CN112662594A

CN112662594A - 一种增加大豆氮、磷吸收和产量的人工合成益生菌群与应用

Info

Publication number: CN112662594A
Application number: CN202110088854.XA
Authority: CN
Inventors: 钟永嘉; 廖红
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2021-01-22
Filing date: 2021-01-22
Publication date: 2021-04-16
Anticipated expiration: 2041-01-22
Also published as: CN112662594B

Abstract

本发明公开了一种增加大豆氮磷吸收和产量的人工合成益生菌群及其应用。该人工合成益生菌群FN‑SynCom1分离自大豆根系，包含3株培养且有显著促生功能的细菌，其中菌株RBC‑258具有IAA分泌能力，菌株RBC‑288和RBC‑289具有溶解难溶性有机磷和无机磷能力。本发明提供的大豆人工合成益生菌群FN‑SynCom1在室内和田间接种条件下能明显促进大豆对氮、磷的吸收，促进大豆生长，增加生物量。其中在田间条件下与不接种的大豆相比接种该益生重组菌群FN‑SynCom1能提高氮（37.2%‑69.6%）、磷（57.5%‑67.7%），且增加大豆的产量23.3%‑36.1%。

Description

一种增加大豆氮、磷吸收和产量的人工合成益生菌群与应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种增加大豆氮、磷吸收和产量的人工合成益生菌群与应用。

背景技术

植物根系相关微生物组对植物的健康、营养和生长十分重要。尽管微生物对宿主植物的益生功能很早就被认识到，但是目前对这些有益微生物的挖掘和利用大都集中在个别的微生物种属上。如何充分的挖掘和综合利用这些有益微生物鲜有报道。氮、磷是植物生长发育所需的重要的矿质营养，植物主要通过根系从土壤获取，利用具有固氮和解磷功能的微生物是提高植物从土壤获取氮、磷的一种行之有效的方法。并且目前在利用植物的益生菌方面主要集中在单菌的应用，这也是造成田间应用效果不稳定的原因之一。因此构建重组有益微生物菌群，综合利用的植物根系相关的有益的功能，是提高植物对土壤养分的吸收、利用和促进植物的生长克服单菌应用效果不稳定的有效途径。

发明内容

本发明目的在于提供一种增加大豆氮、磷吸收和产量的人工合成益生菌群与应用。

为实现上述目的采用以下技术方案：

一种提高大豆氮、磷吸收和产量的人工重组益生菌群FN-SynCom1，包含芽孢杆菌（Bacillus sp.）RBC-258、根瘤菌（Rhizobium sp.）RBC-288、不动杆菌（Acinetobactersp.）RBC-289，且三种菌株于2020年11月 16 日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为CCTCC NO：M2020749、CCTCC NO：M2020750、CCTCC NO：M2020751，地址为武汉大学。菌株RBC-258、RBC-288、RBC-289的质量比为1:1:1。

所述的提高大豆氮、磷吸收和产量的人工重组益生菌群FN-SynCom1在增加大豆氮、磷吸收和产量中的应用。

本发明的优点在于：

本发明所述益生菌群包含3株培养且有显著促生功能的细菌，其中菌株RBC-258具有IAA分泌能力，菌株RBC-288和RBC-289具有溶解难溶性有机磷和无机磷能力。本发明提供的大豆人工合成益生菌群FN-SynCom1在室内和田间接种条件下能明显促进大豆对氮、磷的吸收，促进大豆生长，增加生物量。其中在田间条件下与不接种的大豆相比接种该益生重组菌群FN-SynCom1能提高氮（37.2%-69.6%）、磷（57.5%-67.7%），且增加大豆的产量23.3%-36.1%。

附图说明

图1. 基于16S rDNA序列的重组益生菌群FN-SynCom1单菌的进化树分析。

图2. 不同氮、磷养分条件下接种人工重组益生菌群FN-SnyCom1对大豆生长的影响。

图3. 大田条件下应用重组菌群对大豆氮、磷养分吸收和产量的影响（试验地1-洋中）。

图4. 大田条件下应用重组菌群对大豆氮、磷养分吸收和产量的影响（试验地2-南平）。

具体实施方式

实施例1

（1）菌株获取

收集种植于大田条件下的巴西10号（BX10）大豆品系的根系，用洗涤缓冲液（10 mMpH = 7.0的磷酸盐PBS缓存液）在摇床上以180 rpm洗涤20 min，去除根表土壤，之后用75%酒精（1 min）与2%的次氯酸钠溶液(5 min)对洗涤后样品进行表面进行消毒。表面消毒后的样品用无菌水洗涤5次。取出样品在灭菌后的滤纸上将水吸干。加入5 mL无菌水，通过组织裂解器对样品进行匀浆处理。将匀浆母液进行初步过滤后，按照不同比例稀释（稀释倍数：100倍、1000倍、10000倍），稀释之后取 100 μL分别涂布于细菌生长培养基（表1）上。平板置于28度培养箱，从涂布后第三天开始挑取单菌落，并进行划线纯化，挑选单克隆用相应的液体培养基培养后，加入等体积50%无菌甘油，混匀后，将保存菌种于-80℃。

（2）菌株筛选与鉴定

将从大豆根系分离得到的菌进行溶磷、产IAA功能检测。菌株溶磷功能的检测：在超净工作台中，将保存的菌液每个吸取2 µL接种到蒙金娜植酸钙（有机磷）、蒙金娜磷酸三钙（无机磷）培养基平板上（培养基配方参见表2），30℃培养3~5 d，期间观察菌株的生长状态，如果有溶磷圈的出现，表明菌株具有溶磷能力。菌株产 IAA 活性检测：将Salkowski比色液（50 mL 35% HClO₄+ 1 mL 0.5 mol/L FeCl₃）与加有L-色氨酸且摇至对数期的菌液进行显色反应。如果变红则说明该菌株可以分泌IAA。最终获得菌株RBC-258具有IAA分泌能力，菌株RBC-288和RBC-289具有溶解难溶性有机磷和无机磷能力。

利用引物16s-rRNA-F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG TACGGCTACCTTGTTAC GACTT扩增细菌的16 rRNA, 并进行测序，将得到的序列提交NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行BLAST比对分析。通过分析发现，RBC-258 属于芽孢杆菌（Bacillus sp.），RBC-288属于根瘤菌属（Rhizobium sp.）, RBC-289 属于不动杆菌（Acinetobacter sp.）。

3个菌株的16S rDNA序列如下：

>RBC-288

GCGTGGGAATCTACCTTTTGCTACGGAATAACGCAGGGAAACTTGTGCTAATACCGTATGTGTCCTTCGGGAGAAAGATTTATCGGCAAGAGATGAGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCACCGGAGAAGATAATGACGGTATCCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGATCGATCAGTCAGGGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCCTGGAACTGCCTTTGATACTGTCGATCTGGAGTA。

>RBC-258

TGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAG。

>RBC-289

CGGGTGAGTAATGCTTAGGAATCTGCCTATTAGTGGGGGACAACATTTCGAAAGGAATGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCTAATAGATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTATGGTTGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTTTAGTTAATACCTAGAGATAGTGGACGTTACTCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGCTAATTAAGTCAAATGTGAAATCCCCGAGCTTAACTTGGGAATTGCATTCGATACTGGTTAGCTAGAGTGTGGGAGAGGATGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGG。

表1. 三种细菌固体培养基配方

表2 溶磷和解钾功能筛选的2种固体培养基配方

表3. FN-SynCom1的3株菌株信息

实施例2 室内条件下接种FN-SynCom1对大豆氮、磷养分吸收以及生长的影响。

1.菌株活化：将-80℃保存的菌株（菌株RBC-258、RBC-288、RBC-289）分别划线接种于相应的固体培养基（RBC-258划线与M408固体培养基；RBC-288和RBC-289划线于TSB固体培养基），放置于28℃培养箱进行培养。带长出单克隆之后。将活化后的菌株转接在5 mL相应的液体培养基中培养，置于28℃，200 rpm的摇床，培养至菌液OD₆₀₀ = 1.0。

2.取单菌菌液50 μL，接种到50 mL液体培养基中（各个菌的分离培养基，附表1和表3），于28℃，200 rpm下培养2-3天，至OD₆₀₀ = 1.5。

3.通过离心方式(5000 rpm, 10 min)分别收集菌体，菌体用50 mL无菌水悬浮起来，并用无菌水将OD₆₀₀ 调整至OD₆₀₀ = 0.2。

4.每个菌体的悬浮液取20 mL混合在一起，即为混合的菌液，即重组益生菌群FN-SynCom1。将60 mL混合的菌液拌加到灭菌（121℃，30 min）的含有1L体积的蛭石和1 L体积的植物生长基质（Jiffy Base Peat）（1:1）的混合基质中。

5.将添加了混合菌液的混合基质装到7 ×7 ×10 cm的盆子中（每盆基质添加到距离盆口1 cm 左右，同时在每盆的基质中再添加0.5 g 无机难溶磷 Ca₃(PO4)₂和0.5 g 难溶有机磷植酸钙（C₆H₆Ca₆O₂₄P₆）粉末），每盆播种经过表面消毒处理（70% 酒精处理1分钟）的大豆种子3粒（大豆品种：Williams82），于大豆真叶完全展开后，去除长势不均一的苗子，每盆只留下一株。实验设置两个养分水平处理（低氮低磷（LNLP： 530 μM N， 25μM P）和高磷高氮（HNHP：5300 μM N，500μM P）），同时以不接种重组益生菌的大豆为对照，每个处理种植6盆。大豆于生长室内生长1个月，之后对大豆的长势进行拍照，测定植株氮、磷含量和生物量。

结果显示（图2）：在LNLP和HNHP条件下，接种重组益生菌群FN-SynCom1能明显的促进大豆的生长，接种条件下的植株的总磷、总氮含量和植株的生物量都显著高于对照组。表明接种重组益生菌群FN-SynCom1促进了大豆对氮、磷的吸收。具体来说，在LNLP条件下接种重组益生菌群FN-SynCom1，大豆整株的氮、磷含量和生物量分别增加了196.65%、145.7%、73.8%；HNHP条件下大豆整株的氮、磷含量分别增加了112.23%、88.69%、44.9%。并且在LNLP下接种重组益生菌群下植株的长势基本能达到HNHP不接菌条件下植株的长势。说明菌群在促进氮、磷吸收和植株生长效果显著。

实施例3 大田条件下应用FN-SynCom1对大豆氮、磷养分吸收以及生长的影响（试验地1：福建农林大学，洋中试验基地；试验地2：南平农科院，试验基地）。

1.菌株活化：将-80℃保存的供试菌株先转接于相应的固体培养基 (RBC-258划线与M408固体培养基；RBC-288和RBC-289划线于TSB固体培养基) 进行划线活化，最后将活化后的菌株转接在相应的液体培养基(RBC-258划线与M408液体培养基；RBC-288和RBC-289划线于TSB液体培养基；液体培养基为在固体培养基基础上不添加agar 成分)中培养，培养至菌液OD₆₀₀=1.5。

2.取单菌菌液50 μL，接种到50 mL液体培养基中（各个菌的分离培养基，附表1和3），于28℃，200 rpm下培养2-3天，至OD600 = 1.5。

3.通过离心方式(5000 rpm, 10 min)分别收集菌体，菌体用50 mL无菌水悬浮起来，并用无菌水将OD₆₀₀ 调整至OD₆₀₀ = 1.0。每个菌株取20 mL 菌液混合均匀，获得混合菌液，即重组菌群FN-SynCom1。

4.将60 mL混合菌液与1L 蛭石和1L植物生长基质（Jiffy Base Peat）1:1（体积比）混合均匀，制备大豆接种菌剂。50粒种子播种前与10 g菌剂充分混合。实验设置以不接种菌剂的为对照。

5.大田实验规划：实验每个小区设置：5米行长，1.2米行宽。大豆株距为20 cm，行距为40 cm。每穴播种2粒种子。实验组和对照组分别设置3个小区。大豆种植过程中，根据需求正常浇水，不施肥。于大豆生育期的鼓荚期进行收获，每处理、每小区收获5株大豆植株，检测大豆的氮、磷吸收总量和单株荚数、单株粒重等产量指标。

结果如图3和图4所示：在两个实验地点接种重组益生菌群均明显促进植株的生长，与室内结果一致，在田间应用重组益生菌群FN-SynCom1，均显著提高了大豆植株的总氮（69.6%和37.2%）和总磷含量（67.7%和57.5%），说明重组益生菌群FN-SynCom1的应用提高了大豆对氮、磷的吸收。同时重组益生菌群FN-SynCom1的应用明显增加了果荚数目（43.4%和24.5%），单株粒重（23.3%和36.1%），说明接种重组菌群能够提高大豆的产量，具有较好的应用前景。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种增加大豆氮、磷吸收和产量的人工合成益生菌群与应用

<130> 5

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tacggctacc ttgttacgac tt 22

<210> 3

<211> 498

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcgtgggaat ctaccttttg ctacggaata acgcagggaa acttgtgcta ataccgtatg 60

tgtccttcgg gagaaagatt tatcggcaag agatgagccc gcgttggatt agctagttgg 120

tggggtaaag gcctaccaag gcgacgatcc atagctggtc tgagaggatg atcagccaca 180

ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc agtggggaat attggacaat 240

gggcgcaagc ctgatccagc catgccgcgt gagtgatgaa ggccctaggg ttgtaaagct 300

ctttcaccgg agaagataat gacggtatcc ggagaagaag ccccggctaa cttcgtgcca 360

gcagccgcgg taatacgaag ggggctagcg ttgttcggaa ttactgggcg taaagcgcac 420

gtaggcggat cgatcagtca ggggtgaaat cccagggctc aaccctggaa ctgcctttga 480

tactgtcgat ctggagta 498

<210> 4

<211> 508

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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atggatggac ccgcgtcgca ttagctagtt ggtgaggtaa cggctcacca aggcaacgat 180

gcgtagccga cctgagaggg tgatcggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct 240

acgggaggca gcagtaggga atcttccgca atggacgaaa gtctgacgga gcaacgccgc 300

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tgaataagct ggcaccttga cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc 420

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ggcagcagtg gggaatattg gacaatgggc gcaagcctga tccagccatg ccgcgtgtgt 300

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ctagagatag tggacgttac tcgcagaata agcaccggct aactctgtgc cagcagccgc 420

ggtaatacag agggtgcaag cgttaatcgg atttactggg cgtaaagcgc gcgtaggcgg 480

ctaattaagt caaatgtgaa atccccgagc ttaacttggg aattgcattc gatactggtt 540

agctagagtg tgggagagga tggtagaatt ccaggtgtag cggtgaaatg cgtagagatc 600

tgg 603

Claims

1.一种提高大豆氮、磷吸收和产量的人工重组益生菌群FN-SynCom1，其特征在于：所述人工重组益生菌群FN-SynCom1包含芽孢杆菌（Bacillus sp.） RBC-258、根瘤菌（Rhizobiumsp.）RBC-288、不动杆菌（Acinetobacter sp.）RBC-289，且三种菌株于2020年11月 16 日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为CCTCC NO：M2020749、CCTCC NO：M2020750、CCTCC NO：M2020751。

2.根据权利要求1所述的一种提高大豆氮、磷吸收和产量的人工重组益生菌群FN-SynCom1，其特征在于：菌株RBC-258、RBC-288、RBC-289的质量比为1:1:1。

3.如权利要求1所述的提高大豆氮、磷吸收和产量的人工重组益生菌群FN-SynCom1在增加大豆氮、磷吸收和产量中的应用。