CN103525742B - 防治棉花黄萎病的菌剂及其制备方法和它们的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种防治棉花黄萎病菌剂，该菌剂包括培养基和菌体，其中，所述菌体包括枯草芽孢杆菌（Bacillus？subtilis）、短小芽孢杆菌（Bacillus？pumilus）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus？cereus）、灰绿链霉菌（Streptomyces？viridogriseus）和荧光假单胞杆菌（Pseudomonas？fluorescens）。本发明提供的菌剂能够有效地防治棉花黄萎病，降低棉花黄萎病大爆发的风险，提高棉农收入，具有广阔的应用前景。本发明还提供了所述菌剂的制备方法及该菌剂在预防棉花黄萎病中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种菌剂及其制备方法和应用；更确切地说，涉及一种防治棉花黄萎病的菌剂及其制备方法和它们在防治棉花黄萎病中的应用。
背景技术
棉花黄萎病是由大丽轮枝菌引起的一种真菌性病害，是一种危害性很大的维管束系统病害，由大丽轮枝菌引起的棉花黄萎病是几乎所有棉花生产国棉花生产的主要限制因素。由于高抗黄萎病的棉花品种较少，且对黄萎病致病的机理以及棉花抗黄萎病的遗传方式的了解还比较少，因此，目前对棉花黄萎病的防治还是以生物防治为主，但现有的生物菌剂对棉花黄萎病的防治效果均不够理想，因此，迫切需要开发一种能够有效防治棉花黄萎病的菌剂。
发明内容
本发明的目的在于克服现有生物菌剂存在的防治棉花黄萎病的效果不理想的问题，提供一种能够有效防治棉花黄萎病的菌剂及其制备方法和它们的应用。
为了实现第一个发明目的，本发明提供了一种菌剂，该菌剂包括培养基和菌体，其中，所述菌体包括枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）、蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）、灰绿链霉菌（Streptomycesviridogriseus）和荧光假单胞杆菌（Pseudomonasfluorescens）。
为了实现第二个发明目的，本发明还提供了一种菌剂的制备方法，其中，该方法包括：该方法包括：将枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）、蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）、灰绿链霉菌（Streptomycesviridogriseus）和荧光假单胞杆菌（Pseudomonasfluorescens）接种于培养基中进行培养。
本发明还提供了所述的菌剂在预防棉花黄萎病中的应用。
本发明提供的的菌剂能够有效防治棉花黄萎病，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
本发明提供了一种菌剂，该菌剂包括培养基和菌体，其中，所述菌体包括枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）、蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）、灰绿链霉菌（Streptomycesviridogriseus）和荧光假单胞杆菌（Pseudomonasfluorescens）。
所述菌剂中含有的菌体的量可以在很大范围内改变，优选情况下，每克所述菌剂所含的总活菌数可以为1-5×1010个。
优选地，所述菌剂中，以所述菌剂中的总活菌数为基准，枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）的活菌数可以为总活菌数的10-50％、短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）的活菌数可以为总活菌数的10-50％、蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）的活菌数可以为总活菌数的10-50%、灰绿链霉菌（Streptomycesviridogriseus）的活菌数可以为总活菌数的10-50%、荧光假单胞杆菌（Pseudomonasfluorescens）的活菌数可以为总活菌数的10-50%
更优选地，以所述菌剂中的总活菌数为基准，枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）的活菌数可以为总活菌数的25-35％、短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）的活菌数可以为总活菌数的25-35％、蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）的活菌数可以为总活菌数的10-15％、灰绿链霉菌（Streptomycesviridogriseus）的活菌数可以为总活菌数的10-15％、荧光假单胞杆菌（Pseudomonasfluorescens）的活菌数可以为总活菌数的10-15％。
根据本发明，所述培养基的种类可以在很大范围内改变，可以为各种能够用于培养枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、灰绿链霉菌、荧光假单胞杆菌的培养基，例如，可以为马铃薯蔗糖培养基、LB培养基和CM培养基中的一种或几种，优选为马铃薯蔗糖培养基。上述培养基能够商购得到或者根据“微生物培养基手册”（MicrobiologyCultureMediaManual）的记载制备得到。例如，马铃薯蔗糖培养基（马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，水1000mL）的制备方法可以为：将200g去皮马铃薯切碎，煮烂后取得土豆汁，加入20g葡萄糖或者蔗糖，加入琼脂15～20g，加水至1000mL，121℃灭菌即可。
本发明还提供了所述菌剂的制备方法，其中，该方法包括：将枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）、蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）、灰绿链霉菌（Streptomycesviridogriseus）和荧光假单胞杆菌（Pseudomonasfluorescens）接种于培养基中进行培养。
根据本发明，所述培养的方法包括：在各自独立的培养体系中分别培养枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）、蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）、灰绿链霉菌（Streptomycesviridogriseus）和荧光假单胞杆菌（Pseudomonasfluorescens），并将分别培养得到的微生物按照比例混合。优选情况下，通过在各自独立的培养体系中的培养及培养后的混合，使得到的每克菌剂的总活菌数为1-5×1010个。
在一种优选实施方式中，通过在各自独立的培养体系中的培养及培养后按照比例的混合，所述混合的条件没有特别的限制，只要能够使得到的菌剂满足以下条件即可：以使所述菌剂中的总活菌数为基准，枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）的活菌数为总活菌数的10-50％、短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）的活菌数为总活菌数的10-50％、蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）的活菌数为总活菌数的10-50%、灰绿链霉菌（Streptomycesviridogriseus）的活菌数为总活菌数的10-50%、荧光假单胞杆菌（Pseudomonasfluorescens）的活菌数为总活菌数的10-50%；优选地，以所述菌剂中的总活菌数为基准，枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）的活菌数为总活菌数的25-35％、短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）的活菌数为总活菌数的25-35％、蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）的活菌数为总活菌数的10-15％、灰绿链霉菌（Streptomycesviridogriseus）的活菌数为总活菌数的10-15％、荧光假单胞杆菌（Pseudomonasfluorescens）的活菌数为总活菌数的10-15％。
根据本发明，所述枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、灰绿链霉菌、荧光假单胞杆菌的菌种可以通过商购得到，例如，中国农业微生物菌种保藏中心保藏的枯草芽孢杆菌（ACCC01659）、短小芽孢杆菌（ACCC01171）、蜡样芽孢杆菌（ACCC05302）、灰绿链霉菌（ACCC41544）和荧光假单胞杆菌（ACCC10040）。
根据本发明，所述枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）的培养方法没有特别的限制为本领域技术人员所公知，例如，可以在100重量份的马铃薯蔗糖培养基中接种2-5重量份的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）的菌株，30℃培养，直至枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）的活菌数为1-5×1010个/克的培养基。
所述短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）的培养方法没有特别的限制为本领域技术人员所公知，例如，可以在100重量份的马铃薯蔗糖培养基中接种2-5重量份的短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）的菌株，30℃培养，直至短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）的活菌数为1-5×1010个/克的培养基。
所述蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）的培养方法没有特别的限制，例如，可以在100重量份的马铃薯蔗糖培养基中接种2-5重量份的蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）的菌株，30℃培养，直至蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）的活菌数为1-5×1010个/克的培养基。
所述灰绿链霉菌（Streptomycesviridogriseus）的培养方法没有特别的限制，例如，可以在100重量份的马铃薯蔗糖培养基中接种2-5重量份的灰绿链霉菌（Streptomycesviridogriseus）的菌株，30℃培养，直至灰绿链霉菌（Streptomycesviridogriseus）的活菌数为1-5×1010个/克的培养基。
所述荧光假单胞杆菌（Pseudomonasfluorescens）的培养方法没有特别的限制，例如，可以在100重量份的马铃薯蔗糖培养基中接种2-5重量份的荧光假单胞杆菌（Pseudomonasfluorescens）的菌株，30℃培养，直至荧光假单胞杆菌（Pseudomonasfluorescens）的活菌数为1-5×1010个/克的培养基。
本发明还提供了所述的菌剂在防治棉花黄萎病中的应用。
下面通过具体的实施例对本发明进行更进一步的说明。
实施例1
（1）在100重量份的马铃薯蔗糖培养基（将200g去皮马铃薯切碎，煮烂后取得土豆汁，加入20g葡萄糖或者蔗糖，加入琼脂20g，加水至1000mL，121℃灭菌）中接种5重量份的枯草芽孢杆菌（ACCC01659），30℃培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至枯草芽孢杆菌的活菌数为1×1010个/克的培养基。
（2）在100重量份的马铃薯蔗糖培养基（将200g去皮马铃薯切碎，煮烂后取得土豆汁，加入20g葡萄糖或者蔗糖，加入琼脂20g，加水至1000mL，121℃灭菌）中接种3重量份的短小芽孢杆菌（ACCC01171），30℃培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至短小芽孢杆菌的活菌数为1×1010个/克的培养基。
（3）在100重量份的马铃薯蔗糖培养基（将200g去皮马铃薯切碎，煮烂后取得土豆汁，加入20g葡萄糖或者蔗糖，加入琼脂20g，加水至1000mL，121℃灭菌）中接种4重量份的蜡样芽孢杆菌（ACCC05302），30℃培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至蜡样芽孢杆菌的活菌数为1×1010个/克的培养基。
（4）在100重量份的马铃薯蔗糖培养基（将200g去皮马铃薯切碎，煮烂后取得土豆汁，加入20g葡萄糖或者蔗糖，加入琼脂20g，加水至1000mL，121℃灭菌）中接种5重量份的灰绿链霉菌（ACCC41544），30℃培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至灰绿链霉菌的活菌数为1×1010个/克的培养基。
（5）在100重量份的马铃薯蔗糖培养基（将200g去皮马铃薯切碎，煮烂后取得土豆汁，加入20g葡萄糖或者蔗糖，加入琼脂20g，加水至1000mL，121℃灭菌）中接种5重量份的荧光假单胞杆菌（ACCC10040），30℃培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至荧光假单胞杆菌的活菌数为1×1010个/克的培养基。
（6）将步骤（1）至（5）中分别得到的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）、蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）、灰绿链霉菌（Streptomycesviridogriseus）和荧光假单胞杆菌（Pseudomonasfluorescens）按照比例进行混合，使得到的菌剂中，枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）的活菌数为总活菌数的20％、短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）的活菌数为总活菌数的20％、蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）的活菌数为总活菌数的20％、灰绿链霉菌（Streptomycesviridogriseus）的活菌数为总活菌数的20％、荧光假单胞杆菌（Pseudomonasfluorescens）的活菌数为总活菌数的20％，得到菌剂A1。
实施例2
（1）在100重量份的马铃薯蔗糖培养基（将200g去皮马铃薯切碎，煮烂后取得土豆汁，加入20g葡萄糖或者蔗糖，加入琼脂15g，加水至1000mL，121℃灭菌）中接种4重量份的枯草芽孢杆菌（ACCC01659），30℃培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至枯草芽孢杆菌的活菌数为0.8×1010个/克的培养基。
（2）在100重量份的马铃薯蔗糖培养基（将200g去皮马铃薯切碎，煮烂后取得土豆汁，加入20g葡萄糖或者蔗糖，加入琼脂15g，加水至1000mL，121℃灭菌）中接种2重量份的短小芽孢杆菌（ACCC01171），30℃培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至短小芽孢杆菌的活菌数为0.8×1010个/克的培养基。
（3）在100重量份的马铃薯蔗糖培养基（将200g去皮马铃薯切碎，煮烂后取得土豆汁，加入20g葡萄糖或者蔗糖，加入琼脂15g，加水至1000mL，121℃灭菌）中接种3重量份的蜡样芽孢杆菌（ACCC05302），30℃培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至蜡样芽孢杆菌的活菌数为0.8×1010个/克的培养基。
（4）在100重量份的马铃薯蔗糖培养基（将200g去皮马铃薯切碎，煮烂后取得土豆汁，加入20g葡萄糖或者蔗糖，加入琼脂15g，加水至1000mL，121℃灭菌）中接种4重量份的灰绿链霉菌（ACCC41544），30℃培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至灰绿链霉菌的活菌数为0.8×1010个/克的培养基。
（5）在100重量份的马铃薯蔗糖培养基（将200g去皮马铃薯切碎，煮烂后取得土豆汁，加入20g葡萄糖或者蔗糖，加入琼脂15g，加水至1000mL，121℃灭菌）中接种4重量份的荧光假单胞杆菌（ACCC10040），30℃培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至荧光假单胞杆菌的活菌数为0.8×1010个/克的培养基。
（6）将步骤（1）至（5）中分别得到的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）、蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）、灰绿链霉菌（Streptomycesviridogriseus）和荧光假单胞杆菌（Pseudomonasfluorescens）按照比例进行混合，使得到的菌剂中，枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）的活菌数为总活菌数的15％、短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）的活菌数为总活菌数的15％、蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）的活菌数为总活菌数的15％、灰绿链霉菌（Streptomycesviridogriseus）的活菌数为总活菌数的30％、荧光假单胞杆菌（Pseudomonasfluorescens）的活菌数为总活菌数的25％，得到菌剂A2。
实施例3
（1）在100重量份的马铃薯蔗糖培养基（将200g去皮马铃薯切碎，煮烂后取得土豆汁，加入20g葡萄糖或者蔗糖，加入琼脂18g，加水至1000mL，121℃灭菌）中接种3重量份的枯草芽孢杆菌（ACCC01659），30℃培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至枯草芽孢杆菌的活菌数为0.5×1010个/克的培养基。
（2）在100重量份的马铃薯蔗糖培养基（将200g去皮马铃薯切碎，煮烂后取得土豆汁，加入20g葡萄糖或者蔗糖，加入琼脂18g，加水至1000mL，121℃灭菌）中接种4重量份的短小芽孢杆菌（ACCC01171），30℃培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至短小芽孢杆菌的活菌数为0.5×1010个/克的培养基。
（3）在100重量份的马铃薯蔗糖培养基（将200g去皮马铃薯切碎，煮烂后取得土豆汁，加入20g葡萄糖或者蔗糖，加入琼脂18g，加水至1000mL，121℃灭菌）中接种2重量份的蜡样芽孢杆菌（ACCC05302），30℃培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至蜡样芽孢杆菌的活菌数为0.5×1010个/克的培养基。
（4）在100重量份的马铃薯蔗糖培养基（将200g去皮马铃薯切碎，煮烂后取得土豆汁，加入20g葡萄糖或者蔗糖，加入琼脂18g，加水至1000mL，121℃灭菌）中接种2重量份的灰绿链霉菌（ACCC41544），30℃培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至灰绿链霉菌的活菌数为0.5×1010个/克的培养基。
（5）在100重量份的马铃薯蔗糖培养基（将200g去皮马铃薯切碎，煮烂后取得土豆汁，加入20g葡萄糖或者蔗糖，加入琼脂18g，加水至1000mL，121℃灭菌）中接种2重量份的荧光假单胞杆菌（ACCC10040），30℃培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至荧光假单胞杆菌的活菌数为0.5×1010个/克的培养基。
（6）将步骤（1）至（5）中分别得到的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）、蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）、灰绿链霉菌（Streptomycesviridogriseus）和荧光假单胞杆菌（Pseudomonasfluorescens）按照比例进行混合，使得到的菌剂中，枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）的活菌数为总活菌数的25％、短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）的活菌数为总活菌数的25％、蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）的活菌数为总活菌数的10％、灰绿链霉菌（Streptomycesviridogriseus）的活菌数为总活菌数的20％、荧光假单胞杆菌（Pseudomonasfluorescens）的活菌数为总活菌数的20％，得到菌剂A3。
实施例4
根据与实施例3相同的方法制备菌剂A4，不同在于，将步骤（1）至（5）中分别得到的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）、蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）、灰绿链霉菌（Streptomycesviridogriseus）和荧光假单胞杆菌（Pseudomonasfluorescens）按照比例进行混合，使得到的菌剂中，枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）的活菌数为总活菌数的30％、短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）的活菌数为总活菌数的30％、蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）的活菌数为总活菌数的10％、灰绿链霉菌（Streptomycesviridogriseus）的活菌数为总活菌数的15％、荧光假单胞杆菌（Pseudomonasfluorescens）的活菌数为总活菌数的15％，，得到菌剂A4。
实施例5-8
分别使用实施例1-4中制得的菌剂A1-A4对播种前的感病棉花种子进行处理，具体步骤如下：分别取5g的菌剂混种于1公斤的脱绒棉花种子，搅拌均匀后播种于盛有灭菌土的营养钵中，期间适量浇水保湿，待2周后棉花幼苗长出第一片真叶，取出营养钵置于含有5x106CFU/mL的大丽轮枝菌孢子悬浮液中，3mL/株，处理后继续培养4周，调查棉苗黄萎病发病率。结果表明，棉花种子经菌剂处理后棉苗对黄萎病的抗性显著提高，结果如下表1所示。
对比例1
根据与实施例5-8相同的方法进行处理，不同在于没有使用菌剂，结果如下表1所示。
表1
| 实施例编号 | 发病率 |
| 实施例5（A1） | 16% |
| 实施例6（A2） | 17% |
| 实施例7（A3） | 12% |
| 实施例8（A4） | 10% |
| 对比例1 | 87% |
由上表1中的结果可以看出，实施例5-8中，未经菌剂处理的棉花幼苗接种大丽轮枝菌后棉苗的发病率高达87%，菌剂处理后棉花对大丽轮枝菌的抗性显著提高，菌剂A1处理后的棉花幼苗黄萎病的发病率为16%，菌剂A2处理后的棉花幼苗黄萎病的发病率为17%，菌剂A3处理后的棉花幼苗黄萎病的发病率为12%，菌剂A4处理后的棉花幼苗黄萎病的发病率为10%，由此可以看出本发明提供的菌剂对棉花黄萎病具有良好的预防效果，特别是实施例7和8的预防效果更佳。
Claims (3)
1.一种防治棉花黄萎病的菌剂，该菌剂包括培养基和菌体，其特征在于，所述菌体包括枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ACCC01659、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)ACCC01171、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)ACCC05302、灰绿链霉菌(Streptomycesviridogriseus)ACCC41544和荧光假单胞杆菌(Pseudomonasfluorescens)ACCC10040；每克所述菌剂所含的总活菌数为1-5×1010个；以所述菌剂中的总活菌数为基准，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ACCC01659的活菌数为总活菌数的25-35％、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)ACCC01171的活菌数为总活菌数的25-35％、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)ACCC05302的活菌数为总活菌数的10-15％、灰绿链霉菌(Streptomycesviridogriseus)ACCC41544的活菌数为总活菌数的10-15％、荧光假单胞杆菌(Pseudomonasfluorescens)ACCC10040的活菌数为总活菌数的10-15％。
2.权利要求1所述的菌剂的制备方法，其特征在于，该方法包括：将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ACCC01659、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)ACCC01171、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)ACCC05302、灰绿链霉菌(Streptomycesviridogriseus)ACCC41544和荧光假单胞杆菌(Pseudomonasfluorescens)ACCC10040接种于培养基中进行培养；其中，所述接种于培养基中进行培养的方法包括：在各自独立的培养体系中分别培养枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ACCC01659、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)ACCC01171、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)ACCC05302、灰绿链霉菌(Streptomycesviridogriseus)ACCC41544和荧光假单胞杆菌(Pseudomonasfluorescens)ACCC10040，并将分别培养得到的微生物按照比例混合；通过在各自独立的培养体系中的培养及培养后的混合，使得到的每克菌剂的总活菌数为1-5×1010个，其中，以所述菌剂中的总活菌数为基准，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ACCC01659的活菌数为总活菌数的25-35％、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)ACCC01171的活菌数为总活菌数的25-35％、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)ACCC05302的活菌数为总活菌数的10-15％、灰绿链霉菌(Streptomycesviridogriseus)ACCC41544的活菌数为总活菌数的10-15％、荧光假单胞杆菌(Pseudomonasfluorescens)ACCC10040的活菌数为总活菌数的10-15％。
3.权利要求1所述的菌剂在防治棉花黄萎病中的应用。
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| CN103525742A (zh) | 2014-01-22 |
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