CN115927101A - 一种混菌发酵剂及其在发酵生物基质中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物基质技术领域，具体涉及一种混菌发酵剂及其在发酵生物基质中的应用。该发酵剂是由发酵剂A和发酵剂B组成；所述发酵剂A为非洲哈茨木霉Ta97发酵粉剂；所述发酵剂B为产脲节杆菌Fp64发酵粉剂。本发明草莓专用生物基质中所添加的两种菌剂，两菌配合起到了动态调节根际磷素的功能，有利于根际健康微生态的建立。对草莓具有显著的促生作用的同时，显著减少了磷素流失，起到净化效果。另外产脲节杆菌Fp64还具有高IAA活性。该基质对草莓具有显著的促生作用。
Description
技术领域
本发明属于生物基质技术领域，具体涉及一种混菌发酵剂及其在发酵生物基质中的应用。
背景技术
据统计，我国已成为世界草莓生产和消费第一大国，因其具有较高的营养价值且风味鲜美，经济价值高，草莓种植面积及产量整体均呈上升趋势。草莓也是我国重要的设施化栽培作物，尤其在温度较低的北方地区，设施草莓产业规模逐年增加。在设施农业中，基质是最重要的基础物质，尤其在草莓种植中，从育苗到结果繁殖均离不开栽培基质。
常规的基质由营养物质（包括泥炭等）和具有透气保水等作用的辅料（包括蛭石、椰丝、珍珠岩等）组成。其中泥炭属于不可再生的自然资源，随着需求量日益增加，开采对自然破坏严重，已被严格管控，同时成本上涨显著。农业废弃物中秸秆、牛粪的发酵物是泥炭的良好替代，合理利用下既可以降低基质生产成本，又可以促进农业碳循环，具有良好的应用前景。其中玉米秸秆是我国存量最大的作物秸秆，牛粪也是主要的畜禽养殖废弃物。秸秆牛粪混合堆肥发酵制备基质，相较于仅秸秆发酵或仅牛粪发酵，可有效平衡碳氮比、促进物料腐熟和调节孔隙率含水量等的作用。不过目前生产中以堆肥自然腐解为主，腐解速率受限于木质纤维素的聚合晶体结构中木质素降解速率，发酵腐熟时间长达2~3个月，造成堆肥品质不稳定。另外，由于草莓为须根系且根系纵深较浅，对栽培基质的孔隙度、容重有严格的需求，且通用基质产品中施加的磷素易被固定，造成磷素缺乏，针对这些问题，亟需精准匹配的草莓专用基质产品。
发明内容
针对现有技术中存在的现有草莓基质产品存在的技术缺陷等问题，本发明的目的之一为提供了一种混菌发酵剂。
本发明还提供了一种混菌发酵剂在发酵生物基质中的应用，制备得到的生物基质兼具磷素调节、微生态改善和促生功能。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种混菌发酵剂，是由发酵剂A和发酵剂B组成；所述发酵剂A为非洲哈茨木霉Ta97发酵粉剂，保藏编号为CGMCC No. 19930；所述发酵剂B为产脲节杆菌Fp64发酵粉剂，保藏编号为CGMCC No. 15644。
本发明还提供了一种上述混菌发酵剂在发酵制备生物基质中的应用。
进一步的，该生物基质的制备过程具体包括以下步骤：
（1）将玉米秸秆、水洗牛粪按比例混合，调节含水量，得堆肥发酵原料；
（2）将堆肥发酵原料进行初次发酵，得初次发酵产物；
（3）将初次发酵产物中加入非洲哈茨木霉Ta97发酵粉剂，进行二次发酵，得二次发酵产物；
（4）向二次发酵产物中加入产脲节杆菌Fp64发酵粉剂，得混合物A；
（5）将蛭石、椰丝和珍珠岩混合均匀得混合物B；
（6）将混合物A和混合物B按比例混合即得生物基质。
进一步的，步骤（1）中，所述玉米秸秆的粒径为1 ~ 2 cm；所述玉米秸秆与水洗牛粪的体积比为2.5 ~ 4.5 : 1；所述调节含水量至30% ~ 40%。
进一步的，步骤（2）中，所述初次发酵的具体过程为：将堆肥发酵原料置于槽式发酵车间发酵，物料高度2米以上，每3 ~ 4天翻抛一次，60°C以上时间为7天，当温度在60°C ~70°C时，保持间歇通风，温度高于70°C时即刻翻堆，持续通风，获得待发酵物料，然后继续每2 ~ 3天翻抛一次，间歇通风，保持40°C ~ 50°C时间为10天，获得初次发酵物料。
进一步的，步骤（3）中，所述非洲哈茨木霉Ta97发酵粉剂的菌落总数为1×109cfu/g；所述非洲哈茨木霉Ta97发酵粉剂与初次发酵产物的重量比为1:10000；所述二次发酵的过程为：每1天翻抛一次，间歇通风，保持25°C ~ 35°C时间为10d。
进一步的，步骤（4）中，所述产脲节杆菌Fp64发酵粉剂的菌落总数为6×109 cfu/g；所述产脲节杆菌Fp64发酵粉剂与二次发酵产物的重量比为1:1000。
进一步的，步骤（5）中，所述蛭石、椰丝和珍珠岩按体积比5 ~ 6 : 2 ~ 3 : 1 ~2。
进一步的，步骤（6）中，所述混合物A和混合物B的体积比为2 ~ 5 ： 1 ~ 2。
本发明还提供了一种利用上述方法发酵制备得到的生物基质作为草莓栽培专用基质中的应用。
上述所述非洲哈茨木霉Ta97除了专利ZL202011309961.2记载的木质素降解酶的生物特征，还具有高效解磷作用，7天解磷量达到525.26 ± 22.70 mg/L。
上述所述产脲节杆菌Fp64除了专利ZL201810547376.2记载的聚磷的，还具有高产IAA能力，IAA产量达到255.94 ± 13.25 mg/L。
采用本发明的技术方案，与已知的公有技术相比，具有如下有益效果：
（1）本发明的草莓专用基质制备工艺创新的采用槽式分段式发酵工艺，分别实现消毒（60~70°C）、本底降解菌群富集（40~50°C）和快速腐熟发酵（25~40°C），最长32天内即可完成腐熟发酵，相比较现有技术一般为2~3个月大大缩短了腐熟时间。
（2）本发明的草莓专用生物基质采用玉米秸秆-水洗牛粪发酵物替代传统的泥炭，利用高效木质纤维素降解菌剂通过精准调控发酵参数，槽式堆肥发酵获得保留一定量短纤维的发酵物，进而制备在孔隙度、容重等关键指标上适配草莓生长需求的基质。相比较采用泥炭的通用基质，本发明一方面更加低碳环保，更重要的是可以根据作物根系特点调节孔隙度，草莓适应性更好，富集的微生物多样性高，具有良好的微生态生长环境。
（3）由于草莓生长对磷素的需求较为敏感，大量磷肥施入后易被转化为难溶状态，但又易被水淋流失。本发明草莓专用生物基质中所添加的两种菌剂，其中非洲哈茨木霉Ta97具有高效解磷作用，产脲节杆菌Fp64具有聚磷作用，通过解磷作用活化被固定的磷肥，通过聚磷作用储藏多余的活性磷素，两菌配合起到了动态调节根际磷素的功能，有利于根际健康微生态的建立。对草莓具有显著的促生作用的同时，显著减少了磷素流失，起到净化效果。另外产脲节杆菌Fp64还具有高IAA活性。该基质对草莓具有显著的促生作用。
菌种保藏信息
（一）产脲节杆菌Fp64
保藏时间：2018年4月26日，
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，
保藏编号：CGMCC No. 15644，
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101
分类命名：产脲节杆菌
Arthrobacter ureafaciens
（二）非洲哈茨木霉Ta97
保藏时间：2020年7月14日，
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，
保藏编号：CGMCC No. 19930，
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101
分类命名：非洲哈茨木霉
Trichoderma afroharzianum。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明
实施例1
非洲哈茨木霉Ta97解磷量的测定
在PDA固体平板上活化Ta97菌株，制备分生孢子悬浊液。取108孢子/mL以1%接种量接种于液体解磷培养基（1L培养基中包含：葡萄糖10 g, (NH4)2SO4 0.5 g, NaCl 0.3 g,KCl 0.3 g, MgSO4·7H2O 0.3 g, FeSO4·7H2O 0.03 g, MnSO4·H2O 0.03 g, Ca3(PO4) 25g，调pH至7.0）中，在26℃ ± 0.5℃、130 rpm条件下培养7天，获得发酵液。对照为不加木霉分生孢子悬浊液的液体解磷培养基，3个生物学重复。将发酵液在4℃、10000 rpm离心5min，取上清稀释到合适倍数，采用钼锑抗比色法测定可溶性磷含量，计算公式为：Y = m×15.91×A，式中Y为发酵液中可溶磷含量（mg/L），m为稀释倍数，A为660 nm处吸光度值。经检测，非洲哈茨木霉Ta97的7天解磷量为525.26 ± 22.70 mg/L。
实施例2
产脲节杆菌Fp64的IAA产量测定
在LB固体平板上活化Fp64菌株，在30℃、160 rpm条件下在LB液体培养基中震荡培养，获得种子液（OD600 = 0.6）。将种子液按1%接种量接种于产IAA液体培养基（1L培养基中包含：葡萄糖10 g, (NH4)2SO4 1.0 g, K2HPO4, 2.0 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, NaCl 0.1 g,酵母膏0.5 g, CaCO3 0.5 g，L-色氨酸 0.5 g, 调pH至7.0）中，30℃、160 rpm培养72 h。以不接种菌株的产IAA液体培养基为对照，3次生物学重复。将发酵液在4℃、12000 rpm离心20min，取上清液。利用GC-MS检测发酵上清液中的IAA含量。经检测，产脲节杆菌Fp64的IAA产量为255.94 ± 13.25 mg/L。
实施例3
本发明草莓专用生物基质的制备工艺，具体包括如下步骤:
步骤1、将1 cm长的玉米秸秆和水洗牛粪按3 : 1比例混合，调节含水量为30%，即为堆肥发酵原料；
步骤2、将堆肥发酵原料置于槽式发酵车间发酵，物料高度2米以上，每3天翻抛一次，60°C以上时间为7天，当温度在60°C ~ 70°C时，保持间歇通风，温度高于70°C时即刻翻堆，持续通风。获得待发酵物料。
步骤3、继续每2天翻抛一次，间歇通风，保持40~50°C时间为10天，获得初次发酵物料。
步骤4、木霉菌剂为1×109 cfu/g的非洲哈茨木霉Ta97发酵粉剂，保藏编号为CGMCC No. 19930，木霉菌剂与初次发酵产物按重量比为1 : 10000混合均匀，每1天翻抛一次，间歇通风，保持25°C~35°C时间为10天，获得二次发酵产物。
步骤5、节杆菌菌剂为6×109 cfu/g的产脲节杆菌Fp64发酵粉剂，保藏编号为CGMCC No. 15644，节杆菌菌剂与二次发酵产物按重量比为1:1000混合均匀得混合料A，蛭石、椰丝和珍珠岩按体积比5 : 2 : 1混合均匀的混合料B，向混合料A中加入混合料B，混料A和混料B的体积比为2 : 1混合均匀，即制得草莓专用生物基质。
本实施例制得的草莓专用生物基质，理化和生物指标为：粒径13.52 ± 2.32 mm，含水量46.25 ± 6.23%，总孔隙度69.25 ± 5.25 %，容重0.25 ± 0.01 g/cm3，速效磷含量230.42 ± 24.62 mg/kg，有机质含量77.32% ± 4.42%，EC值为0.5，pH 5.8 ± 0.4，非洲哈茨木霉Ta97浓度为5×108 cfu/g，产脲节杆菌Fp64浓度为6×106 cfu/g。
本实施例制得草莓专用生物基质，发酵需27天，制备基质共需28天。
实施例4
本发明草莓专用生物基质的制备工艺，具体包括如下步骤:
步骤1、将2 cm长的玉米秸秆、水洗牛粪按比例混合，调节含水量为40%，即为堆肥发酵原料；
步骤2、将堆肥发酵原料置于槽式发酵车间发酵，物料高度2米以上，每4天翻抛一次，60°C以上时间为7天，当温度在60°C ~ 70°C时，保持间歇通风，温度高于70°C时即刻翻堆，持续通风。获得待发酵物料。
步骤3、继续每3天翻抛一次，间歇通风，保持40 ~ 50°C时间为10天，获得初次发酵物料。
步骤4、木霉菌剂为1×109 cfu/g的非洲哈茨木霉Ta97发酵粉剂，保藏编号为CGMCC No. 19930，木霉菌剂与初次发酵产物按重量比为1 : 10000混合均匀，每2天翻抛一次，间歇通风，保持25°C~40°C时间为15天，获得二次发酵产物。
步骤5、节杆菌菌剂为6×109 cfu/g的产脲节杆菌Fp64发酵粉剂，保藏编号为CGMCC No. 15644，节杆菌菌剂与二次发酵产物按重量比为1 : 1000混合均匀得混合料A，蛭石、椰丝和珍珠岩按体积比6 : 3 : 2混合均匀的混合料B，向混合料A中加入混合料B，混料A和混料B的体积比为5 : 2混合均匀，制得草莓专用生物基质。
本实施例制得的草莓专用生物基质，理化和生物指标为：粒径12.01 ± 3.90 mm，含水量51.04 ± 7.91%，总孔隙度71.18 ± 9.55 %，容重0.29 ± 0.01 g/cm3，速效磷含量250.02 ± 45.84 mg/kg，有机质含量78.37% ± 8.73%，EC值为0.6， pH 6.2 ± 0.1，非洲哈茨木霉Ta97浓度为4 × 108 cfu/g，产脲节杆菌Fp64浓度为6 × 106 cfu/g。
本实施例制得草莓专用生物基质，发酵需32天，制备基质共需33天。
对比例1
将实施例4中的步骤4的非洲哈茨木霉Ta97发酵粉剂替换为不含任何活菌的硅藻土，其余步骤同实施例4，得到对比例1的基质
对比例2
将实施例4中的步骤5的产脲节杆菌Fp64发酵粉剂替换为不含任何活菌的硅藻土，其余步骤同实施例4，得到对比例2的基质
对比例3
实施例4中的步骤4替换为：
步骤4、木霉菌剂为1×109 cfu/g的非洲哈茨木霉Ta97发酵粉剂，保藏编号为CGMCC No. 19930，木霉菌剂与初次发酵产物按重量比为1 : 10000混合均匀。节杆菌菌剂为6×109 cfu/g的产脲节杆菌Fp64发酵粉剂，保藏编号为CGMCC No. 15644，节杆菌菌剂与初次发酵产物按重量比为1 : 1000混合均匀。每2天翻抛一次，间歇通风，保持25°C~40°C时间为15天，获得二次发酵产物。
实施例4中的步骤5替换为：
步骤5、蛭石、椰丝和珍珠岩按体积比6 : 3 : 2混合均匀的混合料，向二次发酵产物中加入混合料，二次发酵产物和混料的体积比为5 : 2混合均匀。
其余步骤同实施例4，得到对比例3的基质。
效果验证试验
（一）采用实施例3和实施例4中制备的草莓专用生物基质作为处理，对比例1、对比例2、对比例3制备的基质和购买市面上草莓专用基质（泥炭、椰丝、蛭石、珍珠岩的体积比为8 : 2 : 4 : 1）作为对照，在设施大棚种植草莓。草莓品种为白雪公主，将所有处理置于同样环境同时种植统一管理。在草莓生长过程中，移栽30 d后，每处理随机取20株草莓苗，测量生长指标，草莓成熟后统计每棵果数、单果重，检测可溶性糖、维生素C含量，计算平均值及差异统计。具体结果如表1所示：
表1 草莓专用生物基质对草莓的促生作用(
p<0.05)
本发明的草莓专用生物基质对草莓具有显著的促生作用，且显著提升了草莓的风味品质。
（二）取实施例5中各处理和对照的草莓根际土，提取总DNA，采用16S扩增子高通量测序，分析细菌菌群多样性，结果如表2所示：
表2 草莓专用生物基质对草莓根际微生物多样性的提高作用(
p<0.05)
本发明的草莓专用生物基质显著提高了草莓根际菌群多样性，改善了草莓根际微生态环境。
Claims (10)
1.一种混菌发酵剂，其特征在于，是由发酵剂A和发酵剂B组成；所述发酵剂A为非洲哈茨木霉Ta97发酵粉剂，保藏编号为CGMCC No. 19930；所述发酵剂B为产脲节杆菌Fp64发酵粉剂，保藏编号为CGMCC No. 15644。
2.一种如权利要求1所述的混菌发酵剂在发酵制备生物基质中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）将玉米秸秆、水洗牛粪按比例混合，调节含水量，得堆肥发酵原料；
（2）将堆肥发酵原料进行初次发酵，得初次发酵产物；
（3）将初次发酵产物中加入非洲哈茨木霉Ta97发酵粉剂，进行二次发酵，得二次发酵产物；
（4）向二次发酵产物中加入产脲节杆菌Fp64发酵粉剂，得混合物A；
（5）将蛭石、椰丝和珍珠岩混合均匀得混合物B；
（6）将混合物A和混合物B按比例混合即得生物基质。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（1）中，所述玉米秸秆的粒径为1~2cm；所述玉米秸秆与水洗牛粪的体积比为2.5~4.5 : 1；所述调节含水量至30~40%。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，所述初次发酵的具体过程为：将堆肥发酵原料置于槽式发酵车间发酵，物料高度2米以上，每3~4天翻抛一次，60°C以上时间为7天，当温度在60~70°C时，保持间歇通风，温度高于70°C时即刻翻堆，持续通风，获得待发酵物料，然后继续每2~3天翻抛一次，间歇通风，保持40~50°C时间为10天，获得初次发酵物料。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，所述非洲哈茨木霉Ta97发酵粉剂的菌落总数为1×109 cfu/g；所述非洲哈茨木霉Ta97发酵粉剂与初次发酵产物的重量比为1:10000；所述二次发酵的过程为：每1天翻抛一次，间歇通风，保持25~35°C时间为10d。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（4）中，所述产脲节杆菌Fp64发酵粉剂的菌落总数为6×109 cfu/g；所述产脲节杆菌Fp64发酵粉剂与二次发酵产物的重量比为1:1000。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（5）中，所述蛭石、椰丝和珍珠岩按体积比5~6 : 2~3 : 1~2。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，步骤（6）中，所述混合物A和混合物B的体积比为2~5：1~2。
10.一种如权利要求2-9任一项所述的发酵制备得到的生物基质作为草莓栽培专用基质中的应用。
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