KR20160114150A - 변형된 생물학적 방제제 및 그의 용도 - Google Patents

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에이미 엘리자베쓰 쉐키타
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아그바이오메, 인크.
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Abstract

생물학적 작용제의 개체군이 재배지 환경에서 경쟁하고 생존하는 능력을 개선하는 방법이 제공된다. 생물학적 작용제의 개체군을 개선함으로써, 작용제의 변형된 개체군이 성장하고, 다른 미생물 균주 및 진균과 경쟁하고, 병원체로부터의 식물의 보호를 제공할 수 있다. 특히, 제초제 내성 또는 저항성인 변형된 생물학적 작용제 및 이러한 작용제의 변형된 개체군이 선택되거나 또는 조작된다. 이러한 방식으로, 질병-유발 작용제로부터의 보호가 향상된다. 생물학적 작용제의 이러한 변형된 개체군이 진균 병원체 및 이들이 유발하는 질병을 방지하기 위해 토양에 첨가되어, 식물 성장을 촉진할 수 있다. 따라서 본 발명은, 특히 제초제 저항성이 아닌 다른 미생물성 작용제에 비해 변형된 생물학적 작용제의 경쟁력을 향상시키는데 유용하다. 본 발명의 조성물은 선택된 또는 조작된 제초제 저항성 생물학적 작용제 및 생물방제제의 변형된 개체군을 포함한다. 이러한 변형된 생물학적 작용제는 식물 및 종자를 위한 접종제로서 또는 종자 코팅물로서 사용될 수 있다.

Description

변형된 생물학적 방제제 및 그의 용도 {MODIFIED BIOLOGICAL CONTROL AGENTS AND THEIR USES}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2014년 1월 31일에 출원된 미국 가출원 61/933,954, 및 2015년 1월 16일에 출원된 미국 가출원 62/104,122를 우선권 주장하며, 이들 두 가출원 모두의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 변형된 생물방제제 및 개선된 특성을 갖는 개체군에 관한 것이다.
식물 질병 및 해충은 전 세계에서 재배농에 의해 생산되는 식품, 사료, 및 섬유의 품질 및 양을 유지하기 위해 방제될 필요가 있다. 식물 질병은 주로 진균, 박테리아, 바이러스 및 선충에 의해 유발된다. 식물 해충은 특히 나비목(Lepdoptera), 딱정벌레목(Coleoptera), 및 노린재목(Hemiptera)의 저작성, 흡즙성 및 관입성 곤충을 포함한다. 농업에서는 이러한 해충 및 질병으로부터 작물을 보호하기 위해 화학적 살충제가 널리 사용된다. 이러한 화학 제품이 작물 해충, 질병, 및 잡초와 맞서 싸워, 개선된 수확을 초래한다. 작물 보호 및 해충 방제 없이는, 식품 생산 및 생산된 식품의 품질이 저하될 것이다. 그러나 화학적 살충제의 사용은, 이들 대다수가 적절하게 사용되지 않는다면 건강 및 환경을 위태롭게 할 수 있는 특성을 갖기 때문에 일정 수준의 위험성을 부여한다.
살충제, 제초제, 또는 다른 작물 보호 화학제의 계속된 사용으로 인한 문제는 방제제에 대한 저항성의 발생이다. 살충제 저항성은 종의 대부분의 개체를 이전에는 사멸시켰던 용량의 방제제에 대한 해충 개체군의 감수성 감소이다. 따라서, 저항성 관리를 용이하게 하기 위해서는 상이한 작용 방식을 갖는 새로운 제품이 요구된다.
계통 발생적으로 다양한 미생물이 다양한 식물 병원체 및 해충의 천연 길항체로서 작용할 수 있음이 오랫동안 공지되어 있었다. 식물 숙주와 생물방제를 유도하는 미생물 사이의 상호작용은 항생작용, 경쟁, 숙주 저항성의 유도, 및 포식을 포함할 수 있다. 단리물의 스크리닝 및 시험을 통해 상업화를 위한 다수의 후보물질이 제공되었다. 미생물성 생물살충제가 식물 질병 및 해충의 관리를 위한 중요한 옵션을 나타낸다. 재배지 조건에서, 특히 상업적 농업에서 통상 사용되며 미생물에 대하여 항생 효과를 나타낼 수 있는 제초제 및 살진균제의 존재하에 경쟁할 수 있는 생물학적 방제제가 요구된다.
생물학적 작용제 또는 생물방제제의 개체군이 재배지 환경에서 경쟁하고 생존하는 능력을 개선하는 조성물 및 방법이 제공된다. 생물학적 작용제의 개체군을 개선함으로써, 작용제의 변형된 개체군이 성장하고, 다른 미생물 균주 및 진균과 경쟁하고, 병원체로부터의 식물의 보호를 제공할 수 있다. 또한, 변형된 생물학적 방제제는 식물 성장 및 수확을 촉진한다. 특히, 살생물제-내성 또는 -저항성; 제초제-내성 또는 -저항성; 살진균제-내성 또는 -저항성; 살충제-내성 또는 -저항성; 또는 작물 보호 화학제에 대하여 내성 또는 저항성인 변형된 생물학적 작용제 및 이러한 작용제의 변형된 개체군이 선택되거나 또는 조작된다. 이러한 방식으로, 질병-유발 작용제 또는 해충으로부터의 작물의 보호가 향상된다.
변형된 생물학적 작용제는 상업적 농업에서 사용되는 적어도 하나의 제초제, 살진균제, 살충제, 또는 다른 작물 보호 화학제의 존재하에 성장할 수 있다. 이러한 변형된 생물학적 작용제는 이러한 제초제, 살진균제, 살충제, 또는 다른 작물 보호 화학제가 적용되었던 토양에서 성장하고 번식할 수 있다. 변형된 생물학적 작용제는 토양을 질병-유발 병원체 또는 해충에 대하여 억제성 또는 저항성으로 만든다. 생물학적 작용제의 이러한 변형된 개체군이 진균 병원체 및 이들이 유발하는 질병을 방지하거나, 또는 곤충 해충 또는 선충을 위한 영양 공급을 억제하기 위해 토양에 첨가되어, 식물 성장을 촉진하고 작물 수확을 증가시킬 수 있다. 따라서 본 발명은, 특히 제초제, 살진균제, 살충제, 또는 다른 작물 보호 화학제에 대하여 저항성이 아닌 다른 미생물성 작용제에 비해, 변형된 생물학적 작용제의 경쟁력을 향상시키는데 유용하다. 그러므로, 본 발명의 조성물은 선택된 또는 조작된 생물학적 작용제 및 생물방제제의 변형된 개체군을 포함한다. 이러한 변형된 생물학적 작용제는 식물 및 종자를 위한 접종제로서 또는 종자 코팅물로서 사용될 수 있다. 이것은 또한 식물의 지상부에 직접 분무 적용으로서 적용될 수 있고, 그에 대해 내성이 되도록 변형된 제초제 또는 다른 화학제와 혼합될 수 있다. 나타낸 바와 같이, 재배지 조건하에 변형된 생물학적 작용제의 존재는 식물의 병원체에 대한 저항성을 향상시키고 식물 성장을 촉진한다. 본 발명의 이러한 변형된 생물학적 작용제는 식물 성장 및 수확을 촉진하는 다른 작용제와 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 실시양태는 하기를 포함한다:
1. 생물방제제를 적어도 하나의 제초제, 살진균제, 살충제, 또는 다른 작물 보호 화학제에 대하여 저항성이도록 변형시키는 것을 포함하는, 상기 생물방제제를 개선하는 방법.
2. 실시양태 1에 있어서, 상기 생물방제제가, 제초제, 살진균제, 살충제, 또는 다른 작물 보호 화학제의 존재하에 성장시켜 저항성 균주를 선택함으로써 변형된 것인 방법.
3. 실시양태 1에 있어서, 상기 생물방제제가, 상기 생물방제제를 상기 제초제, 살진균제, 살충제, 또는 다른 작물 보호 화학제에 대한 저항성을 부여하는 유전자로 형질전환시킴으로써 변형된 것인 방법.
4. 실시양태 1-3 중 어느 하나에 있어서, 상기 생물방제제가 박테리아성 생물방제제인 방법.
5. 실시양태 1-3 중 어느 하나에 있어서, 상기 생물방제제가 슈도모나스(Pseudomonas), 바실루스(Bacillus), 아그로박테리움(Agrobacterium), 리소박터(Lysobacter), 트리코데르마(Trichoderma), 패실로미세스(Paecilomyces), 글리오클라디움(Gliocladium), 암펠로미세스(Ampelomyces), 피티움(Pythium), 메트쉬니코비아(Metschnikowia), 크로모박테리움(Chromobacterium), 페니실륨(Penicillium), 코니오티리움(Coniothyrium), 캐토미움(Chaetomium), 미로테시움(Myrothecium), 아우레오바시디움(Aureobasidium), 판토에아(Pantoea), 부르크홀데리아(Burkholderia), 스트렙토미세스(Streptomyces), 바리오보랙스(Variovorax), 파스토리아(Pasteuria), 락토바실루스(Lactobacillus), 파에니바실루스(Paenibacillus), 크산토모나스(Xanthomonas) 속으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
6. 실시양태 5에 있어서, 상기 박테리아성 생물방제제가 슈도모나스 박테리아인 방법.
7. 실시양태 6에 있어서, 상기 슈도모나스가 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens ) 또는 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis)인 방법.
8. 실시양태 1-7 중 어느 하나에 있어서, 상기 제초제가 글리포세이트, 글루포시네이트 (글루타민 합성효소 억제제), 술포닐우레아 및 이미다졸리논 제초제 (분지쇄 아미노산 합성 억제제)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
9. 생물방제제가 제초제, 살진균제, 살충제, 또는 다른 작물 보호 화학제의 압력하에 선택되었고 상기 제초제, 살진균제, 살충제, 또는 다른 작물 보호 화학제에 대하여 저항성인, 변형된 생물방제제.
10. 실시양태 9에 있어서, 박테리아성 생물방제제인 변형된 생물방제제.
11. 실시양태 9에 있어서, 상기 생물방제제가 슈도모나스, 바실루스, 아그로박테리움, 리소박터, 트리코데르마, 패실로미세스, 글리오클라디움, 암펠로미세스, 피티움, 메트쉬니코비아, 크로모박테리움, 페니실륨, 코니오티리움, 캐토미움, 미로테시움, 아우레오바시디움, 판토에아, 부르크홀데리아, 스트렙토미세스, 바리오보랙스, 파스토리아, 크산토모나스 속으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 변형된 생물방제제.
12. 실시양태 10에 있어서, 상기 박테리아성 생물방제제가 슈도모나스 박테리아인 변형된 생물방제제.
13. 실시양태 12에 있어서, 상기 슈도모나스가 슈도모나스 플루오레센스 또는 슈도모나스 클로로라피스인 변형된 생물방제제.
14. 실시양태 9-13 중 어느 하나에 있어서, 상기 제초제가 글리포세이트, 글루포시네이트 (글루타민 합성효소 억제제), 술포닐우레아 및 이미다졸리논 제초제 (분지쇄 아미노산 합성 억제제)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 변형된 생물방제제.
15. 생물방제제가 생물방제제를 제초제 저항성으로 만드는 제초제 저항성 유전자로 형질전환된 것인, 재조합 생물방제제.
16. 실시양태 15에 있어서, 상기 변형된 생물방제제가 박테리아성 생물방제제인 재조합 생물방제제.
17. 실시양태 16에 있어서, 상기 박테리아성 생물방제제가 슈도모나스, 바실루스, 아그로박테리움, 리소박터, 글리오클라디움, 피티움, 크로모박테리움, 페니실륨, 판토에아, 부르크홀데리아, 스트렙토미세스, 바리오보랙스, 파스토리아, 및 크산토모나스 속으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 재조합 생물방제제.
18. 실시양태 17에 있어서, 상기 박테리아성 생물방제제가 슈도모나스 박테리아인 재조합 생물방제제.
19. 실시양태 18에 있어서, 상기 슈도모나스가 슈도모나스 플루오레센스 또는 슈도모나스 클로로라피스인 재조합 생물방제제.
20. 실시양태 15-19 중 어느 하나에 있어서, 상기 제초제가 글리포세이트, 글루포시네이트 (글루타민 합성효소 억제제), 술포닐우레아 및 이미다졸리논 제초제 (분지쇄 아미노산 합성 억제제)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 재조합 생물방제제.
21. 실시양태 1-20 중 어느 하나의 생물방제제를 실질적으로 포함하는 생물방제제의 변형된 개체군.
22. 제초제 저항성인 생물방제제의 변형된 개체군, 및 적합한 담체를 포함하는, 식물 병원체의 방제 제제.
23. 실시양태 22에 있어서, 상기 개체군이 변형된 박테리아성 생물방제제를 포함하는 것인 제제.
24. 실시양태 22에 있어서, 상기 개체군이 재조합 생물방제제를 포함하는 것인 제제.
25. 실시양태 22-24 중 어느 하나에 있어서, 상기 생물방제제가 농업 재배지 적용률의 살생물제의 존재하에 식물 건강, 성장 또는 수확을 개선하기에 충분한 유효량으로 존재하는 것인 제제.
26. 실시양태 25에 있어서, 생물방제제가 NRRL No. B-50897로서 수탁된 균주를 포함하고 살생물제가 글리포세이트인 제제.
27. 실시양태 25에 있어서, 생물방제제가 NRRL No. B-50999로서 수탁된 균주 AIP050999를 포함하고 살생물제가 글루포시네이트인 제제.
28. 변형된 생물방제제가 제초제의 존재하에 성장할 수 있도록 생물학적 작용제를 변형시키는 것을 포함하는, 상기 생물방제제의 재배지 환경에서의 경쟁 능력을 개선하는 방법.
29. 생물방제제의 변형된 개체군을 포함하는 조성물을 식물이 성장하고 있는 토양에 적용하는 것을 포함하는, 상기 식물의 성장을 촉진하는 방법.
30. 실시양태 29에 있어서, 상기 생물방제제가 글리포세이트 또는 글루포시네이트에 대하여 저항성이도록 변형된 것인 방법.
31. 작물, 종자 또는 재배 영역에 살생물제의 유효량과 변형된 생물방제제의 유효량의 조합을 적용하는 것을 포함하는 식물을 성장시키는 방법이며, 여기서
(a) 살생물제의 유효량은 작물에 유의하게 피해를 입히지 않으면서 관심 생물체를 선택적으로 방제하기 위한 것이고;
(b) 변형된 생물방제제의 유효량은 동일한 농도의 비-변형 생물방제제가 살생물제의 유효량과 조합되어 적용될 때 발생하는 식물 건강, 수확 및/또는 성장과 비교하여, 식물 건강, 수확 및/또는 성장의 통계학적으로 유의한 증가를 초래하기에 충분한 것인, 식물을 성장시키는 방법.
32. 실시양태 31에 있어서, 변형된 생물방제제 및 살생물제가 동시에 적용되는 것인 방법.
33. 실시양태 32에 있어서, 변형된 생물방제제 및 살생물제가 순차적으로 적용되는 것인 방법.
34. 실시양태 31-33 중 어느 하나에 있어서, 상기 생물방제제가 NRRL No. B-50897로서 수탁된 균주를 포함하는 것인 방법.
35. 실시양태 34에 있어서, 살생물제가 글리포세이트이고, 글리포세이트의 유효량이 작물에 유의하게 피해를 입히지 않으면서 잡초를 선택적으로 방제하기 위한 것인 방법.
36. 실시양태 31-33 중 어느 하나에 있어서, 상기 생물방제제가 NRRL No. B-50999로서 수탁된 균주 AIP050999를 포함하고 살생물제가 글루포시네이트인 방법.
37. 실시양태 36에 있어서, 살생물제가 글루포시네이트이고, 글루포시네이트의 유효량이 작물에 유의하게 피해를 입히지 않으면서 잡초를 선택적으로 방제하기 위한 것인 방법.
38. 작용제의 개체군을 제초제, 살진균제, 살충제 또는 작물 보호 화학제의 압력하에 성장시켜 상기 제초제, 살진균제, 살충제 또는 다른 작물 보호 화학제에 대하여 저항성인 생물방제제의 정제된 배양물을 선택함으로써 생산되는 생물방제제의 배양된 개체군.
39. 실시양태 38에 있어서, 상기 생물방제제가 농업 재배지 적용률의 살생물제의 존재하에 식물 건강, 성장 또는 수확을 개선하기에 충분한 유효량으로 존재하는 것인, 생물방제제의 배양된 개체군.
40. 생물방제제의 단리된 생물학적 순수 배양물이며, 생물방제제가 제초제, 살진균제, 살충제 또는 작물 보호 화학제로부터 선택된 살생물제에 대하여 저항성이고, 상기 배양물은 상기 살생물제의 존재하에 성장시켜 생산되는 것인, 상기 생물방제제의 단리된 생물학적 순수 배양물.
41. 실시양태 40에 있어서, 상기 생물방제제가 농업 재배지 적용률의 살생물제의 존재하에 식물 건강, 성장 또는 수확을 개선하기에 충분한 유효량으로 존재하는 것인, 생물방제제의 단리된 생물학적 순수 배양물.
42. 실시양태 38에 있어서, 상기 조성물이 적합한 담체를 포함하는 것인 방법.
43. 항진균 활성을 가지며 글리포세이트의 존재하에 성장할 수 있는, NRRL No. B-50897로서 수탁된 균주로부터 성장된 박테리아 배양물.
44. 실시양태 43에 있어서, NRRL No. B-50897로서 수탁된 균주가 농업 재배지 적용률의 글리포세이트의 존재하에 식물 건강, 성장 또는 수확을 개선하기에 충분한 유효량으로 존재하는 것인 박테리아 배양물.
45. 항진균 활성을 가지며 글루포시네이트의 존재하에 성장할 수 있는, NRRL No. B-50999로서 수탁된 균주 AIP050999로부터 성장된 박테리아 배양물.
46. 실시양태 45에 있어서, NRRL No. B-50999로서 수탁된 균주 AIP050999가 농업 재배지 적용률의 글루포시네이트의 존재하에 식물 건강, 성장 또는 수확을 개선하기에 충분한 유효량으로 존재하는 것인 박테리아 배양물.
도 1은 글리포세이트 존재하의 다양한 균주의 성장 곡선을 제공한다.
생물학적 방제제를 개선하는 조성물 및 방법이 제공된다. 본 발명의 목적상 생물학적 작용제 또는 생물방제제는 질병-유발 식물 병원체 및 식물 해충을 방제하는데 사용되는 미생물을 기술하기 위해 사용된다. 본 발명의 생물학적 방제제는 적어도 하나의 살생물제의 존재하에 성장할 수 있도록 변형되었다. 살생물제는 화학적 또는 생물학적 수단에 의해 생물체에 대하여 방제 효과를 발휘할 수 있는 화학 물질이다. 살생물제는 살충제, 예컨대 살진균제; 제초제; 살곤충제, 다른 작물 보호 화학제 등을 포함한다. 본 발명의 조성물은 살생물제, 예컨대 제초제, 살진균제, 살충제, 또는 다른 작물 보호 화학제에 대한 저항성을 위해 선택된 하나 이상의 단리된 생물방제제; 제초제, 살진균제, 살충제, 또는 다른 작물 보호 화학제 저항성 유전자를 함유하도록 형질전환된 재조합 생물방제제; 적어도 하나의 제초제, 살진균제, 살충제, 또는 다른 작물 보호 화학제에 대하여 저항성인, 생물방제제의 변형된 개체군; 및 생물방제제의 이러한 변형된 개체군을 포함하는 조성물을 포함한다. 변형된 개체군은 제초제, 살진균제, 살충제, 또는 다른 작물 보호 화학제 저항성을 위해 선택되었거나 또는 이러한 제초제, 살진균제, 살충제, 또는 다른 작물 보호 화학제에 대한 저항성 또는 내성을 부여하는 유전자로 형질전환된 미생물을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 이러한 변형된 생물방제제 또는 변형된 생물학적 작용제의 실질적인 순수 배양물 또는 생물학적 순수 배양물을 포함한다. "생물학적 순수 박테리아 배양물"이란 보통의 박테리아학 기술에 의해 검출되는 양의 다른 박테리아 종을 함유하지 않는 박테리아 배양물을 말한다. 달리 말하면, 사실상 모든 존재하는 박테리아 세포가 선택된 균주의 것인 배양물이다. 변형된 생물방제제는 선택압으로 인해 형질을 획득한 생물방제제 및 적어도 하나의 제초제, 살진균제, 살충제, 또는 다른 작물 보호 화학제에 대한 저항성 또는 내성을 부여하는 유전자로 형질전환된 재조합 생물방제제를 포함한다.
본 발명은 추가로 특정한 변형된 생물학적 방제제를 포괄한다. 이러한 작용제는 AIP1620을 포함한다. AIP1620은 글리포세이트 내성을 위해 선택된 슈도모나스 균주이다. 추가의 작용제는 AIP050999를 포함한다. AIP050999는 글루포시네이트 내성을 위해 선택된 슈도모나스 균주이다.
AIP1620은 미국 일리노이주 61604 피오리아 노쓰 유니버시티 스트리트 1815에 소재하는 미국 농무부(U.S. Department of Agriculture) 농업연구소(Agricultural Research Service) 국립농업이용연구센터(National Center for Argicultural Utilization Research)의 특허 수탁기관에 2014년 1월 31에 수탁되었으며, NRRL No. B-50897이라 지정되었다. AIP050999는 미국 일리노이주 61604 피오리아 노쓰 유니버시티 스트리트 1815에 소재하는 미국 농무부 농업연구소 국립농업이용연구센터의 특허 수탁기관에 2015년 1월 23일에 수탁되었으며, NRRL No. B-50999라 지정되었다. 이들 수탁은 각각 특허 절차의 목적상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 조항하에 유지될 것이다. 이러한 기탁은 단지 관련 기술분야의 통상의 기술자를 위한 편의 목적으로 이루어진 것이며, 35 U.S.C. §112하에 수탁이 요구됨을 인용하는 것이 아니다.
"제초제, 살진균제, 살충제, 또는 다른 작물 보호 화학제 내성 또는 제초제, 살진균제, 살충제, 또는 다른 작물 보호 화학제 저항성"이란 야생형 생물체에게 보통은 치명적인 제초제, 살진균제, 살충제, 또는 다른 작물 보호 화학제의 용량에 노출된 후 생존 및 번식하는 생물체 (즉, 식물, 생물방제제, 생물방제 박테리아성 작용제 등)의 능력을 나타내기 위한 것이다.
본 발명의 생물학적 작용제 또는 생물방제제는 질병-유발 식물 병원체를 방제하고 식물 건강, 성장, 및 수확을 촉진하는 미생물 및 진균을 포함한다. 임의의 이러한 생물학적 작용제 또는 생물방제제가 선택 또는 형질전환에 의해 변형되어 변형된 생물학적 작용제 또는 생물방제제 또는 재조합 생물학적 작용제 또는 생물방제제를 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명은 단리된 변형 생물방제제를 포괄한다. 변형된 생물방제제는 성장하여 생물방제제의 개체군을 생산할 수 있다. "생물학적 작용제 또는 생물방제제의 변형된 개체군"이란 관심 형질, 예컨대 제초제, 살진균제, 살충제, 또는 다른 작물 보호 화학제에 대한 저항성을 갖는 선택된 작용제 또는 재조합 작용제의 배양물을 실질적으로 포함하는 작용제의 개체군을 나타내기 위한 것이다. 실질적으로 포함한다는 것은 변형된 또는 재조합 생물방제제로부터 개체군이 성장하고 생산되었음을 나타내기 위한 것이다. 즉, 변형된 또는 재조합 생물방제제는 성장하여 생물학적 순수 배양물을 생산할 수 있다. 이러한 생물학적 순수 배양물이 함께 사용되어 식물 건강, 성장, 또는 수확을 향상시킬 수 있음이 이해된다.
임의의 생물학적 작용제 또는 생물방제제가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 특정 관심 미생물은 슈도모나스, 바실루스, 아그로박테리움, 리소박터, 글리오클라디움, 피티움, 크로모박테리움, 페니실륨, 판토에아, 락토바실루스, 파에니바실루스, 부르크홀데리아, 스트렙토미세스, 바리오보랙스, 파스토리아, 크산토모나스 등의 박테리아 균주를 포함한다. 관심 진균은 아우레오바시디움, 암펠로미세스, 브베리아(Beauveria), 메타리지움(Metarhizium), 메트쉬니코비아, 미로테시움, 레카니실리움(Lecanicillium), 캐토미움, 코디셉스(Cordyceps), 코니오티리움, 닥틸렐라(Dactylella), 글리오클라디움, 아스페르질리스(Aspergillis), 패실로미세스, 트리코데르마, 피소리투스(Pisolithus), 글로무스(Glomus) 등을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 5,348,742; 5,496,547; 5,756,087; 5,955,348; 6,060,051; 6,635,425; 및 미국 특허 공보 20130142759를 참조하고; 이들은 모두 본원에 참조로 포함된다. 다수의 생물방제제가 시판되고 있으며 이들 중 임의의 것이 본 발명에 따라 변형될 수 있다. 이러한 작용제는 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter) K84; 트리코데르마 아트로비리데(Trichoderma atroviride); 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) GB03; 바실루스 퍼뮤스(Bacillus firmus) I-1582; 트리코데르마 아스페렐룸(Trichoderma asperellum) (ICC 012); 티. 감시(T. gamsii) (ICC 080); 바실루스 푸밀루스(Bacillus pumilus) 균주 QST 2808; 바실루스 서브틸리스 균주 QST 713; 비. 서브틸리스 균주 MBI 600; 패실로미세스 푸모소로세우스(Paecilomyces fumosoroseus); 글리오클라디움 카테눌라툼(Gliocladium catenulatum); 트리코데르마 하르지아눔 리파이(Trichoderma harzianum rifai) 균주 KRL-AG2; 트리코데르마 하르지아눔 T-22; 트리코데르마 하르지아눔 T-22; 트리코데르마 비렌스(Trichoderma virens) 균주 G-41; 트리코데르마 하르지아눔 T-22; 바실루스 서브틸리스 QST 713; 바실루스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주 D747; 트리코데르마 (글리오클라디움) 비렌스 GL-21; 패실로미세스 리라시누스(Paecilomyces lilacinus); 패실로미세스 푸모소로세우스; 암펠로미세스 퀴스퀄리스(Ampelomyces quisqualis); 비. 서브틸리스 DSM 17231; 비. 리체니포르미스(B. licheniformis) DSM 17236; 피티움 올리간드럼(Pythium oligandrum) DV 74; 바실루스 서브틸리스 GB03; 트리코데르마 아스페렐룸; 티. 감시; 슈도모나스 시린재(Pseudomonas syringae) ESC-10; 메트쉬니코비아 프룩티콜라(Metschnikowia fructicola); 트리코데르마 하르지아눔 T-22; 슈도모나스 클로로라피스 MA 342; 비. 아밀로리퀘파시엔스; 크로모박테리움 서브추재(Chromobacterium subtsugae) 균주 PRAA4-1; 비. 서브틸리스 아밀로리퀘파시엔스 FZB24; 페니실륨 빌라이(Penicillium bilaii); 패실로미세스 푸모소로세우스 FE 9901; 스트렙토미세스 라이디쿠스(Streptomyces lydicus) WYEC 108; 피. 시린재 A506; 코니오티리움 미니탄스(Coniothyrium minitans); 패실로미세스 리라시누스 균주 251; 스트렙토미세스 라이디쿠스 WYEC-108; 바실루스 아밀로리퀘파시엔스; 트리코데르마 비렌스; 트리코데르마 비리데(Trichoderma viride); 암펠로미세스 퀴스퀄리스; 캐토미움 글로보숨(Chaetomium globosum); 슈도모나스 플루오레센스; 바실루스 서브틸리스; 바실루스 퓨뮬리스(Bacillus pumulis); 미로테시움 베루카리아(Myrothecium verrucaria) AARC-0255; 스트렙토미세스 악티노박테리움(Streptomyces actinobacterium) 균주 K61; 글리오클라디움 카테눌라툼　J1446; 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) 균주 DSM 14940; 및 에이. 풀루란스 균주 DSM 14941을 포함한다. 추가의 생물학적 질병 방제 제품을 인터넷: nevegetable.org/table-22-biological-disease-control-products에서 찾아볼 수 있다.
질병 유발 병원체는 진균, 박테리아, 바이러스 및 선충을 포함한다. 본 발명의 생물방제제는 임의의 식물 병원체를 표적으로 하는 것들이다. 표적 병원체는 알터나리아(Alternaria), 보트리티스(Botrytis), 푸사리움(Fusarium), 에르위니아(Erwinia), 슈도모나스, 크산토모나스, 서코스포라(Cercospora), 콜레토트리쿰(Colletotrichum), 클라도스포리움(Cladosporium), -에리시패(-Erisyphae) spp., 미크로스파이라 시린재(Microsphaera syringae), 페로노스포라(Peronospora) spp., 플라스모파라(Plasmopara) spp., 피토프토라(Phytophthora), 피티움, 리족토니아(Rhizoctonia), 디플로카르폰(Diplocarpon), 벤튜리아(Venturia), 마이코스패렐라(Mycosphaerella), 포몹시스(Phomopsis), 타프리나(Taphrina), 엘시노이(Elsinoe), 스크렐로티니아(Sclerotinia), 베르티실룸(Verticillum), 그노모니아(Gnomonia), 푸시클라디움(Fusicladium), 넥트리아(Nectria), 필로스틱타(Phyllosticta), 디플로카르폰, 알부고(Albugo), 귀나르디아(Guignardia), 보트리티스, 엑소바시디움(Exobasidium), 엔토모스포리움(Entomosporium), 엑소바시디움, 페스탈로티아(Pestalotia), 포마(Phoma), 크리스툴라리엘라(Cristulariella), 파콥소라(Phakopsora), 텔라비옵시스(Thelaviopsis), 푸치니아(Puccinia), 페로노스포라, 브레미아(Bremia), 판토에아, 클라비박터(Clavibacter)를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다.
제초제, 살진균제, 살충제, 또는 다른 작물 보호 화학제 저항성은 야생형 생물체에게 보통은 치명적이거나 또는 야생형 생물체의 성장을 실질적으로 감소시킬 제초제, 살진균제, 살충제, 또는 다른 작물 보호 화학제의 용량에 노출된 후 생물체가 생존 및 번식하는 능력이다. 저항성은 선택으로 인해 유도 또는 동정될 수 있거나, 또는 유전자 조작을 통해 유도될 수 있다. 선택을 통해 생물방제제의 변형된 개체군을 동정하고 생산하기 위해, 생물방제제를 선택압으로서 제초제, 살진균제, 살충제, 또는 다른 작물 보호 화학제의 존재하에 성장시킨다. 감수성 작용제는 사멸하고, 반면에 저항성 작용제는 생존하여 경쟁 없이 번식한다. 생물방제제가 제초제, 살진균제, 살충제, 또는 다른 작물 보호 화학제의 존재하에 성장하기 때문에, 저항성 생물방제제는 성공적으로 번식하고 개체군에서 우성이 되어, 생물방제제의 변형된 개체군이 된다. 저항성 균주를 선택하는 방법은 공지되어 있으며, 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 4,306,027 및 4,094,097에 포함되어 있다. 따라서, 본 발명은 저항성 생물방제 균주의 생물학적 순수 배양물을 포함한다. 본 발명의 저항성 균주는 이들이 특정 제초제, 살진균제, 살충제, 또는 다른 작물 보호 화학제에 대하여 유의하게 보다 큰 내성을 갖는 것을 제외하고는, 원래의 감수성 균주와 동일한 동정 특징을 갖는다. 따라서, 공지된 감수성 균주의 특징과 비교함으로써 그의 동정이 용이하게 가능하다.
제초제는 글리포세이트, ACCase 억제제 (아릴옥시페녹시 프로피오네이트 (FOPS)); ALS 억제제 (술포닐우레아 (SU)), 이미다졸리논 (IMI), 피리미딘 (PM)); 미세소관 단백질 억제제 (디니트로아닐린 (DNA)); 합성 옥신 (페녹시 (P)), 벤조산 (BA), 카르복실산 (CA)); 광화학계 II 억제제 (트리아진 (TZ)), 트리아지논 (TN), 니트릴 (NT), 벤조티아디아지논 (BZ), 우레아 (US)); EPSP 합성효소 억제제 (글리신 (GC)); 글루타민 합성 억제제 (포스핀산 (PA)); DOXP 합성효소 억제제 (이속사졸리디논 (IA)); HPPD 억제제 (피라졸 (PA)), 트리케톤 (TE)); PPO 억제제 (디페닐에테르 (DE), N-페닐프탈이미드 (NP) (아리 트리아지논 (AT)); VLFA 억제제 (클로로아세트아미드 (CA)), 옥시아세트아미드 (OA)); 광화학계 I 억제제 (비피리딜리움 (BP)) 등을 포함한다.
살충제는 이미다클로프리드 클로티아니딘, 아릴피라졸 화합물 (WO2007103076); 유기인산염, 페닐 피라졸, 피레토이드 카라모일옥심, 피라졸, 아미딘, 할로겐화 탄화수소, 카르바메이트 및 그의 유도체, 터부포스, 클로로피리포스, 피프로닐, 클로르에톡시포스, 텔푸트린, 카르보푸란, 이미다클로프리드, 테부피림포스 (5,849,320)를 포함한다.
살진균제는 지방족 질소 살진균제 (부틸아민, 시목사닐, 도디신, 도딘, 구아자틴, 이민옥타딘); 아미드 살진균제 (벤조빈디플루피르, 카프로파미드, 클로라니포르메탄, 시플루페나미드, 디클로시메트, 디클로시메트, 디목시스트로빈, 페나민스트로빈, 페녹사닐, 플루메토버, 푸라메트피르, 이소페타미드, 이소피라잠, 만데스트로빈, 만디프로파미드, 메토미노스트로빈, 오리사스트로빈, 펜티오피라드, 프로클로라즈, 퀴나자미드, 실티오팜, 트리포린); 아실아미노산 살진균제 (베날락실, 베날락실-M, 푸랄락실, 메탈락실, 메탈락실-M, 페푸라조에이트, 발리페날레이트); 아닐리드 살진균제 (베날락실, 베날락실-M, 빅사펜, 보스칼리드, 카르복신, 펜헥사미드, 플럭사피록사드, 이소티아닐, 메탈락실, 메탈락실-M, 메트술포박스, 오푸라스, 옥사딕실, 옥시카르복신, 펜플루펜, 피라카르볼리드, 세닥산, 티플루자미드, 티아디닐, 반가드); 벤즈아닐리드 살진균제 (베노다닐, 플루톨라닐, 메베닐, 메프로닐, 살리실아닐리드, 테클로프탈람); 푸르아닐리드 살진균제 (펜푸람, 푸랄락실, 푸르카르바닐, 메트푸록삼); 술폰아닐리드 살진균제 (플루술파미드); 벤즈아미드 살진균제 (벤조히드록삼산, 플루오피콜리드, 플루오피람, 티옥시미드, 트리클라미드, 자릴라미드, 족사미드); 푸라미드 살진균제 (시클라푸라미드, 푸르메시클록스); 페닐술파미드 살진균제 (디클로플루아니드, 톨릴플루아니드); 술폰아미드 살진균제 (아미술브롬, 시아조파미드); 발린아미드 살진균제 (벤티아발리카르브, 이프로발리카르브); 항생성 살진균제 (오레오펀진, 블라스티시딘-S, 시클로헥시미드, 그리세오풀빈, 카수가마이신, 모록시딘, 나타마이신, 폴리옥신, 폴리옥소림, 스트렙토마이신, 발리다마이신); 스트로빌루린 살진균제 (플루옥사스트로빈, 만데스트로빈); 메톡시아크릴레이트 스트로빌루린 살진균제 (아족시스트로빈, 비푸준지, 쿠목시스트로빈, 에녹사스트로빈, 플루페녹시스트로빈, 지악시앙준지, 피콕시스트로빈, 피라옥시스트로빈); 메톡시카르바닐레이트 스트로빌루린 살진균제 (피라클로스트로빈, 피라메토스트로빈, 트리클로피리카르브); 메톡시이미노아세트아미드 스트로빌루린 살진균제 (디목시스트로빈, 페나민스트로빈, 메토미노스트로빈, 오리사스트로빈); 메톡시이미노아세테이트 스트로빌루린 살진균제 (크레속심-메틸, 트리플록시스트로빈); 방향족 살진균제 (비페닐, 클로로디니트로나프탈렌, 클로로넵, 클로로탈로닐, 크레졸, 디클로란, 펜준통, 헥사클로로벤젠, 펜타클로로페놀, 퀸토젠, 소듐 펜타클로로페녹시드, 테크나젠, 트리클로로트리니트로벤젠); 비소계 살진균제 (아소메이트, 우르바시드); 아릴 페닐 케톤 살진균제 (메트라페논, 피리오페논); 벤즈이미다졸 살진균제 (알벤다졸, 베노밀, 카르벤다짐, 클로르페나졸, 시펜다졸, 데바카르브, 푸베리다졸, 메카르빈지드, 라벤자졸, 티아벤다졸); 벤즈이미다졸 전구체 살진균제 (푸로파네이트, 티오파네이트, 티오파네이트-메틸); 벤조티아졸 살진균제 (벤탈루론, 벤티아발리카르브, 벤티아졸, 클로벤티아존, 프로베나졸); 식물성 살진균제 (알리신, 베르베린, 카르바크롤, 카르본, 오스톨, 상귀나린, 산토닌); 가교 디페닐 살진균제 (비티오놀, 디클로로펜, 디페닐아민, 헥사클로로펜, 파리놀); 카르바메이트 살진균제 (벤티아발리카르브, 푸로파네이트, 아이오도카르브, 이프로발리카르브, 피카르부트라족스, 프로파모카르브, 피리벤카르브, 티오파네이트, 티오파네이트-메틸, 톨프로카르브); 벤즈이미다졸릴카르바메이트 살진균제 (알벤다졸, 베노밀, 카르벤다짐, 시펜다졸, 데바카르브, 메카르빈지드); 카르바닐레이트 살진균제 (디에토펜카르브, 피라클로스트로빈, 피라메토스트로빈, 트리클로피리카르브); 코나졸 살진균제, 코나졸 살진균제 (이미다졸) (클림바졸, 클로트리마졸, 이마잘릴, 옥스포코나졸, 프로클로라즈, 트리플루미졸); 코나졸 살진균제 (트리아졸) (아자코나졸, 브로무코나졸, 시프로코나졸, 디클로부트라졸, 디페노코나졸, 디니코나졸, 디니코나졸-M, 에폭시코나졸, 에타코나졸, 펜부코나졸, 플루퀸코나졸, 플루실라졸, 플루트리아폴, 푸르코나졸, 푸르코나졸-시스, 헥사코나졸, 이미벤코나졸, 이프코나졸, 메트코나졸, 미클로부타닐, 펜코나졸, 프로피코나졸, 프로티오코나졸, 퀸코나졸, 시메코나졸, 테부코나졸, 테트라코나졸, 트리아디메폰, 트리아디메놀, 트리티코나졸, 유니코나졸, 유니코나졸-P); 구리 살진균제 (아시페탁스-구리, 보르도(Bordeaux) 혼합물, 버건디(Burgundy) 혼합물, 체스헌트(Cheshunt) 혼합물, 구리 아세테이트, 구리 카르보네이트, 염기성, 구리 히드록시드, 구리 나프테네이트, 구리 올레에이트, 구리 옥시클로라이드, 구리 실리케이트, 구리 술페이트, 구리 술페이트, 염기성, 구리 아연 크로메이트, 쿠프라넵, 쿠프로밤, 아산화구리, 만쿠퍼, 옥신-구리, 사이센통, 티오디아졸-구리); 시아노아크릴레이트 살진균제 (벤즈아마크릴, 펜아마크릴); 디카르복스이미드 살진균제 (파목사돈, 플루오로이미드); 디클로로페닐 디카르복스이미드 살진균제 (클로졸리네이트, 디클로졸린, 이프로디온, 이소발레디온, 마이클로졸린, 프로시미돈, 빈클로졸린); 프탈이미드 살진균제 (캡타폴, 캡탄, 디탈림포스, 폴페트, 티오클로르펜핌); 디니트로페놀 살진균제 (비나파크릴, 디노부톤, 디노캡, 디노캡-4, 디노캡-6, 멥틸디노캡, 디녹톤, 디노펜톤, 디노술폰, 디노테르본, DNOC); 디티오카르바메이트 살진균제 (아모밤, 아소메이트, 아지티람, 카르바모르프, 쿠프라넵, 쿠프로밤, 디술피람, 페르밤, 메탐, 나밤, 테코람, 티람, 우르바시드, 지람); 시클릭 디티오카르바메이트 살진균제 (다조메트, 에템, 밀넵); 중합체성 디티오카르바메이트 살진균제 (만쿠퍼, 만코젭, 마넵, 메티람, 폴리카르바메이트, 프로피넵, 지넵); 디티올란 살진균제 (이소프로티올란, 사이준마오); 훈증 살진균제 (이황화탄소, 시아노겐, 디티오에테르, 메틸 브로마이드, 메틸 아이오다이드, 소듐 테트라티오카르보네이트); 히드라지드 살진균제 (벤퀴녹스, 사이준마오); 이미다졸 살진균제 (시아조파미드, 페나미돈, 페나파닐, 글리오딘, 이프로디온, 이소발레디온, 페푸라조에이트, 트리아족시드); 코나졸 살진균제 (이미다졸) (클림바졸, 클로트리마졸, 이마잘릴, 옥스포코나졸, 프로클로라즈, 트리플루미졸); 무기 살진균제 (포타슘 아지드, 포타슘 티오시아네이트, 소듐 아지드, 황, 또한 구리 살진균제 참조, 또한 무기 수은 살진균제 참조); 수은 살진균제; 무기 수은 살진균제 (염화제2수은, 산화제2수은, 염화제1수은); 유기수은 살진균제 ((3-에톡시프로필)수은 브로마이드, 에틸수은 아세테이트, 에틸수은 브로마이드, 에틸수은 클로라이드, 에틸수은 2,3-디히드록시프로필 머캅티드, 에틸수은 포스페이트, N-(에틸수은)-p-톨루엔술폰아닐리드, 히드라가펜, 2-메톡시에틸수은 클로라이드, 메틸수은 벤조에이트, 메틸수은 디시안디아미드, 메틸수은 펜타클로로페녹시드, 8-페닐머큐리옥시퀴놀린, 페닐머큐리우레아, 페닐수은 아세테이트, 페닐수은 클로라이드, 피로카테콜의 페닐수은 유도체, 페닐수은 니트레이트, 페닐수은 살리실레이트, 티오머살, 톨릴수은 아세테이트); 모르폴린 살진균제 (알디모르프, 벤자모르프, 카르바모르프, 디메토모르프, 도데모르프, 펜프로피모르프, 플루모르프, 트리데모르프); 유기인계 살진균제 (암프로필포스, 디탈림포스, EBP, 에디펜포스, 포세틸, 헥실티오포스, 이네진, 이프로벤포스, 이조팜포스, 케준린, 포스디펜, 피라조포스, 톨클로포스-메틸, 트리아미포스); 유기주석 살진균제 (데카펜틴, 펜틴, 트리부틸주석 옥시드); 옥사티인 살진균제 (카르복신, 옥시카르복신); 옥사졸 살진균제 (클로졸리네이트, 디클로졸린, 드라족솔론, 파목사돈, 히멕사졸, 메타족솔론, 마이클로졸린, 옥사딕실, 옥사티아피프롤린, 피리스옥사졸, 빈클로졸린); 폴리술피드 살진균제 (바륨 폴리술피드, 칼슘 폴리술피드, 포타슘 폴리술피드, 소듐 폴리술피드); 피라졸 살진균제 (벤조빈디플루피르, 빅사펜, 펜피라자민, 플럭사피록사드, 푸라메트피르, 이소피라잠, 옥사티아피프롤린, 펜플루펜, 펜티오피라드, 피라클로스트로빈, 피라메토스트로빈, 피라옥시스트로빈, 라벤자졸, 세닥산); 피리딘 살진균제 (보스칼리드, 부티오베이트, 디피리티온, 플루아지남, 플루오피콜리드, 플루오피람, 파리놀, 피카르부트라족스, 피리벤카르브, 피리디니트릴, 피리페녹스, 피리스옥사졸, 피록시클로르, 피록시푸르, 트리클로피리카르브); 피리미딘 살진균제 (부피리메이트, 디플루메토림, 디메티리몰, 에티리몰, 페나리몰, 페림존, 누아리몰, 트리아리몰); 아닐리노피리미딘 살진균제 (시프로디닐, 메파니피림, 피리메타닐); 피롤 살진균제 (디메타클론, 펜피클로닐, 플루디옥소닐, 플루오로이미드); 4급 암모늄 살진균제 (베르베린, 상귀나린); 퀴놀린 살진균제 (에톡시퀸, 할라크리네이트, 8-히드록시퀴놀린 술페이트, 퀴나세톨, 퀴녹시펜, 테부플로퀸); 퀴논 살진균제 (클로라닐, 디클론, 디티아논); 퀴녹살린 살진균제 (키노메티오나트, 클로르퀴녹스, 티오퀴녹스); 티아디아졸 살진균제 (에트리디아졸, 사이센통, 티오디아졸-구리, 아연 티아졸); 티아졸 살진균제 (에타복삼, 이소티아닐, 메트술포박스, 옥틸리논, 옥사티아피프롤린, 티아벤다졸, 티플루자미드); 티아졸리딘 살진균제 (플루티아닐, 티아디플루오르); 티오카르바메이트 살진균제 (메타술포카르브, 프로티오카르브); 티오펜 살진균제 (에타복삼, 이소페타미드, 실티오팜); 트리아진 살진균제 (아닐라진); 트리아졸 살진균제 (아미술브롬, 비테르타놀, 플루오트리마졸, 트리아즈부틸); 코나졸 살진균제 (트리아졸) (아자코나졸, 브로무코나졸, 시프로코나졸, 디클로부트라졸, 디페노코나졸, 디니코나졸, 디니코나졸-M, 에폭시코나졸, 에타코나졸, 펜부코나졸, 플루퀸코나졸, 플루실라졸, 플루트리아폴, 푸르코나졸, 푸르코나졸-시스, 헥사코나졸, 후안준주오, 이미벤코나졸, 이프코나졸, 메트코나졸, 미클로부타닐, 펜코나졸, 프로피코나졸, 프로티오코나졸, 퀸코나졸, 시메코나졸, 테부코나졸, 테트라코나졸, 트리아디메폰, 트리아디메놀, 트리티코나졸, 유니코나졸, 유니코나졸-P); 트리아졸로피리미딘 살진균제 (아메톡트라딘); 우레아 살진균제 (벤탈루론, 펜시쿠론, 퀴나자미드); 아연 살진균제 (아시페탁스-아연, 구리 아연 크로메이트, 쿠프라넵, 만코젭, 메티람, 폴리카르바메이트, 폴리옥소림-아연, 프로피넵, 아연 나프테네이트, 아연 티아졸, 아연 트리클로로페녹시드, 지넵, 지람); 미분류 살진균제 (아시벤졸라르, 아시페탁스, 알릴 알콜, 벤즈알코늄 클로라이드, 베톡사진, 브로모탈로닐, 키토산, 클로로피크린, DBCP, 데히드로아세트산, 디클로메진, 디에틸 피로카르보네이트, 에틸리신, 펜아미노술프, 페니트로판, 펜프로피딘, 포름알데히드, 푸르푸랄, 헥사클로로부타디엔, 메틸 이소티오시아네이트, 니트로스티렌, 니트로탈-이소프로필, OCH, 펜타클로로페닐 라우레이트, 2-페닐페놀, 프탈리드, 피페랄린, 프로파미딘, 프로퀴나지드, 피로퀼론, 소듐 오르토페닐페녹시드, 스피록사민, 술트로펜, 티시오펜, 트리시클라졸) 또는 메페녹삼을 포함한다.
나타낸 바와 같이, 제초제, 살진균제, 살충제, 또는 다른 작물 보호 화학제에 대한 저항성을 갖는 재조합 생물방제제는 유전자 조작 기술을 통해 생산될 수 있고, 이러한 조작된 또는 재조합 생물방제제는 성장하여 생물방제제의 변형된 개체군을 생산할 수 있다. 재조합 생물방제제는 폴리뉴클레오티드를 형질전환에 의해 생물방제 숙주 세포에 도입함으로써 생산된다. 미생물의 형질전환 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며 이용가능하다. 일반적으로, 문헌 [Hanahan, D. (1983) Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids J. Mol . Biol. 166, 557-77]; [Seidman, C.E. (1994) In: Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al. eds., John Wiley and Sons, NY]; [Choi et al. (2006) J. Microbiol. Methods 64:391-397]; [Wang et al. 2010. J. Chem . Technol. Biotechnol . 85:775-778]을 참조한다. 형질전환은 실험실에서 그의 환경으로부터 수용성 세포(competent cell)에 의한 네이키드(naked) DNA의 자연적인 흡수에 의해 발생할 수 있다. 별법으로, 세포는 저온 조건하에서의 2가 양이온에의 노출에 의해, 전기천공법에 의해, 폴리에틸렌 글리콜에의 노출에 의해, 섬유상 나노입자로의 처리에 의해, 또는 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 방법에 의해 수용성 상태가 될 수 있다.
재조합 생물방제제의 형질전환에 사용하기 위한 제초제 저항성 유전자는 푸모니신 독성제거 유전자 (미국 특허 5,792,931); 제초제 저항성, 특히 술포닐우레아-유형 제초제 저항성을 유도하는 아세토락테이트 합성효소 (ALS) 돌연변이체, 예컨대 S4 및/또는 Hra 돌연변이; 글루타민 합성효소의 억제제, 예컨대 포스피노트리신 또는 바스타(basta) (예를 들어, bar 유전자); 및 글리포세이트 저항성 (EPSPS 유전자); 및 HPPD 저항성 (WO 96/38576, 미국 특허 6,758,044; 7,250,561; 7,935,869; 및 8,124,846), 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 이러한 유전자를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다. 이들 공보 및 특허의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. bar 유전자는 제초제 바스타에 대한 저항성을 코딩하고, nptII 유전자는 항생제 카나마이신 및 제네티신에 대한 저항성을 코딩하며, ALS-유전자 돌연변이체는 클로르술푸론, 메트술푸론, 술포메투론, 니코술푸론, 림술푸론, 플라자술푸론, 술포술푸론, 및 트리아술푸론을 포함하는 술포닐우레아 제초제, 및 이마제타피르, 이마자퀸, 이마자피르, 및 이마자메타벤즈를 포함하는 이미다졸리논 제초제에 대한 저항성을 코딩한다.
본 발명의 생물학적 방제제의 변형된 개체군은 습윤성 분말, 분진, 과립, 수성 또는 유성 액체 제품 등으로서 제제화될 수 있다. 이러한 제제는 담체 및 다른 작용제 이외에도, 변형된 생물학적 방제제를 포함할 것이다. 제제는 생물방제를 위한 재배지 접종물, 종자 코팅물 등으로서 사용될 수 있다. 즉, 변형된 생물방제 개체군은 유효량의 변형된 작용제로의 종자 코팅, 토양에 대하여 직접적인 변형된 생물방제 개체군의 이랑간 적용, 엽면 적용, 화분용 혼합물과의 혼합, 및 수확 후의 질병 방제를 포함하는, 관련 기술분야에 공지된 임의의 방식으로 사용될 수 있다. 이러한 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 5,348,742 및 공개 유럽 출원 EP0472494 A2에 개시되어 있고, 이들은 둘다 모두 본원에 참조로 포함된다. 생물방제는 질병을 감소시키기 위한 생물체의 현재 개체군의 관리 및 특정 생물체의 도입을 포함한다.
본원에 제공된 생물방제제는 그의 활성 또는 그것이 첨가된 화학제의 활성을 향상시키도록 살진균제, 살곤충제, 또는 제초제와 혼합될 수 있다. 일부 경우에, 생물방제제와 화학제의 조합은, 이들 2종의 혼합물이 이들의 단순한 상가 효과로부터 예상되는 것 이상의 효과를 나타내는 상승 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 변형된 생물학적 방제제는 질병을 유의하게 감소시키고, 식물 성장 및 수확을 촉진하며, 전통적인 살충제에 대한 의존성을 감소시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 변형된 작용제는 효과적인 통합 해충 관리 프로그램을 위해 다른 살충제와 함께 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 변형된 생물방제 개체군은 본원에 참조로 포함되는 WO 94/10845에 개시된 방식으로, 공지된 살충제와 함께 제제로 혼합될 수 있다.
변형된 생물방제 개체군은 유효량으로 적용된다. 변형된 생물방제 개체군의 유효량은 병원체를 방제 또는 억제하는 충분한 양이다. 다른 실시양태에서, 변형된 생물방제제의 유효량은 농업 재배지 적용률의 살생물제의 존재하에 식물 건강, 성장 또는 수확을 촉진 또는 증가시키는 충분한 양이다. 변형된 생물방제제 및/또는 살생물제의 적용량은 표적으로 하는 병원체, 보호되어야 하는 작물, 변형된 생물방제 개체군의 효능, 질병의 중증도, 기후 조건 등에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 재배지 접종을 위한 변형된 생물방제제의 적용량은 헥타르 당 1012 내지 1016 콜로니 형성 단위 (CFU)이다 (a.i.가 g 당 1000억 CFU라면, 이는 헥타르 당 약 10 g 내지 10 kg의 활성 성분에 상응함). 다른 실시양태에서, 재배지 접종을 위한 변형된 생물방제제의 적용량은 헥타르 당 3 x 1015 내지 1 x 1017 콜로니 형성 단위 (CFU)이다 (a.i.가 g 당 1000억 CFU라면, 이는 헥타르 당 약 30 kg 내지 1000 kg의 활성 성분에 상응함). 다른 실시양태에서, 재배지 접종을 위한 변형된 생물방제제의 적용량은 헥타르 당 3 x 1015 내지 1 x 1017 콜로니 형성 단위 (CFU); 헥타르 당 약 1 x 1012 내지 약 1 x 1013 콜로니 형성 단위 (CFU), 헥타르 당 약 1 x 1013 내지 약 1 x 1014 콜로니 형성 단위 (CFU), 헥타르 당 약 1 x 1014 내지 약 1 x 1015 콜로니 형성 단위 (CFU), 헥타르 당 약 1 x 1015 내지 약 1 x 1016 콜로니 형성 단위 (CFU), 또는 헥타르 당 약 1 x 1016 내지 약 1 x 1017 콜로니 형성 단위 (CFU)이다. 다른 실시양태에서, 재배지 접종을 위한 변형된 생물방제제의 적용량은 헥타르 당 적어도 약 1 x 1013, 약 1 x 1014, 1 x 1015, 약 1 x 1016 또는 약 1 x 1017 콜로니 형성 단위 (CFU)이다. 또 다른 실시양태에서, 변형된 생물방제제의 적용량은 a.i.가 g 당 1000억 CFU라면, 헥타르 당 10 g 내지 50 kg, 50 kg 내지 100 kg, 100 kg 내지 200 kg, 200 kg 내지 300 kg, 300 kg 내지 400 kg, 400 kg 내지 500 kg, 500 kg 내지 600 kg, 600 kg 내지 700 kg, 700 kg 내지 800 kg, 800 kg 내지 900 kg, 900 kg 내지 1000 kg의 활성 성분이다. 또 다른 실시양태에서, 변형된 생물방제제의 적용량은 a.i.가 g 당 1000억 CFU라면, 헥타르 당 적어도 10 g, 50 kg, 100 kg, 200 kg, 300 kg, 400 kg, 500 kg, 600 kg, 700 kg, 800 kg, 900 kg, 1000 kg의 활성 성분이다. 구체적인 실시양태에서, 적용되는 변형된 생물방제제는 NRRL No. B-50897로서 수탁된 균주 및/또는 NRRL No. B-50999로서 수탁된 균주 AIP050999를 포함한다.
살생물제의 임의의 적절한 농업 적용량이 작물에 적용될 수 있는데, 예를 들어 주어진 생물체 (즉, 관심 해충, 예컨대 진균, 곤충, 잡초, 질병 등)를 방제하는 살생물제의 유효량이 적용될 수 있다. 변형된 생물방제제의 유효량에 대한 검정 방법은 예를 들어, 동일한 농도의 비-변형 생물방제제가 살생물제의 유효량과 조합되어 적용될 때 발생하는 식물 건강, 수확 및/또는 성장과 비교하여, 유효량의 생물방제제 및 재배지 적용률의 살생물제의 적용시 발생하는 식물 건강, 수확 및/또는 성장의 임의의 통계학적으로 유의한 증가를 포함한다.
따라서, 본 발명의 추가 실시양태는 본 발명의 변형된 생물학적 방제제의 개체군을 식물 병원체가 성장할 수 있는 환경에 적용함으로써 식물 병원체를 방제하거나 또는 그의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 적용은 식물, 식물의 부분, 보호되어야 하는 식물의 종자, 또는 보호되어야 하는 식물이 성장하고 있거나 또는 성장할 토양에 대한 것일 수 있다. 식물 또는 식물 부분에 대한 적용은 수확 전이거나 또는 수확 후일 수 있다. 종자에 대한 적용은 종자의 파종 전일 것이다.
다른 실시양태에서, 작물, 재배지, 종자 및/또는 잡초가 유효량의 변형된 방제제와 유효량의 살생물제의 조합으로 처리될 수 있다. 작물, 재배 영역 또는 재배지를 변형된 생물방제제와 살생물제의 "조합으로 처리한다" 또는 작물, 재배 영역 또는 재배지에 변형된 생물방제제와 살생물제의 "조합을 적용한다"는 것은, 특정 재배지, 식물 작물, 종자 및/또는 잡초 중 하나 이상을 목적하는 효과가 달성되도록 하기 위해 변형된 생물방제제 중 하나 이상 및 하나 이상의 살생물제로 처리함을 나타내기 위한 것이다. 추가로, 변형된 생물방제제 및 살생물제 중 어느 하나 또는 이들 둘 모두의 적용은 작물의 파종 전에 발생할 수 있다 (예를 들어, 토양, 종자, 또는 식물에 대하여). 게다가, 목적하는 효과가 달성되는 한, 변형된 생물방제제 및 살생물제의 적용은 동시적일 수 있거나 또는 적용이 상이한 시점에 발생할 수 있다 (순차적).
하나의 비제한적 실시양태에서, 변형된 생물방제제는 글리포세이트에 대하여 저항성이고, 이것이 유효량으로 적용되고, 살생물제가 글리포세이트 또는 그의 활성 유도체를 포함할 때 식물 건강, 수확 또는 성장을 추가로 증가시킨다. 이러한 방법에서, 종자, 식물 또는 재배지는 글리포세이트에 대하여 저항성인 변형된 생물방제제의 유효량 및 글리포세이트의 유효량의 조합으로 처리되고, 여기서 글리포세이트의 유효량은 작물에 유의하게 피해를 입히지 않으면서 잡초를 선택적으로 방제하기 위한 것이다. 이러한 실시양태에서, 변형된 생물방제제의 유효량은 동일한 농도의 비-변형 생물방제제가 유효량의 글리포세이트 또는 그의 활성 유도체와 조합되어 적용될 때 발생하는 식물 건강, 수확 및/또는 성장과 비교하여, 식물 건강, 수확 및/또는 성장의 통계학적으로 유의한 증가를 초래하기에 충분하다. 추가 실시양태에서, 생물방제제는 유효량의 AIP1620을 포함한다.
또 다른 하나의 비제한적 실시양태에서, 변형된 생물방제제는 글루포시네이트에 대하여 저항성이고, 이것이 유효량으로 적용되고, 살생물제가 글루포시네이트 또는 그의 활성 유도체를 포함할 때 식물 건강, 수확 또는 성장을 추가로 증가시킨다. 이러한 방법에서, 종자, 식물 또는 재배지는 글루포시네이트에 대하여 저항성인 변형된 생물방제제의 유효량 및 글루포시네이트의 유효량의 조합으로 처리되고, 여기서 글루포시네이트의 유효량은 작물에 유의하게 피해를 입히지 않으면서 잡초를 선택적으로 방제하기 위한 것이다. 이러한 실시양태에서, 변형된 생물방제제의 유효량은 동일한 농도의 비-변형 생물방제제가 유효량의 글루포시네이트 또는 그의 활성 유도체와 조합되어 적용될 때 발생하는 식물 건강, 수확 및/또는 성장과 비교하여, 식물 건강, 수확 및/또는 성장의 통계학적으로 유의한 증가를 초래하기에 충분하다. 추가 실시양태에서, 생물방제제는 유효량의 AIP050999를 포함한다.
본원에 사용된 용어 식물은 식물 세포, 식물 원형질체, 식물이 재생될 수 있는 식물 세포 조직 배양물, 식물 캘러스(calli), 식물 클럼프(clump), 및 식물 또는 식물의 부분, 예컨대 배(embryo), 화분, 배주, 종자, 잎, 꽃, 가지, 열매, 커넬(kernel), 이삭, 속대, 겉껍질, 줄기, 뿌리, 근단, 꽃밥 등에서의 무손상 식물 세포를 포함한다. 곡립은 종의 성장 또는 번식 이외의 목적으로 상업적 재배농에 의해 생산되는 성숙 종자를 의미하기 위한 것이다. 재생 식물의 자손, 변이체, 및 돌연변이체가 또한, 이들 부분이 도입된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 한, 본 발명의 범주 내에 포함된다.
변형된 생물방제제는 단자엽 및 쌍자엽을 비제한적으로 포함하는, 임의의 식물 종과 함께 이용될 수 있다. 관심 식물 종의 예는 옥수수 (Zea mays), 유채속(Brassica) sp. (예를 들어, B. napus , B. rapa , B. juncea), 특히 종자유의 공급원으로서 유용한 유채속 종, 알팔파(alfalfa) (Medicago sativa), 벼 (Oryza sativa), 호밀 (Secale cereale), 수수 (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), 조 (예를 들어, 진주 조(pearl millet) (Pennisetum glaucum), 기장(proso millet) (Panicum miliaceum), 폭스테일 조(foxtail millet) (Setaria italica), 손가락 조(finger millet) (Eleusine coracana)), 해바라기 (Helianthus annuus), 홍화 (Carthamus tinctorius), 밀 (Triticum aestivum), 대두 (Glycine max), 담배 (Nicotiana tabacum), 감자 (Solanum tuberosum), 땅콩 (Arachis hypogaea), 목화 (Gossypium barbadense , Gossypium hirsutum), 고구마 (Ipomoea batatus), 카사바(cassava) (Manihot esculenta), 커피 (Coffea spp.), 코코넛 (Cocos nucifera), 파인애플 (Ananas comosus), 감귤 나무 (Citrus spp.), 코코아 (Theobroma cacao), 차 (Camellia sinensis), 바나나 (Musa spp.), 아보카도 (Persea americana), 무화과 (Ficus casica), 구아바 (Psidium guajava), 망고 (Mangifera indica), 올리브 (Olea europaea), 파파야 (Carica papaya), 캐슈 (Anacardium occidentale), 마카다미아 (Macadamia integrifolia), 아몬드 (Prunus amygdalus), 사탕무 (Beta vulgaris), 사탕수수 (Saccharum spp.), 귀리, 보리, 채소, 관엽식물, 및 구과식물을 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다.
채소는 토마토 (Lycopersicon esculentum), 상추 (예를 들어, Lactuca sativa), 강낭콩 (Phaseolus vulgaris), 리마콩(lima bean) (Phaseolus limensis), 완두콩 (Lathyrus spp.), 및 오이(Cucumis) 속의 구성원, 예컨대 오이 (C. sativus), 칸탈루프 (C. cantalupensis), 및 머스크 멜론 (C. melo)을 포함한다. 관엽식물은 진달래 (Rhododendron spp.), 수국 (Macrophylla hydrangea), 하비스쿠스 (Hibiscus rosasanensis), 장미 (Rosa spp.), 튤립 (Tulipa spp.), 수선화 (Narcissus spp.), 피튜니아 (Petunia hybrida), 카네이션 (Dianthus caryophyllus), 포인세티아 (Euphorbia pulcherrima), 및 국화를 포함한다.
본 발명의 실시에 이용될 수 있는 구과식물은 예를 들어, 소나무, 예컨대 로블롤리 소나무(loblolly pine) (Pinus taeda), 슬래시 소나무(slash pine) (Pinus elliotii), 폰데로사 소나무(ponderosa pine) (Pinus ponderosa), 로지폴 소나무(lodgepole pine) (Pinus contorta), 및 몬테레이 소나무(Monterey pine) (Pinus radiata); 더글라스-퍼(Douglas-fir) (Pseudotsuga menziesii); 웨스턴 헴록(Western hemlock) (Tsuga canadensis); 시트카 스프루스(Sitka spruce) (Picea glauca); 레드우드(redwood) (Sequoia sempervirens); 트루 퍼(true fir), 예컨대 실버 퍼(silver fir) (Abies amabilis) 및 발삼 퍼(balsam fir) (Abies balsamea); 및 시더(cedar), 예컨대 웨스턴 레드 시더(Western red cedar) (Thuja plicata) 및 알래스카 옐로우-시더(Alaska yellow-cedar) (Chamaecyparis nootkatensis)를 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 식물은 작물 식물 (예를 들어, 옥수수, 알팔파, 해바라기, 유채속, 대두, 목화, 홍화, 땅콩, 수수, 밀, 조, 담배 등)이다. 다른 실시양태에서, 옥수수 또는 대두 식물이 이용된다.
하기 실시예는 제한하는 방식이 아닌, 예시하는 방식으로 제공된다.
실험
실시예 1: AIP0069의 글리포세이트 저항성 돌연변이체의 생산.
서론
위험성을 감소시키고 수확을 개선하기 위한 생물학적 작용제가 현재 농업에 사용되고 있다. 이러한 생물학적 작용제의 하나의 중요한 속성은 상업적 농업 관행상 이 또한 적용될 수 있는 화학제와 상용적이어야 한다는 것이다. 글리포세이트는 세계 제초제 시장의 약 25%를 차지하는 화학적 제초제이며, 연간 대략 2억 파운드의 사용량이 적용된다. 이 제초제는 식물 및 수많은 박테리아에서의 방향족 아미노산 생합성의 한 단계를 촉매하는 효소인, 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 (EPSP) 합성효소 (EPSPS)를 억제한다. 그에 따라 글리포세이트는 EPSPS에 의존하는 임의의 생물방제제를 포함하는 생물체의 생존능을 감소시키고, 식물 미생물 군집을 변경시키는 것으로 보고되었다. 상기 보고는 농업에서 중요한 "모잘록병" 질병군의 병원인, 피티움 및 리족토니아를 포함하는 다수의 중요한 진균 식물 병원체의 생물학적 방제에 사용되는 슈도모나스 플루오레센스 균주로의 글리포세이트 내성의 성공적인 도입을 개시한다. 이 생물방제제의 화학적 상용성을 개선하는 것 이외에도, 글리포세이트 저항성의 도입은 상업적 생산에서 추가 장점을 제공한다.
본원에 예를 들어 제공된 글리포세이트 이외에도, 다른 농업 화학제가 바람직한 생물학적 방제 또는 식물 성장 촉진 박테리아의 성장을 억제할 수 있다. 그 예로는 제초제 글루포시네이트 (글루타민 합성효소 억제제), 술포닐우레아 및 이미다졸리논 제초제 (분지쇄 아미노산 합성 억제제) 및 항생제 스트렙토마이신, 옥시테트라시클린 및 카수가마이신이 포함된다.
물질 및 방법 및 결과
생물학적 방제 균주 슈도모나스 플루오레센스 AIP0069를 0 또는 5 mM 글리포세이트를 함유하는 한천 플레이트 상에 스트리킹하였다. 기본 배지는 탈이온수 1 리터 당 11.3 g의 Na2HPO4·7H2O, 3 g의 KH2PO4, 1 g의 NH4Cl, 10 g의 모노소듐 글루타메이트, 31 g의 당밀, 493 mg의 MgSO4·7H2O, 50 mg의 ZnSO4·7H2O, 5 mg의 FeSO4·7H2O, 및 0.3 g의 티아민으로 이루어졌다. 글리포세이트의 부재하에서는 25℃에서 밤새 인큐베이션한 후에 다수의 박테리아 콜로니가 가시적이었다. 5 mM 글리포세이트의 존재하에서는 유사한 인큐베이션 후에 콜로니가 가시적이지 않았지만, 수일간의 연장된 인큐베이션 후에 어느 정도의 콜로니가 관찰되었다. 이러한 콜로니를 단리하여 여러 글리포세이트 농도를 갖는 액체 배지에서 성장시켰다. GlyphR1이라 명명한 하나의 단리물은 글리포세이트에 대하여 모 AIP0069 균주에 비해 10배의 저항성을 나타냈다 (도 1). 이러한 개선된 균주는 글리포세이트가 토양 및 작물에 존재하는 농경 방식에서 AIP0069 또는 유사한 글리포세이트-감수성 균주보다 더 경쟁적이고, 그에 따라 생물방제제로서 더욱 효과적일 것이라 예상된다. 또한, 글리포세이트는 상기 균주의 생산, 제제화 및/또는 저장 동안에 다른 박테리아에 의한 오염을 방지하기 위한 선택적 작용제로서 사용될 수 있다.
실시예 2: 글리포세이트 저항성 돌연변이체의 생물학적 방제 활성.
박테리아를 탈이온수 1 리터 당 11.3 g의 Na2HPO4·7H2O, 3 g의 KH2PO4, 1 g의 NH4Cl, 10 g의 모노소듐 글루타메이트, 30 g의 당밀, 493 mg의 MgSO4·7H2O, 50 mg의 ZnSO4·7H2O, 및 5 mg의 FeSO4·7H2O로 이루어진 브로쓰(broth) 배지 50 ml에 접종하였다. 배양물을 28℃, 250 rpm의 진탕 인큐베이터 내 250 ml 용량의 배플 플라스크에서 2일 동안 성장시켰다. 세포를 3500 xg의 원심분리에 의해 10분 동안 수집하였다. 배양물 상청액을 버리고, 세포를 원래 배양물의 부피로 멸균 탈이온수에 재현탁시켰다. 항진균 활성을 갖지 않는 AIP0069의 돌연변이체 AIP0323이 음성 대조군으로서 포함되었다.
리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 감염 쌀알을 이미 개시된 바와 같이 생산하였다 (K.A. Holmes and D.M. Benson, 1994. Evaluation of Phytophthora parasitica var. nicotianae as a biocontrol for Phytophthora parasitica on Catharanthus roseus. Plant Disease 78:193-199). 감염된 쌀을 블렌더로 분쇄하고 #10 시이브(sieve) (2 mm의 구멍)를 통해 스크리닝하였다. 분쇄된 곡립을 리터 당 2 g의 비율로 발아 배지와 혼합하였다.
봉선화 종자를 사이즈 402의 플러그 트레이(plug tray)에 있는 감염된 발아 배지에 파종하고, 플러그 당 0.3 ml의 재현탁 박테리아로 처리하여, 표준 온실 생산 조건하에 성장시켰다. 각각의 실험 처리를 위해 2개의 반복물이 존재하였고, 반복물 당 20개의 플러그를 가졌다. 2주 후에 건강한 묘목 수를 평가하였다. 하기 표 1의 데이터는 글리포세이트 저항성 변이체 AIP0404 및 AIP1620이 조상 균주 AIP0069와 비교하여 충분한 항진균 활성을 보유함을 입증하였다.
<표 1>
Figure pct00001
생물방제 균주는 푸사리움 이삭마름병(Fusarium head blight), 아시아 대두 녹병(Asian Soybean Rust), 리족토니아, 보트리티스, 피티움, 잔디 병해 등을 방제하는데 사용될 수 있다.
실시예 3:
글리포세이트 내성 EPSPS 효소를 코딩하는 유전자는 다양한 박테리아로부터 수득할 수 있다 (A. Schulz et al, 1985. Differential sensitivity of bacterial 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases to the herbicide glyphosate. FEMS Microbiology Letters, 28:297-301). 특히, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) CP4 (G.F. Barry et al, 1992. Inhibitors of amino acid biosynthesis: Strategies for imparting glyphosate tolerance to crop plants. p. 139-145. In B.K. Singh et al. (e.) Biosynthesis and molecular regulation of amino acids in plants. Am. Soc. Plant Physiologists, Rockville, MD), 및 아트로박터 글로비포르미스(Arthrobacter globiformis) (C.L. Peters et al, 2010, GRG23 and GRG51 genes conferring herbicide resistance. 미국 특허 7,674,958)로부터의 EPSPS 유전자가 고 저항성이다.
적합한 유전자를 PCR에 의해 증폭시키거나 또는 관련 기술분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 합성 생산한다. 오픈 리딩 프레임을 tacI 프로모터와 rrnB 전사 종결인자 사이에서 플라스미드 벡터 pKK223-3 (파마시아(Pharmacia))으로 클로닝한다. tacI 프로모터는 슈도모나스에서 유전자의 강력한 구성적 발현을 제공한다. 균주 AIP0069로부터의 게놈 DNA 서열을 프로모터 - 유전자 - 종결인자 카세트의 양측에 혼입하여 AIP0069 염색체로의 상동 재조합을 지시한다.
그에 따른 플라스미드는 관련 기술분야에 널리 공지된 기술인 접합, 및 100 mM 글리포세이트를 함유하는 제한 배지에서의 선택에 의해 이. 콜라이(E. coli)로부터 슈도모나스 플루오레센스 AIP0069로 동원된다. 플라스미드는 좁은 숙주 범위의 colE1 복제 기점을 함유하므로, 슈도모나스에서 복제될 수 없다. 글리포세이트 저항성 콜로니는 프로모터 - 유전자 - 종결인자 카세트가 상동 재조합에 의해 슈도모나스 염색체로 통합될 때 수득될 것이다. 단일 교차(crossover) 사건 (전체 플라스미드가 염색체로 통합되는 경우)은 PCR, 서던 블롯팅(Southern blotting), 또는 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 기술에 의해 이중 교차 사건 (목적하는 프로모터 - 유전자 - 종결인자 카세트만이 통합되는 경우)과 구별된다. 이중 교차 사건을 사용하도록 선택한다.
실시예 4.
AIP1620 종균 배양물을 루리아(Luria) 한천 플레이트로부터의 콜로니를 사용하여 접종하고, 0.1X NBY 브로쓰 (탈이온수 1 리터 당 0.8 g의 디프코(Difco) 영양 브로쓰 분말 및 0.5 g의 효모 추출물 분말)에서 28℃, 250 rpm으로 성장시켰다. 생산 배양물을 탈이온수 1 리터 당: 11.3 g의 Na2HPO4·7H2O, 3.0 g의 KH2PO4, 1.0 g의 NH4Cl, 10 g의 모노소듐 글루타메이트, 3.0 g의 당밀, 0.49 g의 MgSO4·7H2O, 50 mg의 ZnSO4·7H2O, 5 mg의 FeSO4·7H2O 및 pH를 대략 6.2로 조정하는 충분한 염산을 함유하는 브로쓰에서 성장시켰다. 50 ml의 생산 브로쓰를 250 ml 용량의 배플 배양 플라스크에 넣고, 0.5 ml의 종균 배양물을 접종하여, 28℃, 250 rpm에서 인큐베이션하였다. 생산 배양물을 다양한 시점에 접종한 후에, 동시에 수거하여 15, 24, 33, 및 43시간의 인큐베이션 시간으로 배양물을 수거하였다. 40 ml의 각각의 배양물을 원심분리에 의해 수거하였다. 소비된 배양 브로쓰를 버리고, 세포를 40 ml의 최종 부피로 오토클레이브 처리된 탈이온수에 재현탁시켰다.
진균 접종물을 홈스(Holmes) 및 벤슨(Benson)에 의해 개시된 쌀알 방법을 사용하여 제조하였다 (K.A. Holmes and D.M. Benson, 1994. Evaluation of Phytophthora parasitica var. nicotianae for biocontrol of Phytophthora parasitica on Catharanthus roseus. Plant Disease, 78:193-199). 감염된 쌀알을 블렌더로 분쇄하고 #10 시이브를 통해 스크리닝하였다. 이 접종물을 리터 당 1.0 g의 비율로 파파드(Fafard) 고급 발아 혼합물과 혼합하였다.
접종된 발아 혼합물을 392 온실 플러그 트레이 (미국 오하이오주 애크런에 소재하는 랜드마크 플라스틱 코포레이션(Landmark Plastic Corporation))에 위치시키고 하나의 봉선화 종자를 각각의 셀에 파종하였다. AIP1620 세포 현탁물을 셀 당 0.3 ml의 비율로 적용하였다. 종자를 표준 온실 조건하에 발아시켰다. 각각의 처리에 3개의 반복물이 존재하였고, 반복물 당 20개의 셀을 가졌다. 10 내지 14일 후에 각각의 처리에서의 건강한 묘목 수를 계수함으로써 검정을 평가하였다. 결과가 하기 표 2에 요약되어 있다.
Figure pct00002
실시예 5.
AIP1620 세포의 다중 온실 실험을 10개월의 기간에 걸쳐서 수행하였다. 각각의 실험에서 AIP1620 배양물을 대략 24시간의 배양 시간을 이용하여 본질적으로 실시예 4에 기재된 바와 같이 성장시키고, 수거하여, 오토클레이브 처리된 탈이온수에 재현탁시켰다. 온실 발아 실험을 또한 알. 솔라니 접종률이 실험에 따라, 발아 혼합물 1 리터 당 0.25 내지 1.0 g의 분쇄된 쌀알로 달라지는 것을 제외하고는, 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였다. 17가지의 실험으로부터 얻어진 결과가 하기 표 3에 나타나 있고, 이는 모잘록병의 방제에 있어서의 AIP1620의 일관된 능력을 입증하였다.
Figure pct00003
실시예 6.
50 그램의 AIP1620 세포 페이스트를 0.3 미만의 수분 활성까지 건조된 50 g의 미뉴겔(Min-U-Gel) 400 또는 미뉴겔 200 아타풀자이트(attapulgite) 점토 (미국 메릴랜드주 스팍스에 소재하는 액티브 미네랄스 인터내셔널, 엘엘씨(Active Minerals International, LLC))와 혼합하였다. 각각의 제제의 하나의 분량을 4℃에서 저장하고, 또 다른 분량을 22℃에서 저장하였다.　 이러한 제제의 생존능을 희석 플레이팅에 의해 다양한 시점에 시험하였고, 결과가 하기 표 4에 나타나 있다. 21일의 저장 후에, 4℃에서 저장하였던 샘플을 온실 종자 발아 검정으로 시험하였고, 리족토니아 솔라니에 대한 항진균 활성을 보유하였음이 확인되었다.
Figure pct00004
실시예 7.
100 그램의 AIP1620 세포 페이스트를 식품 가공기를 사용하여 20 g의 합성 규산칼슘 (마이크로셀(MicroCel) E, 미국 캘리포니아주 롬포크에 소재하는 이메리스 필트레이션 미네랄스(Imerys Filtration Minerals))과 혼합하였다.　 생성 물질은 희석 플레이팅에 의해 측정하였을 때, 그램 당 2.7 x 1010 콜로니 형성 단위 (CFU/g)의 AIP1620을 함유하였다.　 이 물질을 0.30 미만의 수분 활성까지 40℃에서 건조시켰고, 이때는 1.4 x 109 CFU/g의 AIP1620을 함유하였다.　 건조된 분말 제제를 진공 밀봉된 마일러 파우치(mylar pouch)에 넣어 22℃에서 저장하였다.　 85일 후에 분말은 1.1 x 106 CFU/g의 AIP1620을 함유하였고, 온실 종자 발아 검정에 의해 측정하였을 때 리족토니아 솔라니에 대한 항진균 활성을 보유하였다.
실시예 8.
100 그램의 AIP1620 세포 페이스트를 식품 가공기를 사용하여 5 g의 글리세롤 및 20 g의 합성 규산칼슘과 혼합하였다.　 생성 물질은 희석 플레이팅에 의해 측정하였을 때, 5.7 x 1011 CFU/g의 AIP1620을 함유하였다.　 이 물질을 0.30 미만의 수분 활성까지 40℃에서 건조시켰고, 이때는 3.1 x 109 CFU/g의 AIP1620을 함유하였다.　 건조된 분말 제제를 진공 밀봉된 마일러 파우치에 넣어 22℃에서 저장하였다.　 61일 후에 분말은 6.2 x 108 CFU/g의 AIP1620을 함유하였고, 온실 종자 발아 검정에 의해 측정하였을 때 리족토니아 솔라니에 대한 항진균 활성을 보유하였다.
실시예 9.
100 그램의 AIP1620 세포 페이스트를 식품 가공기를 사용하여 5 g의 트레할로스 및 20 g의 합성 규산칼슘과 혼합하였다.　 생성 물질은 희석 플레이팅에 의해 측정하였을 때, 5.7 x 1011 CFU/g의 AIP1620을 함유하였다.　 이 물질을 0.30 미만의 수분 활성까지 40℃에서 건조시켰고, 이때는 4.0 x 108 CFU/g의 AIP1620을 함유하였다.　 건조된 분말 제제를 진공 밀봉된 마일러 파우치에 넣어 22℃에서 저장하였다.　 54일 후에 분말은 2.7 x 107 CFU/g의 AIP1620을 함유하였다.
실시예 10.
4 그램의 크산탄 검을 4 g의 대두유에 분산시켰다. 생성 혼합물을 100 g의 AIP1620 세포 페이스트와 합치고 실온에서 약 5분 동안 증점시켰다. 증점된 혼합물을 식품 가공기를 사용하여 20 g의 합성 규산칼슘과 블렌딩하였다. 생성 물질은 9.4 x 1011 CFU/g의 AIP1620을 함유하였고, 이것을 50 g씩 두 분량으로 나누었다. 하나의 분량을 < 0.30의 수분 활성까지 40℃에서 건조시켰고, 이때는 7.0 x 108 CFU/g의 AIP1620을 함유하였다.
다른 하나의 분량을 < 0.10의 수분 활성까지 실온에서 실리카 겔 상에서 건조시켰고, 이때는 1.18 x 1010 CFU/g의 AIP1620을 함유하였다.
실시예 11.
5개의 상이한 제제를 하기 표 5에 제시된 부형제 및 비율을 사용하여, 본질적으로 실시예 4에 기재된 바와 같이 제조하였다. 이러한 제제를 0.30 미만의 수분 활성까지 40℃에서 건조시켜 4℃에서 저장하였다.
진균 접종물을 홈스 및 벤슨에 의해 개시된 쌀알 방법을 사용하여 제조하였다 (K.A. Holmes and D.M. Benson, 1994. Evaluation of Phytophthora parasitica var. nicotianae for biocontrol of Phytophthora parasitica on Catharanthus roseus. Plant Disease, 78:193-199). 감염된 쌀알을 블렌더로 분쇄하고 #10 시이브를 통해 스크리닝하였다. 이 접종물을 리터 당 0.25 g의 비율로 파파드 고급 발아 혼합물과 혼합하였다.
접종된 혼합물을 나누어 AIP1620 제제를 리터 당 5 g의 비율로 첨가하였다. 봉선화 종자를 접종 및 처리된 혼합물에 파종하였다. 종자를 표준 온실 조건하에 발아시켰다. 10일 후에 각각의 처리에서의 건강한 묘목 수를 계수함으로써 검정을 평가하였다. 결과가 하기 표 6에 요약되어 있다.
Figure pct00005
Figure pct00006
실시예 12.
다수의 제제를 여러 경우에 상기 실시예 4 내지 8에 기재된 바와 같이 제조하였다. 상이한 제제의 조성이 하기 표 7에 나타나 있다. 0.30 이하의 수분 활성까지 건조시킨 후에, 제제화된 물질을 마일러 파우치에 넣어 진공 밀봉하고 22℃에서 저장하였다.
진균 접종물을 홈스 및 벤슨에 의해 개시된 쌀알 방법을 사용하여 제조하였다 (K.A. Holmes and D.M. Benson, 1994. Evaluation of Phytophthora parasitica var. nicotianae for biocontrol of Phytophthora parasitica on Catharanthus roseus. Plant Disease, 78:193-199). 감염된 쌀알을 블렌더로 분쇄하고 #10 시이브를 통해 스크리닝하였다. 이 접종물을 리터 당 0.25 g의 비율로 파파드 고급 발아 혼합물과 혼합하였다.
접종된 혼합물을 나누어 AIP1620 제제를 리터 당 5 g의 비율로 첨가하였다. 같은 날에, 각 제제의 서브샘플을 희석 플레이팅하여 AIP1620의 CFU/g을 측정하였다. 봉선화 종자를 접종 및 처리된 혼합물에 파종하였다. 종자를 표준 온실 조건하에 발아시켰다. 10 내지 14일 후에 각각의 처리에서의 건강한 묘목 수를 계수함으로써 검정을 평가하였다. 결과가 하기 표 8에 요약되어 있다.
Figure pct00007
Figure pct00008
이러한 결과는 AIP1620 제제가 생존능 및 활성, 즉 모잘록병에 대하여 묘목을 보호하는 능력을 보유함을 입증하였다.
실시예 13.
50 그램의 AIP1620 세포 페이스트를 0.2 미만의 수분 활성까지 건조된 50 g의 미뉴겔 400 또는 미뉴겔 200 아타풀자이트 점토 (미국 메릴랜드주 스팍스에 소재하는 액티브 미네랄스 인터내셔널, 엘엘씨)와 혼합하여 22℃에서 저장하였다. 이러한 제제의 생존능을 희석 플레이팅에 의해 다양한 시점에 시험하였고, 결과가 하기 표 9에 나타나 있다.　 21일 후에 이들 두 제제를 온실 종자 발아 검정으로 시험하였고, 리족토니아 솔라니에 대한 항진균 활성을 보유하였음이 확인되었다.
<표 9>
Figure pct00009
실시예 14.
온실 실험을 수행하여, 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea)의 방제에 있어서의 AIP1620의 효능을 입증하였다.
AIP1620 종균 배양물을 루리아 한천 플레이트로부터의 콜로니를 사용하여 접종하고, 0.1X NBY 브로쓰 (탈이온수 1 리터 당 0.8 g의 디프코 영양 브로쓰 분말 및 0.5 g의 효모 추출물 분말)에서 28℃, 250 rpm으로 성장시켰다. 생산 배양물을 탈이온수 1 리터 당: 11.3 g의 Na2HPO4·7H2O, 3.0 g의 KH2PO4, 1.0 g의 NH4Cl, 10 g의 모노소듐 글루타메이트, 3.0 g의 당밀, 0.49 g의 MgSO4·7H2O, 50 mg의 ZnSO4·7H2O, 5 mg의 FeSO4·7H2O 및 pH를 대략 6.2로 조정하는 충분한 염산을 함유하는 브로쓰에서 성장시켰다. 50 ml의 생산 브로쓰를 250 ml 용량의 배플 배양 플라스크에 넣고, 0.5 ml의 종균 배양물을 접종하여, 28℃, 250 rpm에서 인큐베이션하였다. 생산 배양물을 다양한 시점에 접종한 후에, 동시에 수거하여 15, 24, 33, 및 43시간의 인큐베이션 시간으로 배양물을 수거하였다. 40 ml의 각각의 배양물을 원심분리에 의해 수거하였다. 소비된 배양 브로쓰를 버리고, 세포를 40 ml의 최종 부피로 오토클레이브 처리된 탈이온수에 재현탁시켰다.
보트리티스 시네레아를 포테이토 덱스트로스 브로쓰에서 진탕 없이 1 내지 2주 동안 성장시켰다. 생성된 균개를 브로쓰로부터 제거하고, 오토클레이브 처리된 탈이온수 중에서 균질화하여 액체 접종물을 생산하였다.
유기농 딸기를 현지 시장에서 구입하였다. 흠 없는 과실을 선택하여 비. 시네레아 접종물에 2 내지 3초 동안 침지시킨 다음, 60분 동안 건조시킨 후 처리하였다. AIP1620 처리는 접종된 과실을 세포 현탁물에 2-3초 동안 침지시킴으로써 적용되었다. 그 후에, 과실을 높은 습도를 유지하기 위한 습윤 종이 타월과 함께 밀봉 플라스틱 용기에 넣어 실온에서 72 내지 84시간 동안 저장하였다. 각각의 처리마다 14개의 반복물 (딸기 열매)이 존재하였다. 각각의 딸기 열매를 0 = 무 피해, 1 = 25%, 2 = 50% 피해, 3 = 75% 피해, 및 4 = 100% (즉, 진균에 의한 딸기 열매의 완전한 피복)의 육안 변질도 등급으로 평가하였다. 결과가 하기 표 10에 요약되어 있다.
Figure pct00010
실시예 15.
온실 실험을 수행하여, 난균성 식물 병원체 피티움 아파나더마툼(Pythium aphanadermatum)에 의해 유발되는 모잘록병의 방제에 있어서의 AIP1620의 효능을 입증하였다.
AIP1620 종균 배양물을 루리아 한천 플레이트로부터의 콜로니를 사용하여 접종하고, 0.1X NBY 브로쓰 (탈이온수 1 리터 당 0.8 g의 디프코 영양 브로쓰 분말 및 0.5 g의 효모 추출물 분말)에서 28℃, 250 rpm으로 성장시켰다. 생산 배양물을 탈이온수 1 리터 당: 11.3 g의 Na2HPO4·7H2O, 3.0 g의 KH2PO4, 1.0 g의 NH4Cl, 10 g의 모노소듐 글루타메이트, 3.0 g의 당밀, 0.49 g의 MgSO4·7H2O, 50 mg의 ZnSO4·7H2O, 5 mg의 FeSO4·7H2O 및 pH를 대략 6.2로 조정하는 충분한 염산을 함유하는 브로쓰에서 성장시켰다. 50 ml의 생산 브로쓰를 250 ml 용량의 배플 배양 플라스크에 넣고, 0.5 ml의 종균 배양물을 접종하여, 28℃, 250 rpm에서 인큐베이션하였다. 생산 배양물을 다양한 시점에 접종한 후에, 동시에 수거하여 15, 24, 33, 및 43시간의 인큐베이션 시간으로 배양물을 수거하였다. 40 ml의 각각의 배양물을 원심분리에 의해 수거하였다. 소비된 배양 브로쓰를 버리고, 세포를 40 ml의 최종 부피로 오토클레이브 처리된 탈이온수에 재현탁시켰다.
피. 아파나더마툼의 접종물을 홈스 및 벤슨에 의해 개시된 쌀알 방법을 사용하여 제조하였다 (K.A. Holmes and D.M. Benson, 1994. Evaluation of Phytophthora parasitica var. nicotianae for biocontrol of Phytophthora parasitica on Catharanthus roseus. Plant Disease, 78:193-199). 감염된 쌀알을 블렌더로 분쇄하고 #10 시이브를 통해 스크리닝하였다. 이 접종물을 리터 당 6.0 g (실험 1-4) 또는 리터 당 7.0 g (실험 5)의 비율로 파파드 고급 발아 혼합물과 혼합하였다.
접종된 발아 혼합물을 392 온실 플러그 트레이 (미국 오하이오주 애크런에 소재하는 랜드마크 플라스틱 코포레이션)에 위치시키고 하나의 봉선화 종자를 각각의 셀에 파종하였다. AIP1620 세포 현탁물을 셀 당 0.3 ml의 비율로 적용하였다. 종자를 표준 온실 조건하에 발아시켰다. 각각의 처리에 2 또는 3개의 반복물이 존재하였고, 반복물 당 20개의 셀을 가졌다. 7 내지 17일 후에 각각의 처리에서의 건강한 묘목 수를 계수함으로써 검정을 평가하였다. 결과가 하기 표 11에 요약되어 있다.
Figure pct00011
실시예 16. 아시아 대두 녹병의 AIP1620에 의한 방제
AIP1620 세포를 상기 실시예에 기재된 바와 같이 생산하였다. 파콥소라 파키리치(Phakopsora pachyrhizi)를 감수성 대두 식물에서 성장시키고, 발진 농포 징후를 보이는 감염된 잎으로부터 진공 흡입에 의해 여름포자를 수거하였다 (Twizeyimana, M., and Hartman, G. L. 2010. Culturing Phakopsora pachyrhizi on detached leaves and urediniospore survival at different temperatures and relative humidities. Plant Disease 94:1453-1460).
윌리엄스(Williams) 82 대두 식물을 식물 성장 챔버에서 관련 기술분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 성장시켰다. 식물이 V3-단계가 되었을 때, 가장 먼저 완전 전개된 삼출엽에 재현탁된 AIP1620 세포, 화학적 살진균제 표준물, 또는 탈이온수 (접종 대조군)를 분무하였다. 하루 후에 잎에 피. 파키리치 여름포자의 현탁물 (1 x 105/ml)을 접종하였다. 접종 및 균주/살진균제는 둘다 공기 압축기에 부착된 분무기를 사용하여 적용되었다. 식물을 성장 챔버 내에서, 95%의 RH에서 각각 21 및 23℃에서의 12 h의 명기 및 12 h의 암기를 갖는 1일 주기로 유지하였다. 2주 후에, 접종된 잎 상의 무작위 선택된 1 cm 직경의 원 안에 있는 포자를 형성하는 여름포자퇴의 개수를 계수함으로써 질병의 중증도를 평가하였다. 각각의 처리마다 3개의 반복물 (식물)이 존재하였고, 각각의 반복물마다 3개의 여름포자퇴 카운트가 존재하였다. 결과가 하기 표 12에 나타나 있으며, 이는 AIP1620의 적용이 파콥소라 파키리치에 의해 유발되는 아시아 대두 녹병을 효과적으로 방제함을 입증하였다.
<표 12>
Figure pct00012
실시예 17. AIP1620의 상업적 살진균제와의 상용성
각각 상이한 활성 성분을 함유하는, 3계통의 상업적 살진균제를 혼합한 후에 AIP1620의 생존능을 측정하였다 (표 13). 살진균제의 농도는 재배지 적용을 위한 전형적인 탱크 믹스 중의 것을 모의하도록 선택되었다.
AIP1620을 10 mL 용량의 튜브 내 3 mL의 LB 배지에서 24시간 동안 28℃, 250 rpm으로 성장시켰다. 세포 펠렛을 원심분리에 의해 수거하여 3 mL의 dH2O에 현탁시켰다. 900 마이크로리터의 세포 현탁물을 100 마이크로리터의 10X 살진균제 원액과 혼합하고 28℃에서 5분 또는 120분 동안 인큐베이션하였다.
Figure pct00013
살진균제와의 인큐베이션 후에 세포를 상기에 기재된 바와 같이 원심분리에 의해 수거하여 탈이온수에 재현탁시켰다. 분취물을 탈이온수로 연속 희석시키고, LB 한천에 플레이팅하고, 관련 기술분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 28℃에서 2일 동안 인큐베이션하였다. 박테리아 콜로니를 계수하고, 원액에서의 ml 당 콜로니 형성 단위 (CFU/ml) 값을 계산하였다. 데이터가 하기 표 14에 나타나 있으며, 이는 AIP 1620의 생존능이 이러한 제제화된 살진균제와의 혼합에 의해 악영향을 받지 않음을 입증하였다.
Figure pct00014
실시예 18. 파콥소라 파키리치에 의해 유발되는 아시아 대두 녹병에 대한 AIP1620과 살진균제의 혼합물의 보호제 활성 평가.
박테리아를 탈이온수 1 리터 당 11.3 g의 Na2HPO4·7H2O, 3 g의 KH2PO4, 1 g의 NH4Cl, 10 g의 모노소듐 글루타메이트, 30 g의 당밀, 493 mg의 MgSO4·7H2O, 50 mg의 ZnSO4·7H2O, 및 5 mg의 FeSO4·7H2O로 이루어진 브로쓰 배지 50 ml에 접종하였다. 배양물을 28℃, 250 rpm의 진탕 인큐베이터 내 250 ml 용량의 배플 플라스크에서 2일 동안 성장시켰다. 세포를 3500 xg의 원심분리에 의해 10분 동안 수집하였다. 배양물 상청액을 버리고, 세포를 원래 배양물의 부피로 멸균 탈이온수에 재현탁시켰다. 항진균 활성을 갖지 않는 AIP0069의 돌연변이체 AIP0323이 음성 대조군으로서 포함되었다.
파콥소라 파키리치의 여름포자를 발진 농포 징후를 보이는 진균으로 감염된 잎으로부터 진공 흡입에 의해 수거하였다. 포자를 10^5/mL로 물에 재현탁시키고, 절단된 대두 잎에 관련 기술분야에 공지된 기술을 이용하여, 에어브러시를 사용하여 에어로졸로서 접종하였다 (Twizeyimana, M., and Hartman, G. L. 2010. Culturing Phakopsora pachyrhizi on detached leaves and urediniospore survival at different temperatures and relative humidities. Plant Disease 94:1453-1460).
물에 재현탁된 AIP1620 세포와 살진균 활성 성분의 혼합물을 헥타르 또는 에이커 당 분무 부피에 대한 추정에 근거하여, 재배지 사용량을 공개된 라벨로부터 g/mL로 변환시켜 계산한, 보통의 재배지 사용량의 1/10X, 1/3X, 1/2X, 또는 1X의 살진균 활성 성분과 혼합된 10^6, 10^7, 10^8, 10^9 또는 10^10 AIP1620 세포/mL를 포함하는 다양한 비율로 제조하였다.
접종된 대두 잎을 상기 역가의 생물방제제, 및 상기 사용량의 살진균제 뿐만 아니라, 상기에 특정된 역가 및 사용량의 다양한 조합을 갖는 생물방제제와 살진균제의 혼합물로 처리하였다. 또한, 일부의 접종된 절단 잎은 미처리로 남겨두거나, 또는 대조군으로서 AIP0323으로 처리하였다. 적어도 3장의 잎 (또는 잎 조각)을 생물방제제, 화학제, 또는 혼합물의 각각의 처리를 위해 사용하였다. 절단 잎을 높은 습도의 성장 챔버에서 12시간의 명기, 21℃ / 12시간의 암기, 23℃로 인큐베이션하였다. 10-14일 후에, 잎을 관찰하여 가시적인 여름포자퇴 개수/cm^2에 따라 평가하였다.
콜비(Colby) 방정식을 사용하여, 혼합물로부터 예상되는 살진균 효과를 결정하였다 (그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Colby, S. R., Calculation of the synergistic and antagonistic response of herbicide combinations.　 Weed s 　1967, 15, 20-22] 참조).
하기 방정식을 사용하여, 2종의 활성 성분으로서 A 및 B를 함유하는 혼합물의 예상 활성을 계산하였다:
예상 = A + B - (A X B / 100)
A = 혼합물에 사용된 것과 동일한 농도의 활성 성분 A의 관찰 효능;
B = 혼합물에 사용된 것과 동일한 농도의 활성 성분 B의 관찰 효능.
이용되는 적용량 및 그에 따른 질병 방제를 포함하는 대표적인 상승 상호작용이 관찰되고 하기와 같이 기록되었다:
% DC = % 질병 방제
% DC Obs = 관찰 % 질병 방제
% DC Exp = 예상 % 질병 방제
상승 지수 = % DC Obs / % DC Exp
실시예 19. 제초제 글루포시네이트에 대한 저항성을 획득한 생물학적 방제 균주 슈도모나스 플루오레센스 AIP000069 개체군의 선택
28℃의 0.5X LB에서 24시간 동안 성장시킨, 50 마이크로리터의 AIP000069 배양물을 0 또는 100 mM 글루포시네이트가 포함된 M63 플러스 배지를 함유하는 플레이트 상에 도말하였다.　 M63 플러스 배지는 탈이온수 1 리터 당 13.6 g의 KH2PO4, 9.92 g의 C6H12O6, 2 g의 (NH4)2SO4, 5.5 mg의 CaCl2,　0.278 mg의 FeSO4·7H2O, 및 10.16 mg의 MgCl2·6H2O로 이루어졌다.　 글루포시네이트의 부재하에서는 28℃에서 2일 동안 플레이트를 인큐베이션한 후에 다수의 박테리아 콜로니 (로온(lawn))가 가시적이었다. 100 mM 글루포시네이트의 존재하에서는 유사한 인큐베이션 후에 콜로니가 가시적이지 않았지만, 수일간의 연장된 인큐베이션 후에 단일 콜로니가 성장하였다. 이 콜로니를 100 mM 글루포시네이트를 함유하는 M63 한천 플레이트 상에 스트리킹하여 단리하였다. 그에 따른 단리물을 AIP050999라 명명하였다. AIP050999의 성장을 모 균주 AIP000069, 및 글리포세이트 저항성 형태의 균주 AIP001620과 비교하였다. 결과가 하기 표 15에 요약되어 있다.
Figure pct00015
본 명세서에 언급된 모든 공보 및 특허 출원은 본 발명과 관련있는 기술분야의 통상의 기술자의 기술 수준의 지표이다. 모든 공보 및 특허 출원은 각각의 개별 공보 또는 특허 출원이 참조로 포함된다고 구체적으로 그리고 개별적으로 지시된 것처럼 본원에 참조로 포함된다.
상기 발명이 명확한 이해를 목적으로 설명 및 예시하는 방식으로 어느 정도 상세히 기재되었지만, 첨부된 청구범위의 범주 내에서 특정 변화 및 수정이 이루어질 수 있음이 자명할 것이다.
아그리컬쳐럴 리서치 컬쳐 콜렉션 (NRRL) NRRLB-50897 20140131 아그리컬쳐럴 리서치 컬쳐 콜렉션 (NRRL) NRRLB-50999 20150123

Claims (46)

  1. 생물방제제를 적어도 하나의 제초제, 살진균제, 살충제, 또는 다른 작물 보호 화학제에 대하여 저항성이도록 변형시키는 것을 포함하는, 생물방제제를 개선하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 생물방제제가, 제초제, 살진균제, 살충제, 또는 다른 작물 보호 화학제의 존재하에 성장시켜 저항성 균주를 선택함으로써 변형된 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 생물방제제가, 상기 생물방제제를 상기 제초제, 살진균제, 살충제, 또는 다른 작물 보호 화학제에 대한 저항성을 부여하는 유전자로 형질전환시킴으로써 변형된 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물방제제가 박테리아성 생물방제제인 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물방제제가 슈도모나스(Pseudomonas), 바실루스(Bacillus), 아그로박테리움(Agrobacterium), 리소박터(Lysobacter), 트리코데르마(Trichoderma), 패실로미세스(Paecilomyces), 글리오클라디움(Gliocladium), 암펠로미세스(Ampelomyces), 피티움(Pythium), 메트쉬니코비아(Metschnikowia), 크로모박테리움(Chromobacterium), 페니실륨(Penicillium), 코니오티리움(Coniothyrium), 캐토미움(Chaetomium), 미로테시움(Myrothecium), 아우레오바시디움(Aureobasidium), 판토에아(Pantoea), 부르크홀데리아(Burkholderia), 스트렙토미세스(Streptomyces), 바리오보랙스(Variovorax), 파스토리아(Pasteuria), 락토바실루스(Lactobacillus), 파에니바실루스(Paenibacillus), 크산토모나스(Xanthomonas) 속으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 박테리아성 생물방제제가 슈도모나스 박테리아인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 슈도모나스가 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 또는 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis)인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제초제가 글리포세이트, 글루포시네이트 (글루타민 합성효소 억제제), 술포닐우레아 및 이미다졸리논 제초제 (분지쇄 아미노산 합성 억제제)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  9. 생물방제제가 제초제, 살진균제, 살충제, 또는 다른 작물 보호 화학제의 압력하에 선택되었고 상기 제초제, 살진균제, 살충제, 또는 다른 작물 보호 화학제에 대하여 저항성인, 변형된 생물방제제.
  10. 제9항에 있어서, 박테리아성 생물방제제인 변형된 생물방제제.
  11. 제9항에 있어서, 상기 생물방제제가 슈도모나스, 바실루스, 아그로박테리움, 리소박터, 트리코데르마, 패실로미세스, 글리오클라디움, 암펠로미세스, 피티움, 메트쉬니코비아, 크로모박테리움, 페니실륨, 코니오티리움, 캐토미움, 미로테시움, 아우레오바시디움, 판토에아, 부르크홀데리아, 스트렙토미세스, 바리오보랙스, 파스토리아, 크산토모나스 속으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 변형된 생물방제제.
  12. 제10항에 있어서, 상기 박테리아성 생물방제제가 슈도모나스 박테리아인 변형된 생물방제제.
  13. 제12항에 있어서, 상기 슈도모나스가 슈도모나스 플루오레센스 또는 슈도모나스 클로로라피스인 변형된 생물방제제.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제초제가 글리포세이트, 글루포시네이트 (글루타민 합성효소 억제제), 술포닐우레아 및 이미다졸리논 제초제 (분지쇄 아미노산 합성 억제제)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 변형된 생물방제제.
  15. 생물방제제가 생물방제제를 제초제 저항성으로 만드는 제초제 저항성 유전자로 형질전환된 것인, 재조합 생물방제제.
  16. 제15항에 있어서, 상기 변형된 생물방제제가 박테리아성 생물방제제인 재조합 생물방제제.
  17. 제16항에 있어서, 상기 박테리아성 생물방제제가 슈도모나스, 바실루스, 아그로박테리움, 리소박터, 글리오클라디움, 피티움, 크로모박테리움, 페니실륨, 판토에아, 부르크홀데리아, 스트렙토미세스, 바리오보랙스, 파스토리아, 및 크산토모나스 속으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 재조합 생물방제제.
  18. 제17항에 있어서, 상기 박테리아성 생물방제제가 슈도모나스 박테리아인 재조합 생물방제제.
  19. 제18항에 있어서, 상기 슈도모나스가 슈도모나스 플루오레센스 또는 슈도모나스 클로로라피스인 재조합 생물방제제.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제초제가 글리포세이트, 글루포시네이트 (글루타민 합성효소 억제제), 술포닐우레아 및 이미다졸리논 제초제 (분지쇄 아미노산 합성 억제제)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 재조합 생물방제제.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 생물방제제를 실질적으로 포함하는 생물방제제의 변형된 개체군.
  22. 제초제 저항성인 생물방제제의 변형된 개체군, 및 적합한 담체를 포함하는, 식물 병원체의 방제 제제.
  23. 제22항에 있어서, 상기 개체군이 변형된 박테리아성 생물방제제를 포함하는 것인 제제.
  24. 제22항에 있어서, 상기 개체군이 재조합 생물방제제를 포함하는 것인 제제.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물방제제가 농업 재배지 적용률의 살생물제의 존재하에 식물 건강, 성장 또는 수확을 개선하기에 충분한 유효량으로 존재하는 것인 제제.
  26. 제25항에 있어서, 생물방제제가 NRRL No. B-50897로서 수탁된 균주를 포함하고 살생물제가 글리포세이트인 제제.
  27. 제25항에 있어서, 생물방제제가 NRRL No. B-50999로서 수탁된 균주를 포함하고 살생물제가 글루포시네이트인 제제.
  28. 변형된 생물방제제가 제초제의 존재하에 성장할 수 있도록 생물학적 작용제를 변형시키는 것을 포함하는, 상기 생물방제제의 재배지 환경에서의 경쟁 능력을 개선하는 방법.
  29. 생물방제제의 변형된 개체군을 포함하는 조성물을 식물이 성장하고 있는 토양에 적용하는 것을 포함하는, 식물의 성장을 촉진하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 생물방제제가 글리포세이트 또는 글루포시네이트에 대하여 저항성이도록 변형된 것인 방법.
  31. 작물, 종자 또는 재배 영역에 살생물제의 유효량과 변형된 생물방제제의 유효량의 조합을 적용하는 것을 포함하는 식물을 성장시키는 방법이며, 여기서
    (a) 살생물제의 유효량은 작물에 유의하게 피해를 입히지 않으면서 관심 생물체를 선택적으로 방제하기 위한 것이고;
    (b) 변형된 생물방제제의 유효량은 동일한 농도의 비-변형 생물방제제가 살생물제의 유효량과 조합되어 적용될 때 발생하는 식물 건강, 수확 및/또는 성장과 비교하여, 식물 건강, 수확 및/또는 성장의 통계학적으로 유의한 증가를 초래하기에 충분한 것인, 식물을 성장시키는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 변형된 생물방제제 및 살생물제가 동시에 적용되는 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 변형된 생물방제제 및 살생물제가 순차적으로 적용되는 것인 방법.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물방제제가 NRRL No. B-50897로서 수탁된 균주를 포함하는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 살생물제가 글리포세이트이고, 글리포세이트의 유효량이 작물에 유의하게 피해를 입히지 않으면서 잡초를 선택적으로 방제하기 위한 것인 방법.
  36. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물방제제가 NRRL No. B-50999로서 수탁된 균주 AIP050999를 포함하고 살생물제가 글루포시네이트인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 살생물제가 글루포시네이트이고, 글루포시네이트의 유효량이 작물에 유의하게 피해를 입히지 않으면서 잡초를 선택적으로 방제하기 위한 것인 방법.
  38. 작용제의 개체군을 제초제, 살진균제, 살충제 또는 작물 보호 화학제의 압력하에 성장시켜 상기 제초제, 살진균제, 살충제 또는 다른 작물 보호 화학제에 대하여 저항성인 생물방제제의 정제된 배양물을 선택함으로써 생산되는 생물방제제의 배양된 개체군.
  39. 제38항에 있어서, 상기 생물방제제가 농업 재배지 적용률의 살생물제의 존재하에 식물 건강, 성장 또는 수확을 개선하기에 충분한 유효량으로 존재하는 것인, 생물방제제의 배양된 개체군.
  40. 생물방제제의 단리된 생물학적 순수 배양물이며, 여기서 생물방제제가 제초제, 살진균제, 살충제 또는 작물 보호 화학제로부터 선택된 살생물제에 대하여 저항성이고, 상기 배양물은 상기 살생물제의 존재하에 성장시켜 생산되는 것인, 생물방제제의 단리된 생물학적 순수 배양물.
  41. 제40항에 있어서, 상기 생물방제제가 농업 재배지 적용률의 살생물제의 존재하에 식물 건강, 성장 또는 수확을 개선하기에 충분한 유효량으로 존재하는 것인, 생물방제제의 단리된 생물학적 순수 배양물.
  42. 제38항에 있어서, 상기 조성물이 적합한 담체를 포함하는 것인 방법.
  43. 항진균 활성을 가지며 글리포세이트의 존재하에 성장할 수 있는, NRRL No. B-50897로서 수탁된 균주로부터 성장된 박테리아 배양물.
  44. 제43항에 있어서, NRRL No. B-50897로서 수탁된 균주가 농업 재배지 적용률의 글리포세이트의 존재하에 식물 건강, 성장 또는 수확을 개선하기에 충분한 유효량으로 존재하는 것인 박테리아 배양물.
  45. 항진균 활성을 가지며 글루포시네이트의 존재하에 성장할 수 있는, NRRL No. B-50999로서 수탁된 균주 AIP050999로부터 성장된 박테리아 배양물.
  46. 제45항에 있어서, NRRL No. B-50999로서 수탁된 균주 AIP050999가 농업 재배지 적용률의 글루포시네이트의 존재하에 식물 건강, 성장 또는 수확을 개선하기에 충분한 유효량으로 존재하는 것인 박테리아 배양물.
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