CN116410869A - 一株被孢霉f34、菌剂及其在促进土壤结构形成和作物生长中的应用 - Google Patents

一株被孢霉f34、菌剂及其在促进土壤结构形成和作物生长中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116410869A
CN116410869A CN202211478572.1A CN202211478572A CN116410869A CN 116410869 A CN116410869 A CN 116410869A CN 202211478572 A CN202211478572 A CN 202211478572A CN 116410869 A CN116410869 A CN 116410869A
Authority
CN
China
Prior art keywords
soil
mortierella
microbial inoculum
fermentation
fermentation culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211478572.1A
Other languages
English (en)
Inventor
李芳�
苗玉红
韩燕来
司亚坤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henan Agricultural University
Original Assignee
Henan Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henan Agricultural University filed Critical Henan Agricultural University
Priority to CN202211478572.1A priority Critical patent/CN116410869A/zh
Publication of CN116410869A publication Critical patent/CN116410869A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/30—Microbial fungi; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P21/00—Plant growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K17/00—Soil-conditioning materials or soil-stabilising materials
    • C09K17/14—Soil-conditioning materials or soil-stabilising materials containing organic compounds only
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2101/00—Agricultural use
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02W—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES RELATED TO WASTEWATER TREATMENT OR WASTE MANAGEMENT
    • Y02W30/00—Technologies for solid waste management
    • Y02W30/40—Bio-organic fraction processing; Production of fertilisers from the organic fraction of waste or refuse

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Soil Sciences (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于微生物菌剂技术领域，具体涉及一株被孢霉F34、菌剂及其在促进土壤结构形成和作物生长中的应用。本发明提供了一株被孢霉(Mortierella sp.)F34，保藏编号为：CGMCC No.40122。结果表明，该株被孢霉F34在秸秆添加下通过产生胞外多聚物多糖、胞外多聚物蛋白和胞外多聚物腐殖酸来有效促进土壤团聚体的形成、提高土壤平均重量直径；施用被孢霉F34菌剂能够调节作物根系激素水平来促进玉米的生长，显著促进小麦的根系及地上部的生长；有效激活土壤微生物活性，提高土壤中微生物量碳氮含量；活化土壤中各种形态的有机磷和无机磷提升土壤肥力。

Description

一株被孢霉F34、菌剂及其在促进土壤结构形成和作物生长中 的应用
技术领域
本发明属于微生物菌剂技术领域，具体涉及一株被孢霉F34、菌剂及其在促进土壤结构形成和作物生长中的应用。
背景技术
早期被孢霉属真菌主要应用在发酵产生不饱和脂肪酸方面，近年来，随着研究的加强，被孢霉属真菌应用在农业上已有部分报道，被孢霉属真菌已经成为目前真菌微生物肥料开发的研究热点。如李芳等从长期施有机肥的砂姜黑土的中分离出一株长孢被孢霉，发现其在促进土壤碳氮磷循环及促进作物生长中发挥了关键作用(Li F，Chen L，Redmile-Gordon.et al，2018.Mortierella elongata’s roles in organic agriculture andcrop growth promotion in mineral soil.Land Degradation&Development 29,1642-1651)。宁琪等研究发现两种被孢霉的联合接种显著提高了土壤中有效氮磷的含量，显著改变了红壤中细菌群落结构(宁琪，陈林，李芳等，被孢霉对土壤养分有效性和秸秆降解的影响，土壤学报，2022)。陈林等从盐碱土中分离出一株被孢霉并证实了其在盐碱土上可优化微生物的群落结构、促进土壤磷素的溶解，降低小麦叶片中的钠钾比(一株高山被孢霉及其应用，中国专利CN201911042908.8，陈林，张佳宝，李含放等，2022)。团聚体是高生产力土壤的基本属性之一，团聚体能通过调节土壤水分运移、养分循环来提高土壤肥力，其形成的多孔结构为土壤微生物提供了异质化的环境，有利于土壤有机碳的封存和作物根系的穿插生长。目前还未报道被孢霉促进土壤团聚体形成方面的研究。
发明内容
本发明的目的提供一株被孢霉F34，该株被孢霉F34可以有效促进土壤团聚体的形成、提高土壤平均重量直径。
为了解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一株被孢霉(Mortierella sp.)F34，保藏编号为：CGMCC No.40122。
本发明提供了一种含有上述技术方案所述被孢霉F34的菌剂，所述菌剂中被孢霉F34的活性菌丝数量为≥106cfu/g。
本发明提供了一种上述技术方案所述菌剂的制备方法，包括如下步骤：被孢霉F34第一发酵培养后得到第一发酵混合物，对所述第一发酵混合物接种到第二发酵培养基进行第二发酵培养得到菌剂；所述第一发酵培养的时间为7～10d；所述第二发酵培养至被孢霉F34菌丝完全覆盖发酵培养基为止。
优选的，所述第一发酵培养的培养基为PD液体培养基，所述第一发酵培养的温度为25～30℃，第一发酵培养的转速为120～180rpm。
优选的，所述第二发酵培养的温度为25～30℃。
优选的，所述第二发酵培养的培养基包括以下重量份的成分：麦麸65～75份、蔗糖2-3份、黄腐酸0.08-0.12份和水90～110份。
优选的，所述接种时所述第一发酵混合物与第二发酵培养基的体积比为(15～25)mL：100mL。
本发明提供了上述技术方案所述的被孢霉F34或上述技术方案所述的菌剂或上述技术方案任一项所述的制备方法制备得到的菌剂在如下(1)～(4)中一种或多种中的应用；
(1)促进土壤团聚体形成；
(2)促进磷酸三钙溶解；
(3)促进植物生长；
(4)促进土壤磷素转化。
优选的，所述植物包括小麦或玉米。
优选的，菌剂施用在土壤中，所述施用时菌剂与土壤质量比为1:(200～1000)。
本发明的有益效果：本发明提供了一株被孢霉(Mortierellasp.)F34，保藏编号为：CGMCCNo.40122。本发明的被孢霉F34可以有效促进土壤团聚体的形成、提高土壤平均重量直径。应用结果表明，该株被孢霉(Mortierellasp.)F34在秸秆添加下通过产生胞外多聚物多糖、胞外多聚物蛋白和胞外多聚物腐殖酸来有效促进土壤团聚体的形成、提高土壤平均重量直径；施用被孢霉(Mortierellasp.)F34菌剂能够调节作物根系激素水平来促进玉米的生长，显著促进小麦的根系及地上部的生长；有效激活土壤微生物活性，提高土壤中微生物量碳氮含量；有效促进土壤中有机磷和无机磷各种形态的活化来促进土壤肥力提升。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1实施例2被孢霉F34在马铃薯葡萄糖培养基和实施例1被孢霉F34土壤培养基上的生长情况；图1中a代表马铃薯葡糖培养基正面，b代表马铃薯葡萄糖培养基背面，c代表土壤培养基；
图2为实施例2被孢霉F34在土壤培养基上生长的扫描电镜能谱分析图；图2中，A为菌丝产生的胞外多聚物(EPS)，B为菌丝对土壤颗粒的缠绕，C为菌丝在矿物颗粒表面的生长，D为菌丝在矿物表面生长的能谱分析图；
图3为实施例3和对比例4被孢霉F34对小麦根系生长的促进作用；图3中对比例代指对比例4，右边实施例代指实施例3；
图4为实施例5和对比例5接种被孢霉F34对玉米生长的促进作用，图4中左边对比例2棵为对比例5，右边对比例2棵为实施例5；
图5为F34的ITS1区的比对相似度最高的序列截图。
生物保藏说明
被孢霉(Mortierellasp.)F34，于2022年3月31日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCCNo.40122。
具体实施方式
本发明提供了一株被孢霉(Mortierellasp.)F34，保藏编号为：CGMCCNo.40122。其ITS序列如SEQ ID NO：1所示。
SEQ ID NO：1序列：
CGAAGGTTTTCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTCATAATAAGTGTT
TTATGGCACTTTTTAAATCCATATCCACCTTGTGTGCAATGTCAGTCGATC
TTCTTTATGGAGATTGGCCAAACATCAACCATATCTTTTAACTCTTTGTCT
GAAAAATATTATGAATAAACAATTCAAAATACAACTTTCAACAACGGATC
TCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGT
GAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCATATTGCGCTC
TTTGGTATTCCGAAGAGCATGCTTGTTTGAGTATCAGTAAACACCTCAAA
GCTTTTGATTTTTTTTTGAAAGCTTTGGACTTGAGCAATCCCAACACCAAT
CTTTTTTAGATTGGAGGCGGGTTGCTTGAAATGCAGGTGCAGCTGGACAT
TCTCCTGAGCTAAAAGCATATTCATTTAGTCCCGTCAAACGGATTATTACT
TTTGCTGCAGCTAACATAAAGGGAGTTTGACCGTATTGGCTGACTGATGC
AGGATTTCACAGGGGTCGGCAACGACGCTTGTTAAACTCGATCTCAAATCAAGTAAGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA。
本发明优选采用以下方法，对F34进行鉴定：
1)取5μL Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR于灭菌离心管中。
2)用灭菌牙签或枪头挑取单菌落，置于离心管中搅动几下后取出。
3)80℃热变性15min后，中间取出快速震荡以保证热变性充分，5000rpm离心5min。
4)取裂解后的上清液作为PCR反应的模板。使用引物为扩增真菌ITS1和ITS2区的ITS1/ITS4引物，PCR扩增体系和扩增程序见表1-1。
表1-1PCR扩增体系和扩增程序
Figure BDA0003960315300000041
5)扩增结束后，用1.2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测合格的样品进行普通测序。
6)测序得到的序列手动去掉引物序列之后，通过National Center forBiotechnology Information数据库进行核酸BLAST，初步确定菌株的分类信息，构建F34的系统发育树。
系统发育树的构建方法为：
将测序得到的被孢霉F34序列1放入NCBIblast进行比对，网址为https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝BlastSea rch&LINK_LOC＝blasthome
采用的数据为Internal transcribed spacer region(ITS)from Fungi typeand reference，比对优化条件选择Highly similar sequences(megablast)，其余条件选用默认条件。
对结果进行分析，发现该序列特异性比较强，与之相似的序列相似度低于97％(最高仅为96.82％，覆盖度91％)，不符合鉴定到种的条件，F34序列比对结果见图5。基于以上分析以及菌落形态特征鉴定，申请人将该菌株命名为被孢霉(Mortierella sp.)F34。
本发明所述的被孢霉(Mortierella sp.)F34是从河南省原阳县的国家潮土肥力肥效试验中长期秸秆还田处理耕层土壤中分离、培养获得。本发明的被孢霉(Mortierellasp.)F34源于长期进行秸秆还田的农田土壤，将被孢霉F34应用在农业领域，可以实现绿色生态农业，以确保食品的优质性与安全性。本发明的被孢霉属真菌F34具有长效性，能够在土壤中自行生长繁殖，与土著微生物群落达到生态稳定平衡，无需重复添加。本发明的被孢霉属真菌F34很少产分生孢子。
本发明提供了一种含有上述技术方案所述被孢霉F34的菌剂，所述菌剂中被孢霉F34的活性菌丝数量为≥106cfu/g。
本发明所述菌剂中被孢霉F34的活性菌丝数量为≥106cfu/g，更优选为2×106cfu/g。
本发明提供了一种含有上述技术方案所述菌剂的制备方法，包括如下步骤：被孢霉F34第一发酵培养后得到第一发酵混合物，对所述第一发酵混合物接种到第二发酵培养基进行第二发酵培养得到菌剂。
本发明的被孢霉(Mortierellasp.)F34的扩大培养过程简单，培养成本低，制备成生物菌剂的方法也十分简单，具有可操作性，在农业领域推广应用。
在本发明中，被孢霉F34第一发酵培养后得到第一发酵混合物，本发明优选将被孢霉F34接种到第一发酵培养基中进行第一发酵培养。本发明所述被孢霉F34接种于PD液体培养基之前优选保存于PDA培养基。本发明所述接种时对被孢霉F34的接种量没有特殊限制，采用本领域常规接种量即可。本发明所述第一发酵培养基优选为PD液体培养基；本发明所述PD液体培养基优选包括如下质量份的组分：去皮马铃薯180～220份、葡萄糖18～22份和水900～1100份，更优选为去皮马铃薯200份、葡萄糖20份和水1000份。本发明优选所述PD液体培养基的pH自然。
本发明所述所述第一发酵的温度优选为25～30℃，进一步优选为26～29℃，更优选为28℃，本发明所述第一发酵培养的转速优选为120～180rpm，进一步优选为140～160rpm，更优选为150rpm，第一发酵培养的时间优选为7～10d，更优选为8～9d。本发明所述第一发酵培养优选被孢霉F34出现大量白色黄豆状菌丝球为止。本发明所述第一发酵培养是为了获得更多的菌丝片段和接合孢子。
得到第一发酵混合物后，本发明对所述第一发酵混合物接种到第二发酵培养基进行第二发酵培养得到菌剂。在本发明中，所述接种时所述第一发酵混合物与第二发酵培养基的体积比优选为(15～25)：100，进一步优选为(18～23)：100，更优选为20：100。本发明所述第二发酵培养基的优选包括如下质量份的组分：麦麸65～75份、蔗糖2～3份、黄腐酸0.08～0.12份和水90～110份，pH自然，更优选包括以下重量份的成分：麦麸72份、蔗糖3份、黄腐酸0.1份和水100份，pH自然。
本发明所述第二发酵培养基优选通过如下方法制备得到：所述黄腐酸和蔗糖先溶解在水中后，得到含有黄腐酸和蔗糖的水，将麦麸和含有黄腐酸和蔗糖的水混合30min后得到混合物，得到第二发酵培养基。本发明所述麦麸优选为未发霉的干燥麦麸。本发明优选对第二发酵培养基进行高温灭菌后应用，本发明所述高温灭菌的条件为121℃条件下灭菌20min。
本发明所述第二发酵培养的温度25～30℃，进一步优选为26～28.5℃，更优选为28℃；本发明所述第二发酵培养至被孢霉F34菌丝完全覆盖发酵培养基为止。本发明所述第二发酵培养的时间优选为10～15d，进一步优选为11～14d，更优选为12d。本发明所述第二发酵培养的方式优选为静置培养，本发明对所述第二发酵培养的容器没有限定，采用常规的容器即可，本发明所述第二发酵培的培养容器优选为聚乙烯方形培养盒。
本发明提供了上述技术方案所述被孢霉F34或上述技术方案所述菌剂或上述技术方案所述制备方法制备得到的菌剂在如下(1)～(4)中一种或多种中的应用；
(1)促进土壤团聚体形成；
(2)促进磷酸三钙溶解；
(3)促进植物生长；
(4)促进土壤磷素转化。
本发明所述植物优选包括小麦或玉米。
本发明所述菌剂优选施用在土壤中，所述施用时菌剂与土壤质量比优选为1:(200～500)，更优选为1：350。当菌剂施用在大田中时，大田的菌剂施用量优选为所述菌剂与耕层深度0～15cm土壤的质量比为1:1000。
本发明的被孢霉(Mortierellasp.)F34通过促进土壤团聚体的形成、增加土壤中有机碳和可溶性碳氮含量、抵抗病原菌来促进土壤肥力提升。土壤磷素分级对于理解土壤磷的转化和作物磷吸收至关重要，目前已有研究多关注被孢霉接种后土壤有效磷的变化，但是对土壤不同活性态磷影响的研究很少。本发明的被孢霉(Mortierellasp.)F34接种到土壤中后，土壤中的速效磷、碳酸氢钠提取态磷、氢氧化钠提取态磷和盐酸提取态磷浓度均出现显著上升，说明被孢霉对土壤无机磷具有极强的活化作用。从有机磷的分组结果看，土壤中接种被孢霉F34后，显著增加了土壤中的碳酸氢钠和氢氧化钠提取态磷浓度。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1被孢霉F34对土壤团聚体形成的促进实验
选取过100目的干土100g，按5mg/kg的量加入过60目筛子的秸秆粉末0.5mg装入1L三角瓶中，透气封口膜封口后，121℃灭菌20min，放凉后再次灭菌，重复灭菌3-4次。秸秆粉的作用是为了帮助真菌F34在土壤中定植和生长。无菌条件下，灭菌后的土壤平铺到直径为70mm的无菌培养皿中，每个平板中装入土壤15g，加入无菌水5mL，之后接种被孢霉F34。在无菌条件下在土壤培养基的中心位置接种一个直径为0.8cm的琼脂块菌种。
在温度为25℃的条件下黑暗培养20天后，进行土壤团聚体分级及各级团聚体胞外多聚物(EPS)的提取测定。被孢霉F34在土壤培养基上的生长情况见图1中c。被孢霉F34在土壤培养基上生长的扫描电镜能谱分析图见图2。
对比例1、2
无菌条件下，灭菌后的土壤平铺到直径为70mm的无菌培养皿中，每个平板中装入土壤15g，加入无菌水5mL，不接种被孢霉属真菌F34作为阴性对照，对比例1，选择不灭菌的土著微生物作为阳性对照，即对比例2。在温度为25℃的条件下黑暗培养20天，其余条件同实施例1。
对实施例1和对比例1、2培养后的土壤进行土壤团聚体分级及提取测定各级团聚体胞外多聚物(EPS)。
测定方法为
选取长势较好的4板，轻柔混匀，成为一个混合土样，共有5个混合土样。(1)～(5)全部在超净台中进行：
(1)混合土样在250μm放入250μm筛子上，淹水5min；
(2)震动2min，振幅为3cm，频率为30次min；
(3)筛子上的土壤转移到灭菌培养皿中，＞250μm团聚体；
(4)水土混合液过53μm筛子，筛子上的土壤转移到灭菌培养皿中，为＞53μm并＜250μm团聚体；
(5)剩余水土混合液保留在保鲜盒中，超净台中过夜，吸取多余水分。超净台中吹风，晾到水土混合液的含水量为20％时，收集到保鲜袋中，分成2部分，-80℃保存用于测定EPS含量。
EPS提取方法如下：
(1)在50mL的聚丙烯离心管中加入0.1M CaCl2溶液30mL以去除可溶性有机质，加入3g含水量为20％的水土混合液。将离心管放在冰中，120rpm往复振动震荡1h。3200g离心30min后弃上清，从剩余的物质中提取EPS。
(2)15.98gCER与25ml缓冲液一起加入沉淀物中。120rpm往复振动震荡2h，之后4000g离心30min。
(3)缓冲液成分为2mM Na3PO4·12H2O(0.760g/L)，4mM NaH2PO4·H2O(0.552g/L)，9mM NaCl(0.526g/L)，1mM KCl(0.0746g/L)，最后使用1M HCl调节PH至7，并在4℃情况下预冷。CER(离子交换树脂‘Marathon C’钠形态，强酸性，20～50目)在上述缓冲液中预清洗两次，CER的含量是根据最高有机碳土壤所要求的178mgCERmg-1SOC所确定的。
(4)将含有EPC的上清液转移到新的试管中，液氮速冻后，-80℃保存用于测定EPS糖醛酸、EPS蛋白和EPS腐殖酸。
EPS uronic acid(EPS糖醛酸)的测定方法：
(1)选取200μL含有EPC的上清液，加入1.2mL的sodium tertraborate四硼酸钠(0.0125M，浓硫酸作物溶剂)溶液。涡旋45s100℃水浴5min，冰上冷却3min，之后加入20μL的m-间羟基联苯溶液(CAS#:580-51-8)混匀后，静置4min，520nm下测定吸光值。
(2)标准曲线的制作方法：D-glucuronic acid(CAS#:6556-12-3)曲线配制25μg/mL的D-glucuronic acid母液。分别吸取0，4，20，60，100和200μl的母液，用去离子水补充到200μl。之后重复步骤(1)得到不同母液的吸光值，制作标准曲线。标准曲线为：y＝0.0053x+0.0812，R2＝0.9978，其中y代表吸光度，x代表糖醛酸浓度。
采用Lowry方法测定EPS蛋白和EPS腐殖酸含量。
A液：将3.5g五水硫酸铜溶于100mL水中得到溶液(1)；将7.0g酒石酸钾钠(sodiumpotassium tartrate)溶于100mL水中溶液(2)；将70g碳酸钠溶于1L 0.35N的氢氧化钠溶液溶液(3)。溶液(1)、溶液(2)和溶液(3)按照1:1:100的体积比混合即可得到A液。
B液：去离子水、溶液(2)和溶液(3)按照体积比1：1:100即可混合获得。
1.每个样品3次重复，A板和B板每个孔分别加入50μL含有EPC的上清液样品，用PBS补充到100μL。
2.加入100μLA液，并吸打混匀。对照加入B液100μL。
3.两个板黑暗室温放置10min。
4.立即加入100μL的Folin-Phenol试剂终止反应。
5.30min后，750nm处测定吸光值。
Folin-Phenol试剂：2N福林酚试剂(Folinphenol)用水稀释10倍。
EPS蛋白和EPS腐殖酸的计算公式如下：其中，AbsA代表添加A液的板的吸光度，AbsB代表添加B液板的吸光度。
Abs蛋白＝1.25*(AbsA-AbsB)；
Abs蛋白的标准曲线为：y＝0.0009x+0.0089，R2＝0.9965；x为EPS蛋白浓度，y为1.25*(AbsA-AbsB)；
Abs腐殖酸＝AbSB-0.2Abs蛋白；
Abs腐殖酸＝AbSB-0.2*1.25*(AbsA-AbsB)；
Abs腐殖酸的标准曲线为：y＝0.0016x+0.0732，R2＝0.9943；x为EPS腐殖酸浓度，y为0.2*1.25*(AbsA-AbsB)。
结果见表1-2和表2。
根据表1-2可知，接种被孢霉F34显著提高了＞1mm、0.053～0.25mm粒级团聚体的占比，0.25～1mm、＜0.053mm粒级团聚占比显著下降。总体上看，土壤团聚体的平均重量直径显著增加，增幅达到了35％。进一步的，对团聚体各个粒级中胞外多聚物的含量进行测定。
表1-2实施例1和对比例1～2的土壤团聚体分级结果
Figure BDA0003960315300000091
注：不同的小写字母代表在p＝0.05水平上具有显著性。
表2实施例1和对比例1～2的土壤中各粒级团聚体中EPS含量
Figure BDA0003960315300000092
Figure BDA0003960315300000101
注：表中的数据代表平均值(标准差)，下同。NA代表没有检测到。不同的小写字母代表P＝0.05水平上的差异性。
根据表2可知，被孢霉F34的接种显著增加了＞1mm和＜0.053mm粒级团聚体中EPS蛋白含量，增幅分别为4.95倍和8.21倍；F34接种显著提高了土壤中所有粒级团聚体中的EPS糖醛酸含量，最大增幅出现在0.25～1mm粒级团聚体，增加了4倍，最小的增幅出现在0.053～0.25mm粒级团聚体，增幅为25％；同样的，F34的接种显著促进了土壤中所有粒级团聚体EPS腐殖酸含量的提升，提升幅度最大的是＜0.053mm粒级团聚体，增加了18倍，最小增幅出现在0.053～0.25mm粒级团聚体，增幅为5.76倍。综合来看，被孢霉F34分泌的EPS蛋白主要累积在＞1mm、＜0.053mm粒级团聚体中，分泌的EPS糖醛酸在各个粒级团聚体中均有累积，以＜0.053mm粒级团聚体累积的浓度最高，分泌的EPS腐殖酸在各个粒级团聚体中均有累积，其中以0.25～1mm粒级累积浓度最高。
实施例2被孢霉F34的纯培养条件下溶磷能力的测定
F34琼脂块菌种的制备方法：在超净工作台中挑取菌丝放在提前制备好的PDA平板培养基的中心，25℃黑暗正置培养5天，菌丝长满全板，即得到琼脂块菌种。用时采用对应大小的打孔器打孔，即可接种。
被孢霉F34在马铃薯葡萄糖培养基中的生长状况见图1中a和图1中b。
测定方法：准备足量外观干净均一的秸秆，用剪刀剪至1cm3大小。每升培养基中含有酵母提取物0.50g、秸秆20.0g、磷酸三钙5.0g、硫酸铵0.50g、氯化钾0.20g、七水硫酸镁0.10g、一水硫酸锰0.0001g、七水硫酸亚铁0.0001g，调节pH到7.0，培养基在121℃条件下灭菌20min。放凉后，1L培养瓶中接种直径1cm的F34琼脂块菌种2块。培养基接种F34琼脂块菌种后在温度为25℃，转速为170rpm的条件下摇床培养7d。
对比例3
空白琼脂块的制备方法：配制好的PDA培养基倒进培养皿，冷凝后即可得到琼脂块，厚度为0.3cm，PDA平板培养皿在25℃黑暗正置培养5天，即得到空白琼脂块。用时采用对应大小的打孔器打孔，即可。
对比例3接种空白琼脂块，其余条件同实施例2。
实施例2和对比例3分别培养7d结束后，静置60min后取实施例2和对比例2的培养瓶中的清澈的培养液测定还原糖的浓度。还原糖测定方法为DNS法(二硝基水杨酸法)，步骤如下：
DNS溶液配制方法：称取3.25g3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中，移入500mL容量瓶，加入2M氢氧化钠162.5mL，再加入22.5g丙三醇，摇匀后定容到500mL，避光储存于4℃冰箱备用。
准确吸取澄清培养基0.5mL到10mL玻璃试管中，加入DNS：1.5mL，沸水浴5min，立即冰上冷却，室温显色20min，540nm下用酶标仪进行比色。
标准曲线的制作方法：取2g的葡萄糖98℃烘干2h至恒重。准确称取1.0000g烘干后的葡萄糖，定容至1L。设置不同的梯度0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mg/mL。沸水浴5min后立即冰上冷却5min，室温显色20min，540nm比色即可。标准曲线为y＝0.2713x，R2＝0.9935；其中x为OD值吸光度，y为还原糖浓度。
实施例2和对比例3的培养液中的可溶性磷的测定方法如下：
分别准确吸取实施例2和对比例3的培养液1mL于25mL容量瓶中，再用滴定管准确加入蒸馏水12.5mL，然后移液管加入钼锑抗试剂2.5mL，摇匀，放置30min后，定容，摇匀后于700nm波长进行比色。
钼锑抗试剂：称取10.0g钼酸铵溶于250mL60℃水中，冷却定容至300ml；将181mL浓H2SO4(分析纯)缓缓注入800mL水中，冷却，然后将稀硫酸注入钼酸溶液中，搅匀；称取0.3g酒石酸锑钾，加入钼酸铵稀硫酸溶液中，用水定容至2升，此溶液称钼锑抗试剂，贮于棕色瓶中，可长期保存。
可溶性磷的测定时应用的标准曲线为y＝1.3935x，R2＝0.9959，x为吸光度值，y值为体系中正磷酸根的浓度。
筛洗实施例2和对比例3的容量为1L的培养瓶中的秸秆，用镊子去除表面的少量菌丝，培养瓶中的秸秆在50℃下烘干至恒重，烘干时间为12-24h，烘干之后称重，采用烘干差减法计算秸秆降解率。
根据表3可知，被孢霉F34接种对秸秆降解率无显著影响，却显著提高了实施例2的培养液中速效磷的含量，说明被孢霉F34对磷酸三钙的溶解具有极强的促进作用，培养基中组分的磷酸三钙是不溶于水的。实施例2的培养液中还原糖因被孢霉F34的吸收利用，还原糖浓度显著低于对比例3。
表3被孢霉F34的溶磷效果、降解率及培养液中的还原糖测定结果
Figure BDA0003960315300000121
注：“**”代表在P＝0.01水平上达到差异显著性，“*”代表在P＝0.05水平上达到差异显著性。
实施例3：被孢霉F34对苗期小麦根系的生长实验
营养土(购自河南丰沃农资有限公司的精制营养土)80g放入1L三角瓶中，调整到30％的含水量，透气封口膜封口后，在121℃条件下高温灭菌20min。营养土放凉后，无菌条件下播种小麦种子到营养土中，播种深度为1cm。同时接种实施例2制备的F34琼脂块菌种3块，接种深度为1cm。封口后在生化培养箱中培养，出苗2天后，无菌条件下剔苗，每瓶留苗1棵，在温度为25℃条件下光照培养16h，在温度为15℃条件下黑暗培养8h的，共培养15d。
对比例4
对比例4接种对比例2制备的3个空白琼脂块，其余条件同实施例3。
培养15天后结束实验。拍照采用根系扫描仪扫描实施例3和对比例4培养15d后的苗期小麦根系，结果见表4和图3。根据表4和图3可知，在营养土中接种被孢霉F34可显著促进小麦根系和小麦地上部的生长。实施例3的小麦的根冠数、交点数、总根长、总根面积和总根体积显著高于对比例4。
表4实施例3和对比例4的苗期小麦根系参数
Figure BDA0003960315300000122
注：“**”代表P＝0.01水平上有显著性，“*”代表P＝0.05水平上具有显著性。
实施例4被孢霉F34菌剂制备
1.接种在25～28℃条件下培养5～7d的PDA培养基上生长旺盛的被孢霉F34菌丝块至PD液体培养基中，置于恒温摇床28℃、220rpm培养7d，得到发酵混合物；
2.无菌条件下取10mL步骤1制备的发酵混合物加入20g发酵培养基(麦麸-蔗糖-黄腐酸培养基)中，立即摇匀；置于28℃静置培养；待到菌丝长满培养基表面及内部，用玻璃棒捣散，即得到被孢霉F34菌剂，菌剂的活性菌丝数量为2×106cfu/g。
采用的PD液体培养基组成为：去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、水1000mL，pH自然。
发酵培养基(麦麸-蔗糖-黄腐酸培养基)组成为：麦麸70g、蔗糖2g、黄腐酸0.1g和水90g，先将蔗糖和黄腐酸在水中充分溶解，之后加入麦麸中拌匀，pH为自然；装入500mL三角瓶中，121℃灭菌20min后，趁热摇散培养基。
实施例5
1.准确称取20g实施例4制备的新鲜菌剂，其活性菌丝和活性菌丝数量为2×106cfu/g，菌剂的含水量为15％，加入7kg砂质潮土中，充分混匀后装种植盆，在离种植盆盆口15cm处埋入烘干后准确称重的秸秆10g，秸秆装入150目双层尼龙袋中。为了保证菌种成活，土壤装好盆埋入秸秆后后立即浇水1L。
充分浇水后在种植盆中进行玉米(登海605)种植，于玉米(登海605)三叶期定苗，每盆留1株。种植盆中的玉米于人工气候室中进行培养，培养条件为14h光照(温度为28℃)，10h黑暗(温度为20℃)，气候室中的相对湿度70％。玉米种植期间按需浇水，定时除草。
对比例5
1.准确称取实施例4中灭菌处理的麦麸-蔗糖-黄腐酸培养基20g，加入7kg砂质潮土中，充分混匀后装盆。土壤装好盆埋入秸秆后立即浇水1L。
2.充分浇水后进行玉米(登海605)种植，于三叶期定苗，每盆留1株。玉米于人工气候室中进行培养。培养条件为14h光照(温度为28℃)，10h黑暗(温度为20℃)，人工气候室相对湿度70％。玉米种植期间按需浇水除草。
实施例5和对比例5的玉米抽雄期进行土壤中的养分、磷分组成测定，同时测定玉米植株生物量以及玉米根系激素含量。
玉米植株地上部生物量采用105℃杀青30min，80℃烘干的方法测定。
秸秆降解率采用烘干差减法，同实施例2的测定方法。
玉米根系激素吲哚乙酸、脱落酸、赤霉素、玉米素核苷含量采用酶联免疫法测定，试剂盒采用上海酶联生物公司的试剂盒进行。
中性磷酸酶采用上海科铭生物公司的试剂盒进行测定。中性磷酸酶活性单位定义：37℃条件下每克土壤每天释放1nmol酚为1个酶活性单位。
土壤中O2和CO2含量采用土壤氧气传感器SO-110和eosGP公司土壤CO2传感器测定。
土壤磷分组方法参考论文进行(Tian,J.,Boitt,G.,Black,A.,Wakelin,S.,Condron,L.M.,Chen,L.,2017.Accumulation and distribution of phosphorus in thesoil profile under fertilized grazed pasture.Agriculture Ecosystems&Environment 239,228-235)。提取的顺序为0.5M碳酸氢钠，0.1M NaOH-1，1M盐酸，最后0.1MNaOH-2。其中0.5M碳酸氢钠，0.1M NaOH-1提取的是易溶态的磷，1M盐酸和NaOH-2提取的是难溶的土壤磷。
土壤可溶性碳氮、微生物量碳氮的测定方法参考论文(Wu,J.,Joergensen,R.G.,Pommerening,B.,Chaussod,R.,Brookes,P.C.,1990.Measurement of soil microbialbiomass C by fumigation--extraction--an automated procedure.Soil Biology&Biochemistry 22,1167-1169.)。
植株全磷的测定方法参考与实施例2中保持一致。
叶片SPAD的测定采用SPAD仪(Aopgee MC-100)测定。
实施例5和对比例5的测定结果如表5～8及图4所示。接种被孢霉F34处理的土壤微生物量碳氮，增幅分别为14％和87％。实施例5的土壤中可溶性氮提高了8％。实施例5的土壤中的中性磷酸酶活性无显著变化。从无机磷分组的结果看，接种被孢霉F34后，土壤中速效磷、碳酸氢钠提取态磷、氢氧化钠提取态磷和盐酸提取态磷浓度均出现显著上升，说明被孢霉F34对土壤无机磷具有极强的活化作用。从有机磷的分组结果看，被孢霉F34的接种显著增加了碳酸氢钠和氢氧化钠提取态磷浓度。
接种被孢霉F34使得玉米生物量增加了11％，而植株的全磷含量没有显著增加，可能是生物量增加的稀释作用引起的。被孢霉F34的接种对玉米根系激素含量产生了极显著的影响。其中，生长素、赤霉素和玉米素核苷含量显著增加，脱落酸含量显著降低。
表5实施例5和对比例5的土壤指标的测定结果
Figure BDA0003960315300000141
/>
Figure BDA0003960315300000151
N＝4.*表示p＜0.05水平上的显著性，**表示p＜0.01水平上的显著性。
表6实施例5和对比例5的土壤各种形态无机磷的含量
Figure BDA0003960315300000152
N＝4.*表示p＜0.05水平上的显著性，**表示p＜0.01水平上的显著性。
表7实施例5和对比例5的土壤各种形态有机磷的含量
Figure BDA0003960315300000153
N＝4.*表示p＜0.05水平上的显著性，**表示p＜0.01水平上的显著性。
表8实施例5和对比例5的对玉米指标测定结果
Figure BDA0003960315300000154
/>
Figure BDA0003960315300000161
N＝4.*表示p＜0.05水平上的显著性，**表示p＜0.01水平上的显著性。
综上，本发明提供的被孢霉F34通过产生胞外多聚物多糖、胞外多聚物蛋白和胞外多聚物腐殖酸来有效促进土壤团聚体的形成、提高土壤平均重量直径；施用被孢霉F34菌剂能够调节作物根系激素水平来促进玉米的生长，显著促进小麦的根系及地上部的生长；有效激活土壤微生物活性，提高土壤中微生物量碳氮含量；活化土壤中各种形态的有机磷和无机磷提升土壤肥力。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一株被孢霉(Mortierella sp.)F34，其特征在于，保藏编号为：CGMCC No.40122。
2.一种含有权利要求1所述被孢霉F34的菌剂，其特征在于，所述菌剂中被孢霉F34的活性菌丝数量为≥106cfu/g。
3.一种如权利要求2所述被孢霉F34的菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：被孢霉F34第一发酵培养后得到第一发酵混合物，对所述第一发酵混合物接种到第二发酵培养基进行第二发酵培养得到菌剂；所述第一发酵培养的时间为7～10d；所述第二发酵培养至被孢霉F34菌丝完全覆盖发酵培养基为止。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述第一发酵培养的培养基为PD液体培养基，所述第一发酵培养的温度为25～30℃，第一发酵培养的转速为120～180rpm。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述第二发酵培养的温度为25～30℃。
6.根据权利要求3或5所述的制备方法，其特征在于，所述第二发酵培养应用的培养基包括以下重量份的成分：麦麸65～75份、蔗糖2～3份、黄腐酸0.08～0.12份和水90～110份。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述接种时所述第一发酵混合物与第二发酵培养基的体积比为(15～25)mL：100mL。
8.权利要求1所述的被孢霉F34或权利要求2所述的菌剂或权利要求3～7任一项所述的制备方法制备得到的菌剂在如下(1)～(4)中一种或多种中的应用；
(1)促进土壤团聚体形成；
(2)促进磷酸三钙溶解；
(3)促进植物生长；
(4)促进土壤磷素转化。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述植物包括小麦或玉米。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，菌剂施用在土壤中，所述施用时菌剂与土壤质量比为1:(200～1000)。
CN202211478572.1A 2022-11-23 2022-11-23 一株被孢霉f34、菌剂及其在促进土壤结构形成和作物生长中的应用 Pending CN116410869A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211478572.1A CN116410869A (zh) 2022-11-23 2022-11-23 一株被孢霉f34、菌剂及其在促进土壤结构形成和作物生长中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211478572.1A CN116410869A (zh) 2022-11-23 2022-11-23 一株被孢霉f34、菌剂及其在促进土壤结构形成和作物生长中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116410869A true CN116410869A (zh) 2023-07-11

Family

ID=87052121

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211478572.1A Pending CN116410869A (zh) 2022-11-23 2022-11-23 一株被孢霉f34、菌剂及其在促进土壤结构形成和作物生长中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116410869A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110438037B (zh) 一株具有溶磷作用的克雷伯氏菌p5及其应用
US20220033762A1 (en) Penicillium oxalicum SDF-25 strain and application thereof
CN107586743B (zh) 一株林木根际高效溶磷巨大芽胞杆菌及应用
CN107858296A (zh) 一株解磷、解钾和降解纤维素的黑曲霉及其菌剂的制备与应用
CN113980836B (zh) 贝莱斯芽孢杆菌及其在草莓根腐病防治中的应用
CN111057665B (zh) 一株产IAA的纤维素降解菌n3及其应用
CN114381378B (zh) 降解木质素的产黄青霉及其应用
CN111187737B (zh) 一种耐盐碱促生菌及其在盐碱地改良中的应用
CN113088471B (zh) 一株产iaa和cmc酶的普沙根瘤菌x2及其应用
CN116463220B (zh) 一株促进蓝莓生长的深色有隔dse真菌及其应用
CN104108964A (zh) 一种全营养微生物生防有机肥的制备方法与应用
CN113234601B (zh) 一株海洋真菌新种及其在植物抗干旱胁迫中的应用
CN115651846A (zh) 一种木霉菌剂、生物有机肥及其制备方法及应用
CN115725419A (zh) 一株解磷蓝莓内生木霉菌及其应用
CN115960766A (zh) 一种防治青枯病的微生物及其应用
CN114933978A (zh) 一种丛枝菌根真菌培养基质
CN114231425A (zh) 一株溶磷解钾菌黑曲霉z8及应用
CN116410869A (zh) 一株被孢霉f34、菌剂及其在促进土壤结构形成和作物生长中的应用
CN113817625A (zh) 一株酸性黄杆菌及其在改良盐碱土壤中的应用
CN110938575A (zh) 一株高效降解纤维菌株及其应用
AU2020103947A4 (en) Trichoderma viride, microbial agent, biological fertilizer and application
CN117551556B (zh) 一种新型解钾菌被孢霉2k4及其应用
CN114561319B (zh) 一种解钾菌及解钾菌肥
CN110272848B (zh) 一株具有解钾作用的根瘤菌j16及其应用
CN105861384B (zh) 一种硅酸盐岩高效溶蚀细菌液化沙雷氏菌nlx-15及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination