CN111727879A - 一种用于油用牡丹繁殖的培养基及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于油用牡丹繁殖的培养基及方法。本发明首先公开了用于牡丹繁殖的培养基组，包括：增殖培养基和根原基诱导培养基；所述增殖培养基为在1/2MS培养基添加物质A得到的培养基；所述物质A包括脯氨酸、天冬酰胺、6‑BA、NAA和GA3；所述根原基诱导培养基为在1/2MS培养基添加物质B得到的培养基；所述物质B包括脯氨酸、天冬酰胺、IBA和IAA。本发明进一步公开了牡丹的繁殖方法。本发明以油用牡丹的鳞芽为外植体，通过对不同培养基类型、不同培养条件、不同取材时间以及不同生根移栽方法等进行全面试验，建立了牡丹的快繁技术，促进了牡丹的高效繁殖。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种用于油用牡丹繁殖的培养基及方法。
背景技术
牡丹(Paeonia suffruticasa)是芍药科、芍药属植物，为多年生落叶亚灌木，是中国特有的名贵观赏兼药用植物，栽培历史悠久。近年来随着牡丹籽油逐渐被发掘利用，牡丹已成为集观赏、药用和食品保健于一身的重要经济植物。油用牡丹不仅含油量高，油品质好，而且耐旱、耐贫瘠，适合荒山绿化造林、林下种植，既美化环境，又有很好的经济收入。
传统的牡丹繁殖方法有播种、嫁接、分株和扦插。种子繁殖虽然能够获得大量苗木，但因变异大而不易保持优良性状，在生产上大多采用嫁接或分株等无性繁殖方式。然而，这些方式繁殖率低，优良品种得不到快速扩繁，严重制约了牡丹产业化及商品化生产的发展。采取组织培养快速繁殖技术不仅可以在短时期内提供大量种苗，而且能够保持优良种性，使苗木更加整齐一致。
牡丹组织培养研究虽然取得了较大进展，但多数仍然停留在实验室研究阶段，一些关键性的技术问题尚未解决，如褐化、生根率低、不定根质量差、驯化移栽困难等等。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何实现牡丹的快速繁殖，即如何提高牡丹组织培养的鳞芽增殖率和/或生根率。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于牡丹繁殖的培养基组，所述培养基组包括：增殖培养基和根原基诱导培养基；
所述增殖培养基为在1/2MS培养基添加物质A得到的培养基；所述物质A包括脯氨酸、天冬酰胺、6-BA、NAA和GA3；其中，所述脯氨酸在所述增殖培养基中的含量为500mg/L，所述天冬酰胺在所述增殖培养基中的含量为150mg/L，所述6-BA在所述增殖培养基中的含量为1-2mg/L，所述NAA在所述增殖培养基中的含量为0.2-0.5mg/L，所述GA3在所述增殖培养基中的含量为0.3-0.5mg/L；如所述脯氨酸在所述增殖培养基中的含量为500mg/L，所述天冬酰胺在所述增殖培养基中的含量为150mg/L，所述6-BA在所述增殖培养基中的含量为1mg/L，所述NAA在所述增殖培养基中的含量为0.2mg/L，所述GA3在所述增殖培养基中的含量为0.3mg/L；
所述根原基诱导培养基为在1/2MS培养基添加物质B得到的培养基；所述物质B包括脯氨酸、天冬酰胺、IBA和IAA；其中，所述脯氨酸在所述根原基诱导培养基中的含量为500mg/L，所述天冬酰胺在所述根原基诱导培养基中的含量为150mg/L，所述IBA在所述根原基诱导培养基中的含量为2-4mg/L，所述IAA在所述根原基诱导培养基中的含量为0.5-1.0mg/L，如所述脯氨酸在所述根原基诱导培养基中的含量为500mg/L，所述天冬酰胺在所述根原基诱导培养基中的含量为150mg/L，所述IBA在所述根原基诱导培养基中的含量为3mg/L，所述IAA在所述根原基诱导培养基中的含量为0.5mg/L。
上述培养基组中，所述增殖培养基和根原基诱导培养基均还包括水解酪蛋白；所述水解酪蛋白在所述增殖培养基和根原基诱导培养基中的含量均为0.5g/L。
上述培养基组中，所述增殖培养基和根原基诱导培养基均还包括凝固剂；具体的，所述凝固剂为琼脂，所述琼脂在所述增殖培养基和根原基诱导培养基中的含量均为7g/L。
上述培养基组中，所述增殖培养基和根原基诱导培养基的pH值均为5.8。
上述用于牡丹繁殖的培养基组为提高牡丹组织培养的鳞芽增殖率和/或生根率的培养基组也在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了制备上述培养基组的方法。
一种制备上述培养基组的方法，包括如下步骤：
1)分别制备上述培养基组中的所述增殖培养基和根原基诱导培养基；
2)将步骤1)得到的所述增殖培养基和根原基诱导培养基独立包装，得到培养基组。
上述方法中，所述增殖培养基的制备方法包括：将所述脯氨酸、天冬酰胺、6-BA、NAA和GA3添加到1/2MS培养基得到；
所述根原基诱导培养基的制备方法包括：将所述脯氨酸、天冬酰胺、IBA和IAA添加到1/2MS培养基中得到。
上述方法中，在所述增殖培养基和所述根原基诱导培养基还需要添加水解酪蛋白和琼脂到1/2MS培养基。
本发明进一步提供了一种牡丹繁殖的方法。
一种牡丹繁殖的方法，包括以下步骤：
1)将牡丹的外植体置于上述增殖培养基中培养，得到无根芽苗；
2)将步骤1)得到的无根芽苗置于新的上述增殖培养基中培养，得到芽丛；
3)将步骤2)得到的芽丛分割成单个无根芽苗后置于上述根原基诱导培养中培养，得到芽苗；
4)将步骤3)得到的芽苗转接到生根培养基中培养，得到生根苗；
5)待步骤4)得到的生根苗长出不定根进行移栽驯化。
上述方法中，所述生根培养基为1/2WPM培养基或1/2MS培养基。
上述方法中，所述步骤1)培养的条件为在23-25℃，每天光照10小时，光照强度1000lx环境中培养4周；
所述步骤2)培养的条件为在23-25℃，每天光照10小时，光照强度1000lx环境中培养3周；
所述步骤3)培养的条件为在10-15℃环境中暗培养1周；
所述步骤4)培养的条件为在23-25℃，每天光照10小时，光照强度1000lx环境中培养4周；
所述移栽驯化是在23-25℃环境中培养4周后，再在4℃环境中培养4周。
上述方法中，所述外植体为鳞芽。
在步骤1)前对外植体进行处理，包括如下步骤：
a1)去掉鳞芽最外层散落鳞片，70％酒精消毒1-2min，0.1％升汞10min，无菌水冲洗3-5次；
a2)拨去鳞芽剩余的鳞片，得到用于接种增殖培养基的外植体。
本发明上述牡丹繁殖的方法在提高牡丹组织培养的鳞芽增殖率和/或生根率中的应用也在本发明的保护范围之内。
上述方法，或，上述应用中，所述牡丹可为油用牡丹；所述油用牡丹可为“凤丹”牡丹。
本发明以油用牡丹的鳞芽为外植体，通过对不同培养基类型、不同培养条件、不同取材时间以及不同生根移栽方法等进行全面试验，建立了牡丹快繁技术。通过增殖培养基增殖使得平均增殖率达到了4.4，最高达到4.7，通过根原基诱导培养基对根原基进行诱导后转入生根培养基使得平均生根率达到了57％，最高达到59％，达到了油用牡丹高效的快繁的目的。
附图说明
图1为“凤丹”牡丹鳞芽增殖实例照片。
图2为“凤丹”牡丹芽苗不定根实例照片。
图3为“凤丹”牡丹增殖苗移栽实例照片。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明中“凤丹”牡丹在北京植物园试验地有种植，河南及山东等地均有很多种植。
本发明下述实施例中用到的培养基及其制备方法如下：
1、1/2MS培养基：表1中MS培养基的各溶质减半。
2、1/2WPM培养基：表1中WPM培养基的各溶质减半。
表1 Ms培养基和WPM培养基的溶质
注：“-----”表示不含有该物质。
3、增殖培养基(ZZM)：
将水解酪蛋白、脯氨酸、天冬酰胺、6-BA、NAA、GA3和琼脂添加到1/2MS培养基中，得到增殖培养基；其中，水解酪蛋白在增殖培养基中的含量为0.5g/L，脯氨酸在增殖培养基中的含量为500mg/L，天冬酰胺在增殖培养基中的含量为150mg/L，6-BA在增殖培养基中的含量为1mg/L，NAA在增殖培养基中的含量为0.2mg/L，GA3在增殖培养基中的含量为0.3mg/L，琼脂在增殖培养基中的含量为7g/L，调pH为5.8。
4、根原基诱导培养基(RIM)：
将水解酪蛋白、脯氨酸、天冬酰胺、IBA、IAA和琼脂添加到1/2MS培养基中，得到根原基诱导培养基；其中，水解酪蛋白在根原基诱导培养基中的含量为0.5g/L，脯氨酸在根原基诱导培养基中的含量为500mg/L，天冬酰胺在根原基诱导培养基中的含量为150mg/L，IBA在根原基诱导培养基中的含量为3mg/L，IAA在根原基诱导培养基中的含量为0.5mg/L，琼脂在根原基诱导培养基中的含量为7g/L，调pH为5.8。
实施例1油用牡丹繁殖方法
1、外植体的获得：
选取秋季饱满无病虫害“凤丹”牡丹鳞芽，去掉最外层散落鳞片，70％酒精消毒1-2min，0.1％升汞10min，无菌水冲洗5次。
2、增殖培养：
在超净台用手术刀和镊子拨去鳞芽的鳞片，得到花芽，将花芽置于增殖培养基(ZZM)中，在23-25℃，每天光照10小时、黑暗14小时，光照强度1000lx的环境中培养4周，得到无根芽苗。
3、继代培养：
将培养4周左右的无根芽苗去掉花蕾，转接到新的增殖培养基(ZZM)，在23-25℃，每天光照10小时、黑暗14小时，光照强度1000lx的环境中继续培养3周，得到芽丛，观察增殖情况(图1)，统计增殖系数，结果如表2，平均增殖率为4.4％，最高达到4.7％。
表2鳞芽增殖率统计
4、根原基诱导培养：
将芽丛用手术刀分割成单个无根芽苗，转接到根原基诱导培养(RIM)，在10-15℃环境中暗培养一周，得到芽苗。
5、生根培养：将芽苗转接到1/2WPM培养基，在23-25℃，每天光照10小时、黑暗14小时，光照强度1000lx的环境中培养，培养4周后，得到生根苗，观察其生根情况(图2)，统计生根率，结果如表3，平均生根率为57％，最高达到59％。
表3增殖芽生根率统计
| 试验批次 | 生根芽数(个) | 芽苗总数(个) | 生根率(％) |
| 第一批 | 28 | 51 | 28/51＝54.9 |
| 第二批 | 36 | 61 | 36/61＝59.0 |
| 平均增殖率 | 57.0 |
6、移栽驯化：
将生根苗转移到装有灭菌营养土(花土与蛭石等比例混合)的育苗盘(图3)，盖透明塑料盖，在23-25℃，每天光照10小时、黑暗14小时，光照强度1000lx的环境中培养4周，之后转移到4℃低温环境下培养4周，最后放温室培养。
对比例1油用牡丹繁殖方法
本对比例所用到的增殖培养基和制备方法如下：将6-BA、NAA、GA3和琼脂添加到1/2MS培养基中，得到增殖培养基；其中，6-BA在增殖培养基中的含量为1mg/L，NAA在增殖培养基中的含量为0.2mg/L，GA3在增殖培养基中的含量为0.3mg/L，琼脂在增殖培养基中的含量为7g/L，调pH为5.8。
1、外植体的获得：
选取秋季饱满无病虫害“凤丹”牡丹鳞芽，去掉最外层散落鳞片，70％酒精消毒1-2min，0.1％升汞10min，无菌水冲洗5次。
2、增殖培养：
在超净台用手术刀和镊子拨去鳞芽的鳞片，得到花芽，将花芽置于增殖培养基中，在23-25℃，每天光照10小时、黑暗14小时，光照强度1000lx环境中培养4周左右，得到无根芽苗。
3、继代培养：
将培养4周左右的无根芽苗去掉花蕾，转接到新的增殖培养基，在23-25℃，每天光照10小时、黑暗14小时，光照强度1000lx环境中继续培养3周左右，得到芽丛，统计增殖系数，结果显示平均增殖率为3.1％。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.一种用于牡丹繁殖的培养基组，其特征在于，所述培养基组包括：增殖培养基和根原基诱导培养基；
所述增殖培养基为在1/2MS培养基添加物质A得到的培养基；所述物质A包括脯氨酸、天冬酰胺、6-BA、NAA和GA3；其中，所述脯氨酸在所述增殖培养基中的含量为500mg/L，所述天冬酰胺在所述增殖培养基中的含量为150mg/L，所述6-BA在所述增殖培养基中的含量为1-2mg/L，所述NAA在所述增殖培养基中的含量为0.2-0.5mg/L，所述GA3在所述增殖培养基中的含量为0.3-0.5mg/L；
所述根原基诱导培养基为在1/2MS培养基添加物质B得到的培养基；所述物质B包括脯氨酸、天冬酰胺、IBA和IAA；其中，所述脯氨酸在所述根原基诱导培养基中的含量为500mg/L，所述天冬酰胺在所述根原基诱导培养基中的含量为150mg/L，所述IBA在所述根原基诱导培养基中的含量为2-4mg/L，所述IAA在所述根原基诱导培养基中的含量为0.5-1.0mg/L。
2.根据权利要求1所述的培养基组，其特征在于：所述增殖培养基和根原基诱导培养基均还包括水解酪蛋白；其中，所述水解酪蛋白在所述增殖培养基和根原基诱导培养基中的含量均为0.5g/L。
3.根据权利要求1所述的培养基组，其特征在于：所述增殖培养基和根原基诱导培养基均还包括凝固剂；具体的，所述凝固剂为琼脂，所述琼脂在所述增殖培养基和根原基诱导培养基中的含量均为7g/L。
4.权利要求1-3任一所述的培养基组在提高牡丹组织培养的鳞芽增殖率和/或生根率中的应用。
5.一种制备权利要求1-3任一所述培养基组的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)分别制备权利要求1-3任一所述培养基组中的所述增殖培养基和根原基诱导培养基；
2)将步骤1)得到的所述增殖培养基和根原基诱导培养基独立包装，得到培养基组。
6.一种牡丹繁殖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将牡丹的外植体置于权利要求1-3中任一所述的增殖培养基中培养，得到无根芽苗；
2)将步骤1)得到的无根芽苗置于权利要求1-3中任一所述的增殖培养基中培养，得到芽丛；
3)将步骤2)得到的芽丛分割成单个无根芽苗后置于权利要求1-3中任一所述根原基诱导培养中培养，得到芽苗；
4)将步骤3)得到的芽苗转接到生根培养基中培养，得到生根苗；
5)待步骤4)得到的生根苗长出不定根进行移栽驯化。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述生根培养基为1/2WPM培养基或1/2MS培养基。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：
所述步骤1)培养的条件为在23-25℃，每天光照10小时，光照强度1000lx环境中培养4周；
所述步骤2)培养的条件为在23-25℃，每天光照10小时，光照强度10001x环境中培养3周；
所述步骤3)培养的条件为在10-15℃环境中暗培养1周；
所述步骤4)培养的条件为在23-25℃，每天光照10小时，光照强度1000lx环境中培养4周；
所述移栽驯化是在23-25℃环境中培养4周后，再在4℃环境中培养4周。
9.根据权利要求6-8任一所述的方法，其特征在于：所述外植体为鳞芽。
10.权利要求6-9任一所述的方法在提高牡丹组织培养的鳞芽增殖率和/或生根率中的应用。
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