CN113881779A - 一种利用edg1基因提高肉牛产肉性能的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种利用EDG1基因g.42041062G>T位点提高肉牛产肉性能的方法。本发明的利用EDG1基因g.42041062G>T位点提高肉牛产肉性能的方法，包括以下步骤：检测待测肉牛基因组中的EDG1基因是否存在g.42041062G>T位点的突变：选取基因型为TT型的肉牛个体，进行人工输精和本交。本发明利用上述分子标记作为秦川牛和中国西门塔尔牛产肉性能的可靠标记，并建立了DNA检测该基因型的技术体系，提高了选择强度以及选育的准确性和效率，提高了秦川牛和中国西门塔尔牛产肉性能。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种利用EDG1基因 g.42041062G>T位点提高肉牛产肉性能的方法。
背景技术
秦川牛因位于陕西关中“八百里秦川”而得名，系中国黄牛的代表性品种，位居我国“五大黄牛”之首，具有躯干强壮、耐粗饲、抗逆性强、大理石花纹适宜等特点。秦川牛养殖已成为陕西及甘肃、宁夏等省区许多地方农民增收的支柱产业。但与国外优质肉牛品种相比，秦川牛存在生长速度慢、产肉量低和脂肪沉积欠佳等问题。
西门塔尔牛原产于瑞士，1990年山东省畜牧局牛羊养殖基地引进该品种。西门塔尔牛并不是纯种肉用牛，但由于西门塔尔牛产乳量高，产肉性能也并不比专门化肉牛品种差，役用性能也很好，是乳、肉、役兼用的大型品种，被畜牧界称为全能牛。西门塔尔牛在引进我国后，对我国各地的黄牛改良效果非常明显，杂交一代的生产性能一般都能提高30％以上，因此很受欢迎。中国西门塔尔牛品种于2006年在内蒙古和山东省梁山县同时育成。中国西门塔尔牛由于培育地点的生态环境不同，分为平原、草原、山区三个类群，种群规模达100 万头。该品种被毛颜色为黄白花或红白花。三个类群牛的体高分别为130.8、 128.3和127.5厘米；体长分别为165.7.147.6和143.l厘米。各类群核心群种牛的遗传基础已达到遗传同质化水平。犊牛初生重平均41.6千克，6月龄体重199.4千克，12月龄重324千克，18月龄434千克，24月龄592千克。产奶量平均4300千克，乳脂率4.0％。屠宰实验结果，屠宰率平均61.4％，净肉率 50.0％，眼肌面积90.5平方厘米。早期生长快是该品种的主要特点之一。因此，中国西门塔尔牛将成为我国未来牛肉生产的重要利用品种。
产肉性能是肉牛重要的经济性状，对于秦川牛和中国西门塔尔牛养殖产业的发展具有极其重要的意义，因此提高产肉性能是提升秦川牛和中国西门塔尔牛养殖业经济效益的重要方向。
EDG1(endothelial differentiation sphingolipid G-protein-coupledreceptor 1)既内皮分化G蛋白偶联受体1，该基因位于3号染色体，全长6369bp，该区域位于日本黑毛和牛大理石花纹等级和体重的QTL区域内。大理石花纹肉的特征与肌内脂肪(Intramuscular fat,IMF)的含量和分布密切相关，高肌内脂肪含量的背部最长肌中EDG1基因表达水平显著高于低肌内脂肪含量(P <0.05)，EDG1的高表达可能通过促进肌肉内血管形成，然后为肌肉提供能量，从而增加脂肪细胞的增殖，分化或成熟，从而导致IMF含量增加，以增加中国秦川牛的大理石花纹肉等级。
单核苷酸多态性标记(Single nucleotide polymorphism,SNP)是指单个核苷酸发生改变而引起的DNA序列多态性，引起具有数量多、密度大、遗传稳定性高等优点而被广泛应用。将这些遗传标记与生长性状相关联，从而实现在 DNA水平上选择育种，有效的避免人为影响并提高选择育种的准确性，并且可实现在早期鉴定出具有优良性状的个体，筛选出优良的后备亲本，缩短育种周期，大大加快选育进程。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用EDG1基因g.42041062G>T位点提高肉牛产肉性能的方法。
根据本发明具体实施方式的利用EDG1基因g.42041062G>T位点提高肉牛产肉性能的方法，所述方法包括以下步骤：
S1、检测待测肉牛基因组中的EDG1基因5'UTR下游8000bp处是否存在g.42041062G>T位点的突变：
若EDG1基因编码区5'UTR下游第42041062位核苷酸为G时，其纯合体的基因型为GG；第42041062位核苷酸为T时，其纯合体的基因型为为TT；杂合体基因型为GT；
S2、选取携带EDG1基因g.42041062G>T位点基因型为TT型的肉牛个体，进行人工输精和本交。
根据本发明具体实施方式的利用EDG1基因g.42041062G>T位点提高肉牛产肉性能的方法，步骤S1中，EDG1基因g.42041062G>T SNP位点的检测方法为：利用PCR方法扩增待测肉牛EDG1基因GenBank Accession Number为 NC_037330.1的42041062到42041062位核苷酸的片段，并将扩增产物进行酶切。
根据本发明具体实施方式的利用EDG1基因g.42041062G>T位点提高肉牛产肉性能的方法，步骤S1中，扩增产物酶切后的酶切片段长度为38bp和117bp，判断为TT基因型，酶切片段长度为155bp，判断为GG基因型，酶切片段长度为38bp、117bp、155bp时，则判断为GT基因型。
根据本发明具体实施方式的利用EDG1基因g.42041062G>T位点提高肉牛产肉性能的方法，步骤S1中，PCR方法所用的引物序列如下：
SEQ ID NO.1：5′-GTGTTAATATGTATGAAGCTTGATAGTCAGGAAATAAAT-3′；
SEQ ID NO.2：5′-CCACTGTATCGCTGAGCTAGGT-3′。
根据本发明具体实施方式的利用EDG1基因g.42041062G>T位点提高肉牛产肉性能的方法，步骤S1中，PCR方法的扩增程序为：PCR反应条件为：94℃5 min；94℃30s 60℃30s，72℃30s，35个循环；最后72℃延伸7min，保存4℃。
根据本发明具体实施方式的利用EDG1基因g.42041062G>T位点提高肉牛产肉性能的方法，步骤S1中，PCR方法的反应体系共25μL，其中，10pmol/ μL上下游引物各1.25μL，2×Taq Master Mix 12.5μL，50～100ng/μL 基因组DNA 2μL，ddH2O 8μL。
根据本发明具体实施方式的利用EDG1基因g.42041062G>T位点提高肉牛产肉性能的方法，所述产肉性能包括腰角宽、背膘厚、眼肌面积、肌内脂肪含量。
优选的，本发明中所述肉牛为秦川牛或中国西门塔尔牛。
本发明利用上述分子标记作为秦川牛和中国西门塔尔牛产肉性能的可靠标记，提高了选择强度以及选育的准确性和效率，证实了EDG1基因g.42041062G>T 的SNP位点对中国秦川牛和中国西门塔尔牛产肉性能的遗传效应。
本发明的有益效果：
本发明将EDG1基因作为育种标记中的候选基因，采用PCR-RFLP技术，对 EDG1基因进行SNP酶切检测，比较EDG1基因在秦川牛和中国西门塔尔牛中的多态性，选取携带EDG1基因g.42041062G>T位点基因型为TT型的肉牛个体，进行人工输精和本交，从而提高了肉牛的产肉性能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1显示本发明EDG1的NC_037330.1：g.42041062G>T位点的PCR产物图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1秦川牛和中国西门塔尔牛EDG1基因SNP检测片段的获得及多态性位点检测方法的建立
1、秦川牛和中国西门塔尔牛基因组DNA的提取
本发明的试验牛为西北农林科技大学国家肉牛改良中心的350头秦川成年母牛(年龄18-24月龄，至少三代没有亲缘关系)，赤峰圣泉生态牧业有限公司的260头中国西门塔尔牛(年龄14-18月龄)。秦川牛和中国西门塔尔牛基因组DNA采用北京天根生化科技有限公司生产的血液基因组DNA提取试剂盒进行提取，具体步骤参照试剂盒说明书。评估提取DNA的质量和数量，并通过琼脂糖凝胶电泳评估，置于-40℃下保存备用。
2、秦川牛和中国西门塔尔牛EDG1基因SNP遗传标记检测片段的获得
利用PCR-RFLP技术对秦川牛EDG1基因g.42041062G>T位点进行基因分型 (1)PCR扩增
根据GenBank报道的秦川牛EDG1基因的基因组序列(GenBank ID： NC_037330.1)，本发明设计上下游引物M-F和M-R，引物如下：
M-F：5′-GTGTTAATATGTATGAAGCTTGATAGTCAGGAAATAAAT-3′；
M-R：5′-CCACTGTATCGCTGAGCTAGGT-3′。
利用上述引物在秦川牛基因组DNA中进行PCR扩增，PCR反应体系如表1 所示，总体积为25μL；PCR反应条件如表2所示。
表1 PCR反应体系
表2 PCR反应条件
PCR产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：
GTGTTAATATGTATGAAGCTTGATAGTCAGGAAATAAGTGGTTTTAAAGGACTTTCATTGTCAG ACAGTTGTATACATACAGAACCCCTAAACTGTTTACTGAAGGCATTTGACATGGCATTTGAGTTTTCAAACCTAGCTCAGCGATACAGTGG
利用限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切，使用限制性内切酶Tsp509I 1 μL，10×Fast digest green buffer 2μL，PCR产物2μL，用ddH2O补齐至20μL，37℃反应2h。然后用2％的琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统照相分析。
结果如图1所示，可根据酶切结果将所有个体分为TT、TG和GG 3种基因型，酶切片段长度为38bp和117bp则表示TT基因型，酶切片段长度为155bp 则表示GG基因型，酶切片段长度为38bp，117bp，155bp则表示GT基因型。
实施例2检测分子标记在秦川牛、中国西门塔尔牛和其他地方肉牛品种群体中的多态性分布
对7个黄牛群体中检测EDG1基因g.42041062G>T位点的遗传多样性，检测结果如表3所示。
表3 EDG1基因g.42041062G>T位点在黄牛群体中的基因型频率和等位基因频率
注：QC，秦川牛；LX，鲁西牛；MGC，蒙古牛群体(中国内蒙古自治区)；MGG，蒙古牛群体(蒙古国)； WL，巫陵牛；LL，隆林牛；CS，中国西门塔尔。
由表3结果可知：中国秦川牛EDG1基因g.42041062G>T位点的基因型频率为： TT(0.034)、GT(0.237)、GG(0.729)，G等位基因频率(0.847)高于T 等位基因频率(0.153)；中国鲁西黄牛、中国内蒙古蒙古牛、蒙古国蒙古牛、中国巫陵牛和中国隆林牛G等位基因频率也均高于T等位基因频率。
实施例3考察g.42041062G>T分子标记与秦川牛、中国西门塔尔牛产肉性能的关联
为了确定EDG1基因g.42041062G>T位点与秦川牛、中国西门塔尔牛产肉性能差异是否相关，采用实施例1建立的方法进行多态性检测，使用SPSS 19.0 软件分析c.*188G>A位点的三种基因型与秦川牛、中国西门塔尔牛产肉性能的相关性。
所采用数学模型为：Yijklm＝μ+Gi+Aj+Fk+Sl+Sm+eijklm；
其中，Yijklm为性状观察值，μ为性状的平均值，Gi为基因型效应，Aj为年龄造成的固定效应，Fk为牧场环境效应，Sl为性别效应，Sm为家系效应，eijklm为随机误差。
在秦川牛和中国西门塔尔牛群体中进行c.*188G>A位点三种基因型与产肉性能间的关联分析，统计分析结果如表4所示：
表4秦川牛EDG1基因g.42041062G>T位点与生长性状的关联分析
注：数值以平均值±标准差表示；同一列中不同上标的数值在P<0.05时有显著差异(a，b)，P<0.01 (A，B)。
由表4可知，在秦川牛群体中，g.42041062G>T位点的基因型有GG，GT，TT三种基因型，其中GG基因型的腰角宽显著高于GT基因型(P<0.05)，GG 基因型、GT基因型和TT基因型在体长、体重、腰高、尻长、胸深和胸围无显著性差异(P>0.05)。
表5秦川牛EDG1基因g.42041062G>T位点与胴体性状的关联分析
注：数值以平均值±标准差表示；同一列中不同上标的数值在P<0.05时有显著差异(a，b)，P<0.01 (A，B)
由表5可知，对秦川牛EDG1基因g.42041062G>T位点与胴体性状进行关联性分析结果表明，TT基因型的背膘厚显著高于GG和GT基因型(P<0.05)，GG，TT和GT基因型眼肌面积极显著高于GG基因型(P<0.05；P<0.01)， TT基因型的肌内脂肪含量显著高于GG基因型(P<0.05)。
表6中国西门塔尔牛EDG1基因g.42041062G>T位点与生长形状的关联分析
由表6可知，对中国西门塔尔牛EDG1基因g.42041062G>T位点与产肉性状进行关联性分析结果表明，TT基因型的肌内脂肪含量显著高于GG基因型(P< 0.05)。
依照上述育种实验方案，在实施以提高秦川牛和中国西门塔尔牛产肉性能为目标的分子标记辅助育种时，可检测后备种公牛EDG1基因g.42041062G>T 位点，优先选取携带EDG1基因g.42041062G>T位点基因型为TT型的个体，利用人工输精和本交，可提高秦川牛和中国西门塔尔牛后代的产肉性能。具体方法如下：
S1、检测待测肉牛基因组中的EDG1基因5'UTR下游8000bp处是否存在g.42041062G>T位点的突变：
若EDG1基因编码区5'UTR下游第42041062位核苷酸为G时，其纯合体的基因型为GG；第42041062位核苷酸为T时，其纯合体的基因型为为TT；杂合体基因型为GT；
S2、选取携带EDG1基因g.42041062G>T位点基因型为TT型的肉牛个体，进行人工输精和本交。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 内蒙古大学
西北农林科技大学
赤峰圣泉生态牧业有限公司
中育科技有限公司
<120> 一种利用EDG1基因提高肉牛产肉性能的方法
<141> 2021-08-16
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgttaatat gtatgaagct tgatagtcag gaaataaat 39
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccactgtatc gctgagctag gt 22
<210> 3
<211> 155
<212> DNA
<213> 秦川牛和中国西门塔尔牛(Bos taurus)
<400> 3
gtgttaatat gtatgaagct tgatagtcag gaaataagtg gttttaaagg actttcattg 60
tcagacagtt gtatacatac agaaccccta aactgtttac tgaaggcatt tgacatggca 120
tttgagtttt caaacctagc tcagcgatac agtgg 155
Claims (8)
1.一种利用EDG1基因g.42041062G>T位点提高肉牛产肉性能的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1、检测待测肉牛基因组中的EDG1基因5'UTR下游8000bp处是否存在g.42041062G>T位点的突变：
若EDG1基因编码区5'UTR下游第42041062位核苷酸为G时，其纯合体的基因型为GG；第42041062位核苷酸为T时，其纯合体的基因型为为TT；杂合体基因型为GT；
S2、选取携带EDG1基因g.42041062G>T位点基因型为TT型的肉牛个体，进行人工输精和本交。
2.根据权利要求1所述的用EDG1基因g.42041062G>T位点提高肉牛产肉性能的方法，其特征在于，步骤S1中，EDG1基因g.42041062G>TSNP位点的检测方法为：利用PCR方法扩增待测肉牛EDG1基因GenBankAccessionNumber为NC_037330.1的42041062到42041062位核苷酸的片段，并将扩增产物进行酶切。
3.根据权利要求2所述的用EDG1基因g.42041062G>T位点提高肉牛产肉性能的方法，其特征在于，步骤S1中，扩增产物酶切后的酶切片段长度为38bp和117bp，判断为TT基因型，酶切片段长度为155bp，判断为GG基因型，酶切片段长度为38bp、117bp、155bp时，则判断为GT基因型。
4.根据权利要求2所述的用EDG1基因g.42041062G>T位点提高肉牛产肉性能的方法，其特征在于，步骤S1中，PCR方法所用的引物序列如下：
M-F：5′-GTGTTAATATGTATGAAGCTTGATAGTCAGGAAATAAAT-3′；
M-R：5′-CCACTGTATCGCTGAGCTAGGT-3′。
5.根据权利要求2所述的用EDG1基因g.42041062G>T位点提高肉牛产肉性能的方法，其特征在于，步骤S1中，PCR方法的扩增程序为：PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s60℃30s，72℃30s，35个循环；最后72℃延伸7min，保存4℃。
6.根据权利要求2所述的用EDG1基因g.42041062G>T位点提高肉牛产肉性能的方法，其特征在于，步骤S1中，PCR方法的反应体系共25μL，其中，10pmol/μL上下游引物各1.25μL，2×TaqMasterMix12.5μL，50～100ng/μL基因组DNA2μL，ddH2O8μL。
7.根据权利要求1所述的用EDG1基因g.42041062G>T位点提高肉牛产肉性能的方法，其特征在于，所述产肉性能包括腰角宽、背膘厚、眼肌面积、肌内脂肪含量。
8.根据权利要求1或7所述的用EDG1基因g.42041062G>T位点提高肉牛产肉性能的方法，其特征在于，所述肉牛为秦川牛或中国西门塔尔牛。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| LI等: "Effect of Expressions and SNPs of Candidate Genes on Intramuscular Fat Content in Qinchuan Cattle", ANIMALS, vol. 10, no. 8, pages 1 - 6 * |
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