CN107211882A - 一种利用根腐病菌粗毒素快速筛选小麦根腐病抗性品种的育种方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用根腐病菌粗毒素快速筛选小麦根腐病抗性品种的育种方法，步骤如下：（1）选取待改良小麦品种/系和小麦根腐病抗源，杂交获得F1；（2）F1回交获得BCF1；（3）分期播种父母本和BCF1；（4）梯度浓度的根腐病菌粗毒素处理父母本，选定根腐病抗性筛选压；（5）根腐病抗性筛选压处理BCF1，获得BCF2；（6）取BCF2进行花药培养获得花培家系，根腐病抗性、农艺性状筛选获得根腐病抗性小麦新品系。本发明通过优选适宜浓度的根腐病菌粗毒素处理杂交种对根腐病菌粗毒素的超敏时期‑受精卵第一次分裂期，从而特异性筛选根腐病抗性小麦家系，大大提高了根腐病抗性育种的工作效率和准确度。

Description

一种利用根腐病菌粗毒素快速筛选小麦根腐病抗性品种的育 种方法

技术领域

本发明涉及农业科学技术领域，尤其是指一种通过优选适宜浓度的根腐病菌粗毒素处理杂交种对根腐病菌粗毒素的超敏时期-受精卵第一次分裂期、从而特异性筛选根腐病抗性小麦家系、大大提高了根腐病抗性育种的工作效率和准确度的利用根腐病菌粗毒素快速筛选小麦根腐病抗性品种的育种方法。

背景技术

小麦根腐病（wheat root rot）又称根腐叶斑病或黑胚病，属于土传真菌病害，可在小麦的全生育期内发病，可以危害小麦根茎部，引起根腐，也可以危害小麦的叶部，引起叶斑，亦能危害小麦籽粒，引起黑胚。该病分布在亚洲、北美洲、南美洲和欧洲等许多国家，属于全世界性病害。在我国东北、华北、西北地区、内蒙古等地区发生严重，近年来不断扩大，广东、福建麦区也有发现。

小麦根腐病症状因气候条件而不同。在干旱半干旱地区，多引起茎基腐、根腐；多湿地区除以上症状外，还引起叶斑、茎枯、穗颈枯。小麦根腐病是小麦全生育期病害。幼苗受侵，芽鞘和根部变褐甚至腐烂；严重时，幼芽不能出土而枯死。在分蘖期，根茎部产生褐斑，叶鞘发生褐色腐烂，严重时也可引起幼苗死亡。成株期在叶片或叶鞘上，最初产生黑褐色梭形病斑，以后扩大变为椭圆形或不规则形褐斑，中央灰白色至淡褐色，边缘不明显，叶鞘上的病斑还可引起茎节发病。穗部发病，一般是个别小穗发病，小穗梗和颖片变为褐色，在湿度较大时，病斑表面也产生黑色霉状物，有时会发生穗枯或掉穗。种子受害时，病粒胚尖呈黑色，重者全胚呈黑色。根腐病除发生在胚部以外，也可发生在胚乳的腹背或腹沟等部分。

小麦根腐病患病田块轻者一般减产5%～10%，重则减产20%～50%。在墨西哥，小麦根腐病部分地区发病严重，对麦类作物可造成减产高达43.2%。在赞比亚，由麦根腐离蠕孢引起的小麦根腐病造成过85%的产量损失。在我国，河北张家口地区小麦根腐病曾造成高达20%～30%的损失。麦类根腐病症状复杂，损失较大，不仅影响产量，还可以产生毒素，严重降低小麦的品质和商品价值。近年来，由于秸秆持续还田等原因，小麦根腐病在北方地区的发生逐年加重，部分地区造成严重危害，已经成为小麦生产上的重要问题。

随着人们对小麦根腐病认识的逐渐加深，对根腐病的防治也越来越受到重视。小麦根腐病防治措施主要包括农业防治、化学防治和生物防治三个方面。通过耕作制度和栽培方式的改变，在一定程度上可以减轻小麦根腐病的发生及危害程度，但难以从根本上消除病害的蔓延和危害。利用科学预报，并在恰当时段内采用化学药剂防治的手段，对防控小麦根腐病的发生和危害具有一定的效果，然而化学药剂防治不仅会增加农业生产成本，降低小麦生产效益，还不可避免地会造成农业环境污染。环境微生物和植物提取物也常被用来防治小麦根部病害，生物防治具有环保污染小的优点，但生物防治治理效果有待提高，而且成本较高，难以产业化推广。

利用抗病品种是防治小麦根腐病的主要措施之一，培育和种植小麦根腐病抗病品种是控制小麦根腐病危害最为经济环保的有效途径。国内外对麦类品种抗根腐病的研究共同表明，生产上推广的小麦品种大部分表现为感病或高感，只有少量属于抗病品种，高抗品种很少。随着小麦根腐病的不断加重，对该病的研究和防治工作亟待加强。而且目前该地区推广的品种对小麦根腐病的抗性尚不明确，给利用品种抗性防治该病带来一定困难。由于该病病原菌麦根腐离蠕孢易发生遗传变异，容易导致致病力分化和强致病力菌株出现，原有抗病品种的抗性丧失，给抗病品种的筛选和新品种培育带来了一定的困难。目前小麦根腐病抗性改良进程较慢，难以满足生产上对抗性品种的要求。

发明内容

本发明的目的是针对目前小麦根腐病抗性鉴定工作量大、抗病育种进程缓慢的缺陷，提供了一种通过优选适宜浓度的根腐病菌粗毒素处理杂交种对根腐病菌粗毒素的超敏时期-受精卵第一次分裂期、从而特异性筛选根腐病抗性小麦家系、大大提高了根腐病抗性育种的工作效率和准确度的利用根腐病菌粗毒素快速筛选小麦根腐病抗性品种的育种方法。

本发明的目的是通过以下技术方案解决的：

一种利用根腐病菌粗毒素快速筛选小麦根腐病抗性品种的育种方法，其特征在于：该育种方法的步骤如下：

（1）选取待改良小麦品种/系和小麦根腐病抗源，杂交获得F1：选择农艺性状优良、根腐病抗性待改良的小麦品种/系作为杂交母本，选择高抗根腐病的小麦根腐病抗源作为杂交父本，大田种植父母本，抽穗后杂交获得F1；

（2）F1回交获得BCF1：将上步收获的F1杂交种和母本大田种植，抽穗后回交获得BCF1杂交种；

（3）分期播种父母本和BCF1：大田正季种植杂交父本、母本和BCF1杂交种，分期播种，父母本提前播种，使父母本的抽穗期比BCF1杂交种早15～25天；

（4）梯度浓度的根腐病菌粗毒素处理父母本，选定根腐病抗性筛选压：采用梯度浓度的根腐病菌粗毒素分别处理父本和母本抽穗期植株的小花，处理完成后将植株回栽到大田，待小麦籽粒进入“多半仁”期时即统计籽粒结实率，由于父本的根腐病抗性要远远高于母本，因此父本自交受精卵对根腐病菌粗毒素的耐性要高于母本自交受精卵，选择母本小麦籽粒结实率为0且20%＜父本小麦籽粒结实率＜50%的浓度的根腐病菌粗毒素作为根腐病抗性筛选压；

（5）根腐病抗性筛选压处理BCF1，获得BCF2：采用根腐病抗性筛选压处理抽穗期BCF1杂交种小麦植株小花，处理完成后将植株回栽到大田，结实后收种，获得BCF2；

（6）取BCF2进行花药培养获得花培家系，根腐病抗性、农艺性状筛选获得根腐病抗性小麦新品系：BCF2大田种植，正季农艺性状筛选淘汰部分BCF2（如株高不适、分蘖力差、抽穗期过迟），抽穗后取花药进行培养获得花培家系，花培家系大田种植，以待改良小麦品种/系和小麦根腐病抗源亲本为对照，根腐病抗性鉴定各家系综合感病指数、农艺性状筛选获得农艺性状良好且根腐病抗性得到改良的根腐病抗性小麦新品系。

所述步骤（1）中的农艺性状优良、根腐病抗性待改良的小麦品种/系是指产量高、米质优良、抗倒伏、根腐病抗性有待改良的小麦品种/系；小麦根腐病抗源是指根腐病抗性鉴定试验中，综合感病指数不高于抗病对照郑麦9962感病指数的小麦品种/系。

所述的根腐病菌粗毒素的制备方法为：将小麦根腐病菌活化后转接于PDA培养基，28℃下暗培养7d，然后取菌落边缘菌丝按照30cm²菌丝/L液体培养基的比例接种菌丝到改良Fries液体培养基中，置于摇床中70r/min、28℃暗培养21d，待菌丝长成菌球后，用纱布过滤，滤出菌丝和菌球，然后将滤液3000r/min离心30m，弃沉淀，得毒素上清液；分别将上清液与等体积的乙酸乙酯、乙醇混合，萃取分层后，移出有机相，继续对水相进行萃取，连续萃取2次，将有机相和水相萃取液在38℃条件下减压蒸馏，残渣用无菌水溶解，定容至毒素上清液的1/100，即为根腐病菌粗毒素原液。

所述的根腐病菌粗毒素和根腐病抗性筛选压处理抽穗期小麦植株小花的具体操作流程为：前天下午挖取小麦抽穗期植株，于当天晚上剪掉已经开花的小花，第2天下午开花后再剪掉未开花的幼嫩的小花，只留取当天开花的小穗用于根腐病菌粗毒素浸泡处理，浸泡处理时间为挖取植株的第2天晚上18点到第3天早上8点，浸泡结束后将麦穗用流水冲洗10min。

所述的综合感病指数的获取方法为：小麦根腐病抗性鉴定试验中，发病盛期调查叶病情严重度2～3次，叶部病情严重度分5个标准级别：

0级：旗叶无病或上部第二叶偶有小病斑，占叶面积≤5%；

l级：旗叶有个别小病斑，5%＜占叶面积≤15%；

2级：旗叶病斑较多，15%＜占叶面积≤45%；

3级：旗叶病斑很多，45%＜占叶面积≤75%，部分叶片枯死；

4级：全株病斑密集，病斑大而连片，占叶面积＞75%，叶片大部分枯死；

计算叶感病指数，叶感病指数=各级病叶数（0～4）×相应级别的总和/（调查叶数×4）；

待鉴定小麦材料按穗收种，脱粒后调查黑胚粒率，穗部病情严重度按黑胚粒率分5个标准级别：

0级：黑胚粒率≤2%；

l级：2%＜黑胚粒率≤10%；

2级：10%＜黑胚粒率≤25%；

3级：25%＜黑胚粒率≤45%；

4级：黑胚粒率＞45%；

计算穗感病指数，穗感病指数=各级病穗数（0～4）×相应级别的总和/（调查穗数×4）；

然后计算综合感病指数，综合感病指数=1/2（叶感病指数+穗感病指数）。

本发明相比现有技术有如下优点：

本发明的利用根腐病菌粗毒素快速筛选小麦根腐病抗性品种的育种方法与常规育种方法相比，成功挖掘到根腐病菌粗毒素对小麦籽粒发育的超敏时期-受精卵第一次分裂期，进而发现小麦家系植株对根腐病菌粗毒素抗性与小麦家系受精卵第一次分裂期根腐病菌粗毒素耐性间具有良好的相关性。本发明进一步通过优选适宜浓度的根腐病菌粗毒素处理抽穗期受精卵第一次分裂期的杂交种植株小花，从而特异性筛选到高抗根腐病的小麦育种家系，从源头上大大减少了筛选工作量，从而大大提高了根腐病抗性鉴定的工作效率和准确度，具有较大的育种应用价值。

附图说明

附图1为本发明的利用根腐病菌粗毒素快速筛选小麦根腐病抗性品种的育种方法的技术路线图。

具体实施方式

下面结合附图1与实施例对本发明作进一步的说明。

如图1的技术路线图所示：一种利用根腐病菌粗毒素快速筛选小麦根腐病抗性品种的育种方法，其特征在于：该育种方法的步骤如下：

（1）选取待改良小麦品种/系和小麦根腐病抗源，杂交获得F1：

选择农艺性状优良、根腐病抗性待改良的小麦品种/系，具体是指产量高、米质优良、抗倒伏、根腐病抗性有待改良的小麦品种/系，选择其作为杂交母本；小麦根腐病抗性鉴定试验中，发病盛期调查叶病情严重度2～3次，叶部病情严重度分5个标准级别：

0级：旗叶无病或上部第二叶偶有小病斑，占叶面积≤5%；

l级：旗叶有个别小病斑，5%＜占叶面积≤15%；

2级：旗叶病斑较多，15%＜占叶面积≤45%；

3级：旗叶病斑很多，45%＜占叶面积≤75%，部分叶片枯死；

4级：全株病斑密集，病斑大而连片，占叶面积＞75%，叶片大部分枯死；

计算叶感病指数，叶感病指数=各级病叶数（0～4）×相应级别的总和/（调查叶数×4）；

待鉴定小麦材料按穗收种，脱粒后调查黑胚粒率，穗部病情严重度按黑胚粒率分5个标准级别：

0级：黑胚粒率≤2%；

l级：2%＜黑胚粒率≤10%；

2级：10%＜黑胚粒率≤25%；

3级：25%＜黑胚粒率≤45%；

4级：黑胚粒率＞45%；

计算穗感病指数，穗感病指数=各级病穗数（0～4）×相应级别的总和/（调查穗数×4）；

然后计算综合感病指数，综合感病指数=1/2（叶感病指数+穗感病指数）；根腐病抗性鉴定试验中，综合感病指数不高于抗病对照郑麦9962感病指数的小麦品种/系确定为小麦根腐病抗源，选择其作为杂交父本，大田种植父母本，抽穗后杂交获得F1；

（2）F1回交获得BCF1：

将上步收获的F1杂交种和母本大田种植，抽穗后回交获得BCF1杂交种；

（3）分期播种父母本和BCF1：

大田正季种植杂交父本、母本和BCF1杂交种，分期播种，父母本提前播种，使父母本的抽穗期比BCF1杂交种早15～25天；

（4）梯度浓度的根腐病菌粗毒素处理父母本，选定根腐病抗性筛选压：

制备根腐病菌粗毒素，具体制备方法为：将小麦根腐病菌活化后转接于PDA培养基， 28℃下暗培养7d，然后取菌落边缘菌丝按照30cm²菌丝/L液体培养基的比例接种菌丝到改良Fries液体培养基中，置于摇床中70r/min、28℃暗培养21d，待菌丝长成菌球后，用纱布过滤，滤出菌丝和菌球，然后将滤液3000r/min离心30m，弃沉淀，得毒素上清液；分别将上清液与等体积的乙酸乙酯、乙醇混合，萃取分层后，移出有机相，继续对水相进行萃取，连续萃取2次，将有机相和水相萃取液在38℃条件下减压蒸馏，残渣用无菌水溶解，定容至毒素上清液的1/100，即为根腐病菌粗毒素原液；

父母本抽穗后，采用梯度浓度的根腐病菌粗毒素分别处理父本和母本抽穗期植株的小花，具体操作流程为：前天下午挖取小麦抽穗期植株，于当天晚上剪掉已经开花的小花，第2天下午开花后再剪掉未开花的幼嫩的小花，只留取当天开花的小穗用于根腐病菌粗毒素浸泡处理，浸泡处理时间为挖取植株的第2天晚上18点到第3天早上8点，浸泡结束后将麦穗用流水冲洗10min；

处理完成后将植株回栽到大田，待小麦籽粒进入“多半仁”期时即统计籽粒结实率，由于父本的根腐病抗性要远远高于母本，因此父本自交受精卵对根腐病菌粗毒素的耐性要高于母本自交受精卵，选择母本小麦籽粒结实率为0且20%＜父本小麦籽粒结实率＜50%的浓度的根腐病菌粗毒素作为根腐病抗性筛选压；

（5）根腐病抗性筛选压处理BCF1，获得BCF2：

采用根腐病抗性筛选压处理抽穗期BCF1杂交种小麦植株小花，处理完成后将植株回栽到大田，结实后收种，获得BCF2；

（6）取BCF2进行花药培养获得花培家系，根腐病抗性、农艺性状筛选获得根腐病抗性小麦新品系：

BCF2大田种植，正季农艺性状筛选淘汰部分BCF2（如株高不适、分蘖力差、抽穗期过迟），抽穗后取花药进行培养获得花培家系，花培家系大田种植，以待改良小麦品种/系和小麦根腐病抗源亲本为对照，根腐病抗性鉴定各家系综合感病指数、农艺性状筛选获得农艺性状良好且根腐病抗性得到改良的根腐病抗性小麦新品系。

实施例1

2009～2010年，在江苏省东辛农场试验田分别了采用郑麦9962（大田表现高抗小麦根腐病）、西农919（大田表现中感小麦根腐病）、周麦18（大田表现高感小麦根腐病）进行根腐病菌粗毒素处理小麦不同花药发育时期的试验。2009年秋季播种，2010年正季设置了梯度浓度的根腐病菌粗毒素分别处理5个小麦不同花药发育时期进行试验，分别为未受精花粉期、受精卵第一次分裂期、受精后5天籽粒胚发育期、受精后15天籽粒“多半仁”期、受精后25天籽粒灌浆期。由于不同时期对根腐病菌粗毒素的敏感度不同，因此郑麦9962、西农919、周麦18小麦不同花药发育时期试验均设置了系列梯度浓度根腐病菌粗毒素进行试验。

提前制备根腐病菌粗毒素，具体制备方法为：将小麦根腐病菌活化后转接于PDA培养基， 28℃下暗培养7d，然后取菌落边缘菌丝按照30cm²菌丝/L液体培养基的比例接种菌丝到改良Fries液体培养基中，置于摇床中70r/min、28℃暗培养21d，待菌丝长成菌球后，用纱布过滤，滤出菌丝和菌球，然后将滤液3000r/min离心30m，弃沉淀，得毒素上清液；分别将上清液与等体积的乙酸乙酯、乙醇混合，萃取分层后，移出有机相，继续对水相进行萃取，连续萃取2次，将有机相和水相萃取液在38℃条件下减压蒸馏，残渣用无菌水溶解，定容至毒素上清液的1/100，即为根腐病菌粗毒素原液，置冰箱备用。

根腐病菌粗毒素处理未受精花粉具体操作流程为：下午挖取小麦抽穗期植株，当天剪掉已经开花的小花用于根腐病菌粗毒素浸泡处理，设置梯度浓度的根腐病菌粗毒素进行花药浸泡处理，浸泡处理时间为晚上18点到第2天早上8点，浸泡结束后将麦穗用流水冲洗10min；

根腐病菌粗毒素处理受精卵第一次分裂期花药的具体操作流程为：前天下午挖取小麦抽穗期植株，于当天晚上剪掉已经开花的小花，第二天下午开花后再剪掉未开花的幼嫩的小花，只留取当天开花的小穗用于根腐病菌粗毒素浸泡处理，浸泡处理时间为挖取植株的第2天晚上18点到第3天早上8点，浸泡结束后将麦穗用流水冲洗10min；

根腐病菌粗毒素处理受精后5天籽粒胚发育期花药的具体操作流程为：前天下午挖取小麦抽穗期植株，于当天晚上剪掉已经开花的小花，第2天下午开花后再剪掉未开花的幼嫩的小花，回栽到大田，第6天挖取回来进行根腐病菌粗毒素浸泡处理，浸泡处理时间为晚上18点到第2天早上8点，浸泡结束后将麦穗用流水冲洗10min；

根腐病菌粗毒素处理受精后15天籽粒“多半仁”期花药的具体操作流程为：前天下午挖取小麦抽穗期植株，于当天晚上剪掉已经开花的小花，第2天下午开花后再剪掉未开花的幼嫩的小花，回栽到大田，第16天挖取回来进行根腐病菌粗毒素浸泡处理，浸泡处理时间为晚上18点到第2天早上8点，浸泡结束后将麦穗用流水冲洗10min；

根腐病菌粗毒素处理受精后25天籽粒灌浆期花药的具体操作流程为：前天下午挖取小麦抽穗期植株，于当天晚上剪掉已经开花的小花，第2天下午开花后再剪掉未开花的幼嫩的小花，回栽到大田，第26天挖取回来进行根腐病菌粗毒素浸泡处理，浸泡处理时间为晚上18点到第2天早上8点，浸泡结束后将麦穗用流水冲洗10min。

小麦结实后统计梯度浓度根腐病菌粗毒素处理的5个小麦不同花药发育时期试验的郑麦9962、西农919和周麦18的籽粒结实率，统计结果如下表1～表5。

由上表1中根腐病菌粗毒素处理高抗、中感、高感根腐病代表品种郑麦9962、西农919和周麦18未受精花粉后统计所处理小麦的籽粒结实率可以发现，高抗、中感、高感根腐病代表品种郑麦9962、西农919和周麦18对根腐病菌粗毒素的敏感度出现明显的差异，但是浸泡的处理方式会严重降低小麦的籽粒结实率，因此小麦未受精花粉时期不宜采用根腐病菌粗毒素处理。

由表2到表5的对比可以发现，受精卵第一次分裂期、受精后5天籽粒胚发育期、受精后15天籽粒“多半仁”期和受精后25天籽粒灌浆期小麦籽粒结实率对根腐病菌粗毒素浸泡处理的敏感度迅速降低，而且高抗、中感、高感根腐病代表品种郑麦9962、西农919和周麦18之间根腐病菌粗毒素处理后相同水平的籽粒结实率表现所对应的根腐病菌粗毒素浓度差逐渐缩小，这反映出选择受精卵第一次分裂期小麦花药采用根腐病菌粗毒素处理既能最大程度的节约根腐病菌粗毒素，又是区分小麦品种间对根腐病抗感性差异的最佳时期。

实施例2

2010～2011年，利用征集的研究报道过的小麦根腐病高抗材料和本单位多年田间调查筛选的高抗材料共计12份，同时选择本单位筛选的大田表现中感、高感根腐病的小麦品种各4份，在江苏省东辛农场试验田进行根腐病菌粗毒素处理试验，试验时期选为小麦受精卵第一次分裂期。鉴于2009～2010年在小麦不同花药发育时期进行根腐病菌粗毒素处理试验中，10%稀释比例的粗毒素原液浓度对小麦品种间根腐病抗感性差异分化显著，因此优选10%稀释比例浓度的粗毒素进行试验。

同期进行大田病圃抗性鉴定试验，土质为壤土，肥力中等，耕地前每亩施用小麦复合肥（N：P：K=15：15：10）40 kg，将地块分成面积为1.5m²（1.5m×1m）的小区。每个小区间隔0.8m，将用小米培养基扩繁的病原菌接种物均匀地撒在麦沟里，每个小区15g，然后播种供试小麦品种。每个小区播种1个品种，种植5行，各品种重复3次。田间管理按照普通麦田管理办法，期间不再追施肥料，在小麦蜡熟期调查各品种发病情况，计算综合感病指数。

综合感病指数的获取方法为：小麦根腐病抗性鉴定试验中，发病盛期调查叶病情严重度2～3次，叶部病情严重度分5个标准级别：

0级：旗叶无病或上部第二叶偶有小病斑，占叶面积≤5%；

l级：旗叶有个别小病斑，5%＜占叶面积≤15%；

2级：旗叶病斑较多，15%＜占叶面积≤45%；

3级：旗叶病斑很多，45%＜占叶面积≤75%，部分叶片枯死；

4级：全株病斑密集，病斑大而连片，占叶面积＞75%，叶片大部分枯死；

计算叶感病指数，叶感病指数=各级病叶数（0～4）×相应级别的总和/（调查叶数×4）；

待鉴定小麦材料按穗收种，脱粒后调查黑胚粒率，穗部病情严重度按黑胚粒率分5个标准级别：

0级：黑胚粒率≤2%；

l级：2%＜黑胚粒率≤10%；

2级：10%＜黑胚粒率≤25%；

3级：25%＜黑胚粒率≤45%；

4级：黑胚粒率＞45%；

计算穗感病指数，穗感病指数=各级病穗数（0～4）×相应级别的总和/（调查穗数×4）；

然后计算综合感病指数，综合感病指数=1/2（叶感病指数+穗感病指数），20个品种的试验结果统计如表6。

由表6的10%稀释倍数的根腐病菌粗毒素处理20个小麦品种的受精卵第一次分裂期

花药对籽粒结实率的影响与其大田根腐病抗性表现的比较可以发现，通过综合感病指数调查得到的小麦根腐病大田抗性表现差异与根腐病菌粗毒素处理不同品种花药受精卵第一次分裂期后籽粒结实率测定值的差异呈现良好的相关性，大田表现高抗小麦根腐病的品种根腐病粗毒素处理后小麦籽粒结实率普遍较高，而较感根腐病的小麦品种花药受精卵第一次分裂期根腐病菌粗毒素处理后籽粒结实率极低，而且对应关系很好，这反映出采用粗毒素处理小麦花药受精卵第一次分裂期对小麦品种间根腐病抗感性差异分化显著，粗毒素处理小麦花药受精卵第一次分裂期是鉴别小麦根腐病品种间抗性差异的良好方法。

实施例3

2011年到2016年，采用本发明的技术路线，优选了望水白作为杂交父本，成功改良了育种主干亲本W0962的根腐病抗性，培育出3个根腐病抗性小麦新品系。

（1）分别筛选W0962和望水白作为杂交母本和父本：

W0962是本单位多年沿用的小麦育种主干亲本，具有产量高、米质优良、早熟等多种优点，属弱春性中早熟品系，苗期长势一般，分蘖集中，抗寒性好，分蘖成穗率较高，亩成穗较多；春季返青拔节快，长相清秀，旗叶较宽上举，株型适中，穗较大，抗寒、落黄好，籽粒半角质，较饱满，粒重较高。茎秆有韧性，轻度倒伏对灌浆影响不大；产量三要素协调，丰产稳产性好。然而W0962根腐病抗性较差，2011年与实施例2同期进行了10%稀释倍数的根腐病菌粗毒素处理W0962受精卵第一次分裂期花药测的籽粒结实率为5.8%，而大田根腐病抗性表现测定得综合抗病指数为61.9，高感小麦根腐病。望水白是源于江苏溧阳的地方品种，是公认的小麦根腐病高抗品种，2010～2011年，利用征集的小麦根腐病高抗材料在江苏省东辛农场试验田进行根腐病菌粗毒素处理试验，无论是根腐病菌粗毒素处理受精卵第一次分裂期花药的籽粒结实率表现还是大田根腐病抗性试验测量综合感病指数，望水白的小麦根腐病抗性表现均最优，因此优选望水白作为杂交父本，进行W0962的根腐病抗性改良。2011年秋季大田播种W0962和望水白作为杂交母本和父本，2012年小麦抽穗后杂交配组获得F1，2013年正季F1回交获得BCF1。

（2）分期播种父母本和BCF1，梯度浓度的根腐病菌粗毒素处理父母本，选定根腐病抗性筛选压：

2013年秋季大田播种杂交父本、母本和BCF1杂交种，分期播种，父母本提前播种，使父母本的抽穗期比BCF1杂交种早15～25天；2014年正季采用5%、10%、15%、20%、25%、30%稀释比例的根腐病菌粗毒素分别处理父本和母本抽穗期植株的小花，处理完成后将植株回栽到大田，待小麦籽粒进入“多半仁”期时即统计籽粒结实率，得表7；

因此我们选择20%稀释倍数的根腐病菌粗毒素作为根腐病抗性筛选压，然后采用根腐病抗性筛选压处理晚抽穗的BCF1杂交种小麦植株小花，处理完成后将植株回栽到大田，结实后收种，获得BCF2杂交种。

（3）取BCF2进行花药培养获得花培家系，根腐病抗性、农艺性状筛选获得根腐病抗性小麦新品系：

2014年秋季BCF2大田播种，2015年正季农艺性状筛选淘汰部分BCF2（如株高不适、分蘖力差、抽穗期过迟），优选农艺性状优良的BCF2小麦单核晚期花药进行花药培养，2016年正季获得花培家系88份，2016年秋季花培家系大田种植，以W0962和望水白为对照，获得3个农艺性状良好且根腐病抗性得到改良的根腐病抗性小麦新品系，命名为W1735、W1736、W1737，进入小麦品种预试试验。

本发明的利用根腐病菌粗毒素快速筛选小麦根腐病抗性品种的育种方法与常规育种方法相比，成功挖掘到根腐病菌粗毒素对小麦籽粒发育的超敏时期-受精卵第一次分裂期，进而发现小麦家系植株对根腐病菌粗毒素抗性与小麦家系受精卵第一次分裂期根腐病菌粗毒素耐性间具有良好的相关性。本发明进一步通过优选适宜浓度的根腐病菌粗毒素处理抽穗期受精卵第一次分裂期的杂交种植株小花，从而特异性筛选到高抗根腐病的小麦育种家系，从源头上大大减少了筛选工作量，从而大大提高了根腐病抗性鉴定的工作效率和准确度，具有较大的育种应用价值。

以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。

Claims (5)

1.一种利用根腐病菌粗毒素快速筛选小麦根腐病抗性品种的育种方法，其特征在于：该育种方法的步骤如下：

（1）选取待改良小麦品种/系和小麦根腐病抗源，杂交获得F1：选择农艺性状优良、根腐病抗性待改良的小麦品种/系作为杂交母本，选择高抗根腐病的小麦根腐病抗源作为杂交父本，大田种植父母本，抽穗后杂交获得F1；

（2）F1回交获得BCF1：将上步收获的F1杂交种和母本大田种植，抽穗后回交获得BCF1杂交种；

（3）分期播种父母本和BCF1：大田正季种植杂交父本、母本和BCF1杂交种，分期播种，父母本提前播种，使父母本的抽穗期比BCF1杂交种早15～25天；

（4）梯度浓度的根腐病菌粗毒素处理父母本，选定根腐病抗性筛选压：采用梯度浓度的根腐病菌粗毒素分别处理父本和母本抽穗期植株的小花，处理完成后将植株回栽到大田，待小麦籽粒进入“多半仁”期时即统计籽粒结实率，由于父本的根腐病抗性要远远高于母本，因此父本自交受精卵对根腐病菌粗毒素的耐性要高于母本自交受精卵，选择母本小麦籽粒结实率为0且20%＜父本小麦籽粒结实率＜50%的浓度的根腐病菌粗毒素作为根腐病抗性筛选压；

（5）根腐病抗性筛选压处理BCF1，获得BCF2：采用根腐病抗性筛选压处理抽穗期BCF1杂交种小麦植株小花，处理完成后将植株回栽到大田，结实后收种，获得BCF2；

（6）取BCF2进行花药培养获得花培家系，根腐病抗性、农艺性状筛选获得根腐病抗性小麦新品系：BCF2大田种植，正季农艺性状筛选淘汰部分BCF2（如株高不适、分蘖力差、抽穗期过迟），抽穗后取花药进行培养获得花培家系，花培家系大田种植，以待改良小麦品种/系和小麦根腐病抗源亲本为对照，根腐病抗性鉴定各家系综合感病指数、农艺性状筛选获得农艺性状良好且根腐病抗性得到改良的根腐病抗性小麦新品系。

2.根据权利要求1所述的利用根腐病菌粗毒素快速筛选小麦根腐病抗性品种的育种方法，其特征在于：所述步骤（1）中的农艺性状优良、根腐病抗性待改良的小麦品种/系是指产量高、米质优良、抗倒伏、根腐病抗性有待改良的小麦品种/系；小麦根腐病抗源是指根腐病抗性鉴定试验中，综合感病指数不高于抗病对照郑麦9962感病指数的小麦品种/系。

3.根据权利要求1所述的利用根腐病菌粗毒素快速筛选小麦根腐病抗性品种的育种方法，其特征在于：所述的根腐病菌粗毒素的制备方法为：将小麦根腐病菌活化后转接于PDA培养基， 28℃下暗培养7d，然后取菌落边缘菌丝按照30cm²菌丝/L液体培养基的比例接种菌丝到改良Fries液体培养基中，置于摇床中70r/min、28℃暗培养21d，待菌丝长成菌球后，用纱布过滤，滤出菌丝和菌球，然后将滤液3000r/min离心30m，弃沉淀，得毒素上清液；分别将上清液与等体积的乙酸乙酯、乙醇混合，萃取分层后，移出有机相，继续对水相进行萃取，连续萃取2次，将有机相和水相萃取液在38℃条件下减压蒸馏，残渣用无菌水溶解，定容至毒素上清液的1/100，即为根腐病菌粗毒素原液。

4.根据权利要求1和3所述的利用根腐病菌粗毒素快速筛选小麦根腐病抗性品种的育种方法，其特征在于：所述的根腐病菌粗毒素和根腐病抗性筛选压处理抽穗期小麦植株小花的具体操作流程为：前天下午挖取小麦抽穗期植株，于当天晚上剪掉已经开花的小花，第2天下午开花后再剪掉未开花的幼嫩的小花，只留取当天开花的小穗用于根腐病菌粗毒素浸泡处理，浸泡处理时间为挖取植株的第2天晚上18点到第3天早上8点，浸泡结束后将麦穗用流水冲洗10min。

5.根据权利要求1和2所述的利用根腐病菌粗毒素快速筛选小麦根腐病抗性品种的育种方法，其特征在于：所述的综合感病指数的获取方法为：小麦根腐病抗性鉴定试验中，发病盛期调查叶病情严重度2～3次，叶部病情严重度分5个标准级别：

0级：旗叶无病或上部第二叶偶有小病斑，占叶面积≤5%；

l级：旗叶有个别小病斑，5%＜占叶面积≤15%；

2级：旗叶病斑较多，15%＜占叶面积≤45%；

3级：旗叶病斑很多，45%＜占叶面积≤75%，部分叶片枯死；

4级：全株病斑密集，病斑大而连片，占叶面积＞75%，叶片大部分枯死；

计算叶感病指数，叶感病指数=各级病叶数（0～4）×相应级别的总和/（调查叶数×4）；

待鉴定小麦材料按穗收种，脱粒后调查黑胚粒率，穗部病情严重度按黑胚粒率分5个标准级别：

0级：黑胚粒率≤2%；

l级：2%＜黑胚粒率≤10%；

2级：10%＜黑胚粒率≤25%；

3级：25%＜黑胚粒率≤45%；

4级：黑胚粒率＞45%；

计算穗感病指数，穗感病指数=各级病穗数（0～4）×相应级别的总和/（调查穗数×4）；

然后计算综合感病指数，综合感病指数=1/2（叶感病指数+穗感病指数）。