CN107135828A - 一种花生白绢病温室苗期接种方法 - Google Patents

一种花生白绢病温室苗期接种方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种花生白绢病温室苗期接种方法。一种花生白绢病温室苗期接种方法，其特征在于包括如下步骤：1).白绢菌株的获得：从武汉田间花生白绢病株上采集白绢菌核，在室内进行分离、纯化，序列测定，比对，鉴定为Sclerotium rolfsii；2).带菌接种物的制备：①白绢菌碟的制备；②带菌牙签的制备；③带菌燕麦粒的制备；3).带菌接种物以不同方式接种花生幼苗；4).不同数量的带菌燕麦粒接种花生幼苗；5).带菌燕麦粒接种不同苗龄的花生幼苗；6).带菌燕麦粒接种不同花生品种/系。本发明建立了一种简便、可靠的白绢菌接种方法，便于苗期筛选抗白绢病的花生种质，获得抗白绢病的材料，为抗病育种提供技术手段。

Description

一种花生白绢病温室苗期接种方法
技术领域
本发明涉及一种花生白绢病温室苗期接种方法。
背景技术
花生白绢病，又称白脚病，是由半知菌亚门无孢菌目齐整小菌核属(Sclerotiumrolfsii Sacc.)引起的一种土传维管束病害，花生白绢病在我国长江流域以南的省份发生广泛，在北方花生产区零星发生。近年来随全球气候的变暖，高水肥高密度种植模式下花生冠层郁闭的小环境导致白绢病在我国危害愈来愈严重，发生区域从南方蔓延到北方，造成了严重的经济损失。2004年山东临沂发病面积达6万公顷，占全市播种面积的40％，重病田病株率达到67.3％。2007年河南郑州东部重病田发病率达20％；同年该病害在辽宁兴城首次大面积发生，一般地块发病株率为10％左右，严重地块发病株率为30％～40％。由于花生白绢病以菌核在病残体和土层中越冬，能在土壤中存活多年，防治比较困难。
目前针对该病害的防治措施主要包括与非寄主作物的轮作、深耕，这些栽培措施防治效果不理想；利用杀菌剂防治花生白绢病具有一定的防治效果，但杀菌剂防治存在高成本、破坏环境及导致病原产生抗药性等问题。目前在国家提倡的“减施化肥和农药”的方针下，急需建立经济有效的防治措施。防治花生白绢病最经济有效的防治方法是种植抗病品种，我国目前尚无高抗品种的报道，而筛选抗病品种必须建立稳定可靠的抗性鉴定技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种花生白绢病温室苗期接种方法，旨建立一种简便、可靠的白绢菌接种方法，便于苗期筛选抗白绢病的花生种质，获得抗白绢病的材料，为抗病育种提供技术手段。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：一种花生白绢病温室苗期接种方法，其特征在于包括如下步骤：
1)白绢菌株的获得(分离获得白绢病菌)：从田间(武汉市的田间)花生白绢病株上采集白绢菌核，在室内进行分离、纯化{表面消毒后接种PDA培养基，30℃恒温培养后，挑取菌落菌丝尖端转接新鲜PDA培养基}，鉴定{收集菌丝提取DNA，然后利用真菌DNAITS区间通用引物ITS1和ITS4PCR扩增后序列测定，经BLAST在GenBanK比对，鉴定为Sclerotiumrolfsii}；获得白绢病菌(Sclerotium rolfsii)菌株(或称武汉菌株)；
2)带菌接种物的制备：白绢菌的活化：将4℃保存白绢病菌菌株(或称白绢病菌武汉菌株)的菌核利用70wt％乙醇表面消毒30s，1wt％次氯酸钠浸泡2min，无菌蒸馏水冲洗3次，蘸干后接种于PDA培养基上，30℃黑暗条件下培养至菌丝长出，得到活化的白绢菌丝；
①白绢菌碟的制备：取活化的白绢菌丝接种于PDA培养上，30℃黑暗条件下培养3～4d，利用0.5cm的灭菌打孔器在菌落边缘菌丝处打孔(无菌打孔器打取菌碟)，获得白绢菌碟；
②带菌牙签的制备：灭菌牙签呈扇形插入中央放置白绢菌碟的PDA培养中，培养至牙签布满菌丝，得到带菌牙签；
具体为：将牙签用蒸馏水浸泡过夜后，控干水分，高温高压灭菌后，超净工作台中呈扇形排布于PDA平板上，中央接种新鲜的白绢菌碟，30℃黑暗条件下培养5～6d，直至菌丝布满牙签；
③带菌燕麦粒的制备：燕麦粒用水浸泡后高压灭菌，冷却后接种白绢菌碟，培养至燕麦粒上布满菌丝，每天摇动培养瓶，确保燕麦粒均有菌丝生长，得到带菌燕麦粒；
具体为：将燕麦粒装入三角瓶中，蒸馏水浸泡4h后，倒掉水分，121℃高压灭菌20min；将白绢菌碟接种到灭菌的燕麦粒中，置于30℃黑暗条件下培养5～6d，每天摇动接种瓶2-3次，直至所有燕麦粒均有菌丝生长；
3)带菌接种物以不同方式接种花生幼苗：通过不同白绢菌的接种物接种花生幼苗，所述接种物为白绢菌碟、带菌牙签或带菌燕麦粒，不同时间观察症状表现，明确带菌燕麦粒接种优于白绢菌碟和带菌牙签，其中带菌燕麦粒贴茎法病害发展速度最快，其次为带菌燕麦粒撒表土法，这两种方法病情指数差异不显著，其中带菌燕麦粒撒表土法比贴茎法操作简便、快速，选择该方法为花生白绢病接种方法；
具体为：将感病花生(感病花生品系14-2012)种植于温室的塑料大盆中，土壤：蛭石：营养土的质量比＝2：1：1，培养温度为26±1℃，16h光照/8h黑暗，感病花生单粒种植，行距12～13cm，间距为6～9cm；播种15d后的花生幼苗按照下面5种方法接种白绢病菌：①菌碟法：将白绢菌碟(简称菌碟)的菌丝面贴在花生植株茎基部，透明胶固定；②牙签法：将带菌牙签(长满菌丝的牙签)插入距离茎基部周围的土壤中，5根带菌牙签/植株(每植株插入5根带菌牙签)；③燕麦粒贴茎法：将带菌燕麦粒(带菌的燕麦粒)按照每株2粒，贴于花生茎基部，并缠绕透明胶固定；④燕麦粒埋土法：将带菌燕麦粒埋入花生茎基部周围2cm深的土层中，2粒/株(每株埋入2粒带菌燕麦粒)；⑤燕麦粒撒表土法：花生植株浇透水分，将带菌燕麦粒(带菌的燕麦粒)撒在植株茎基部周围的土壤表面，2粒/株(每株根表撒布2粒带菌燕麦粒)，每天浇水一次；
5种方法接种白绢病菌，每种处理4次重复，每种重复7～10株，随机排列；从接种4d后开始调查植株发病，随后间隔3d调查一次，一共调查7次，记录发病株数和发病的严重度；试验重复两次；病害分级的调查根据Shokes等1998的标准稍加修改：1级：仅茎上有病斑，2级：茎基部有病斑，全株≤25％以下萎蔫和死亡，3级：全株26-50％表现萎蔫和死亡，4级：全株≥50％表现萎蔫和死亡。
病情指数的计算公式为：DI＝{[Σ(各级病株×相对级数值)]/(调查总株数×4)}×100；
4)不同数量的带菌燕麦粒接种花生幼苗：播种15d的花生幼苗浇水后，将带菌燕麦粒利用撒表土法接种于花生茎基部周围，接种量分别为1粒、2粒、3粒、4粒和5粒；每个处理4次重复(处理指不同接种数量，就是接种1粒～5粒这5个不同处理)，每个重复7～10株，随机排列；每天浇水一次，温室培养条件同上(培养温度为26±1℃，16h光照/8h黑暗)；接种4d后开始病害调查，间隔3d调查一次，调查4周；试验重复2次；
5)带菌燕麦粒接种不同苗龄的花生幼苗：将带菌燕麦粒利用撒表土法接种于播种后15d、20d、25d、30d和35d的花生植株茎基部周围，接种量为4粒/植株，7～10株/重复，每个处理四次重复，随机排列，接种后管理方法同上(每天浇水一次)；接种4d后开始病害调查，间隔3d调查一次，调查4周；试验重复2次；
6)带菌燕麦粒接种不同花生品种/系：将带菌燕麦粒利用撒表土法接种于播种后15d的19份品种/品系花生幼苗茎基部周围，4粒/植株，7～10植株/重复，每个处理四次重复，随机排列，接种后的管理方法同上(每天浇水一次)；接种4d后开始病害调查，间隔3d调查一次，调查4周；试验重复2次。
本发明主要通过分离获得白绢菌；通过不同接种技术的比较，获得较好的接种方式；并对接种量和接种时间的比较，明确最佳的接种量和接种时间；进一步对不同花生品种/系接种进行抗病性鉴定，获得相对抗病的花生材料。为花生抗白绢病种质资源的筛选和培育抗白绢病品种提供技术支撑。
本发明的有益效果是：本发明的方法繁殖的白绢菌的致病性强，接种操作简单，不需要额外盖膜保湿，受环境影响小，效果稳定，接种效率高，可结合田间接种实验，辅助验证花生种质对花生白绢病的抗性。本发明提供一种简便、快速、可靠的花生抗白绢病的鉴定方法，可以进行大量花生种质资源材料抗白绢病的鉴定，为花生抗白绢病种质资源的筛选和培育抗白绢病品种提供技术支撑。
附图说明
图1是花生白绢菌的菌落形态图(纯化的白绢菌在PDA培养基上的菌落)。
图2是不同接种方法接种花生后的病害发展动态图。
图2中：横向座标标号，1-接种后第4天，2-接种后第7天，3-接种后第10天，4-接种后第13天，5-接种后第16天，6-接种后第19天，7-接种后第22天。
图3是不同花生品种/系接种白绢后的表现图(即白绢菌接种不同品种/系花生幼苗后的症状)。
图3中：从左至右，1、2、3、4、5纵向排为不同花生品种/系。
具体实施方式
一种花生白绢病温室苗期接种方法，包括如下步骤：
1).白绢菌株的获得(分离获得白绢病菌)：从武汉的田间花生白绢病株上采集白绢菌核，在室内进行分离、纯化{表面消毒后接种PDA培养基，30℃恒温培养后，挑取菌落菌丝尖端转接新鲜PDA培养基}，鉴定{收集菌丝提取DNA，然后利用真菌DNAITS区间通用引物ITS1和ITS4PCR扩增后序列测定，经BLAST在GenBanK比对，鉴定为Sclerotium rolfsii}；获得白绢病菌(Sclerotium rolfsii)菌株；
2).带菌接种物的制备：白绢菌的活化：将4℃保存白绢病菌菌株(白绢病菌武汉菌株)的菌核利用70wt％乙醇表面消毒30s，1wt％次氯酸钠浸泡2min，无菌蒸馏水冲洗3次，蘸干后接种于PDA培养基上，30℃黑暗条件下培养至菌丝长出，得到活化的白绢菌丝；
①白绢菌碟的制备：取活化的白绢菌丝接种于PDA培养上，30℃黑暗条件下培养3～4d，利用0.5cm的灭菌打孔器在菌落边缘菌丝处打孔(无菌打孔器打取菌碟)，获得白绢菌碟；
②带菌牙签的制备：灭菌牙签呈扇形插入中央放置白绢菌碟的PDA培养中，培养至牙签布满菌丝，得到带菌牙签；
具体为：将牙签用蒸馏水浸泡过夜后，控干水分，高温高压灭菌后，超净工作台中呈扇形排布于PDA平板上，中央接种新鲜的白绢菌碟，30℃黑暗条件下培养5～6d，直至菌丝布满牙签；
③带菌燕麦粒的制备：燕麦粒用水浸泡后高压灭菌，冷却后接种白绢菌碟，培养至燕麦粒上布满菌丝，每天摇动培养瓶，确保燕麦粒均有菌丝生长，得到带菌燕麦粒；
具体为：将燕麦粒装入三角瓶中，蒸馏水浸泡4h后，倒掉水分，121℃高压灭菌20min；将白绢菌碟接种到灭菌的燕麦粒中，置于30℃黑暗条件下培养5～6d，每天摇动接种瓶2-3次，直至所有燕麦粒均有菌丝生长；
3).带菌接种物以不同方式接种花生幼苗：通过不同白绢菌的接种物接种花生幼苗，所述接种物为白绢菌碟、带菌牙签或带菌燕麦粒，不同时间观察症状表现，明确带菌燕麦粒接种优于白绢菌碟和带菌牙签，其中带菌燕麦粒贴茎法病害发展速度最快，其次为带菌燕麦粒撒表土法，这两种方法病情指数差异不显著，其中带菌燕麦粒撒表土法比贴茎法操作简便、快速，选择该方法为花生白绢病接种方法；
具体为：将感病花生(感病花生品系14-2012)种植于温室的塑料大盆中，土壤：蛭石：营养土的质量比＝2：1：1，培养温度为26±1℃，16h光照/8h黑暗，感病花生单粒种植，行距12～13cm，间距为6～9cm；播种15d后的花生幼苗按照下面5种方法接种白绢病菌：①菌碟法：将白绢菌碟(简称菌碟)的菌丝面贴在花生植株茎基部，透明胶固定；②牙签法：将带菌牙签(长满菌丝的牙签)插入距离茎基部周围的土壤中，5根带菌牙签/植株(每植株插入5根带菌牙签)；③燕麦粒贴茎法：将带菌燕麦粒(带菌的燕麦粒)按照每株2粒，贴于花生茎基部，并缠绕透明胶固定；④燕麦粒埋土法：将带菌燕麦粒埋入花生茎基部周围2cm深的土层中，2粒/株(每株埋入2粒带菌燕麦粒)；⑤燕麦粒撒表土法：花生植株浇透水分，将带菌燕麦粒(带菌的燕麦粒)撒在植株茎基部周围的土壤表面，2粒/株(每株根表撒布2粒带菌燕麦粒)，每天浇水一次；
5种方法接种白绢病菌，每种处理4次重复，每种重复7～10株，随机排列；从接种4d后开始调查植株发病，随后间隔3d调查一次，一共调查7次，记录发病株数和发病的严重度；试验重复两次；病害分级的调查根据Shokes等1998的标准稍加修改：1级：仅茎上有病斑，2级：≤25％的茎萎蔫和死亡，3级：26-50％茎萎蔫和死亡，4级：≥50％的茎萎蔫和死亡；
病情指数的计算公式为：DI＝{[Σ(各级病株×相对级数值)]/(调查总株数×4)}×100；
4).不同数量的带菌燕麦粒接种花生幼苗：播种15d的花生幼苗浇水后，将带菌燕麦粒利用撒表土法接种于花生茎基部周围，接种量分别为1粒、2粒、3粒、4粒和5粒；每个处理4次重复(处理指不同接种数量，就是接种1粒～5粒这5个不同处理)，每个重复7～10株，随机排列；每天浇水一次，温室培养条件同上(培养温度为26±1℃，16h光照/8h黑暗)；接种4d后开始病害调查，间隔3d调查一次，调查4周；试验重复2次；
5).带菌燕麦粒接种不同苗龄的花生幼苗：将带菌燕麦粒利用撒表土法接种于播种后15d、20d、25d、30d和35d的花生植株茎基部周围，接种量为4粒/植株，7～10株/重复，每个处理四次重复，随机排列，接种后管理方法同上(每天浇水一次)；接种4d后开始病害调查，间隔3d调查一次，调查4周；试验重复2次；
6).带菌燕麦粒接种不同花生品种/系：将带菌燕麦粒利用撒表土法接种于播种后15d的19份品种/品系花生幼苗茎基部周围，4粒/植株，7～10植株/重复，每个处理四次重复，随机排列，接种后的管理方法同上(每天浇水一次)；接种4d后开始病害调查，间隔3d调查一次，调查4周；试验重复2次。采用相对抗病程度评价方法(王继华等2005，郑章云等2015)调查供试花生品种/系对花生白绢病的温室苗期抗病能力。相对病情指数(relativediseaseindex,RDI)＝1-鉴定品种平均病情指数/发病最严重品种的平均病情指数。抗病程度分为5级，免疫：相对抗病指数为1.0，高抗：相对抗病指数为0.8～0.99，抗病：相对抗病指数为0.40～0.79，中感：相对抗病指数为0.2～0.39，高感：相对抗病指数低于0.2。
1～5粒带菌燕麦粒通过撒表土法接种花生，发现不同接种量间病情指数差异不显著，其中以接种4粒带菌燕麦的发病率和病情指数最高；利用带菌燕麦粒接种不同苗龄的花生植株，发现播种后15d～35d的花生幼苗接种白绢菌都能发病，病情指数方差分析无显著差异，以播种后15d接种白绢菌和病害调查时间总共所用的时间少，单位时间内鉴定的材料份数多，选择该时间为白绢病的接种时间；建立了花生播种后15d的幼苗以4粒带菌燕麦粒撒于茎基部土表的花生白绢接种方法。
花生抗白绢病的评价：19份花生材料利用带菌燕麦粒接种花生，通过不同时间的症状观察，统计发病率和病情指数，发现绝大部分材料为感病材料，只有1份材料存在相对抗性。
表1 5种不同接种方法接种3周后的发病结果
表1中：方差分析P<0.05时，相同小写字母表示两个处理间平均数差异不显著，不同字母表示两个处理间平均数差异显著(即a，b，c)。
表2带菌燕麦粒不同接种量接种后3周后的发病结果
表2中：方差分析P<0.05时，相同小写字母表示处理间平均数差异不显著。
表3不同苗龄接种带菌燕麦粒的发病结果
表3中：方差分析P<0.05时，相同小写字母表示两个处理间平均数差异不显著。
表4不同花生品种/系接种白绢菌后的抗/感病表现
表4中：HS表示高度敏感，MS表示中等敏感，MR表示中等抗性。

Claims (6)

1.一种花生白绢病温室苗期接种方法，其特征在于包括如下步骤：
1)白绢菌株的获得：从田间花生白绢病株上采集白绢菌核，在室内进行分离、纯化，然后利用真菌DNAITS区间通用引物ITS1和ITS4PCR扩增后序列测定，经BLAST在GenBanK比对，鉴定为Sclerotium rolfsii；获得白绢病菌(Sclerotium rolfsii)菌株；
2)带菌接种物的制备：白绢菌的活化：将4℃保存白绢病菌菌株的菌核利用70wt％乙醇表面消毒30s，1wt％次氯酸钠浸泡2min，无菌蒸馏水冲洗3次，蘸干后接种于PDA培养基上，30℃黑暗条件下培养至菌丝长出，得到活化的白绢菌丝；
①白绢菌碟的制备：取活化的白绢菌丝接种于PDA培养上，30℃黑暗条件下培养3～4d，利用0.5cm的灭菌打孔器在菌落边缘菌丝处打孔，获得白绢菌碟；
②带菌牙签的制备：灭菌牙签呈扇形插入中央放置白绢菌碟的PDA培养中，培养至牙签布满菌丝，得到带菌牙签；
③带菌燕麦粒的制备：燕麦粒用水浸泡后高压灭菌，冷却后接种白绢菌碟，培养至燕麦粒上布满菌丝，每天摇动培养瓶，确保燕麦粒均有菌丝生长，得到带菌燕麦粒；
3)带菌接种物以不同方式接种花生幼苗：通过不同白绢菌的接种物接种花生幼苗，所述接种物为白绢菌碟、带菌牙签或带菌燕麦粒，不同时间观察症状表现；
4)不同数量的带菌燕麦粒接种花生幼苗：播种15d的花生幼苗浇水后，将带菌燕麦粒利用撒表土法接种于花生茎基部周围，接种量分别为1粒、2粒、3粒、4粒和5粒；每天浇水一次，接种4d后开始病害调查，间隔3d调查一次，调查4周；
5)带菌燕麦粒接种不同苗龄的花生幼苗：将带菌燕麦粒利用撒表土法接种于播种后15d、20d、25d、30d和35d的花生植株茎基部周围，接种量为4粒/植株，接种4d后开始病害调查，间隔3d调查一次，调查4周；
6)带菌燕麦粒接种不同花生品种/系：将带菌燕麦粒利用撒表土法接种于播种后15d的19份品种/品系花生幼苗茎基部周围，4粒/植株，接种4d后开始病害调查，间隔3d调查一次，调查4周。
2.根据权利要求1所述的一种花生白绢病温室苗期接种方法，其特征在于步骤1)中在室内进行分离、纯化为：白绢菌核表面消毒后接种PDA培养基，30℃恒温培养后，挑取菌落菌丝尖端转接新鲜PDA培养基，收集菌丝提取DNA。
3.根据权利要求1所述的一种花生白绢病温室苗期接种方法，其特征在于步骤2)中白绢菌碟的制备具体为：取活化的白绢菌丝接种于PDA培养上，30℃黑暗条件下培养3～4d，利用0.5cm的灭菌打孔器在菌落边缘菌丝处打孔，获得白绢菌碟。
4.根据权利要求1所述的一种花生白绢病温室苗期接种方法，其特征在于步骤2)中带菌牙签的制备具体为：将牙签用蒸馏水浸泡过夜后，控干水分，高温高压灭菌后，超净工作台中呈扇形排布于PDA平板上，中央接种新鲜的白绢菌碟，30℃黑暗条件下培养5～6d，直至菌丝布满牙签。
5.根据权利要求1所述的一种花生白绢病温室苗期接种方法，其特征在于步骤2)中：带菌燕麦粒的制备具体为：将燕麦粒装入三角瓶中，蒸馏水浸泡4h后，倒掉水分，121℃高压灭菌20min；将白绢菌碟接种到灭菌的燕麦粒中，置于30℃黑暗条件下培养5～6d，每天摇动接种瓶2-3次，直至所有燕麦粒均有菌丝生长。
6.根据权利要求1所述的一种花生白绢病温室苗期接种方法，其特征在于步骤3)具体为：将感病花生种植于温室的塑料大盆中，土壤：蛭石：营养土的质量比＝2：1：1，培养温度为26±1℃，16h光照/8h黑暗，感病花生单粒种植，行距12～13cm，间距为6～9cm；播种15d后的花生幼苗按照下面5种方法接种白绢病菌：①菌碟法：将白绢菌碟的菌丝面贴在花生植株茎基部，透明胶固定；②牙签法：将带菌牙签插入茎基部周围的土壤中，5根带菌牙签/植株；③燕麦粒贴茎法：将带菌燕麦粒按照每株2粒，贴于花生茎基部，并缠绕透明胶带固定；④燕麦粒埋土法：将带菌燕麦粒埋入花生茎基部周围2cm深的土层中，2粒/株；⑤燕麦粒撒表土法：花生植株浇透水分，将带菌燕麦粒撒在植株茎基部周围的土壤表面，2粒/株，每天浇水一次；
5种方法接种白绢病菌，从接种4d后开始调查植株发病，随后间隔3d调查一次，一共调查7次，记录发病株数和发病的严重度；病害分级：1级：仅茎上有病斑，2级：茎基部有病斑，全株≤25％以下萎蔫和死亡，3级：全株26-50％表现萎蔫和死亡，4级：全株≥50％表现萎蔫和死亡。
CN201710298155.1A 2017-04-30 2017-04-30 一种花生白绢病温室苗期接种方法 Active CN107135828B (zh)

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