KR100838707B1

KR100838707B1 - 중신 줄기세포주

Info

Publication number: KR100838707B1
Application number: KR1020060117430A
Authority: KR
Inventors: 이창규; 손혜영; 이유진; 김혜선; 김민구; 박치훈; 김정은
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2006-11-27
Filing date: 2006-11-27
Publication date: 2008-06-16
Also published as: KR20080047676A

Abstract

본 발명은 중신 줄기세포주(mesonephric stem cell line)를 제조하는 방법 및 중신 세포-유래 줄기세포주에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 (a) 포유동물의 중신으로부터 중신 세포를 수득하는 단계; (b) 상기 중신 세포를 피더 세포층 상에서 배양하여 콜로니를 형성시키는 단계; 및 (c) 상기 콜로니를 계대 배양하여 중신 줄기세포주를 수득하는 단계를 포함한다. 본 발명의 중신 줄기세포주는 본 발명자들에 의해 최초로 구축된 것이며, 이에 배반포의 내부세포괴와 태아 생식선의 원시생식세포 이외의 새로운 줄기세포 소스를 제시한다. 또한, 본 발명의 중신 줄기세포주는 다양한 세포로 분화될 수 있으며, 세포이식 치료를 통하여 다양한 질병 또는 질환을 치료할 수 있으며, 이종간장기이식(xenotransplantation)에 이용되는 형질전환 동물의 개발에 이용될 수 있다.

중신, 줄기세포, 이종간장기이식, 배양

Description

중신 줄기세포주{Mesonephric Stem Cells Lines}

도 1은 돼지 중신 줄기세포(Porcine Mesonephric Stem Cells: PMSCs)의 분리 및 배양 결과를 보여주는 도면이다. 패널 (A): 26-30일째(발정 = 0일)의 돼지 태아(배아)의 중신으로부터 PMSCs를 분리하였다. ▲ 중신, ↑ 생식융기. PMSCs를 중신의 바깥쪽 부분에서 분리하였다. 패널 (B): 그라인딩된 신선한 중신 조직은 알칼린 포스파타아제(AP)에 대한 염색에서 양성반응을 나타내었다. 패널 (C): AP-양성 콜로니, 피더층에 씨딩된 후 7일째의 세포덩어리. 패널 (D): 7^th 패시지의 배양된 PMSCs 콜로니는 마우스 ESCs-유사 형태를 나타내었다. 패널 (E): AP-양성 콜로니, 8^th 패시지의 PMSCs. 패널 (F): 중신, PMSCs 및 난모세포(생식세포-양성 대조군)에서 VASA mRNA 발현 양상을 보여주는 RT-PCR 젤의 사진. 하우스-키핑 유전자로서의 β-액틴은 대조군으로 이용되었다(A, B, E, F): 400 x, (C): 40 x.

도 2는 면역조직화학 염색 결과이다. 돼지 태아로부터 얻은 중신 조직(27일째)을 Oct-4(패널 A-F) 및 SSEA-1(패널 G-L)에 대하여 염색하였다. Oct-4가 염색되었다. 패널 (A): 제1차 항체 없이 Oct-4에 대하여 염색한 네가티브 대조군. 패널 (B): 중신의 바깥쪽 부분(+) 및 생식선으로 이동 중인 생식세포(*)는 양성반응을 나타내었다. Oct-4 양성반응 세포의 확대 이미지. 패널 (C,D): 이동한 생식 세포 및 패널 (E,F): 중신 튜블. SSEA-1을 염색하였다. 패널 (G,H): 제1차 항체 없이 SSEA-1에 대하여 염색한 네가티브 대조군. 패널 (I,J,L): 중신의 튜블 세포(+)의 표면이 SSEA-1에 대하여 양성 반응을 나타내었다. 중신 조직의 확대 이미지. 패널 (I,J,K): 원시생식기-동맥 부위(*)는 SSEA-1 음성 반응을 나타내었다. 핵은 헤마톡실린(청색)으로 염색하였다. (A,B,G,I): 40 x, (C,E,J): 200 x, (D,F,H,K,L): 400 x (x40).

도 3은 배양된 돼지 중신 줄기세포의 특성을 보여주는 사진이다. 패널 (A): 제1차 항체가 없는 네가티브 대조군, 패널 (B): Oct-4에 대한 강한 양성 반응, 패널 (C): SSEA-1에 대한 양성 반응, 패널 (D): SSEA-4에 대한 양성 반응, 패널 (E): Tral-60에 대한 약한 양성 반응, 패널 (F): Tral-81에 대한 양성 반응. (A-F): 400 x.

도 4는 장기간 배양된 PMSCs가 정상적인 핵형을 보유한다는 것을 보여주는 사진이다. 패널 (A): 4개월 인 비트로 배양 후에 대표적인 염색체들에 대하여 핵형 분석하였다(n=38). 패널 (B): SRY 유전자 발현에 대한 RT-PCR 분석 결과이다. 분화된 PMSCs는 SRY 유전자를 발현 하였다.

도 5는 인 비트로 분화된 돼지 중신 줄기세포(PMSCs)를 보여준다. 패널 (A): 배아유사체. PMSCs의 자연적인 분화결과, 신경필라멘트(패널 B) 및 β Ⅲ 튜블린(패널 C) 항체를 이용한 외배엽 세포에 대한 면역조직화학 염색에서 양성 반응을 나타내었고, α-페토단백질 항체를 이용한 내배엽 세포에 대한 면역조직화학 염색에서 양성 반응을 나타내었으며, 트로포닌 I 항체(패널 E)를 이용한 중배엽 세 포에 대한 면역조직화학 염색에서 양성 반응을 나타내었다.

도 6은 유전자 발현 프로파일을 조사한 RT-PCR 결과이다. 줄기세포 마커인 Oct-4, Tert 및 Nanog, 외배엽 마커인 Nestin 및 GFAP, 중배엽 마커인 트로포닌 I 및 패스트 골결근 트로포닌 T3, 내배엽 마커인 α1-안티트립신 및 α-페토단백질의 mRNA 발현 양상을 조사하였다. 중신(MT), 분화전 PMSCs(Undi), 분화 5일(Di5) 및 분화 25일(Di25)에 대한 세포. 네가티브 대조군으로서 MEF와 WB를 이용하였다. “WB"는 cDNA 없는 PCR 결과이다. 하우스-키핑 유전자로서 β-액틴의 발현을 대조군으로 이용하였다.

도 7은 중신 줄기세포의 배양에 대한 피더세포의 종류와 수의 영향을 보여주는 사진이다. 패널 A-D는 각각 ICR 마우스 피더(2.5 x 10⁵/ml), ICR 마우스 피더(1.5 x 10⁵/ml), CF-1 마우스 피더(1.5 X 10⁵/ml) 및 STO 피더(2.5 x 10⁵/ml)를 사용하여 중신 줄기세포를 배양한 결과이다.

본 발명은 중신 줄기세포주(mesonephric stem cell line)를 제조하는 방법 및 중신 세포-유래 줄기세포주에 관한 것이다.

돼지는 면역학적으로 그리고 생리학적으로 다른 동물 종들 보다 인간과 유사하다[1]. 돼지 줄기세포주의 구축은, 형질전환 돼지의 생산뿐만 아니라 발달 유전자 조절의 연구 및 생의학 연구에 유용하다[2, 3, 4]. 이는 줄기세포 생물학의 발전을 기여하며, 인간 임상 연구에 기여한다[5]. 설치류 및 인간의 다양한 조직으로부터 줄기세포를 분리하고 특성을 연구하는 데에는 많은 성공적인 사례가 있음에도 불구하고, 비설치류 동물의 줄기세포에 대한 연구는 거의 없는 실정이다[6]. 돼지에 있어서, 줄기세포는 배반포의 내세포괴로부터 유래된 배아줄기(ES) 세포[4, 7, 8], 원시생식기의 원시생식세포로부터 유래된 배아생식(EG) 세포[9,10,11], 태아 피부[6] 및 성체 피부[12]로부터 유래된 피부 줄기세포 및 간엽줄기세포로서의 성체 줄기세포[13]가 알려져 있다.

중신(mesonephros)은 중간(intermediate) 중배엽으로부터 유래되는 일시적인 신장 기관으로서, 척추동물의 배아에서 배발생 동안에만 기능을 나타낸다[14]. 원시생식기 내의 원시생식세포(PGCs)로부터 유래되는 배아생식세포(EGCs)[9, 10, 11, 15, 16], 대동맥-원시생식기-중신(AGM) 부위에서의 조혈줄기세포(HSCs)[17, 18]는 줄기세포의 소스로서 인식된다. 따라서, 중신은 다양한 줄기세포의 소스로서의 영역으로 판단될 수 있다. 내부세포괴 및 원시생식세포는 전능성 줄기세포(pluripotent stem cells)의 소스이며, 상기 세포는 미분화 표현형의 공통적인 마커인 알칼린 포스파타아제(AP) 활성에 대하여 염색되며[9, 20], 돼지의 ES 세포 및 EG 세포로서의 전능성 줄기세포는 피더세포 상에서 미분화된 상태로 유지된다[7-12].

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 새로운 줄기세포 소스(source)를 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 중신 세포로부터 줄기세포를 구축할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 중신 줄기세포주(mesonephric stem cell line)의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 중신 세포-유래 중신 줄기세포주를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 중신 줄기 세포주(mesonephric stem cell line)의 제조방법을 제공한다: (a) 포유동물의 중신으로부터 중신 세포를 수득하는 단계; (b) 상기 중신 세포를 피더 세포층 상에서 배양하여 콜로니를 형성시키는 단계; 및 (c) 상기 콜로니를 계대 배양하여 중신 줄기세포주를 수득하는 단계.

본 발명의 방법을 각 단계에 따라 구체적으로 설명하면 다음과 같다:

(a) 중신 세포의 준비

본 발명의 가장 큰 특징 중 하나는 줄기세포(전능성 줄기세포 또는 다능성 줄기세포, 바람직하게는 전능성 줄기세포)의 소스로서 중신(mesonephros)를 이용한는 것이다. 본 발명자들이 아는 범위에서, 중신 유래 세포를 이용하여 줄기세포를 구축하였던 종래 기술은 없다.

본 명세서에서 출발세포인 중신 세포는 중신의 조직으로부터 얻을 수 있다. 중신은 중간 중배엽으로부터 유래되는 일시적인 신장 기관으로서, 척추동물의 배아에서 배발생 동안에만 기능을 나타낸다[14].

본 명세서에서 용어 “중신 줄기세포주”는 중신 세포로부터 유래된 줄기세포로서, 실질적인 변화(예컨대, 유전적, 생리학적 변화 등) 없이 장시간 배양(예컨대, 1년 이상)이 가능한 줄기세포로서 안정성을 나타내는 줄기세포를 의미한다. 따라서, 용어 “중신 줄기세포주”는 용어 “중신 줄기세포”와는 다른 의미를 갖는다. 용어 “중신 세포로부터 유래된”은 중신 세포를 출발세포로 하여 이를 인 비트로 배양하여 줄기세포주를 구축한다는 의미를 갖는다.

중신 세포를 수득하는 방법을 요약하면 다음과 같다: 배아(또는 태아)를 얻은 다음, 이로부터 중신을 분리한다. 이어, 중신 조직을 그라인딩 하여 중신 세포를 수득한다.

중신 세포는 다양한 포유동물의 중신으로부터 얻을 수 있으며, 바람직하게는 인간, 돼지, 소, 양, 말, 토끼, 염소, 마우스, 햄스터 및 래트로부터 얻을 수 있으며, 가장 바람직하게는 돼지로부터 얻을 수 있다.

(b) 중신 세포의 배양

상기 과정에서 수득한 중신 세포를 적합한 배지에서 배양하여 줄기세포를 포함하는 콜로니를 형성시킨다.

콜로니를 형성시키기 위하여 중신 세포를 배양하는 경우에는, 포유동물 줄기세포를 수득하기 위하여 사용되는 통상적인 어떠한 배지도 사용할 수 있다.

예를 들어, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol . 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지 (Morgan et al., Proc . Soc . Exp . Bio. Med ., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer . Med . Assoc . 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp . Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물 (Barnes, D. et al., Anal. Biochem . 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/1 (Waymouth, C. J. Natl . Cancer Inst . 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc . Soc . Exp . Biol . Med . 100:115(1959)), MCDB 시리즈 (Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978)) 및 Ham's F10 등이 이용될 수 있다. 가장 바람직하게는, DMEM 및 Ham's F10의 혼합물이다. 배지에 대한 설명은, R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, Inc., New York, WO 97/47734 and WO 98/30679에 상세하게 기재되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

이 단계에서 사용되는 배지에는 적합한 성장인자 및 혈청이 포함된다. 예를 들어, 줄기세포 인자(SCF), 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF) 및 우태아혈청이 배지에 포함된다. 또한, 이 단계에서 사용되는 배지에는 적합한 분화억제인자, 예컨대, 류케미아 억제인자(LIF)가 포함된다.

이외에도, 이 단계에서 사용되는 배지에는 L-글루타민, β-머캅토에탄올, 비필수 아미노산 및 항생제-항진균제가 포함될 수 있다.

본 발명의 가장 바람직한 구현 예에 따르면, 이 단계에서 사용되는 배지는, 줄기세포 인자, 염기성 섬유아세포 성장인자, 우태아혈청, 류케미아 억제인자, L-글루타민, β-머캅토에탄올, 비필수 아미노산 및 항생제-항진균제가 보충된 DMEM 및 Ham's F10의 혼합물이다.

이 과정에서 중신 세포는 피더세포층 상에서 배양된다. 본 발명의 방법에 적합한 피더층은 다양한 동물로부터 유래된 섬유아세포 및 상피세포를 포함하며, 예를 들어, 마우스 배아 섬유아세포(MEF), 인간 섬유아세포-유사 세포, 닭 섬유아 세포, 자궁상피세포, STO 및 SI-m220 피더 세포주, 그리고 BRL 세포를 포함한다. 바람직하게는, 이 단계에서 사용되는 피더세포층은 배아 섬유아세포이며, 보다 바람직하게는 마우스 섬유아세포이며, 가장 바람직하게는 ICR 마우스로부터 유래된 배아 섬유아세포이다. ICR 마우스 유래 배아 섬유아세포는, 줄기세포의 배양에서 통상적으로 이용되는 다른 피더 세포, 예컨대 CF-1 마우스 유래 배아 섬유아세포 및 STO보다 중신 줄기세포의 배양에 매우 적합하다. 한편, 적합한 피더세포의 수는 제한되지 않지만, ICR 마우스 유래 배아 섬유아세포를 이용하는 경우, 바람직하게는 1.8-2.8 x 10⁵ 세포/ml(배지의 부피), 보다 바람직하게는 2.0-2.8 x 10⁵ 세포/ml, 가장 바람직하게는 2.3-2.5 x 10⁵ 세포/ml이다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 피더 세포는 유사분열 활성이 없는(mitotically inactive) 세포이다. 이러한 유사분열 비활성 세포는 마이토마이신 C와 같은 항-유사분열제를 세포에 처리하여 얻을 수 있다. 유사분열 비활성 피더 세포를 사용함으로써, 그에 의해 지지되는 세포보다 우세하여 성장하는 것을 막을 수 있다.

이러한 배양 과정을 적합한 기간 동안 실시하면 중신 세포로부터 콜로니가 형성되며, 이 콜로니는 배아줄기세포의 형태를 갖는다. 배양 기간은 특별하게 제한되지 않으며, 가장 바람직하게는 6-8일이다.

(c) 중신 줄기세포주의 구축

상기 과정에서 수득한 콜로니를 계대배양(subculturing)하여 중신 줄기세포주를 구축한다.

이 단계에서 콜로니의 계대 배양은 상술한 (b) 단계에서의 배양 방법이 적용된다. 예를 들어, 사용되는 배지 및 피더 세포층은 상술한 (b) 단계에서 기재된 것들이 적용된다. 계대 배양은 바람직하게는 6-8일 마다 새로운 배지를 이용하여 실시된다.

계대 배양에 의해 줄기세포(전능성 줄기세포 또는 다능성 줄기세포) 특성을 안정되게 나타내는 중신 줄기세포주를 수득한다.

줄기세포주의 구축은 다양한 방법을 통하여 확인할 수 있다. 예를 들어, 줄기세포 마커인, 알칼린 포스파타아제(AP), Oct-4, SSEA(stage-specific embryonic antigen)-1, SSEA-4, Tral-60, Tral-81, Tert 및/또는 Nanog의 발현 여부를 확인하여 줄기세포주의 구축을 확인할 수 있다.

또한, 줄기세포주의 구축은, LIF의 부재 하에서 자연적(spontaneous) 분화를 유도하여 배아유사체(embryonic body: EB)를 형성하는 지 여부를 확인하여 할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 최종 단계에서 얻는 중신 줄기세포주는 알칼린 포스파타아제, Oct-4, SSEA(stage-specific embryonic antigen)-1, SSEA-4, Tral-60 또는 Tral-81에 대한 염색반응에서 양성 반응을 나타낸다. 바람직하게는, 상기 중신 줄기세포주는 Tert 및 Nanog를 발현한다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 최종 단계에서 얻는 중신 줄기세포주는 EB를 형성하는 능력을 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 상기 중신 줄기세포주는 Vasa 유전자를 발현하지 않으며, 이는 본 발명에 의해 구축된 중신 줄기세포주가 원시생식세포로부터 유래된 줄기세포와는 다른 리니지(lineage)를 갖는다는 것을 나타낸다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 포유동물의 중신 세포-유래 중신 줄기세포주로서, 상기 중신 줄기세포주는 알칼린 포스파타아제에 대한 양성 반응을 나타내며, 배아유사체로 자연분화할 수 있는 능력을 가지는 것을 특징으로 하는 중신 세포-유래 중신 줄기세포주를 제공한다.

중신 줄기세포주는 본 발명자들에 의해 최초로 개발 및 제안된 것이다. 본 발명의 중신 줄기세포주에 의해, 줄기세포에 대한 또 하나의 소스(source)가 제공되는 것이다.

본 발명의 중신 줄기세포주는 전능성(pluripotent) 특성을 나타낸다. 용어 “전능성”은 3종의 배엽(내배엽, 중배엽 및 외배엽)의 세포로 발달할 수 있는 능력을 의미한다. SCF, bFGF, LIF 및 피더세포층의 부재 하에서, 본 발명의 중신 줄기세포주를 배양하면 3종의 배엽에 대한 마커에 대하여 양성반응을 나타내는 배아유사체를 형성한다: α-페토 단백질(내배엽), 심장 트로포닌 1(중배엽) 및 βⅢ-튜블린과 신경필라멘트(외배엽).

본 발명의 줄기세포주를 만들기 위한 중신 세포는 다양한 포유동물의 중신으로부터 얻을 수 있으며, 바람직하게는 돼지, 소, 양, 말, 토끼, 염소, 마우스, 햄 스터 및 래트로부터 얻을 수 있으며, 가장 바람직하게는 돼지로부터 얻을 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 중신 줄기세포주는 Oct-4, SSEA(stage-specific embryonic antigen)-1, SSEA-4, Tral-60 또는 Tral-81에 대한 염색반응에서 양성 반응을 나타낸다. 또한, 본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 중신 줄기세포주는 Tert 및 Nanog를 발현한다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 중신 줄기세포주는 EB를 형성하는 능력을 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 중신 줄기세포주는 Vasa 유전자를 발현하지 않으며, 이는 본 발명의 중신 줄기세포주가 원시생식세포로부터 유래된 줄기세포와는 다른 리니지(lineage)를 갖는다는 것을 나타낸다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 중신 줄기세포주는 상술한 본 발명의 방법에 의해 제조된 것이다.

본 발명의 중신 줄기세포주는 다양한 세포로 분화될 수 있다. 따라서, 본 발명의 중신 줄기세포주는 다양한 종류의 세포를 제공하는 우수한 소스(source)가 될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 중신 줄기세포주는 적합한 환경(조건 또는 자극)에 의해, 조혈모세포, 신경세포, 베타세포, 근세포, 간세포, 연골세포, 상피세포, 요로관세포 등으로 분화될 수 있다. 줄기세포의 분화에 적합한 배지 및 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(Palacios, et al., PNAS. USA, 92:7530-7537(1995); Pedersen, J. Reprod. Fertil. Dev., 6:543-552(1994); and Bain et al., Dev. Biol, 168:342-357(1995)).

본 발명의 중신 줄기세포주는 이식 치료(transplantation therapy)를 통해 많은 치료학적 용도를 갖는다. 예를 들어, 본 발명의 중신 줄기세포주는 당뇨병, 파킨슨병, 알쯔하이머병, 척수 손상, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 근육 이영양증, 간 질환, 콜레스테롤 과잉혈증, 심장 질환, 족부궤양, 위장관 질환, 혈관 질환, 신장 질환, 요도관 질환 및 노화 등을 치료하는 데 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 중신 줄기세포주는, 이종간장기이식(xenotransplantation)에 이용되는 형질전환 동물의 개발에 이용될 수 있다.

본 발명의 중신 줄기세포주의 기술적 달성(accomplishment) 및 이점(advantages)을 요약하면 다음과 같다:

(a) 중신 줄기세포주는 본 발명자들에 의해 최초로 구축된 것이다.

(b) 본 발명의 중신 줄기세포주는 내세포괴와 원시생식세포 이외의 새로운 줄기세포 소스를 제시한다.

(c) 본 발명의 중신 줄기세포주는 다양한 세포로 분화될 수 있으며, 세포이식 치료를 통하여 다양한 질병 또는 질환을 치료할 수 있다.

(d) 본 발명의 중신 줄기세포주는 이종간장기이식(xenotransplantation)에 이용되는 형질전환 동물의 개발에 이용될 수 있다

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

돼지 중신 세포(Porcine Mesonephric cells)의 분리

임신 26-30일째(발정 = 1일)에 자궁적출술을 이용하여 교잡종 어린 암퇘지의 돼지 태아를 수집하였다. 1% 항생제-항진균제(Gibco BRL) 및 0.4% BSA가 보충된 PBS(Antibio-PBS/BSA)에서 태아를 세척하였다. 외측 중신 표면을 따라 길게 도출된 기관(longitudinal protrusions)으로 검출되는 중신을 분리하고 Antibio-PBS/BSA에서 세척하였다. 플랫 실린지 바닥을 이용하여 중신 조직을 아래쪽으로 압착하고 갈아 돼지 중신 세포를 분리한 다음 2000 rpm에서 5분 동안 원심분리 하였다.

PMSCs (Porcine Mesonephric stem cells)의 배양

사이토카인, 용해성 40 ng/ml 재조합 인간 줄기세포 인자(SCF; R&D systems), 20 ng/ml 재조합 인간 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF; R&D systems)와 10 ng/ml 인간 류케미아 억제인자(LIF; Chemicon)를 포함하며, 15% 우태아혈청(FBS, Hyclone), 2 mM L-글루타민(Gibco BRL), 0.1 mM β-머캅토에탄올(Gibco BRL), 1% MEM 비필수 아미노산(Gibco BRL) 및 1% 항생제-항진균제(Gibco BRL)가 보 충된 DMEM(low glucose, Gibco BRL) 및 함스 F10(Gibco BRL) 배지의 50:50 혼합물로 이루어진 PES 배지에서 돼지 PMSCs를 배양하였다[10]. 상기 과정에서 분리된 돼지 중신 세포를 마이토마이신-C(Roche) 처리된 ICR 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 피더 세포(2.5 x 10⁵ 세포) 상에 플레이팅 하고, 37℃에서 5% CO₂의 습윤 환경에서 배양하였다. 배지를 매일 교환하였다. 0.25% 트립신/EDTA(Gibco BRL)를 배양물에 5분 동안 처리하여, 배양 6-8일 후의 ES-유사 형태를 가지는 PMSCs-유래 콜로니를 분리하고, 새로운 피더 세포층에 옮겼다.

PMSC 의 기타

상기 과정에서 구축된 PMSCs 중에서, 하나의 세포주를 “PMSC050901m(pMS-SNU1)"이라 명명하고 국제기탁기관인, 한국세포주연구재단에 2006년 10월 30일에 기탁하고 기탁번호 KCLRF -BP-00147을 부여받았다.

PMSCs 의 분화

컨플루언시 상태로 성장된 PMSCs을 트립신 처리하고, 세포를 "행잉 드랍(hanging drops)(30 ㎕/드랍, 2 x 10⁶ 세포/ml)" 방식으로 5일 동안 배양하여 배아유사체(embryoid bodies: EBs)를 형성시켰다. 사이토카인이 없는 15% 우태아혈청(FBS, Hyclone), 2 mM L-글루타민(Gibco BRL) 및 1% 항생제-항진균제가 보충된 DMEM(low glucose, Gibco BRL)에서 EBs를 배양하였다. 5일 후, EBs를 페트리 디 쉬에 옮기고 5일 동안 배양하였다. 그 후, EBs를 0.25% 트립신-EDTA로 해리시키고, 12-웰 플레이트에 다시 플레이팅 하였다. 배지를 2일에 한번씩 교체하였다.

PMSCs 의 특성 연구

PMSCs를 계대 후 6-7일 동안 배양하였다. 이어, 배양 플레이트를 PBS로 두 번 세척하고, PMSCs를 PBS 내의 4% 포름알데하이드로 실온에서 15분 동안 고정화 하였다.

알칼린 포스파타아제(AP) 염색

PMSCs의 AP 활성을 모두 패시지에서 분석하였다. 세척한 다음, 고정된 세포를, 완충액(0.1 M Tris-HCl, pH 9.5 및 0.1 M NaCl)이 있는 NBT(nitro blue tetrazolium chloride)/BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate, toluidine salt) 스톡 용액(Roche)을 이용하여 30분 동안 실온에서 염색 하였다.

면역조직화학 또는 면역세포화학 염색

염색을 위하여 파라핀 섹션 및 배양 세포를 준비하였다. 파라핀 섹션에서, 27일째의 생식융기(genital ridge) 및 중식의 조직을 PBS내 4% 파라포름알데하이드에서 고정하고, 파라핀에 임베딩 하였다. 각각의 섹션(5 ㎛)을 슬라이드에 놓고 면역조직화학 염색을 실시하였다. 섹션로부터 파라핀을 제거하고 수화시켰다. 고정된 세포 또는 조직 섹션을 BSA(1 mg/ml)/PBS로 두 번 세척하였다. 내인성 퍼 옥시다아제 활성을 없애기 위하여 0.3% 과산화수소로 15분 동안 처리하였다. 세포를 BSA/PBS에서 두 번 세척하였다. BSA/PBS with 10% 염소 혈청(Sigma)가 있는 BSA/PBS 블록킹 용액을 30분 동안 적용시켰다. 이어, SSEA1 (Chemicon MAB4301), SSEA4 (Chemicon MAB4304), Tra 1-60 (Chemicon MAB4360), Tra 1-81 (Chemicon MAB4381), Oct-3/4 (Santacruze sc-9081), 신경필라멘트(Chemicon MAB1615), βⅢ 튜불린(MAB1637), 심장 트로포닌 1(MAB3152) 및 α 페토단백질에 대한 일차항체와 세포를 반응시켰다. 일차항체를 2 ㎍/ml의 BSA/PBS (SSEA1, Tra 1-60 및 Tra 1-81) 또는 1 ㎍/ml의 BSA/PBS(SSEA4 및 Oct-4)에서 희석하여 사용하였다. 일차항체를 시료 적용한 다음 4℃에서 하룻밤 동안 보관하였다. 그 다음날, 시료를 BSA/PBS로 세 번 세척하였다. 이차항체를 시료에 적용한 다음 실온에서 1시간 동안 보관하였다. 모든 시료에 대하여, 이차항체로서 DakoCytomation LSAB 2 System-HRP code K0675(DakoCytomation)를 이용하였다. 시료를 BSA/PBS로 세 번 세척하였다. DAB(갈색, 3,3’-diminobenzidine, Vector Laboratories) 또는 AEC(적색, 3-amino-9-ethylcarbazole, Zymed Laboratories Inc.)에 의한 발색 반응 분석을 하였다.

핵형 분석

커버 글래스가 있는 4-웰 플레이트 상의 PMSCs를 24시간 동안 배양하고 150 ㎕의 colcemid (KARYO MAX^TM COLCEMID^TM Solution, Gibco)로 1시간 동안 37℃에서 5% CO₂ 습윤 환경에서 처리하였다. PBS로 세척한 다음, 세포를 0.75 M KCl을 포함하는 저장성 용액으로 처리하고 메탄올-아세트산으로 고정 및 염색체 염색을 실시하였다.

RT- PCR (reverse transcriptase -polymerase chain reaction) 분석

총 RNA를 TRizol^TM 시약(Invitrogen)을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 세포로부터 분리하였다. M-MLV 역전사효소 키트(Invitrogen)를 이용하여, 20 ㎕ 반응 혼합물에 대하여 1 ㎍ RNA를 cDNAs로 전환하였다. 증폭된 유전자, 프라이머 및 어닐링 온도는 표 1에 정리되어 있다.

유전자	5‘ 프라이머	3‘ 프라이머	어닐링 온도 (℃)	증폭물 크기 (bp)
Oct-4	AGGTGTTCAGCCAAACGACC	TGATCGTTTGCCCTTCTGGC	55	316
Nanog	AATCTTCACCAATGCCTGAG	GGCTGTCCTGAATAAGCAGA	55	141
TERT	TGTTTGCTGTGCTGAACTAC	GTCCACCTTGACAAAGTACAG	53	161
네스틴	GGCTTCTCTCAGCATCTTGG	AGGCTGGCATAGGTGTGTC	55	150
GFAP	ACATCGAGATCGCCACCTAC	ACATCACATCCTTGTGCTCC	55	219
트로포닌 I	GTAGTGGATGAGGAGAGATATGAC	ATGGACACCTTGTGTTTAGAG	48	194
패스트 골격근 트로포닌 T3	CAGACGGCCCGGGAAATGA	TCGTATTTCTGGCGCTTCA	48	165
α-1-암티트립신	CACCGTATTTGCTCTGGTGAAC	TCACAGTGGTGGAGGTCGAA	48	161
α-페토단백질	GGAGCTGCGGCCTCTTC	GCTCCTGTGGTCGCCATT	53	700
SRY	CGTGAAACTAGAGGAAGTGG	ATAGCCCGGGTATTTATCTC	50	246
VASA	TTGCAGGACGAGATTTGATG	CCAATTCTCGAGTTGGTGT	53	165
β-액틴	CCTGGAGAAGAGCTACGAG	TTCATGATGGAGTTGAAGGT	55	153

1 ㎕ cDNA, 1 ㎕(10 picomol) 프라이머, 10 ㎕ i-StarTaq 2x PCR 마스터 믹스 용액(iNtRON BIOTECHNOLOGY) 및 7 ㎕ 증류수를 포함하는 증폭 반응용액을 이용하였다. 온도 사이클은 94℃에서 2분 동안 반응시킨 다음, 94℃ 20초, 어닐링온도 10초 및 74℃ 20초의 총 35사이클을 포함한다. PCR 후, 5 ㎕ 반응물을 EtBr (ethidium bromide)이 있는 1.2% 아가로스 젤에서 전기영동 하고, UV 조사 하에서 가시화 하였다. 프라이머 서열은 다음의 GenBank 데이터 및 문헌을 참조하여 디자인 하였다: Oct-4 (316bp, [12]), TERT (161bp, AY785158), Nanog (141bp, DQ447201), 네스틴 (150bp, [6]), GFAP (219bp, [21]), 트로포닌 I (194bp, NM_213912), 패스트 골격근 트로포닌 T3 (165bp, AJ301278, [22]), VASA (165bp, AY626785, [23]), SRY (246bp, U49860) 및 β-액틴 (153bp, AY550069).

Vasa는 생식 세포에서 발현되는 것으로 알려져 있다[23-25]. 본 발명자들은 Vasa 양성 대조군으로써 난모세포를 이용하였다. 난소를 성성숙전(prepubertal)의 어린 암퇘지로부터 회수하고 30-35℃ 생리식염수에 넣어서 실험실로 이송하였다. 직경 3-6 mm의 난포로부터 난포액 및 포-난자 복합체(cumulus-oocyte complexes: COCs)를 18-게이지 바늘로 흡입하였다. 조밀한 COCs를 선별하였다.

실험 결과

PMSCs 의 분리 및 검출

PMSCs를 분리하기 위하여, 태아를 개별적으로 절개 분리 하여 중신에 대동맥-원시생식기 부위와 같은 다른 조직이 결합하지 않도록 중신을 분리하고, 중신의 외부 표면 조직을 그라인딩 하였다. 중신 조직 세포의 일부를 그라인딩 하고, 즉시 고정한 다음 AP에 대하여 염색하였다(도 1, 패널 A-B). 많은 중신 조직 세포들이 AP에 대한 강하게 염색되었다. 세포들을 피더 세포인 마이토마이신 C-처리 MEF에 플레이팅 하고 배양하였으며, 배지는 매일 교체 하였다. 배양 3일 후부터, 일차 PMSCs 콜로니들이 성장하기 시작하였고, 이들 콜로니들은 AP에 대하여 강하게 염색되었다(도 1, 패널 C). 배양 6-8일 후, 일차 콜로니들을 0.25% 트립신-EDTA로 분리시키고, 새로운 피더 세포에 플레이팅 하였다. 마우스 ES 세포-유사 또는 돼지 EG 세포-유사 형태를 가지는 다수의 콜로니들을 피더층과의 배양 과정에서 관찰할 수 있었다(도 1, 패널 D). PMSCs를 7일에 한번씩 패시지시켰고, 각각의 패시지는 AP에 대하여 염색 되었다(도 1, 패널 E). Vasa 발현은 후-마이그레이션 단계에서 시작되며 배발생 동안의 원시생식세포 및 생식자발생 과정의 생식 세포에 한정적으로 발생하며, 후-유사분열 단계까지 발현된다[23-25]. 본 실험에 따르면, Vasa는 중신 및 PMSCs에서 검출되지 않았고(도 1, 패널 F), 따라서 본 발명에서 얻은 세포는 원시생식세포가 아니라는 것을 알 수 있었다.

임신 후 27일째에 대동맥-원시생식기-중신(AGM) 부위에서, Oct-4 및 SSEA-1가 파라핀 조직 섹션에서 관찰되었다(도 2). Oct-4는 원시생식기 부위에 있는 각각의 크고 둥근 세포들에서 염색되었고(도 2, 패널 C-D), 이들 세포는 마우스에서 발견되는 이동된 원시생식세포와 유사하였다[26]. 또한, 중신 조직의 외부 튜블에서도 Oct-4 양성이 관찰되었다. Oct-4 양성 세포들에서 주로 세포질이 염색되었고, 몇몇의 핵도 염색되었으며(도 2, 패널 E-F), 이는 원시생식세포에서의 Oct-4 염색과는 다른 양상이다. SSEA-1은 중신 튜블의의 세포 표면에 존재하였으나(도 2, 패널 I, J 및 L), SSEA-1-양성 세포들은 대동맥-원시생식기 부위에서는 관찰되지 않았다(도 2, 패널 I-K). 이차항체 단독으로는 염색되는 파라핀 섹션이 없었다(도 2, 패널 A, G 및 H).

한편, 중신 줄기세포의 구축 및 유지는 피더의 종류와 수에 대하여 대체적으로 민감하게 반응하였다. 도 7의 패널 A-D는 각각 ICR 마우스 피더(2.5 x 10⁵/ml), ICR 마우스 피더(1.5 x 10⁵/ml), CF-1 마우스 피더(1.5 X 10⁵/ml) 및 STO 피더(2.5 x 10⁵/ml)를 사용하여 중신 줄기세포를 배양한 결과이다. A와 B를 비교하였을 때, ICR 마우스 피더 수가 많을 때가 적을 때보다 미분화 중신 줄기세포 콜로니를 더 유지시켜주는 것을 볼 수 있다. B와 C를 비교하였을 때 마우스 피더의 종류에 따라 ICR이 CF-1 마우스보다 미분화 중신 줄기세포 콜로니를 더 강하게 지탱해 주는 것을 볼 수 있다. D의 STO 피더를 사용할 때는 수적으로 많아도 ICR 마우스 피더나 CF-1마우스 피더를 사용하는 것보다 확연하게 미분화 중신 줄기세포를 지탱해 줄 수 없는 것을 알 수 있다.

PMSCs 의 특성 연구

인간 재조합 염기성 FGF, SCF 및 LIF와 같은 사이토카인을 포함하는 PES 배지에서 AP 양성-둥근 모양의 콜로니들이 20 패시지 이상에서도 계속적으로 만들어졌다. Oct-4, SSEA-1, SSEA-4, Tra1-60 및 Tra1-81에 대한 항체로 면역세포화학 염색을 실시한 경우, 모든 PMSCs는 양성으로 염색되었다. Oct-4 (도 3, 패널 B) 및 SSEA-1(도 3, 패널 C)에 대한 항체를 이용한 반응의 세기는 다른 항체들(도 3, 패널 D-F)보다 강하였다. 더욱이, Tra1-60은 약하게 염색되었다(도 3, 패널E). 모든 항체에 대한 특이성을 일차항체 없이 시험 하였다(도 3, 패널 A). 돼지 EG 세포와 거의 동일한 형태 및 항원 발현 양상이, PMSCs에서 관찰되었다. PMSCs에서 Oct-4, SSEA-1 및 SSEA-4 항원이 존재하는 것은, 돼지 EG 세포와 유사한 특성이다 [11].

배양 4개월 후에 핵형 분석을 실시하였다. 염색체의 수는 정상적인 핵형을 나타내었다(도 4). 한편, SRY 유전자가 발현된다는 것을 RT-PCR로 확인하였다(도 4). SRY(성-결정 부위 Y 유전자를 의미한다)는 Y 염색체에 존재하기 때문에, 본 실험에서 얻은 PMSCs는 웅성이다.

인 비트로 분화

컨플루언시 상태로 성장된 PMSCs를 트립신 처리하고, 사이토카인과 피더층 없이 FBS-함유 배지에서 행잉 드랍 방식으로 세포를 배양하였다. 배양 5일 후, PMSCs로부터 배아유사체(EB)를 형성시키고, 페트리 디쉬로 옮겼다. PMSCs의 EB는 추가적으로 더 분화되어 시스틱 EB (도 5, 패널 A)를 형성하였다. EBs는 3개의 배엽으로부터 유래된 조직을 포함한다: 내배엽, 중배엽 및 외배엽[27]. 5일 후, EBs를 트립신-EDTA로 처리한 다음, 배양 디쉬에 다시 플레이팅 하였다. 자연적으로 분화된 PMSCs를 15일 이상 배양하였고, βⅢ-튜블린(외배엽, 도 5 패널 B), 신경필라멘트(외배엽, 도 5, 패널 C), α-페토 단백질(내배엽, 도 5, 패널 D) 및 심장 트로포닌 1(중배엽, 도 5 패널 E)에 대한 항체로 면역조직화학 염색을 하여 3개의 배엽의 존재를 확인하였다. 내배엽 마커로서의 α-페토 단백질은 25일 이상 배양된 분화된 PMSCs에서 관찰되었다.

PMSCs 의 유전자 발현 프로파일

본 발명의 PMSCs의 줄기세포 특성을 평가하기 위하여, 줄기세포 마커로서의 Oct-4, Tert 및 Nanog, 외배엽 마커로서의 Nestin 및 GFAP, 중배엽 마커로서의 트로포닌 I 및 패스트 골격근 트로포닌 T3, 내배엽 마커로서의 α1-안티트립신 및 α-페토단백질에 대한 mRNA 발현 양상을 RT-PCR로 분석하였고, 중신 조직, 미분화 PMSCs, 분화 초기 PMSCs 및 분화 말기 PMSCs에 대하여 실험을 하였다(도 6). 중신 조직은 줄기세포 및 3개 배엽 세포들의 혼합 세포를 가지고 있었다. 그러나, 미분화 PMSCs는 내배엽 세포를 가지고 있지 않았고, 감소된 중배엽 세포를 가지고 있었다. Oct 4 mRNA는 미분화 PMSCs에서는 발현되었으나, 분화 초기 세포에서는 발현되지 않았고, 분화 후기 세포에서 다시 발현 되었다. PMSCs의 분화가 진행될수록 Tert 발현이 중신보다 증가하는 양상을 나타내었다. Nanog의 발현은, 중신, 미분화 PMSCs 및 분화된 PMSCs에서 관찰되었다. 중배엽 마커는 mRNA 수준에서 검출되지 않았으나, 분화된 PMSCs의 배양 세포에서 면역세포화학염색에 의해서는 검출되었다.

실험결과에 대한 논의 사항

돼지의 중신은 중간 중배엽으로부터 유래되는 일시적인 신장 기관으로서, 돼지의 발생 동안에만 기능을 나타낸다. 마우스에서, 제한적인 조혈은 대동맥-원시생식기-중신(AGM) 부위에서 시작되며[17, 18], 원시생식세포는 생식융기로 이동하여 이곳에 집중된다[28]. 마우스에서 중신 조직은 AP에 대하여 염색되지 않았지만(데이터 미제시), 돼지 중신 조직은 강한 AP-양성 세포를 가지고 있었다. 또한, 줄기세포 마커로서의 Oct-4 및 SSEA-1이 돼지 중신 조직에 존재하였고, 생식세포 마커로서의 Vasa 유전자는 검출되지 않았다. 따라서, 중신은 다른 줄기세포 리니지를 가지고 있음을 알 수 있다.

PMSCs에 대하여 형태 및 줄기세포 마커(Oct-4, SSEA-1, SSEA-3, Tra1-60 및 Tra1-81) 분석을 하였다. 염색된 Oct-4, SSEA-1 및 SSEA-3는 돼지 EG 세포주에 유사하였다[11]. PMSCs 형태 및 항원 발현은 EG 세포와 유사하였는데, 그 이유는 상기 두 세포 모두 마우스 세포를 피더층으로 이용하고 공통된 사이토카인(재조합 인간 bFGF, SCF 및 LIF)를 이용하여 배양되기 때문이다. PMSCs는, 돼지 EG 세포와 같이[29], 피더 세포의 조건 및 수에 민감하였다(데이터 미제시). Oct-4는 전능성 줄기세포에서 주로 발현되는 것으로 알려져 있으며, 성숙한 동물에서는 생식세포에서만 발현된다[30]. Oct-4 mRNA는 중신과 PMSCs에서 발현되었고, 이 발현은 PMSCs의 분화 초기 단계에서 상실되었다가 분화 후기 단계에서 재개되었다. Oct-4는 PMSCs에서 강력한 줄기세포 마커로서 기능을 하였고, 그 이유는 Oct-4가 모든 조직 섹션 및 미분화 세포에서 염색 되었고, mRNA 발현이 확인 되었기 때문이다. 전능성 줄기세포의 마커로서의 Tert 및 Nanog는 분화된 PMSCs에서 발현되었다. 따라서, 분화된 PMSCs는 줄기세포 파퓰레이션을 가지거나 생식된 줄기세포를 가지고 있음을 알 수 있다. 외배엽 마커로서의 Nestin 및 GFAP는 중신, PMSCs, 태아 섬유아세포(데이터 미제시) 및 귀 섬유아세포(데이터 미제시), 모두에서 발현되었다. 분화가 일어나는 경우 PMSCs는 세포 타입이 변화되며, 3개의 배엽이 검출되었다.

결론적으로, 본 실험은 중신 조직의 익스플랜트는 전능성 줄기세포의 서브파퓰레이션을 포함한다는 것을 보여준다. 돼지 중신은 생식융기보다 크기가 크며 세포수도 많이 포함한다. 따라서, 본 발명의 돼지 줄기세포 기술은, 유전자 타겟팅 기술과 함께, 이종간장기이식(xenotransplantation)에 이용되는 형질전환 동물의 개발을 가능하게 한다.

위에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 중신 줄기세포주(mesonephric stem cell line)를 제조하는 방법 및 중신 세포-유래 줄기세포주를 제공한다. 본 발명의 중신 줄기세포주는 본 발명자들에 의해 최초로 구축된 것이며, 이에 내세포괴와 원시생식세포 이외의 새로운 줄기세포 소스를 제시한다. 또한, 본 발명의 중신 줄기세포주는 다양한 세포로 분화될 수 있으며, 세포이식 치료를 통하여 다양한 질병 또는 질환을 치료할 수 있으며, 이종간장기이식(xenotransplantation)에 이용되는 형질전환 동물의 개발에 이용될 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음의 단계를 포함하는 전능성(pluripotent) 중신 줄기세포주(mesonephric stem cell line)의 제조방법:

(a) 인간을 제외한 포유동물의 중신으로부터 중신 세포를 수득하는 단계;

(b) 상기 중신 세포를 피더 세포층 상에서 배양하여 콜로니를 형성시키는 단계; 및

(c) 상기 콜로니를 계대 배양하여 중신 줄기세포주를 수득하는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 포유동물은 돼지, 소, 양, 말, 토끼, 염소, 마우스, 햄스터 또는 래트인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 포유동물은 돼지인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 피더 세포층은 섬유아세포의 층인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 섬유아세포는 ICR 마우스로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 섬유아세포는 유사분열 활성이 없는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 섬유아세포의 수는 1.8-2.8 x 10⁵ 세포/ml인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 류케미아 억제 인자(leukemia inhibitory factor) 및 bFGF(basic fibroblast growth factor)의 존재 하에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 중신 줄기세포주는 알칼린 포스파타아제, Oct-4, SSEA(stage-specific embryonic antigen)-1, SSEA-4, Tral-60 또는 Tral-81에 대한 염색반응에서 양성 반응을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 중신 줄기세포주는 Vasa 유전자를 발현하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
포유동물의 중신 세포-유래 전능성(pluripotent) 중신 줄기세포주로서, 상기 중신 줄기세포주는 알칼린 포스파타아제에 대한 양성 반응을 나타내며, 배아유사체로 자연분화할 수 있는 능력을 가지는 것을 특징으로 하는 중신 세포-유래 전능성(pluripotent) 중신 줄기세포주.
제 11 항에 있어서, 상기 포유동물은 돼지, 소, 양, 말, 토끼, 염소, 마우스, 햄스터 또는 래트인 것을 특징으로 하는 전능성(pluripotent) 중신 줄기세포주.
제 12 항에 있어서, 상기 포유동물은 돼지인 것을 특징으로 하는 전능성(pluripotent) 중신 줄기세포주.
제 11 항에 있어서, 상기 중신 줄기세포주는 Oct-4, SSEA(stage-specific embryonic antigen)-1, SSEA-4, Tral-60 또는 Tral-81에 대한 염색반응에서 양성 반응을 나타내는 것을 특징으로 하는 전능성(pluripotent) 중신 줄기세포주.
제 11 항에 있어서, 상기 중신 줄기세포주는 Vasa 유전자를 발현하지 않는 것을 특징으로 하는 전능성(pluripotent) 중신 줄기세포주.
제 11 항에 있어서, 상기 중신 줄기세포주는 상기 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 전능성(pluripotent) 중신 줄기세포주.