CN101698829B

CN101698829B - 一种枯草芽孢杆菌a16及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN101698829B
Application number: CN2009101929226A
Authority: CN
Inventors: 王振中; 徐立新; 董章勇
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2009-09-30
Filing date: 2009-09-30
Publication date: 2011-11-16
Anticipated expiration: 2029-09-30
Also published as: CN101698829A

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌A16，Bacillus subtilis A16，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 209105。该枯草芽孢杆菌A16在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落呈乳白色，形状不规则，无光泽，不湿润，边缘不整齐，菌落直径0.5～1cm，表面有皱褶，菌体成直杆状，芽孢呈椭圆形。本发明还公开了该枯草芽孢杆菌A16的制备方法与应用。本发明枯草芽孢杆菌A16抑菌谱广，可抑制玉米大、小斑病，对玉米大斑病菌、玉米小斑病菌、玉米弯孢叶斑病菌、棉花黄萎病菌、小麦赤霉病菌、香蕉炭疽病菌和香蕉枯萎病菌也均有较强的拮抗作用，防治效率高，环境安全性好，具有良好的开发应用前景。

Description

一种枯草芽孢杆菌A16及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及植物保护领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌A16及其制备方法与应用。

背景技术

玉米大斑病是由子囊菌门球腔菌属大斑刚毛球腔菌[Setosphaeria turcica(Luttrell)Leonardet Suggs]所引起的以叶部产生大型病斑症状为主的玉米病害，其分布较广，为害较重，是世界性的病害。在世界各地主要玉米产区，该病害都有不同程度的发生和危害。玉米小斑病是由子囊菌门旋孢腔菌属异旋孢腔菌[Cochliobolus heterostrophus Drechsler]所引起的温暖潮湿玉米产区的重要叶部病害，是国内外玉米上普遍发生的病害之一。据估计，一般中等发病年份感病品种损失约10％～20％，严重时可达30％～80％，甚至毁种绝收。

目前，对玉米大、小斑病的防治主要是农业防治和化学防治。农业防治主要是通过栽培抗病品种，但一些品种很容易失去抗病性，所以完全通过抗病品种来实现防治病害有一定的难度。化学药剂防治虽然能有效的控制病害的发生和流行，但是长期的使用会对非靶标生物产生直接毒害，造成对环境污染，严重影响了人类的健康和环境。因此，寻找新的无公害方法已成为当务之急，生物防治方法将越来越受到重视。

拮抗内生细菌作为一种重要的生防菌，在植物病害生物防治中起着很重要的作用。其主要优势在于：(1)细菌的种类和数量众多，在植物根际和地上部大量存在；(2)细菌对病原菌的作用方式较广，可以通过竞争，拮抗和寄生，诱导植物产生抗性等方式对病原菌产生影响；(3)具有惊人的繁殖速度；(4)许多细菌存在于植物根际和地上部，对植物的生态环境较适宜；(5)细菌大多可以通过人工培养，便于控制，在实践中易操作；(6)有些细菌不仅能防治病害而且还可以产生增收效应。

因此，从甜玉米健康植株内筛选获得对玉米大、小斑病有拮抗作用的内生生防细菌菌株，对于玉米大、小斑病的防治具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种对玉米大、小斑病菌具有拮抗作用的枯草芽孢杆菌A16，该菌株可以有效抑制玉米大、小斑病，对玉米大、小斑病的防治具有重要意义。

本发明的另一目的在于提供上述枯草芽孢杆菌A16的制备方法。

本发明还有一个目的是提供上述枯草芽孢杆菌A16在植物疾病防治中的应用。

本发明通过以下技术方案予以实现：

本发明枯草芽孢杆菌A16，Bacillus subtilis A16，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 209105。

所述枯草芽孢杆菌A16在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落呈乳白色，形状不规则，无光泽，不湿润，边缘不整齐，菌落直径0.5～1cm，表面有皱褶，菌体成直杆状，大小约3.10um×0.65um，芽孢呈椭圆形。

所述枯草芽孢杆菌A16具有以下生化特性：对玉米大斑病菌、玉米小斑病菌、玉米弯孢叶斑病菌、棉花黄萎病菌、小麦赤霉病菌、香蕉炭疽病菌和香蕉枯萎病菌有拮抗作用；其中，枯草芽孢杆菌A16还对玉米大斑病菌和玉米小斑病菌有平板拮抗作用。

所述枯草芽孢杆菌A16还具有固氮、促进植物生长、增强宿主抗逆性等生物学作用。

本发明枯草芽孢杆菌A16的制备包括如下步骤：

(1)剪取待分离的玉米组织，消毒后用1％NaClO处理，再用无菌水冲洗；

(2)将经过表面消毒的玉米组织加无菌水研磨，按照梯度浓度依次稀释1×10²、1×10³、1×10⁴倍，分别涂布于NA平板上，置于28℃恒温培养箱中培养；

(3)待平板长出菌落后，根据菌落的形态特征，挑取单个菌落，经划线、纯化后得到枯草芽孢杆菌A16，4℃冰箱保存在NA斜面上。

上述枯草芽孢杆菌的制备方法，优选为如下步骤：

(1)剪取待分离的玉米组织2g，75％酒精消毒3min后，用1％NaClO处理10min，再用无菌水冲洗4次，取最后一次冲洗液留做对照；

(2)将经过表面消毒的玉米组织加10mL无菌水置于灭菌的研钵中研磨至组织粉碎，静置3～10min，按照梯度浓度依次稀释1×10²、1×10³、1×10⁴倍，分别吸取100μL涂布于NA平板上，置于28℃恒温培养箱中培养；

(3)待平板长出菌落后，根据菌落的形态特征，挑取单个菌落，经划线、反复纯化后，得到枯草芽孢杆菌A16，4℃冰箱保存在NA斜面上。

本发明枯草芽孢杆菌A16用于促进植物生长和防治植物病害时，将该枯草芽孢杆菌A16接种于玉米苗、棉花苗、小麦苗或香蕉苗后，可获得对玉米大斑病、玉米小斑病和玉米弯孢叶斑病具有抗病力的玉米植株、对棉花黄萎病具有抗病力的棉花植株、对小麦霉菌病具有抗病力的小麦植株或对香蕉炭疽病和香蕉枯萎病具有抗病力的香蕉植株，且植株的生长状况得到显著改善。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明枯草芽孢杆菌A16为植物有益内生细菌，对玉米大、小斑病菌的抑制作用强，对多种病原菌具有拮抗作用，抑菌谱广，环境安全性好，可应用于植物病害的生物防治中，尤其是对玉米大、小斑病的防治具有重要意义；本发明枯草芽孢杆菌A16的培养条件简单，容易保存，便于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

附图说明

图1为枯草芽孢杆菌A16对玉米小斑病菌菌丝的抑制作用；

图2为枯草芽孢杆菌A16对玉米大斑病菌菌丝的抑制作用；

图3为枯草芽孢杆菌A16对玉米弯孢叶斑病菌、小麦赤霉病菌、棉花黄萎病菌和香蕉枯萎病菌的抑制作用，其中，A为枯草芽孢杆菌A16对玉米弯孢叶病菌的抑制作用；B为枯草芽孢杆菌A16对小麦赤霉病菌的抑制作用；C为枯草芽孢杆菌A16对棉花黄萎病菌的抑制作用；D为枯草芽孢杆菌A16对香蕉枯萎病菌(FOC4)的抑制作用。

具体实施方式

以下就实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何限定。

实施例1枯草芽孢杆菌A16对玉米小斑病菌和玉米大斑病菌的平板拮抗作用

枯草芽孢杆菌A16经平板对峙筛选获得。在马铃薯蔗糖培养基PDA(其中加5g/L蛋白胨，pH值调节到6.5)平板中央接入直径为5mm的玉米大、小斑病菌菌丝块，随后在每皿对称接上三片直径为5mm的灭菌滤纸片，滤纸片中心距离中央菌丝块为25mm，最后在每片滤纸片上接入细菌培养液10μL，以不接枯草芽孢杆菌培养液的平板为空白对照，三次重复，置于28℃培养箱中培养7d后，测定抑菌圈半径，由图1可见枯草芽孢杆菌A16显著抑制玉米小斑病菌的生长，由图2可见枯草芽孢杆菌A16显著抑制玉米大斑病菌的生长。

实施例2枯草芽孢杆菌A16室内防效测定

将经0.1％NaClO消毒后的甜玉米种子用拮抗菌株培养液(含菌量为1.2×10⁹cfu/ml)浸种5h后，播于花盆中(泥土消毒)，每盆播种10粒种子，设无菌水浸种为对照。每处理播种10盆，长至三叶一新时(21d左右)，喷玉米大、小斑病菌孢子悬浮液，接种后放置在温室中培养，在接种病原菌后7d调查发病情况。结果显示经A16菌株处理过的玉米植株大、小斑病的病情指数分别比对照低了31.4、46.3。

实施例3枯草芽孢杆菌A16对多种病原菌的拮抗作用

采用平板对峙法，测试枯草芽孢杆菌A16对玉米弯孢叶斑病菌、棉花黄萎病菌、小麦赤霉病菌、香蕉炭疽病菌和香蕉枯萎病菌5种病原菌的拮抗作用。参照平板对峙法进行筛选。在马铃薯蔗糖培养基PDA(其中加5g/L蛋白胨，pH值调节到6.5)平板中央接入直径为5mm的病原菌菌丝块，在距离病原菌两侧25mm处，用接种环划线接种内生细菌，以只接病原菌为对照，于28℃培养箱中培养7d，测量抑菌带宽度，每处理重复3次。结果见表1以及图3。从图3的图A中可看到枯草芽孢杆菌A16对玉米弯孢叶斑病菌的抑制作用；B中可观察到枯草芽孢杆菌A16对小麦赤霉病菌的抑制作用；C中可观察到枯草芽孢杆菌A16对棉花黄萎病菌的抑制作用；D中可观察到枯草芽孢杆菌A16对香蕉枯萎病菌4号小种(FOC4)的抑制作用。

表1拮抗菌株对不同病原菌的抑制作用

“++”表示抑菌带为6～8mm；“+++”表示抑菌带为8～10mm；

“++++”表示抑菌带＞10mm。

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌A16，其特征在于所述枯草芽孢杆菌A16，Bacillus subtilis A16，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 209105。

2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌A16，其特征在于所述枯草芽孢杆菌A16在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落呈乳白色，形状不规则，无光泽，不湿润，边缘不整齐，菌落直径0.5～1cm，表面有皱褶，菌体成直杆状，芽孢呈椭圆形。

3.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌A16，其特征在于所述枯草芽孢杆菌A16具有以下生化特性：对玉米大斑病菌、玉米小斑病菌、玉米弯孢叶斑病菌、棉花黄萎病菌、小麦赤霉病菌、香蕉炭疽病菌和香蕉枯萎病菌有拮抗作用。

4.根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌A16，其特征在于所述枯草芽孢杆菌A16对玉米大斑病菌和玉米小斑病菌有平板拮抗作用。

5.权利要求1所述枯草芽孢杆菌A16用于防治玉米大斑病、玉米小斑病、玉米弯孢叶斑病、棉花黄萎病、小麦霉菌病、香蕉炭疽病和香蕉枯萎病的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于利用枯草芽孢杆菌A16CCTCC NO.M 209105接种于玉米苗、棉花苗、小麦苗或香蕉苗，获得对玉米大斑病、玉米小斑病和玉米弯孢叶斑病具有抗病力的玉米植株、对棉花黄萎病具有抗病力的棉花植株、对小麦霉菌病具有抗病力的小麦植株或对香蕉炭疽病和香蕉枯萎病具有抗病力的香蕉植株。