CN104025928B - 一种鉴定籽莲品种对镰刀菌腐败病抗病性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定籽莲品种对镰刀菌腐败病抗病性的方法。属于水生蔬菜植物保护技术领域。本发明应用莲子萌发长出3‑5条幼根的实生苗，剪去根尖后浸根接种腐败病病原菌。接种后的实生苗进行盆栽，并于接种后20‑25d，按照莲藕腐败病叶片症状分级标准，对病害等级进行鉴定，进而确定籽莲品种对腐败病菌的抗病能力。目前尚未见籽莲品种抗镰刀菌腐败病的鉴定方法，本发明实现了不同籽莲品种对腐败病抗性的快速、准确鉴定。
Description
技术领域
本发明属于水生蔬菜的植物保护技术领域；具体涉及鉴定籽莲品种对镰刀菌腐败病抗病性的方法。
背景技术
籽莲属睡莲科植物，是“中国莲”三大品系(藕莲、籽莲、花莲)栽培品种之一，因其具有观赏价值高的莲花、味美可口的鲜食嫰籽、可加工成各种营养丰富食品的老熟莲子，在我国具有十分悠久的种植历史。近年来，随着种植业结构调整，我国的籽莲种植面积有了较大幅度增加，已成为莲农创收的重要途径。
籽莲从浮叶生出到莲蓬采收的整个生育期，都会受到腐败病的为害，该病可使籽莲地下茎腐烂坏死地上部枯萎，一般造成籽莲减产20％-45％，严重时达60％以上，甚至绝收，严重影响了莲子的品质和产量。莲腐败病主要是由镰刀菌属真菌侵染引起的一种土传病害，由于该病首先为害籽莲的地下茎(藕节)，地下部受到病原菌的侵染出现病变后，病茎生出的地上部叶片和叶柄才逐渐显症。莲镰刀菌腐败病发生的种植环境特殊性及地上部显症明显的滞后性，以及荷叶特殊的纳米结构使得药液难附着性，都增加了该病的防治难度，使得常规的防治措施很难取得较好的防控效果。因此，筛选、选育和种植抗病品种是防治该病经济有效的方法之一，其中建立便利高效的籽莲抗腐败病的鉴定评价体系和方法，是开展该项工作的基础。而目前，国内尚未见鉴定籽莲品种对镰刀菌腐败病抗病性方法的报道。
发明内容
本发明的目的是针对目前莲腐败病为害日益严重而常规防治方法难以取得理想防治效果的现状，提供一种籽莲品种对镰刀菌腐败病抗性鉴定的体系和方法，以获得籽莲抗腐败病的种质资源和育种材料，实现筛选、选育和利用籽莲抗病品种防治腐败病的目的。
本发明的目的是通过以下方式实现的：
一种鉴定籽莲品种对镰刀菌腐败病抗病性的方法：1)选择待鉴定籽莲品种的颗粒饱满、充分成熟的当年莲子，将莲子种脐一端的果皮破一小口；再将破口的莲子进行催芽；2)待莲子萌发长出带根的实生苗接种莲腐败病病原菌；3)将接种后的实生苗移栽栽培，按照病害评价等级对叶片进行病害等级鉴定，据此确定植株品种的抗病能力。
所述的莲真菌性腐败病病原菌为尖孢镰刀菌莲专化型((Fusarium.oxysporumSchl.sp.nelumbicola(Nis.et Wat.)Booth))，是从籽莲发病植株上分离纯化，经过分子鉴定，并接种于新鲜藕块上筛选出的强致病性菌株。
接种新鲜藕块筛选出强致病性菌株的过程为：经过分离纯化和分子鉴定的供试镰刀菌用PDA培养基培养5d后，用直径为7mm的无菌打孔器自菌落的边缘打取菌饼，置于藕块(取嫩藕节，中间段的6-8cm，纵剖获得)的中央，菌丝体面朝下，每个藕块上均匀接种两个镰刀菌菌饼，然后将装有已接种藕块的发芽盒放置于26℃恒温培养箱中进行保湿培养；依据发病藕块的病情程度来判断选取强致病性菌株作为籽莲品种抗病菌鉴定的接种菌株。
接种新鲜藕块后依据发病藕块的病情程度来判断菌株的致病力强弱，病情分级标准为：0级：藕块生长正常、完好；1级：藕块有轻微病变，病变尚未侵及藕块体内组织；2级：藕块组织有明显病变，维管束呈褐色；3级：藕块维管束呈深褐色，病变部分占藕块总面积的10％以下；4级：病变部分占藕块总面积的10％～30％；5级：病变部分占藕块总面积的30％以上。每个藕块为一计量单位，每个病原菌接种18个藕块。病情指数＝∑(各级藕块数×相对级数值)/(调查总藕块数×5)×100；其致病力强弱的划分标准：当病情指数>70时，表示强致病力；当30≤病情指数≤70时，表示中致病力；当病情指数<30时，表示弱致病力；病情指数为0时，表示无致病力。
上述方法中待莲子萌发长出直立的幼叶、生根3-5条时，接种莲腐败病病原菌。
上述方法中将破口的莲子浸在灭菌水中，25℃条件下催芽，每天换水一次。
上述方法中莲腐败病病原菌在超净工作台上按以下操作进行接种：将每条根在距根尖0.5cm处剪断，以造成根系的微伤口，然后将整个根系浸入由无菌水调节的含105-106个孢子/mL莲腐败病菌悬浮液中20-40min。
上述方法中将接种后的实生苗移栽于盆钵中栽培，接种至少20d后，按照病害评价等级标准对叶片进行病害等级鉴定，鉴定后计算病情指数，病情指数＝∑(各级病叶数×相对级数值)/(调查总叶片数×6)×100，依据病情指数，确定籽莲品种对腐败病的抗病性类型。
病害评价等级分为1-6级，具体是：0级-植株叶片未见任何发病症状；1级-叶片仅叶缘出现零星病斑，病斑面积不超过叶该叶片总面积的5％；2级-病斑沿叶缘连片，并向叶片中心发展，病斑面积占该叶片总面积的5％-20％；3级-病斑面积占该叶片总面积的20％-40％；4-病斑面积占该叶片总面积的40％-60％；5级-病斑面积占该叶片总面积的60％-80％；6级-病斑面积占该叶片总面积的80％-100％，叶片褐腐死亡。
籽莲不同品种对腐败病的抗性评价根据病情指数分成6个等级：高抗(HR)≤10；10＜抗病(R)≤20：20＜中抗(MR)≤40；40＜中感(MS)≤60；60＜感病(S)≤80；80＜高感(HS)≤100。
本发明可达到以下有益效果：
本发明首次针对目前莲镰刀菌腐败病为害日益严重而常规防治方法难以取得理想防治效果的现状，提供一种籽莲品种对该病抗性的鉴定体系和方法，以实现筛选、选育和利用籽莲抗病品种防治腐败病的目的。本发明能在较小的面积(盆栽)、较短时间里(鉴定时间周期一般为20d)连续、大量的鉴定不同籽莲品种对腐败病的抗性；鉴定结果容易观察；在一年中可进行多次重复试验，所得结果可靠性好。
附图说明
图1腐败病菌强致病性菌株筛选的接种试验；
图2应用接种腐败病菌的莲实生苗；
图3接种后移栽到盆中的部分实生苗；
图4接种后15d不同品种发病程度(部分重复)；
图5接种后30d不同品种发病程度(部分重复)；
图6破壳莲子浸泡接种后直接盆栽；
图7莲子浸泡接种30d后不同品种发病程度。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例1：
1.供试籽莲腐败病病原菌的分离与鉴定
供试病原菌分离于湖南长沙县、沅江县和湘潭县等地的籽莲种植田中腐败病发病植株。
所述分离步骤如下：
(1)将带病籽莲植株发病部位用清水洗净，用灭菌过的剪刀剪成约2mm2的小块或小片；
(2)置于75％的酒精中进行表面消毒，10s后再置于0.1％的酸性升汞水溶液中3-5min，而后用无菌水漂洗3次；
(3)利用灭菌过的吸水纸吸干漂洗后的病组织表面残留的无菌水后，移入含农用链霉素(40μg/ml)的PDA培养基中，于25℃的恒温培养；
(4)5d后挑取藕块上所有生长菌落边缘的少量菌丝，接种到PDA培养基上进一步纯化培养，观察菌株的培养性状并进行显微镜检查，以初步判断分离物的纯化性。再将分离物产生的孢子用灭菌水洗下，适当稀释后(大致稀释到每个培养皿中只有30个左右的孢子)，取一定量的孢子悬浮液与融化后冷却到45℃左右的琼脂培养基充分混合，倒在培养皿中，25℃恒温培养，从形成的单个分散的菌落上移植菌丝体培养。将分离纯化的单菌落培养物回接到健康的籽莲植株上，待籽莲植株表现出腐败病典型症状时，对发病组织重复上述方法的病原菌的分离，检测是否获得与出发病原微生物相同的纯培养物，如相同则初步确定分离获得腐败病病原菌。
(5)提取病原菌DNA，利用真菌的ITS序列扩增引物ITS1和ITS4进行PCR扩增，通过对PCR扩增产物切胶回收并测序，再结合NCBI数据库进行序列比对，从DNA分子水平上确定莲腐败病病原菌为尖孢镰刀菌莲专化型。
2.籽莲腐败病病原菌强致病性菌株的筛选
供试籽莲腐败病镰刀菌病原菌用PDA培养基培养5d后，用无菌打孔器自菌落的边缘取7mm的菌饼，纵剖切取大小一致的新鲜藕块，将菌饼置于藕块的中央位置，菌丝体面朝下，每个藕块等距离接种两个镰刀菌菌饼，然后将装有已接种藕块的发芽盒放置于26℃恒温培养箱中保湿培养5-7d，按下述分级标准调查藕块发病情况：0级：藕块生长正常、完好；1级：藕块表面有轻微病变，病变尚未侵及藕块体内组织；2级：藕块组织有明显病变，维管束呈褐色；3级：藕块维管束呈深褐色，病变部分占藕块总面积的10％以下；4级：藕块维管束呈深褐色，病变部分占藕块总面积的10％～30％；5级：藕块维管束呈深褐色，病变部分占藕块总面积的30％以上。每个藕块为一计量单位，每种病原菌接种20个藕块。病情指数＝∑(各级藕块数×相对级数值)/(调查总藕块数×5)×100；其致病力强弱的划分标准：病情指数>70，表示强致病力；30<病情指数≤70，表示中致病力；病情指数≤30，表示弱致病力；病情指数为0，表示无致病力。选取强致病性菌株作为籽莲品种抗病菌鉴定的接种菌株。
3.不同籽莲品种抗腐败病的人工接种
在湖南省湘潭地区白石镇、石鼓镇、乌石镇籽莲主种植区，选取对莲腐败病表现不同抗性的本地籽莲品种，无具体名称，本发明中将其分别命名为湘莲1，2，3，4号。其中湘莲1号在主栽地表现为感病品种，田中最高发病率可达75％以上；湘莲2号和3号在主栽地表现为中抗品种，田中发病率一般为25％-40％；湘莲4号在主栽地表现为高抗品种，田中最高发病率一般为5％-8％。将四个品种饱满的当年生的莲子，用尖嘴钢钳把含莲子种脐一端破一小口后，将种子完全浸没于无菌水中。待种子发芽后，将发芽莲子移植大试管中，每试管装一株莲子苗，倒入仅浸没莲子的灭菌水，置于25℃条件下生长，当发芽的莲子长至具3-5条根的实生苗(此时一般有3-5片叶)时，用灭菌的剪刀将每条跟在距根尖0.5cm处剪断，以造成根系的微伤口，然后将整个根系浸入由无菌水调节的含1╳106个孢子/mL莲腐败病菌悬浮液中30min，以浸泡等体积的无菌水为对照。
4.不同籽莲品种抗腐败病的抗性测定
将接种后的供试品种实生苗移栽于装有菜园土的盆钵中，每盆栽10株，设4个重复，按籽莲正常生长需求进行水肥管理。分别于接种10d，15d，20d,25d，30d后，按照以下病害评价等级对叶片发病情况进行调查：0级：植株叶片未见任何发病症状；1级：叶片仅叶缘出现零星病斑，病斑面积不超过叶该叶片总面积的5％；2级：病斑沿叶缘连片，并向叶片中心发展，病斑面积占该叶片总面积的5％-20％；3级：病斑面积占该叶片总面积的20％-40％；4：病斑面积占该叶片总面积的40％-60％；5级：病斑面积占该叶片总面积的60％-80％；6级：病斑面积占该叶片总面积的80％-100％，叶片褐腐死亡。本试验中籽莲每个品种评价的总叶片数为50片。根据调查数据计算发病率和病情指数。其中发病率％＝病叶数/调查总叶数×100；病情指数＝∑(各级病叶数×相对级数值)/(调查总叶数×6)×100。籽莲不同品种对腐败病的抗性评价根据病情指数分成6个等级：高抗(HR)≤10；10＜抗病(R)≤20：20＜中抗(MR)≤40；40＜中感(MS)≤60；60＜感病(S)≤80；80＜高感(HS)≤100。
表1不同籽莲品种不同接种时期发病情况
注：表中同列数值后不同字母表示差异达到显著水平/0.05
试验结果显示，本发明一种快速鉴定、筛选籽莲腐败病抗病品种的方法，通过盆栽试验结果(表1)对比，4个不同抗性品种的病情指数的变化趋势与依据发病率所判断的抗病程度的结果基本一致，也与相应的田间病害发生程度的评价一致。根据前述的田间试验籽莲对腐败病抗感病的划分标准，确定湘莲1号为中感类型；湘莲2号和3号为中抗类型；湘莲4号为高抗类型。在接种后10天，田间抗性表现不同的品种，在盆栽试验发病率上已显示出抗性的区别，但病情指数尚未有显著的差别；随着病情发展，在20d时，不同抗性品种间的发病率和病情指数已呈现显著差异，但20-25d不同抗性品种间的发病率差异又渐趋于不显著，而通过病情指数所确定的各品种的抗性能力已很稳定，20d、25d与30d抗性评价结果均完全一致，说明应用病情指数鉴定品种对腐败病的抗病性较应用发病率鉴定更为准确和科学，在接种后20-25d通过比较病情指数，能完全区分出籽莲不同品种间对腐败病抗性的差异。本试验中4个品种对腐败病抗性鉴定结果与田间抗病表现完全吻合，证明应用本发明提供的鉴定方法能够快速、准确地鉴定出不同籽莲品种对镰刀菌腐败病的抗性能力，可为大量筛选籽莲腐败病抗病品种提供一个良好依据。
同时本申请人曾尝试过对莲子破壳处理后，即刻将莲子浸泡于盛有腐败病菌孢子悬浮液(孢子悬浮液的浓度为106个/ml)的发芽盒中进行浸泡2h接种，然后将接种后莲子直接播于栽培缸中(图6)，30d后按前述方法调查实生苗叶片发病情况，计算发病率和病情指数(图7)。
试验结果见表2：
试验结果表明，应用莲子实生苗根部微创接种腐败病菌，比用莲子浸泡接种，更易发病，更易区别不同籽莲品种间的抗病性差异。
Claims (4)
1.一种鉴定籽莲品种对镰刀菌腐败病抗病性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)选择待鉴定籽莲品种的颗粒饱满、充分成熟的当年莲子，将含莲子种脐一端的种壳破一小口；将破口的莲子在灭菌水中，24-26℃条件下催芽，每天换水一次；
2)待莲子萌发长出直立的幼叶、生根3-5条时，在超净工作台上将每条根在距根尖0.5cm处剪断，以造成根系的微伤口，然后将整个根系浸入由无菌水调节的含105-106个孢子/mL莲腐败病病原菌悬浮液中20-40min；
3)将接种后的实生苗移栽于盆钵中栽培，接种至少20d后，按照病害评价等级对叶片进行病害等级鉴定，鉴定后计算病情指数，病情指数＝∑(各级病叶数×相对级数值)/(调查总叶片数×6)×100，依据病情指数，确定籽莲品种对腐败病的抗病性类型；
病害评价等级分为1-6级，具体是：0级-植株叶片未见任何发病症状；1级-叶片仅叶缘出现零星病斑，病斑面积不超过叶该叶片总面积的5％；2级-病斑沿叶缘连片，并向叶片中心发展，病斑面积占该叶片总面积的5％-20％；3级-病斑面积占该叶片总面积的20％-40％；4-病斑面积占该叶片总面积的40％-60％；5级-病斑面积占该叶片总面积的60％-80％；6级-病斑面积占该叶片总面积的80％-100％，叶片褐腐死亡；
籽莲不同品种对腐败病的抗性评价根据病情指数分成6个等级：高抗≤10；10＜抗病≤20：20＜中抗≤40；40＜中感≤60；60＜感病≤80；80＜高感≤100。
2.根据权利要求1所述的鉴定籽莲品种对镰刀菌腐败病抗病性的方法，其特征在于：镰刀菌腐败病病原菌为尖孢镰刀菌莲专化型，是从籽莲发病植株上分离纯化，经过分子鉴定，并接种于新鲜藕块上筛选出的强致病性菌株。
3.根据权利要求2所述的鉴定籽莲品种对镰刀菌腐败病抗病性的方法，其特征在于：接种新鲜藕块筛选出强致病性菌株的过程为：经过分离纯化和分子鉴定的供试镰刀菌菌株用PDA培养基培养5-6d，取嫩藕节6-8cm长的中间段，纵剖切取获得用于接种的藕块；用直径为5-7mm无菌打孔器自菌落的边缘打取菌饼，菌饼置于藕块的中央，菌丝体面朝下，每个藕块均匀接种两个镰刀菌菌饼，然后将装有接种藕块的发芽盒放置于24-26℃恒温培养箱中进行保湿培养；依据发病藕块的病情程度来判断、选取强致病性菌株作为籽莲品种抗病菌鉴定的接种菌株。
4.根据权利要求3所述的鉴定籽莲品种对镰刀菌腐败病抗病性的方法，其特征在于：接种新鲜藕块依据发病藕块的病情程度来判断菌株的致病力强弱，病情分级标准为：0级：藕块生长正常、完好；1级：藕块表面有轻微病变，病变尚未侵及藕块体内组织；2级：藕块组织有明显病变，维管束呈褐色；3级：藕块维管束呈深褐色，病变部分占藕块总面积的10％以下；4级：藕块维管束呈深褐色，病变部分占藕块总面积的10％～30％；5级：藕块维管束呈深褐色，病变部分占藕块总面积的30％以上，每个藕块为一计量单位；病情指数＝∑(各级藕块数×相对级数值)/(调查总藕块数×5)×100；腐败病病原菌致病力强弱的划分标准：病情指数>70，表示强致病力；30≤病情指数≤70，表示中致病力；病情指数<30，表示弱致病力；病情指数为0，表示无致病力。
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