CN105331545B - 一种防治苹果树腐烂病的菌株，微生物菌剂及其制备方法 - Google Patents
一种防治苹果树腐烂病的菌株，微生物菌剂及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种防治苹果树腐烂病的菌株，微生物菌剂及其制备方法，所述菌株61239已于2015年7月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，其简称为CGTCC，保藏编号为CCTCC M 2015420。本发明还包括含有防治苹果树腐烂病的球毛壳菌的微生物菌剂及其制备方法。本发明生防真菌来源于自然界中，无污染、无公害、无残留，对人畜无毒副作用，无论是对苹果树还是对人体、生态环境都相当的安全，可运用于苹果树的任何生育期，特别是休眠期，不产生任何抗性，可彻底控制和根治苹果腐烂病。实验证明，本发明之球毛壳菌株61239对苹果树腐烂病菌特异性强，控制效果好，平均防效在95％以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种菌株，微生物菌剂及其制备方法，具体涉及一种防治苹果树腐烂病的菌株，微生物菌剂及其制备方法。
背景技术
苹果树腐烂病(Valsa canker of apple)为一区域性病害，主要发生在我国、日本和朝鲜，在美国、加拿大、英国和俄罗斯等国零星分布。历史上我国先后有5次腐烂病大流行，给各个时期的苹果产业造成了毁灭性打击。自20世纪50年代以来，先后采用保护性化学杀菌剂全园喷洒，预防发病，以及对苹果树患病部位采取手术刮治、涂抹內吸治疗性杀菌剂，杀菌治病的方法，均未能取得预期的效果。
近年来,苹果腐烂病的防治，仍以化学药剂为主要防治方式，但是由于苹果腐烂病菌在树体内的潜伏侵染特性，使化学农药无法解决老疤的复发问题，使得该病年复一年，至今无法有效控制；同时，由于化学农药的药效期较短，使用次数和使用剂量在不断加大，已对果品安全和环境安全构成了巨大的威胁，直接影响着我国在国际上的苹果贸易。因此，采用生物防治无害化技术，生产高档优质绿色或有机果品，已日益成为人们追求的时尚。
目前，生物防治苹果腐烂病的方法主要包括中草药提取物防治、生防真菌防治和利用农用抗生素防治。例如，段泽敏，王贤萍，周柏玲等.苹果树腐烂病无公害防治技术研究[J]，山西农业科学，2002，30(4):55～59中公开茵陈、苦参和黄芩等多味中药用于腐烂病的防治，但中药成分复杂，提取过程繁琐，生产成本高，因此，难以广泛应用。焦荣斌.防治苹果腐烂病的新药－抗生素S－921[J]，河北农业科技，1988，3:15中公开农用抗生素S－921对苹果腐烂病病斑有很好的治疗效果，但不能解决老疤的复发问题。茆振川，王桂荣，魏建梅等.木霉菌对苹果树腐烂病菌的抑制作用[J]，河北果树，1999，4:12～13中利用木霉作为生防菌防治苹果腐烂病，但受环境影响大，难以在田间长期定殖，而且至今未见在苹果生产中应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种防治苹果树腐烂病的微生物菌剂及其制备方法。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种防治苹果树腐烂病的球毛壳菌(Chaetomium globosum)菌株61239，已于2015年7月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，保藏编号为CCTCC M2015420，保藏地址：中国武汉武汉大学，中国典型培养物保藏中心，邮编：430072。
该菌株分离自陕西省白水县苹果园的苹果树翘皮中，该菌的分类地位为真菌界、子囊菌门、粪壳菌纲、粪壳目、毛壳科、毛壳属，在CMA培养基上菌落呈灰白色，气生菌丝灰白色。子囊果表生，球形或椭圆形，有孔口，顶生附属丝茂密，不分枝，直或弯曲，波浪状。子囊棍棒状，簇生，含8个子囊孢子，具柄，易消解。子囊孢子褐色，柠檬形，厚壁，两侧平滑，两端突起，大小为7.5-8.75×8.75-12.5μm，有一顶生萌发孔。经形态学特征、培养习性以及rDNA-ITS序列分析鉴定，菌株61239属于球毛壳菌Chaetomium globosum。
本发明进一步解决其技术问题采用的技术方案是，一种防治苹果树腐烂病的微生物菌剂，将球毛壳菌Chaetomium globosum菌株61239经固体发酵得到发酵物，阴干或在20～40℃烘干，粉碎，然后与湿润剂、发泡剂、分散剂和填料混合，制成可湿性菌剂，可兑水喷雾，也可制成涂抹剂。
进一步，所述湿润剂为二异丁基萘磺酸钠，例如拉开粉bx；所述发泡剂为十二烷基硫酸钠；所述分散剂为木质素磺酸钙；所述填料为硅藻土。
本发明进一步解决其技术问题采用的技术方案是，一种防治苹果树腐烂病的微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)一级种子培养：将权利要求1所述的球毛壳菌株61239斜面孢子接到已灭菌好一级种子培养基中，在培养温度32～36℃，通气量1：0.4～0.8v/v/min并搅拌的条件下培养45～60hr；
(2)二级种子培养：按接种量5～15％接入到灭菌好的二级种子培养基中，在培养温度32～36℃，通气量1：0.8～1.2v/v/min并搅拌的条件下培养20～30hr，得到二级种子；
(3)固体发酵培养：在灭菌后冷却至25～30℃的固体发酵培养基中按4～6％比例接入二级种子，混合后放入固体发酵罐内培养，整个发酵过程分为三个阶段，第一阶段(0～24h)：0～10h静止培养，物料升温后间断通风降温使物料温度控制在25～30℃；12～24h第一次翻曲，并将温度控制在25℃～28℃；第二阶段(24～100h):24～30h第二次翻曲，并将温度控制在26℃～27℃；之后每15h翻曲一次，并间隔一次补加无菌水100Kg，将温度控制在25℃～27℃；第三阶段(100h以后)：100h后不再补水，保持温度控制在26℃～28℃，直至发酵结束，得到含有球毛壳菌株61239的发酵液；
(4)微生物菌剂的制备：将发酵物阴干或在在20～40℃烘干，粉碎过90～120目，然后与湿润剂、发泡剂、分散剂和填料混合，制成可湿性菌剂。
进一步，步骤(1)中，所述一级种子培养基是由500ml三角瓶加入50g大麦和40g水，pH自然，搅拌均匀后，在121℃灭菌40min制成。
进一步，步骤(2)中，二级种子培养基是由5Kg大麦和4Kg水，拌匀后，在121℃灭菌40min，冷却后接入50g一级种子,平均装入4个曲盘，置于28℃±1曲房中培养5天，期间补加无菌水1～2次，每间隔1天翻曲一次制成。
进一步，步骤(3)中，所述固体发酵培养基是在6m3蒸煮锅内加入500Kg玉米粉和500Kg过60目玉米秸秆粉，5Kg KH2PO4和550Kg水，搅拌均匀后，直接蒸汽加热至121℃，保温40min后冷却至28℃制成。
本发明筛选的球毛壳菌株61239对苹果腐烂病菌具有显著的抑菌和杀菌活性，特别是能以苹果树体上的老翘皮、各个剪锯口处死组织上的纤维素和木质素为养分，长期定殖存活于苹果树上，既能预防新病斑的产生，又能防止原有老疤的复发，可持久地控制苹果腐烂病菌，从而达到彻底控制和根治苹果腐烂病的目的。
本发明生防真菌来源于自然界中，无污染、无公害、无残留，对人畜无毒副作用，无论是对苹果树还是对人体、生态环境都相当的安全，可运用于苹果树的任何生育期，特别是休眠期，不产生任何抗性。
实验证明，本发明之球毛壳菌株61239对苹果树腐烂病菌特异性强，控制效果好，平均防效在99.34％。
附图说明
图1为球毛壳61239对苹果树腐烂病菌的拮抗效果。
图2为球毛壳61239对苹果树腐烂病菌的离体防治效果。
图3为涂抹球毛壳菌剂的腐烂病疤处老翘皮保湿结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步加以说明。
实施例1：防治苹果树腐烂病的球毛壳菌的分离、纯化、鉴定
1、分离、纯化
分离自陕西省白水县苹果园的苹果树翘皮中。取苹果树翘皮干样5g，剪成1cm左右小段，装入1000ml三角瓶中，向内加入特制消毒液10ml，振摇6-8min。再加入无菌水600ml，吸取此悬浮液2ml涂布于马丁培养基平面，倾去水液，用镊子夹出翘皮于无菌培养皿中，剪成小段一并放入马丁培养基平面，28℃培养。
待分离培养基上长出明显可辨的毛壳菌子囊果后，在解剖镜下挑取单个子囊果，接种于水琼脂培养基或PDA培养基中进行培养纯化。
2、分离鉴定
(1)形态特征
在CMA培养基上菌落呈灰白色，气生菌丝灰白色。子囊果表生，球形或椭圆形，有孔口，顶生附属丝茂密，不分枝，直或弯曲，波浪状。子囊棍棒状，簇生，含8个子囊孢子，具柄，易消解。子囊孢子褐色，柠檬形，厚壁，两侧平滑，两端突起，大小为7.5-8.75×8.75-12.5μm，有一顶生萌发孔.
(2)分子生物学鉴定
挑取在PDA上培养6d的真菌61239的菌丝，采用CTAB法提取其基因组DNA。利用真菌的通用引物ITS1-F(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')对真菌61239rDNA-ITS序列进行PCR扩增，扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。PCR扩增和测序结果，获得了长度为563bp的DNA序列。测序结果在GenBank中进行BLAST比对，结果显示真菌61239和球毛壳Chaetomium globosum的同源性高达100％。利用MrBayes v.3.1.2软件构建不同毛壳菌的ITS序列系统发育树，结果显示真菌61239和球毛壳Chaetomium globosum聚在一类，关系最近。
综上，根据形态学特性和分子生物学鉴定，并结合文献报道，确定防治苹果树腐烂病的球毛壳菌61239为球毛壳菌(Chaetomium globosum)。
实施例2：防治苹果树腐烂病的球毛壳菌的防效测定
室内采用平板对峙培养法和菌丝生长速率法测定61239球毛壳菌对苹果树腐烂病的防治效果。对峙培养结果显示，其对苹果树腐烂病菌菌丝生长有明显的抑制效果，见图1。对峙培养8d后，在生防菌周围形成直径为13mm的透明抑菌圈，显微镜下观察可见，抑菌圈周围的病原菌菌丝生长缓慢，菌丝顶端膨大，并且细胞壁被破坏，原生质体外泄，表现出溶菌现象，见图1。
选取61239球毛壳菌株进行液体发酵，结果表明其发酵滤液对苹果树腐烂病菌菌丝的生长表现出显著的抑制作用，见表1。
表1-生防球毛壳菌发酵滤液对苹果树腐烂病菌的抑制作用
由表1可知，发酵滤液的50倍稀释液在5d后仍有70.90％抑制率。
实施例3：防治苹果树腐烂病的微生物菌剂的制备
(1)一级种子培养：将权利要求1所述的球毛壳菌株61239斜面孢子接到已灭菌好一级种子培养基中，在培养温度32～36℃，通气量1：0.4～0.8v/v/min并搅拌的条件下培养45～60hr；其中，一级种子培养基的获得：500ml三角瓶加入50g大麦和40g水，pH自然，搅拌均匀后，在121℃灭菌40min。
(2)二级种子培养：按接种量5～15％接入到灭菌好的二级种子培养基中，在培养温度32～36℃，通气量1：0.8～1.2v/v/min并搅拌的条件下培养20～30hr，得到二级种子；其中，二级种子培养基的获得：称取5Kg大麦和4Kg水，拌匀后，在121℃灭菌40min,冷却后接入50g一级种子,平均装入4个曲盘，置于(28℃±1)曲房中培养5天，期间补加无菌水1～2次，每间隔1天翻曲一次。
(3)固体发酵培养：在灭菌后冷却至28℃的固体发酵培养基中按5％比例接入二级种子，混合后放入固体发酵罐内培养，整个发酵过程分为三个阶段，第一阶段(0～24h)：0～10h静止培养，物料升温后间断通风降温使物料温度控制在25～30℃；12～24h第一次翻曲，并将温度控制在25℃～28℃；第二阶段(24～100h):24～30h第二次翻曲，并将温度控制在26℃～27℃；之后每15h翻曲一次，并间隔一次补加无菌水100Kg，将温度控制在25℃～27℃；第三阶段(100h以后)：100h后不再补水，保持温度控制在26℃～28℃，直至发酵结束，得到含有球毛壳菌株61239的发酵液；其中，固体发酵培养基的获得：在6m3蒸煮锅内加入500Kg玉米粉和500Kg过60目玉米秸秆粉，5Kg KH2PO4和550Kg水，搅拌均匀后，直接蒸汽加热至121℃，保温40min后冷却至28℃制成。
(4)微生物菌剂的制备：将发酵物阴干或在在30℃烘干，粉碎过100目，然后以拉开粉bx为湿润剂，以十二烷基硫酸钠为乳化发泡剂，以木质素磺酸钙为分散剂，以硅藻土为载体填料制成球毛壳孢子粉可湿性粉剂。
实施例4：微生物菌剂对苹果腐烂病的离体防效和田间防治效果
采用打孔法接种红富士苹果离体枝条。采集长势一致的2-3a红富士苹果枝条，将其截成40cm长的小段，用75％乙醇进行表面消毒，然后用灭菌水冲洗干净，在超净工作台上吹干，枝条顶端用石蜡封顶。再用6mm打孔器在枝条上取下树皮块，分别接种同样大小的菌饼，以长满菌丝的一面紧贴伤口部位。试验分先接生防菌、1d后再接腐烂病菌或同时接种二种菌饼或先接腐烂病菌、1d后再接生防菌，共三种处理。接种后在接种点上方1-2cm处用湿脱脂棉团保湿。外围再用塑料薄膜包扎。25℃恒温暗培养14d后测量病斑大小，计算病斑面积和防治效果。
球毛壳菌61239对苹果树腐烂病的离体防治效果，如图2示，在25℃恒温暗培养14d后，只接腐烂病菌的对照组病斑直径由5mm平均扩展至30.2mm。而只要在伤口处接种球毛壳菌61239的，不论接种顺序如何，25℃恒温暗培养14d后，枝条上的伤口直径已小于5mm，而且伤口边缘出现愈伤组织，伤口表面出现球毛壳菌61239的黑色子囊果，防效达到100％。
田间防治试验采用球毛壳菌61239制成的菌剂。秋季在苹果采收后，用液体石蜡拌以球毛壳菌61239制成的菌剂涂抹腐烂病疤，次春腐烂病发病高峰期调查病疤的复发状况，结果表明凡涂抹菌剂的腐烂病疤，较空白对照的62.67％复发率，仅有一个病疤的一角出现腐烂病，平均防效达99.34％。同时剥取伤口边缘处的老翘皮带回室内保湿培养，结果又长出了球毛壳菌的菌丝和黑色子囊果，见图3，由图3可知，生防球毛壳菌61239已在原有的腐烂病病疤处定殖了下来，能长期发挥作用。
Claims (7)
1.一种防治苹果树腐烂病的球毛壳菌(Chaetomium globosum)菌株61239，其特征在于，所述菌株61239已于2015年7月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC ，保藏编号为CCTCC M2015420。
2.一种防治苹果树腐烂病的微生物菌剂，其特征在于，将权利要求1所述的球毛壳菌菌株61239经固体发酵得到发酵物，阴干或在20～40℃烘干，粉碎，然后与湿润剂、发泡剂、分散剂和填料混合，制成可湿性菌剂。
3.根据权利要求2所述的防治苹果树腐烂病的微生物菌剂，其特征在于，所述湿润剂为二异丁基萘磺酸钠；所述发泡剂为十二烷基硫酸钠；所述分散剂为木质素磺酸钙；所述填料为硅藻土。
4.一种如权利要求2或3所述的防治苹果树腐烂病的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 一级种子培养：将权利要求1所述的球毛壳菌株61239斜面孢子接到已灭菌好一级种子培养基中，在培养温度32～36℃，通气量1：0.4～0.8v/v/min并搅拌的条件下培养45～60hr；
(2)二级种子培养：按接种量5～15％接入到灭菌好的二级种子培养基中，在培养温度32～36℃，通气量1：0.8～1.2v/v/min并搅拌的条件下培养20～30hr，得到二级种子；
(3)固体发酵培养：在灭菌后冷却至25～30℃的固体发酵培养基中按4～6％比例接入二级种子，混合后放入固体发酵罐内培养，第一阶段：0～10h静止培养，物料升温后间断通风降温使物料温度控制在25～30℃；12～24h第一次翻曲，并将温度控制在25℃～28℃；第二阶段:24～30h第二次翻曲，并将温度控制在26℃～27℃；之后每15h翻曲一次，并间隔一次补加无菌水100Kg，将温度控制在25℃～27℃；第三阶段：100h后不再补水，保持温度控制在26℃～28℃，直至发酵结束，得到含有球毛壳菌株61239的发酵液；
(4)微生物菌剂的制备：将发酵物阴干或在在20～40℃烘干，粉碎过90～120目，然后与湿润剂、发泡剂、分散剂和填料混合，制成可湿性菌剂。
5.根据权利要求4所述的防治苹果树腐烂病的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述一级种子培养基是由500ml三角瓶加入50g大麦和40g水，pH自然，搅拌均匀后，在121℃灭菌40min制成。
6.根据权利要求4或5所述的防治苹果树腐烂病的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，二级种子培养基是由5Kg大麦和4Kg水，拌匀后，在121℃灭菌40min，冷却后接入50g一级种子,平均装入4个曲盘，置于28℃±1曲房中培养5天，期间补加无菌水1～2次，每间隔1天翻曲一次制成。
7.根据权利要求4或5所述的防治苹果树腐烂病的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述固体发酵培养基是在6m3蒸煮锅内加入500Kg玉米粉和500Kg过60目玉米秸秆粉，5Kg KH2PO4和550Kg水，搅拌均匀后，直接蒸汽加热至121℃，保温40min后冷却至28℃制成。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20190405 Termination date: 20191109 |