CN110024688B - 一种锦鸡儿芽增殖与植株再生的方法及其培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种锦鸡儿芽增殖与植株再生的方法，通过材料准备、茎段腋芽诱导、芽继代增殖、生根培养、植株移栽等步骤，建立了锦鸡儿芽增殖与植株再生的方法，本方法为锦鸡儿的组织培养提供了稳定高效的快繁体系，有效保证了锦鸡儿组培体系的高生根率和存活率，为锦鸡儿快繁体系的扩大发展和推广种植提供了有力的技术保障。
Description
发明领域
本发明涉及植物组织培养领域，具体为一种锦鸡儿芽增殖与植株再生的方法及其培 养基。
背景技术
锦鸡儿(Caragana sinica)又名金雀花、娘娘袜，是豆科锦鸡儿属灌木。主要分布于 我国山西、内蒙古、新疆、河北、河南、山东、陕西、甘肃、湖北、湖南、四川、吉林、辽 宁、黑龙江、江西等省、区。耐瘠薄,生于山坡,于石灰岩山地土层浅薄处也常见，常与杂 草及其他灌木混生。锦鸡儿具有食用、饲养、绿肥、薪碳、蜜源等资源价值，其根或根皮可 入药(中药名：金雀根)，富含的二苯乙烯类化合物具有多种活性，可促进成骨细胞增殖， 具有预防骨质疏松的功效。锦鸡儿植物是西部恢复生态的先锋树种，是防沙治沙发展畜牧业 的优选灌木植物，具有极高的生态价值、经济价值和药用价值。
锦鸡儿种子采集困难，其繁殖一般采取扦插、分株、压条等方法，繁殖系数低，时间周期长，生根困难，无法满足市场和科研需求。组织培养能短时间内获得大量苗木，且不受季节因素影响，可常年进行。目前，对于锦鸡儿及其同属植物组织培养方面的研究虽然已有一些，但缺少稳定高效的快繁体系，生根率及存活率较低。
发明内容
本发明的目的是提供一种克服现有技术不足，提出一种锦鸡儿芽增殖与植株再生的 方法及其培养基。
本发明的目的一是提供一种锦鸡儿芽增殖与植株再生的方法，具体包括如下步骤：
(1)材料准备：采取3～4年龄的锦鸡儿半木质化枝条为外植体，剪去叶片后消毒，将消 毒后的外植体剪成1.0～1.5cm长单节茎段备用。
(2)茎段腋芽诱导：将步骤(1)获得的茎段接种到芽诱导培养基中，置于透气瓶 中培养，培养间温度23-26℃，光照时间14h/d,光照强度约3000Lux，培养40d。芽诱导培 养基配方为：在MS培养基中加入6g.L-1琼脂和30g.L-1蔗糖,添加15uM 6-苄氨基腺嘌呤 (6-BA)和1uM萘乙酸(NAA)，pH值调整为5.8～6.0。
(3)芽继代增殖：将步骤(2)中诱导出的新生幼芽剪成0.5～1cm长的单节茎段， 接种到继代增殖培养基中，置于透气瓶中培养，培养间温度23-26℃，光照时间14h/d,光照 强度约3000Lux，培养30d。芽继代增殖培养基配方为：在MS培养基中加入6g.L-1琼脂 和30g.L-1蔗糖，添加5uM 6-BA、0.1uM NAA和2uM GA3，pH值调整为5.8～6.0。
(4)生根培养：切取步骤(3)获得的3cm以上的健壮芽至MS培养基中，30d后接 种到生根培养基中，置于透气瓶中培养，培养条件为0.15％CO2，培养温度20-25℃，光照 时间14h/d，光照强度3300Lux，RH 90％，培养30d。生根培养基配方为：在1/2MS中添 加6g.L-1琼脂和10g.L-1的蔗糖，pH值调整为5.8～6.0。
(5)将步骤(4)得到的生根的植株移栽到混合基质中，即珍珠岩：蛭石：腐质土 ＝1：1：3。
作为优选，所述锦鸡儿半木质化枝条为4-5月的新生枝条。
本发明的目的二是提供一套锦鸡儿芽增殖与植株再生的培养基，具体包括以下内容： (1)芽诱导培养基配方：在MS培养基中加入6g.L-1琼脂和30g.L-1蔗糖,添加15uM 6- BA和1uM NAA。
(2)芽继代增殖培养基配方：在MS培养基中加入6g.L-1琼脂和30g.L-1蔗糖，添 加5uM 6-BA、0.1uM NAA和2uM GA3。。
(3)生根培养基配方：增施0.15％的CO2，在1/2MS中添加6g.L-1琼脂和10g.L-1的蔗糖。。
本发明提供的技术方案可以有效实现锦鸡儿芽增殖与植株再生。4-5月的新生枝条的 茎段初生芽诱导率最高，高于90％；芽诱导培养基中的6-BA对芽的诱导有显著促进作用， 是实现锦鸡儿芽高诱导率的关键因素；；在增殖培养过程中，6-BA对继代增殖出芽率的影 响最显著，通过我们的试验发现GA3可有效增加芽长，是实现锦鸡儿茎段芽伸长的关键因 子。而我们筛选的增殖培养基可成功实现锦鸡儿的继代增殖培养；生根培养阶段增施0.15％ 的CO2可以在不添加激素的情况下有效诱导生根，且根系生长良好，幼苗健壮，生根率和存 活率高，是一种简单有效的促生根方法。
本发明提供的一种锦鸡儿芽增殖与植株再生的方法及其培养基，为锦鸡儿的组织培 养提供了稳定高效的快繁体系，有效保证了锦鸡儿组培体系的高生根率和存活率，为锦鸡儿 快繁体系的扩大发展和推广种植提供了有力的技术保障。
具体实施方式
下面结合具体实施实例对本发明进行详细说明。以下实施实例有助于此领域的技术 人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
以下实施例所选用的锦鸡儿枝条均采自3～4年龄的锦鸡儿半木质化新生枝条，以下 实施例中所使用的各种试剂材料均可通过商业途径购买获得。
实施例1材料准备与茎段腋芽诱导
采取3～4年龄的当年4～5月的锦鸡儿半木质化新生枝条为外植体，剪去叶片，肥皂水漂洗 3～5min,用流动的自来水冲洗干净。无菌条件下75％的乙醇表面消毒30s,无菌蒸馏水冲洗 1～2次后，0.1％氯化汞灭菌10min,再用无菌蒸馏水冲洗4～5次，洗去残余氯化汞。将消毒 后的外植体剪成1.0～1.5cm长单节茎段备用。
以MS为基本培养基，添加不同浓度的(5、10、15、20uM)6-BA与1uMNAA的 A1～A5培养基(表一)，置于透气瓶中培养，培养间温度23-26℃，光照时间14h/d，光照强 度约3000Lux，培养40d后，统计出芽率、芽长等相关指标。实验结果如表1所示：
表一不同浓度6-BA和NAA对锦鸡儿腋芽诱导的影响
注：A5(CK)为空白对照；*号表示差异显著，即P<0.05
不同浓度的6-BA与1uMNAA组合对茎段腋芽诱导的结果如表1所示。6-BA浓度在5～15 uM时，茎段出芽率均为90％，芽长3.49～3.88cm，增殖系数最高2.9(p<0.05)。6-BA浓 度继续增大时会抑制出芽率和芽长，增值系数降低。茎段腋芽诱导最佳初代培养基为MS 培养基中加入6g.L-1琼脂和30g.L-1蔗糖,添加15uM 6-BA和1uM NAA，腋芽生长良好。
实施例2芽继代增殖实验
采用正交试验设计L16(43)，将实施例1中得到的新生幼芽剪成0.5～1cm长的单节茎段， 接种到芽继代增殖培养基B1～B16中，置于透气瓶中培养，培养间温度23-26℃，光照时间 14h/d,光照强度约3000Lux，30d后统计芽增殖情况，探讨6-BA、NAA和GA3对再生芽继代增殖的影响，实验结果见表二。
表2锦鸡儿芽增殖继代培养出芽比极差分析
实验结果表明，16种处理实验结果如表2所示,表中的K1、K2、K3、K4分别表示为因素A、B、C在四个水平上的试验指标之和，k1、k2、k3、k4为四个水平上的平均值，Ri为极差， 是平均值最大值与最小值之间的差，以因素A的第1水平对应的K1、k1、Ri举例说明：
因素A的第1水平所对应的出芽比试验指标之和及其平均值和极差Ri分别为：
K1＝0.04+0.12+0.04+0.28＝0.48，k1＝1/4K1＝0.12，Ri＝k3-k2＝0.25
不同因素对继代增殖的出芽率影响不同，比较因素极差Ri的大小，极差越大影响最主要， 即因素A>C>B，6-BA对继代增殖出芽率的影响最显著，其次为GA3，NAA的影响最小。纵向比较三因素四水平平均值k1、k2、k3和k4的大小，表中数值显示A因素中平均值k3最 大；B因素中平均值k1、k2最大，根据实验经验，为了后续的继代，我们一般会选用较低浓 度的B因素NAA，因此，在B因素中平均值k1和k2相同的情况下，我们会选取更适宜的 第一水平k1值作为参考；C因素中平均值k4最大，选取的最优组合为A3B1C4，即A因素6- BA选取第三水平的浓度5uM，B因素NAA选取第一水平的浓度0.1uM，C因素GA3选取 第四水平的浓度2uM。因此最佳培养基是在MS培养基中加入6g.L-1琼脂和30g.L-1蔗糖， 添加5uM 6-BA、0.1uM NAA和2uMGA3，此培养基可成功实现锦鸡儿茎段继代增殖培养。
实施例3生根培养及移栽
切取实施例2所述的增殖培养基中长度为3cm以上的健壮芽至空白培养基(MS+6g.L-1琼脂 +30g.L-1蔗糖)中壮苗，30d后转入生根培养基1-7中，培养条件为下表备注所示。30d后， 统计生根率、根长、根数等数据，实验结果见表三。将生根的植株移栽到混合基质中,即珍 珠岩：蛭石：腐质土＝1：1：3，30d后统计成活率，实验结果见表三。
表3 不同培养基及培养方法对锦鸡儿生根的影响
培养条件 a: 23～26℃, 约3000 Lux, 14 h/d b: 0.15% CO2; 25℃/20℃, 14h/d, 3300 Lux; RH 90%
实验结果表明，CO2增施条件下，琼脂基质要优于开放培养的蛭石基质；添加少量蔗糖（10 g.L-1）的6#培养基，有利于生根，生根率高达80%，且根系生长良好，植株健壮，其根长、根数及成活率均最高，显著高于传统生根法中添加激素NAA的1#生根率（8%）；即最适宜生根的培养基为1/2MS中添加6 g.L-1琼脂和10 g.L-1的蔗糖。
Claims (3)
1.一种锦鸡儿芽增殖与植株再生的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
a. 采取3～4年龄的锦鸡儿半木质化枝条为外植体，消毒备用；
b. 将步骤a获得的外植体接种到芽诱导培养基中， 23-26℃，光照14 h/d， 3000 Lux，透气培养40d至长出新生幼芽；
芽诱导培养基配方为：在MS培养基中加入6 g.L-1琼脂和30 g.L-1蔗糖,添加15 uM 6-BA和1 uM NAA，pH 5.8～6.0；
c. 将步骤b中诱导出的新生幼芽剪成0.5～1 cm长的单节茎段，23-26℃，光照14 h/d，3000 Lux，透气培养40d；
芽继代增殖培养基配方为：在 MS 培养基中加入6 g.L-1琼脂和30 g.L-1蔗糖，添加5 uM6-BA、0.1 uM NAA和2 uM GA3，pH 5.8～6.0；
d. 切取步骤c获得的3cm以上的健壮芽至MS培养基中，30d后接种到生根培养基中，置于透气瓶中培养，培养条件为 0.15% CO2， 20-25℃，14 h/d， 3300 Lux， RH 90%，培养30d；
生根培养基配方为：在1/2MS中添加6g.L-1琼脂和10 g.L-1的蔗糖，pH值调整为5.8～6.0；
e. 将步骤d得到的生根的植株移栽到混合基质中，即珍珠岩：蛭石：腐质土=1：1：3。
2.根据权利要求1所述的锦鸡儿芽增殖与植株再生的方法，其特征在于所述步骤a所述的锦鸡儿半木质化枝条为4-5月的新生枝条。
3.一套用于锦鸡儿芽增殖与植株再生的培养基，其特征在于该培养基包括以下内容：
a. 芽诱导培养基配方为：在MS培养基中加入6 g.L-1琼脂和30 g.L-1蔗糖,添加15 uM6-BA和1 uM NAA，pH 5.8～6.0；
b. 芽继代增殖培养基配方为：在 MS 培养基中加入6 g.L-1琼脂和30 g.L-1蔗糖，添加5uM 6-BA、0.1 uM NAA和2 uM GA3，pH 5.8～6.0；
c. 生根培养基配方为：在1/2MS中添加6g.L-1琼脂和10 g.L-1的蔗糖，pH值调整为5.8～6.0。
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| 小叶锦鸡儿的组织培养和快速繁殖;牛西午等;《西北植物学报》;20041231;第1502-1505页 * |
| 柠条锦鸡儿组织培养技术;邵玲玲等;《农业系统科学与综合研究》;20111231;第27卷(第4期);第469-474页 * |
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