ES2959700T3

ES2959700T3 - Métodos de cribado para la selección de microorganismos capaces de impartir una propiedad beneficiosa a una planta

Info

Publication number: ES2959700T3
Application number: ES14886390T
Authority: ES
Inventors: Susan Jane Turner; Peter John Wigley
Original assignee: Bioconsortia Inc
Current assignee: Bioconsortia Inc
Priority date: 2014-03-19
Filing date: 2014-03-19
Publication date: 2024-02-27
Anticipated expiration: 2034-03-19
Also published as: EP3119903A4; WO2015142185A1; BR112016021566A2; EP3119903B1; NZ630873A; PT3119903T; DK3119903T3; EP3119903A1

Abstract

La invención se refiere a métodos para la selección, identificación y/o aplicación de microorganismos útiles para impartir propiedades beneficiosas a las plantas. En una realización, el método implica identificar uno o más marcadores de plantas asociados con una propiedad beneficiosa, someter una o más plantas a un medio de crecimiento en presencia de un conjunto de microorganismos, seleccionar una o más plantas sobre la base de que la una o más marcadores de plantas está presente, adquiriendo uno o más microorganismos asociados con la(s) planta(s) seleccionada(s) y repitiendo el proceso una o más veces. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de cribado para la selección de microorganismos capaces de impartir una propiedad beneficiosa a una planta

Campo

La presente invención se refiere a métodos para la selección de uno o más microorganismos capaces de impartir una o más propiedades beneficiosas a una planta.

Antecedentes

La geografía, condiciones ambientales, enfermedades y ataques de insectos son factores importantes que influyen en la capacidad de crecer y cultivar diferentes especies de plantas. Dichos factores pueden tener un importante impacto económico y social en las comunidades de todo el mundo. Sería beneficioso identificar productos y métodos que pudieran impartir propiedades beneficiosas a una especie de planta para permitirle crecer en una variedad de ubicaciones geográficas, en diferentes condiciones climáticas, sobrevivir a enfermedades y ser resistente, por ejemplo al ataque de insectos.

Subsiste una demanda cada vez mayor de plantas que tienen otras características deseables tales como calidad mejorada, niveles aumentados o disminuidos de ciertos compuestos, sabor, olor, color u otras propiedades físicas o químicas mejorados o diferentes.

Para este fin se han utilizado técnicas de reproducción selectivas. La reproducción selectiva se basa principalmente en la diversidad genética en una población inicial acoplada con la selección para lograr un cultivar de planta con características beneficiosas para el uso humano. A medida que ha disminuido la diversidad genética disponible y no utilizada de especies de plantas cultivables, ha disminuido el potencial de mejora. Esta situación ha estimulado el crecimiento de la modificación genética de plantas en la que genes de especies estrechamente relacionadas se introducen en el nuevo cultivar para proporcionar una nueva base genética para impartir rasgos deseables a nuevos cultivares. Sin embargo, este proceso es extremadamente costoso, lento, de alcance limitado y plagado de dificultades regulatorias. Se han obtenido pocos éxitos comerciales a partir de más de dos décadas de inversiones a gran escala en esta tecnología.

A pesar de muchas décadas de investigaciones científicas exitosas sobre la reproducción convencional de cultivos altamente productivos y el desarrollo de cultivos transgénicos, se ha dirigido relativamente poco esfuerzo de investigación al desarrollo de rasgos vegetales por otros medios.

Los jardineros domésticos y los productores de alimentos orgánicos han comprendido la importancia de proporcionar a las plantas un suelo “bueno” con una rica diversidad microbiana a través de compost y fertilizantes biomateriales complejos, por ejemplo, sangre y huesos, para garantizar su crecimiento saludable. Sin embargo, los inventores han reconocido que no se comprende bien la complejidad de las asociaciones planta-microorganismo que sustentan los beneficios observables. Los beneficios para el crecimiento y la salud de las plantas en dichos suelos a menudo están mediados por microbios a través de una mejor disponibilidad de nutrientes. Esto puede ser el resultado de la solubilización de minerales de la propia biomasa del suelo, o de la colonización de las plantas con microorganismos en asociaciones endofíticas, epífitas o rizosféricas que conducen a la fijación de nitrógeno, resistencia a plagas y enfermedades a través de la competencia microbiana directa dentro de la planta, o la provocación de reacciones de defensa de las plantas. La comunidad científica ha producido literatura sobre los diversos mecanismos de asociaciones de microorganismos vegetales endófitos, epífitos y rizosféricos, en gran medida en relación con las plantas de cultivo y sus suelos. Se conoce la naturaleza de algunas asociaciones, que abarcan la base genética de la producción de metabolitos inducida por las plantas por de organismos específicos y la influencia inversa del microbio en la expresión genética de la planta (por ejemplo, Neotyphodium spp), y se han documentado aumentos en el crecimiento de las plantas después de la aplicación microbiana a ciertas plantas de cultivo o semillas. Sin embargo, a pesar del potencial de los microorganismos para mejorar el crecimiento de las plantas, el éxito comercial se limita a un rango relativamente pequeño de aplicaciones microbianas específicas, por ejemplo, Rhizobium spp. para semillas de leguminosas, o el uso de productos resultantes de fermentaciones microbianas “ incontroladas”, por ejemplo, tés de compost, fermentaciones de algas marinas, fermentaciones de desechos de pescado, etc.

Hay muchas cepas específicas de microorganismos potencialmente beneficiosos para asociación con cultivares de plantas específicos, lo que hace que la tarea de encontrar una(s) cepa(s) apropiada(s) para cualquier cultivo en particular sea un procedimiento muy pesado. Los medios actuales se centran principalmente en la aplicación de microorganismos solos o en combinaciones limitadas. Es probable que dichos microorganismos hayan sido seleccionados por propiedades potenciales específicas en base a su identidad. Sería útil si no fuera necesario conocer la identidad microbiana para tener éxito. El documento WO2012/125050 describe métodos para el cribado, identificación y/o aplicación de microorganismos y/o composiciones de uso para impartir propiedades beneficiosas a las plantas.

Los detalles bibliográficos de las publicaciones a las que aquí se hace referencia se recogen al final de la descripción.

Objeto

Un objeto de la presente invención es proporcionar un método para la selección de uno o más microorganismos que sean útiles para impartir una o más propiedades beneficiosas a una planta que supere o mejore al menos una de las desventajas de los métodos conocidos.

En el presente documento también se divulga un método para identificar nuevos marcadores de plantas para la reproducción de plantas con rasgos beneficiosos.

En el presente documento también se divulga un método para identificar nuevos marcadores de microorganismos que pueden identificar que el microorganismo tiene un rasgo que es útil para impartir una o más propiedades beneficiosas a una planta.

En el presente documento también se divulga un método y/o sistema para ayudar en la mejora de una o más plantas.

Declaración de invención

La presente invención está definida por las reivindicaciones adjuntas.

En un primer aspecto de la presente invención se proporciona un método para la selección de uno o más microorganismos capaces de impartir una o más propiedades beneficiosas a una planta, el método comprende al menos las etapas de:

a) someter una o más plantas (que incluyen, por ejemplo, semillas, plántulas, esquejes y/o propágulos de las mismas) a un medio de crecimiento en presencia de un primer conjunto de uno o más microorganismos, en el que la una o más plantas se somete a al menos una presión selectiva;

b) seleccionar una o más plantas siguiendo la etapa a) en base a uno o más rasgos fenotípicos de la planta;

c) adquirir un segundo conjunto de uno o más microorganismos asociados con dicha una o más plantas seleccionadas en la etapa b);

d) repetir las etapas a) a c) una o más veces, en las que el segundo conjunto de uno o más microorganismos adquiridos en la etapa c) se utiliza como el primer conjunto de microorganismos en la etapa a) de cualquier repetición sucesiva;

en el que al menos una ronda del método comprende la etapa de identificar una asociación entre (i) la una o más propiedades beneficiosas y (ii) uno o más marcadores de plantas y/o uno o más marcadores de microorganismos después de la etapa b) y/o después etapa c), en donde el marcador de planta es al menos un QTL (Locus de Rasgo Cuantitativo), y/o en la que el marcador de microorganismo se selecciona del grupo que consiste en un polimorfismo, una mutación, una variación alélica, presencia o ausencia de expresión de uno o más genes, nivel de expresión de uno o más genes, presencia o ausencia de producción de uno o más compuestos por un microorganismo, y nivel de producción de uno o más compuestos por un microorganismo.

El método de acuerdo con el primer aspecto se puede denominar en el presente documento como “un método de la invención” o “el método de la invención”.

En el presente documento también se divulga un método (denominado en el presente documento “un método de la divulgación” o “el método de la divulgación”) para la selección de uno o más microorganismos capaces de impartir una o más propiedades beneficiosas a una planta, el método comprende al menos las etapas de:

a) identificar uno o más marcadores de plantas asociados con una o más propiedades beneficiosas;

b) someter una o más plantas (que incluyen, por ejemplo, semillas, plántulas, esquejes y/o propágulos de las mismas) a un medio de crecimiento en presencia de un primer conjunto de uno o más microorganismos;

c) seleccionar una o más plantas después de la etapa b) en base a que uno o más marcadores de plantas están presentes;

d) adquirir un segundo conjunto de uno o más microorganismos asociados con dicha una o más plantas seleccionadas en la etapa c);

e) repetir las etapas a) a d) y/o las etapas b) a d) una o más veces, en las que el segundo conjunto de uno o más microorganismos adquiridos en la etapa d) se utiliza como el primer conjunto de microorganismos en la etapa b) de cualquier repetición sucesiva.

En una realización del método de la invención o método de la divulgación, el segundo conjunto de uno o más microorganismos se aísla de dicha una o más plantas en la etapa d (método de la divulgación) o en la etapa c (método de la invención).

En una realización del método de la invención o método de la divulgación, donde se adquieren dos o más microorganismos en la etapa d) (método de la divulgación), o en la etapa c) (método de la invención), el método comprende además las etapas de separar los dos o más microorganismos en aislados individuales, seleccionar dos o más aislados individuales y luego combinar los dos o más aislados seleccionados. Los aislados combinados se pueden utilizar entonces en cualesquiera repeticiones sucesivas del método o cualquier parte del mismo. Además, se pueden realizar dos o más métodos o partes de los mismos por separado y combinar uno o más microorganismos adquiridos en el método de la divulgación y/o el método de la invención. En una realización, los microorganismos combinados se utilizan en cualesquiera rondas sucesivas del método o parte del mismo.

En otra realización del método de la invención o método de la divulgación, el método comprende además repetir las etapas a) a d) o las etapas b) a d) (método de la divulgación) o las etapas a) a c) (método de la invención) una o más veces, en el que cuando se adquieren dos o más microorganismos en la etapa d) (método de la divulgación) o en la etapa c) (método de la invención), los dos o más microorganismos se separan en aislados individuales, dos o más los aislados individuales se seleccionan y luego se combinan, y aislados combinados se utilizan en la etapa b) (método de la divulgación) o en la etapa a) (método de la invención) de cualquier repetición sucesiva. De acuerdo con lo anterior, cuando se hace referencia al uso de uno o más microorganismos adquiridos en la etapa d) (método de la divulgación) o la etapa c) (método de la invención) del método, se debe considerar que incluye el uso de los aislados combinados de esta realización.

En otra realización, se pueden realizar dos o más métodos de la invención por separado y se pueden combinar uno o más microorganismos adquiridos en la etapa d) (método de la divulgación) o en la etapa c) (método de la invención) de cada método separado. En una realización, los microorganismos combinados se utilizan en la etapa b) (método de la divulgación) o en la etapa a) (método de la invención) cuando se realiza un método adicional de la invención.

Se aplican una o más presiones selectivas en la etapa b) (método de la divulgación) o en la etapa a) (método de la invención).

En una realización, la presión selectiva es biótica e incluye, pero no se limita a, la exposición a uno o más organismos que son perjudiciales para la planta. En una realización, los organismos incluyen hongos, bacterias, virus, insectos, ácaros y nematodos.

En otra realización, la presión selectiva es abiótica. Las presiones selectivas abióticas incluyen, pero no se limitan a, exposición o cambios en el nivel de concentración de sal, temperatura, pH, agua, minerales, nutrientes orgánicos, nutrientes inorgánicos, toxinas orgánicas, toxinas inorgánicas y metales.

En una realización, la presión selectiva se aplica sustancialmente durante todo el tiempo durante el cual la una o más plantas se someten al medio de crecimiento y a uno o más microorganismos. En una realización, la presión selectiva se aplica sustancialmente durante todo el período de crecimiento de una o más plantas. Alternativamente, la presión selectiva se aplica en un momento discreto.

En una realización, una o más presiones selectivas aplicadas en repeticiones sucesivas son diferentes. En otra realización, la(s) presión(es) selectiva(s) aplicada(s) en repeticiones sucesivas es la misma.

En una realización, el método comprende además la siguiente etapa que se lleva a cabo antes de la etapa a) (método de la divulgación o método de la invención) o etapa b) (método de la divulgación): someter la una o más plantas (que incluye, por ejemplo semillas, plántulas, esquejes y/o propágulos de los mismos) a un medio de crecimiento en presencia de uno o más microorganismos, y después de un período deseado, aislar uno o más microorganismos asociados con dicha una o más plantas. En una realización preferida, en el proceso se utilizan uno o más microorganismos adquiridos de la una o más plantas. En una realización, esta etapa se puede realizar dos o más veces.

En una realización del método de la invención o método de la divulgación, los métodos se combinan, en cualquier orden o combinación. Dicho método puede repetirse cualquier número de veces.

En una realización del método de la invención o método de la divulgación, el primer conjunto y/o el segundo conjunto de uno o más microorganismos se seleccionan de los microorganismos que se detallan a continuación.

En una realización del método de la invención o método de la divulgación, el medio de crecimiento se selecciona de los medios de crecimiento que se detallan en el presente documento a continuación.

En una realización del método de la invención o método de la divulgación, el medio de crecimiento es selectivo para un marcador de interés específico.

En una realización del método de la invención o método de la divulgación, el marcador en cada repetición iterativa de los métodos de la invención podría ser el mismo o diferente. Se pueden evaluar dos o más marcadores en cada iteración del método.

En otra realización del método de la invención o método de la divulgación, se pueden seleccionar una o más plantas en base a la presencia de uno o más marcadores en combinación con uno o más criterios de selección diferentes.

En una realización del método de la invención o método de la divulgación, el uno o más criterios de selección incluyen uno o más rasgos fenotípicos. En una realización preferida, uno o más rasgos fenotípicos son un rasgo fenotípico deseable. En una realización, el rasgo fenotípico es uno de los que se detallan a continuación. En una realización, el uno o más criterios de selección es uno o más rasgos genotípicos. En una realización preferida, uno o más rasgos genotípicos son un rasgo genotípico deseable. En una realización, el uno o más criterios de selección es una combinación de uno o más rasgos genotípicos y uno o más rasgos fenotípicos. En una realización, se pueden utilizar diferentes criterios de selección en cada iteración de un método de la invención.

En una realización del método de la invención o método de la divulgación, la etapa de someter una o más plantas a un medio de crecimiento implica hacer crecer o multiplicar la planta.

En una realización del método de la invención o método de la divulgación, dos o más plantas se someten a un medio de crecimiento en presencia de uno o más microorganismos. En otras realizaciones, se someten de 10 a 20 plantas a un medio de crecimiento en presencia del primer conjunto de uno o más microorganismos. En otras realizaciones, 20 o más, 100 o más, 300 o más, 500 o más, o 1000 o más plantas se someten a un medio de crecimiento en presencia del primer conjunto de uno o más microorganismos.

En una realización del método de la invención o método de la divulgación, el segundo conjunto de uno o más microorganismos se adquiere de la raíz, el tallo y/o el tejido foliar (que incluye el reproductivo) de la una o más plantas seleccionadas. Alternativamente, el segundo conjunto de uno o más microorganismos se adquiere a partir de tejido vegetal completo de una o más plantas seleccionadas. En otra realización, los tejidos vegetales se pueden esterilizar en superficie y luego se pueden adquirir uno o más microorganismos de cualquier tejido de una o más plantas. Esta realización permite la selección dirigida de microorganismos endofíticos. En otra realización, el uno o más microorganismos se pueden adquirir del medio de crecimiento que rodea a las plantas seleccionadas.

En otra realización del método de la invención o método de la divulgación, el segundo conjunto de uno o más microorganismos se utiliza en cualquier repetición sucesiva del método en forma cruda.

En una realización del método de la invención o método de la divulgación, uno o más microorganismos se adquieren en cualquier momento después de la germinación de la una o más plantas.

En una realización, el método de la invención o el método de la divulgación también puede ser útil para identificar y/o seleccionar uno o más microorganismos endofíticos capaces de impartir una o más propiedades beneficiosas a una planta.

En una realización, se puede utilizar material vegetal (que incluye, por ejemplo, semillas, plántulas, esquejes y/o propágulos de los mismos) como fuente de microorganismos para la etapa a). En una realización preferida, el material vegetal utilizado como fuente de microorganismos en la etapa a) es material de semilla. Preferiblemente, el material vegetal se esteriliza en superficie.

En otra realización, el método de la invención o el método de la divulgación puede ser útil para identificar y/o seleccionar uno o más microorganismos no cultivables capaces de impartir una o más propiedades beneficiosas a una planta. En esta realización, se puede utilizar material vegetal (que incluye, por ejemplo, semillas, plántulas, esquejes y/o propágulos de los mismos) como fuente de microorganismos para la etapa a). En una realización preferida, el material vegetal utilizado como fuente de microorganismos en la etapa a) es material de explante (por ejemplo, esquejes de plantas). Preferiblemente, el material vegetal se esteriliza en superficie.

En el presente documento y sin formar parte de la invención, también se divulga un método para ayudar en la mejora de una o más plantas, que comprende disponer la evaluación de dicha(s) planta(s) en presencia de uno o más microorganismos y/o composiciones.

De acuerdo con una realización, la(s) planta(s) está(n) destinada(s) a crecer en una primera región. El(los) microorganismo(s) puede(n) o no estar presente(s) (o al menos en una medida significativa) en la primera región.

“Región” y “primera región” se deben interpretar en sentido amplio en el sentido de una o más áreas de tierra. Las áreas de tierra se pueden definir por límites geográficos/políticos/privados o por áreas de tierra que tienen propiedades similares como clima, propiedades del suelo, presencia de una plaga particular, etc.

Preferiblemente, la evaluación se realiza en una segunda región en la que el(los) microorganismo(s) está(n) presente(s), pero esto no es en modo alguno esencial. Los microorganismos se pueden obtener de otras fuentes, que incluyen depósitos de microorganismos, y asociar artificialmente con material vegetal y/o suelo. Además, aunque las plantas se pueden cultivar esencialmente de una manera convencional pero, en una realización particular en una región que tiene microorganismos normalmente no asociados con las plantas, al menos en la primera región, alternativamente se pueden utilizar entornos de cultivo artificiales como lo apreciarán aquellos expertos en la técnica. Por tanto, se pueden identificar posibles relaciones microorganismo/planta beneficiosas que no necesariamente se utilizarían normalmente.

Preferiblemente, la etapa de disponer comprende disponer uno o más de:

- recepción o transmisión de una identidad de una o más plantas o tipos de plantas que se van a evaluar;

- recepción o transmisión de material vegetal de una o más plantas o tipos de plantas que se van a evaluar; identificación y/o selección del(los) microorganismo(s) y/o composición(es);

adquisición del(los) microorganismo(s) y/o composición(es); y

asociación del(los) microorganismo(s) y/o la(s) composición(es) con el material vegetal.

Preferiblemente, el método comprende evaluar (o disponer dicha evaluación de) dicha(s) planta(s) en presencia de dicho(s) microorganismo(s) y/o composición(es).

La etapa de evaluar preferiblemente comprende realizar uno o más de las etapas de un método descrito en el presente documento, en realizaciones particulares de un método del primer aspecto, segundo aspecto, octavo (y/o relacionado) aspecto o noveno (y/o relacionado) aspecto de la invención.

Las diversas etapas identificadas anteriormente se pueden realizar por una sola entidad, aunque se prefiere que estén involucradas al menos dos partes, una primera que realiza una solicitud y una segunda que ejecuta la solicitud. Tenga en cuenta que varios agentes pueden actuar para una o ambas partes y que se pueden utilizar distintos niveles de automatización. Por ejemplo, en respuesta a una solicitud particular, el(los) microorganismo(s) se puede(n) seleccionar por un procesador que consulta una base de datos basada en asociaciones de microorganismos conocidas para esa planta o planta(s) similar(es) con poca o ninguna entrada requerida por parte del operador.

Además, la evaluación se puede realizar por la parte solicitante y/o en la primera región. Realizar la evaluación en la primera región garantiza mejor que la evaluación sea precisa y que no se consideren factores ambientales imprevistos que puedan afectar a la(s) planta(s) o el(los) microorganismo(s).

Después de la evaluación o durante el transcurso de la misma, el método preferiblemente comprende además uno o más de:

- recibir o enviar uno o más microorganismos (o al menos la identidad de los mismos) y/o composición(es) a la primera región, incluso en combinación con material vegetal; y

- hacer crecer dicha(s) planta(s) u otras plantas (preferiblemente que tengan propiedades similares) en la primera región en presencia de dicho(s) microorganismo(s) y/o composición(es).

El método para ayudar a la mejora de una o más plantas se podrá realizar por una primera parte:

- identificar una necesidad de mejora en una(s) planta(s);

- enviar la identidad de las mismas y/o material vegetal relevante a una segunda parte junto con cualquier información relevante, y

- recibir material vegetal y/o uno o más microorganismos y/o las identidades de los mismos y/o composición(es).

La etapa de recepción se realiza preferiblemente después o como resultado de una evaluación de las asociaciones planta/microorganismo y/o planta/composición. Preferiblemente, la evaluación se realiza utilizando un método como se describe en el presente documento.

El método para ayudar en la mejora de una o más plantas puede realizarse adicional o alternativamente por una segunda parte:

- recibir una identidad de una(s) planta(s) y/o material vegetal relevante de una primera parte junto con cualquier información relevante, y

- enviar el material vegetal y/o uno o más microorganismo(s) y/o las identidades de los mismos y/o composición(es) a la primera parte.

La etapa de envío se realiza preferiblemente después o como resultado de una evaluación de las asociaciones planta/microorganismo y/o planta/composición. Preferiblemente, la evaluación se realiza utilizando un método descrito en el presente documento.

En el presente documento y sin formar parte de la invención, también se divulga un sistema para implementar el método para ayudar en la mejora de una o más plantas.

El sistema incluye preferiblemente uno o más de:

- medios para recibir o transmitir una identidad de una o más plantas o tipos de plantas que se van a evaluar;

- medios para recibir o transmitir material vegetal de una o más plantas o tipos de plantas que se van a evaluar;

- medios para identificar y/o seleccionar microorganismo(s) y/o composición(es);

- medios para adquirir el(los) microorganismo(s) y/o la(s) composición(es);

- medios para asociar el(los) microorganismo(s) y/o la(s) composición(es) con el material vegetal;

- medios para evaluar dicha(s) planta(s) en presencia de dicho(s) microorganismo(s) y/o composición(es);

- medios para recibir o enviar uno o más microorganismos (o al menos la identidad de los mismos) y/o composición(es) a la primera región, incluso en combinación con material vegetal; y

- medios para hacer crecer dicha(s) planta(s) u otras plantas (preferiblemente que tienen propiedades similares) en la primera región en presencia de dicho(s) microorganismo(s) y/o composición(es).

Se pueden utilizar medios conocidos por aquellos expertos en la técnica para proporcionar la funcionalidad requerida en el sistema del tercer aspecto. Por ejemplo, se pueden utilizar medios de comunicación convencionales, que incluyen Internet, para transmitir las identidades de plantas/microorganismos; se pueden utilizar medios portadores convencionales para transportar el material vegetal/microorganismos/composición(es); se pueden utilizar medios y procesos convencionales para asociar un microorganismo y/o composición con el material vegetal y se pueden utilizar medios convencionales para evaluar dicha(s) planta(s) y/o las asociaciones planta/microorganismo y/o planta/composición. El sistema se puede realizar en una instalación configurada para transmitir solicitud(es) para una mejora en una(s) planta(s) y posteriormente para recibir material vegetal y/o uno o más microorganismos y/o las identidades de los mismos, preferiblemente después o como resultado de una evaluación de asociaciones planta/microorganismos. Preferiblemente, la evaluación se realiza utilizando un método descrito en el presente documento.

El sistema se puede realizar adicional o alternativamente mediante una instalación configurada para recibir una identidad de una(s) planta(s) y/o material vegetal relevante junto con cualquier información relevante; y enviar material vegetal y/o uno o más microorganismos y/o las identidades del mismo y/o composición(es), preferiblemente después o como resultado de una evaluación de asociaciones planta/microorganismo o planta/composición. Preferiblemente, la evaluación se realiza utilizando un método descrito en el presente documento.

En el presente documento, y sin formar parte de la invención, también se describe un microorganismo adquirido, seleccionado o aislado mediante un método como el descrito anteriormente en el presente documento. El microorganismo puede ser un endófito. El microorganismo puede no ser cultivable.

En el presente documento y sin formar parte de la invención también se describe un método para la producción de una composición para apoyar el crecimiento, la calidad y/o la salud de las plantas, o una composición para suprimir o inhibir el crecimiento, la calidad y/o la salud de una planta, el método comprende las etapas de un método descrito en el presente documento anteriormente y la etapa adicional de combinar uno o más microorganismos seleccionados por el método con uno o más ingredientes adicionales.

En el presente documento y sin formar parte de la invención también se describe una composición que comprende uno o más microorganismos descritos en el presente documento o preparados mediante un método para la producción de una composición como se describe en el presente documento.

En el presente documento también se describe un método para la selección de una composición que es capaz de impartir una o más propiedades beneficiosas a una planta, el método comprende al menos las etapas de:

a) cultivar uno o más microorganismos seleccionados mediante un método del primer aspecto y/o del segundo aspecto en uno o más medios para proporcionar uno o más cultivos;

b) separar el uno o más microorganismos del uno o más medios en el uno o más cultivos después de un período de tiempo para proporcionar una o más composiciones sustancialmente libres de microorganismos;

c) someter una o más plantas (que incluyen, por ejemplo, semillas, plántulas, esquejes y/o propágulos de las mismas) a una o más composiciones de la etapa b);

d) seleccionar una o más composiciones de la etapa c) si se observa que imparte una o más propiedades beneficiosas a la una o más plantas.

a) cultivar uno o más microorganismos seleccionados mediante un método del primer aspecto y/o el segundo aspecto de la invención en uno o más medios para proporcionar uno o más cultivos;

b) inactivar uno o más cultivos de la etapa a) para proporcionar una o más composiciones que contienen uno o más microorganismos inactivados;

d) seleccionar una o más composiciones de la etapa c) si se observa que imparte una o más propiedades beneficiosas a una o más plantas.

En el presente documento también se describe un método para la selección de uno o más microorganismos que son capaces de producir una composición que es capaz de impartir una o más propiedades beneficiosas a una planta, el método comprende al menos las etapas de:

b) separar el uno o más microorganismos del uno o más medios en el uno o más cultivos de la etapa a) después de un período de tiempo para proporcionar una o más composiciones sustancialmente libres de microorganismos;

d) seleccionar uno o más microorganismos asociados con una o más composiciones observadas para impartir una o más propiedades beneficiosas a una o más plantas.

a) cultivar uno o más microorganismos en uno o más medios para proporcionar uno o más cultivos;

b) separar el uno o más microorganismos del uno o más medios en uno o más cultivos después de un período de tiempo para proporcionar una o más composiciones sustancialmente libres de microorganismos;

d) seleccionar uno o más microorganismos asociados con (o en otras palabras utilizados para producir la) una o más composiciones observadas que imparten una o más propiedades beneficiosas a una o más plantas; y,

e) utilizar uno o más microorganismos seleccionados en la etapa d) de un método del primer aspecto de la invención o en la etapa c) del segundo aspecto de la invención.

Adecuadamente, en el método para la selección de uno o más microorganismos que sean capaces de producir una composición que sea capaz de impartir una o más propiedades beneficiosas a una planta, la etapa b) se podría sustituir por la etapa de b) inactivar el uno o más cultivos de la etapa a) para proporcionar una o más composiciones que contienen uno o más microorganismos inactivados, y luego utilizar esta composición en la etapa c) del proceso.

Se debe apreciar que los métodos descritos en el presente documento se pueden combinar en cualquier combinación, que incluye los métodos que se ejecutan de forma concurrente o secuencial en cualquier número de iteraciones, con composiciones y/o microorganismos seleccionados, adquiridos o aislados de los métodos que se utilizan individualmente o combinados y utilizado en rondas iterativas de cualquiera de los métodos. A modo de ejemplo, se puede realizar un método para la selección de una composición y seleccionar una composición. La selección de una composición indica que uno o más microorganismos separados del medio en la etapa b) son deseables para impartir propiedades beneficiosas a una o más plantas (ya que uno o más microorganismos son capaces de producir una composición seleccionada). El uno o más microorganismos se pueden utilizar luego en otra ronda de un método descrito en el presente documento. Alternativamente, la combinación de métodos podría ejecutarse a la inversa. Esto podría repetirse cualquier número de veces en cualquier orden y combinación. De acuerdo con lo anterior, se divulga el uso de uno o más microorganismos, composiciones o plantas adquiridas, seleccionadas o aisladas mediante un método descrito en el presente documento. En el presente documento se divulga y sin formar parte de la invención se divulga una composición obtenida como resultado de los métodos descritos en el presente documento.

En el presente documento se divulga y sin formar parte de la invención se divulga una combinación de dos o más microorganismos adquiridos, seleccionados o aislados mediante un método como el descrito anteriormente en el presente documento.

En el presente documento se divulga y sin formar parte de la invención se divulga el uso de una o más composiciones y/o microorganismos adquiridos, seleccionados o aislados mediante un método de la invención para impartir una o más propiedades beneficiosas a una o más plantas.

Se debe apreciar que el método de la invención o el método de la divulgación también puede implicar aplicar las etapas a) a e) (método de la divulgación) o las etapas a) a d) (método de la invención) a dos o más especies diferentes de planta para identificar combinaciones de microorganismos que pueden impartir un beneficio positivo a una especie y un beneficio negativo a otra especie simultáneamente. Por ejemplo, es posible que se desee identificar un grupo de microorganismos que puedan mejorar simultáneamente el crecimiento y la supervivencia de un cultivo alimentario y suprimir o inhibir el crecimiento de un cultivo o maleza competidora. Esto se puede lograr al utilizar dos o más especies de plantas diferentes o ejecutar métodos separados en diferentes especies y en puntos apropiados combinando los microorganismos adquiridos en esos métodos y llevar a cabo iteraciones adicionales.

En el presente documento y sin formar parte de la invención, también se divulgan plantas seleccionadas en un método de la invención.

En el presente documento también se divulga el uso de un método descrito en el presente documento (que incluye el método de la invención) en un programa de reproducción de plantas, y un programa de reproducción de plantas que comprende llevar a cabo un método descrito en el presente documento.

En el presente documento también se describe un método para identificar uno o más marcadores de plantas que están asociados con uno o más rasgos beneficiosos, el método comprende al menos la etapa de llevar a cabo un método de la divulgación de la invención e identificar uno o más marcadores de plantas.

En el presente documento también se describe un método para identificar uno o más marcadores de microorganismos que están asociados con uno o más rasgos beneficiosos de la planta, el método comprende al menos la etapa de llevar a cabo un método de la invención o divulgación e identificar uno o más marcadores de microorganismos.

En el presente documento también se describe un método para identificar una combinación de uno o más marcadores de plantas y uno o más marcadores de microorganismos que comprende al menos la etapa de llevar a cabo un método de la invención o divulgación e identificar la combinación de uno o más marcadores de plantas y uno o más marcador de microorganismos.

Figuras

La divulgación resultará evidente a partir de la siguiente descripción, que se proporciona únicamente a modo de ejemplo, con referencia a las figuras acompañantes, en las que:

La Figura 1: muestra un sistema como se describe en el presente documento;

La Figura 2: muestra el flujo de proceso de un método como se describe en el presente documento.

Realización(es) preferida(s)

El(los) inventor(es) han descubierto que se pueden identificar fácilmente microorganismos capaces de impartir una o más propiedades beneficiosas a una o más plantas a través del uso de un método de la invención. El método se basa en términos generales en la presencia de variabilidad (tal como variabilidad genética o variabilidad en el fenotipo, por ejemplo) en las plantas y poblaciones microbianas utilizadas. Los inventores han identificado que esta variabilidad se puede utilizar para apoyar un proceso dirigido de selección de uno o más microorganismos de uso para una planta y para identificar combinaciones particulares de planta/microbio que son beneficiosas para un propósito particular, y que tal vez nunca hayan sido reconocidos utilizando técnicas convencionales.

Los métodos de la invención se pueden utilizar como parte de un programa de reproducción de plantas. Los métodos pueden permitir, o al menos ayudar con, la selección de plantas que tienen un genotipo/fenotipo particular que está influenciado por la flora microbiana, además de identificar microorganismos y/o composiciones que son capaces de impartir una o más propiedades a una o más plantas.

Los métodos de la invención pueden ser útiles para mejorar la eficiencia de los programas de reproducción de cultivos mediante el uso de selección dirigida de microbios asociados a cultivos que influyen en los rasgos fenotípicos bajo el control de loci de rasgos cuantitativos (QTL). Los métodos pueden manipular indirectamente la expresión de QTL de cultivos que controlan la variabilidad hereditaria de los rasgos y los mecanismos fisiológicos subyacentes a los rasgos deseables, tales como la compartimentación de la biomasa, la tolerancia al estrés abiótico, la resistencia a plagas y enfermedades y la asimilación de nutrientes.

Los métodos de la invención se pueden utilizar para ayudar a mejorar las plantas al identificar microorganismos que optimicen la expresión de marcadores de plantas.

Como se utiliza en el presente documento, un “marcador” de planta pretende significar cualquier rasgo fenotípico o genotípico. En determinadas realizaciones incluye elementos genéticos, que incluyen loci de rasgos cuantitativos (QTL), cualquier variación genética que incluye, pero no se limita a, polimorfismos (SNP, RFLP), mutaciones y variación alélica, la presencia o ausencia o nivel de expresión de uno o más genes, la presencia o ausencia o nivel de producción de uno o más compuestos por una planta, que incluyen uno o más metabolitos.

Como se utiliza en el presente documento, un “marcador” de microorganismo pretende significar cualquier rasgo fenotípico o genotípico. En determinadas realizaciones incluye elementos genéticos, cualquier variación genética que incluye, pero no se limita a, polimorfismos (SNP, RFLP), mutaciones y variación alélica, la presencia o ausencia o nivel de expresión de uno o más genes, la presencia o ausencia o nivel de producción de uno o más compuestos por un microorganismo, que incluyen uno o más metabolitos.

La invención se refiere a un método para identificar uno o más microorganismos capaces de impartir una o más propiedades beneficiosas a una planta. Se debe apreciar que, cuando se hace referencia en el presente documento, a una “propiedad beneficiosa para una planta” se debe interpretar en sentido amplio para significar cualquier propiedad que sea beneficiosa para cualquier propósito particular, que incluye propiedades que puedan ser beneficiosas para los seres humanos, otros animales, el entorno, un hábitat, un ecosistema, la economía, de beneficio comercial, o de cualquier otro beneficio para cualquier entidad o sistema. De acuerdo con lo anterior, se debe considerar que el término incluye propiedades que pueden suprimir, disminuir o bloquear una o más características de una planta, que incluye suprimir, disminuir o inhibir el crecimiento o la tasa de crecimiento de una planta. La invención se puede describir en el presente documento, sólo a modo de ejemplo, en términos de identificar beneficios positivos para una o más plantas o mejorar plantas. Sin embargo, se debe apreciar que la invención es igualmente aplicable para identificar beneficios negativos que se pueden conferir a las plantas.

Dichas propiedades beneficiosas incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo: características mejoradas de crecimiento, salud y/o supervivencia, resistencia a plagas y/o enfermedades, tolerancia al crecimiento en diferentes ubicaciones geográficas y/o diferentes condiciones biológicas y/o físicas ambientales, idoneidad o calidad de una planta para un propósito particular, estructura, color, composición química o perfil, sabor, olor, calidad mejorada. A modo de ejemplo, la invención puede permitir la identificación de microorganismos que permiten que una planta crezca en una variedad de diferentes temperaturas (que incluyen temperaturas extremas), pH, concentraciones de sal, concentraciones de minerales, en presencia de toxinas y/o Responden en mayor medida a la presencia de fertilizantes orgánicos y/o inorgánicos. En otras realizaciones, las propiedades beneficiosas incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo; disminuir, suprimir o inhibir el crecimiento de una planta identificada como maleza; restringir la altura y la anchura de una planta a un tamaño ornamental deseable; limitar la altura de las plantas utilizadas en aplicaciones de cobertura del suelo, tales como autopistas y bancos al costado de la carretera y proyectos de control de la erosión; ralentizar el crecimiento de las plantas utilizadas en aplicaciones de césped, tales como césped, campos de bolos y campos de golf, para reducir la necesidad de cortar el césped; reducir la relación follaje/flores en arbustos con flores ornamentales; regular la producción y/o la respuesta a las feromonas vegetales (lo que resulta en un aumento en la producción de taninos en la comunidad vegetal circundante y una reducción del atractivo para las especies forrajeras).

Como se utiliza en el presente documento, “mejorado” se debe entender en sentido amplio para abarcar la mejora de una característica de una planta que puede ya existir en una planta o plantas antes de la aplicación de la invención, o la presencia de una característica que no existía en una planta o plantas antes de la aplicación de la invención. A modo de ejemplo, se debe considerar que el crecimiento “mejorado” incluye el crecimiento de una planta donde previamente no se sabía que la planta crecía bajo condiciones relevantes.

Como se utiliza en el presente documento, “ inhibir y suprimir” y términos similares deben tomarse de manera amplia y no se deben interpretar como que requieren una inhibición o supresión completa, aunque esto puede ser deseable en algunas realizaciones.

Para ayudar a describir el método de la invención o el método de la divulgación, los términos un “primer conjunto de uno o más microorganismos” y un “segundo conjunto de uno o más microorganismos” se pueden utilizar en el presente documento para distinguir el conjunto o grupo de microorganismo(s) aplicado(s), por ejemplo, en la etapa b) del método de la divulgación y la etapa a) del método de la invención y, el conjunto o grupo de microorganismo(s) adquirido(s) en un método de la invención, por ejemplo en la etapa d) del método de la divulgación y en la etapa c) del método de la invención. En determinadas realizaciones, los conjuntos de microorganismos serán distintos; por ejemplo, el segundo conjunto puede ser un subconjunto del primer conjunto, como resultado de combinar el primer conjunto con la planta y luego seleccionar una o más plantas en base a uno o más criterios de selección. Sin embargo, se debe apreciar que este puede no ser siempre el caso y, de acuerdo con lo anterior, el uso de esta terminología no se debe interpretar de una manera tan limitada.

Los métodos de la invención se refieren a seleccionar uno o más microorganismos que sean capaces de impartir una o más propiedades beneficiosas a una planta. Como se describe con más detalle a continuación, dicho(s) microorganismo(s) puede(n) estar contenido(s) dentro de una planta, en una planta y/o dentro de la rizosfera de la planta. De acuerdo con lo anterior, cuando en el presente documento se hace referencia a la adquisición de un segundo conjunto de uno o más microorganismos “de” una planta, a menos que el contexto requiera lo contrario, se debe considerar que incluye la referencia a la adquisición de un segundo conjunto de microorganismos contenidos dentro de una planta, sobre una planta y/o dentro de la rizosfera de la planta. Para facilitar la referencia, la expresión “asociado con” se puede utilizar como sinónimo para referirse a microorganismos contenidos dentro de una planta, en una planta y/o dentro de la rizosfera de la planta.

Un método de la invención comprende ampliamente al menos las etapas de cultivar una o más plantas en un medio de crecimiento en presencia de un primer conjunto de uno o más microorganismos, seleccionar una o más plantas después de la etapa de crecimiento y adquirir un segundo conjunto de uno o más microorganismos asociados con dicha una o más de las plantas seleccionadas. La una o más plantas, el medio de crecimiento y uno o más microorganismos se pueden proporcionar por separado y combinar en cualquier orden apropiado. El método de la invención también incluye la etapa de identificación de uno o más marcadores de plantas y/o se identifican uno o más marcadores de microorganismos asociados con la propiedad beneficiosa. En particular, la invención proporciona un método iterativo en el que las etapas relevantes del método se repiten una o más veces, en el que uno o más microorganismos adquiridos en el método se utilizan en cualquier repetición o ciclo sucesivo del método. En una realización, las etapas relevantes del método se repiten una vez. En otra realización, las etapas relevantes del método se repiten dos veces. En otra realización, las etapas relevantes del método se repiten tres veces. En otra realización, las etapas relevantes del método se repiten al menos hasta que se observe una propiedad beneficiosa deseada.

El método de la invención comprende una etapa de aplicar una presión selectiva. La presión selectiva se aplica en la etapa en el método que comprende someter una o más plantas a un medio de crecimiento en presencia de un primer conjunto de uno o más microorganismos. En particular, la invención de este aspecto proporciona un método iterativo en el que las etapas relevantes del método se repiten una o más veces, en el que uno o más microorganismos adquiridos en el método se utilizan en cualquier repetición o ciclo sucesivo del método. En una realización, las etapas relevantes del método se repiten una vez. En otra realización, las etapas relevantes del método se repiten dos veces. En otra realización, las etapas relevantes del método se repiten tres veces. En otra realización, las etapas relevantes del método se repiten al menos hasta que se observe una propiedad beneficiosa deseada. Si bien se pueden aplicar la(s) misma(s) presión(es) selectiva(s) en cada iteración del método, se pueden aplicar diferentes presiones selectivas en cada iteración. Además, el método puede comprender una etapa (o etapas) adicionales que se llevan a cabo antes de la primera etapa de un método del primer o segundo aspecto e incluyen someter la una o más plantas a un medio de crecimiento en presencia de una o más microorganismos pero sin presión selectiva. Después de un período deseado, se pueden adquirir uno o más microorganismos de dicha una o más plantas y se pueden utilizar en cualquier repetición sucesiva del proceso. También se debe apreciar que se pueden llevar a cabo rondas sucesivas de esta etapa, utilizando los microorganismos adquiridos en cualquier ronda posterior del proceso, antes de embarcarse en las etapas de los procesos del primer aspecto o segundo aspecto como se describe anteriormente en el presente documento. Además, los inventores prevén un método iterativo en el que las etapas relevantes (por ejemplo, como se describió en el primer y segundo aspecto del presente documento anteriormente) se repiten una o más veces, pero se intercalan con la etapa de someter las plantas a un medio de crecimiento y uno o más microorganismos y aislando los microorganismos, sin aplicar una presión selectiva.

Se apreciará que después de un número deseado de repeticiones de las etapas a) a d) de un método de la divulgación o de las etapas a) a c) de un método de la invención, o cualquier combinación de los mismos, el método puede concluir con la adquisición de un conjunto de uno o más microorganismos de la etapa d) del método de la divulgación o de la etapa c) del método de la invención (según sea el caso puede ser) de cualquiera de dichos métodos.

Se debe apreciar que los métodos no requieren la identificación de los microorganismos en la población adquirida en el método (por ejemplo en la etapa d) de la divulgación o la etapa c) del método de la invención) ni requieren una determinación de las propiedades beneficiosas de microorganismos individuales o combinaciones de microorganismos adquiridos. Sin embargo, si se desea, se podría realizar una evaluación, identificación y/o determinación de las propiedades beneficiosas. Por ejemplo, en algunos casos se puede preferir aislar e identificar los microbios en la etapa final de un método de la invención para determinar su seguridad para uso comercial y satisfacer los requisitos reglamentarios. En dichos casos, se podrán realizar análisis genéticos y/o fenotípicos.

En una realización de los métodos de la invención, la etapa a) se lleva a cabo utilizando al menos dos plantas. En otras realizaciones se utilizan de 10 a 20 plantas. En todavía otras realizaciones, se utilizan 20 o más, 50 o más, 100 o más, 300 o más, 500 o más o 1000 o más plantas. Como se señaló anteriormente, cuando se utilizan dos o más plantas en un método particular de la invención, no es necesario que sean de la misma variedad o especie. Por ejemplo, en una realización, puede ser deseable seleccionar microorganismos que puedan impartir un beneficio positivo a una variedad o especie de planta y un beneficio negativo a otra variedad o especie de planta.

En una realización, donde se adquieren dos o más microorganismos (por ejemplo en la etapa d) del método de la divulgación o en la etapa c) del método de la invención), el método puede comprender además las etapas de separar los dos o más microorganismos en aislados individuales, seleccionar dos o más aislados individuales y luego combinar los dos o más aislados seleccionados. Esto puede dar como resultado el conjunto de microorganismos adquiridos al concluir un método de la invención. Sin embargo, en una realización, los aislados combinados se pueden utilizar luego en la etapa b) del método de la divulgación o en la etapa a) del método de la invención de rondas sucesivas del método. A modo de ejemplo se pueden combinar dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez aislados individuales. Los inventores prevén un método iterativo en el que las etapas a) a d) y/o las etapas b) a d) (método de la divulgación) o las etapas a) a c) (método de la invención) se repiten una o más veces, utilizando estas etapas adicionales de separar, seleccionar y combinar con cada repetición del método, o intercalados o combinados de otro modo con un método en el que los aislados individuales no se seleccionan ni combinan.

Se espera que estas combinaciones detecten interacciones sinérgicas que promueven propiedades deseables y previamente desconocidas (tal como el crecimiento de las plantas) entre microbios previamente adquiridos. Utilizar las etapas iterativas de los métodos impulsará la población inicial de dos o más microorganismos hacia microbios que interactúan con la planta para impartir una propiedad o característica deseada. En otras palabras, el proceso permitirá el enriquecimiento de microorganismos adecuados dentro del microbioma de la planta.

La selección de aislados individuales puede realizarse sobre la base de cualquier criterio de selección apropiado. Por ejemplo, puede ser aleatorio, se puede basar en la propiedad o propiedades beneficiosas observadas al realizar un método de la invención o, cuando se conoce información sobre la identidad del microorganismo, se puede basar en que el microorganismo ha se le ha reconocido que tiene una propiedad beneficiosa particular.

Además, se pueden realizar dos o más métodos descritos en el presente documento por separado o en paralelo y los microorganismos que resultan de cada método se pueden combinar en una única composición. Por ejemplo, se pueden realizar dos métodos separados, uno para identificar microorganismos capaces de impartir una o más primeras propiedades beneficiosas y un segundo para identificar microorganismos capaces de impartir una o más segundas propiedades beneficiosas. Los métodos separados pueden estar dirigidos a identificar microorganismos que tengan la misma propiedad beneficiosa o que tengan propiedades beneficiosas distintas. Cuando se utiliza un método que emplea una presión selectiva, la presión selectiva en los métodos separados puede ser igual o diferente. De manera similar, los microorganismos y plantas utilizados en los métodos separados pueden ser los mismos o diferentes. Si se desea una optimización adicional de los microorganismos, la composición única de microorganismos se puede aplicar a una o más rondas adicionales de un método de la invención. Alternativamente, se puede utilizar la composición única de microorganismos, según se desee, para conferir las propiedades relevantes a los cultivos, sin optimización adicional. Combinar dos o más métodos de la invención de esta manera permite la selección y combinación de microorganismos que normalmente pueden estar separados por tiempo y/o espacio en un entorno particular.

En determinadas realizaciones de los métodos divulgados en el presente documento, los métodos pueden comprender hacer crecer o propagar una o más plantas seleccionadas en la etapa c) (método de la divulgación) o la etapa b) (método de la invención), para hacer crecer la población del segundo conjunto de uno o más microorganismos asociados con la una o más plantas seleccionadas, ya sea al concluir un método de la invención, o antes de utilizar el segundo conjunto de uno o más microorganismos en la etapa b) o la etapa a) de cualquier repetición sucesiva del método. Si una o más plantas (con microorganismos asociados) se hacen crecer o propagan al concluir un método de la invención, entonces se pueden utilizar o vender en esa forma. Alternativamente, se pueden aislar uno o más microorganismos de una o más plantas, o se pueden utilizar uno o más tejidos vegetales y/o una o más partes de plantas con microorganismos asociados como fuente bruta de uno o más microorganismos en cualquier repetición sucesiva de la invención, o para cualquier otro propósito al concluir el método. En una realización, las semillas (con microorganismos asociados) de una o más plantas que se han hecho crecer o propagarse pueden obtener y utilizar como fuente de uno o más microorganismos en cualquier repetición sucesiva del método. Alternativamente, si se obtienen al concluir un método de la invención, las semillas y los microbios asociados se pueden vender o utilizar para cualquier otro propósito.

En realizaciones particulares, uno o más microorganismos seleccionados o adquiridos mediante los presentes métodos se pueden formular como una composición, como se describe a continuación. Dichas composiciones se pueden utilizar, por ejemplo, para apoyar el crecimiento, la calidad y/o la salud de las plantas, o para suprimir o inhibir el crecimiento, la calidad o la salud de las plantas. En una realización, se utiliza una composición como un recubrimiento de semillas para cultivos agrícolas comercialmente importantes, por ejemplo.

En determinadas realizaciones, las composiciones comprenden uno o más microorganismos combinados con uno o más ingredientes adicionales. En determinadas realizaciones, uno o más microorganismos se pueden combinar con activos conocidos disponibles en el espacio agrícola, tales como: pesticida, herbicida, bactericida, fungicida, insecticida, virucida, acaricida, nematicida, acaricida, regulador del crecimiento de plantas, rodenticida o agente antialgas. Además, uno o más microorganismos se pueden combinar con fertilizantes conocidos.

En algunas realizaciones, cuando el uno o más microorganismos se combinan con un agente químico activo, se presencia un efecto aditivo sobre un rasgo fenotípico de interés de la planta.

En algunas realizaciones, cuando el uno o más microorganismos se combinan con un fertilizante, se presencia un efecto aditivo sobre un rasgo fenotípico de interés de la planta.

En otras realizaciones, cuando el uno o más microorganismos se combinan con un agente químico activo se presencia un efecto sinérgico. El efecto sinérgico obtenido por los métodos enseñados se puede cuantificar de acuerdo con la fórmula de Colby. (es decir (E) =X Y - (X * Y/100). Véase Colby, R. S., “Calculating Synergistic and Antagonistic Responses of Herbicide Combinations”, 1967 Weeds, vol. 15, pp. 20-22. Por lo tanto, por “sinérgico” se entiende un componente que, en virtud de su presencia, aumenta el efecto deseado en más que una cantidad de aditivo. El uno o más microorganismos seleccionados o adquiridos mediante los métodos divulgados en el presente documento pueden aumentar sinérgicamente la eficacia de los compuestos activos agrícolas y también de los compuestos auxiliares agrícolas.

En otras realizaciones, cuando el uno o más microorganismos se combinan con un fertilizante se presencia un efecto sinérgico.

La composición que comprende el uno o más microorganismos se puede formular con ciertos auxiliares para mejorar la actividad de un compuesto agrícola activo conocido. Esto tiene la ventaja de que se pueden reducir las cantidades de ingrediente activo en la formulación mientras se mantiene la eficacia del compuesto activo, lo que permite mantener los costes lo más bajos posible y seguir las regulaciones oficiales. En casos individuales también puede ser posible ampliar el espectro de acción del compuesto activo, ya que las plantas en las que el tratamiento con un determinado principio activo sin adición no ha tenido suficiente éxito, en realidad se pueden tratar con éxito mediante la adición de determinados coadyuvantes junto con el uno o más microorganismos seleccionados o adquiridos mediante los métodos divulgados en el presente documento. Más aún, en casos individuales se puede aumentar el rendimiento del principio activo mediante una formulación adecuada cuando las condiciones ambientales no sean favorables.

Dichos auxiliares que se pueden utilizar en una composición que comprende un compuesto agrícola activo y uno o más microorganismos seleccionados o adquiridos de acuerdo con los métodos divulgados pueden ser un adyuvante. Frecuentemente los adyuvantes se presentan en forma de compuestos tensioactivos o salinos. Dependiendo de su modo de acción, se pueden clasificar a grandes rasgos como modificadores, activadores, fertilizantes, tampones de pH y similares. Los modificadores afectan las propiedades de humectación, adherencia y propagación de una formulación. Los activadores rompen la cutícula cerosa de la planta y mejoran la penetración del ingrediente activo en la cutícula, tanto a corto plazo (en minutos) como a largo plazo (en horas). Los fertilizantes tales como el sulfato de amonio, el nitrato de amonio o la urea mejoran la absorción y solubilidad del ingrediente activo y pueden reducir el comportamiento antagónico de los ingredientes activos. Los tampones de pH se utilizan convencionalmente para llevar la formulación a un pH óptimo.

Microorganismos

Como se utiliza en el presente documento, el término “microorganismo” se debe entender en sentido amplio. Incluye, pero no se limita a, los dos dominios procarióticos, Bacteria y Archaea, así como hongos y protistas eucariotas. A modo de ejemplo, los microorganismos pueden incluir Proteobacterias (tales como Pseudomonas, Enterobacter, Stenotrophomonas, Burkholderia, Rhizobium, Herbaspirillum, Pantoea, Serratia, Rahnella, Azospirillum, Azorhizobium, Azotobacter, Duganella, Delftia, Bradyrhizobiun, Sinorhizobium y Halomonas), Firmicutes (tales como Bacillus, Paenibacillus, Lactobacillus, Mycoplasma, y Acetobacterium), Actinobacterias (tales como Streptomyces, Rhodococcus, Microbacterium, y Curtobacterium), y los hongos Ascomicota (tales como Trichoderma, Ampelomyces, Coniothyrium, Paecoelomyces, Penicillium, Cladosporium, Hypocrea, Beauveria, Metarhizium, Verticullium, Cordyceps, Pichea, y Candida, Basidiomicota (tales como Coprinus, Corticium, y Agaricus) y Oomicota (tales como Pythium, Mucor, y Mortierella).

En una realización particularmente preferida, el microorganismo es un endófito o una epífita o un microorganismo que habita en la rizosfera de la planta. En una realización, el microorganismo es un endófito transmitido por semillas.

En determinadas realizaciones, el microorganismo no se puede cultivar. Esto se debería entender en el sentido de que no se sabe que el microorganismo sea cultivable o que sea difícil de cultivar utilizando métodos conocidos por un experto en la técnica.

Los microorganismos de uso en los métodos de la presente invención (por ejemplo, como el primer conjunto de uno o más microorganismos) se pueden recolectar u obtener de cualquier fuente o estar contenidos dentro y/o asociados con material recolectado de cualquier fuente.

En una realización, el primer conjunto de uno o más microorganismos se obtiene de cualquier entorno terrestre general, que incluye sus suelos, plantas, hongos, animales (que incluyen invertebrados) y otra biota, que incluyen los sedimentos, el agua y la biota de lagos y ríos; del entorno marino, su biota y sedimentos (por ejemplo agua de mar, lodos marinos, plantas marinas, invertebrados marinos (por ejemplo esponjas), vertebrados marinos (por ejemplo, peces)); la geosfera terrestre y marina (regolitos y rocas, por ejemplo rocas subterráneas trituradas, arenas y arcillas); la criosfera y su agua de deshielo; la atmósfera (por ejemplo, polvo aéreo filtrado, nubes y gotas de lluvia); entornos urbanos, industriales y otros creados por el hombre (por ejemplo, materia orgánica y mineral acumulada en el hormigón, cunetas, superficies de tejados y superficies de carreteras).

En otra realización, el primer conjunto de uno o más microorganismos se recoge de una fuente que probablemente favorezca la selección de microorganismos apropiados. A modo de ejemplo, la fuente puede ser un entorno particular en el que sea deseable que crezcan otras plantas, o que se cree que está asociado con el terreno. En otro ejemplo, la fuente puede ser una planta que tenga uno o más rasgos deseables, por ejemplo una planta que crece naturalmente en un entorno particular o bajo ciertas condiciones de interés. A modo de ejemplo, una determinada planta puede crecer naturalmente en suelo arenoso o arena de alta salinidad, o bajo temperaturas extremas, o con poca agua, o puede ser resistente a ciertas plagas o enfermedades presentes en el entorno, y puede ser deseable para que un cultivo comercial se cultive en dichas condiciones, particularmente si son, por ejemplo, las únicas condiciones disponibles en una ubicación geográfica particular. A modo de ejemplo adicional, los microorganismos se pueden recolectar de cultivos comerciales cultivados en dichos entornos, o más específicamente de plantas de cultivo individuales que exhiben mejor un rasgo de interés entre un cultivo en cualquier entorno específico, por ejemplo, las plantas de crecimiento más rápido entre un cultivo cultivado en suelos limitantes de salinidad, o las plantas menos dañadas en cultivos expuestos a daños severos por insectos o epidemias de enfermedades, o plantas que tienen cantidades deseadas de ciertos metabolitos y otros compuestos, que incluyen el contenido de fibra, contenido de aceite y similares, o plantas que exhiben colores, sabores u olores deseables. Los microorganismos se pueden recolectar de una planta de interés o de cualquier material que se encuentre en el entorno de interés, que incluye hongos y otra biota animal y vegetal, suelo, agua, sedimentos y otros elementos del entorno como se mencionó anteriormente.

En determinadas realizaciones, los microorganismos provienen de métodos de la invención o divulgación realizados previamente (por ejemplo, los microorganismos adquiridos en la etapa d) (método de la divulgación) o la etapa c) (método de la invención), incluyendo combinaciones de aislados individuales separados del segundo conjunto de microorganismos adquiridos en la etapa d) (método de la divulgación) o la etapa c) (método de la invención) o combinaciones de microorganismos resultantes de dos o más métodos de la invención realizados por separado.

Si bien la invención obvia la necesidad de conocimientos preexistentes acerca de las propiedades deseables de un microorganismo con respecto a una especie de planta particular, en una realización un microorganismo o una combinación de microorganismos de uso en los métodos de la invención se puede seleccionar de una colección preexistente de especies o cepas microbianas individuales basada en algún conocimiento de su beneficio probable o previsto para una planta. Por ejemplo, se puede predecir que el microorganismo: mejora la fijación de nitrógeno; libera fosfato de la materia orgánica del suelo; libera fosfato de las formas inorgánicas de fosfato (por ejemplo, fosfato de roca); “fija el carbono” en la microesfera de la raíz; vive en la rizosfera de la planta, ayudando de esta manera a la planta a absorber nutrientes del suelo circundante y luego proporcionárselos más fácilmente a la planta; aumenta el número de nódulos en las raíces de las plantas y, por tanto, aumentar el número de bacterias fijadoras de nitrógeno simbióticas (por ejemplo, de Rhizobium) por planta y la cantidad de nitrógeno fijado por la planta; provoca respuestas defensivas de la planta tales como ISR (resistencia sistémica inducida) o SAR (resistencia sistémica adquirida) que ayudan a la planta a resistir la invasión y propagación de microorganismos patógenos; compite con microorganismos perjudiciales para el crecimiento o la salud de las plantas mediante antagonismo o utilización competitiva de recursos tales como nutrientes o espacio; cambia el color de una o más partes de la planta, o cambia el perfil químico de la planta, su olor, sabor o una o más cualidades.

En una realización, se selecciona un microorganismo o una combinación de microorganismos (el primer conjunto de uno o más microorganismos) de una colección preexistente de especies o cepas microbianas individuales que no proporciona ningún conocimiento de su beneficio probable o previsto para una planta. Por ejemplo, una colección de microorganismos no identificados aislados de tejidos vegetales sin ningún conocimiento de su capacidad para mejorar el crecimiento o la salud de las plantas, o una colección de microorganismos recolectados para explorar su potencial para producir compuestos que podrían conducir al desarrollo de fármacos.

En una realización, los microorganismos se adquieren del material de origen (por ejemplo, suelo, roca, agua, aire, polvo, planta u otro organismo) en el que residen naturalmente. Los microorganismos se pueden proporcionaren cualquier forma apropiada, teniendo en cuenta su uso previsto en los métodos de la invención. Sin embargo, sólo a modo de ejemplo, los microorganismos se pueden proporcionar como una suspensión acuosa, gel, homogeneizado, gránulo, polvo, lechada, organismo vivo o material seco. Los microorganismos se pueden aislar en cultivos sustancialmente puros o mixtos. Se pueden concentrar, diluir o proporcionar en las concentraciones naturales en las que se encuentran en el material de origen. Por ejemplo, se pueden aislar microorganismos de sedimentos salinos para uso en esta invención al suspender el sedimento en agua dulce y permitir que el sedimento caiga al fondo. El agua que contiene la mayor parte de los microorganismos se puede eliminar por decantación después de un período adecuado de sedimentación y aplicar directamente al medio de crecimiento de las plantas, o concentrar mediante filtración o centrifugación, diluirse hasta una concentración apropiada y aplicarse al medio de crecimiento de las plantas con el Se elimina la mayor parte de la sal. A modo de ejemplo adicional, se pueden tratar de manera similar microorganismos de fuentes mineralizadas o tóxicas para recuperar los microbios para su aplicación al material de crecimiento vegetal para minimizar el potencial de daño a la planta.

En otra realización, los microorganismos (que incluyen el primer conjunto de uno o más microorganismos y/o el segundo conjunto de uno o más microorganismos) se utilizan en una forma cruda, en la que no están aislados del material de origen en el que residen naturalmente. Por ejemplo, los microorganismos se proporcionan en combinación con el material de origen en el que residen; por ejemplo, como suelo, o raíces, semillas o follaje de una planta. En esta realización, el material de origen puede incluir una o más especies de microorganismos.

Se prefiere que en los métodos de la invención se utilice una población mixta de microorganismos.

En realizaciones de la invención en las que los microorganismos se aíslan de un material de origen (por ejemplo, el material en el que residen naturalmente), se puede utilizar cualquiera o una combinación de una serie de técnicas estándar que serán fácilmente conocidas por aquellos expertos. Sin embargo, a modo de ejemplo, estos en general emplean procesos mediante los cuales se puede obtener un cultivo sólido o líquido de un solo microorganismo en una forma sustancialmente pura, usualmente mediante separación física en la superficie de un medio de crecimiento microbiano sólido o mediante aislamiento dilutivo volumétrico en un medio líquido de crecimiento microbiano. Estos procesos pueden incluir aislamiento de material seco, suspensión líquida, lechadas u homogeneizados en los que el material se esparce en una capa delgada sobre un medio de crecimiento de gel sólido apropiado, o diluciones en serie del material convertido en un medio estéril e inoculado en medios de cultivo líquidos o sólidos.

Aunque no es esencial, en una realización, el material que contiene los microorganismos se puede tratar previamente antes del proceso de aislamiento para multiplicar todos los microorganismos en el material o seleccionar porciones de la población microbiana, ya sea al enriquecer el material con nutrientes microbianos (por ejemplo, nitratos, azúcares o extractos vegetales, microbianos o animales), o al aplicar un medio que garantice la supervivencia selectiva de sólo una porción de la diversidad microbiana dentro del material (por ejemplo, al pasteurizar la muestra a 60 °C-80 °C durante 10 20 minutos para seleccionar microorganismos resistentes a la exposición al calor (por ejemplo, bacilos), o al exponer la muestra a bajas concentraciones de un solvente orgánico o esterilizante (por ejemplo, etanol al 25 % durante 10 minutos) para potenciar la supervivencia de actinomicetos y microorganismos formadores de esporas o resistentes a solventes). Después se pueden aislar microorganismos de los materiales enriquecidos o de los materiales tratados para supervivencia selectiva, como anteriormente.

En una realización preferida de la invención, los microorganismos endofíticos o epífitos se aíslan del material vegetal. Se puede utilizar cualquier número de técnicas estándar conocidas en la técnica y los microorganismos se pueden aislar de cualquier tejido apropiado en la planta, que incluye por ejemplo raíz, tallo y hojas, y tejidos reproductivos de la planta. A modo de ejemplo, los métodos convencionales para el aislamiento de plantas normalmente incluyen la escisión estéril del material vegetal de interés (por ejemplo, longitudes de raíces o tallos, hojas), esterilización de la superficie con una solución adecuada (por ejemplo, hipoclorito de sodio al 2 %), después de lo cual la planta El material se coloca en un medio nutritivo para el crecimiento microbiano (véase, por ejemplo, Strobel G and Daisy B (2003) Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products. Microbiology and Molecular Biology Reviews 67 (4): 491-502; Zinniel DK et al. (2002) Isolation and characterisation of endophytic colonizing bacteria from agronomic crops and prairie plants. Applied and Environmental Microbiology 68 (5): 2198-2208). En una realización preferida de la invención, los microorganismos se aíslan del tejido de la raíz. A continuación se detallan metodologías adicionales para aislar microorganismos a partir de material vegetal.

Como se utilizan en el presente documento, los términos “aislar”, “aislado” y similares se deben entender en sentido amplio. Estos términos pretenden significar que uno o más microorganismo(s) se ha(n) separado al menos parcialmente de al menos uno de los materiales con los que está asociado en un entorno particular (por ejemplo, suelo, agua, tejido vegetal). Los términos “aislar”, “aislado” y similares no se deben interpretar como indicadores del grado en que se han purificado el(los) microorganismo(s).

Como se utiliza en el presente documento, “aislados individuales” se debe entender como una composición o cultivo que comprende un predominio de un único género, especie o cepa de microorganismo, después de la separación de uno o más microorganismos diferentes. La frase no se debe interpretar como una indicación del grado en que se ha aislado o purificado el microorganismo. Sin embargo, los “aislados individuales” preferiblemente comprenden sustancialmente sólo un género, especie o cepa de microorganismo.

En una realización, la población microbiana se expone (antes del método o en cualquier estadio del método) a una presión selectiva para potenciar la probabilidad de que las plantas finalmente seleccionadas tengan ensamblajes microbianos que probablemente tengan las propiedades deseadas. Por ejemplo, es probable que la exposición de los microorganismos a la pasteurización antes de su adición a un medio de crecimiento vegetal (preferiblemente estéril) potencie la probabilidad de que las plantas seleccionadas para un rasgo deseado se asocien con microbios formadores de esporas que pueden sobrevivir más fácilmente en condiciones adversas, en almacenamiento comercial, o si se aplica a semillas como un recubrimiento, en un entorno adverso.

Se debe apreciar que el segundo conjunto de microorganismos adquiridos en un método como se describe en el presente documento (que incluye un método de la invención) se puede aislar de una planta o material vegetal, superficie o medio de crecimiento asociado con una planta seleccionada utilizando cualesquier técnicas apropiadas conocidas en el arte, que incluyen pero no se limitan a, aquellas técnicas descritas anteriormente en el presente documento. Sin embargo, en determinadas realizaciones, como se mencionó anteriormente en el presente documento, el(los) microorganismo(s) se pueden utilizar en forma cruda y no es necesario aislarlos de una planta o un medio. Por ejemplo, se puede obtener material vegetal o medio de crecimiento que incluya los microorganismos identificados como beneficiosos para una planta seleccionada y utilizar como fuente bruta de microorganismos para la siguiente ronda del método o como fuente bruta de microorganismos al concluir el método. Por ejemplo, se podría obtener y opcionalmente procesar material vegetal entero, como por ejemplo triturado o molido. Alternativamente, los tejidos individuales o partes de plantas seleccionadas (tales como hojas, tallos, raíces y semillas) se pueden separar de la planta y, opcionalmente, procesar, tal como triturarse o molerse. En determinadas realizaciones, una o más partes de una planta que están asociadas con el segundo conjunto de uno o más microorganismos se pueden eliminar de una o más plantas seleccionadas y, cuando se va a realizar cualquier repetición sucesiva del método, se puede injertar en una o más plantas utilizadas en la etapa b) del método de la divulgación o en la etapa a) del método de la invención.

Los métodos de la invención se pueden describir en el presente documento en términos de que el segundo conjunto de uno o más microorganismos que se aíslan de su material de origen. Sin embargo, a menos que el contexto requiera lo contrario, esto también se debe entender como una referencia al uso de microorganismos en forma cruda en los que no han sido aislados del material de origen.

Plantas

En los métodos de la invención se puede utilizar cualquier serie de una variedad de plantas diferentes, que incluyen musgos, líquenes y algas. En realizaciones preferidas, las plantas tienen valor económico, social y/o ambiental. Por ejemplo, las plantas pueden incluir aquellas de uso: como cultivos alimenticios; como cultivos de fibra; como cultivos oleaginosos; en la industria forestal; en la industria de la celulosa y el papel; como materia prima para la producción de biocombustibles; y/o, como plantas ornamentales. En otras realizaciones, las plantas pueden ser económica, social y/o ambientalmente indeseables, tales como las malezas. La siguiente es una lista de ejemplos no limitantes de los tipos de plantas a las que se pueden aplicar los métodos de la invención:

Cultivos alimenticios:

- Cereales (maíz, arroz, trigo, cebada, sorgo, mijo, avena, centeno, triticale, trigo sarraceno);

- verduras de hoja (plantas brasicáceas tales como coles, brócoli, bok choy, rúcula; verduras para ensalada tales como espinacas, berros, lechuga);

- verduras de fructificación y floración (por ejemplo, aguacate, maíz dulce, alcachofas, cucurbitáceas, por ejemplo, zapallos, pepinos, melones, calabacines, calabazas; verduras/frutas solonáceas, por ejemplo, tomates, berenjenas, pimientos);

- verduras en vaina (cacahuetes, maní, guisantes, soja, judías, lentejas, garbanzos, okra);

- verduras de bulbo y tallo (espárragos, apio, cultivos de Allium, por ejemplo, ajo, cebolla, puerro);

- verduras de raíces y tuberosas (zanahorias, remolachas, brotes de bambú, mandioca, ñame, jengibre, topinambur, chirivías, rábanos, patatas, boniatos, malanga, nabos, wasabi);

- cultivos de azúcar que incluyen remolacha azucarera (Beta vulgar), caña de azúcar (Saccharum officinarum);

- cultivos cultivados para la producción de bebidas no alcohólicas y estimulantes (café, tes negros, de hierbas y verdes, cacao, tabaco);

- cultivos frutales tales como bayas verdaderas (por ejemplo,, kiwi, uva, grosellas, grosella espinosa, guayaba, feijoa, granada), frutas cítricas (por ejemplo, naranjas, limones, limas, pomelos), frutas epíginas (por ejemplo,, plátanos, arándanos rojos, arándanos azules), frutas agregadas (mora, frambuesa, zarzamora), frutas múltiples (por ejemplo, piña, higo), cultivos de frutas de hueso (por ejemplo, albaricoque, melocotón, cereza, ciruela), frutas de pepita (por ejemplo, manzanas, peras) y otras tales como fresas, semillas de girasol;

- hierbas culinarias y medicinales por ejemplo, romero, albahaca, laurel, cilantro, menta, eneldo, hipérico, dedalera, aloe vera, escaramujo);

- plantas de cultivo que producen especias por ejemplo, pimienta negra, comino, canela, nuez moscada, jengibre, clavo, azafrán, cardamomo, macis, pimentón, masalas, anís estrellado;

- cultivos cultivados para la producción de nueces por ejemplo, almendras y nueces, nueces de Brasil, anacardos, cocos, castañas, nueces de macadamia y pistachos; maní, nueces pecanas;

- cultivos cultivados para la producción de cervezas, vinos y otras bebidas alcohólicas por ejemplo uvas, lúpulo;

- cultivos de semillas oleaginosas por ejemplo, soja, maní, algodón, aceitunas, girasol, sésamo, especies de lupino y cultivos de brasicáceas (por ejemplo, canola/colza); y,

- hongos comestibles por ejemplo, setas blancas, shiitake y setas ostra;

Plantas utilizadas en la agricultura pastoril:

- legumbres: especies de Trifolio, especies de Medicago, y especies de Lotus; trébol blanco (Trepens); trébol rojo (T pratense); trébol caucásico (T ambigum); trébol subterráneo (T subterraneum); Alfalfa/Lucerna (Medicago sativum); medicago anual; medicago de barril; medicago negro; Esparceta (Onobrychis viciifolia); trébol de los pájaros (Lotus corniculatus); Trébol de los pájaros mayor (Lotus pedunculatus);

- leguminosas/legumbres de semilla que incluyen guisantes (Pisum sativum) frijol común (Phaseolus vulgaris), habas (Vicia faba), frijol mungo (Vigna radiata), caupí (Vigna unguiculata), garbanzo (Cicer arietum), Lupinos (especies de Lupinos);

- Cereales que incluyen elote/maíz (Zea mays) Sorgo (Srogom spp.), Mijo (Panicum miliaceum, P sumatrense), Arroz (Oryza sativa indica, Oryza sativa japonica), Trigo (Triticum sativa), Cebada (Hordeum vulgare), Centeno (Secale cereale), Triticale (Triticum X Secale), Avena (Avena fatua);

- Pastos forrajeros y de recreo: Pastos templados como especies de Lolium; especies de Festuca; Agrostis spp., raigrás perenne (Lolium perenne); raigrás híbrido (Lolium hybridum); raigrás anual (Lolium multiflorum), festuca alta (Festuca arundinacea); festuca de pradera (Festuca pratensis); festuca roja (Festuca rubra); Festuca ovina; festulolios (cruces de Lolium X Festuca); pasto ovillo ((Dactylis glomerata); pasto azul de Kentucky Poa pratensis; Poa palustris; Poa nemoralis; Poa trivialis; Poa compresa; especies de Bromus; albardana (especies de Phleum); Arrhenatherum elatius; Agropyron species; Avena strigosa; Setaria italic;

- Pastos tropicales tales como: especies de Phalaris; especies de Brachiaria; especies de Eragrostis; especies de Panicum; hierba bahai (Paspalum notatum); especies de Brachypodium; y

- Pastos utilizados para la producción de biocombustibles como Switchgrass (Panicum virgatum) y especies de Miscanthus;

Cultivos de fibra:

- algodón, cáñamo, yute, coco, sisal, lino (Linum spp.), lino de Nueva Zelanda (Phormium spp.); especies de plantaciones y bosques naturales aprovechadas para producir papel y productos de fibras de madera modificadas, tales como especies forestales de coníferas y latifoliadas;

- Especies de árboles y arbustos utilizados en plantaciones forestales y cultivos para biocombustibles:

- Pino (especies de Pinus); abeto (especies de Pseudotsuga); Abeto (especies de Picea); Ciprés (especies de Cupressus); Zarzo (especies de Acacia); Aliso (especies de Alnus); especies de roble (especies de Quercus); Secuoya (especies de Sequoiadendron); sauce (especies de Salix); abedul (especies de Betula); Cedro (especies de Cedurus); Fresno (especies de Fraxinus); Alerce (especies de Larix); especies de Eucalipto; Bambú (especies de Bambuseae) y álamos (especies de Populus).

Plantas cultivadas para su conversión en energía, biocombustibles o productos industriales mediante tratamiento extractivo, biológico, físico o bioquímico:

- Plantas productoras de aceite tales como palma aceitera, jatrofa, soja, algodón, linaza;

- Plantas productoras de látex tales como el árbol de Caucho Para, Hevea brasiliensis y el Árbol del Caucho de Panamá Castilla elastica;

- plantas utilizadas como materia prima directa o indirecta para la producción de biocombustibles, es decir, después de una transformación química, física (por ejemplo, térmica o catalítica) o bioquímica (por ejemplo, tratamiento enzimático previo) o biológica (por ejemplo, fermentación microbiana) durante la producción de biocombustibles, solventes industriales o productos químicos, por ejemplo, etanol o butanol, propanodioles u otros combustibles o materiales industriales, que incluyen cultivos de azúcar (por ejemplo, remolacha, caña de azúcar), cultivos productores de almidón (por ejemplo, cultivos de cereales C3 y C4 y cultivos tuberosos), cultivos celulósicos tales como árboles forestales (por ejemplo, pinos, Eucaliptos) y plantas Gramináceas y Poáceas tales como bambú, pasto de escobilla, miscanthus;

- cultivos utilizados en la producción de energía, biocombustibles o productos químicos industriales mediante gasificación y/o conversión microbiana o catalítica del gas en biocombustibles u otras materias primas industriales tales como solventes o plásticos, con o sin producción de biocarbón (por ejemplo, cultivos de biomasa tales como coníferas, eucaliptos, árboles forestales tropicales o de hoja ancha, cultivos de gramíneas y poáceas tales como bambú, pasto de escobilla, miscanthus, caña de azúcar o cáñamo o maderas blandas tales como álamos, sauces; y,

- cultivos de biomasa utilizados en la producción de biocarbón;

Cultivos que producen productos naturales útiles para las industrias farmacéutica, nutracéutica agrícola y cosmecéutica:

- cultivos que producen precursores o compuestos farmacéuticos o compuestos y materiales nutracéuticos y cosmecéuticos, por ejemplo, anís estrellado (ácido shikímico), fallopia japonesa (resveratrol), kiwi (fibra soluble, enzimas proteolíticas);

Plantas florícolas, ornamentales y de esparcimiento cultivadas por sus propiedades estéticas o ambientales.:

- Flores tales como rosas, tulipanes, crisantemos;

-Arbustos ornamentales como Boj, Hebe, Rosa, Rododendro, Hiedra.

- Plantas de adorno tales como Plátano, Azahar mexicano, Escallonia, Euforbia, Cárice

- Musgos tales como el musgo de sphagnum

Plantas cultivadas para biorremediación:

- Girasol, Brassica, Sauce, Álamo, Eucalipto

Se debe apreciar que una planta se puede proporcionar en la forma de semilla, plántula, esqueje, propágulo o cualquier otro material o tejido vegetal capaz de crecer. En una realización, la superficie de la semilla puede esterilizarse con un material tal como hipoclorito de sodio o cloruro de mercurio para eliminar los microorganismos contaminantes de la superficie. En una realización, el propágulo se hace crecer en cultivo axénico antes de colocarlo en el medio de crecimiento de plantas, por ejemplo como plántulas estériles en cultivo de tejidos.

Medio de crecimiento

El término “medio de crecimiento”, como se utiliza en el presente documento, se debe entender en sentido amplio como cualquier medio que sea adecuado para apoyar el crecimiento de una planta. A modo de ejemplo, los medios pueden ser naturales o artificiales, que incluyen, pero no se limitan a, suelo, mezclas para macetas, corteza, vermiculita, soluciones hidropónicas solas y aplicadas a sistemas de apoyo sólidos de plantas y geles de cultivo de tejidos. Se debe apreciar que los medios se pueden utilizar solos o en combinación con uno o más medios diferentes. También se puede utilizar con o sin la adición de nutrientes exógenos y sistemas de apoyo físico para raíces y follaje.

En una realización, el medio de crecimiento es un medio de origen natural tal como suelo, arena, barro, arcilla, humus, regolito, roca o agua. En otra realización, el medio de crecimiento es artificial. Dicho medio de crecimiento artificial se puede construir para imitar las condiciones de un medio de origen natural; sin embargo, esto no es necesario. Los medios de crecimiento artificiales se pueden fabricar a partir de uno o más de cualquier número y combinación de materiales, que incluyen arena, minerales, vidrio, roca, agua, metales, sales, nutrientes y agua. En una realización, el medio de crecimiento es estéril. En otra realización, el medio de crecimiento no es estéril.

El medio se puede modificar o enriquecer con compuestos o componentes adicionales, por ejemplo, un componente que pueda ayudar en la interacción y/o selección de grupos específicos de microorganismos con la planta y entre sí. Por ejemplo, podrían estar presentes antibióticos (tales como la penicilina) o esterilizantes (por ejemplo, sales de amonio cuaternario y agentes oxidantes) y/o las condiciones físicas (tales como la salinidad, los nutrientes de las plantas (por ejemplo, minerales orgánicos e inorgánicos (tales como el fósforo, sales nitrogenadas, amoníaco, potasio y micronutrientes tales como cobalto y magnesio), pH y/o temperatura).

En determinadas realizaciones de la invención, el medio de crecimiento se puede tratar previamente para ayudar en la supervivencia y/o selección de ciertos microorganismos. Por ejemplo, el medio se puede tratar previamente al incubarlo en un medio de enriquecimiento para estimular la multiplicación de microbios endógenos que pueden estar presentes en el mismo. A modo de ejemplo adicional, el medio se puede tratar previamente al incubarlo en un medio selectivo para estimular la multiplicación de grupos específicos de microorganismos. Un ejemplo adicional incluye el tratamiento previo del medio de crecimiento para excluir un elemento específico del ensamblaje microbiano en el mismo; por ejemplo, pasteurización (para eliminar bacterias y hongos formadores de esporas) o tratamiento con solventes orgánicos como diversos alcoholes para eliminar microorganismos sensibles a estos materiales pero que permitan la supervivencia de actinomicetos y bacterias formadoras de esporas, por ejemplo.

Los métodos de tratamiento previo o enriquecimiento se pueden basar en técnicas de elaboración de perfiles de comunidades microbianas independientes del cultivo que proporcionan información sobre la identidad de los microbios o grupos de microbios presentes. Estos métodos pueden incluir, pero no se limitan a, técnicas de secuenciación que incluyen secuenciación de alto rendimiento y análisis filogenético, o cribado basado en micromatrices de ácidos nucleicos que codifican componentes de operones de ARNr u otros loci taxonómicamente informativos.

Condiciones de crecimiento

De acuerdo con los métodos de la invención, una o más plantas se someten a uno o más microorganismos y un medio de crecimiento. Preferiblemente, la planta se hace crecer o se deja multiplicar en presencia de uno o más microorganismo(s) y medio de crecimiento. El(los) microorganismo(s) puede(n) estar presente(s) en el medio de crecimiento de forma natural sin la adición de microorganismos adicionales, por ejemplo en un suelo natural. El medio de crecimiento, la planta y los microorganismos se pueden combinar o exponerse entre sí en cualquier orden apropiado. En una realización, la planta, semilla, plántula, esqueje, propágulo o similar se planta o se siembra en el medio de crecimiento que ha sido previamente inoculado con uno o más microorganismos. Alternativamente, el uno o más microorganismos se pueden aplicar a la planta, semilla, plántula, esqueje, propágulo o similar que luego se planta o se siembra en el medio de crecimiento (que puede contener o no microorganismos adicionales). En otra realización, la planta, semilla, plántula, esqueje, propágulo o similar se planta o siembra primero en el medio de crecimiento, se le permite crecer y, en un momento posterior, uno o más microorganismos se aplican a la planta, semilla, plántula, esqueje, propágulo o similar y/o el propio medio de crecimiento se inocula con uno o más microorganismos.

Los microorganismos se pueden aplicar a la planta, plántula, esqueje, propágulo o similar y/o al medio de crecimiento utilizando cualquier técnica apropiada conocida en el arte. Sin embargo, a modo de ejemplo, en una realización, el uno o más microorganismos se aplican a la planta, plántula, esqueje, propágulo o similares mediante pulverización o espolvoreo. En otra realización, los microorganismos se aplican directamente a las semillas (por ejemplo como un recubrimiento) antes de la siembra. En una realización adicional, los microorganismos o esporas de microorganismos se formulan en gránulos y se aplican junto con las semillas durante la siembra. En otra realización, se pueden inocular microorganismos en una planta al cortar las raíces o tallos y exponer la superficie de la planta a los microorganismos mediante pulverización, inmersión o aplicación de otro modo de una suspensión, gel o polvo microbiano líquido. En otra realización, el(los) microorganismo(s) se pueden inyectar directamente en el tejido foliar o de la raíz, o inocular de otro modo directamente en un corte foliar o de raíz, o bien en un embrión, radícula o coleoptilo extirpado. Estas plantas inoculadas pueden luego exponerse adicionalmente a un medio de crecimiento que contiene más microorganismos, aunque esto no es necesario. En determinadas realizaciones, los microorganismos se aplican a la planta, plántula, esqueje, propágulo o similar y/o medio de crecimiento en asociación con material vegetal (por ejemplo, material vegetal con el que están asociados los microorganismos).

En otras realizaciones, particularmente cuando los microorganismos no son cultivables, los microorganismos se pueden transferir a una planta mediante cualquiera o una combinación de injertos, inserción de explantes, aspiración, electroporación, herida, poda de raíces, inducción de apertura estomática o cualquier tratamiento físico, químico o biológico que brinda la oportunidad a los microbios de ingresar a las células vegetales o al espacio intercelular. Aquellos expertos en la técnica podrán apreciar fácilmente que se pueden utilizar varias técnicas alternativas.

Se debe apreciar que dichas técnicas son igualmente aplicables a la aplicación del primer conjunto de uno o más microorganismos y del segundo conjunto de microorganismos cuando se utilizan en la etapa a) de una repetición sucesiva del método.

En una realización, los microorganismos se infiltran en partes de la planta tales como raíces, tallos, hojas y/o partes de plantas reproductivas (se vuelven endofíticas), y/o crecen sobre la superficie de raíces, tallos, hojas y/o partes de plantas reproductivas (se vuelven epífitas) y/o crecen en la rizosfera de la planta. En una realización preferida, el(los) microorganismo(s) forma(n) una relación simbiótica con la planta.

Las condiciones de crecimiento utilizadas pueden variar dependiendo de la especie de planta, como apreciarán aquellos expertos en la técnica. Sin embargo, a modo de ejemplo, en el caso del trébol, en una sala de crecimiento normalmente se harían crecer plantas en un suelo que contiene aproximadamente 1/3° de materia orgánica en forma de turba, 1/3° de abono, y 1/3° de piedra pómez tamizada, complementada con fertilizantes que normalmente contienen nitratos, fosfatos, sales de potasio y magnesio y micronutrientes y a un pH entre 6 y 7. Las plantas se pueden hacer crecer a una temperatura entre 22 y 24 °C en un período de luz diurna y oscuridad de 16:8 y se pueden regar automáticamente.

Presión selectiva

En el método de la invención, en un momento deseado durante el período dentro del cual la planta está sometida a uno o más microorganismos y un medio de crecimiento, se aplica una presión selectiva. La presión selectiva puede ser cualquier factor o elemento biótico o abiótico que puede tener un impacto en la salud, el crecimiento y/o la supervivencia de una planta en particular, que incluyen las condiciones ambientales y los elementos a los que las plantas se pueden exponer en su entorno natural o en una situación comercial.

Ejemplos de presiones bióticas selectivas incluyen, pero no se limitan a, organismos que son perjudiciales para la planta, por ejemplo, hongos, bacterias, virus, insectos, ácaros, nematodos y animales.

Las presiones selectivas abióticas incluyen, por ejemplo, cualquier factor químico y físico del entorno; por ejemplo, disponibilidad de agua, composición mineral del suelo, sal, temperatura, alteraciones en el espectro de luz (por ejemplo, aumento de la luz UV), pH, toxinas orgánicas e inorgánicas (por ejemplo, exposición a o cambios en el nivel de toxinas), metales, nutrientes orgánicos , nutrientes inorgánicos, calidad del aire, composición de gases atmosféricos, flujo de aire, lluvia y granizo.

Por ejemplo, la planta/los microorganismos se pueden exponer a cambios o concentraciones extremas de sal, temperatura, pH, niveles superiores a los normales de gases atmosféricos tales como CO<2>, niveles de agua (que incluyen condiciones de sequía o inundaciones), niveles bajos de nitrógeno, suministro de fósforo en una forma que solo está disponible para la planta después de la degradación microbiana, exposición a o cambios en el nivel de toxinas en el entorno, suelos con niveles casi tóxicos de ciertos minerales como los aluminatos, o fuertes vientos.

En una realización, la presión selectiva se aplica directamente a la planta, los microorganismos y/o el medio de crecimiento. En otra realización, la presión selectiva se aplica indirectamente a la planta, los microorganismos y/o el medio de crecimiento, a través del entorno circundante; por ejemplo, una toxina gaseosa en el aire o un insecto volador.

La presión selectiva se puede aplicar en cualquier momento, preferiblemente durante el tiempo que la planta está sometida a uno o más microorganismos y medio de crecimiento. En una realización, la presión selectiva se aplica sustancialmente durante todo el tiempo durante el cual una planta está creciendo y/o multiplicándose. En otra realización, la presión selectiva se aplica en un momento discreto durante el crecimiento y/o la multiplicación. A modo de ejemplo, la presión selectiva se puede aplicar en diferentes fases de crecimiento de una o más plantas que simulan un estrés potencial en la planta que podría ocurrir en un entorno natural o comercial. Por ejemplo, el inventor ha observado que algunas plagas atacan a las plantas sólo en estadios específicos de su vida. Además, el inventor ha observado que diferentes poblaciones de microorganismos potencialmente beneficiosos se pueden asociar con plantas en diferentes momentos de la vida de la planta. Simular un ataque de plaga a la planta en el momento relevante puede permitir la identificación y aislamiento de microorganismos que pueden proteger a la planta del ataque en ese estadio de vida en particular. También se debe apreciar que la presión selectiva puede estar presente en el medio de crecimiento o en el entorno general en el momento en que se planta o siembra la planta, semilla, plántula, esqueje, propágulo o similar.

En una realización, la población microbiana se expone (antes del método o en cualquier estadio del método) a una presión selectiva para potenciar la probabilidad de que las plantas finalmente seleccionadas tengan ensamblajes microbianos que probablemente tengan las propiedades deseadas. Por ejemplo, es probable que la exposición de los microorganismos a la pasteurización antes de su adición a un medio de crecimiento vegetal (preferiblemente estéril) potencie la probabilidad de que las plantas seleccionadas para un rasgo deseado se asocien con microbios formadores de esporas que pueden sobrevivir más fácilmente en condiciones adversas, en almacenamiento comercial, o si se aplica a semillas como recubrimiento, en un entorno adverso. Otro ejemplo se proporciona a continuación en el Ejemplo 11B, en el que se sometieron microorganismos a un medio que permitió la selección de microbios solubilizadores de fosfato. Dicha etapa de aplicar una presión selectiva a la población microbiana se puede denominar en el presente documento “etapa de enriquecimiento”.

Las plantas se pueden hacer crecer y someter a presión selectiva durante cualquier período de tiempo apropiado antes de seleccionarlas y cosecharlas. Sólo a modo de ejemplo, las plantas y cualquier microorganismo asociado con ellas se pueden seleccionar y cosechar en cualquier momento durante el período de crecimiento de una planta, en una realización, en cualquier momento después de la germinación de la planta. En una realización preferida, las plantas se hacen crecer o se dejan multiplicar durante un período que permite distinguir entre plantas que tienen características fenotípicas deseables y aquellas que no las tienen. A modo de ejemplo general, se puede seleccionar trigo para mejorar la velocidad del crecimiento foliar, digamos después de un mes, pero igualmente se puede seleccionar para un rendimiento de grano superior en la madurez de la espiga de la semilla. El período de tiempo que se cultiva una planta depende del tiempo requerido para expresar el rasgo de la planta que se desea mejorar mediante la invención, o del tiempo requerido para expresar un rasgo correlacionado con el rasgo deseado. Por ejemplo, en el caso de las variedades de trigo de invierno, sembradas principalmente en el hemisferio norte, puede ser importante seleccionar plantas que exhiban un macollamiento temprano después de la exposición de la semilla a un medio de crecimiento que contiene microorganismos bajo condiciones de luz y temperatura similares a las experimentadas por la semilla de trigo de invierno en el hemisferio norte, ya que el macollamiento temprano es un rasgo relacionado con la supervivencia en invierno, el crecimiento y el eventual rendimiento de grano en el verano. O bien, se puede seleccionar una especie de árbol para mejorar el crecimiento y la salud a los 4-6 meses, ya que estos rasgos están relacionados con la salud y la tasa de crecimiento y el tamaño de los árboles de 10 años después, un período poco práctico para el desarrollo de productos utilizando esta invención.

Se debe apreciar que los métodos de la invención pueden implicar la aplicación de dos o más presiones selectivas simultánea o sucesivamente en la etapa b).

Selección

Normalmente, después del crecimiento de una o más plantas en presencia de uno o más microorganismos, y en determinadas realizaciones después de la exposición a una presión selectiva, se selecciona una o más plantas en base a uno o más criterios de selección. En el método de la invención, las plantas se seleccionan en base a uno o más rasgos fenotípicos. Aquellos expertos apreciarán fácilmente que dichos rasgos incluyen cualquier característica observable de la planta, que incluye, por ejemplo, tasa de crecimiento, altura, peso, color, sabor, olor, cambios en la producción de uno o más compuestos por la planta (que incluyen, por ejemplo, metabolitos, proteínas, fármacos, carbohidratos, aceites y cualesquier otros compuestos). También se prevé seleccionar plantas en base a información genotípica (por ejemplo, que incluyen el patrón de expresión de genes de plantas en respuesta a los microorganismos, el genotipo, la presencia de marcadores genéticos). Se debe apreciar que en determinadas realizaciones, las plantas se pueden seleccionar en base a la ausencia, supresión o inhibición de una determinada característica o rasgo (tal como una característica o rasgo indeseable) en contraposición a la presencia de una determinada característica o rasgo (tal como una característica o rasgo deseable).

Cuando se evalúa la presencia de uno o más marcadores genéticos, es posible que el uno o más marcadores ya sean conocidos y/o estén asociados con una característica particular de una planta; por ejemplo, un marcador o marcadores se pueden asociar con una mayor tasa de crecimiento o perfil de metabolitos. Esta información se podría utilizar en combinación con una evaluación basada en otras características en un método de la invención para seleccionar una combinación de diferentes características de la planta que puedan ser deseables. Dichas técnicas se pueden utilizar para identificar nuevos QTL que vinculen rasgos deseables de las plantas con una flora microbiana específica, por ejemplo, haciendo coincidir el genotipo de la planta con el tipo de microbioma.

A modo de ejemplo, las plantas se pueden seleccionar en base a la tasa de crecimiento, tamaño (que incluye, pero no se limitan a, peso, altura, el tamaño de las hojas, tamaño del tallo, patrón de ramificación o tamaño de cualquier parte de la planta), la salud general, la supervivencia, tolerancia a entornos físicos adversos y/o cualquier otra característica, como se describió anteriormente en el presente documento. Ejemplos no limitantes adicionales incluyen la selección de plantas en base a: velocidad de germinación de las semillas; cantidad de biomasa producida; aumento del crecimiento de raíces y/o hojas/brotes que conduce a un mayor rendimiento (hierba o grano o fibra o aceite) o producción de biomasa; efectos sobre el crecimiento de las plantas que resultan en un mayor rendimiento de semillas para un cultivo, lo que puede ser particularmente relevante en cultivos de cereales tales como trigo, cebada, avena, centeno, maíz, arroz, sorgo y cultivos de semillas oleaginosas tales como soja, canola, algodón y girasol. y legumbres de semilla tales como guisantes, frijoles; efectos sobre el crecimiento de las plantas que resultan en un aumento del rendimiento de aceite, que puede ser particularmente relevante en cultivos de semillas oleaginosas tales como soja, la canola, algodón, jatrofa y girasol; efectos sobre el crecimiento de las plantas que dan lugar a un mayor rendimiento de fibra (por ejemplo, en algodón, lino y linaza) o para efectos que dan lugar a un mayor rendimiento de tubérculos en cultivos tales como patatas y remolacha azucarera; efectos sobre el crecimiento de las plantas que resultan en una mayor digestibilidad de la biomasa que puede ser particularmente relevante en cultivos forrajeros tala como leguminosas forrajeras (alfalfa, trébol, lucerna), pastos forrajeros (especies de Lolium; especies de Festuca; especies de Paspalum; especies de Brachiaria; especies de Eragrostis), cultivos forrajeros para ensilaje tales como maíz y cereales forrajeros (trigo, cebada, avena); efectos sobre el crecimiento de las plantas que resultan en un aumento del rendimiento de frutos que puede ser particularmente relevante para árboles frutales de pepita (tales como manzanas, peras, etc.), bayas (tales como fresas, frambuesas, arándanos), frutas de hueso (tales como nectarinas, albaricoques ), y cítricos, uvas, higos, nueces; efectos sobre el crecimiento de las plantas que conducen a una mayor resistencia o tolerancia a enfermedades, que incluyen enfermedades fúngicas, virales o bacterianas, o a plagas tales como insectos, ácaros o nematodos en los que el daño se mide por la disminución de los síntomas foliares, como la incidencia de lesiones bacterianas o fúngicas, o área de follaje dañado o reducción en el número de quistes o agallas de nematodos en las raíces de las plantas, o mejoras en el rendimiento de las plantas en presencia de dichas plagas y enfermedades de las plantas; efectos sobre el crecimiento de las plantas que conducen a un aumento del rendimiento de metabolitos, por ejemplo en plantas de crecimiento con fines farmacéuticos, nutracéuticos o cosmecéuticos, que pueden ser particularmente relevantes para plantas como el anís estrellado cultivado para la producción de ácido shikímico, fundamental para la producción de fármacos contra la gripe. oseltamivir, o la producción de nudo japonés para la extracción de resveratrol, o la producción de fibra soluble y productos enzimáticos dietéticos a partir del kiwi, o por ejemplo, mayores rendimientos de “taninos condensados” u otros metabolitos útiles para inhibir la producción de gases de efecto invernadero tales como metano en animales de pastoreo; efectos sobre el crecimiento de las plantas que conducen a un atractivo estético mejorado que puede ser particularmente importante en plantas cultivadas por su forma, color o sabor, por ejemplo la intensidad del color y la forma de las flores ornamentales, el sabor de las frutas o verduras, o el sabor del vino de vides tratadas con microorganismos; y efectos sobre el crecimiento de las plantas que conducen a concentraciones mejoradas de compuestos tóxicos absorbidos o desintoxicados por las plantas cultivadas con fines de biorremediación.

La selección de plantas basada en información fenotípica o genotípica se puede realizar utilizando técnicas tales como, pero no se limitan a: cribado de alto rendimiento de componentes químicos de origen vegetal, técnicas de secuenciación que incluyen secuenciación de alto rendimiento de material genético, técnicas de visualización diferencial (que incluyen DDRT-PCR y DD-PCR), técnicas de micromatrices de ácidos nucleicos, ARN-seq (secuenciación de escopeta de transcriptoma completo), qRT-PCR (PCR cuantitativa en tiempo real).

En determinadas realizaciones de la invención, se puede desear la selección de una combinación de rasgos de plantas; por ejemplo, en las realizaciones de la invención que implican repetir las etapas del método básico y aplicar diferentes presiones selectivas con cada iteración del método. Esto se puede lograr de varias maneras. En una realización, se pueden realizar múltiples rondas de mejora iterativa para un rasgo, por ejemplo, el crecimiento superior en suelos infestados de nematodos se mantiene hasta que se alcance un nivel aceptable de resistencia a los nematodos. Se llevan a cabo rondas de selección similares, pero completamente separadas, para identificar microorganismos que pueden conferir al menos diferentes rasgos deseables, por ejemplo, simplemente para un crecimiento mejorado u otras características, o un crecimiento mejorado que resulta de una mejor utilización microbiana del fosfato del suelo, o un crecimiento mejorado que resulta de una mayor tolerancia a plagas de insectos chupadores. Dichas rondas de selección separadas se pueden realizar utilizando un enfoque iterativo o de apilamiento o se podría utilizar una combinación de métodos separados, los microorganismos que resultan de esas rondas o métodos separados se combinan en una única composición. En este punto, el(los) microorganismos se podrían convertir en un producto que contiene combinaciones de microorganismos fermentados por separado, cada uno de los cuales ha mostrado mejorar un atributo diferente de la planta. En una realización adicional, los conjuntos de microorganismos seleccionados por separado se pueden combinar en conjuntos de dos o más y utilizarse en métodos adicionales de la invención. En otra realización, los conjuntos de microorganismos seleccionados por separado se pueden separar en aislados individuales y luego los aislados individuales se combinan en conjuntos de dos o más y se utilizan en métodos adicionales de la invención. En una realización, los microorganismos combinados se aplican a la planta y/o al medio de crecimiento para la aplicación de dos o más presiones de selección en el mismo ciclo iterativo. Por ejemplo, en una combinación, los microorganismos capaces de mejorar el crecimiento de las plantas en un medio que contiene niveles bajos de fósforo disponible para las plantas se combinan con microorganismos capaces de potenciar el crecimiento de las plantas en suelos infestados con nematodos parásitos de las plantas. Los microorganismos combinados se agregan luego a un medio de crecimiento de plantas con bajos niveles de fósforo disponible en el que las plantas se hacen crecer durante un período adecuado, se aplican nematodos y las plantas se hacen crecer adicionalmente hasta que se puede expresar el daño de los nematodos. El grado de daño a las raíces de los nematodos y la biomasa de las plantas se evalúa de forma no destructiva y los microbios se aíslan de las plantas de mejor rendimiento para uso en una iteración posterior. Se pueden continuar rondas iterativas similares hasta que se alcance un nivel aceptable de crecimiento de las plantas bajo ambas presiones selectivas. Este enfoque ayudará a seleccionar microbios que mejoren sinérgicamente el rendimiento de las plantas, es decir, mejoren el crecimiento de las plantas y la resistencia a los nematodos en un grado mejor que el logrado si los microorganismos se aplican simplemente como una combinación de dos conjuntos seleccionados por separado. El mismo enfoque se podría utilizar en métodos de la invención que no emplean la aplicación de una o más presiones selectivas. Por ejemplo, los microorganismos adquiridos a partir de ejecuciones separadas de un método de la invención, cada uno de los cuales se muestra asociado con diferentes características deseables de la planta (a modo de ejemplo no limitante, contenido de azúcar o fibra y tasa de crecimiento, o color y altura de la flor) se podrían combinar en una única composición y aplicar a una o más plantas en una ronda adicional del método para la selección de plantas que tienen ambas características o incluso una característica adicional.

Cosecha

Después de la selección, se cosechan una o más plantas y se pueden examinar los tejidos vegetales para detectar microorganismos que forman asociaciones con las plantas (por ejemplo, asociaciones endofíticas, epífitas o rizosféricas).

Las técnicas descritas en esta sección se pueden utilizar para adquirir un segundo conjunto de microorganismos al concluir un método de la invención o para utilizar en cualquier repetición sucesiva de los métodos de la invención.

El uno o más microorganismos se pueden aislar de cualquier tejido apropiado de las plantas seleccionadas; por ejemplo, planta entera, tejido foliar, tejido de tallo, tejido de raíz y/o semillas. En una realización preferida, los microorganismos se aíslan del tejido de la raíz, del tallo o de los tejidos foliares y/o de las semillas de una o más plantas seleccionadas.

En determinadas realizaciones, los microorganismos se pueden adquirir en forma cruda, en la que no están aislados del material de origen en el que residen (tal como tejido vegetal o medio de crecimiento).

Cuando se produce el aislamiento de los microorganismos, se pueden aislar de las plantas utilizando cualquier método apropiado conocido en la técnica. Sin embargo, a modo de ejemplo, los métodos para aislar microbios endofíticos pueden incluir la escisión estéril del material vegetal de interés (por ejemplo, raíz, tallos, semillas), esterilización de la superficie con una solución adecuada (por ejemplo, hipoclorito de sodio al 2 %), después de lo cual el material vegetal se coloca en un medio nutritivo para el crecimiento microbiano, especialmente hongos filamentosos. Alternativamente, el material vegetal esterilizado en la superficie se puede triturar en un líquido estéril (normalmente agua) y la suspensión líquida, que incluyen pequeñas piezas del material vegetal triturado, se puede esparcir sobre la superficie de un medio o medios de agar sólido adecuados, que pueden o pueden no ser selectivos (por ejemplo, contener únicamente ácido fítico como fuente de fósforo). Este enfoque es especialmente útil para bacterias y levaduras que forman colonias aisladas y se pueden separar individualmente para separar placas de medio nutritivo y purificar posteriormente hasta obtener una única especie mediante métodos bien conocidos. Alternativamente, las muestras de raíz o follaje de la planta no se pueden esterilizar en la superficie, sino que solo se lavan suavemente, incluyendo de esta manera los microorganismos epífitos que habitan en la superficie en el proceso de aislamiento, o los microbios epífitos se pueden aislar por separado, al imprimir y levantar piezas de raíces de plantas, tallos de hojas en la superficie de un medio de agar y luego aislar las colonias individuales como se indicó anteriormente. Este enfoque es especialmente útil para bacterias y levaduras, por ejemplo. Alternativamente, las raíces se pueden procesar sin lavar pequeñas cantidades de suelo adherida a las raíces, incluyendo de esta manera microbios que colonizan la rizosfera de la planta. De lo contrario, el suelo adherido a las raíces se puede eliminar, diluir y esparcir en agar de medios selectivos y no selectivos adecuados para aislar colonias individuales de microbios rizosféricos. Se puede encontrar más metodología de ejemplo en: Strobel G and Daisy B (2003) Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products. Microbiology and Molecular Biology Reviews 67 (4): 491-502; Zinniel DK et al. (2002) Isolation and characterisation of endophytic colonising bacteria from agronomic crops and prairie plants. Applied and Environmental Microbiology 68 (5): 2198-2208; Manual of Environmental Microbiology, Hurst et al., ASM Press, Washington DC.

Los métodos de aislamiento se pueden basar en técnicas de elaboración de perfiles comunitarios independientes del cultivo que proporcionan información sobre la identidad y la actividad de los microbios presentes en una muestra determinada. Estos métodos pueden incluir, pero no se limitan a, técnicas de secuenciación que incluyen secuenciación de alto rendimiento y análisis filogenético, o cribado basado en micromatrices de ácidos nucleicos que codifican componentes de operones de ARNr u otros loci taxonómicamente informativos.

En realizaciones de la invención en las que se aíslan dos o más microorganismos del material vegetal y luego se separan en aislados individuales, se puede utilizar cualquier metodología apropiada para separar uno o más microorganismos entre sí. Sin embargo, a modo de ejemplo, los extractos microbianos preparados a partir de material vegetal se podrían esparcir en placas de agar, hacer crecer a una temperatura apropiada durante un período de tiempo adecuado y las colonias microbianas resultantes posteriormente seleccionar y hacer crecer en un medio apropiado (por ejemplo, sembradas en estrías sobre placas frescas o que se hacen crecer en un medio líquido). Las colonias se pueden seleccionar en base a la morfología o cualquier otro criterio de selección apropiado como se entenderá en la técnica. A modo de ejemplo adicional, se podrían utilizar medios selectivos.

Uno o más microorganismos se pueden recolectar (incluso en forma aislada o cruda) de las plantas (que incluyen la rizosfera como se describió anteriormente en el presente documento) en cualquier momento apropiado. En una realización, se cosechan en cualquier momento después de la germinación de la planta. Por ejemplo, se pueden aislar del período poco después de la germinación (donde la supervivencia en los primeros días después de la germinación es un problema, por ejemplo con la pudrición bacteriana y fúngica de la raíz y el cuello), y luego en cualquier estadio posterior, dependiendo del momento requerido para que una planta crezca para evidenciar un beneficio discriminatorio que permita su selección de la población de plantas (por ejemplo, para discriminar, digamos, las 10 primeras de 200 plantas).

El(los) inventor(es) ha(n) observado que diferentes microorganismos se pueden asociar con una planta en diferentes etapas de la vida de la planta. De acuerdo con lo anterior, cosechar una planta en diferentes momentos puede dar como resultado la selección de una población diferente de microorganismos. Dichos microorganismos pueden ser de particular beneficio para mejorar la condición, la supervivencia y el crecimiento de la planta en momentos críticos durante su vida: a modo de ejemplo, como se mencionó anteriormente en el presente documento, una planta puede ser susceptible al ataque de nematodos en momentos discretos durante su vida y la invención se puede utilizar para identificar y aislar una población de microorganismos que pueden aumentar la resistencia a dicho ataque en ese estadio particular de la vida.

En otra realización de la invención, en el caso de microorganismos que forman una asociación con una planta que permite la transmisión vertical de una generación o propágulo a la siguiente (por ejemplo asociaciones endofíticas o epífitas de semilla, o asociaciones endofíticas y epífitas con plantas/propágulos multiplicados vegetativamente) los microorganismos no se pueden aislar de la(s) planta(s). Al concluir un método de la invención, una planta objetivo o seleccionada se puede multiplicar por semilla o vegetativamente (junto con los microorganismos asociados) para impartir el(los) beneficio(s) a las plantas “hijas” de la siguiente generación o fase multiplicativa. De manera similar, cuando se desea una repetición sucesiva del método, se puede utilizar material vegetal (planta entera, tejido vegetal, parte de la planta) que comprende el conjunto de uno o más microorganismos en la etapa b) (primer aspecto) o en la etapa a) (segundo aspecto) de la repetición sucesiva.

Apilado

El(los) inventor(es) prevé(n) que se obtengan ventajas al apilar presiones selectivas en rondas repetidas del método de la invención. Esto puede permitir adquirir una población de microorganismos que pueden ayudar a una planta a sobrevivir en varias condiciones ambientales diferentes, por ejemplo resistiendo varias enfermedades diferentes y ataques de varios organismos diferentes.

De manera similar, el(los) inventor(es) prevé(n) que se obtienen ventajas al apilar los medios de selección (o los criterios de selección) de plantas en rondas repetidas del método de la invención. Esto puede permitir la adquisición de una población de microorganismos que pueden ayudar a una planta a tener varios rasgos deseables diferentes, por ejemplo.

También se podrían apilar presiones selectivas y criterios de selección en los métodos de la invención.

En una realización de la invención, uno o más microorganismos adquiridos de una o más plantas seleccionadas después de la exposición a una presión selectiva, como se describió anteriormente, se utilizan en una segunda ronda o ciclo del método; es decir, se proporcionan los microorganismos de las plantas seleccionadas, junto con una o más plantas y un medio de crecimiento, se aplica una presión selectiva, se seleccionan las plantas en un momento deseado y se aíslan los microorganismos de las plantas seleccionadas. Los microorganismos adquiridos en la segunda ronda del método se podrán utilizar en una ronda posterior, y así sucesivamente.

En una realización, la presión selectiva aplicada en cada repetición del método es diferente. Por ejemplo, en la primera ronda la presión puede ser un pH particular del suelo y en la segunda ronda la presión puede ser el ataque de nematodos. Sin embargo, en otras realizaciones de la invención, la presión selectiva aplicada en cada ronda puede ser la misma. También podría ser lo mismo pero aplicado en diferentes intensidades en cada ronda. Por ejemplo, en la primera ronda la presión selectiva puede ser una concentración particular de sal presente en el suelo. En la segunda ronda, la presión selectiva puede ser una mayor concentración de sal presente en el suelo. En una realización, la presión selectiva aumenta en rondas sucesivas en un patrón que puede ser lineal, escalonado o curvilíneo. Por ejemplo, en la ronda 1 de un proceso selectivo iterativo, el trigo más los microorganismos se pueden exponer a NaCl 100 mM, en la segunda a sal 110 mM, en la tercera a sal 120 mM, aumentando de esta manera la presión selectiva sobre las plantas a medida que se produce la adaptación a través de asociaciones planta/microorganismo mejoradas. Alternativamente, puede ser ventajoso mantener una presión selectiva de 120 mM durante varias rondas para permitir un ajuste más lento en el equilibrio de la población microbiana que subyace a las mejoras en la capacidad del trigo para crecer productivamente en un entorno con mayor contenido de sal.

En una realización, una presión selectiva se puede separar de manera disyuntiva de una etapa específica del proceso iterativo, particularmente la primera ronda de un ciclo iterativo. Por ejemplo, en la primera ronda es posible que no se aplique presión selectiva en absoluto. Pero después de que los microorganismos se hayan aislado de las plantas seleccionadas después de la exposición durante un período relevante a un medio de crecimiento y los microorganismos en la ronda 1, se aplican al medio de crecimiento de la planta junto con la planta, semilla, plántula, esqueje, propágulo o similares. para la ronda 2. Después de un tiempo adecuado se aplica una presión selectiva en la ronda 2 y en rondas sucesivas. Este tipo de selección puede ser especialmente relevante para factores de selección que disminuyen gravemente el tejido vegetal que es el objetivo de la selección. Por ejemplo, los nematodos son especialmente destructivos del tejido de las raíces y puede ser ventajoso permitir que microbios particulares se multipliquen a niveles altos en, dentro o alrededor de las raíces en la ronda 1 para permitir que se eliminen altas concentraciones de microorganismos de las raíces de las plantas seleccionadas en la ronda 1 aplicada al medio de crecimiento en la ronda 2.

Cuando se apilan criterios de selección, el uno o más microorganismos adquiridos de la una o más plantas seleccionadas, como se describió anteriormente, se utilizan en una segunda ronda o ciclo del método, donde se utiliza un criterio de selección diferente. Por ejemplo, en la primera ronda, es posible que se hayan seleccionado una o más plantas en base a la biomasa. En la segunda ronda, se pueden seleccionar una o más plantas en función de la producción de un compuesto particular. Los microorganismos de la segunda ronda del método se pueden utilizar luego en una ronda posterior, y así sucesivamente. Se puede emplear cualquier serie de criterios de selección diferentes en rondas sucesivas del método, según se desee o sea apropiado.

En una realización, el criterio de selección aplicado en cada repetición del método es diferente. Sin embargo, en otras realizaciones de la invención, los criterios de selección aplicados en cada ronda pueden ser los mismos. También podría ser lo mismo pero aplicado en diferentes intensidades en cada ronda. Por ejemplo, el criterio de selección puede ser niveles de fibra y el nivel de fibra requerido para que se seleccione una planta puede aumentar con rondas sucesivas del método. Los criterios selectivos pueden aumentar o disminuir en rondas sucesivas en un patrón que puede ser lineal, escalonado o curvilíneo.

Se debe apreciar que el método de la invención y el método de la divulgación se pueden combinar de manera que se alternen. Por ejemplo, se realiza un método de la divulgación y los microorganismos adquiridos en ese método se utilizan en la etapa a) de un método de la invención. Los microorganismos adquiridos en la etapa c) de un método de la invención luego se pueden utilizar en la etapa b) de un método de la divulgación. Esto se puede repetir tantas veces como sea necesario o deseado. Se debe apreciar que los métodos se pueden combinar en cualquier orden y en cualquier combinación o permutación. Por ejemplo, no es necesario que se alternen en una base uno por uno. Se puede realizar cualquier número de repeticiones de un método antes de cambiar a una o más rondas de otro método descrito en el presente documento. Los métodos de la invención y de la divulgación también se pueden ejecutar de forma independiente y luego los microorganismos adquiridos en los métodos se combinan y se utilizan en una ronda adicional de uno o ambos métodos, y así sucesivamente.

También se debe apreciar que en determinadas realizaciones de la invención, donde uno o más microorganismo(s) forma(n) una relación endofítica o epífita con una planta que permite la transmisión vertical de una generación o propágulo a la siguiente, no es necesario aislar los microorganismos de la(s) planta(s). Al concluir un método de la invención, una planta objetivo o seleccionada se puede multiplicar por semilla o vegetativamente (junto con los microorganismos asociados) para conferir el(los) beneficio(s) a las plantas “hijas” de la siguiente generación o fase multiplicativa. De manera similar, cuando se desea una repetición sucesiva del método, se puede utilizar material vegetal (planta entera, tejido vegetal, parte de la planta) que comprende el conjunto de uno o más microorganismos en la etapa b) (primer aspecto) o en la etapa a) (segundo aspecto) de la repetición sucesiva.

Se debe apreciar además que se pueden aplicar dos o más presiones selectivas y/o dos o más criterios de selección con cada iteración de un método de la invención.

Identificación de marcadores genéticos.

En una realización, los métodos de la divulgación implican identificar uno o más marcadores de plantas asociados con una o más propiedades beneficiosas en una planta (por ejemplo, el método de la divulgación) antes de someter una o más plantas a un medio de crecimiento en presencia de un primer conjunto de uno o más microorganismos. Los métodos de la invención implican identificar uno o más marcadores de plantas y/o uno o más marcadores de microorganismos asociados con una o más propiedades beneficiosas en una planta.

La etapa de identificar uno o más marcadores ocurre después de la etapa b) y/o después de la etapa c) y antes de la etapa a) de cualquier repetición sucesiva del método. También puede ocurrir después de la etapa c) al concluir un método de la invención.

En una realización, es posible que uno o más marcadores ya sean conocidos y se sepa que están asociados con una propiedad beneficiosa en una planta. De esta manera, puede ser posible identificar la presencia de una propiedad beneficiosa particular en la planta, antes de su manifestación física, por ejemplo. En otras realizaciones, es posible que uno o más marcadores no se hayan conocido previamente y los métodos de la invención permiten la identificación de nuevos marcadores o nuevas correlaciones o asociaciones de marcador/propiedad beneficiosa. Una vez que se identifican nuevas correlaciones o asociaciones de marcador/propiedad beneficiosa, se pueden utilizar en cualquier repetición sucesiva de un método de la invención para seleccionar plantas deseables.

Por lo tanto, la invención también proporciona métodos para identificar uno o más marcadores de plantas que están asociados con uno o más rasgos beneficiosos y/o uno o más marcadores de microorganismos que están asociados con uno o más rasgos de plantas beneficiosos.

Estos métodos generalmente implicarán realizar un método de la invención y cribar marcadores y/o correlaciones entre uno o más marcadores y la presencia de una o más propiedades beneficiosas en la planta.

Los marcadores pueden examinarse e identificarse utilizando cualquier metodología estándar conocida en la técnica a la que se refiere la invención. Sin embargo, a modo de ejemplo, se pueden utilizar métodos bien conocidos para la detección y análisis de los siguientes tipos de marcadores: polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), repeticiones de secuencias simples (SSR o microsatélites), RFLP y posiciones de elementos transponibles. De manera similar, las correlaciones entre la presencia o ausencia de uno o más marcadores y una o más propiedades beneficiosas se pueden identificar utilizando cualquier metodología estándar conocida en la técnica.

Microorganismos y composiciones que los contienen.

Además de los métodos descritos anteriormente en el presente documento, la divulgación se refiere a microorganismos obtenidos mediante dichos métodos y composiciones que comprenden dichos microorganismos. En su forma más simple, una composición que comprende uno o más microorganismos incluye un cultivo de microorganismos vivos, o microorganismos en estado(s) vivo(s) pero inactivo(s), que incluyen cultivos congelados, liofilizados o secos. Sin embargo, las composiciones pueden comprender otros ingredientes, como se analiza a continuación.

También se divulgan métodos para la producción de una composición para apoyar el crecimiento, la calidad y/o la salud de las plantas, o una composición para suprimir o inhibir el crecimiento, la calidad y/o la salud de las plantas, el método comprende las etapas de un método descrito anteriormente en el presente documento y la etapa adicional de combinar uno o más microorganismos con uno o más ingredientes adicionales.

Una “composición para apoyar el crecimiento, la salud y/o la calidad de las plantas” se debe considerar en sentido amplio para incluir composiciones que puedan ayudar al crecimiento, la salud general y/o la supervivencia de una planta, la condición de una planta, o ayudar en el mantenimiento o promover cualquier característica, cualidad y/o rasgo deseado. Se debería considerar que incluye mantener o alterar la producción de uno o más metabolitos u otros compuestos por una planta, así como alterar la expresión genética y similares. La frase no se debe interpretar en el sentido de que la composición es capaz de apoyar el crecimiento, la calidad y/o la salud de las plantas por sí sola. Sin embargo, en un caso las composiciones son adecuadas para este fin. Las composiciones de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, medios de crecimiento de plantas, suplementos minerales y micronutrientes para plantas, compost, fertilizantes, mezclas para macetas, insecticidas, fungicidas, medios para proteger contra infecciones o infestaciones de plagas y enfermedades, medios de cultivo de tejidos, recubrimientos de semilla, medios hidropónicos, composiciones que imparten tolerancia a la sequía o al estrés abiótico tal como toxicidad por metales, composiciones que modifican el pH del suelo.

Una “composición para inhibir o suprimir el crecimiento, la salud y/o la calidad de las plantas” se debe considerar en sentido amplio para incluir composiciones que pueden ayudar a suprimir o inhibir una o más características o cualidades y/o rasgos de una planta, que incluye su crecimiento, salud y/o supervivencia general. Se debería considerar que incluye mantener o alterar la producción de uno o más metabolitos u otros compuestos por una planta, así como alterar la expresión genética y similares. La frase no se debe interpretar en el sentido de que la composición es capaz de suprimir o inhibir el crecimiento, la calidad y/o la salud de las plantas por sí sola. Sin embargo, las composiciones pueden ser adecuadas para este fin. Las composiciones de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, medios de supresión del crecimiento de plantas, herbicidas, fertilizantes, mezclas para macetas, suplementos minerales y micronutrientes para plantas, compost, mezclas, insecticidas, fungicidas, medios de cultivo de tejidos, recubrimientos de semillas, medios hidropónicos, composiciones que imparten tolerancia a sequía o estrés abiótico como toxicidad por metales, composiciones que modifican el pH del suelo.

Aquellos expertos apreciarán fácilmente los tipos de ingredientes adicionales que se pueden combinar con uno o más microorganismos, teniendo en cuenta la naturaleza de la composición que se va a preparar, los microorganismos que se van a utilizar y/o el método de suministro de la composición de una planta o su entorno. Sin embargo, a modo de ejemplo, los ingredientes pueden incluir portadores líquidos y/o sólidos, conservantes microbianos, activadores microbianos que inducen actividades metabólicas específicas, aditivos para prolongar la vida microbiana (tales como geles y arcillas), polvos humectables, portadores granulados, suelo, arena, agentes que se sabe que son beneficiosos para la supervivencia microbiana y el crecimiento y la salud general de una planta, turba, materia orgánica, agentes de carga orgánicos e inorgánicos, otros microorganismos, agentes humectantes, nutrientes orgánicos e inorgánicos y minerales.

Dichas composiciones se pueden elaborar utilizando una metodología estándar teniendo en cuenta la naturaleza de los ingredientes que se van a utilizar.

Las composiciones desarrolladas a partir de los métodos descritos en el presente documento se pueden aplicar a una planta mediante cualquier número de métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Estos incluyen, por ejemplo: pulverizadores; polvos; gránulos; recubrimiento de semillas; pulverización o espolvoreo de semillas tras la aplicación; germinar la semilla en un lecho que contiene concentraciones adecuadas de la composición antes de la germinación y plantar las plántulas; perlas o gránulos aplicados junto a la semilla o planta durante la siembra o plantación, o aplicados a un cultivo existente a través de un proceso tal como la siembra directa; aplicación a esquejes de plantas u otros propágulos vegetativos al sumergir la superficie cortada o el propágulo en un sustrato microbiano líquido o en polvo antes de plantar; aplicación al suelo como “tratamiento del suelo” en forma de una pulverización, polvo, gránulos o composición de compost que se puede o no aplicar con fertilizantes para plantas antes o después de la siembra o plantación del cultivo; aplicación a un medio de crecimiento hidropónico; inoculación en tejidos vegetales bajo condiciones axénicas a través de inyección de composiciones o inoculación de otro modo a través de un corte en dichos tejidos, para el posterior establecimiento de una relación endofítica con la planta que se extiende hasta la semilla, o tejidos propagativos, de tal manera que la planta se pueda multiplicar mediante práctica agronómica convencional, junto con el microbio endofítico que proporciona un(os) beneficio(s) a la planta.

Método de producción de composiciones alternativas.

Cuando se cultivan microorganismos, pueden producir uno o más metabolitos que pasan al medio en el que residen. Dichos metabolitos pueden conferir propiedades beneficiosas a las plantas.

De acuerdo con lo anterior, en el presente documento se divulga un método para seleccionar o producir una composición capaz de impartir una o más propiedades beneficiosas a una planta, por ejemplo para apoyar el crecimiento, la calidad y/o la salud de la planta, o por ejemplo para suprimir o inhibir el crecimiento, calidad y/o salud de una planta, o para identificar microorganismos que sean capaces de producir dicha composición. En un caso, la composición está sustancialmente libre de microorganismos.

En un caso, el método es para la selección de una composición y comprende al menos las etapas de:

a) cultivar uno o más microorganismos seleccionados mediante un método del primer aspecto y/o un método del segundo aspecto en uno o más medios para proporcionar uno o más cultivos;

En otro caso, el método es para la selección de una composición y comprende al menos las etapas de:

En otro caso, el método es para la selección de uno o más microorganismos que sean capaces de producir una composición y comprende al menos las etapas de:

d) seleccionar uno o más microorganismos asociados con (o en otras palabras utilizados para producir) una o más composiciones que se observa que imparten una o más propiedades beneficiosas a una o más plantas.

d) seleccionar uno o más microorganismos asociados con (o en otras palabras utilizados para producir la) una o más composiciones que se observa que imparten una o más propiedades beneficiosas a una o más plantas; y,

e) utilizar uno o más microorganismos seleccionados en un método del primer, segundo, octavo (y/o relacionado) y/o noveno (y/o relacionado) aspectos de la invención.

En otro caso, la etapa b) del método de los dos párrafos anteriores se podría sustituir con la etapa de b) inactivar uno o más cultivos de la etapa a) para proporcionar una o más composiciones que contengan uno o más microorganismos inactivados, y luego utilizar esta composición en la etapa c) del proceso en lugar de la composición.

Como se utiliza en el presente documento, “ inactivar” el uno o más cultivos y “microorganismos inactivados” y términos similares se deben entender en sentido amplio que significan que los microorganismos se inactivan, matan, fijan o destruyen de otro modo sustancialmente. El término no se debe entender en el sentido de que todos los microorganismos se inactivan, matan o destruyen; sin embargo, esto puede ser preferible. En una realización, los microorganismos se inactivan, fijan, matan o destruyen hasta el grado de que la replicación autosostenida ya no es mensurable utilizando técnicas conocidas por un experto en la técnica.

Los microorganismos se pueden inactivar, matar o destruir utilizando cualquier técnica apropiada conocida en la técnica. Sin embargo, a modo de ejemplo, se pueden utilizar agentes químicos y/o medios físicos para hacerlo. En un caso, las células se lisan. En otro caso, las células se fijan por medios químicos, de modo que los organismos sean inviables, pero conservando su integridad estructural.

Como se utiliza en el presente documento, una “composición sustancialmente libre de microorganismos” se debe tomar en sentido amplio y no se debe interpretar en el sentido de que no hay microorganismos presentes, aunque esto se puede preferir.

En ciertos casos de estos métodos, los microorganismos se cultivan en dos o más (preferiblemente un gran número, por ejemplo, desde al menos aproximadamente 10 hasta aproximadamente 1000) cultivos mixtos utilizando medios que pueden apoyar el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos. Se puede utilizar cualquier medio apropiado conocido en la técnica. Sin embargo, a modo de ejemplo, los medios de crecimiento pueden incluir TSB (caldo de soja tríptico), caldo Luria-Bertani (LB) o caldo R2A. En otro caso, se pueden utilizar medios selectivos o de enriquecimiento que sean capaces de apoyar el crecimiento de microorganismos con una matriz de propiedades separadas pero deseables. A modo de ejemplo, se pueden utilizar los medios de enriquecimiento mencionados en otra parte del presente documento.

Los microorganismos se pueden cultivar en los medios durante cualquier período deseado. Después del cultivo, los microorganismos se separan del medio y se almacenan para uso posterior. También resulta una composición separada. Luego se someten a la composición una o más plantas en un medio de crecimiento adecuado (utilizando cualquier metodología conocida, o metodología como se describió anteriormente en el presente documento). Después de un período de tiempo, se evalúa el crecimiento de las plantas y se seleccionan las plantas (como se describió anteriormente en el presente documento, por ejemplo). Las plantas se seleccionan preferiblemente en base al tamaño. Sin embargo, se pueden utilizar otros criterios de selección como se menciona en el presente documento.

En un caso, el(los) microorganismo(s) que produce(n) el subconjunto de composiciones asociadas con las plantas seleccionadas se recupera del almacenamiento. Luego se pueden mezclar entre sí dos o más cultivos separados de los microorganismos y separarlos en dos o más subcultivos cultivados en dos o más medios diferentes.

Este proceso se puede repetir de forma iterativa tantas veces como se considere eficaz, con etapas progresivas que van refinando a menos medios y una diversidad más estrecha de microorganismos hasta que se logre un efecto deseable en las plantas en crecimiento con una mezcla de microbios que se pueden identificar, hacer crecer y almacenar indefinidamente como un inóculo de partida estándar para la producción de la composición.

Las composiciones divulgadas en el presente documento se pueden utilizar o formular solas o combinadas con uno o más ingredientes adicionales.

Se debe apreciar que la metodología general descrita anteriormente en el presente documento puede ser aplicable a este método, que incluye, pero no se limita a, medios de crecimiento, plantas, microorganismos, presiones selectivas, tiempos, procesamiento iterativo y combinaciones de los mismos.

Metodología adicional

La siguiente metodología se puede aplicar para identificar uno o más microorganismos como se describió anteriormente en el presente documento.

La Figura 1 muestra un sistema 10 de acuerdo con la divulgación. El sistema 10 incluye solicitantes 11, procesador 12 de solicitudes, instalación 13 de crecimiento, base de datos o biblioteca 14 y depósito 15.

La Figura 2 proporciona un diagrama de flujo que ilustra un método 20 de acuerdo con la divulgación. Las etapas mostradas en la Figura 2 se describirán con referencia al sistema 10 mostrado en la Figura 1.

Este aspecto de la invención se describe en términos de identificar uno o más microorganismos que pueden impartir una o más propiedades deseadas a una o más plantas, con referencia particular al método de la invención y/o al método de la divulgación. Sin embargo, se debe apreciar que es igualmente aplicable a la identificación de una o más composiciones que pueden impartir una o más propiedades deseadas a una o más plantas, o a uno o más microorganismos que producen una composición que puede impartir una o más propiedades deseadas a una o más plantas, como se describió anteriormente en el presente documento.

El método comienza en la etapa 21 con un solicitante 11 que identifica una planta (o una clase o grupo de plantas). Las razones por las que se pueden identificar plantas o tipos de plantas particulares serán evidentes para aquellos expertos en la técnica. Sin embargo, a modo de ejemplo, se puede haber descubierto que una planta que se caracteriza en general por tener una alta tasa de crecimiento está creciendo a tasas más bajas o no crece en absoluto, puede haber simplemente un deseo de mejorar las tasas de crecimiento existentes o puede haber un deseo de introducir una planta en un clima/entorno/región geográfica diferente. La divulgación no se limita a conferir mejoras a planta(s) particular(es) y se puede utilizar para inhibir el crecimiento o afectar negativamente de otro modo a la(s) planta(s).

En la etapa 22, el solicitante 11 envía la planta y/o la identidad de la misma a un procesador 12 de solicitudes. El solicitante 11 puede proporcionar información relevante adicional, como por qué o qué propiedades busca mejorar. Aunque sólo se muestra un procesador 12 de solicitudes, se apreciará que se puede proporcionar más de uno en el sistema 10.

Cuando un solicitante 11 identifica una clase o grupo de plantas, se podrá evaluar más de una variedad vegetal. Alternativa o adicionalmente, la selección de una o más variedades de plantas se puede realizar en otro lugar dentro del sistema 10 en base al grupo o clase identificada, incluso después de la evaluación de diferentes variedades, que incluyen utilizar diferentes microorganismos de acuerdo con los métodos divulgados en el presente documento.

Las solicitudes se pueden recibir cómodamente a través de Internet a través de un navegador web, aunque no se limitan a ello. El uso de un navegador web se puede utilizar adicional o alternativamente para permitir que un solicitante 11 vea informes sobre el progreso realizado en respuesta a su solicitud. Por ejemplo, se pueden proporcionar medidas de crecimiento.

En la etapa 23, el procesador 12 de solicitudes recibe y procesa la solicitud, esencialmente al iniciar el desarrollo del método para la selección de uno o más microorganismos de acuerdo con el método de la divulgación. Tenga en cuenta que el procesador 12 de solicitudes puede realizar o no activamente el método, o puede realizar sólo partes del mismo. El procesador 12 de solicitudes puede actuar como un intermediario o agente entre el solicitante 11 y las partes capaces de realizar el método de la divulgación. También, se pueden hacer diferentes disposiciones en respuesta a diferentes solicitudes. Por ejemplo, para una solicitud, el entorno alrededor del procesador 12 de solicitudes puede ser adecuado para evaluar una planta particular pero no adecuado para otra, requiriendo la asistencia de una instalación de terceros. Esto se podría deber al deseo de realizar la prueba en un tipo de suelo, altitud o clima en particular. También serán evidentes otros factores, aunque se aprecia que se pueden utilizar entornos “artificiales”. Además, pueden tener lugar diversos grados de interacción del usuario en el procesador 12 de solicitudes. Un procesador de ordenador puede seleccionar parámetros o condiciones para un estudio en base a la entrada de datos por parte de un solicitante 11. Como se apreciará, proporcionar una solicitud de información estructurada puede ayudar a lograr esto y, cuando sea necesario, se puede hacer referencia a bases de datos, que incluyen la base 14 de datos.

En la etapa 24, se seleccionan los parámetros del proceso de evaluación. Por ejemplo, se puede hacer referencia a la base 14 de datos para microorganismos que pueden proporcionar la mejora deseada en la(s) planta(s). Si bien hasta la fecha se han proporcionado pocos datos en la técnica sobre microorganismos que tienen asociaciones beneficiosas con variedades de plantas particulares, esto se mejorará a través del funcionamiento continuo de los métodos descritos en el presente documento y almacenados en la base 14 de datos. También se pueden seleccionar otros parámetros como tipo(s) de planta y condiciones ambientales.

En la etapa 25, la solicitud (o porciones de la misma) y los parámetros de evaluación se envían a la instalación 13 de crecimiento que puede obtener microorganismos adecuados del depósito 15. Estos pueden haber sido identificados previamente o no. Aunque sólo se muestra una instalación 13 de crecimiento y un depósito 15, se apreciará que la invención no está tan limitada. Además, dos o más cualesquiera de procesador 12 de solicitudes, instalación 13 de crecimiento, base 14 de datos y depósito 15 pueden estar ubicados conjuntamente y/o bajo el mismo control.

En la etapa 26, se realiza un proceso de selección, preferiblemente de acuerdo con el método de selección de la divulgación.

En la etapa 27, se envía una respuesta a la solicitud. Se puede enviar una respuesta al solicitante 11 y/o a un tercero y preferiblemente incluye al menos uno de al menos un subconjunto de los resultados generados en la etapa 26, identificación de planta(s), planta(s), identificación de microorganismo(s) microorganismo(s), o planta(s) proporcionada(s) en asociación con microorganismos, a saber, aquellas que han demostrado proporcionar beneficios en la etapa 26.

En la etapa 28, la base 14 de datos se puede actualizar con los resultados del proceso de selección de la etapa 26. Esta etapa se puede realizar antes de la etapa 27, incluso periódicamente o en otros estadios en los que se lleva a cabo el proceso de selección. Preferiblemente, se registran al menos detalles de nuevas asociaciones beneficiosas entre planta(s) y microorganismos. Se apreciará que también se registrarán preferiblemente asociaciones incompatibles o menos beneficiosas, construyéndose así con el tiempo un marco de conocimiento de plantas y microorganismos.

Se apreciará que uno o más de las etapas de la Figura 2 se pueden omitir o repetir. Por ejemplo, la instalación 13 de crecimiento puede generar resultados en la etapa 26 y en respuesta a los mismos, se pueden repetir uno o más de las etapas 21 a 26.

Por lo tanto, la invención proporciona medios y métodos para mejorar la(s) planta(s) (o el crecimiento u otras características de las mismas). Esto se logra permitiendo a un solicitante 11 en una primera región geográfica (por ejemplo, país) o entorno definido de otro modo (por ejemplo, mediante parámetros o características que afectan las condiciones de crecimiento tales como salinidad o acidez del suelo) acceder a la biodiversidad microbiológica no presente o de presencia limitada en la primera región con fines de mejora vegetal en la primera o en otra región. La otra región puede estar en un país extranjero, pero puede estar definida de otro modo por las características de ese entorno que afectan a una planta en lugar de estar definida por fronteras políticas. De acuerdo con lo anterior, la invención puede permitir a un solicitante obtener los efectos beneficiosos de un(os) microorganismo(s) particular(es) en una(s) planta(s) particular(es) en una primera región, incluso aunque dichos microorganismos puedan no estar presentes o tengan una presencia limitada en la primera región.

A continuación se proporciona un ejemplo de implementación de la invención.

1. Una empresa en, digamos, Nueva Zelanda (empresa local), establece una relación contractual con una segunda empresa, digamos en el extranjero (empresa extranjera).

2. La empresa extranjera acepta enviar semillas, esquejes u otros propágulos de plantas (cultivares extranjeros) a la empresa local a partir de cultivares de plantas adaptados al(los) entorno(s) de su propio país o de otros países extranjeros, con el fin de obtener acceso a elementos de la biodiversidad microbiana terrestre y marina de Nueva Zelanda que pueden formar asociaciones beneficiosas entre plantas y microorganismos con el cultivar extranjero.

3. La naturaleza del beneficio puede abarcar una mayor productividad de la planta, por ejemplo a través de uno o más de, pero sin limitarse a: aumento de la masa radicular o foliar, o a través de un aumento en la eficiencia en la utilización de nutrientes a través de la fijación de nitrógeno por diazótrofos tales como Klebsiella o Rhizobium, o a través de la liberación de nutrientes vegetales del suelo, tales como los fosfatos liberados en el suelo a través de la producción de fitasas microbianas, o a través de una resistencia mejorada al ataque de plagas y enfermedades que abarcan una amplia gama de nematodos, insectos, enfermedades microbianas y virales, o a través de mejoras en la capacidad de la planta para resistir condiciones ambientales adversas tales como sequía, salinidad, temperaturas extremas, minerales tóxicos del suelo, o a través de mejoras en el fenotipo de la planta, por ejemplo, fecha de floración, o cambios en la forma física, por ejemplo, frecuencia del color de las raíces o ramificaciones foliares, o cambios en el perfil químico, que incluyen compuestos asociados con el sabor, el olor o las propiedades que hacen que la planta sea adecuada para un propósito particular.

4. En Nueva Zelanda, la empresa local identifica qué microorganismos autóctonos pueden formar una asociación con la planta extranjera al exponer la semilla a los microorganismos, con o sin conocimiento de sus probables efectos sobre la planta, mediante el método de germinación de la semilla y crecimiento de la planta en un material de crecimiento que asegura el contacto de la planta durante su crecimiento con microorganismos autóctonos a través del recubrimiento de la semilla, la inoculación directa en la semilla o la plántula en germinación y/o la contaminación del medio de crecimiento. La invención no se limita a esta disposición o metodología. Por ejemplo, puede ser evidente que los microorganismos presentes en suelos distintos de Nueva Zelanda pueden proporcionar beneficios y se pueden realizar pruebas en dichas regiones además de Nueva Zelanda o en lugar de ella. También, se podrán crear entornos artificiales. Con referencia al ejemplo inmediatamente anterior, esto se puede lograr al obtener suelo y/o microorganismos de dichas regiones y llevar a cabo las pruebas en, digamos, Nueva Zelanda. Como será evidente, dichas realizaciones pueden incluir disposiciones para el control artificial de las condiciones climáticas, pero no se limitan a parámetros. Por tanto, la invención no se limita a realizar pruebas en una región en base a sus microorganismos autóctonos: los microorganismos se pueden introducir artificialmente para llevar a cabo las pruebas en otro lugar que no sea el entorno natural de los microorganismos.

5. El período de crecimiento y las condiciones físicas bajo las que se llevan a cabo pueden variar ampliamente de acuerdo con las especies de plantas y los rasgos específicos de mejora de las plantas, incluso en base a los parámetros deseados o especificados por la empresa extranjera. Después del período relevante de crecimiento de las plantas, la naturaleza de las posibles asociaciones planta-microorganismos se puede determinar mediante evaluación microbiológica para determinar si los microorganismos han formado una asociación endofítica, epífita o rizosférica con el cultivo extranjero. Una o más de las etapas anteriores se pueden repetir según sea necesario hasta que se encuentre la relación deseada.

6. Cuando se demuestra dicha(s) asociación(es), los microorganismos forman una colección de microorganismos (digamos autóctonos de Nueva Zelanda) capaces de asociarse con el cultivo o planta (digamos extranjera).

7. En una realización de la invención, los aislados microbianos de la colección se pueden, por ejemplo, recubrir sobre semillas, inocularse en semillas o plántulas, o inocular en un medio de cultivo que puede ser estéril o no.

8. Después de un período adecuado, las plantas se evalúan para determinar un crecimiento foliar y radicular mejorado u otras características deseadas y/o se pueden exponer a factores estresantes ambientales diseñados para identificar las asociaciones planta-microorganismo más capaces de proporcionar beneficios a la planta de la manera deseada por la empresa extranjera.

9. Se proporcionan ejemplos de dichos factores estresantes o criterios de selección en el punto 3 anterior y en otros lugares del presente documento, y cuando plagas, enfermedades u otros parámetros idénticos del segundo entorno extranjero no estén presentes en la región local o de prueba (es decir, Nueva Zelanda en el ejemplo), se pueden seleccionar enfermedades microbianas similares, plagas de nematodos e insectos u otros parámetros más similares a los del entorno extranjero y que se puedan considerar aceptables para la empresa extranjera. Como se mencionó anteriormente en 4, la invención también incluye la introducción de material extranjero o la creación de condiciones artificiales en la región local o de prueba.

10. Las etapas que implican hacer crecer una o más plantas en presencia de uno o más microorganismos, seleccionar una o más plantas con las características deseadas y adquirir el(los) microorganismo(s) que forma(n) una asociación con la planta se repetirá una o más veces.

11. Una o más etapas que implican identificar uno o más marcadores de plantas y/o microorganismos de acuerdo con la invención se realizan en el momento apropiado (tal como se describe en el método de la invención o el método de la divulgación descrito anteriormente en el presente documento).

12. Este proceso identifica los microorganismos de élite que proporcionan beneficios comercialmente significativos al crecimiento del cultivar extranjero y pueden enviarse a la empresa extranjera para realizar más pruebas y seleccionarlos en el entorno extranjero.

13. En una realización adicional, la empresa extranjera aceptará que los microorganismos encontrados en o dentro de las semillas, esquejes o propágulos del cultivar extranjero se agreguen a la colección de la empresa local para ampliar la colección para uso tanto en ese cultivar como en otros cultivares extranjeros recibidos de otras empresas para pruebas similares.

En una realización alternativa, los aislados microbianos capaces de formar asociaciones planta-microorganismo con el cultivar extranjero, es decir, la colección, se envían a la segunda empresa para su prueba y selección, de tal manera que los ítems 7-12 anteriores se realicen por y/o en los terrenos de la segunda empresa. Esto se puede realizar por o bajo el control de la primera empresa.

Como alternativa adicional, en lugar de identificar y utilizar microorganismo(s) predeterminado(s) de una colección, la empresa local puede simplemente exponer la semilla a microorganismos autóctonos, con o sin conocimiento de sus probables efectos en la planta, por ejemplo, al germinar la semilla y hacer crecer la planta en un material de crecimiento que asegure el contacto de la planta durante su crecimiento con microorganismos autóctonos mediante el recubrimiento de la semilla, la inoculación directa en la semilla o la plántula en germinación y/o contaminación del medio de cultivo o de otro modo. Como resultará evidente, la empresa local puede, adicional o alternativamente, disponer pruebas similares en otras regiones, donde puedan estar presentes los mismos o diferentes microorganismos. El período de crecimiento y las condiciones físicas bajo las que se llevan a cabo pueden variar ampliamente de acuerdo con las especies de plantas y los rasgos específicos de las plantas deseados por la empresa extranjera. Después de un período de crecimiento de la planta, la naturaleza de posibles asociaciones planta-microorganismo se puede determinar de manera similar a aquella descrita anteriormente.

Ejemplos

La invención es como se define en las reivindicaciones. Cualquiera de los siguientes ejemplos que no caen dentro del alcance de las reivindicaciones no forman parte de la invención y se proporcionan únicamente con fines comparativos.

Uso de un proceso para optimizar la expresión de loci de rasgos cuantitativos (QTL) para fenotipos de plantas beneficiosas

La expresión de los QTL de las plantas a menudo puede variar dependiendo de factores ambientales, que incluyen la composición y actividad de las comunidades microbianas locales. Esta invención utiliza el proceso de selección dirigida para generar plantas con expresión de QTL microbianamente optimizada para potenciar la estabilidad y eficacia del fenotipo.

Los métodos de los primeros 2 ejemplos involucran 3 procesos clave

- Captura de microbios: las plantas se exponen a una colección diversa de microbios generando un conjunto de material enriquecido con microbios capaces de asociarse con las especies de plantas de interés. Los extractos que contienen los microbios se preparan y utilizan como inóculo en la siguiente etapa.

- Selección: Rondas iterativas de inoculación microbiana, crecimiento de plantas y selección basadas en algún rasgo fenotípico. Las plantas/semillas se inoculan inicialmente utilizando extractos de la ronda de captura de microbios. En rondas adicionales se utilizan extractos preparados a partir de las plantas cultivadas en la ronda anterior. Las condiciones de crecimiento pueden incluir, pero no necesariamente requieren, alguna forma de estrés biótico o abiótico.

-Aislamiento de microbios: Los microbios se aíslan de plantas que exhiben el rasgo fenotípico deseado y se utilizan como pistas para el desarrollo de productos comerciales.

Ejemplo 1: Identificación de microorganismos que optimicen la expresión de loci de rasgos cuantitativos (QTL) asociados a fenotipos específicos.

Etapa 1: Identificar loci de interés. Los QTL específicos y los marcadores de expresión genotípicos y/o fenotípicos asociados se identifican dentro de la planta de elección. Por ejemplo, pero sin limitación, se puede identificar QTL que codifica la tolerancia al aluminio en el trigo.

Etapa 2: Captura de microbios: Las semillas no tratadas de uno o varios cultivares seleccionados se plantan en macetas en una amplia variedad de suelos. Los suelos pueden incluir modificaciones adicionales que comprenden cultivos puros de microorganismos, mezclas de microorganismos o materiales que contienen microorganismos que se derivan de otras fuentes y pueden incluir microbios GM. Alternativamente, las semillas no tratadas se plantan en una amplia variedad de suelos que son selectivos para el QTL de interés (por ejemplo, concentraciones elevadas de Al para el QTL de tolerancia al Al).

Etapa 3: Preparación del inóculo: Después de un período adecuado de crecimiento, las plantas se retiran del suelo o se lavan, y los microorganismos se aíslan de las raíces y tallos/follaje, ya sea como aislados individuales en cultivo puro o como poblaciones mixtas, por ejemplo, como una suspensión microbiana de un triturado acuoso de raíz y/o un triturado de tallo/foliar.

Etapa 4: Primera ronda de selección. Los microorganismos se agregan a un medio de crecimiento vegetal en el que luego se plantan semillas sin tratar. Alternativamente, el(los) microorganismo(s) se mezcla(n) con un material de recubrimiento de semillas adecuado, por ejemplo, un gel y se recubre las semillas antes de plantarlas en un medio de crecimiento vegetal similar. Alternativamente, las semillas se geminan y luego se exponen a los microorganismos durante un período corto de, digamos, 1 a 24 horas (para maximizar la posibilidad de que los microbios puedan formar una asociación endofítica o epífita con la planta en germinación) y luego se plantan en un medio de crecimiento similar. En cada uno de estos casos, el medio de cultivo puede ser inicialmente estéril, aunque esto no es esencial y se aplican más microorganismos al medio de crecimiento y/o a la planta.

El medio de crecimiento y/o las condiciones de crecimiento están diseñados para inducir la expresión del QTL, por ejemplo niveles elevados de Al para la inducción de QTL con tolerancia al. El medio de crecimiento puede ser un tipo de suelo específico o puede ser un rango de tipos de suelo diferentes. Después de un período apropiado de crecimiento, digamos dos semanas (pero en cualquier momento deseable entre la germinación y la recolección de semillas), se criban las plantas para determinar la expresión del QTL. La expresión cuantitativa se puede determinar utilizando métodos que cuantifican marcadores genotípicos o productos de los mismos, que incluyen qPCR de ARNm, análisis de micromatrices de expresión génica, secuenciación de alto rendimiento de transcripciones, análisis de proteoma o metaboloma.

Etapa 5: Rondas iterativas de selección. Las mejores plantas se seleccionan según lo determinado por el nivel más alto de expresión de QTL. Los criterios de selección pueden incluir o no otros factores tales como la expresión de otros rasgos fenotípicos deseables tales como el crecimiento del forraje y/o raíces determinado por el peso seco, o análisis de imágenes o similares, y/o síntomas de enfermedades. Los microorganismos radiculares y foliares de las plantas seleccionadas se aíslan y se preparan para agregarse a las semillas y/o al medio de cultivo como suspensiones individuales o combinadas, como en la etapa 3.

Todo el proceso desde la etapa 3 hasta el final de la etapa 5 se puede repetir de forma iterativa, con o sin aumentar la presión selectiva para la expresión de QTL.

Etapa 6: Aislamiento. Después de una serie de iteraciones hasta el punto en el que se considera que la expresión de QTL se estabiliza y se logra el mejor fenotipo, se aíslan los microbios de las plantas con mejor rendimiento. Luego, estas cepas microbianas se utilizan individualmente o en una mezcla para desarrollar un producto comercial que optimice la expresión de QTL y fenotipos asociados.

Ejemplo 2: Identificación de loci de rasgos cuantitativos (QTL) inducidos microbianamente asociados con rasgos beneficiosos de las plantas.

Etapa 1: Captura de microbios: Las semillas no tratadas de un cultivar seleccionado se plantan en una amplia variedad de suelos. Los suelos pueden incluir modificaciones adicionales que comprenden cultivos puros de microorganismos, mezclas de microorganismos o materiales que contienen microorganismos que se derivan de otras fuentes y pueden incluir microbios GM. Alternativamente, las semillas no tratadas se plantan en una amplia variedad de suelos que son selectivos para los QTL de interés (por ejemplo, concentraciones elevadas de Al para los QTL con tolerancia al Al).

Etapa 2: Preparación del inóculo: Después de un período adecuado de crecimiento, las plantas se retiran del suelo o se lavan, y los microorganismos se aíslan de las raíces y tallos/follaje, ya sea como aislados individuales en cultivo puro o como poblaciones mixtas, por ejemplo, como una suspensión microbiana de un triturado acuoso de raíz y/o un triturado de tallo/foliar.

Etapa 3: Selección. Se agregan los microorganismos a un medio de crecimiento de plantas en el que luego se plantan semillas sin tratar. Alternativamente, el(los) microorganismo(s) se mezcla(n) con un material de recubrimiento de semillas adecuado, por ejemplo, un gel y se recubren las semillas antes de plantarlas en un medio de crecimiento vegetal similar. Alternativamente, las semillas se germinan y luego se exponen a los microorganismos durante un período corto de, digamos, 1 a 24 horas (para maximizar la posibilidad de que los microbios puedan formar una asociación endofítica o epífita con la planta en germinación) y luego se plantan en un medio de crecimiento similar. En cada uno de estos casos, el medio de cultivo puede ser inicialmente estéril, aunque esto no es esencial y se aplican microorganismos adicionales al medio de crecimiento y/o a la planta.

El medio de crecimiento y/o las condiciones de crecimiento se pueden diseñar para inducir una respuesta a un estrés biótico o abiótico específico y pueden ser un tipo de suelo específico o pueden ser un rango de tipos de suelo diferentes. Después de un período de crecimiento apropiado (pero en cualquier momento deseable entre la germinación y la recolección de las semillas), las plantas se criban para determinar la expresión del fenotipo deseado (por ejemplo, aumento del peso foliar) y se seleccionan las mejores plantas. Los criterios de selección pueden incluir un solo factor o una combinación de factores. Los microorganismos radiculares y foliares de las plantas seleccionadas se aíslan y se preparan para agregarse a las semillas y/o al medio de crecimiento como suspensiones individuales o combinadas, como en la etapa 2.

Todo el proceso desde la etapa 2 hasta el final de la etapa 3 se puede repetir de forma iterativa, con o sin aumentar la presión selectiva para un fenotipo específico. Todas las rondas incluyen un control que comprende plantas en suelo normal a las que no se les ha agregado ningún extracto microbiano.

Etapa 4: Aislamiento microbiano y evaluación de la expresión de genes vegetales. Después de varias iteraciones hasta el punto en el que se considera que se logra el mejor fenotipo, se aíslan los microbios en las plantas de mejor rendimiento y se evalúa la expresión genética de la planta, en relación con los controles en los que no se ha aplicado ninguna selección microbiana. Los patrones de expresión se pueden determinar utilizando métodos que cuantifican marcadores genotípicos o productos de los mismos, que incluyen qPCR de ARNm, análisis de micromatrices de expresión génica, secuenciación de alto rendimiento de transcripciones, análisis de proteoma o metaboloma. También se pueden incluir métodos de genotipado convencionales y de alto rendimiento (por ejemplo, análisis de SNP) para evaluar los patrones de expresión en el contexto de la variación genotípica.

El aislamiento de microbios puede realizarse a través del uso de métodos que permitan la identificación independiente del cultivo de los constituyentes del microbioma de la planta. Dichos métodos pueden incluir, pero no se limitan a, secuenciación de alto rendimiento o análisis de micromatrices de genes de ARNr.

Etapa 5: Elaboración de patrones de expresión génica inducidos microbianamente que se asocian con rasgos beneficiosos de las plantas. Las cepas microbianas aisladas en la etapa 4 se pueden utilizar individualmente o en una mezcla para elaborar más los efectos de la interacción microbiana en la expresión de genes de plantas bajo diferentes condiciones de crecimiento y en diferentes momentos de la vida de la planta. El preacondicionamiento de los microbios antes de su aplicación a la planta (por ejemplo, a través del crecimiento en diferentes medios o en presencia de estrés biótico o abiótico) también se puede evaluar para determinar sus efectos sobre la expresión genética de la planta, lo que permite una optimización adicional de los rasgos inducidos microbianamente.

Una vez que se han identificado los QTL que se asocian con rasgos de plantas beneficiosos inducidos microbianamente, se pueden desarrollar marcadores para uso en el mejoramiento de cultivos utilizando la selección asistida por marcadores (MAS). Los QTL también se pueden utilizar como objetivos para modificaciones genéticas que permitan la expresión del fenotipo en la ausencia de un inductor microbiano.

Ejemplo 3: Uso de un proceso para seleccionar endófitos portados por semillas que transmiten un rasgo beneficioso para el cultivo

Pastos forrajeros que expresan rasgos beneficiosos como resistencia a los insectos y tolerancia mejorada a factores estresantes tanto bióticos como abióticos a través de cepas del hongo portado por semillas Neotyphodium sp. han sido ampliamente adoptados por agricultores de Nueva Zelanda y otros lugares. Sería deseable extender los beneficios de rasgos similares a los expresados por este hongo portado por semillas y otras especies similares de la familia de los hongos, a un rango más amplio de microbios endófitos transmitidos por semillas, proporcionando de esta manera acceso a un rango mucho más amplio de rasgos beneficiosos para los cultivos.

Etapa 1. Las semillas de raigrás sin tratar se plantan en una amplia variedad de suelos en macetas pequeñas. Los suelos pueden incluir modificaciones adicionales que comprendan cultivos puros de microorganismos, mezclas de microorganismos o materiales que contengan microorganismos derivados de otras fuentes.

Etapa 2. Después de un período de crecimiento adecuado, las plantas se eliminan del suelo por lavado, se esteriliza la superficie con una combinación de etanol e hipoclorito de sodio u otros métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica, y se aíslan los microorganismos endofíticos (endófitos) de los tejidos internos de las raíces y tallos/follaje y semillas, ya sea como aislados individuales en cultivo puro o como poblaciones mixtas, por ejemplo, como una suspensión microbiana de un triturado acuoso de raíz y/o un triturado de tallo/foliar.

Etapa 3. Luego, los microorganismos endófitos se agregan a un medio de crecimiento vegetal en el que se plantan semillas de raigrás pregerminadas y esterilizadas en la superficie (se comprueba la esterilidad de las semillas al germinar en placas de agar nutritivo). Alternativamente, el(los) microorganismo(s) se mezcla(n) con un material de recubrimiento de semillas adecuado, por ejemplo, un gel y se aplica sobre semillas esterilizadas en la superficie antes de plantarlas en un medio vegetal similar. Alternativamente, las semillas esterilizadas en la superficie se germinan sobre placas de agar nutritivo, se verifica su esterilidad y luego se exponen a los microorganismos durante un período corto (usualmente entre 1 y 24 horas para maximizar la posibilidad de que los microbios formen una asociación endofítica o epífita con la planta en germinación) y luego se planta en un medio de crecimiento similar. En cada uno de estos casos, el medio de crecimiento puede ser inicialmente estéril, aunque esto no es esencial y se pueden aplicar más microorganismos al medio de crecimiento y/o a la planta.

Etapa 4). Después de un período de crecimiento adecuado, por ejemplo, Después de 4 a 6 semanas, se evalúan las plantas para determinar la expresión del fenotipo deseado. Los fenotipos pueden incluir una resistencia relativa a las presiones de selección abiótica, tales como el crecimiento relativo en condiciones de deficiencia de nutrientes, por ejemplo, nitrógeno o fósforo, crecimiento en un medio alto en salinidad o deficiente en agua. Las presiones de selección también podrían ser bióticas, tales como la exposición a plagas de insectos, nematodos parásitos de las plantas o enfermedades de las plantas. Alternativamente, no se puede aplicar ninguna selección y las plantas se seleccionan simplemente en función de un atributo fenotípico tal como color mejorado, forma de la planta, expresión de metabolitos o similares.

Etapa 5). A las plantas seleccionadas se les permite crecer hasta el punto de formación de semillas. En este estadio, se puede cribar un subconjunto de semillas de cada planta para determinar si son portadoras de endófitos utilizando métodos independientes o dependientes del cultivo. Las semillas restantes de las plantas que producen resultados positivos en el cribado se germinan y se plantan sin adición microbiana en una ronda adicional de selección para enriquecer el transporte de endófitos y la capacidad de transmitir el fenotipo deseado como se describe en las etapas 3-5.

Alternativamente, los microbios endofíticos se pueden adquirir de un subconjunto de semillas de cada planta, ya sea como aislados de semillas esterilizadas en la superficie o como explantes, o como una suspensión microbiana preparada, por ejemplo, al triturar la semilla esterilizada en la superficie en una solución acuosa. Los aislados y preparaciones se utilizan como inóculo para plantas que surgen de semillas esterilizadas en la superficie como se describe en la etapa 3.

En una variación adicional del método, la selección para la transmisión del rasgo por semilla puede tener lugar en la siguiente generación al esterilizar en superficie un subconjunto de semillas (con o sin cribado previo) de las plantas seleccionadas de la generación anterior y permitiéndoles germinar y crecer durante el período en el que se lleva a cabo el cribado fenotípico como se describe generalmente en las etapas 3 y 4 (es decir, antes de la formación de semillas). Se seleccionan las plantas que exhiben el fenotipo deseado en esta generación (es decir, mediante transmisión por semillas) y se preparan explantes de tejido y/o se aíslan microbios de los tejidos vegetales y/o se preparan suspensiones microbianas crudas al triturar la superficie del follaje o las raíces en una solución acuosa. Una o una combinación de estas preparaciones se utilizan como inóculo para rondas iterativas adicionales de crecimiento, selección y recolección de semillas, como se describe en las etapas 3-5. Alternativamente, las semillas restantes de plantas que exhiben el rasgo deseado portado por semillas se pueden germinar y plantar sin adición microbiana en una ronda adicional de selección para enriquecer el transporte de endófitos y la capacidad de transmitir el fenotipo deseado como se describe en las etapas 3-5. Etapa 6). Al final de rondas sucesivas de este proceso iterativo, según lo determinado por la generación de un fenotipo transmitido por semilla deseado, se seleccionan las mejores líneas de semillas para evaluación comercial y desarrollo de cultivares.

En este ejemplo, antes del proceso se identifican uno o más QTL de una planta y/o microorganismo que está asociado con uno o más rasgos beneficiosos. Alternativamente, uno o más de dichos QTL se identifican después de la adquisición de uno o más microorganismos o en el momento de la selección de una o más plantas.

La invención se ha descrito en el presente documento, con referencia a determinadas realizaciones preferidas, para permitir al lector practicar la invención sin experimentación indebida. Además, los títulos, encabezados o similares se proporcionan para potenciar la comprensión del lector de este documento y no se deben interpretar como limitativos del alcance de la presente invención.

La referencia a cualesquier solicitudes, patentes y publicaciones en esta especificación no es, ni debe tomarse como, un reconocimiento o cualquier forma de sugerencia de que constituyen una técnica anterior válida o forman parte del conocimiento general común en cualquier país del mundo.

A lo largo de esta especificación y cualquier reivindicación que sigue, a menos que el contexto requiera lo contrario, las palabras “comprende”, “que comprende” y similares, se deben interpretar en un sentido inclusivo en contraposición a un sentido exclusivo, es decir, en el sentido de “que incluye, pero no se limita a”.

Bibliografía

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Fahraeus, G. (1957). J. GenMicrobiol. 16: 374-381 Colby, R. S., “Calculating Synergistic and Antagonistic Responses of Herbicide Combinations, 1967 Weeds, vol. 15, pp. 20-22

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para la selección de uno o más microorganismos capaces de impartir una o más propiedades beneficiosas a una planta, el método comprende al menos las etapas de:

a) someter una o más plantas a un medio de crecimiento en presencia de un primer conjunto de uno o más microorganismos, opcionalmente en el que la una o más plantas comprenden semillas, plántulas, esquejes y/o propágulos de las mismas; y en el que la una o más plantas se someten a al menos una presión selectiva;

d) repetir las etapas a) a c) una o más veces, en las que el segundo conjunto de uno o más microorganismos adquiridos en la etapa c) se utiliza como el primer conjunto de microorganismos en la etapa a) de cualquier repetición sucesiva; en la que al menos una ronda del método comprende la etapa de identificar una asociación entre (i) la una o más propiedades beneficiosas y (ii) uno o más marcadores de plantas y/o uno o más marcadores de microorganismos después de la etapa b) y/o después de la etapa c), en la que el marcador de planta es al menos un QTL (Locus del Rasgo Cuantitativo), y/o en el que el marcador de microorganismo se selecciona del grupo que consiste en un polimorfismo, una mutación, una variación alélica, presencia o ausencia de expresión de uno o más genes, nivel de expresión de uno o más genes, presencia o ausencia de la producción de uno o más compuestos por un microorganismo, y nivel de producción de uno o más compuestos por un microorganismo.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que una o más plantas se seleccionan en base a la presencia de uno o más marcadores en combinación con uno o más criterios de selección diferentes.

3. Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende:

i) cultivar uno o más microorganismos del segundo conjunto de microorganismos en uno o más medios para proporcionar uno o más cultivos;

ii) inactivar uno o más cultivos de la etapa i) para proporcionar una o más composiciones que contienen uno o más microorganismos inactivados;

iii) someter una o más plantas a la una o más composiciones de la etapa ii), opcionalmente en la que la una o más plantas comprende semillas, plántulas, esquejes y/o propágulos de las mismas;

iv) seleccionar cualquiera de

a) una o más composiciones de la etapa iii); o

b) el uno o más microorganismos asociados con la una o más composiciones de la etapa iii);

si se observa que la composición imparte una o más propiedades beneficiosas a una o más plantas.

4. Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que además comprende

ii) separar uno o más microorganismos del uno o más medios en el uno o más cultivos después de un período de tiempo para proporcionar una o más composiciones sustancialmente libres de microorganismos;

iv) seleccionar cualquiera de

a) una o más composiciones de la etapa iii); o

b) uno o más microorganismos asociados con la una o más composiciones de la etapa iii);

5. Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el segundo conjunto de microorganismos se:

i. aísla de la planta en la etapa c.;

ii. adquiere de la raíz, tallo y/o tejido foliar de una o más plantas seleccionadas, opcionalmente en el que el tejido foliar es tejido reproductivo;

iii. adquiere del tejido vegetal completo de una o más plantas seleccionadas;

iv. adquiere del medio de crecimiento que rodea a las plantas seleccionadas; o

v. adquiere en cualquier momento después de la germinación de una o más plantas.

6. Un método como se reivindica en la reivindicación 1, en el que la presión selectiva es:

i. presión selectiva biótica;

ii. exposición a uno o más organismos que son perjudiciales para la planta;

iii. exposición a hongos, bacterias, virus, insectos, ácaros, nematodos; y

iv. presión selectiva abiótica;

v. exposición a o cambios en el nivel de concentración de sal, temperatura, pH, agua, minerales, nutrientes orgánicos, nutrientes inorgánicos, toxinas orgánicas, toxinas inorgánicas o metales;

vi. aplicada durante todo el tiempo durante el cual la una o más plantas se someten al medio de crecimiento y uno o más microorganismos;

vii. aplicada durante sustancialmente todo el período de crecimiento de una o más plantas;

viii. aplicada en un momento discreto;

ix. aplicada en la que la una o más presiones selectivas aplicadas en repeticiones sucesivas son diferentes; o x. aplicada en la que la una o más presiones selectivas aplicadas en repeticiones sucesivas son las mismas.

7. Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el medio de crecimiento es selectivo para un marcador de interés específico.

8. Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el marcador en cada repetición iterativa del método es el mismo o diferente.

9. Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se evalúan dos o más marcadores en cada iteración del método.

10. Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la planta se esteriliza en superficie.