KR20060007460A - 양수세포를 이용한 인간배아 줄기세포의 배양방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 양수세포를 이용한 인간배아 줄기세포의 배양방법에 관한 것이다.

본 발명의 세포배양방법은 양수세포를 인간배아 줄기세포 배양을 위한 영양세포층으로 이용하는 방법과, 양수세포를 배양한 후 수거한 배양액을 인간배아 줄기세포의 배양액으로 이용하는 방법을 포함한다.

본 발명의 세포배양방법에 의해 배양된 인간배아줄기세포는 미분화 세포의 세포학적, 면역학적, 유전학적 특징을 유지한다. 또한 본 발명의 세포배양방법에 의해 배양된 인간배아줄기세포는 분화 조건에서 배아체를 잘 형성하여, 다양한 조직으로 분화되는 능력을 지닌다.

따라서 본 발명의 세포배양방법은 인간배아 줄기세포를 이용한 치료 및 연구 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

양수세포를 이용한 인간배아 줄기세포의 배양방법 {Culture method for human embryonic stem cells by using amniotic fluid cells}

도 1은 양수세포를 영양세포층으로 이용하여 배양한 인간배아 줄기세포의 형태적 특성을 나타낸 도이다.

도 2는 양수세포 배양 후 수거한 배양액을 사용하여 배양한 인간배아 줄기세포의 형태적 특성을 나타낸 도이다.

도 3은 양수세포를 영양세포층으로 이용하여 배양한 인간배아 줄기세포의 핵형분석도이다.

도 4는 양수세포를 영양세포층으로 이용하여 배양한 인간배아 줄기세포에서 배아세포 특이적 세포막 항원 발현을 나타낸 도이다.

도 5는 양수세포를 영양세포층으로 이용하여 배양한 인간배아 줄기세포에서 Oct-4 mRNA의 발현을 나타낸 도이다.

도 6은 양수세포를 영양세포층으로 이용하여 배양한 인간배아 줄기세포의 텔로머라제 활성도를 나타낸 도이다.

도 7은 양수세포를 영양세포층으로 이용하여 배양한 인간배아 줄기세포를 분화시킨 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 양수세포를 이용한 인간배아 줄기세포(human embryonic stem cells)의 배양방법에 관한 것이다.

인간배아줄기세포는 인간의 포배시기(blastocyst)의 내세포괴(inner cell mass)에서 유래한 세포이다. 이들 세포들은 인간의 몸을 구성하는 삼배엽성 세포들로 분화할 수 있는 능력을 지니고 있으며, 1998년 Thomson 등이 인간배아 줄기세포의 배양에 성공한 이후, 줄기세포를 이용한 세포 치료(cell therapy) 분야가 각광받고 있다.

인간배아 줄기세포는 생쥐배아 줄기세포(mouse embryonic stem cell)와 달리, 미분화 상태를 계속 유지하며 증식시키기 위하여 영양세포층(feeder layer)을 필요로 한다. 지금까지의 인간배아 줄기세포의 배양에서는 주로 생쥐배아섬유아세포(mouse embryonic fibroblast, MEF)를 영양세포층으로 사용하여 왔다.

그러나 이와 같이 인간배아 줄기세포를 다른 종의 세포와 함께 배양하는 경우 바이러스에 감염될 가능성이 높으며, 추후 세포치료의 걸림돌로 작용하게 되는 문제가 있다.

이에 Xu 등(2001)은 생쥐배아섬유아세포를 배양한 배양액을 인간배아줄기세포의 배양액으로 사용함으로써, 영양세포층 없이 인간배아줄기세포를 배양하는데 성공하였다. 그러나 이 방법 역시 인간과는 다른 종의 세포인 생쥐배아섬유아세포의 배양 후 수거한 배양액을 이용하였기 때문에, 이종세포에 노출된다는 문제점을 전혀 배제한 것이라고 볼 수는 없다.

따라서 최근에는 다른 종의 세포를 영양세포층으로 이용하지 않고 인간에서 유래한 세포를 이용한 배양방법에 대한 연구가 이루어지고 있다.

Amit 등(2003)은 신생아의 포피세포(foreskin)를 이용하여 인간배아줄기세포를 미분화상태로 배양 및 유지하는 방법을 개시하였다.

Cheng 등(2003)은 인간성체골수세포(human adult marrow cell)를 이용하여 인간배아줄기세포를 배양하는 방법을 개시하였다.

또한 Richarde 등(2002, 2003)은 다양한 세포를 이용하여 인간배아줄기세포를 배양한 결과, 유산된 태아의 근육과 피부에서 유래한 세포가 미분화상태를 유지할 수 있었다고 보고한 바 있다.

한편, 임신 중 태아로부터 탈락되어 나오는 세포인 양수세포(amniotic fluid cells)에서 미분화세포의 표식인자인 Oct-4가 발현된다고 보고된 바 있다(Prusa et al.,2003).

이에 본 발명자들은 양수세포를 영양세포층으로 이용하거나, 그 배양액을 인간배아 줄기세포의 배양액으로 사용하면 줄기세포의 미분화 특성을 유지하면서 안정적으로 배양할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명에서는 양수세포를 이용함으로써, 미분화 특성을 유지하면서 인간배아 줄기세포를 안정적으로 배양할 수 있는 세포배양방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 양수세포를 이용한 인간배아 줄기세포의 배양방법을 제공한다.

본 발명의 세포배양방법은 양수세포를 인간배아 줄기세포 배양을 위한 영양세포층으로 이용하는 방법을 포함한다.

상기 방법은 1) 양수세포의 배양단계, 2) 양수세포와 인간배아 줄기세포의 공배양(coculture) 단계로 이루어진다.

양수세포는 태아가 산모의 뱃속에서 자라고 있을 때 양수로 탈락되어 나오는 태아의 세포이다. 양수세포는 양수 내에서 그 함량비율이 매우 적지만, 분열능이 왕성하므로 적절한 조건에서 초기 배양을 진행하여 다량의 세포를 얻을 수 있다.

제 1)단계에서는 양수를 원심분리하여 얻은 세포 침전물에 배지를 첨가하여, 적절한 양을 배양 접시에 심는다.

상기 단계에서 사용가능한 배지는 Chang 배지, AmnioMax 등이 있다.

세포군의 밀도를 확인하면서 계대배양을 시행하여 세포를 충분히 증식시킨 후, 세포를 분주하여 다음 단계에 사용할 때까지 액체질소통에 냉동보관한다.

냉동보관된 양수세포를 인간배아 줄기세포의 배양을 위한 영양세포층으로 사용할 때는, 미분화 상태를 유지해야하므로 세포분열을 억제시키는 약물인 미토마이신 C(mitomycin C)를 처리한다.

제 2) 단계에서는 상기에서 준비한 양수세포와 배아줄기세포 SNUhES 세포주(서울대학교 의과대학 산부인과)를 공배양한다.

상기 단계에서 사용할 수 있는 배지는 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)과 페니실린(Penicillin), 스트렙토마이신(Streptomycin) 등이 포함된 KO-DMEM 배지, DMEM/F12 등을 이용할 수 있다.

배아 줄기 세포군(colony)이 형성되면 세포 덩어리(clump) 당 100-200개의 줄기세포가 존재하도록 분획하여 7일 간격으로 계대배양하면서 세포의 상태를 관찰한다.

또한 본 발명의 세포배양방법은 양수세포를 배양한 후 수거한 배양액(conditioned media)을 인간배아 줄기세포의 배양액으로 이용하는 방법을 포함한다.

상기 방법은 1) 양수세포를 배양한 후 그 배양액을 수거하는 단계, 2) 상기 배양액으로 인간배아 줄기세포를 배양하는 단계로 이루어진다.

제 1)단계에서, 양수세포를 배양하는 방법은 상기 양수세포를 영양세포층으로 이용하는 방법의 1)단계와 같다.

이후 양수세포에 미토마이신 C 를 처리한 후, FBS가 포함된 DMEM 배지를 사용하여 세포배양용 플라스크에 배양한다. 세포 밀도가 70-80% 이상일 때 새 배지로 교환하여 일주일동안 매일 24시간 이후로 배지를 걷어낸다. 수거한 배지는 멸균용 필터를 이용하여 여과한 후, 다음 단계에서 사용될 때까지 냉동보관한다.

제 2)단계에서는 상기에서 수거한 배지(conditioned media)를 이용하여 인간배아 줄기세포를 배양한다.

배아 줄기 세포군이 형성되면 세포 덩어리 당 100-200개의 줄기세포가 존재하도록 분획하여 7일 간격으로 계대배양하면서 세포의 상태를 관찰한다.

본 발명의 세포배양방법에 의해 배양된 인간배아줄기세포는 정상적인 핵형을 가지며, 미분화 세포의 형태적 특징을 그대로 나타낸다.

본 발명의 세포배양방법에 의해 배양된 인간배아줄기세포는 미분화세포의 세포막 표식 인자인 알칼리성 포스파타아제(Alkaline phosphatase), SSEA(stage specific embryo antigen)-3, SSEA-4, Tra-1-60, Tra-1-81를 발현한다.

본 발명의 세포배양방법에 의해 배양된 인간배아줄기세포는 미분화 배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC), 배아생식세포(embryonic germ cell, EGC)와 배아암종세포(embryonic carcinoma cell, ECC) 등에서 특징적으로 발현되어 다잠재성 줄기세포 확립에 필수적인 요소로 알려진 Oct-4(octamer-binding transcription factor-4) mRNA를 발현한다.

본 발명의 세포배양방법에 의해 배양된 인간배아줄기세포는 노화되지 않고 증식이 계속되는 세포에서 높은 활성을 나타내는 효소인 텔로머라제(telomerase) 활성을 나타낸다. 텔로머라제는 염색체의 말단부위에 존재하는 텔로미어(telomere)의 길이를 유지할 수 있게 해주는 효소로 세포의 무한 증식과 생존에 관여하며, 배아조직의 표식인자로 알려져 있다.

본 발명의 세포배양방법에서, 양수세포 배양 후 수거한 배양액을 사용하여 영양세포층 없이 인간배아 줄기세포를 배양한 경우에도 초기 4-5번의 계대배양시까지 미분화 상태를 유지하면서 인간배아 줄기세포를 배양할 수 있다.

따라서 본 발명의 세포배양방법은 미분화 특성을 유지하면서 인간배아 줄기세포를 안정적으로 배양할 수 있게 한다.

본 발명의 세포배양방법에 의해 배양된 인간배아줄기세포는 분화 조건에서 배아체(embryoid body)를 잘 형성한다.배아체는 인간배아줄기세포를 이용한 분화실험에 있어서 기본적으로 형성되어야 하는 형태이다.

따라서 본 발명의 세포배양방법에 의해 배양된 인간배아줄기세포는 향후 각종 조직으로의 분화실험에 이용되는데 문제가 없을 것으로 생각된다.

또한 본 발명의 세포배양방법에 의해 배양된 인간배아 줄기세포는 양수세포에 미토마이신 C를 처리했는지의 여부에 상관없이 상기와 같은 결과를 일관되게 나타내었다. 즉, 본 발명의 세포배양방법은 영양세포의 증식 여부에 상관없이 인간배아 줄기세포를 미분화 상태로 안정하게 배양할 수 있으므로, 줄기세포의 배양과정에 소요되는 시간 및 비용을 절감하는 효과가 있다.

본 발명의 세포배양방법은 인간 유래의 세포를 이용하여 인간배아 줄기세포를 배양하므로, 이종의 영양세포층으로 인한 감염의 우려 없이 세포치료를 위한 세포이식에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 본 발명의 방법에 의한 인간배아 줄기세포의 배양 - 1

본 발명의 세포배양방법 중 양수세포를 영양세포층으로 이용하는 방법에 의해 다음과 같이 인간배아 줄기세포를 배양하였다.

1) 양수세포의 분리 및 배양

본 발명의 방법에 의해 양수세포를 배양하였다.

산전유전진단을 위한 염색체 검사용으로 채취된 양수 10㎖을 1000rpm에서 8분간 원심분리하였다.

원심분리 결과 얻은 세포 침전물에 Chang 배지(Irvine scientific) 1㎖을 첨가하고, 그 부유액을 in situ 배양 접시 내에 위치한 덮개 유리 슬라이드 위에 0.5㎖씩 나누어 심었다.

37??, 5% CO₂ 조건이 유지되는 세포배양기에서 이틀간 배양한 후, 다음날 영양 배지 2㎖을 첨가해 주고 약 일주일 동안 위상차 현미경에서 세포관찰을 통해 부착된 세포군의 밀도를 확인하며 배지를 교환해 주었다. 4-5 개 정도로 세포군이 슬라이드에 부착된 것을 확인한 후, 0.25% trypsin-EDTA를 처리하여 2개의 배양접시안의 덮개 슬라이드에 계대배양을 시행하였다.

이후 덮개 슬라이드 위에 부착된 세포군의 밀도와 세포분열 중인 세포의 밀도를 확인하여 계대배양 및 핵형분석을 위한 세포 수확(harvest)을 시행하였다. 세포 수확 및 핵형분석 완료 후, 나머지 계대배양된 양수세포는 세포 상태를 확인하여 0.25% trypsin-EDTA를 0.5㎖ 처리하고 35mm 배양접시 한 개당 25cm² T-flask 1개에 각각 계대배양하였다.

이틀 후 상기 25T-flask에 배지를 첨가하고, 삼일째 되는 날 다시 25T flask 1개를 75 cm² T-flask 2개에 나누어 계대배양하였다. 이 2개의 75cm² T-flask를 각 각 5개의 75 T-flask에 나누어 계대배양하였다. 배양된 세포들을 다시 0.25% trypsin-EDTA로 처리하고, 5% DMSO가 포함된 배지에 2 X 10⁶ 세포수가 되도록 세포를 분주하여 액체질소통에 냉동보관하였다.

상기와 같이 냉동보관된 양수세포는 인간 배아 줄기 세포의 미분화 상태로 체외 장기 배양을 위한 영양 세포층으로 이용되기 위해, 세포분열을 억제시키는 약물인 미토마이신 C(mitomycin C)를 0.01mg/㎖의 농도로 150분간 처리하였다. 또한 미토마이신 C를 처리하지 않은 양수세포도 영양 세포층으로 이용하였다.

2) 양수세포 영양층을 이용한 인간배아 줄기세포 배양

상기 1)에서 얻은 양수세포들을 영양층으로 이용하여 인간배아 줄기세포를 배양하였다.

20:1로 희석한 마트리젤(matrigel)로 전처리한 배양접시를 준비하고, mitomycin C를 처리하여 분열능을 억제시킨 양수세포와 mitomycin C를 처리하지 않은 양수세포를 각각 영양세포층으로 사용하여 배아줄기세포 SNUhES 세포주(서울대학교 의과대학 산부인과)를 배양하였다.

배양액은 20% 혈청 대체물(serum replacement, SR, Gibco), 0.4ng/㎖의 bFGF(basic fibroblast growth factor, Invitrogen), 1% 비필수 아미노산(non-essential amnio acid), 0.1mM 베타-머캡토에탄올(??-mercaptoethanol), 0.5% 페니실린/스트렙토마이신(penicilline/ streptomycin)을 함유하는 DMEM-F12를 사용하였 다.

미분화된 배아 줄기 세포군(colony)을 미세한 유리칼(glass knife)로 세포 덩어리(clump) 당 100-200개의 줄기세포가 존재하도록 분획한 후 7일 간격으로 계대배양하고, 세포의 형태를 관찰하여 그 결과를 도 1에 나타내었다(양수세포에 미토마이신 C를 처리한 경우 2일(a), 7일(b) 및 양수세포에 미토마이신 C를 처리하지 않은 경우 2일(c), 7일(d)).

도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 배양방법에 따라 배양된 인간배아 줄기세포는 작고 둥근 모양을 지니며, 여러 개의 인이 관찰되고, 세포내 세포질에 비해서 핵의 비율이 현저하게 높아 전형적인 줄기세포 세포군 형태를 나타내었다.

이러한 형태는 쥐 배아 섬유세포를 영양세포층으로 이용하여 배양한 인간배아 줄기세포와 일치하는 것으로(Amit 등,2003), 32 계대까지 배양하여도 그 형태가 유지되었다.

특히 본 발명의 방법에 의해 배양된 인간배아 줄기세포는 양수세포에 미토마이신 C를 처리했는지의 여부에 상관없이 같은 결과를 나타내었다.

따라서, 본 발명의 방법에서 영양세포층으로 이용하는 양수세포는 기존에 사용된 영양세포와 비슷한 수준으로 인간배아 줄기세포를 미분화 상태로 배양할 수 있음을 알 수 있다.

[실시예 2] 본 발명의 방법에 의한 인간배아 줄기세포의 배양 - 2

본 발명의 세포배양방법 중 양수세포 배양액을 인간배아 줄기세포의 배양액 으로 이용하는 방법에 의해 다음과 같이 인간배아 줄기세포를 배양하였다.

1) 양수세포의 배양 및 배양액 수거

양수세포의 분리 및 배양은 상기 실시예 1의 1)과 같은 방법에 의해 수행하였다.

상기와 같이 준비한 양수세포에 미토마이신 C를 처리한 후, 2 X 10⁶개/㎖의 밀도로 25 cm² T flask에 배양하였다. FBS가 포함된 DMEM 배지를 사용하여 배양하면서, 세포 밀도가 70-80% 이상일 때 새 배지로 교환해주었다. 일주일동안 매일 24시간 이후로 배지를 걷어낸 후, 멸균용 필터로 여과함으로써 인간배아 줄기세포의 배양에 사용할 배양액(conditioned media)을 준비하였다.

2) 양수세포 배양액을 이용한 인간배아 줄기세포의 배양

0.1% 젤라틴(gelatin)으로 전처리한 배양접시를 준비하고, 상기 1)에서 제조한 배양액을 사용하여 배아줄기세포 SNUhES 세포주(서울대학교 의과대학 산부인과)를 배양하였다.

미분화된 배아 줄기 세포군을 미세한 유리칼로 세포 덩어리 당 100-200개의 줄기세포가 존재하도록 분획한 후 7일 간격으로 계대배양하고, 세포의 형태를 관찰하여 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 배양방법에 따라 배양된 인간배아 줄기 세포는 상기 실시예 1에서 배양한 세포와 비슷하게 미분화 세포의 형태적 특징을 나타내었다.

이러한 경향은 초기 4-5 계대까지 지속되어, 세포 분열이 활발한 미분화 세포들을 관찰할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 방법에서 영양세포층으로 이용하는 양수세포는 기존에 사용된 영양세포와 비슷한 수준으로 인간배아 줄기세포를 미분화 상태로 배양할 수 있음을 알 수 있다.

[실험예] 본 발명의 방법에 의해 배양된 인간배아 줄기세포의 미분화 특성 및 분화능력 확인

(1) 핵형분석

본 발명의 방법에 의해 배양된 인간배아 줄기세포의 미분화 특성을 분석하기 위해, 상기 실시예 1에서 배양한 인간배아 줄기세포에 대해 다음과 같이 핵형분석을 수행하였다.

200개의 세포군을 물리적으로 양수 영양 세포층에서 분리시켜 15㎖ 코니칼 튜브(conical tube)에 모은 후 Chang 배지를 이용하여 전체 부피가 1㎖이 되도록 하고, 콜세미드(Colcemid, 10㎍/㎖)를 21G 바늘로 15방울 집적하여 4시간 세포 배양기에서 배양하였다.

시간이 지나면 1000rpm에서 8분 원심 분리하여 그 침전물을 1㎖ dPBS로 세척한 후, 다시 원심분리하고 그 침전물에 0.25% trypsin-EDTA 200㎕을 첨가하여 섞 어준 후 3분간 방치하였다. 배지 1㎖을 첨가하고 원심 분리한 후 0.075M KCl 저장액에서 20분간 중탕하였다.

카노이 고정액(Canoy fixing reagent, Methanol: Acetic acid= 3:1)을 0.5㎖ 첨가하여 원심 분리한 후, 1차 고정과 2차 고정과정을 수행하였다. 표본 슬라이드 제작 후 김자 염색(Gimsa banding by trypsin and Giemsa, GTG)을 수행하여 슬라이드를 관찰하였다. 염색체 이상의 표기법은 1995년 제정된 ISCN(International System for human Cytogenetic Nomenclature)의 명명규약을 따랐으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다(양수세포에 미토마이신 C를 처리한 경우:a, 양수세포에 미토마이신 C를 처리하지 않은 경우:b).

도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 배양된 인간배아 줄기세포는 양수세포에 미토마이신 C를 처리했는지의 여부에 상관없이 정상적인 핵형을 나타내어, 44개의 상염색체와 XX 성염색체를 가지는 것을 확인할 수 있었다.

(2) 면역조직 화학염색(immunohistochemical staining)

본 발명의 방법에 의해 배양된 인간배아 줄기세포의 미분화 특성을 분석하기 위해, 상기 실시예 1에서 배양한 인간배아 줄기세포에 대해 미분화 배아 줄기 세포의 세포 표면 표식자(cell surface marker)로 알려진 막 단백질을 대상으로 하여 활성도 측정 및 면역염색을 수행하였다.

본 실시예에서 사용한 표식자 단백질은 알칼리성 포스파타아제, 스테이지 특이적 배아 항원 SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, 그리고 Tra-1-60, Tra-1-81이었다.

알칼리성 포스파타아제의 측정은 알칼리성 포스파타아제 검출 키트(Sigma, USA)를 이용하여 다음과 같이 수행하였다.

기존의 배양액을 제거한 후 PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4)를 첨가하여 두 번 세척하였다. 여기에 시트레이트-아세톤-포름알데히드 용액(citrate-acetone-formaldehyde solution)을 1분간 처리하여 고정시킨 후, PBS로 2분간 2번 세척하였다. 나프톨 AS-BI 알칼리성 용액(Naphthol AS-BI alkaline solution)을 처리하여 15분간 발색반응을 수행하였다. 15분 후 PBS로 2분간 3번 세척하여 발색 유무를 관찰하였다. 상기 모든 과정은 상온이 유지되는 암실에서 수행하였다.

또한 스테이지 특이적 배아 항원 SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, 그리고 Tra-1-60, Tra-1-81에 대해, 다음과 같이 면역조직 화학염색을 실시하였다.

우선 배양액을 제거한 후 ES 세포에 4% 파라포름알데히드를 첨가하여 30분간 고정하였다. 고정 후, 3% H₂O₂을 10분간 처리하였고 PBS로 5분간 3번 세척하였다. 비특이적인(nonspecific) 반응의 억제를 위해 1시간 동안 정상 염소 혈청(normal goat serum)을 처리하였다.

1시간 후, 각 표식 인자에 대한 일차항체(primary antibody)를 1시간 동안 처리한 후, PBS로 3분간 3번 세척하였다. SSEA-1에 대한 일차항체는 MC-480를 이용하고, SSEA-3에 대한 일차항체는 MC 631를 이용하고, SSEA-4에 대한 일차항체는 MC-813-70 항체를 이용하였으며, 각각 1:100의 농도로 희석하여 사용하였다.

곧이어 이차항체를 45분간 처리하였다. 이차항체(secondary antibody)는 벡 타스테인 ABC 키트(Vectastaine ABC kit)의 마우스 항체(Mouse Ig)를 이용하였다.

이차항체 처리 후 PBS로 3분간 3번 세척하고, ABC(avidin biotin peroxidase complex, Vestor) 용액을 30분간 처리하였다. 다시 PBS로 3분간 3번 세척한 후, 발색시약인 페록시다아제 기질 키트 DAB(Peroxidase substrate kit DAB, Vestor)를 처리하여 20분간 발색반응을 수행하였다. 반응 후, PBS로 3분간 3번 세척하여 발색유무를 관찰하였다. 위의 모든 과정은 상온의 암실 상태에서 이루어졌다.

상기와 같이 각 표식 인자들의 발현 여부를 확인하여 그 결과를 도 4에 나타내었다(양수세포에 미토마이신 C를 처리한 경우의 알칼리성 포스파타아제 활성(a), Tra-1-60(b), Tra-1-81(c), SSEA-1(d), SSEA-3(e), SSEA-4(f) 및 양수세포에 미토마이신 C를 처리하지 않은 경우의 알칼리성 포스파타아제 활성(g), Tra-1-60(h), Tra-1-81(i), SSEA-1(j), SSEA-3(k), SSEA-4(l))

도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 배양된 인간배아 줄기세포는 양수세포에 미토마이신 C를 처리했는지의 여부에 상관없이, 그 세포 표면에 알칼리성 포스파타아제를 발현하는 것으로 나타났다.

또한 본 발명의 방법에 의해 배양된 인간배아 줄기세포는 SSEA-4, Tra-1-60, Tra-1-81에 대해서 양성 반응을 나타내었으며, SSEA-3는 부분적인 양성 반응을 나타내었다.

반면 마우스 배아줄기세포 특이적 인자인 SSEA-1에 대한 반응은 관찰되지 않았다.

3) Oct-4 발현 확인

본 발명의 방법에 의해 배양된 인간배아 줄기세포의 미분화 특성을 분석하기 위해, 상기 실시예 1에서 배양한 인간배아 줄기세포에 대해 Oct-4 mRNA의 발현여부를 관찰하였다.

우선 인간배아 줄기세포로부터 전체 RNA(total RNA)를 Chomczynski와 Sacchi(1987)의 방법에 따라 분리하였다.

각 조직을 피펫으로 분리하여 1.5㎖ 튜브로 옮기고, 시료 1g당 2-5㎖의 RNA 추출 완충용액[5 M 구아니디움 티오시아네이트(guanidium thiocyanate), 25 mM 소듐 시트레이트(sodium citrate, pH 7.0), 0.5% (w/v) 사코실(sarkosyl), 2 mM EDTA, 5% (w/v) - 머캡토에탄올(mercaptoethanol)]을 처리하여 세게 흔들어주었다.

0.5㎖ 2M 소듐 아세테이트(sodium acetate, pH 4.0), 5㎖ 페놀, 1㎖ 클로로포름:이소아밀알콜(v:v = 49:1)을 첨가하여 10초 동안 세게 흔들어 완전히 섞은 후, 4??에서 15분간 방치하였다. 10,000ㅧg, 4??에서 원심분리하여 얻은 상층액을 새로운 50㎖ 튜브로 옮기고, 5㎖ 이소프로판올을 첨가하여 부드럽게 아래위로 흔들어서 섞었다.

- 20??에서 최소 1시간 이상 방치한 후, 10,000ㅧg, 4??에서 원심분리하고 상층액을 제거하여 얻은 핵산 침전물을 1.4㎖ RNA 추출 완충용액에 녹였다. 1.4㎖의 이소프로판올을 첨가하고 -20??에서 최소 1시간 이상 방치한 후, 10,000ㅧg, 4??에서 원심분리하여 얻은 핵산 침전물을 75% 에탄올로 세척하고 DEPC(diethylpyrocabonate)를 처리한 증류수에 녹여 RT-PCR(Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction) 실험에 사용하였다.

ES 세포에서 분리한 1㎍의 전체 RNA를 주형으로 하고, 단일가닥 cDNA 합성 키트(1st strand cDNA synthesis kit, Roche)를 사용하여, 42??에서 60분간 역전사 반응을 수행하였다.

이후 99??에서 5분간 역전사효소를 불활성화시키고, 동일한 튜브에서 다음과 같은 프라이머(primer)가 첨가된 반응액에서 전체 반응물 5㎕를 주형으로 cDNA를 합성하였다. 이때 사용된 프라이머는 대조군인 베타 액틴 프라이머(??- actin primer)의 경우 정방향은 서열번호 1(5'-CGCACCACTGGCATTGTCAT-3'), 역방향은 서열번호 2(5'-TTCTCCTTGATGTCACGCAC -3'), Oct-4 프라이머의 경우 정방향은 서열번호 3(5'-GGCGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTC-3'), 역방향은 서열번호 4(5'-CTCGAACCACATCCTTCTCT-3')의 염기서열을 사용하였다.

PCR 반응조건은 94??에서 40초간 변성시키고, 61??에서 40초간 중합(annealing)한 후, 72??에서 40초 동안 확장시키는 반응을 35회 반복하도록 PCR을 수행하였다. PCR 생성물을 2% 아가로오스 겔에서 전기영동하여 DNA 밴드를 확인하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다(양수세포에 미토마이신 C를 처리한 경우 베타-액틴(1), Oct-4(2), 양수세포에 미토마이신 C를 처리하지 않은 경우 베타-액틴(3), Oct-4(4), 베타-액틴(5), 양수세포(6)).

도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 배양된 인간배아 줄기세포는 양수세포에 미토마이신 C를 처리했는지의 여부에 상관없이, Oct-4 mRNA를 발현하는 것으로 확인되었다.

4) 텔로머라제 활성 확인

본 발명의 방법에 의해 배양된 인간배아 줄기세포의 미분화 특성을 분석하기 위해, 상기 실시예 1에서 배양한 인간배아 줄기세포에 대해 텔로머라제 활성도를 측정하였다.

세포들을 1.5㎖ 튜브에 모은 후 텔로머라제 검출 키트(TRAPeze telomerase detection kit, Chemicon)에 포함되어 있는 200㎕의 분해 완충용액을 첨가하였다. 완충용액과 시료가 잘 섞이도록 한 후, 4??에서 30분간 방치하였다. 이 시료를 12,000ㅧg, 4??에서 원심분리 한 후 얻어진 상층액을 새 튜브로 옮겼다.

이렇게 얻어진 상층액을 텔로머라제 반응에 사용하였다. 이때 상층액 10㎕를 85??에서 10분간 변성시켜, 불활성화된 대조군을 준비하였다.

반응조건은 30??에서 30분간 반응시킨 후 94??, 30초간 변성시키고, 59??, 30초간 중합시키는 반응을 33회 반복하도록 하여 PCR을 수행하였다. PCR 생성물을 12.5 % 비변성(non-denature) 폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동하였다. 전기영동 후 폴리아크릴아마이드 겔에 염색약(SYBR green Ⅰ)을 첨가하여 단백질 밴드를 검출하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다(양수세포에 미토마이신 C를 처리한 경우 실험군(1), 대조군(2), 양수세포에 미토마이신 C를 처리하지 않은 경우 실험군(3), 대조군(3), 양수세포(6), 음성대조군(7), 양성대조군(8)).

도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 배양된 인간배아 줄기세포는 양수세포에 미토마이신 C를 처리했는지의 여부에 상관없이, 높은 텔로머라제 활 성도를 확인할 수 있었다.

5) 분화능력 확인

본 발명의 방법에 의해 배양된 인간배아 줄기세포가 분화조건에서 제대로 분화할 수 있는지 확인하기 위해, 상기 실시예 1에서 배양한 인간배아 줄기세포에 대해 분화를 유도하였다.

상기 실시예 1에서 배양한 인간배아 줄기세포를 약 500개의 배아 줄기 세포 덩어리로 분획하여, 시험관 아기 배양접시에서 2시간 배양기에 넣어두었다. 세포를 다시 꺼내어 4-5㎖의 배아체 배지가 들어있는 부유 배양접시로 옮겨 세포 배양기에서 배양하였다.

배양액은 20% 혈청 대체물, 0.4ng/㎖의 bFGF, 1% 비필수 아미노산, 0.1mM 베타-머캡토에탄올, 0.5% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM-F12를 사용하였다.

상기와 같은 분화유도조건에서 세포를 배양하면서 배아체의 형성 여부를 관찰하여 그 결과를 도 7에 나타내었다(양수세포에 미토마이신 C를 처리한 경우(a), 양수세포에 미토마이신 C를 처리하지 않은 경우(b)).

도 7에 나타난 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 배양된 인간배아 줄기세포는 양수세포에 미토마이신 C를 처리했는지의 여부에 상관없이, 배아체를 잘 형성하였다.

따라서, 본 발명의 방법에 의해 배양된 인간배아 줄기세포는 적절하게 조건 을 조절함으로써 다양한 조직으로 분화될 수 있음을 알 수 있다.

6) 결론

이상에서, 본 발명의 세포배양방법에 의해 배양된 인간배아 줄기세포는 양수세포의 세포증식을 억제하는 경우와 억제하지 않는 경우 모두 미분화 세포의 세포학적, 면역학적, 유전학적 특징을 유지함을 알 수 있다.

따라서 본 발명의 세포배양방법은 영양세포의 증식을 억제하는 약물을 굳이 처리하지 않고도, 인간배아 줄기세포를 미분화 상태로 안정하게 배양할 수 있다.

본 발명의 세포배양방법에 의해 배양된 인간배아줄기세포는 미분화 세포의 세포학적, 면역학적, 유전학적 특징을 유지한다.

본 발명의 세포배양방법에 의해 배양된 인간배아줄기세포는 분화 조건에서 배아체를 잘 형성하여, 다양한 조직으로 분화되는 능력을 지닌다.

특히 본 발명의 세포배양방법은 영양세포의 증식 여부에 상관없이 인간배아 줄기세포를 미분화 상태로 안정하게 배양할 수 있으므로, 줄기세포의 배양과정에 소요되는 시간 및 비용을 절감하는 효과가 있다.

따라서 본 발명의 세포배양방법은 인간배아 줄기세포를 이용한 치료 및 연구 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (2)

1. 양수세포를 배양한 후 수거한 배양액을 인간배아 줄기세포의 배양액으로 이용함을 특징으로 하는 인간배아 줄기세포의 배양방법
2. 제1항에 있어서, 1) 양수세포를 배양한 후 그 배양액을 수거하는 단계, 2) 상기 배양액으로 인간배아 줄기세포를 배양하는 단계로 이루어짐을 특징으로 하는 인간배아 줄기세포의 배양방법

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