CN107138521A - 一种镉污染底泥的微生物修复方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种镉污染底泥的微生物修复方法，属于底泥微生物修复领域。所述方法包括硫酸盐还原菌的富集、驯化与扩大培养；硫酸盐还原菌修复Cd污染底泥。该方法通过将分离鉴定后的硫酸盐还原菌复合菌添加至Cd污染底泥中，能降低Cd的可交换态和碳酸盐结合态含量，提高铁锰氧化物、有机物结合态和残渣态含量，使Cd向稳定态转变，并使修复后底泥间隙水中Cd含量明显下降，从而降低Cd的迁移性、生物有效性和毒性，具有技术简便、成本低、修复效果好和原位应用潜力等特点。

Description

一种镉污染底泥的微生物修复方法
技术领域
本发明属于底泥微生物修复领域，具体涉及一种镉污染底泥的微生物修复方法。
背景技术
重金属因具有难降解性、生物累积性和食物链放大等生态环境效应而备受关注。水体底泥是各种污染物进入水环境后的最终归宿，99％以上的重金属进入水环境后会以各种形式积聚在底泥中，使底泥重金属含量往往高出上覆水几个数量级，从而造成底泥污染。世界范围内，水体底泥普遍存在重金属污染，尤其是毒性较大的镉(Cd)，例如，希腊Attica工业最发达的Keratsini港表层底泥中的Cd高达190～1763mg/kg；伦敦东港和伊丽莎白港底泥中Cd分别高达120～1630mg/kg和100～1400mg/kg；含量如此之高的Cd，已远远超过其可能效应浓度(Probable Effect Concentration，PEC)，势必对水生生物和人体健康产生毒害风险。已有研究表明，我国经济较发达的东南沿海地区，Cd生态风险最大。作为城市水环境的重要组成，底泥修复是整个水生生态系统修复的关键，针对镉污染底泥，研究出切实可行的修复技术是现在的当务之急。
底泥修复方法有很多，按底泥与上覆水是否分离可分为原位修复(如覆盖、稳定和植物修复等)和异位修复(如疏浚、清洗和电化学等)；按方法原理则又可分为物理、化学和生物修复等。对重金属而言，尽管不能像有机污染物那样可被生化降解，但其能在不溶和可溶物质间转换，形态和毒性也随之发生变化。基于此，许多修复方法试图从降低金属溶解性(固化)或增加金属溶解性(活化)两个思路对污染底泥开展修复。
固化(也称钝化或稳定化)通常利用稳定剂、微生物菌种、微生物制剂或生物刺激，通过理化作用(如吸附、氧化还原等)或生物作用(如生物吸附、生物积累、生物转化等)将重金属转化为无毒或低毒形态的修复方法，其最终目的是降低金属的迁移性、毒性和生物有效性；而活化方法则恰恰相反，它先是借助理化浸提或生物淋溶等使重金属从底泥中解吸、溶解和分离，然后再对淋洗液进行后续处理，从源头上对底泥重金属进行减量。重金属活化(如酸淋洗、生物浸矿等)虽能彻底将重金属从底泥中去除，但通常是异位修复，存在工程量大、费用高昂和环境扰动大等问题；相对而言，固化技术虽然不能将污染物从底泥中彻底根除，但其操作简便可实现底泥的原位修复，大大减少了修复的工程量以及高昂的费用，同时具有修复时间短、环境扰动小和污染释放少等优点，是一类经济有效的修复方法。
常见的底泥重金属固化方法包括理化、植物和微生物固化。其中，理化固定需要投加大量的稳定剂修复材料(如水泥、粉煤灰、膨润土、赤泥、生物炭等)，所以其修复成本与生物固化相比往往较高，该方法用于对疏浚底泥异位修复时存在底泥最终处置问题，用于原位修复时所投稳定剂还可能对水生生态系统产生一定的环境风险；植物固定主要利用植物提取、根际微生物及其生长代谢产物对重金属进行提取或固定，但植物固定目前仍存在生长周期长和生物量小等不足，此外诸多研究表明植物自身直接提取重金属的效果其实并不高(尤其是水生植物)，而间接作用(如根际圈微生物、氧化还原反应形成、根际圈可溶性金属化合物沉淀)则起到更重要的作用；而微生物固化在修复成本和环境兼容性等方面则具有一定优势，据报道，微生物固化(如生物刺激)所需费用约为理化固定的二分之一。因此，越来越多的学者关注微生物对底泥重金属的固定。
针对重金属微生物固化，硫酸盐还原菌(SRB)因能在硫酸盐异化还原过程中和金属离子形成性质稳定的金属硫化物，可实现重金属离子的沉淀、回收和再利用，而受到人们的广泛关注。SRB生物固化对修复重金属污染环境介质是非常有效的，一般多用于废水处理，尤其是矿山酸性废水的处理。SRB在废水治理的成功应用，为SRB修复重金属污染底泥提供了很好的借鉴。但从目前研究现状看，SRB应用于底泥重金属修复的研究并不多见，其用于重金属修复时还存在对个别金属稳定效率低和复合污染修复效果欠佳的不足；前人已开展的零星研究多集中于水和土壤，而对重金属污染底泥的修复研究尚不多见，且应用较少，其中很重要的一个原因就是SRB生长代谢所需的环境条件(如pH、ORP、硫酸盐、温度、稳定电子供体等)在自然状况下很难兼备，导致SRB室内修复效果显著，但野外测试效果欠佳。因此，亟待遴选一种环境适应能力强、修复效率高、经济廉价的Cd污染底泥的SRB修复方法。
发明内容
本发明提供一种Cd污染底泥的微生物修复方法。该方法通过将分离鉴定后的硫酸盐还原菌复合菌添加至Cd污染底泥中，能降低Cd的可交换态和碳酸盐结合态含量，提高铁锰氧化物、有机物结合态和残渣态含量，使Cd向稳定态转变，并使修复后底泥间隙水中Cd含量明显下降，从而降低Cd的迁移性、生物有效性和毒性，具有技术简便、成本低、修复效果好和原位应用潜力等特点。
本发明提出的一种Cd污染底泥的微生物修复方法，主要包括以下两个步骤：
步骤一：硫酸盐还原菌的富集、驯化与扩大培养；
(1)培养基：KH2PO4 0.5g/L，NH4Cl 1g/L，CaSO4 1g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，乳酸3.5g/L，酵母膏1g/L，抗坏血酸0.1g/L，巯基醋酸0.1g/L，FeSO4·7H2O 0.5g/L，超纯水1L，调节pH在7.0～7.5之间。
(2)菌种富集：挑取2g水库天然底泥样品，放入50mL具塞玻璃管中，加入9mL的0.75％的生理盐水，得到10-1的稀释液。摇匀后，吸取2mL的底泥稀释液加入到灭菌后的含有300mL培养基的锥形瓶中。用封口膜密封锥形瓶，将其放入30℃恒温培养箱中培养。2～3天后，会发现锥形瓶中的液体颜色变为黑色，摇晃后会发现黑色沉淀，表明培养基中有SRB存在。即已成功富集到SRB。
(3)菌种驯化：吸取15mL富集得到的SRB菌液加入到另一个300mL的培养基中，进行下一次纯化培养，如此重复操作三次，使得到的SRB更加纯正。
(4)菌种扩大培养：按上述培养基配方称取药品后，使用超纯水定容到1L，轻摇，待药品充分溶解后，转移到300mL锥形瓶中，用铝箔纸封口，放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌后备用，灭菌条件为121℃，20min。其中，巯基醋酸和抗坏血酸需要单独配制成10％的溶液，也需进行高压蒸汽灭菌。根据实验用量，对菌种进行适量扩大培养。
步骤二：硫酸盐还原菌修复Cd污染底泥。
在室温条件下(20～30℃)，先将湿重为800g的底泥(含水率约50％)装入2000mL烧杯中；加入超纯水定容至1800mL；然后加入步骤一中扩大培养的菌液300mL；匀速搅拌使培养基与底泥充分混合；烧杯经保鲜膜密封后，放置在30℃的生化培养箱中，进行为期166天的修复。
SRB对Cd污染底泥的修复效果，主要根据底泥间隙水Cd含量和底泥中Cd化学形态变化可进行考量。Cd化学形态分析采用改进Tessier连续提取法。
本发明具体有的优点在于：
(1)本发明提供一种Cd污染底泥的微生物修复方法，可使Cd向稳定态转变，降低底泥间隙水中Cd含量，降低Cd的迁移性、生物有效性和毒性；
(2)本发明提供一种Cd污染底泥的微生物修复方法，具有技术简便、成本低和修复效果好等显著优点，且工程量小、环境扰动小和能降低二次污染，对重金属污染底泥的原位修复有广阔的应用潜力。
附图说明
图1：本发明中所用SRB复合菌液在(a)门、(b)目、(c)科和(d)属水平上的菌群组成。
图2：本发明中用于Cd底泥修复的SRB扩大培养菌液，Control是未加Cd的原始底泥；A、B、C、D、E、F和G实验组中Cd加标量分别为0、25、50、100、200、400和600mg/kg)。
图3：本发明中Cd污染底泥经SRB修复前后间隙水中Cd含量。
图4：本发明中修复过程中底泥中Cd地球化学形态含量变化；A、B、C、D、E、F和G实验组中Cd加标量分别为0、25、50、100、200、400和600mg/kg；F1、F2、F3、F4和F5分别代表Cd的可交换态、碳酸盐结合态、铁锰氧化物结合态、有机物结合态和残渣态。
图5：本发明中经SRB修复后底泥(实验组G，含Cd 600mg/kg)X射线光电子能谱分析；(a)和(b)分别为对照组166天后Cd和S的XPS分析结果；(c)和(d)分别为修复组166天后Cd和S的XPS分析结果。
具体实施方式
下面将结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
本发明提供Cd污染底泥的微生物修复方法，具体包括以下两个步骤：
步骤一：硫酸盐还原菌的富集、驯化与扩大培养。
(1)培养基：KH2PO4 0.5g/L，NH4Cl 1g/L，CaSO4 1g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，乳酸3.5g/L，酵母膏1g/L，抗坏血酸0.1g/L，巯基醋酸0.1g/L，FeSO4·7H2O 0.5g/L，超纯水1L，调节pH值在7.0～7.5之间。
(2)菌种富集：挑取2g水库天然底泥样品，放入50mL具塞玻璃管中，加入9mL的0.75％(质量百分比)的生理盐水，得到10-1的底泥稀释液。摇匀后，吸取2mL的底泥稀释液加入到灭菌后的含有300mL培养基的锥形瓶中。用封口膜密封锥形瓶，将其放入30℃恒温培养箱中培养。2～3天后，会发现锥形瓶中的液体颜色变为黑色，摇晃后会发现黑色沉淀，表明培养基中有SRB存在。即已成功富集到SRB。
(3)菌种驯化：吸取15mL富集得到的SRB菌液加入到另一个300mL的培养基中，进行下一次纯化培养，如此重复操作三次，使得到的SRB更加纯正。根据16S rRNA鉴定结果，该SRB菌群是一种复合菌，其在门、目、科和属水平上的菌群组成见图1所示，图中，(a)中：Bacteroidetes为拟杆菌门、Firmicutes为厚壁菌门、Proteobacteria为变形菌门；(b)中：Bacteroidales为拟杆菌目、Clostridiales为梭菌目、Desulfovibrionales为脱硫弧菌目、Bacillales为芽孢杆菌目、Other为比例小于1％菌群之和；(c)中：Porphyromonadaceae为紫单胞菌科、Lachnospiraceae为毛螺菌科、Clostridiaceae_1为梭菌科_1、Desulfovibrionaceae为脱疏弧菌科、Bacillaceae为芽胞杆菌科、Ruminococcaceae为疣微菌科、Family_XI为梭菌目的XI科、Bacteroidaceae为拟杆菌科、Christensenellaceae为克里斯滕森菌科；(d)中：Macellibacteroides为铁还原菌属、Lachnoclostridium为梭菌属、Desulfovibrio为脱硫弧菌属、Clostridium_sensu_stricto_12为梭菌属stricto_12、Bacillus为芽孢杆菌属、Clostridium_sensu_stricto_1为梭菌属stricto_1、Sedimentibacter为沉淀杆属、Bacteroides为拟杆菌属、Anaerotruncus为厌氧球菌属、Ruminococcaceae_UCG-009为疣微菌科UCG-009属)。复合菌中，脱硫弧菌是典型的SRB，其在目(Desulfovibrionales脱硫弧菌目)、科(Desulfovibrionaceae脱疏弧菌科)和属(Desulfovibrio脱硫弧菌属)水平上的细菌丰度为8.28％。
(4)菌种扩大培养：按上述培养基配方称取药品后，使用超纯水定容到1L，轻摇，待药品充分溶解后，转移到300mL锥形瓶中，用铝箔纸封口，放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌后备用，灭菌条件为121℃，20min。其中，巯基醋酸和抗坏血酸需要单独配制成质量百分比含量为10％的溶液，也需进行高压蒸汽灭菌。根据实验用量，对经过菌种驯化后的SRB菌种进行适量扩大培养(每300mL培养基中加入15mL驯化后的SRB菌液)。菌液经扩大培养，待出现黑色后(如图2所示)，即可用于底泥修复。
步骤二：硫酸盐还原菌修复Cd污染底泥。
在室温条件下(20～30℃)，先将湿重为800g的底泥(含水率约50％)装入2000mL烧杯中；加入超纯水定容至1800mL；然后加入步骤一中扩大培养的菌液300mL；匀速搅拌使培养基与底泥充分混合；烧杯经保鲜膜密封后，放置在30℃的生化培养箱中，进行为期166天的修复。
SRB对Cd污染底泥的修复效果，主要根据底泥间隙水Cd含量和底泥中Cd化学形态变化进行考量。其中，间隙水Cd含量的测试方法为：取已去除明显上覆水的湿泥20g至50ml离心管；在4800r/min条件下离心30min后，用一次性注射器吸取上清液；然后过0.45μm微孔滤膜后，测定间隙水中Cd含量。底泥Cd化学形态分析方法为：利用改进的Tessier连续提取法分析底泥Cd化学形态，经连续提取后，Cd共分为五种形态，即可交换态(F1)、碳酸盐结合态(F2)、铁锰氧化物结合态(F3)、硫化物及有机物结合态(F4，俗称有机物结合态)和残渣态(F5)。
改进Tessier连续提取法具体操作步骤：
①可交换态：称取1.000g底泥(干重)至50mL离心管中，加入1mol/L的MgCl2(pH＝7)溶液8mL，在25±1℃下振荡提取1h后，离心(4500rpm，20min)，用5mL移液枪取4mL上清液；向提取液中加入1mL70％的浓硝酸，摇匀，之后将消解管放到消解炉上以140℃加热至完全干燥为止(约需7h)，待温度降到70℃左右时再加入2％(质量百分比浓度)的HNO3后定容到8mL，待测；用16mL超纯水洗涤残余物，离心(4500rpm，20min)，弃去上清液，重复操作洗涤三次，洗涤后的残渣经-18℃冷冻后(一般隔夜)用于下一步提取。
②碳酸盐结合态：将步骤①提取后的冷冻残渣，加入1mol/L的NaOAc溶液8mL(醋酸调pH＝5)，在25±1℃条件下振荡提取5h后，离心(4500rpm，20min)，用5mL移液枪取1mL上清液；向提取液中加入1mL70％(质量百分比浓度)的浓硝酸，摇匀，之后将消解管放到自制消解炉上以140℃加热至完全干燥为止(约需2h)，待温度降到70℃左右时再加入2％(质量百分比浓度)的HNO3后定容到8mL，待测；用16mL超纯水洗涤残余物，离心(4500rpm，20min)，弃去上清液，重复操作洗涤三次，洗涤后的残渣经-18℃冷冻后用于下一步提取。
③铁锰氧化物结合态：在步骤②提取后的冷冻残渣中，加入20mL 0.04mol/L的NH2OH·HCl的25％(质量百分比浓度)HAc溶液，在96±3℃条件下振荡提取6h(注意及时补充水)，冷却离心(4500rpm，20min)，用5mL移液枪取15mL上清液；向提取液中加入1mL70％(质量百分比浓度)的浓硝酸，摇匀，之后将消解管放到自制消解炉上以140℃加热至完全干燥为止(约需2.5h)，待温度降到70℃左右时再加入2％(质量百分比浓度)的HNO3后定容到8mL，待测；用16mL超纯水洗涤残余物，离心(4500rpm，20min)，弃去上清液，重复操作洗涤三次，洗涤后的残渣经-18℃冷冻后用于下一步提取。
④有机物结合态：在步骤③提取后的冷冻残渣中，加入3mL 0.02mol/L的HNO3的溶液，再加入5mL 30％的H2O2(用稀硝酸调pH＝2)，85±2℃条件下振荡提取2h(注意及时补充水)后，加入3mL 30％(质量百分比浓度)的H2O2(pH＝2)，在85±2℃条件下再振荡提取3h，冷却至25±1℃，加入5mL 3.2mol/L的NH4OAc的20％(质量百分比浓度)HNO3溶液，并用超纯水稀释到20mL后再振荡提取30min，再次离心(4500rpm，20min)，取15mL上清液；向提取液中加入1mL70％(质量百分比浓度)的浓硝酸，摇匀，之后将消解管放到自制消解炉上以140℃加热至完全干燥为止(约需5.5h)，待温度降到70℃左右时再加入2％(质量百分比浓度)的HNO3后定容到8mL，待测；用16mL超纯水洗涤残余物，离心(4500rpm，20min)，弃去上清液，重复操作洗涤三次，洗涤后的残渣经-18℃冷冻后用于下一步提取。
⑤残渣态：将步骤④提取后的冷冻残渣转移至消解管中，依次加入65％～68％(质量百分比浓度)的HNO3 1mL和70％～72％(质量百分比浓度)HClO4 4mL，加完之后按照以下的加热程序方式进行：50℃加热3h，70℃加热0.5h，100℃加热0.5h，150℃加热3h，190℃加热至完全干燥(约需11h)；待温度降到70℃左右时再加入2％(质量百分比浓度)的HNO3后定容到8mL，离心(4500rpm，20min)，取上清液待测。①～⑤待测样种重金属Fe和Mn由ICP-OES测定，Cd等由ICP-MS测定。
实施例1：
本实施例中提供Cd污染底泥的微生物修复方法，具体包括以下两个步骤：
步骤一：硫酸盐还原菌的富集、驯化与扩大培养
(1)培养基：KH2PO4 0.5g/L，NH4Cl 1g/L，CaSO4 1g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，乳酸3.5g/L，酵母膏1g/L，抗坏血酸0.1g/L，巯基醋酸0.1g/L，FeSO4·7H2O 0.5g/L，超纯水1L，调节pH在7.0～7.5之间。
(2)菌种富集：挑取2g水库天然底泥样品，放入50mL具塞玻璃管中，加入9mL的0.75％(质量百分比浓度)的生理盐水，得到10-1的稀释液。摇匀后，吸取2mL的底泥稀释液加入到灭菌后的含有300mL培养基的锥形瓶中。用封口膜密封锥形瓶，将其放入30℃恒温培养箱中培养。2～3天后，会发现锥形瓶中的液体颜色变为黑色，摇晃后会发现黑色沉淀，表明培养基中有SRB存在。即已成功富集到SRB菌液。
(3)菌种驯化：吸取15mL富集得到的SRB菌液加入到另一个300mL的培养基中，进行下一次纯化培养，如此重复操作三次，使得到的SRB更加纯正。根据16S rRNA鉴定结果，该SRB菌群是一种复合菌，其在门、目、科和属水平上的菌群组成见图1所示。复合菌中，脱硫弧菌是典型的SRB，其在目(Desulfovibrionales脱硫弧菌目)、科(Desulfovibrionaceae脱疏弧菌科)和属(Desulfovibrio脱硫弧菌属)水平上的细菌丰度为8.28％。
(4)菌种扩大培养：按上述培养基配方称取药品后，使用超纯水定容到1L，轻摇，待药品充分溶解后，转移到300mL锥形瓶中，用铝箔纸封口，放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌后备用，灭菌条件为121℃，20min。其中，巯基醋酸和抗坏血酸需要单独配制成10％(质量百分比浓度)的水溶液，也需进行高压蒸汽灭菌。根据实验用量，对菌种进行适量扩大培养。经扩大培养后，用于底泥修复的菌液如图2所示。
步骤二：硫酸盐还原菌修复Cd污染底泥。
(1)在室温条件下(20～30℃)，分别取湿重为800g的底泥(含水率约50％)放置在标号为A、B、C、D、E、F和G七个2000mL烧杯中，加超纯水定容至1800mL。然后分别加入Cd含量为0.01g m/L的储备液(由Cd(NO3)2·4H2O配制)0、1、2、4、6、8、16和24mL。假设Cd能全部被底泥所吸附，则各实验组底泥中Cd设计浓度应分别为0、25、50、100、200、400和600mg/Kg。各加标实验组有4个平行样。
(2)向各加标实验组加入步骤一中扩大培养的菌液300mL；匀速搅拌使培养基与底泥充分混合；烧杯经保鲜膜密封后，放置在30℃的生化培养箱中，进行为期166天的修复。空白对照组中仅加入300ml灭菌后的超纯水。
(3)修复组分别在修复前、修复后第5、32、61、103和166天采集底泥样品，进行重金属形态分析；空白对照组仅在修复实验开始前和修复后166天共进行两次底泥采样；测定了原底泥样品、166d后的各修复组和空白对照组中底泥间隙水中Cd含量：取20g泥(无明显上覆水)至50mL离心管，4800r/min离心30min，用一次性注射器吸取上清液，过0.45um微孔滤膜后，冷藏待测。
(4)底泥样品经自然风干后，按改进Tessier连续提取法进行处理；待测液体样品中，Fe和Mn由ICP-OES(Optima 5300DV)测定；Cd等由ICP-MS(VGPQ2Turbo)测定。
(5)修复效果主要根据底泥间隙水Cd含量和底泥中Cd化学形态变化进行考量。
①间隙水中的重金属含量取决于底泥中重金属的总量及其(溶解)迁移性，因此间隙水重金属含量可以反映的底泥中金属的迁移性，并在很大程度上可以真实反映底泥的污染状况以及生物的实际暴露情况。在本实验研究中，加菌修复后，各实验组间隙水的Cd含量都明显低于未修复组(图3)，其中高浓度实验组(E～G)效果更显著，修复组比未修复组低11～27倍，说明加菌修复显著降低了Cd的(溶解)迁移性。
②金属各形态的相对百分含量能直观表现其地球化学形态分布。修复过程中，各实验组Cd形态质量百分含量变化如图4所示。F1由修复前的16.3％～37.3％(均值27.2％)降至修复后7.0％～24.1％(均值14.7％)；F2由28.1％～40.8％(均值34.5％)降至22.7％～36.1％(均值31.6％)；相反，F3由28.5％～53.0％(均值36.7％)增加至41.1％～66.5％(均值51.5％)；F4由1.1％～2.5％(均值1.6％)增加至1.9％～2.5％(均值2.1％)；F5由0.0％～0.11％(均值0.03％)增加至0.0％～0.12％(均值0.06％)。以上数据说明，经SRB修复后，底泥Cd非稳定态(尤其是可交换态)含量明显减少，而相对稳定态(尤其是铁锰氧化物结合态和有机物结合态)含量增加了。
为鉴定SRB修复过程中是否有CdS生成，以实验组G为例(含Cd 600mg/kg)，利用X射线光电子能谱(XPS)分析了其空白对照组和加菌修复组底泥中Cd和S的价态(图5)。分析结果表明，空白对照组和加菌修复组都有CdS生成。具体来说，空白对照组的Cd 3d光谱峰位出现在405eV(Cd 3d5/2)，411.5eV(Cd 3d3/2)，405.6eV(Cd 3d5/2)和412.3eV(Cd 3d3/2)；S2p光谱峰位出现在163.7eV(S 2p3/2)，164.9eV(S 2p1/2)和168eV(S 2p)；加菌修复组的Cd3d光谱峰位出现在405.3eV(Cd 3d5/2)，412eV(Cd 3d3/2)，405.7eV(Cd 3d5/2)和412.5eV(Cd 3d3/2)；S 2p光谱峰位出现在169.4eV(S 2p)，161.6eV(S 2p3/2)和162.8eV(S 2p1/2)。但是XPS分析结果同时还表明，加菌修复组中的CdS(28.9％)大于空白对照组(27.3％)，说明加菌修复确实能促进金属硫化物形成，更能使Cd化学形态向稳定态转变。

Claims (3)

1.一种镉污染底泥的微生物修复方法，其特征在于：包括以下两个步骤，
步骤一：硫酸盐还原菌的富集、驯化与扩大培养；
(1)培养基：KH2PO4 0.5g/L，NH4Cl 1g/L，CaSO4 1g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，乳酸3.5g/L，酵母膏1g/L，抗坏血酸0.1g/L，巯基醋酸0.1g/L，FeSO4·7H2O 0.5g/L，超纯水1L，调节pH在7.0～7.5之间；
(2)菌种富集：挑取2g水库天然底泥样品，放入50mL具塞玻璃管中，加入9mL的0.75％的生理盐水，得到10-1的稀释液；摇匀后，吸取2mL的底泥稀释液加入到灭菌后的含有300mL培养基的锥形瓶中；用封口膜密封锥形瓶，将其放入30℃恒温培养箱中培养；2～3天后，富集到SRB菌液；
(3)菌种驯化：吸取15mL富集得到的SRB菌液加入到另一个300mL的培养基中，进行下一次纯化培养，如此重复操作三次纯化培养；
(4)菌种扩大培养：按上述(1)中的培养基配方称取各组分后，使用超纯水定容到1L，轻摇，待药品充分溶解后，转移到300mL锥形瓶中，用铝箔纸封口，放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌后备用，灭菌条件为121℃，20min；其中，巯基醋酸和抗坏血酸需要单独配制成质量百分比含量为10％的溶液，进行高压蒸汽灭菌；每300mL培养基中加入15mL驯化后的SRB菌液进行扩大培养，待出现黑色后即可用于底泥修复；
步骤二：硫酸盐还原菌修复Cd污染底泥；
在室温条件下，先将湿重为800g的底泥装入2000mL烧杯中；加入超纯水定容至1800mL；然后加入步骤一中扩大培养的菌液300mL；匀速搅拌使培养基与底泥充分混合；烧杯经保鲜膜密封后，放置在30℃的生化培养箱中，进行为期166天的修复。
2.根据权利要求1所述的一种镉污染底泥的微生物修复方法，其特征在于：所述的SRB菌液为复合菌，其中，脱硫弧菌在脱硫弧菌目、脱疏弧菌科和脱硫弧菌属水平上的细菌丰度为8.28％。
3.用于底泥Cd化学形态分析的改进的Tessier连续提取法，具体操作步骤如下：
①可交换态：称取1.000g底泥至50mL离心管中，加入1mol/L的MgCl2溶液8mL，在25±1℃下振荡提取1h后，离心，用5mL移液枪取4mL上清液；向提取液中加入1mL 70％的浓硝酸，摇匀，之后将消解管放到消解炉上以140℃加热至完全干燥为止，待温度降到70℃时再加入2％的HNO3后定容到8mL，待测；用16mL超纯水洗涤残余物，离心，弃去上清液，重复操作洗涤三次，洗涤后的残渣经-18℃冷冻后用于下一步提取；
②碳酸盐结合态：将步骤①提取后的冷冻残渣，加入1mol/L的NaOAc溶液8mL，在25±1℃条件下振荡提取5h后，离心，用5mL移液枪取1mL上清液；向提取液中加入1mL70％的浓硝酸，摇匀，之后将消解管放到自制消解炉上以140℃加热至完全干燥为止，待温度降到70℃左右时再加入2％的HNO3后定容到8mL，待测；用16mL超纯水洗涤残余物，离心，弃去上清液，重复操作洗涤三次，洗涤后的残渣经-18℃冷冻后用于下一步提取；
③铁锰氧化物结合态：在步骤②提取后的冷冻残渣中，加入20mL 0.04mol/L的NH2OH·HCl的25％HAc溶液，在96±3℃条件下振荡提取6h，冷却离心，用5mL移液枪取15mL上清液；向提取液中加入1mL70％的浓硝酸，摇匀，之后将消解管放到自制消解炉上以140℃加热至完全干燥为止，待温度降到70℃左右时再加入2％的HNO3后定容到8mL，待测；用16mL超纯水洗涤残余物，离心，弃去上清液，重复操作洗涤三次，洗涤后的残渣经-18℃冷冻后用于下一步提取；
④有机物结合态：在步骤③提取后的冷冻残渣中，加入3mL 0.02mol/L的HNO3的溶液，再加入5mL 30％的H2O2，85±2℃条件下振荡提取2h后，加入3mL 30％的H2O2，在85±2℃条件下再振荡提取3h，冷却至25±1℃，加入5mL 3.2mol/L的NH4OAc的20％HNO3溶液，并用超纯水稀释到20mL后再振荡提取30min，再次离心，取15mL上清液；向提取液中加入1mL70％的浓硝酸，摇匀，之后将消解管放到自制消解炉上以140℃加热至完全干燥为止，待温度降到70℃左右时再加入2％的HNO3后定容到8mL，待测；用16mL超纯水洗涤残余物，离心，弃去上清液，重复操作洗涤三次，洗涤后的残渣经-18℃冷冻后用于下一步提取；
⑤残渣态：将步骤④提取后的冷冻残渣转移至消解管中，依次加入65％～68％的HNO31mL和70％～72％HClO4 4mL，加完之后按照以下的加热程序方式进行：50℃加热3h，70℃加热0.5h，100℃加热0.5h，150℃加热3h，190℃加热至完全干燥；待温度降到70℃左右时再加入2％的HNO3后定容到8mL，离心，取上清液待测。
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