效果，同时也有助于维护和改善修复后土壤微生物生态功能多样性与稳定性。

实施例3：

供试盆栽用土采自江苏省南京市横梁奶牛场粪便堆积池周围污染土壤。种植蔬菜为红品一号朝天椒（Capsicum frutescens var），千疏百花种业。土壤基本理化性质：沙粒23.8 %，壤粒45.4 %，粘粒31.8 %，pH 7.7，全氮1.7 g·kg^-1，水溶性氮1.7 g·kg^-1，全磷1.3 g·kg^-1，全钾17.5 g·kg^-1，CEC 19.4 cmol·kg^-1。

实验共设置四组处理：实验共设置四组处理：①对照组（CK）：每盆种植3棵朝天椒（在种子上覆土0.5~1 cm，室温25±2℃）；②生物质炭处理（B）：在对照组基础上施加生物质炭（1 g/kg）；③噬菌体φYSZPK处理（P）：在对照组基础上接种100 mL浓度为10⁶ pfu·mL^-1的噬菌体φYSZPK；④生物质炭与噬菌体φYSZPK联用处理（BP）：在对照组基础上施加生物质炭（1 g/kg）并接种100mL浓度为10⁶ pfu·mL^-1的噬菌体φYSZPK。在朝天椒生长第70天后对土壤和朝天椒进行现场采样，测定CK、B、P、BP四组处理下污染土壤中铜绿假单胞菌PAO1的污染浓度为：5.2×0⁷ cfu·g^-1、3.7×10⁴cfu·g^-1、1.8×10⁵ cfu·g^-1、2.3×10³ cfu·g^-1；氯霉素抗性基因ampC丰度分别为：8.3×10⁸ copies·g^-1、4.8×10⁵ copies·g^-1、3.5×10⁶ copies·g^-1、4.5×10⁴ copies·g^-1。B、P、BP三组处理中较对照组污染土壤中肺炎克雷伯氏菌数量分别下降了3.1、2.2、4.3个数量级，抗性基因tetW丰度分别下降了：3.3、2.2、4.5个数量级。测定朝天椒果实中PAO1在CK、B、P、BP 四组处理中的数量分别下降到：6.3×10⁴ cfu g^-1、4.8×10³ cfu·g^-1、2.2×10² cfu·g^-1、4.2×10¹ cfu·g^-1，抗性基因ampC丰度分别下降到：1.8×10⁶ copies·g^-1、8.3×10⁴ copies·g^-1、4.1×10³ copies·g^-1、8.2×10² copies·g^-1。B、P、BP三组处理的果实内肺炎克雷伯氏菌数量较对照组分别下降了1.1、2.4、3.1个数量级，抗性基因tetW丰度分别下降了：1.4、2.8、3.6个数量级。其中生物质炭与噬菌体φYSZPK联用对抗性致病细菌和抗性基因的阻控灭活效果显著高于单独施加生物质炭或接种噬菌体φYSZPK。

分析发现CK、B、P、BP四组处理下土壤环境微生物生态多样性指标，AWCD指数分别为：0.51±0.1、0.55±0.2、0.47±0.2、0.57±0.1，施加生物质炭土壤微生物多样性较对照相比出现了一定程度的上升，但接种噬菌体φYSZPK处理后土壤微生物多样性较对照相比出现一定程后度的下降，然而生物质炭与噬菌体φYSZPK联用后修复后对土壤微生物功能多样性和稳定性促进效果最为显著（p＜0.05），说明该修复技术对修复抗性细菌的扩散具有显著效果，同时也有助于维护和改善修复后土壤微生物生态功能多样性与稳定性。

实施例4：

供试盆栽用土采自江苏省南京市横梁奶牛场粪便堆积池周围污染土壤。种植蔬菜为意大利全年耐抽苔生菜（Lactuca sativa L），河北金发种业有限公司。土壤基本理化性质：沙粒23.8 %，壤粒45.4 %，粘粒31.8 %，pH 7.7，全氮1.7 g·kg^-1，水溶性氮1.7 g·kg^-1，全磷1.3 g·kg^-1，全钾17.5 g·kg^-1，CEC 19.4 cmol·kg^-1。

实验共设置四组处理：①对照组（CK）：每盆种植3棵生菜（在种子上覆土0.5~1 cm，室温18±2℃）；②生物质炭处理（B）：在对照组基础上施加生物质炭（1 g/kg）；③噬菌体φYSZPK处理（P）：在对照组基础上接种100 mL浓度为10⁶ pfu·mL^-1的噬菌体φYSZPK；④生物质炭与噬菌体φYSZPK联用处理（BP）：在对照组基础上施加生物质炭（1 g/kg）并接种100mL浓度为10⁶ pfu·mL^-1的噬菌体φYSZPK。在生菜生长第60天后对土壤和生菜进行现场采样，测定CK、B、P、BP四组处理下污染土壤中铜绿假单胞菌PAO1的污染浓度分别为：2.8×10⁷ cfu·g^-1、1.3×10⁵ cfu·g^-1、5.6×10⁵ cfu·g^-1、2.4×10⁴cfu·g^-1；氯霉素抗性基因ampC丰度分别为：1.4×10⁸ copies·g^-1、2.5×10⁵ copies·g^-1、5.3×10⁵ copies·g^-1、2.8×10⁴ copies·g^-1，B、P、BP三组处理下污染土壤中肺炎克雷伯氏菌总量与对照组相比分别下降了2.2、1.6、3.1个数量级，抗性基因tetW丰度与对照组相比分别下降了：2.8、2.6、3.8个数量级。测定CK、B、P、BP四组处理下生菜叶片中PAO1的数量分别为：8.2×10³ cfu·g^-1、3.8×10² cfu·g^-1、2.3×10² cfu·g^-1、3.2×10¹ cfu·g^-1，抗性基因ampC丰度分别为：1.6×10⁴ copies·g^-1、8.9×10² copies·g^-1、1.2×10² copies·g^-1、1.4×10¹ copies·g^-1；B、P、BP三组处理下生菜叶片内肺炎克雷伯氏菌数量较对照组相比分别下降了1.4、1.9、2.5个数量级，抗性基因tetW丰度分别下降了：1.3、2.1、3.1个数量级。其中生物质炭与噬菌体φYSZPK联用对抗性致病细菌和抗性基因的阻控灭活效果显著高于单独施加生物质炭或接种噬菌体φYSZPK。

分析发现CK、B、P、BP四组处理下土壤环境微生物生态多样性指标，AWCD指数分别为0.64±0.1、0.70±0.2、0.61±0.1、0.75±0.2，施加生物质炭后土壤微生物群落多样性较对照相比出现了一定程度的上升，但接种噬菌体φYSZPK处理后土壤微生物多样性较对照相比出现一定程度的下降，然而生物质炭与噬菌体φYSZPK联用后修复后对土壤微生物功能多样性和稳定性促进效果最为显著（p＜0.05），说明该修复技术对修复抗性细菌的扩散具有显著效果，同时也有助于维护和改善修复后土壤微生物生态功能多样性与稳定性。

说明生物质炭与噬菌体疗法联用同步阻控灭活土壤-蔬菜体系中多种抗性致病细菌和抗性基因的技术具有广谱性高、生态风险低、环境友好的优点，是一种具有良好应用前景的复合致病细菌污染土壤修复技术。

Claims (8)

1.一株噬菌体φYSZPK，于2018年08月01日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M 2018516，分类命名为 Pseudomonas aeruginosa and Klebsiella phage φYSZPK。

2.权利要求1所述噬菌体φYSZPK在土壤-蔬菜体系中同时裂解肺炎克雷伯氏菌和铜绿假单胞菌PAO1中的应用。

3.权利要求1所述噬菌体φYSZPK在与生物质炭联合阻控灭活土壤-蔬菜体系中肺炎克雷伯氏菌和铜绿假单胞菌PAO1中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述生物质炭是以小麦秸秆为原料，450 ℃高温烧制而成，基本理化性质为：全碳548.4 g/kg，全氮13.4 g/kg，C/N 33.6 ，灰分175.5g/kg，全磷2.1 g/kg，全钾10.3 g/kg，pH 8.5。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述噬菌体φYSZPK与生物质炭按质量比1：1000混合后回接污染土壤中。

6.权利要求1所述噬菌体φYSZPK在制备同时裂解肺炎克雷伯氏菌和铜绿假单胞菌PAO1产品中的应用。

7.权利要求1所述噬菌体φYSZPK在制备阻控灭活土壤-蔬菜体系中肺炎克雷伯氏菌和铜绿假单胞菌PAO1产品中的应用。

8.一种阻控灭活土壤-蔬菜体系中抗生素抗性致病细菌的产品，其特征在于含有权利要求1所述噬菌体φYSZPK和生物质炭。