CN107683090A - 利用抗菌剂、农药、微生物的植物病害的防除方法、及新型枯草芽孢杆菌 - Google Patents

利用抗菌剂、农药、微生物的植物病害的防除方法、及新型枯草芽孢杆菌 Download PDF

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Abstract

一种抗菌剂，其包含：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和枯草芽孢杆菌的培养物的至少一者，前述枯草芽孢杆菌在通过使用了基质辅助激光解吸电离法的飞行时间型质谱法(MALDI‑TOF MS)进行的质谱分析中，在选自由3045.5±0.58的范围、6942.5±0.58的范围和9140.5±0.58的范围(m/z)组成的组中的至少1个质荷比(m/z)具有峰。

Description

利用抗菌剂、农药、微生物的植物病害的防除方法、及新型枯 草芽孢杆菌
技术领域
[相关申请的相互参照]
本申请主张基于2016年3月4日申请的、日本专利申请第2016-042659号说明书(通过参照在该说明书中援用其全部公开内容)的优先权。
本发明涉及利用抗菌剂、农药、微生物的植物病害的防除方法、及新型枯草芽孢杆菌。
背景技术
农作物的栽培时，由微生物导致的对农作物的病害正成为问题。作为对于前述病害的处置方法，例如尝试了散布其它微生物且利用前述微生物所产生的抗菌物质来防除前述病害的方法。然而，如专利文献1记载的那样，尚不知晓对于水稻所感染的真菌等显示出抗菌活性的抗菌物质。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2003-199558号公报
发明内容
发明要解决的问题
因此，本发明的目的在于提供例如对于水稻所感染的真菌等显示出抗菌活性的、新型的利用抗菌剂、农药、微生物进行的植物病害的防除方法、及新型枯草芽孢杆菌。
用于解决问题的方案
为了实现前述目的而进行了深入研究，结果完成了以下的发明。
本发明的抗菌剂为如下微生物，其包含：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和枯草芽孢杆菌的培养物的至少一者，前述枯草芽孢杆菌在通过使用了基质辅助激光解吸电离法的飞行时间型质谱法(MALDI-TOF MS)进行的质谱分析中，在选自由3045.5±0.58的范围、6942.5±0.58的范围和9140.5±0.58的范围(m/z)组成的组中的至少1个质荷比(m/z)具有峰。
本发明的农药包含前述本发明的抗菌剂。
本发明的利用微生物的植物病害的防除方法(以下也称为“防除方法”)包括使前述本发明的抗菌剂与植物接触的接触工序。
本发明的新型枯草芽孢杆菌(以下也称为“新型微生物”)为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，
前述枯草芽孢杆菌在通过使用了基质辅助激光解吸电离法的飞行时间型质谱法(MALDI-TOF MS)进行的质谱分析中，在选自由3045.5±0.58的范围、6942.5±0.58的范围和9140.5±0.58的范围(m/z)组成的组中的至少1个质荷比(m/z)具有峰。
发明的效果
根据本发明，可以提供例如针对水稻所感染的真菌等显示出抗菌活性的、新型的利用抗菌剂、农药、微生物进行的植物病害的防除方法、及新型枯草芽孢杆菌。
附图说明
图1是实施例1中的培养后的琼脂培养基的照片。
图2是示出实施例1中的质谱的结果的图。
图3是示出实施例2中的各馏分的电泳的结果的照片。
图4是示出实施例2中的各馏分的抗菌活性的照片。
图5是示出实施例2中的各区域的抗菌活性的照片。
图6是示出实施例2中的HPLC的分析结果的图。
图7是示出实施例2中的包含电喷雾离子化的液相色谱质谱法的分析结果的图。
具体实施方式
关于本发明的抗菌剂，例如前述枯草芽孢杆菌和前述枯草芽孢杆菌的培养物的至少一者是前述枯草芽孢杆菌和前述枯草芽孢杆菌的培养物的至少一者中的显示出抗菌活性的抗菌物质，
前述抗菌物质的分子量在聚丙烯酰胺凝胶电泳中为15KDa以下，且
前述抗菌物质的碎片离子的质量在通过电喷雾离子化质谱法进行的质谱分析中，为1460±1的范围和1474±1的范围。
关于本发明的抗菌剂，例如，前述抗菌剂是针对真菌的抗菌剂。前述真菌例如是选自由梨孢菌属(Pyricularia sp.)、丝核菌属(Rhizoctonia sp.)、木霉菌属(Trichodermasp.)、镰刀菌属(Fusarium sp.)和腐霉菌属(Pythium sp.)组成的组中的至少一种真菌。
关于本发明的防除方法，例如，前述植物为水稻。前述水稻例如是前述水稻的苗或种子(以下也称为“稻种”。)。
＜抗菌剂＞
关于本发明的抗菌剂，如上所述，其特征在于，其包含枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和枯草芽孢杆菌的培养物的至少一者，前述枯草芽孢杆菌在通过使用了基质辅助激光解吸电离法的飞行时间型质谱法(MALDI-TOF MS)进行的质谱分析中，在选自由3045.5±0.58的范围、6942.5±0.58的范围和9140.5±0.58的范围(m/z)组成的组中的至少1个质荷比(m/z)具有峰。本发明的抗菌剂的特征在于：包含前述枯草芽孢杆菌和前述枯草芽孢杆菌的培养物的至少一者，前述枯草芽孢杆菌具有前述峰，其它构成和条件没有特别限制。
本发明人等进行了深入的研究，结果发现：在利用MALDI-TOF MS进行的质谱分析中，具有前述峰的新型枯草芽孢杆菌(新型微生物)产生针对真菌、细菌等微生物显示出抗菌活性的抗菌物质。另外，前述抗菌物质的碎片离子例如在通过包含电喷雾离子化的液相色谱质谱法进行的质谱分析中，与公知的枯草芽孢杆菌所产生的、伊枯草菌素(iturin)、表面活性素(surfactin)、芬荠素(fengycin)等抗菌物质不同的质荷比具有峰，由此推断前述抗菌物质为新型的抗菌物质。因此，根据本发明，可以提供例如针对水稻的苗、稻种所感染的真菌、细菌等微生物显示出抗菌活性的新型的抗菌物质、包含其的新型微生物、包含前述新型微生物的培养物等的新的抗菌剂。
在本发明中，抗菌活性可以是抑菌活性，也可以是杀菌活性。如下所述，将前述抗菌剂用于真菌时，前述抗菌活性例如可以是前述真菌的菌丝的伸长阻碍或抑制、前述真菌的分生孢子形成阻碍或抑制、及前述真菌的菌丝体的形成阻碍或抑制等的任意种。将前述抗菌剂用于细菌时，前述抗菌活性例如可以是前述细菌的增殖的阻碍或抑制、及灭菌的任意种。
在本发明中，前述枯草芽孢杆菌在利用前述MALDI-TOF MS进行的质谱分析中，在选自由3045.5±0.58的范围、6942.5±0.58的范围和9140.5±0.58的范围组成的组中的至少1个、优选为在选自由3046、6943和9141、或3045、6942和9140(m/z)组成的组中的至少1个质荷比(m/z)具有峰。前述枯草芽孢杆菌例如可以具有上述峰中的任意1个峰、也可以具有多个峰，但优选具有全部峰。供于前述MALDI-TOF MS的枯草芽孢杆菌的培养方法和条件没有特别限制，例如，可列举出后述实施例的培养方法和条件。
用于利用前述MALDI-TOF MS进行的质谱分析的质谱仪和质谱条件例如可分别列举出AXIMA(注册商标)Confidence MALDI-TOF型质谱仪(株式会社岛津制作所制)和下述质谱分析条件。
(质谱分析条件)
加速电压：20kV(线性模式)
离子源部的激光：波长337nm的氮激光
脉冲重复值：3纳秒
激光辐射功率：50Hz以下
腔室内的真空度：1.0E-3Pa以下
前述新型微生物的培养物没有特别限制，例如可列举出前述新型微生物的菌体、前述新型微生物的培养上清液、前述新型微生物的菌体提取物等。另外，本发明的抗菌剂还可以进一步包含除了前述新型微生物以外的微生物的培养物。作为除了前述新型微生物以外的微生物的培养物，没有特别限制，例如可列举出其它微生物的菌体、前述其它微生物的培养上清液、前述其它微生物的菌体提取物等。
前述培养物例如也可以是前述菌体的处理物、前述培养上清液的处理物、前述菌体提取物的处理物等。前述处理物没有特别限制，例如可列举出：前述培养物的浓缩物、干燥物、冷冻干燥物、溶剂处理物、表面活性剂处理物、酶处理物、蛋白质馏分、超声波处理物、磨碎处理物、前述抗菌物质的纯化物等。另外，前述培养物例如也可以是前述菌体、前述培养上清液、前述菌体提取物、前述菌体的处理物、前述培养上清液的处理物、前述菌体提取物的处理物等的混合物。前述混合物没有特别限制，可以是以任意的组合和比率混合而成的混合物。前述组合没有特别限制，例如可列举出：前述菌体和前述培养上清液的混合物等。
本发明的抗菌剂例如优选包含前述枯草芽孢杆菌和前述枯草芽孢杆菌的培养物的至少一者显示出抗菌活性的抗菌物质。前述抗菌物质的分子量例如在聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中为15KDa以下，且前述抗菌物质的碎片离子的质量在利用电喷雾离子化分析法进行的质谱分析中，为1460±1的范围和1474±1的范围或1460和1474。前述抗菌物质显示出抗菌活性，因此，对于本发明的抗菌剂而言，例如前述枯草芽孢杆菌和前述枯草芽孢杆菌的培养物的至少一者也可以是前述枯草芽孢杆菌和前述枯草芽孢杆菌的培养物的至少一者中的显示出前述抗菌活性的抗菌物质。
用于前述SDS-PAGE的电泳装置和条件例如可分别列举出小型垂直电泳槽(Mini-PROTEAN Tetra Cell)系统(BIO-RAD公司制)和下述电泳条件。
(电泳条件)
(1)分离凝胶：20％丙烯酰胺
(2)浓缩凝胶：4.5％丙烯酰胺
(3)凝胶大小：微型凝胶(大小(W×L)：8.3cm×7.3cm)
(4)凝胶的厚度：1mm
(5)电泳缓冲液：25mmol/L Tris、200mmol/L甘氨酸、0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠
另外，用于前述电喷雾离子化质谱的分析仪器、质谱仪和质谱分析条件例如可分别列举出1260Infinity HPLC系统(Agilent Technologies公司制、Agilent G6530BAccurate-Mass Q TOF(Agilent Technologies公司制)和下述包含电喷雾离子化的液相色谱质谱法的条件。
(包含电喷雾离子化的液相色谱质谱法的条件)
(1)柱：Monobis ODS柱(Kyoto Monotech Co.,Ltd.制)
(2)流动相：溶剂A：0.2％乙酸水溶液
B：0.2％乙酸-甲醇
梯度条件：时间(溶剂比(A：B))
0分钟：(A：B＝98：2)
13分钟：(A：B＝2：98)
从0分钟起至13分钟，直线性地使溶剂A的比例减少、
溶剂B的比例增加，维持6分钟溶剂A和B的比例。
(3)流速：0.6mL/分钟
(4)模式：MS Q-TOF、Dual AJS ESI离子化、阳离子模式
本发明的抗菌剂还可以进一步包含例如添加剂等其它成分。作为前述添加剂，没有特别限制，例如可列举出稳定剂等。前述抗菌剂的制造方法没有特别限制，例如可以根据后述抗菌剂的剂型来适宜确定，例如可以采用通常使用的制剂化技术等。
本发明的抗菌剂可以用于例如各种真菌、细菌等微生物。前述真菌例如可列举出：灰梨孢菌(Pyricularia grisea)、稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)等梨孢菌属(Pyricularia sp.)；立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)等丝核菌属(Rhizoctoniasp.)、绿色木霉(Trichoderma viride)等木霉菌属(Trichoderma sp.)；水稻恶苗病菌(Fusarium fujikuroi)、串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)等镰刀菌属(Fusarium sp.)；腐霉菌属(Pythium sp.)等。前述细菌例如可列举出：唐菖蒲伯克霍尔德菌(Burkholderia gladioli)、水稻细菌性谷枯病菌(Burkholderia glumae)等伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)；燕麦假单胞菌(Pseudomonas avenae)、植物假单胞菌(Pseudomonas plantarii)等假单胞菌属(Pseudomonas sp.)等。
作为前述新型微生物的采集源，没有特别限定，例如可列举出：肥料、土壤、海水、河水、湖水、沼泽水、废水等，优选为前述肥料。另外，作为前述土壤，例如可列举出：陆地、海底、河底、湖底和沼泽底的土、沙和泥土等。
作为前述新型微生物的分离方法，没有特别限制，例如可以使用现有公知的采集法、培养法等。前述新型微生物的分离方法例如可以参照后述的实施例的分离方法。前述采集源为肥料时，前述新型微生物例如可以如下方式得到：利用缓冲液等使采集的肥料悬浮，然后对该悬浮液进行离心分离，将得到的上清液在琼脂培养基等中培养，从得到的菌落中进行分离。前述采集源为湖水时，前述新型微生物例如可以如下方式得到：利用过滤器等将采集的湖水过滤，将该滤液在琼脂培养基等中培养，从得到的菌落中分离。另外，前述采集源为泥土时，前述新型微生物例如可以如下方式得到：利用缓冲液等使采集的泥土悬浮，然后对该悬浮液进行离心分离，将得到的上清液在琼脂培养基等培养，从得到的菌落中分离前述新型微生物。前述分离的新型微生物进而还可以在例如液体培养基中进行培养。
对于前述新型微生物的培养，培养基没有特别限制，例如可以使用后述E5液体培养基及其固体培养基、玉米粉(corn meal)液体培养基及其固体培养基(Fluka公司制、目录号：42347-500G-F)、LB液体培养基及其固体培养基、马铃薯葡萄糖(Potato Dextrose)液体培养基及其固体培养基等。
前述新型微生物的培养温度没有特别限制，例如为25～55℃、25～35℃、45～55℃。
对于前述培养，培养时的pH没有特别限定，例如为pH4.5～7.5的范围、pH6.5～7.5的范围、pH4.5～5.5的范围。
前述培养例如可以在好氧条件下进行、也可以在厌氧条件下进行。前述好氧条件或厌氧条件没有特别限制，可以使用现有公知的方法进行设定。另外，前述培养时的光条件没有特别限制，例如可以是黑暗条件，也可以是照明条件。
前述培养时间没有特别限制，例如可以是前述新型微生物的增殖达到稳定期为止的时间。前述新型微生物的增殖在约72小时以内达到稳定期的培养条件的情况，前述培养时间例如可以是72小时。
对于前述新型微生物的培养，例如，也可以仅培养前述新型微生物，进而，也可以同时混合培养其它微生物。作为前述其它微生物，没有特别限制。
＜农药＞
关于本发明的农药，如上所述，其特征在于：包含前述本发明的抗菌剂。本发明的农药的特征在于包含前述本发明的抗菌剂，其构成和条件没有特别限制。利用本发明的农药，例如可以防除由微生物导致的植物病害。本发明的农药例如可以援用前述本发明的抗菌剂的说明。
本发明的农药的剂型没有特别限制，例如可列举出：散剂、细粒剂、颗粒剂等固体制剂；溶液剂、乳剂等。本发明的农药例如还可以包含公知的农药。前述公知的农药例如可以是生物性农药、化学性农药。前述生物性农药是包含例如具有抗菌活性、杀虫活性、杀菌活性、除草活性、植物生长调节活性、驱虫活性等活性的微生物(例如，细菌、真菌)的农药。另外，前述化学性农药例如可列举出：抗菌物质、杀虫物质、杀菌物质、除草物质、植物生长调节物质、驱虫物质等。
前述农药的使用对象没有特别限制，例如可列举出：植物、栽培前述植物的土壤、水等的培养基。前述植物例如可列举出水稻等稻科植物等。将前述农药用于前述植物时，对于前述植物与前述农药接触的位置没有特别限制，可以是前述植物整个个体，也可以是前述植物部分个体。前述植物部分个体例如可列举出器官、组织、细胞或营养繁殖体等，也可以是任意一种。前述器官例如可列举出：花瓣、花冠、花、叶子、种子、果实、茎、根等。作为具体例子，前述使用对象例如可列举出：水稻的种子(稻种)、苗等。使用前述农药时的植物的生长状态没有特别限制，例如可以是种子，也可以是苗，也可以是生长体。
前述农药的用量和使用次数没有特别限制，例如可以根据前述使用对象来适宜设定。
本发明的农药例如可以利用通常的使用方法来使用。前述使用方法例如可列举出：用手直接散布前述农药的方法；使用背包式散粒机、导管散粒机、空中散粒机、动力散粒机、育苗箱用散粒机、多嘴软管散粒机、附设于水稻种植机等的散粒机等散粒机进行散粒的方法等。另外，本发明的农药为溶液剂时，前述农药例如可以使用背包式散布机、动力散布机、搭载于洒水车、拖拉机等的形式的散布机、多嘴软管散布机等散布机进行散布。
本发明的农药的使用场所没有特别限制，例如可以用于水田、旱田、育苗箱、农田、果树园、桑田、温室、露天等的耕地等。
对于将本发明的农药用于水稻的情况而言，举例进行说明。将本发明的农药用于水稻时，本发明的农药例如可以用于接种时、育苗期、水稻种植时等。本发明的农药例如可以在未稀释的状态下使用，也可以在稀释的状态下使用，例如用于前述水田时，例如可以使用前述散粒机、散布机、洒水器等进行散粒、散布等。另外，将本发明的农药用于前述水稻的稻种的消毒时，前述农药例如可以作为前述水稻的稻种的涂布剂使用。前述本发明的农药例如进而还可以在前述水稻的稻种的浸种时溶解于浸渍的水中来使用；也可以在对前述水稻的稻种进行种子消毒时，溶解于热水来使用；也可以在前述水稻的稻种的发芽时在水中进行喷雾。
用于前述水田时，本发明的农药的用量和使用次数没有特别限制，可以根据前述水田的大小和前述使用方法来适宜确定。
＜由微生物导致的植物病害的防除方法＞
关于本发明的由微生物导致的植物病害的防除方法，如上所述，其包括使前述本发明的抗菌剂与植物接触的接触工序。本发明的防除方法的特征在于使用前述本发明的抗菌剂，其它工序和条件没有特别限制。利用本发明的防除方法，例如可以防除前述种苗、生长体等植物受到由前述真菌、前述细菌等微生物导致的植物病害。本发明的防除方法例如可以援用前述本发明的抗菌剂、农药等的说明。
在本发明中，前述由微生物导致的植物病害的防除是指例如针对由前述微生物的感染导致的病害的发生和加剧的阻碍能力或抑制能力，具体而言，例如，可以是不会发生病害、停止发生了的病害的加剧、及抑制(也称为“阻碍”)发生了的病害的加剧等的任一种。
前述接触工序是使前述本发明的抗菌剂与植物接触的工序。前述接触工序例如作为前述本发明的抗菌剂，也可以使前述本发明的农药与前述植物接触。前述本发明的抗菌剂与前述植物的接触方法等例如可以援用前述本发明的农药的说明。
＜新型枯草芽孢杆菌＞
关于本发明的新型枯草芽孢杆菌，如上所述，其特征在于，其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，前述枯草芽孢杆菌在通过使用了基质辅助激光解吸电离法的飞行时间型质谱法(MALDI-TOF MS)进行的质谱分析中，在选自由3045.5±0.58的范围、6942.5±0.58的范围和9140.5±0.58的范围(m/z)组成的组中的至少1个质荷比(m/z)具有峰。本发明的新型微生物的特征在于，其为前述枯草芽孢杆菌，前述枯草芽孢杆菌在利用MALDI-TOF MS进行的质谱分析中具有前述峰，其它构成和条件没有特别限制。利用本发明的新型微生物，可以制造例如前述本发明的抗菌剂和农药。本发明的新型微生物例如可以援用前述本发明的抗菌剂、农药和防除方法的说明。
实施例
接着，对本发明的实施例进行说明。但是，本发明不限定于下述实施例。市售的试剂只要没有特别说明则基于这些操作规程来使用。
[实施例1]
确认了：对本发明的新型微生物进行分离，前述新型微生物产生了显示出抗菌活性的抗菌物质。
(1)新型微生物的分离
将在山形县内获得的有机肥料作为分离源，对前述新型微生物进行分离。分离用培养基使用E5培养基。前述E5培养基的原料培养基以下述表1的组成进行混合，然后保管在阴冷的地方。接着，称量前述原料培养基2.4g，将其添加至1.2L的蒸馏水中，煮沸5分钟。进行前述煮沸后，过滤得到的溶液并除去杂质，然后将溶液部分回收至容器中。进而，对于回收的溶液在121℃、20分钟的条件下进行高压釜灭菌，然后冷却，由此制备了前述E5培养基。
[表1]
原料名 重量(k g)
螃蟹壳粉 1.5
海带粉 1.5
牡蛎壳粉 2.3
鲣鱼干粉 1.5
高粱粉 3
米粉 2.1
酱油渣 1
花生粉 1
玉米粉 2
鱼粉 2
稻谷壳 0.8
米糠 1.8
二氧化硅粉 1
菜籽渣 1.2
荞麦粉 0.8
总计 23.5
以最终浓度成为1.5％w/v的方式向1L的E5培养基中添加琼脂。将得到的混合液溶解，在121℃、20分钟的条件下进行高压釜灭菌，然后在适合的温度状态(液体的状态)下注入培养皿中，进行冷却、固化，由此制备了E5琼脂平板培养基(E5琼脂培养基)。
将适量的前述E5培养基导入烧瓶中，然后向前述烧瓶中投入前述分离源250mg，在30～48℃、转速120rpm的条件下培养24～144小时。将得到的培养液的一部分涂抹至前述E5琼脂培养基，培养至能够确认到形成菌落为止。对于所形成的各菌落用灭菌后的牙签提取细菌，通过菌落的形状、颜色、味道等进行判断，进而将它们再次涂抹至前述E5琼脂培养基。重复多次同样的处理，由此进行累积培养，获得了特征不同的72株微生物。将它们命名为YAE株。前述新型微生物(YAE51株)是利用上述分离方法于第51个获得的枯草芽孢杆菌。
(2)抗菌活性的确认
向1L的E5培养基中添加1.25g的Bacto(商标)酵母提取物(BectonDickinson公司制、目录号：212750)后，进而以最终浓度成为1.5％w/v的方式添加琼脂。将得到的混合液溶解，在121℃、20分钟的条件下进行高压釜灭菌，然后在适合的温度状态(液体的状态)下注入培养皿中，进行冷却、固化，由此制备了E5酵母琼脂平板培养基(E5酵母琼脂培养基)。
在前述E5酵母琼脂培养基的中心部以0.5cm×0.5cm大小的琼脂块的形式接种另行在前述E5酵母琼脂培养基中培养的真菌株。前述真菌株使用水稻恶苗病菌(Fusarium fujikuroi)MAFF235949(水稻恶苗病菌、从农业生物资源基因库获得)、灰梨孢菌(Pyricularia grisea)MAFF101518(水稻稻瘟病菌、从农业生物资源基因库获得)或立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)MAFF305229(水稻纹枯病菌、从农业生物资源基因库获得)。
进行前述接种后，进而在前述真菌株的周边用灭菌后的牙签接种前述新型微生物。然后，在30℃的条件下、在前述E5酵母琼脂培养基培养规定天数(水稻恶苗病菌：5天、水稻稻瘟病菌：3天、水稻纹枯病菌：3天)。进行前述培养后，对于新型微生物在各真菌株之间形成的抑菌圈的直径(R)，依据下述抗菌活性的评价基准进行评价。需要说明的是，抑菌圈的直径设为长径和短径的平均值。另外，代替前述E5酵母琼脂培养基而使用玉米粉琼脂培养基(Fluka公司制、目录号：42347-500G-F)，作为前述真菌株，使用绿色木霉(Trichodermaviride)NBRC30546(水稻立枯病、从独立行政法人制品评价技术基础机构获得)，培养规定天数(水稻立枯病：3天)，除此以外同样地进行了评价。
(抗菌活性的评价基准)
+++：5≤R(mm)
++：1＜R＜5(mm)
+：0＜R≤1(mm)
-：0＝R(mm)
将这些结果示于图1。图1是前述培养后的琼脂培养基的照片。图1中，图1的(A)示出水稻恶苗病菌的结果，图1的(B)示出水稻稻瘟病菌的结果，图1的(C)示出水稻纹枯病菌的结果，图1的(D)示出水稻立枯病的结果，图中的实线是前述新型微生物增殖了的区域，虚线是各真菌株增殖了的区域，前述实线与前述虚线之间的区域示出前述抑菌圈。如图1所示，前述新型微生物对于任意真菌株均显示出抗菌活性。
接着，将前述抑菌圈的直径(R)、及抗菌活性的评价示于下述表2。如下述表2所示，前述新型微生物对于任意真菌株均显示出抗菌活性，尤其对水稻稻瘟病菌和水稻纹枯病菌显示出高的抗菌活性。
[表2]
水稻恶苗病菌 水稻稻瘟病菌 水稻纹枯病菌 水稻立枯丝核菌
直径(R)(mm) 1.5 5 2.5 0.9
抗菌活性 ++ +++ ++ +
(3)新型微生物的鉴定
向内装有冷藏保存的5mg的基质4-CHCA(岛津GLC公司制、目录号：529-CHCA)粉末的小瓶中分别添加67μL的100％乙腈、100％乙醇和10％TFA/H2O，然后使其充分悬浮，制备了前述基质的最终浓度为25mg/ml的基质试剂。
使用灭菌后的牙签，对前述E5酵母琼脂培养基中的前述新型微生物的增殖期菌落提取细菌，并涂布在样品平板(岛津GLC公司制)的孔中。接着，向前述孔中添加1μL的前述基质试剂，然后在室温(25℃左右)的条件下干燥30分钟～1小时，使前述基质试剂完全干燥。
前述新型微生物的鉴定使用质谱仪(AXIMA(注册商标)ConfidenceMALDI-TOF型质谱仪、株式会社岛津制作所制)并在下述质谱分析条件下进行测定。前述质谱仪的控制和质量数据的收集使用附带的软件(LAUNCHPAD、株式会社岛津制作所制)。需要说明的是，在下述质谱分析条件下能够测量的质量范围为1Da～500kDa。
(质谱条件)
加速电压：20kV(线性模式)
离子源部的激光：波长337nm的氮激光
脉冲重复值：3纳秒
激光辐射功率：50Hz以下
腔室内的真空度：1.0E-3Pa以下
基于得到的质量数据和Bio Merieux公司注册的6种源自标准细菌株的蛋白质的质量数据，使用软件(SARAMIS(商标)Premium、Bio Merieux公司制)，进行了前述新型微生物株的鉴定。前述鉴定基于下述参考文献来实施。同样的鉴定进而实施了3次。参考文献：Lohmann C et.al.，“Comparison between the Biflex III-Biotyper and the Axima-SARAMIS Systems for Yeast Identification by Matrix-Assisted Laser DesorptionIonization-Time of Flight Mass Spectrometry”,J Clin Microbiol.,2013,vol.51,No.4,pages.1231-1236
将这些结果示于图2。图2是示出质谱的结果的图。图2示出前述新型微生物和前述标准细菌株的结果，图中的数字表示峰的数值(m/z)，箭头表示前述新型微生物中存在而前述标准细菌株中不存在的峰。图2中，横轴表示质荷比(m/z)，纵轴表示相对强度(％)。如图2所示，前述新型微生物的质量数据中，多个峰与前述标准细菌株的蛋白质的质量数据的峰一致。另外，前述新型微生物的质量数据中，存在3046、6943和9141(m/z)的峰，与此相对，前述标准细菌株的蛋白质的质量数据中，不存在这些峰。另外，就进一步平均了3次鉴定结果而得到的结果而言，可知前述新型微生物在3045.5±0.58的范围、6942.5±0.58的范围和9140.5±0.58的范围(m/z)具有峰。
接着，将前述新型微生物的质量数据与前述6种标准细菌株的质量数据的峰的一致率示于下述表3。如下述表3所示，前述新型微生物与属于枯草芽孢杆菌的细菌株的峰的一致率极高。由这些结果可知，前述新型微生物是属于枯草芽孢杆菌的新型微生物。需要说明的是，在前述新型微生物的质量数据中，可知：在3045.5±0.58的范围、6942.5±0.58的范围和9140.5±0.58的范围(m/z)的峰与这些细菌株的质量数据的峰不同，由这些峰能够确定本发明的新型微生物。
[表3]
[实施例2]
从本发明的新型微生物中对显示出前述抗菌活性的抗菌物质进行纯化和分析。
(1)使用了凝胶过滤柱的纯化
将200mL的LB培养基加入1L的带搅拌叶片的锥形瓶中，在121℃、20分钟的条件下进行高压釜灭菌。前述LB培养基的组成为1％Bacto(商标)Trypton(Becton Dickinson公司制、目录号：211705)、0.5％Bacto(商标)酵母提取物、1％NaCl(和光纯药工业公司制：目录号：191-01665)。将前述新型微生物接种在前述LB培养基中，在振荡转速120rpm、30℃的条件下培养48小时。
进行前述培养后，在8000×g的条件下进行20分钟离心分离。接着，回收上清液，除去菌体之后，以最终浓度成为30％的方式向前述上清液中添加硫酸铵(和光纯药工业公司制：目录号：013-03433)。接着，在4℃的条件下静置1小时，进而在10000×g的条件下进行20分钟离心分离，回收析出的物质(沉淀)。
用2mL的20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)溶解回收的沉淀，制备了粗纯化试样。将前述粗纯化试样导入纤维素管18/32(Edia公司制、目录号：UC18-32-100)内，在1L的透析液中进行脱盐(以下也称为“透析”。)，得到粗纯化抗菌物质溶液。前述透析液为20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液。前述透析处理在4℃的条件下持续进行一夜。另外，前述透析处理中对前述透析液进行1次交换。
接着，在下述凝胶过滤的纯化条件下将前述粗纯化抗菌物质溶液供于凝胶过滤，获得第912、21、24、27和30个馏分。需要说明的是，在前述凝胶过滤时导入250mL的柱平衡用缓冲液，然后导入1mL的前述粗纯化抗菌物质溶液，进而导入180mL的流动相。然后在前述流动相的导入中回收了各馏分。
(凝胶过滤的纯化条件)
(1)使用仪器：低压正相色谱(AKTA prime plus(GE Healthcare BioSciencesInc.制)
(2)柱：HiPrep 16/60Sephacryl S-200HR(GE Healthcare BioSciences Inc.制、目录号：17116601)
(3)柱平衡用缓冲液和流动相：20mmol/L Tris-HCl、150mmol/L NaCl(pH8.0)
(4)流速：0.5mL/分钟
(5)分馏量：5mL/馏分
接着，对于各馏分使用Amicon Ultra-0.5(Merck Millipore公司制、目录号：UFC501096)，利用超滤浓缩至20倍的浓度(1/20的体积)，制备了各馏分的试样。分别将前述粗纯化抗菌物质溶液和前述各馏分的试样与等量的×2SDS样品缓冲液混合，在100℃的条件下煮沸3分钟。进行前述煮沸后，对于前述粗纯化抗菌物质溶液和前述各馏分的试样，使用电泳装置(小型垂直电泳槽系统、BIO-RAD公司制)，在下述电泳条件下进行SDS-PAGE。需要说明的是，电流值为30mA，进行40分钟电泳。
(电泳条件)
(1)分离凝胶：20％丙烯酰胺
(2)浓缩凝胶：4.5％丙烯酰胺
(3)凝胶大小：微型凝胶(大小(W×L)：8.3cm×7.3cm)
(4)凝胶的厚度：1mm
(5)电泳缓冲液：25mmol/L Tris(和光纯药公司制、目录号：207-06275)、200mmol/L甘氨酸(和光纯药公司制、目录号：G8898-1KG)、0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠(NacalaiTesque,Inc.制、目录号：31607-65)
进行前述电泳后，用固定剂对前述丙烯酰胺凝胶进行处理，然后用考马斯亮蓝(coomassie brilliant blue：CBB)(和光纯药公司制、目录号：031-17922)的染色液染色30分钟。前述固定剂的组成为50％乙醇、10％乙酸。进行前述染色后，用漂白液除去CBB色素来进行脱色。前述漂白液的组成为25％甲醇、7.5％乙酸。前述脱色处理进行3小时，更换了数次前述漂白液。
将该结果示于图3。图3是示出各馏分的电泳的结果的照片。图3中，照片的左边表示分子量，各泳道从左边起显示出分子量标记、前述粗纯化抗菌物质溶液、前述第9、12、21、24、27和30个馏分。如图3所示，前述粗纯化抗菌物质溶液中所含的前述抗菌物质被纯化为前述第12个馏分，在SDS-PAGE中，是分子量为15KDa以下的抗菌物质。
接着，利用Well Diffusion Assay法对各馏分的抗菌活性进行了研究。首先，使用Difco(商标)马铃薯葡萄糖琼脂(Potato Dextrose Agar)(Becton Dickinson公司制、目录号：21340)，基于另附的操作规程制备了培养基。具体而言，称量Difco(商标)马铃薯葡萄糖琼脂39g，将其导入装有1L的蒸馏水的容器中，进行溶解。将前述容器和培养基在121℃、20分钟的条件下进行高压釜灭菌，然后在适合的温度状态(液体的状态)下注入塑料制的培养皿中，进行冷却、固化，由此制备了马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基。
接着，作为前述真菌株，使用立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)MAFF305229(水稻纹枯病菌)代替前述新型微生物，将100μL的前述第9、12、21、24、27和30个馏分分别导入在前述真菌株的周边形成的直径约0.8mm的6个孔中，除此以外与前述实施例1(2)同样地进行培养。
将该结果示于图4。图4是示出各馏分的抗菌活性的照片。如图4所示，可知：前述第12个馏分的抑菌圈极大，前述第12个馏分中包含抗菌物质。由上述结果可知，前述抗菌物质是在SDS-PAGE中分子量为15KDa以下的抗菌物质。
对于前述第12个馏分而言，使用20％丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE。前述第12个馏分利用多个泳道进行电泳。然后，进行前述电泳后，对于1个泳道进行CBB染色。然后，将进行了前述CBB染色的泳道作为基准，对未进行前述CBB染色的泳道分割为：可观察到谱带的区域(第2区域)、与前述区域相比分子量大的区域(第1区域)和与前述区域相比分子量小的区域(第3区域)这3个区域。对于前述分割后的3个区域用超纯水进行清洗。
接着，作为前述真菌株，使用立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)MAFF305229(水稻纹枯病菌)。在前述E5酵母琼脂平板培养基上放置前述清洗后的3个区域代替前述新型微生物，进而在其上层叠10mL的经灭菌后的E5酵母琼脂溶液并固定凝胶。接着，接种在凝胶周边部生长有立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)MAFF305229的、约5mm×5mm方形的琼脂块。进行前述接种后，在30℃的条件下培养3天。抗真菌反应通过前述水稻纹枯病菌的生育抑菌圈的大小进行评价。
将该结果示于图5。图5是示出各区域的抗菌活性的照片。如图5所示，前述第2区域中未观察到菌丝的形成。与此相对，前述第1和第3区域中观察到了菌丝的形成。由这些结果可确认到：前述抗菌物质是在SDS-PAGE中分子量为15KDa以下的抗菌物质。
(2)利用HPLC进行的分析
用有机溶剂(1-丁醇)对前述粗纯化抗菌物质溶液进行提取处理，然后使提取液干燥固化。将其溶解于乙醇中，由此来制备粗纯化样品，供于利用HPLC进行的分析。使用分析仪器(LaChrom HPLC系统、Hitachi High-Tech Science Corporation制)，在下述反相HPLC的分析条件下供于反相HPLC(高效液相色谱)进行分析。另外，关于对照1，使用甲醇代替前述粗纯化样品，除此以外同样地进行分析，另外，关于对照2，使用包含1.0mg/mL A型伊枯草菌素和1.0mg/mL表面活性素的甲醇溶液，除此以外同样地进行分析。
(反相HPLC的分析条件)
(1)柱：Monobis ODS柱(Kyoto Monotech Co.,Ltd.制、耐高压型、中孔直径11nm、内径2.0mm×50mm)
(2)流动相：溶剂A：0.1％甲酸(关东化学公司制、目录号：16233-00)-乙腈(关东化学公司制、目录号：01031-96)与2-丙醇(关东化学公司制、目录号：32435-80)的混合液(混合比、甲酸-乙腈：2-异丙醇＝3：7)
B：0.1％甲酸水溶液
梯度条件：时间(溶剂比(A：B))
0分钟：(A：B＝40：60)
30分钟：(A：B＝100：0)
从0分钟起至13分钟，直线性地使溶剂B的比例减少、溶
剂A的比例增加。
流速：0.15mL/分钟
(3)测定波长：205nm
(4)柱温度：40℃
将该结果示于图6。图6是示出HPLC的分析结果的图。图6中，横轴表示保持时间，纵轴表示浓度分布。如图6所示，在图中的箭头所示的位置，前述粗纯化样品具有前述对照1和2所不存在的峰。由这些结果可知，前述粗纯化样品包含与公知的抗菌物质不同的抗菌物质。
(3)通过包含电喷雾离子化的液相色谱质谱法进行的分析
使用分析仪器(1260Infinity HPLC系统、Agilent Technologies公司制)和质谱仪(Agilent G6530B Accurate-Mass Q TOF、Agilent Technologies公司制)，对于前述粗纯化样品，在下述包含电喷雾离子化的液相色谱质谱法的条件下进行测定。前述质谱仪的控制和质量数据的收集使用附带的软件(MassHunter Workstation SoftwareQualitative Analysis Version B.06.00、Agilent Technologies公司制)。另外，关于对照，使用包含1.0mg/mL A型伊枯草菌素和1.0mg/mL表面活性素的甲醇溶液，除此以外同样地进行分析。
(包含电喷雾离子化的液相色谱质谱法的条件)
(1)柱：Monobis ODS柱
(2)流动相：溶剂A：0.2％乙酸(关东化学公司制、目录号：01021-00)水
溶液
B：0.2％乙酸-甲醇(关东化学公司制、目录号：25185-76)
梯度条件：时间(溶剂比(A：B))
0分钟：(A：B＝98：2)
3分钟：(A：B＝2：98)
从0分钟起至13分钟，直线性地使溶剂A的比例减少、溶
剂B的比例增加，维持6分钟溶剂A和B的比例。
(3)流速：0.6mL/分钟
(4)模式：MS Q-TOF、Dual AJS ESI离子化、阳离子模式
将该结果示于图7。图7是示出包含电喷雾离子化的液相色谱质谱法的分析结果的图。图7中，(A)示出前述粗纯化样品的结果，(B)示出前述对照的结果，横轴表示质荷比(m/z)，纵轴表示相对强度(％)。如图7所示，前述粗纯化样品中，可知：与作为公知的抗菌物质的A型伊枯草菌素、芬荠素和表面活性素的峰不同，在731和738(m/z)的质荷比具有峰，是新型的抗菌物质的碎片离子。另外，由前述质荷比可知，前述新型的抗菌物质的碎片离子的质量(分子量)分别为1460和1474。由这些结果可知，前述新型微生物在通过包含电喷雾离子化的液相色谱质谱法进行的质谱分析中，作为前述新型的抗菌物质的碎片离子的峰，产生了质量为1460和1474的新型的抗菌物质。
以上参照实施方式和实施例对本发明进行了说明，但本发明不限定于上述实施方式和实施例。对于本发明的构成、详细内容，可以在本发明的范围内进行本领域技术人员可以理解的各种各样的变更。
产业上的可利用性
如上所述，根据本发明，能够提供例如针对水稻所感染的真菌、细菌等微生物显示出抗菌活性的、新型的抗菌物质、包含其的新型微生物、包含前述新型微生物的培养物等的新的抗菌剂。因此，本发明在农业领域、医疗领域、环境领域等中是极其有用的。

Claims (9)

1.一种抗菌剂，其包含：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和枯草芽孢杆菌的培养物的至少一者，
所述枯草芽孢杆菌是如下微生物：在通过使用了基质辅助激光解吸电离法的飞行时间型质谱法(MALDI-TOF MS)进行的质谱分析中，在选自由3045.5±0.58的范围、6942.5±0.58的范围和9140.5±0.58的范围(m/z)组成的组中的至少1个质荷比(m/z)具有峰。
2.根据权利要求1所述的抗菌剂，其中，所述枯草芽孢杆菌和所述枯草芽孢杆菌的培养物的至少一者是所述枯草芽孢杆菌和所述枯草芽孢杆菌的培养物的至少一者中的显示出抗菌活性的抗菌物质，
所述抗菌物质的分子量在聚丙烯酰胺凝胶电泳中为15KDa以下，且
所述抗菌物质的碎片离子的质量在利用电喷雾离子化质谱法进行的质谱分析中，为1460±1的范围和1474±1的范围。
3.根据权利要求1或2所述的抗菌剂，其中，所述抗菌剂是针对真菌的抗菌剂。
4.根据权利要求3所述的抗菌剂，其中，所述真菌是选自由梨孢菌属(Pyriculariasp.)、丝核菌属(Rhizoctonia sp.)、木霉菌属(Trichoderma sp.)、镰刀菌属(Fusarium sp.)和腐霉菌属(Pythium sp.)组成的组中的至少一种真菌。
5.一种农药，其包含权利要求1～4中任一项所述的抗菌剂。
6.一种利用微生物的植物病害的防除方法，其包括使权利要求1～4中任一项所述的抗菌剂与植物接触的接触工序。
7.根据权利要求6所述的防除方法，其中，所述植物为水稻。
8.根据权利要求7所述的防除方法，其中，所述水稻为所述水稻的苗或种子。
9.一种新型枯草芽孢杆菌，其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，
所述枯草芽孢杆菌在通过使用了基质辅助激光解吸电离法的飞行时间型质谱法(MALDI-TOF MS)进行的质谱分析中，在选自由3045.5±0.58的范围、6942.5±0.58的范围和9140.5±0.58的范围(m/z)组成的组中的至少1个质荷比(m/z)具有峰。
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