CN114921373A - 栖稻根瘤菌在提高植物耐盐性中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物菌肥技术领域，具体涉及一种耐盐菌剂及其在提高植物耐盐性中的应用。所述耐盐菌剂包括栖稻根瘤菌M15的菌体、菌悬液、发酵液、发酵液粗提物和发酵液粗提物的单体化合物中的一种或多种。在盐胁迫条件下，所述栖稻根瘤菌M15可降低包括水稻在内的植物的相对导电率、脯氨酸含量、Na+含量以及Na+/K+比值，提高植物中还原型谷胱甘肽和抗氧化酶的活性，进而缓解盐胁迫对植物的危害，促进植物的生长。

Description

栖稻根瘤菌在提高植物耐盐性中的应用
技术领域
本发明属于微生物菌肥技术领域，具体涉及栖稻根瘤菌在提高植物耐盐性中的应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa L.)是世界上50％以上人口的主食，主要分布在亚洲、拉丁美洲和非洲，90％的水稻在亚洲种植，其中我国占1/3。随着气候变化，导致土壤盐碱度增加，土壤盐渍化严重影响农业生产和生态环境，造成植物生理干旱和养分吸收不平衡。盐胁迫是制约粮食生产的主要非生物胁迫之一。与其他粮食作物相比，水稻对田间盐分更为敏感，当土壤含量超过6dS/m时，会使水稻减产50％以上，土壤盐化严重影响水稻产量。
伴随工业化进程，盐化土壤逐渐增多，传统盐碱地开发利用以盐碱地改良为主，综合运用物理、水利、化学等措施降低土壤中盐浓度，改良盐碱地使之适应作物生长。盐碱地改良耗费大量人力物力财力、不易大面积推广。水稻作为主要粮食作物和盐碱地改良的先锋作物，在淡水资源充足条件下，种植水稻是改良利用盐碱地的最好措施。
植物根际促生菌(PGPR)能够提高水稻耐盐能力，具有环保、经济、可持续等优点，是耐盐作物选育的重要补充手段。研究和开发缓解水稻盐胁迫的PGPR创制耐盐碱水稻具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供栖稻根瘤菌在提高植物耐盐性中的应用，所述耐盐菌剂包括栖稻根瘤菌M15及其活性物质，可以显著缓解盐胁迫对植物的危害，促进植物生长。
本发明提供了一种耐盐菌剂，所述耐盐菌剂包括下述Ⅰ-Ⅴ中的一种或多种：
Ⅰ：栖稻根瘤菌M15菌体；
Ⅱ：栖稻根瘤菌M15的菌悬液；
Ⅲ：栖稻根瘤菌M15的发酵液；
Ⅳ：栖稻根瘤菌M15的发酵液粗提物；
Ⅴ：分离自栖稻根瘤菌M15的发酵液粗提物中的单体化合物；
所述栖稻根瘤菌M15的保藏编号为CGMCC No.15530。
优选的，所述栖稻根瘤菌M15的发酵液粗提物包括栖稻根瘤菌M15发酵液的乙酸乙酯相粗提物、正丁醇相粗提物和水相粗提物中的一种或多种。
优选的，所述栖稻根瘤菌M15发酵液粗提物的单体化合物从栖稻根瘤菌M15发酵液的水相粗提物中分离得到。
优选的，所述栖稻根瘤菌M15发酵液粗提物的单体化合物包括环-(L-脯氨酸-L-酪氨酸)、环-(L-脯氨酸-L-苯丙氨酸)、环-(S-脯氨酸-S-异亮氨酸)、环-(R-脯氨酸-R-亮氨酸)、环-(S-脯氨酸-R-缬氨酸)、酪醇和2-(4-乙酰氧基苯基)乙醇中的一种或多种。
优选的，当所述耐盐菌剂中包含栖稻根瘤菌M15菌体时，所述栖稻根瘤菌M15的浓度为(0.5～3)×108CFU/mL。
优选的，当所述耐盐菌剂中包含栖稻根瘤菌M15的发酵液、栖稻根瘤菌M15的发酵液粗提物和栖稻根瘤菌M15的发酵液粗提物的单体化合物的任意一种或多种时，所述栖稻根瘤菌M15的发酵液中所述栖稻根瘤菌M15的浓度为(0.5～3)×108CFU/mL。
本发明还提供了一种分离自栖稻根瘤菌M15发酵液的水相粗提物，包括：环-(L-脯氨酸-L-酪氨酸)、环-(L-脯氨酸-L-苯丙氨酸)、环-(S-脯氨酸-S-异亮氨酸)、环-(R-脯氨酸-R-亮氨酸)、环-(S-脯氨酸-R-缬氨酸)、酪醇和2-(4-乙酰氧基苯基)乙醇中的一种或多种。
本发明还提供了一种耐盐组合物，包括下述上述技术方案所述的单体化合物中的一种或多种。
本发明还提供了上述技术方案所述的耐盐菌剂、水相粗提物或耐盐组合物在提高植物耐盐性和/或制备植物耐盐产品中的应用。
优选的，所述植物包括水稻。
有益效果：
本发明提供了一种耐盐菌剂，所述耐盐菌剂包括栖稻根瘤菌M15的菌体、菌悬液、发酵液、发酵液粗提物和发酵液粗提物的单体化合物中的一种或多种。在盐胁迫条件下，所述栖稻根瘤菌M15可降低包括水稻在内的植物的相对导电率、脯氨酸含量、Na+含量以及Na+/K+比值，提高植物中还原型谷胱甘肽和抗氧化酶的活性，进而缓解盐胁迫对植物的危害，促进植物的生长。
生物保藏信息
栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15，于2018年03月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.15530。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为栖稻根瘤菌M15发酵液萃取方法；
图2为栖稻根瘤菌M15发酵液水相粗提物中分离得到的7种单体化合物；
图3为栖稻根瘤菌M15对水稻生长的影响；
图4为栖稻根瘤菌M15缓解水稻盐胁迫(100mM)下生长指标的测定，A图为水稻株高的测定，B图为水稻地上部分鲜重的测定，C图为水稻地上部分干重，D图为水稻根长的测定，E图为水稻根鲜重的测定，F图为水稻根干重的测定；
图5为栖稻根瘤菌M15对水稻叶绿素含量的影响，A图为水稻叶片内的叶绿素a含量，B图为水稻叶片内叶绿素b含量，C图为水稻叶片内叶绿素总含量；
图6为栖稻根瘤菌M15对水稻相对电导率的影响，A图为水稻叶片相对电导率，B图为水稻根部相对电导率；
图7为栖稻根瘤菌M15对水稻可溶性糖含量的影响，A图为水稻叶片可溶性糖，B图为水稻根部可溶性糖；
图8为栖稻根瘤菌M15对水稻GSH含量的影响，A图为水稻叶片的GSH含量，B图水稻根部的GSH含量；
图9为栖稻根瘤菌M15对水稻抗氧化酶的影响，A图为水稻叶片的CAT活性，B图为水稻叶片的POD活性，C图为水稻叶片的SOD活性，D图为水稻根内CAT活性，E图为水稻根内POD活性，F图为水稻根内SOD活性；
图10为栖稻根瘤菌M15对水稻钠钾离子含量的影响，A图水稻叶片中Na+含量，B图为水稻叶片中K+含量，C图为水稻叶片中Na+/K+，D图为水稻根内Na+含量，E图为水稻根内K+含量，F图为水稻根内Na+/K+；
图11为栖稻根瘤菌M15发酵液的乙酸乙酯相粗提物对水稻生长的影响，A图为乙酸乙酯相对无盐胁迫水稻幼苗生长的影响，B图为乙酸乙酯相对100mM盐胁迫水稻幼苗生长的影响；
图12为栖稻根瘤菌M15发酵液的正丁醇相粗提物对水稻生长的影响，A图为正丁醇相对无盐胁迫水稻幼苗生长的影响，B图为正丁醇相对100mM盐胁迫水稻幼苗生长的影响；
图13为栖稻根瘤菌M15发酵液的水相粗提物对水稻生长的影响，A图为水相粗提物对无盐胁迫水稻幼苗生长的影响，B图为水相粗提物对100mM盐胁迫水稻幼苗生长的影响；
图14为栖稻根瘤菌M15发酵液的水相粗提物对水稻生长指标的测定数据，B图为水稻株高，C图水稻地上部分鲜重，D图为水稻地上部分干重，E图为水稻根长，F图为水稻根鲜重，G图水稻根干重。
具体实施方式
本发明提供了一种耐盐菌剂，所述耐盐菌剂包括下述Ⅰ-Ⅴ中的一种或多种：
Ⅰ：栖稻根瘤菌M15菌体；
Ⅱ：栖稻根瘤菌M15的菌悬液；
Ⅲ：栖稻根瘤菌M15的发酵液；
Ⅳ：栖稻根瘤菌M15的发酵液粗提物；
Ⅴ：栖稻根瘤菌M15的发酵液粗提物的单体化合物；
所述栖稻根瘤菌M15的保藏编号为CGMCC No.15530。
本发明所述栖稻根瘤菌M15优选从健康水稻根际内分离纯化后获得，并已进行生物保藏，所述栖稻根瘤菌M15具体的分离和鉴定步骤见中国专利CN108396005A。
在本发明中，所述耐盐菌剂中的活性成分包括单独的栖稻根瘤菌M15的菌体、菌悬液、发酵液、发酵液粗提物、发酵液粗提物的单体化合物，或以上述任意两种或多种物质的混合物形式存在。本发明所述耐盐菌剂优选具有如下特性中的一种或几种：Ⅰ：降低植物的相对导电率、脯氨酸含量、Na+含量或Na+/K+；Ⅱ：提高植物中还原型谷胱甘肽或抗氧化酶的活性；Ⅲ：促进植物生长。本发明所述抗氧化酶优选包括过氧化氢酶CAT、过氧化物酶POD和超氧化物歧化酶SOD；所述促进植物生长优选包括增加植物的株高，地上部鲜重和干重，根长、根鲜重和根干重。本发明所述耐盐菌剂中的栖稻根瘤菌M15的浓度优选为0.5～3×108CFU/mL，更优选为1×108CFU/mL。本发明对所述耐盐菌剂的剂型没有特殊限定，采用本领域常规剂型均可，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。本发明所述耐盐菌剂优选还包括生物或非生物辅料，本发明对所述辅料的类型没有特殊限定，可与耐盐菌剂组合且不产生拮抗作用的辅料均可。
本发明所述栖稻根瘤菌M15的菌悬液的制备方法优选包括如下步骤：将活化的栖稻根瘤菌M15在TY液体培养基中过夜培养至菌液浑浊，对得到的浑浊菌液离心，得菌体；采用无菌Kimura B营养液重悬菌体，得到所述栖稻根瘤菌M15的菌悬液。
本发明栖稻根瘤菌M15的活化方法优选包括：采用连续划线法于TY固体培养基上活化栖稻根瘤菌M15菌种，恒温过夜培养，挑取M15单菌落，得到所述活化的栖稻根瘤菌M15。本发明所述恒温过夜培养的温度优选为28～35℃，更优选为30℃。
得到所述活化的栖稻根瘤菌M15后，本发明优选将所述活化的栖稻根瘤菌M15在TY液体培养基中过夜培养至菌液浑浊，对得到的浑浊菌液进行离心，弃上清，得菌体。本发明所述过夜培养优选为振荡培养，所述振荡培养的温度优选为28～35，更优选为30℃；转速优选为150～200rpm，更优选为180rpm。本发明所述浑浊菌液的OD600值优选为0.5～1.5，更优选为1.0。本发明所述离心的转速优选为5000rpm，温度优选为10℃，时间优选为10min。
得到所述菌体后，本发明优选还包括采用无菌Kimura B营养液洗涤所述菌体，得到洗涤后的菌体。本发明所述洗涤的次数优选为3次。
得到所述洗涤后的菌体后，本发明优选采用KimuraB营养液重悬所述洗涤后的菌体，得到所述栖稻根瘤菌M15的菌悬液。本发明优选将所述栖稻根瘤菌M15的菌悬液稀释至OD600＝1.0，备用。
本发明所述栖稻根瘤菌M15的发酵液的制备方法优选包括：将活化的栖稻根瘤菌M15在TY液体培养基中过夜培养，得到栖稻根瘤菌M15菌液；将所述栖稻根瘤菌M15菌液转接到TY液体培养基中第一培养，得到第一培养液；将所述第一培养液转接到TY液体培养基中继续培养，得到所述栖稻根瘤菌M15的发酵液。
本发明获得栖稻根瘤菌M15菌液的方式与上述栖稻根瘤菌M15菌悬液中获得浑浊菌液的方式相同，在此不再赘述。
得到所述栖稻根瘤菌M15菌液后，本发明优选将将所述栖稻根瘤菌M15菌液转接到TY液体培养基中第一培养，得到第一培养液。本发明进行所述第一培养时，所述栖稻根瘤菌M15菌液的接种量优选为所述TY液体培养基体积的1％。本发明所述第一培养优选为过夜培养，所述第一培养的温度优选为28～35℃，更优选为30℃；转速优选为150～200rpm，更优选为180rpm。
得到所述第一培养液后，本发明优选将所述第一培养液转接到TY液体培养基中继续培养，得到所述栖稻根瘤菌M15的发酵液。本发明进行所述继续培养时，所述第一培养液的接种量优选为所述TY液体培养基体积的1％。本发明所述继续培养的温度优选为28～35℃，更优选为30℃；转速优选为150～200rpm，更优选为180rpm；时间优选为60～84h，更优选为72h。
本发明优选还提供了所述栖稻根瘤菌M15的发酵液粗提物的制备方法，包括如下步骤：将所述栖稻根瘤菌M15的发酵液与溶剂混合，萃取，得到所述栖稻根瘤菌M15的发酵液粗提物。本发明所述栖稻根瘤菌M15的发酵液与溶剂的体积比优选为0.5～1.0：0.5～2.0，更优选为1：1。本发明所述溶剂优选包括乙酸乙酯和水饱和正丁醇，即以乙酸乙酯对所述栖稻根瘤菌M15的发酵液萃取，得到的是栖稻根瘤菌M15发酵液的乙酸乙酯相粗提物，以水饱和正丁醇对所述栖稻根瘤菌M15的发酵液萃取，得到的是栖稻根瘤菌M15发酵液的正丁醇相粗提物和水相粗提物。本发明对制备述栖稻根瘤菌M15的发酵液粗提物的具体过程没有特殊限定，采用对应溶剂对所述栖稻根瘤菌M15的发酵液进行提取即可，具体操作流程见图1。在本发明中，每一种溶剂的萃取的次数均优选为2～4次，更优选为3次。本发明用于制备所述栖稻根瘤菌M15的发酵液粗提物的栖稻根瘤菌M15的浓度优选为(0.5～3)×108CFU/mL。
得到所述栖稻根瘤菌M15发酵液的水相提取物后，本发明优选还包括从所述栖稻根瘤菌M15发酵液的水相粗提物中分离单体化合物，得到Cyclo-(L-Pro-L-Tyr)、Cyclo-(L-Pro-L-Phe)、Cyclo-(S-Pro-S-Ile)、Cyclo-(R-Pro-R-Leu)、Cyclo-(S-Pro-R-Val)、Tyrosol和2-(4-Acetoxyphenyl)ethanol。
本发明优选提供了所述单体化合物的制备方法，包括如下步骤：采用半制备型色谱对所述栖稻根瘤菌M15发酵液的水相提取物进行洗脱，得到两个馏分，标记为Fr.1和Fr.2；采用半制备液相对所述Fr.1进行分离纯化，得到化合物1、化合物6、化合物5和化合物7。采用半制备液相对所述Fr.2进行分离纯化得到馏分Fr.5.1、化合物4和化合物2。采用半制备液相对所述馏分Fr.5.1进行纯化得到化合物5。
本发明优选采用半制备型液相色谱对所述栖稻根瘤菌M15发酵液的水相提取物进行洗脱，得到两个分离馏分Fr.1和Fr.2。本发明所述洗脱优选为不同浓度甲醇梯度洗脱，洗脱条件：0-5min 20％甲醇，5-30min 20％-100％甲醇，30min后为100％甲醇，流速：5ml/min。
得到所述Fr.1后，本发明优选采用半制备液相对所述Fr.1进行分离纯化，得到化合物1、化合物6、化合物3和化合物7。本发明分离所述Fr.1的流动相优选为18％甲醇-水系统，流速优选为2mL/min。本发明所述化合物1的保留时间优选为35.3min，化合物6的保留时间优选为38.1min，化合物3的保留时间优选为42.2min，化合物7的保留时间优选为47.1min。
得到所述Fr.2后，本发明优选采用半制备液相对所述Fr.2进行分离纯化得到馏分Fr.5.1、化合物4和化合物2。本发明分离所述Fr.2的流动相优选为35％甲醇-水系统，流速优选为2mL/min。本发明所述馏分Fr.5.1的保留时间优选为38.3min，化合物4的保留时间优选为40.3min，化合物2的保留时间优选为48.5min。
得到所述馏分Fr.5.1后，本发明优选采用半制备液相对所述馏分Fr.5.1进行分离纯化，得到化合物5。本发明优选使用甲醇进行梯度洗脱，洗脱梯度分配：0～5min，30％甲醇；5～23min，30～80％甲醇，＞23.1min，30％甲醇。本发明所述化合物5的保留时间优选为30.5min。
本发明优选还包括对分离得到的7个化合物的化学结构和理化性质进行鉴定，得到所述7个化合物的化学结构(图2)和波谱数据。本发明对7个化合物的理化性质和化学结构的鉴定方法没有特殊限定，采用本领域常规鉴定方法即可。
本发明所述7个化合物分别为Cyclo-(L-Pro-L-Tyr)、Cyclo-(L-Pro-L-Phe)、Cyclo-(S-Pro-S-Ile)、Cyclo-(R-Pro-R-Leu)、Cyclo-(S-Pro-R-Val)、Tyrosol和2-(4-Acetoxyphenyl)ethanol。
本发明还提供了一种一种分离自栖稻根瘤菌M15发酵液的水相粗提物，包括：Cyclo-(L-Pro-L-Tyr)、Cyclo-(L-Pro-L-Phe)、Cyclo-(S-Pro-S-Ile)、Cyclo-(R-Pro-R-Leu)、Cyclo-(S-Pro-R-Val)、Tyrosol和2-(4-Acetoxyphenyl)ethanol中的一种或多种。
本发明还提供了一种耐盐组合物，包括上述技术方案所述的单体化合物中的一种或多种。在本发明中，包括上述7种单体化合物中的任意一种或几种单体化合物的组合物均具备缓解盐胁迫对植物的迫害的作用，提高植物的耐盐性，促进植物的生长。本发明所述7种单体化合物优选分离自栖稻根瘤菌M15发酵液的水相粗提物。
本发明还提供了上述技术方案所述的耐盐菌剂或耐盐组合物在提高植物耐盐性和/或制备植物耐盐产品中的应用。本发明所述植物优选包括水稻。本发明所述耐盐菌剂包括栖稻根瘤菌M15的菌体、菌悬液、发酵液、发酵液粗提物和发酵液粗提物的单体化合物中的一种或多种。在盐胁迫条件下，所述栖稻根瘤菌M15可降低包括水稻在内的植物的相对导电率、脯氨酸含量、Na+含量以及Na+/K+比值，提高植物中还原型谷胱甘肽和抗氧化酶的活性，进而达到环节盐胁迫对植物的危害，促进植物的生长，可将其应用于制备植物耐盐性产品，本发明对所述耐盐性产品的类型没有特殊限定，本领域常规用于提高植物耐盐性的产品均可，如菌剂、农药或肥料等。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例中所使用的培养基或试剂配方如下：
1/2MS固体培养基：将2.2g Murashige Skoog培养基(含维生素)干粉与10.0g蔗糖和8.0g植物凝胶溶于1L无菌去离子水中，pH调至5.8，121℃高压灭菌15min。
KimuraB营养液：将254mg Kimura B水稻营养液干粉及0.2mL配套5,000×钙浓缩液溶解至1L去离子水中，pH调至5.8，121℃高压灭菌15min。
TY液体培养基：TRYPTONE 5.0g/L，YEAST EXTRACT 3.0g/L，CaCl20.87g/L，加入去离子水定容至1L。
TY固体培养基：TRYPTONE 5.0g/L，YEAST 3.0g/L，CaCl20.87g/L，琼脂粉15.0g/L，加入去离子水定容至1L。
蛋白质(TP)、Pro、植物可溶性糖、CAT、POD、SOD、GSH测定的试剂盒采购于南京建成生物研究所。
PBS缓冲液，氯化钠(分析纯)、丙酮、乙醇购买于中国药集团化学试剂有限公司；乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、氯仿、HCl等购买于中国药集团化学试剂有限公司；硅胶由青岛海洋化工厂提供。
实施例中所使用的供试植物为水稻，品种为日本晴(Oryza sativaL.cv.Nipponbare)。
实施例中所使用的水稻幼苗的培养方法：把去壳的饱满健康水稻种子放入无菌容器中，加入一定量的75％乙醇消毒45s，弃去酒精，2.5％次氯酸钠消毒15min，消毒三次，无菌水清洗。消毒后的种子放于1/2MS固体培养基培养(种子胚向上竖直放置)，于25℃，16h光照条件培养7-9天。拔出培养皿上无菌且长势一致的水稻苗，将根上的培养基洗净，再移栽至无菌Kimura B营养液中，长至水稻苗两叶一心期备用。
实施例1
栖稻根瘤菌M15缓解水稻盐胁迫：
栖稻根瘤菌M15(下称M15菌株)的分离与鉴定步骤参见中国专利CN108396005A，不再赘述。
栖稻根瘤菌M15菌悬液的制备：吸取保存在-80℃冰箱甘油管中的M15菌种转移至TY固体培养基上，使用连续划线法活化，30℃恒温过夜培养。从平板上挑取M15单菌落，转移至TY液体培养基中，30℃、180rpm条件下过夜培养，直至菌液浑浊。将浑浊菌液(OD600≈1.0)以5000rpm、4℃离心10min，弃去上清，用无菌Kimura B营养液洗涤3次，最后用一定体积的无菌Kimura B营养液重悬菌液，将菌液稀释到OD600＝1.0备用。
配置含0mM、25mM、50mM、75mM、100mM、125mM NaCl的Kimura B溶液，将两叶一心期水稻苗分别置于上述溶液中进行培养，添加M15菌株的为处理组(终浓度为1×108CFU/mL，OD600＝1.0的菌液稀释10倍)，不添加菌液的为对照组，处理后培养15d，摸索具有显著差异的盐分浓度。
经过盐浓度的探究，确定100mM NaCl作为盐胁迫的最适浓度后，对两叶一心期的水稻苗进行如下处理，其中CK表示不添加任何物质。
C0(CK+0mM NaCl)：将水稻苗移至无菌Kimura B营养液中；
C1(CK+100mM NaCl)：将水稻苗移至无菌含100mM NaCl Kimura B营养液中(NaCl终浓度为100mM)；
M0(M15+0mM NaCl)：将水稻苗移至含菌Kimura B营养液中(M15终浓度为1×108CFU/mL)；
M1(M15+100mM NaCl)：将水稻苗移至含菌Kimura B营养液中(M15终浓度为1×108CFU/mL，NaCl终浓度为100mM)。
每个处理3个重复，每个重复3株水稻苗。将上述水稻苗置于光照培养箱内培养，期间每三天左右补加对应的营养液(含NaCl或不含NaCl)。
测定不同处理下水稻的生物量及生理指标，测定方法如下：
1、水稻生物量测定：将盐胁迫处理15d的水稻苗拔出，测量高度；将水稻表面的水分擦干后，称量；烘干至恒重后，测干重。
2、水稻生理指标测定
2.1叶绿素测定：参照张宪政(张宪政,1986)的方法对水稻叶片的叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素进行测定。同时，参考谭佳缘的方法采用叶绿素荧光成像系统分析叶绿素荧光动力学(谭佳缘,2020)。
2.2相对电导率测定：参照陈爱葵(陈爱葵等,2010)的方法测定水稻叶片和根部的电导，并根据公式计算其相对电导率。
2.3可溶性蛋白、可溶性糖、游离Pro、GSH和抗氧化酶含量测定：
待测样品制备：准确称取0.1g水稻地上部分(或地下部分组织)的重量，液氮处理后迅速用研磨仪研磨，加入900μL的磷酸缓冲液(pH＝7.4)，摇匀，3500r/min离心10min，舍弃沉淀，上清液备测。
可溶性蛋白、游离Pro、CAT、POD、SOD、GSH、植物可溶性糖等按照试剂盒(南京建成公司)中说明书对本实验水稻叶片及根中相关物质进行测定。
2.4元素含量测定：取0.1g烘干磨细的水稻叶片和根样品，用H2SO4-H2O2法进行消煮，消煮液过滤后备用。用火焰分光光度计法对钠钾离子含量进行测定(陈淋,2016)。
实验结果：
M15菌株对水稻生物量的影响
水稻在盐胁迫下生长缓慢，叶尖卷曲、变白、干枯，但接种M15菌株后能够明显缓解水稻盐胁迫的症状，且M15菌株几乎不影响不受盐胁迫的水稻形态(图3)。
无盐环境下，接种M15菌株15d后对水稻的根长、地上部分和根的鲜重及干重并无明显影响，但是导致其株高明显长于对照组(图4中A图)。
在盐胁迫下，接种M15菌株使水稻的地上部分的鲜重和干重高于对照组，但差异不显著(图4中B和C图)；地下部分与对照相比，鲜重和干重分别在0.01和0.05水平上差异显著，根鲜重和干重分别增加61.53％和41.67％(图4中E和F图)；水稻经M15菌株处理后株高明显高于对照组，在0.01水平上差异显著，增加了13.81％(图4中A图)。
M15菌株对水稻叶绿素的影响
在无盐胁迫下，接种M15对水稻叶绿素的合成无显著影响(图5)，而在100mM NaCl胁迫条件下，接种M15的水稻中的叶绿素a含量显著高于对照组，增加了14.00％，叶绿素b含量无明显区别，叶绿素总含量虽无显著差异，但增加了22.73％。可以得出，在盐胁迫下，接种M15能够增强水稻光合作用，促进水稻幼苗叶片中叶绿素a的合成。
M15菌株对水稻相对电导率的影响
植物受胁迫后，细胞膜破裂，膜蛋白受损，使胞液外渗，相对电导率增加。相对电导率反映植物膜系统损伤状况。由图6可知，无盐胁迫情况下，M15菌株不影响水稻的膜系统。100mM NaCl处理显著增加水稻叶片及根部的相对电导率，分别增加219.60％、28.91％；而在100mM NaCl胁迫条件下，加入M15处理后，水稻叶片的相对电导率显著降低，降低了80.32％，根部无显著降低(图6)。因此，M15能够降低盐胁迫对水稻叶片细胞膜的损伤。
M15菌株对水稻可溶性糖含量的影响
在未受到盐胁迫时，接种M15不影响水稻叶片和根中的可溶性糖含量(图7)。在受到盐胁迫时，水稻叶片和根中的可溶性糖含量与无盐胁迫时相比，分别显著升高和降低(图7中A和B图)，但接种M15的水稻叶片和根中的可溶性糖含量均显著高于对照组，分别是盐胁迫对照组的1.27倍、1.29倍。
M15菌株对水稻GSH的影响
GSH作为非酶性抗氧化物，可衡量植物抗氧化能力。图8为M15接种水稻幼苗在有无盐胁迫条件下，GSH含量的变化。当无盐胁迫时，M15菌株不影响水稻GSH含量；在盐胁迫条件下，不接种M15的水稻叶片和根内的GSH含量都降低了，而接种M15的水稻叶片和根内的GSH与盐胁迫对照组相比，GSH含量显著提高。
M15菌株对水稻抗氧化酶活性的影响
通过试验发现，在无盐胁迫条件下，接种M15对水稻叶片中的抗氧化酶活性没有影响，在水稻根内，除了CAT活性显著降低外，POD和SOD活性也无显著影响(图9)。盐胁迫条件下，与对照组相比，接种M15的水稻叶片内抗氧化酶活性显著升高，CAT、POD、SOD活性分别是对照组的1.15倍、1.26倍和1.04倍(图9中A、B和C图)；而接种M15对水稻根内的抗氧化酶活性无显著影响(图9中D、E和F图)。
M15菌株对水稻离子稳态的影响
在盐胁迫条件下，植物体内的离子含量会发生明显变化。图10反映了水稻在不同情况下体内钠钾离子的变化。在无盐胁迫条件下，接种M15对水稻叶片中的Na+含量影响显著(图10中A图)，对水稻叶片中K+含量无明显影响(图10中B图)，接种M15的水稻叶片中的Na+/K+比值显著高于对照组，但相对于盐胁迫条件下的变化不大(图10中C图)。接种M15对水稻根内的Na+、K+和Na+/K+值无影响(图10中D、E和F图)。
在盐胁迫下，接种M15的水稻叶片及根内Na+含量显著低于对照组，分别比对照组低了382.34％、14.77％(图10中A和B图)。接种M15的水稻叶片和根内的K+含量变化趋势不同，在叶片中，接种M15的水稻内K+含量显著低于对照组，降低了24.68％，而在根内，显著高于对照组，增加了50.22％(图10中B和E图)。最终，M15主要通过降低植物内Na+含量来降低植物Na+/K+比值的，在叶片和根内分别降低了287.84％、73.21％(图10中C和F图)，从而减少离子对水稻的毒害。
实施例2
栖稻根瘤菌M15发酵液粗提物对植物耐盐性的影响
M15发酵液的水相粗分离：
将-80℃甘油管中保存的M15菌种于固体TY平板上划线活化，在30℃恒温培养箱过夜培养。挑取M15单菌落于5mL液体TY培养基试管中，30℃、180rpm过夜培养后取出，按1％的接种量转接到100mL液体TY培养基三角瓶中，30℃、180rpm过夜培养后，按1％的接种量30℃、180rpm、72小时培养数升M15发酵液。按发酵液：溶剂＝1：1(体积比)混合后，将混合液导入分液漏斗中，依次用乙酸乙酯、水饱和正丁醇对其进行萃取(各溶剂萃取3次)，分别得到乙酸乙酯相、正丁醇相、水相。将各部分旋蒸至干燥后得到的物质使用少量的超纯水溶解后备用。具体操作流程见图1。
M15发酵液不同萃取相对植物耐盐的影响：
以两叶一心期水稻幼苗为材料，检测乙酸乙酯相、正丁醇相、水相中是否存在发挥耐盐的活性物质。将浓度为1×108CFU/mL的发酵液萃取得到的萃取相浓度定义为E-1，其中E-1/10、E-1/50、E-1/100，分别表示将E-1稀释10倍、50倍和100倍，E-10和E-20分别表示将E-1浓缩10倍和20倍。将不同浓度梯度的萃取物分别添加到不含NaCl、含100mM NaCl的无菌KimuraB营养液中，并将M15(终浓度为1×108CFU/mL)分别添加到不含NaCl、含100mM NaCl的无菌KimuraB营养液中作为阳性对照组，阴性对照组分为不含NaCl和添加100mMNaCl的无菌Kimura B营养液，将水稻幼苗分别在以上营养液中培养。每个处理设置5个重复，放置在光照培养箱中，培养15天后，观察水稻的生长情况并收集数据。
实验结果：
由图11可知，在无盐胁迫条件下，低浓度的乙酸乙酯相对水稻的生长并无影响，而高浓度的乙酸乙酯相(浓缩10倍)明显抑制水稻生长；在盐胁迫条件下，低浓度的乙酸乙酯相不能缓解盐胁迫，而高浓度的乙酸乙酯相(浓缩10倍)对水稻造成更大的伤害。
由图12可知，无论是否受到盐胁迫，低浓度的正丁醇相对水稻的生长并无显著影响，而高浓度正丁醇相(浓缩10倍)抑制水稻生长。乙酸乙酯相和正丁醇相的表型实验表明M15发酵液的乙酸乙酯相和正丁醇相粗提物中无缓解水稻盐胁迫的活性物质。
在无盐胁迫时，E-1/50和E-1/10水相粗提物对水稻生长无明显作用(图13和图14)；E-1水相粗提物对水稻具有促生作用，处理组水稻的株高、地上部分鲜重和干重、水稻根长及根的鲜重和干重分别增加了19.82％、61.55％、15.40％、79.98％、77.97％、46.58％(图13和图14)；E-10和E-20水相粗提物由于浓度过高，明显抑制了水稻的生长(图13和图14)。以上结果表明，M15水相粗提物对水稻具有促生作用。
在盐胁迫条件下，除E-20水相粗提物降低了水稻的株高和根长，E-1/50、E-1/10、E-1和E-10水相粗提物能不同程度缓解盐胁迫对水稻的危害(图13和图14)。E-1缓解水稻盐胁迫最明显，与阴性对照相比，E-1处理组的水稻地上部分鲜重和干重、根的鲜重和干重分别增加70.33％、90.36％、62.60％、68.18％；且E-1水相粗提物缓解盐胁迫的作用强于M15菌体(图13和图14)。由此可知，M15发酵液的水相提取物中，存在增强水稻耐盐胁迫的物质。
实施例3
M15水相粗提物中单体化合物的分离和初步鉴定
M15发酵液的水相粗提物(150mg)采用半制备型色谱按照表1进行洗脱分离，主要获得了2个分离馏分(Fr.1、Fr.2)。
对Fr.1馏分进一步采用半制备液相(18％甲醇-水系统，加酸，等度制备，流速：2mL/min)纯化得到化合物1(tR1＝35.3min，11.6mg)、化合物6(tR2＝38.1min，5.0mg)、化合物3(tR3＝42.2min，4.1mg)和化合物7(tR4＝47.1min，1.7mg)。
对Fr.2馏分进一步通过半制备液相(35％甲醇-水系统，加酸，等度制备，流速：2mL/min)纯化得到馏分Fr.5.1(tR5＝38.3min，2.0mg)、化合物4(tR6＝40.3min，1.6mg)和化合物2(tR7＝48.5min，3.9mg)。Fr.5.1经半制备液相(0-5min 30％甲醇，5-23min 30％-80％甲醇，23.1min后30％甲醇)纯化后获得化合物5(tR5＝30.5min，0.8mg)。
表1流动相洗脱条件
Figure BDA0003661066210000141
M15发酵液水相部分化合物的结构解析
为了进一步确定M15发酵液水相部分化合物的组成，通过理化性质和波谱数据分析，对所分离的7个单体化合物进行了化学结构鉴定：5个环二肽类化合物(化合物1-5)，1个苯酚类化合物(化合物6)和1个醇类化合物(化合物7)(图2)。
化合物1为无色油状；1HNMR(500MHz,CD3OD)δH 7.06(d,2H,J＝8.5Hz,H-12/H-16),6.72(d,2H,J＝8.5Hz,H-13/H-15),4.38(td,1H,J＝5.0,2.0Hz,H-9),4.07(ddd,1H,J＝11.0,6.5,2.0Hz,H-6),3.57(dt,1H,J＝12.0,8.5Hz,H-3a),3.37(dt,1H,J＝12.5,6.5Hz,H-3b),3.11(dd,1H,J＝14.0,5.5Hz,H-10a),3.05(dd,1H,J＝14.0,5.0Hz,H-10b),2.11(ddt,1H,J＝12.0,6.0,4.5Hz,H-5a),1.24(dtd,1H,J＝12.0,10.0,9.0Hz,H-5b),1.82(dddd,2H,J＝14.0,10.0,5.5,2.0Hz,H-4)。以上数据与文献化合物Cyclo-(L-Pro-L-Tyr)基本一致。
化合物2为无色油状；1HNMR(500MHz,CD3OD)δH 7.23-7.33(m,5H,Ar),4.46(tdd,1H,J＝5.0,2.0,1.0Hz,H-9),4.08(ddd,1H,J＝11.0,6.5,2.0Hz,H-6),3.55(dt,1H,J＝12.0,8.5Hz,H-3a),3.38(m,1H,H-3b),3.18(dd,2H,J＝5.0,2.5Hz,H-10),3.18(dd,2H,J＝11.0,6.5Hz,H-5a),2.11(ddq,1H,J＝12.5,6.0,3.0Hz,H-5a),1.81(m,2H,H-H-4),1.24(m,1H,H-5b)。以上数据与文献化合物Cyclo-(L-Pro-L-Phe)基本一致。
化合物3为无色油状；1HNMR(500MHz,CD3OD)δH 4.21(ddd,1H,J＝10.0,6.5,2.0Hz,H-6),4.08(td,1H,J＝2.0,1.0Hz,H-9),3.54(m,2H,H-3),2.33(m,1H,H-5a),2.18(m,1H,H-10),2.03(m,1H,H-5b),1.94(m,2H,H-4),1.46(m,1H,H-12a),1.34(m,1H,H-12b),1.08(d,3H,J＝7.0Hz,H-11),0.95(t,3H,J＝7.5Hz,H-13)。以上数据与文献化合物Cyclo-(S-Pro-S-Ile)基本一致。
化合物4为无色油状；1HNMR(500MHz,CD3OD)δH 4.27(ddd,1H,J＝9.5,7.0,2.0Hz,H-6),4.14(m,1H,H-9),3.52(m,2H,H-3),2.31(m,1H,H-5a),2.03(m,2H,H-5b/H-10a),1.92(m,3H,H-10b/H-4),1.54(m,2H,H-11),0.97(d,3H,J＝6.5Hz,H-12),0.97(d,3H,J＝6.5Hz,H-13)。以上数据与文献化合物Cyclo-(R-Pro-R-Leu)基本一致。
化合物5为无色油状；1HNMR(500MHz,CD3OD)δH 4.22(ddt,1H,J＝8.5,6.5,2.0Hz,H-6),4.05(t,1H,J＝2.0Hz,H-9),3.58(m,1H,H-3a),3.52(ddd,1H,J＝11.5,8.5,3.0Hz,H-3b),2.50(m,1H,H-10),2.34(m,1H,H-5a),2.03(m,1H,H-5b),1.96(m,2H,H-4),1.11(d,3H,J＝7.0Hz,H-12),0.95(d,3H,J＝7.0Hz,H-11)。以上数据与文献化合物Cyclo-(S-Pro-R-Val)基本一致。
化合物6为无色油状；1HNMR(500MHz,CD3OD)δH 7.04(d,2H,J＝8.5Hz,H-3/H-5),6.71(d,2H,J＝8.5Hz,H-2/H-6),2.72(t,1H,J＝7.0Hz,H-7),3.69(t,1H,J＝7.0Hz,H-8)。以上数据与文献化合物Tyrosol基本一致。
化合物7为无色油状；1HNMR(500MHz,CDCl3)δH 7.04(d,2H,J＝8.5Hz,H-3/H-5),6.79(d,2H,J＝8.5Hz,H-2/H-6),5.45(brs,1H,OH),3.48(t,1H,J＝7.0,6.0Hz,H-8),2.74(t,1H,J＝7.0Hz,H-7),1.94(s,3H,1-OAc)。以上数据与文献化合物2-(4-Acetoxyphenyl)ethanol基本一致。
由实施例2～3可以证实，在栖稻根瘤菌M15菌株缓解盐胁迫的活性物质与从水相中分离出的7种化合物具有显著关系。
由以上实施例可以得出，栖稻根瘤菌M15可以缓解盐胁迫对植物的危害，促进植物的生长。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种耐盐菌剂，其特征在于，所述耐盐菌剂包括下述Ⅰ-Ⅴ中的一种或多种：
Ⅰ：栖稻根瘤菌(Rhizobium oryzihabitans)M15菌体；
Ⅱ：栖稻根瘤菌M15的菌悬液；
Ⅲ：栖稻根瘤菌M15的发酵液；
Ⅳ：栖稻根瘤菌M15的发酵液粗提物；
Ⅴ：分离自栖稻根瘤菌M15的发酵液粗提物中的单体化合物；
所述栖稻根瘤菌M15的保藏编号为CGMCC No.15530。
2.根据权利要求1所述的耐盐菌剂，其特征在于，所述栖稻根瘤菌M15的发酵液粗提物包括栖稻根瘤菌M15发酵液的乙酸乙酯相粗提物、正丁醇相粗提物和水相粗提物中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的耐盐菌剂，其特征在于，所述栖稻根瘤菌M15发酵液粗提物的单体化合物从栖稻根瘤菌M15发酵液的水相粗提物中分离得到。
4.根据权利要求3所述的耐盐菌剂，其特征在于，所述栖稻根瘤菌M15发酵液粗提物的单体化合物包括环-(L-脯氨酸-L-酪氨酸)、环-(L-脯氨酸-L-苯丙氨酸)、环-(S-脯氨酸-S-异亮氨酸)、环-(R-脯氨酸-R-亮氨酸)、环-(S-脯氨酸-R-缬氨酸)、酪醇和2-(4-乙酰氧基苯基)乙醇中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的耐盐菌剂，其特征在于，当所述耐盐菌剂中包含栖稻根瘤菌M15菌体时，所述耐盐菌剂中栖稻根瘤菌M15的浓度为(0.5～3)×108CFU/mL。
6.根据权利要求1所述的耐盐菌剂，其特征在于，当所述耐盐菌剂中包含栖稻根瘤菌M15的发酵液、栖稻根瘤菌M15的发酵液粗提物和栖稻根瘤菌M15的发酵液粗提物的单体化合物的任意一种或多种时，所述栖稻根瘤菌M15的发酵液中所述栖稻根瘤菌M15的浓度为(0.5～3)×108CFU/mL。
7.一种分离自栖稻根瘤菌M15发酵液的水相粗提物，其特征在于，包括：环-(L-脯氨酸-L-酪氨酸)、环-(L-脯氨酸-L-苯丙氨酸)、环-(S-脯氨酸-S-异亮氨酸)、环-(R-脯氨酸-R-亮氨酸)、环-(S-脯氨酸-R-缬氨酸)、酪醇和2-(4-乙酰氧基苯基)乙醇中的一种或多种。
8.一种耐盐组合物，其特征在于，包括权利要求7所述单体化合物中的一种或多种。
9.权利要求1～6任一项所述的耐盐菌剂、权利要求7所述的水相粗提物或权利要求8所述的耐盐组合物在提高植物耐盐性和/或制备植物耐盐产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述植物包括水稻。
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