CN111514314A - 改进的腺病毒配制品 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了药用腺病毒配制品，具体地而言是包括腺病毒的液体药用配制品。

Description

改进的腺病毒配制品
本申请是2014年9月16日提交的题为“改进的腺病毒配制品”的中国专利申请201480050694.8的分案申请。
发明领域
本发明涉及用于例如基因疗法和/或疫苗应用的腺病毒配制品和相关的药用产品。具体地而言，在此披露了针对腺病毒的液体配制品，当存放在约2℃-8℃范围或更高范围时，同时还与肠胃外给予相容，该液体配制品通过保留所含有的腺病毒的数量、效力(感染性)和质量改进了腺病毒的稳定性。
发明背景
腺病毒载体被认为是用于基因送递的最有效并广泛使用的运载体。在基因疗法和疫苗研究的领域中一个持续性挑战是产生液体腺病毒配制品，这些腺病毒配制品能够在药用产品的现实储存温度范围内，如从约2℃至约8℃，稳定这些病毒较长的时间。
腺病毒的生物活性取决于由二十面体外壳结构包围的核苷酸的至少一个核心序列的构象的完整性，该二十面体外壳结构由衣壳蛋白组成。不同于传统有机和无机药物，这些是非常复杂的生物结构和小化学或物理压力源，可以促进腺病毒粒子的降解。因此，为了确保合理的保质期，腺病毒制剂的良好配制品是至关重要的，但是稳定这些载体带来了特殊的挑战。腺病毒可能由于物理不稳定性而失去效力，这些物理不稳定性包括变性、聚集(可溶的和不溶解的聚集体形成)、沉淀和吸附，连同化学不稳定性，这些化学不稳定性包括水解、脱酰胺、和氧化。任何这些降解途径可以导致降低的生物活性，但是还可潜在地导致具有增加的毒性、和/或改变的免疫原性的副产物或衍生物的形成。
因此，它需要专门定制的方法找到腺病毒的稳固的配制品，确保在较宽的条件范围内的稳定性。将需要对缓冲液类型、pH和专业的赋形剂进行细致地优化，以保持腺病毒化学、物理和生物学上的稳定性。鉴于可以变化的所有因素，发现用于配制腺病毒的最佳条件承受着挑战，并且良好配制品的组合物是先验不可预知的。
冻干配制品存在并且是稳定的。然而，它们往往是相对昂贵的，在给予前需要费时的处理，并且效力在冻干过程中可能在一定程度上有所损失。存在在冷冻条件(-80℃)稳定的液体配制品，但是这些需要专门的装运和昂贵的贮存设施，使得可靠冷链几乎是不可能的，尤其是在分配网络的周边。因此，针对腺病毒的优选配制品是一种液体配制品，该液体配制品在2℃-8℃之间或更高的温度范围提供腺病毒稳定性。这种配制品可以存储在普通的冰箱，并且可以快速并容易地给予。
之前已经描述了针对腺病毒的液体配制品，例如在埃文斯(Evans)等人(2004)中。在所述申请中例示的最佳配制品是具有pH范围在7.5和8.5之间的Tris缓冲配制品。我们在此已经发现针对腺病毒所述配制品是次优的。在WO 00/29024中还披露了针对腺病毒的配制品，其主要涉及冻干技术。其他包括多元醇的腺病毒配制品在WO 00/29024中提到。
因此，在本领域存在找到以下配制品的需要，这些配制品在延长的时期内通过保留所含有的腺病毒的数量和效力改进腺病毒的稳定性。腺病毒稳定性还应当在运输过程中的搅拌应激的情况下，或生产或临床使用过程中的剪切力的情况下，并且在广泛的气候条件下，特别是在升高的温度下或反复冻/融循环后仍然保持。此外，该配制品应当适用于预期给予途径，应当被很好地耐受并且应当优选具有含尽可能少的组分的组合物。本发明的目的是提供此类针对腺病毒的配制品。
发明概述
我们已经发现了并且在此描述了以下针对腺病毒的配制品，与之前披露的配制品相比，这些针对腺病毒的配制品通过保留腺病毒的数量和效力(感染性)改进了腺病毒的稳定性。很明显，具有pH范围在5.5和6.5之间的柠檬酸盐缓冲液与羟丙基-β-环糊精(HBCD)的组合产生了出色的用于保留腺病毒的数量、效力(感染性)和质量的配制品，于此与本领域已知的其他配制品相比改进了整体腺病毒稳定性。
与用于配制品开发的所有赋形剂一样，在根据本发明的配制品中存在的组分中的一些单独地在现有技术中引用。然而，它是若干组分的非常特定的组合，该组合为本发明配制品提供了其优秀的特性和稳定化潜能。根据本发明的确切的配制品未披露于现有技术中。此外，它是无法预见的，基于在这固有不可预测的领域中的现有技术，所述配制品将对腺病毒提供这种改进的稳定性。
因此，本发明涉及可以例如用于基因疗法和/或疫苗应用的稳定化的腺病毒配制品和相关的药物产品。
根据本发明的配制品包括pH处于在5.5和6.5之间范围内的柠檬酸盐缓冲液，并进一步包括羟丙基-β-环糊精(HBCD)。该配制品另外包括盐和非离子型洗涤剂。可任选地，根据本发明的配制品进一步包括2-碳醇或4-碳醇。本发明的腺病毒配制品适合在2℃至8℃或者≤-65℃下长期储存，持续超过6个月、1年、1.5年、2年、或更久。
本发明的腺病毒配制品包括在b)柠檬酸盐缓冲溶液中的a)重组腺病毒，该柠檬酸盐缓冲溶液进一步包括c)羟丙基-β-环糊精(HBCD)；d)盐；以及e)非离子型洗涤剂。为了保持腺病毒的稳定性，必要的是此配制品的pH范围在5.5和6.5之间。
优选地，根据本发明的配制品包括滴度范围在约1x 107vp/mL和1x1013vp/mL之间的腺病毒。
在根据本发明的一个优选实施例中，配制品中的柠檬酸盐浓度范围在约5mM和30mM之间。
羟丙基-β-环糊精(HBCD)是优选的冷冻保护剂。HBCD优选以范围在约1％(w/w)和10％(w/w)之间的浓度存在。
氯化钠(NaCl)是优选的盐，其优选以范围在约20mM和200mM之间的浓度存在。
聚山梨酯-80是优选的非离子型洗涤剂，其优选具有范围在约0.005％(w/w)和0.5％(w/w)之间的浓度。
在根据本发明的更优选的实施例中，该配制品具有范围在约5.7和6.3之间的pH，并且包括浓度范围在约5和30mM之间的柠檬酸盐；浓度范围在1％(w/w)和10％(w/w)之间的HBCD；浓度范围在20mM和200mM之间的NaCl；浓度范围在约0.01％(w/w)和0.05％(w/w)之间的聚山梨酯-80。
在根据本发明的另一个优选实施例中，该配制品具有范围在约5.8和6.2之间的pH，并且包括浓度范围在约15和25mM之间的柠檬酸盐；浓度范围在3％(w/w)和8％(w/w)之间的HBCD；浓度范围在50mM和100mM之间的NaCl；浓度范围在约0.01％(w/w)和0.03％(w/w)之间的聚山梨酯-80。
在一个甚至更优选的实施例中，根据本发明的配制品pH约为6，并且包括浓度约为20mM的柠檬酸盐；浓度约为5％(w/w)的HBCD；浓度约为75mM的NaCl；浓度约为0.02％(w/w)的聚山梨酯-80。
在此证实了，添加2-碳醇或4-碳醇(具体地而言是乙醇)到本发明的配制品中，出乎意料地有力保护了腺病毒抵抗冻/融损害并且因此充当冷冻保护剂。
因此，在一个优选的实施例中，根据本发明的配制品进一步包括2-碳醇或4-碳醇。在一个甚至更优选的实施例中，根据本发明的配制品包括乙醇。该乙醇浓度优选在约0.1％(w/w)至1％(w/w)之间的范围内。
在根据本发明的一个优选实施例中，该配制品具有范围在约5.7和6.3之间的pH，并且包括浓度范围在约5和30mM之间的柠檬酸盐；浓度范围在1％(w/w)和10％(w/w)之间的HBCD；浓度范围在20mM和200mM之间的NaCl；浓度范围在约0.01％(w/w)和0.05％(w/w)之间的聚山梨酯-80；以及浓度范围在约0.2％(w/w)和0.6％(w/w)之间的乙醇。
在根据本发明的另一个优选实施例中，该配制品具有范围在约5.8和6.2之间的pH，并且包括浓度范围在约15和25mM之间的柠檬酸盐；浓度范围在3％(w/w)和8％(w/w)之间的HBCD；浓度范围在50mM和100mM之间的NaCl；浓度范围在约0.01％(w/w)和0.03％(w/w)之间的聚山梨酯-80；以及浓度范围在约0.2％(w/w)和0.6％(w/w)之间的乙醇。
在一个甚至更优选的实施例中，根据本发明的配制品pH约为6，并且包括浓度约为20mM的柠檬酸盐；浓度约为5％(w/w)的HBCD；浓度约为75mM的NaCl；浓度约为0.02％(w/w)的聚山梨酯-80；以及浓度约为0.4％(w/w)的乙醇。
在另一个优选的实施例中，根据本发明的配制品pH约为6，并且包括浓度约为20mM的柠檬酸盐；浓度约为5％(w/w)的HBCD；浓度约为80mM的NaCl；浓度约为0.025％(w/w)的聚山梨酯-80；以及浓度约为0.4％(w/w)的乙醇。
在一个甚至更优选的实施例中，根据本发明的配制品pH约为6，并且包括浓度约为20mM的柠檬酸盐；浓度约为5％(w/w)的HBCD；浓度约为80mM的NaCl；浓度约为0.025％(w/w)的聚山梨酯-80；以及浓度约为0.4％(w/w)的乙醇。
在本发明的另一个优选的实施例中，这些配制品是(冷冻的)液体配制品。在又另一个实施例中，本发明的配制品适用于肠胃外使用。
在一个实例中，根据本发明的配制品包含在小瓶中。在另一个实施例中，这些配制品包含在袋或瓶中。在又另一个实施例中，这些配制品包含在注射器或药筒中。
本发明还涉及一种保存腺病毒的方法，该方法包括制备根据本发明的配制品。
在又另一个实施例中，本发明涉及一种保存腺病毒的方法，该方法包括制备如在此描述的配制品并且将所述配制品储存在范围在2℃和8℃之间的温度下。
在宽温度范围内的增强的长期稳定性导致在此披露的病毒配制品的保质期延长，允许这些配制品在优选约1-2年期间内或更长时间储存以及最终的宿主给予，伴随着可接受的病毒效力的损失(即，在2℃-8℃下每两年不超过0.3log)。此外，本发明的配制品在暴露于升高的温度、延长的冻融循环和搅拌期间显示出稳定性。
附图说明
图1.在配制品B(空心菱形)和对照配制品(实心圆)中，在25℃下，在加速温度过程中，Ad26的效力(以log IU/mL计)损失(Δ)。显示了平均Δ效力(n＝4)，反映了效力应激样品-效力对照样品。已经通过QPA测量效力。
图2.在配制品B(空心菱形)和对照配制品(实心圆)中，在25℃下，在加速温度过程中，Ad35的效力(以log IU/mL计)损失(Δ)。显示了平均Δ效力(n＝4)，反映了效力应激样品-效力对照样品。已经通过QPA测量效力。
图3.在配制品B和对照配制品中的Ad26的热熔点。在t＝0样品上针对Ad26进行TMA(热熔解测定)分析(n＝3)。
图4.在配制品B和对照配制品中的Ad35的热熔点。在t＝0样品上针对Ad35进行TMA(热熔解测定)分析(n＝3)。
图5.在具有或不具有NaCl、EDTA、乙醇及其组合的情况下，在25℃下，在69天后，配制品B中的Ad26的ΔCt(ΔCt)值。ΔCt值与效力损失直接相关，其中较高的数量意指较多的效力损失。
图6.在具有或不具有NaCl、EDTA、乙醇及其组合的情况下，在35℃下，在16天后，配制品B中的Ad26的ΔCt(ΔCt)值。ΔCt值与效力损失直接相关，其中较高的数量意指较多的效力损失。
图7.在具有或不具有NaCl、EDTA、乙醇及其组合的情况下，在30次冻/融循环随后搅拌1天后，配制品B中的Ad26的ΔCt(ΔCt)值。ΔCt值与效力损失直接相关，其中较高的数量意指较多的效力损失。
图8.在具有或不具有NaCl、EDTA、乙醇及其组合的情况下，t＝0(实心环)的、在25℃下持续69天(空心菱形)的、在35℃下持续16天(实心三角)的和30次冻/融循环随后搅拌(空心三角)的配制品B中，在350nm下，通过Ad26的吸光度测量的比浊法。
图9.在具有或不具有NaCl、EDTA、乙醇及其组合的情况下，t＝0(实心环)的、在25℃下持续69天(空心菱形)的、在35℃下持续16天(实心三角)的和30次冻/融循环随后搅拌(空心三角)的配制品B中，Ad26的内源荧光。
图10.在配制品F和对照配制品中的Ad26的热熔点。在t＝0样品上针对Ad26进行TMA分析(n＝3)。
图11.在应激条件下冻/融(FT)+搅拌(AG)+在35℃下储存，针对CQA效力(Δ效力极限≥-0.30log IU/mL)的成功概率的对图。成功概率的标度为从0.4(淡灰色)至1(黑)。探索了全部的实验域。白色方格中是基于绘图建议的设计空间。
发明详述
如前所述，在本领域存在找到以下配制品的需要，这些配制品在延长的时间内通过保留所含有的腺病毒的数量和效力改进腺病毒的稳定性。
若干参考文献披露了腺病毒配制品的特定组分的使用。阿尔塔拉斯(Altaras)等人披露了柠檬酸盐作为自由基氧化的可能抑制剂大清单中的一部分。所述清单还包含EDTA和乙醇(EDTA/乙醇)的组合，该组合被鉴定为自由基氧化的另外的抑制剂。本发明的配制品使用柠檬酸盐作为缓冲液而不是作为抗氧化剂。
伦特里亚(Renteria)等人鉴定羟丙基-β-环糊精(HBCD)为添加剂之一，被用来促进某些蛋白的稳定性并且来避免在鼻腔给予过程中聚合。伦特里亚(Renteria)等人披露了羟丙基-β-环糊精在配制品的背景中的用途，该配制品适用于可提高粘膜吸收的鼻腔给予。就结构、电荷、以及大小而言，与肝病毒如腺病毒相比，所有的蛋白都是不同的。因此，鉴于蛋白质的稳定机制，腺病毒的稳定机制是完全不同且不可预测的。
WO 029024披露了羟丙基-β-环糊精作为可能的用来制备冻干配制品的冻干保护剂的大清单中的部分。WO 029024涉及冻干组合物，不同于在本发明中披露的液体组合物。液体配制品的优势在于，其更为便宜，并且在给予前的处理更少费时，并且更不易发生临床给药或重构的错误。此外，冻干工艺的放大可能是一个繁琐的努力过程。
我们已经发现了并且在此描述了针对腺病毒的配制品，与之前披露的配制品相比，这些针对腺病毒的配制品通过保留腺病毒的数量和效力(感染性)改进了腺病毒的稳定性。
本发明的配制品包含至少一种重组腺病毒。腺病毒载体的构建是本领域中充分理解的，并且涉及使用标准的分子生物学技术，如，说明于以下的那些，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，分子克隆，实验室手册(Molecular Cloning,a Laboratory Manual)，第2版，冷泉港出版社Cold Spring Harbor Press)，冷泉港，纽约，(1989)，沃森(Watson)等人，重组DNA(Recombinant DNA)，第2版，科学美国人书刊(Scientific American Books)(1992)，和奥苏贝尔(Ausubel)等人，分子生物学现代方法(Current Protocols inMolecular Biology，威利国际科学出版社(Wiley Interscience Publishers)，纽约(1995)，和在此提及的其他参考文献。简单地说，该腺病毒载体在腺病毒基因组的E1区域(例如，E1a区域和/或E1b区域)的至少一个必需基因功能中可以是有缺陷的，该E1区域对该病毒复制是必需的。对于生产腺病毒，正如本领域技术人员已知的，在缺失来自腺病毒基因组的必需区域的情况下，由这些区域编码的功能必须反式提供，优选地由生产细胞提供，例如，当生产重组腺病毒的时候，由这些区域编码的功能被整合到基因组中，或处于所谓的辅助腺病毒或辅助质粒形式。
在以下文献中详细描述了重组腺病毒的增殖：美国专利6,492,169或者在WO 03/104467美国专利号5,559,099、5,837,511、5,846,782、5,851,806、5,994,106、5,994,128、5,965,541、5,981,225、6,040,174、6,020,191、和6,113,913，和托马斯申克(ThomasShenk)“腺病毒科及其复制(Adenoviridae and their Replication)”，M.S.霍维茨(M.S.Horwitz)，“腺病毒(Adenoviruses)”，分别第67和68章，在病毒学(Virology)，B.N.菲尔茨(B.N.Fields)等人，编辑，第3版，雷文出版社有限公司(Raven Press,Ltd.)，纽约(1996)，将其通过引用在此结合。通过使用腺病毒或嵌合的腺病毒的任何物种、菌株、亚型，或物种、菌株、亚型的混合物作为载体DNA的来源可产生复制缺陷型腺病毒载体(参见例如WO 96/26281、WO00/03029)。在本发明的某些实施例中，人腺病毒的血清型包括血清型2、4、5、7、11、26、34、35、36、48、49或50中的任一项或者任何混合或突变腺病毒血清型。在本发明的一个优选实施例中，该重组腺病毒来自人腺病毒血清型5、26或35。
在另一个实施例中，本发明的腺病毒是猿猴腺病毒，优选黑猩猩或大猩猩腺病毒。这些腺病毒在人群中一般具有低血清阳性率和/或低预先存在的中和抗体滴度。
在另一个实施例中，本发明的腺病毒进一步包括异源核酸。对技术人员来说，适合的异源核酸是熟知的，并且例如可以包括转基因开放阅读框，例如编码多肽的开放阅读框(当出于接种目的使用该载体时，针对这些多肽的免疫应答是希望的)，例如适用于产生对抗疟疾(参见例如WO2004/055187)、HIV、结核病(参见例如WO 2006/053871)、某些病毒等的免疫应答的转基因，这些对于技术人员来说均是熟知的。事实上，转基因的性质并不是本发明的关键，它可以是任何异源核酸序列，并且因此在此不需要进一步精制。
在此使用的术语“稳定性”是指在配制品中降解腺病毒粒子的相对抗性，在其预期有用性的时间尺度上保留其效力。优选地，该效力显示出，在2℃-8℃下，每两年减少不超过0.3log。
如在此使用的术语“效力”是指就在基于细胞的效力测定中测量的感染单位而言所表达的腺病毒活性的量度，在下文中将描述。
根据本发明的组合物在加速稳定性研究中显示出，每60天减少不超过0.4log的效力，以及每60天减少不超过0.3log的滴度，该研究通过在25℃±2℃下，在1至3个月期间，通过孵育配制品来进行。
根据本发明的组合物在一个研究中还显示出，每10次循环减少不超过0.2log的效力，其中使小瓶经受反复冻融循环，随后在室温下，以水平方向以200rpm经24小时搅拌。
“药学上可接受的赋形剂”意指与一种活性分子(如一种病毒)组合用于制备一种合意或便利剂型的任何惰性物质。“药学上可接受的赋形剂”是一种在所用剂量和浓度下对接受者无毒并且与包括病毒制剂的配制品的其他成分相容的赋形剂。赋形剂的实例是冷冻保护剂、非离子型洗涤剂、缓冲液、盐以及自由基氧化的抑制剂。
术语“副产物”包括不希望的产物，这些产物在给出的配制品中削弱或减少治疗/预防性腺病毒的比例。典型的副产物包括腺病毒的聚合体和腺病毒的片段，这些是由例如蛋白质变性、脱酰胺作用、水解或其组合造成的。典型地，聚合体是复合物，这些复合物具有比分离的病毒粒子更大的分子量。
改进腺病毒稳定性的配制品，也称为如在此使用的“稳定配制品”，是这样一种配制品，当储存时在该配制品中的腺病毒基本上保留了其物理和/或化学完整性和/或生物学活性。在一段时间内以及在某些储存条件下，可以通过确定在配制品中的腺病毒的不同特征来评估稳定性，这些特征如所述腺病毒的数量(配制品中腺病毒的数量)、效力、和/或其他质量方面。腺病毒配制品的这些特征可以在升高的温度(针对实时温度预测的)或在其他应激条件下测量，例如配制品可以在25℃下经受孵育或者经受冻/融循环和搅拌，以便研究不同配制品最大化保质期的效果。确定稳定性的所述特征可以通过选自下组的方法中的至少一项来确定，该组由以下各项组成：目测、病毒粒子定量聚合酶链反应(vp-QPCR)、基于QPCR的效力测定(QPA)、反相高效液相层析(RP-HPLC)和差速离心沉降(DCS)、热熔解测定(TMA)、比浊法、和内源荧光。
病毒粒子定量聚合酶链反应(vp-QPCR)
开发该vp-QPCR用于使用引物定量腺病毒粒子，这些引物靶向在腺病毒载体中存在的转基因盒的CMV启动子的100bp区域。简言之，这种QPCR方法依赖于Taq聚合酶的外切核酸酶活性，该外切核酸酶活性导致在100bp扩增子的中间处退火的特定荧光探针的降解。将该探针共价连接至光发射体和淬灭体，并且它的降解从淬灭体中释放了发射体，伴随着与模板量成正比的随之而来的荧光发射。定量值获得自循环阈值(Ct)，在该循环中荧光信号的增加超过了阈值。检测基于DNA的荧光的阈值设置略高于背景。荧光超过阈值的循环的数量称为循环阈值(Ct)，或者根据MIQE指南称为量化周期(Cq)(巴斯廷(Bustin)等人，2009)。在指数式扩增阶段过程中，靶DNA序列每个循环都加倍。例如，其Ct领先于另一个样品的Ct3个循环的DNA样品包含多出23＝8倍的模板。因此，更高的Ct值代表了更低量的靶DNA，并且更低的Ct值代表靶DNA的高可用性。绝对量化可以通过比较由原料腺病毒的连续稀释产生的标准曲线进行，该原料腺病毒的浓度已经通过在260nm(OD260)下的光密度来确定。将测试材料的Ct值对标准曲线的Ct值进行作图，这产生了载体粒子的准确且精确的数量。
当在E1感受态细胞上孵育之后用作读数(QPA，见下文)，更多降解的样品将导致更高Δ(减去t＝0)Ct值，并且更多稳定化配制品将导致更低的Ct值。
基于QPCR的效力测定(QPA)
为了量化腺病毒效力，QPA将QPCR与基于组织培养的感染性测定进行结合。该测定是基于实验观察，观察到的是新合成的病毒DNA在细胞单层的接种后快速出现，并且在大的感染复数(MOI)范围内与病毒输入浓度成正比。将稀释的样品(非端点稀释的)接种于96孔板中的HEK293单层细胞上。允许感染在35℃下进行3小时。对孔进行抽吸并且用不含腺病毒的介质补充。将板孵育另外的42小时，之后进行细胞裂解，通过曲通X-100溶液和单次冻/融步骤进行该细胞裂解以便释放腺病毒DNA。根据以上描述的方法，在稀释的细胞裂解物上进行QPCR。感染性滴度是通过与由具有已知感染性的样品的Ct值产生的标准曲线比较来计算的，该感染性是通过终点滴定来确定的。可替代地，Δ效力可以直接表达为Ct值，因为感染性滴度、或效力与Ct值直接相关。尤其是在比较配制品之间效力的相对差异中，这是一种快速并可靠的方法。
反相高效液相层析(RP-HPLC)
为了确定腺病毒的一些质量方面，人们可以通过反相高效液相层析(RP-HPLC)分析腺病毒的蛋白图谱。HPLC通过使用在样品、流动相(缓冲液或溶剂)和固定相(在柱中的色谱填充材料)之间多种化学相互作用来分离混合物的组分。高压泵使流动相移动通过柱，并且检测器使用在280nm下的UV吸收检测显示出分子的保留时间(tR；在样品注射和最大峰值出现之间的时间)。RP-HPLC的分离是基于疏水性的差异。非极性固定相是由疏水性烷基链(链长：C4、C8和C18)组成。极性流动相是具有0.1％三氟乙酸(TFA)的水。使用浓度递增的具有0.1％TFA的乙腈，对结合至柱的化合物进行洗脱。总体来说，具有较大疏水表面积的分析物具有较长的保留时间，然而极性基团的存在减少了保留时间。典型腺病毒的RP-HPLC图由10或14种蛋白组成，包括核心蛋白(VII)、五邻体基底(III)和六邻体(II)。
差速离心沉淀(DCS)
DCS是一种通过沉淀测量粒度分布(聚合)的方法。在盘式离心机中，根据斯托克斯定律，在高引力下，粒子在蔗糖梯度(具有已知粘度和密度)中沉降。沉降速度随粒子直径的平方而增大，因此，大小仅相差几个百分比的粒子以显著不同的速率来沉降。到达检测器需要的时间被用来计算粒子的大小。这种方法的量程约为0.02至30微米。
热熔解测定(TMA)
可以使用热熔解测定(TMA)来确定实验配制品中腺病毒的熔解温度(Tm)，该熔解温度是病毒衣壳变性的温度。这种病毒崩解可以使用嵌入荧光染料的dsDNA来实时测量。只有当结合至当病毒粒子崩解时释放的DNA时，这种荧光染料才提供荧光信号。可以在温度逐步增加过程中，使用常见的QPCR机器来测量当衣壳熔解时的指数性荧光增加。将具体配制品中的样品稀释至相同浓度(范围是4x 109至1x 1012vp/mL)，并且与50μL体积的SYBRGreen染料(1X终浓度)进行混合。温度每30秒增加0.5℃，从30℃开始上升至79℃。从荧光原始数据，计算一阶和二阶导数，并且在二阶导数与x-轴的截距处读取熔解温度。较高的熔解温度(Tm)可以表示更稳定的配制品。
浊度测定
比浊法测量由于样品中粒子散射(表观吸光度)造成的透射光强度损失，是在一定波长检测，在该波长处样品中的分子不吸收光(例如，350nm，对于其中蛋白质是主要生色团的样品)。当分子聚集或形成超分子复合物时，光散射(当来自分离的粒子时是随机的)现在变得相干，并且从而测量的强度增加。这使得光散射和比浊法成为检测聚集体和复合物形成或解离的有用的技术。
在浊度测定中，将样品一式三份转移至UV可透过的平底微板。该板覆盖有UV-可透过的封口。在230和500nm之间通过酶标仪记录吸收光谱，并且测量在975nm下的吸光度以确定并可能校正光程差异。如果需要的话，在测定中包括由不具有腺病毒的配制品组成的对照样品，以校正基质组分的散射或吸收。在350nm下的表观吸光度被用作浊度的定量量度。
浊度测定是针对腺病毒样品指示稳定性的。病毒聚集导致浊度的增加和衣壳解离的减少。在浊度值>1NTU时，该测定准确性为<5％(CV％)。
应当总是将应激样品所获得的浊度与对照样品进行比较。由于施加应激之后的增加或减少取决于降解途径以及针对每个活性药物成分(API)的特异性，因此它不能被预测。与t＝0样品相比的变化(更高或更低)指示出不太稳定的配制品。预期可与t＝0样品相比的应激样品是更加稳定的。
内源荧光测定
腺病毒衣壳蛋白包含在激发后重发射光的芳族氨基酸，具体地是色氨酸以及在较少程度上是酪氨酸和苯丙氨酸。色氨酸的发射最大值和量子产率强烈依赖于其环境的极性。在极性水性环境(例如，球状蛋白质的表面)中，量子产率是相对低的，然而在非极性环境(例如，聚集体的内部)中，量子产率增加。这种特征使得色氨酸荧光成为研究蛋白质构象变化、聚集、以及分子间相互作用的有用工具。
在内源荧光测定中，将样品一式三份转移至UV可透过的平底微板。该板覆盖有UV-可透过的封口。色氨酸荧光是通过酶标仪使用具有280nm的中央波长以及10nm带宽的激发滤光片，和具有340nm的中央波长和10nm的带宽的发射滤光片来侧量的。使用底部镜片来最小化密封和弯月面形状的影响。
在本领域中已知荧光强度是腺病毒稳定性的灵敏量度。当应激时，可能观察到增加或减少，其取决于发生在样品中变化的性质。希望蛋白质解折叠和衣壳解离导致内源荧光的减少，并且预期聚集导致增加。在使用的范围中，测定的精确度为<5％(CV％)。
应当总是将应激样品所获得的荧光与对照样品进行比较。由于施加应激之后的增加或减少取决于降解途径以及针对每个活性药物成分(API)的特异性，因此它不能被预测。与t＝0样品相比的变化(更高或更低)指示出不太稳定的配制品。保持接近与t＝0样品值的应激样品更为稳定。
如果腺病毒(除其他以外)就数量和效力而言，显示出最小损失(即，0.3log/2年)，并且没有展示出主要的蛋白质修饰，腺病毒在药用配制品中“仍保持其物理稳定性”。另外，当肉眼检查时应当观察到没有聚集、沉淀、颜色和/或澄清度变化的迹象。
除非另有说明，在本申请中使用的“约”意指±10％。
本发明涉及稳定腺病毒的配制品并且涉及相关的药用产品，优选用于基因疗法和/或疫苗应用。在此披露的优选稳定化的含有病毒的配制品是一种液体腺病毒配制品，当在约2℃-8℃范围中储存时，同时还可以与肠胃外给予相容时，该液体腺病毒配制品显示出改进的腺病毒稳定性。然而，这些配制品还可以储存在更低的温度下，例如，-20℃或更低、-40℃或更低、-65℃或更低、-80℃或更低。它们也可以在高于8℃的温度下更加稳定，例如，25℃或甚至更高。
能够稳定腺病毒的这些配制品包括柠檬酸盐缓冲液、羟丙基-β-环糊精(HBCD)、盐和非离子型洗涤剂，连同对添加的病毒提高稳定性的可任选的其他组分。所述缓冲液的pH在5.5与6.5之间。
本发明的配制品为处于不同病毒浓度、单-或多价的腺病毒提供了稳定性，并且可以向各种脊椎动物给予，优选哺乳动物并且尤其是人类。本发明的稳定的病毒配制品是基于腺病毒的组合物，这些组合物可以例如作为疫苗给予，该疫苗可以向之前未感染的个体提供预防性的优势和/或提供治疗效果。
本发明的一个优选方面是一种针对重组腺病毒的配制品(即，包含全部或部分转基因的腺病毒，该转基因继宿主给予之后在靶宿主内进行表达，如按照技术人员可以使用的基于任何哺乳动物/人类基因治疗或基因疫苗接种的方法)，该配制品在病毒浓度在从约1x 107vp/mL(病毒粒子/mL)至约1x1013vp/mL的范围中的情况下显示出提高的在此描述的稳定性特征。一个更优选的范围是从约1x 109至1x 1013vp/mL，其中尤其优选的病毒浓度是从约1x 1010至5x 1012vp/mL。可以将本发明配制品的治疗或预防组合物以足以治疗或预防对应疾病的量向个体给予。当然，用于人类给予的有效量可以根据各种因素变化，如个体病症、体重、性别和年龄。其他因素包括给予方式。在一个优选的实施例中，本发明的配制品适用于肠胃外使用。
本发明的配制品是具有范围在5.5和6.5之间的pH的柠檬酸盐缓冲溶液，进一步包括羟丙基-β-环糊精(HBCD)并且可任选地包括二碳醇或四碳醇。出乎意料地，所述组合已经证实针对保存腺病毒的数量、效力(感染性)和质量而言是一种出色的配制品，如在此所证实的。
在一个优选的实施例中，柠檬酸盐的浓度范围在约5mM和30mM之间，例如，在约5mM和25mM之间，例如，在约10mM和25mM之间，例如，约20mM。
在这些配制品中另一种必要成分(该必要成分促成在大温度范围内以及持续长时间储存期的病毒稳定化)是HBCD，该HBCD被用作冷冻保护剂。在一个优选的实施例中，HBCD的浓度范围在约1％(w/w)至10％(w/w)之间，例如，在约3％(w/w)至约8％(w/w)之间，例如，在约4％(w/w)至6％(w/w)之间，例如，约5％(w/w)。
本发明配制品的另外的组分是盐。盐提高了病毒的稳定性。在配制品中包含盐的目的是获得所希望的离子强度或渗透压，并且另外优化静电作用。盐是以对宿主而言在生理学上可接受的渗透压存在。对离子强度的贡献可以来自由缓冲化合物产生的离子连同非缓冲盐的离子。适用于本发明配制品的盐包括但不限于：氯化钠(NaCl)、氯化钙(CaCl2)或氯化锰(MnCl2)。与现有技术相比之下，氯化镁(MgCl2)显示出不利于腺病毒稳定性。因此，在一个优选的实施例中，根据本发明的配制品不含氯化镁。
在一个优选的实施例中，根据本发明的病毒配制品包括氯化钠(NaCl)。在一个优选的实施例中，氯化钠的浓度范围在约10mM和250mM之间，例如，约20mM和200mM之间，例如，在约30mM和150mM之间，例如，在约50mM和100mM之间，例如，约80mM。
本发明的配制品包括至少一种手添加的非离子型洗涤剂(还称为非离子型表面活性剂)，以减少吸附至容器表面连同可能提供增加的病毒稳定化(例如，通过减少聚集)。用于本发明配制品中的非离子型洗涤剂包括但不限于聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯，这些聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯包括但不限于聚山梨酯-80(Tween
Figure BDA0002491885860000121
)、聚山梨酯-60(Tween
Figure BDA0002491885860000122
)、聚山梨酯-40(Tween
Figure BDA0002491885860000123
)和聚山梨酯-20(Tween
Figure BDA0002491885860000124
)、以及普朗尼克(Pluronic)系列的非离子表面活性剂(例如，普朗尼克121)。
在一个优选的实施例中，非离子型洗涤剂的浓度范围在约0.001％(w/w)至1％(w/w)之间，例如，在约0.005％(w/w)至约0.5％(w/w)之间，例如，约0.01％(w/w)至0.1％(w/w)之间，例如，在约0.01％(w/w)至约0.05％(w/w)之间，例如，在约0.015％(w/w)至0.03％(w/w)之间，例如，约0.025％(w/w)。
在一个优选的实施例中，根据本发明的病毒配制品包括聚山梨酯-80。聚山梨酯-80的浓度优选范围在约0.001％(w/w)至1％(w/w)之间，例如，在约0.005％(w/w)至约0.5％(w/w)之间，例如，约0.01％(w/w)至0.1％(w/w)之间，例如，在约0.01％(w/w)至约0.05％(w/w)之间，例如，在约0.015％(w/w)至0.03％(w/w)之间，例如，约0.025％(w/w)。
在一个优选的实施例中，根据本发明的病毒配制品进一步包括EDTA。在一个更优选的实施例中，EDTA的浓度范围在约0.05mM和0.2mM之间，例如，在约0.05mM和0.15mM之间，例如，在约0.08mM和0.12mM之间，例如，约0.1mM。
在另一个优选的实施例中，根据本发明的病毒配制品进一步包括乙醇。在一个更优选的实施例中，乙醇的浓度范围在约0.1％(w/w)至1％(w/w)之间，例如，在约0.2％(w/w)至约0.8％(w/w)之间，例如，在约0.2％(w/w)至0.6％(w/w)之间，例如，约0.4％(w/w)。
在一个优选的实施例中，当根据本发明的病毒配制品包括乙醇时，它不是一定必须同时包括EDTA。
鉴于以上讨论，本发明涉及一种包含腺病毒如重组Ad5、Ad26或Ad35的配制品，这些可以例如用于基因疗法和/或基因疫苗接种应用，与本能领域中已知表现最好的配制品(披露于埃文斯(Evans)等人，2004)相比，该配制品显示出改进的稳定性特性，并且该配制品包含至少一种柠檬酸盐缓冲液、作为冷冻保护剂的HBCD、盐、以及表面活性剂。
本发明的一个具体实施例涉及这种重组腺病毒配制品，该配制品用柠檬酸盐缓冲至范围在5.5和6.5之间的pH，并且进一步包括羟丙基-β-环糊精(HBCD)、盐、非离子型洗涤剂、以及2-碳醇或4-碳醇。
在根据本发明的一个优选实施例中，该配制品包括具有范围从约pH 5.5至pH 6.5的pH值，包括作为冷冻保护剂的HBCD、作为盐的NaCl、作为表面活性剂的聚山梨酯-80和作为另外的没有前例的冷冻保护剂的2-碳醇或4-碳醇。
在根据本发明的另一个优选实施例中，该配制品包括pH范围为从约pH5.5至pH6.5的柠檬酸盐缓冲液，包括作为冷冻保护剂的HBCD、作为盐的NaCl、作为表面活性剂的聚山梨酯-80和EDTA。
在根据本发明的另一个优选实施例中，该配制品包括pH范围为从约pH5.5至pH6.5的柠檬酸盐缓冲液，包括作为冷冻保护剂的HBCD、作为盐的NaCl、作为表面活性剂的聚山梨酯-80和作为另外的没有前例的冷冻保护剂的乙醇。
在根据本发明的另一个优选实施例中，该配制品包括pH范围为从约pH5.5至pH6.5的柠檬酸盐缓冲液，包括作为冷冻保护剂的HBCD、作为盐的NaCl、作为表面活性剂的聚山梨酯-80。此配制品进一步包括乙醇，并且不包含EDTA。
在根据本发明的一个优选实施例中，该配制品具有范围在约5.9和6.2之间的pH，并且包括浓度范围在约10和25mM之间的柠檬酸盐；浓度范围在4％(w/w)和6％(w/w)之间的HBCD；浓度范围在70mM和100mM之间的NaCl；浓度范围在约0.018％(w/w)和0.035％(w/w)之间的聚山梨酯-80；以及浓度范围在约0.3％(w/w)至0.45％(w/w)之间的乙醇。
在根据本发明的另一个优选实施例中，该配制品具有范围在约5.8和6.2之间的pH，并且包括浓度范围在约15和25mM之间的柠檬酸盐；浓度范围在3％(w/w)和8％(w/w)之间的HBCD；浓度范围在50mM和100mM之间的NaCl；浓度范围在约0.01％(w/w)和0.03％(w/w)之间的聚山梨酯-80；以及浓度范围在约0.05mM至0.15mM之间的EDTA。
在根据本发明的另一个优选实施例中，该配制品具有范围在约5.9和6.2之间的pH，并且包括浓度范围在约10和25mM之间的柠檬酸盐；浓度范围在4％(w/w)和6％(w/w)之间的HBCD；浓度范围在70mM和100mM之间的NaCl；浓度范围在约0.018％(w/w)和0.035％(w/w)之间的聚山梨酯-80；以及浓度范围在约0.05mM至0.15mM之间的EDTA。
在本发明的一个甚至更优选的实施例中，将该配制品用约20mM的柠檬酸盐缓冲至pH约为6；HBCD以约5％(w/w)的浓度存在；NaCl以约80mM的浓度存在；表面活性剂是处于约0.025％(w/w)浓度的聚山梨酯-80；并且EDTA以约0.1mM的浓度存在。
在本发明的一个甚至更优选的实施例中，将该配制品用约20mM的柠檬酸盐缓冲至pH约为6；HBCD以约5％(w/w)的浓度存在；NaCl以约80mM的浓度存在；表面活性剂是处于约0.025％(w/w)浓度的聚山梨酯-80；并且乙醇以约0.4％(w/w)的浓度存在。此外，可以使用上述因素的组合。
在一个实施例中，根据本发明的配制品包含在小瓶中像例如，DIN 2R I型硼硅玻璃小瓶。在另一个实施例中，配制品包含在袋中。包含本发明配制品的袋可以包括由例如乙烯-乙酸乙烯酯共聚物(EVA)或乙基乙烯醇(EVOH)制成的层。在本发明的又另一个实施例中，配制品包含于注射器中。
可以将在此描述的重组病毒配制品通过本领域已知的任何手段向脊椎动物宿主(优选哺乳动物宿主并且尤其是人类受体)给予。这些递送途径包括但不限于：肌内注射、腹腔注射、静脉注射、吸入法或鼻内递送、口服递送、舌下给予、皮下给予、经皮给予(transdermal administration)、皮内给予、管内唾液腺给予、经皮肤给予(transcutaneous administration)和透皮给予。在一个优选的实施例中，本发明的配制品可以与肠胃外给予相容。
根据在此披露的配制品，本发明还涉及保存腺病毒的方法，该方法包括制备如在此披露的包含病毒的配制品，此类配制品当储存在-65℃之下并且在约2℃-8℃范围内并且可能更高时导致改进的病毒稳定性，同时还可以与肠胃外给予相容，尤其是对人类的肠胃外给予。
因此，本发明的另一方面涉及保存腺病毒的方法，该方法包括制备如在此披露的配制品，并且将所述配制品储存在范围为2℃和8℃之间的温度下。
提供以下实例用于说明本发明而不对其造成限制。
实例实例1.
实验设计和方法
在测试若干不同的配制品后，一种配制品胜过其他配制品。这种新配制品被命名为“配制品B”并且在6.0的pH下包括5％(w/w)HBCD、20mM柠檬酸盐、0.02％(w/w)PS-80和75mM NaCl。
已经将两种腺病毒(Ad35.TB-S和Ad26.Mos1.Gag-Pol)制剂(一种包括血清型35腺病毒(Ad35)并且一种包括血清型26腺病毒(Ad26))使用PD-10柱(GE医疗(GE Healthcare))经缓冲液交换进配制品B中。
两种腺病毒制剂也已经配制成“对照配制品”，这在埃文斯等人(2004)中已经描述，并且其为迄今为止可获得的最佳配制品。所述“对照配制品”在pH为7.4下包括10mMTris、10mM组氨酸、1mM MgCl2、75mM NaCl、5％(w/w)蔗糖、0.02％(w/w)PS-80、0.1mM EDTA、0.4％(w/w)EtOH。
每种配制品，使用12个柱；收集洗出液，无菌过滤并且在2℃-8℃下储存于玻璃瓶中。取样用于通过vp-QPCR确定病毒滴度，并且将所有的滴度都用适合的缓冲配制品调节至1.7x 1011vp/mL。随后，将配制品填充至玻璃小瓶(0.7mL/小瓶)中，加塞并加帽。
将t＝0样品(对照，6个小瓶/组)直接在≤-65℃下储存。随后，在25℃下孵育六个小瓶/组(n＝6)，并且在t＝10、20、30、40、50、60、65、70、75、80和90天在≤-65℃下冰冻，直到通过QPA以每种样品一式三份进行样品分析。
此外，针对在两种配制品中的载体，通过TMA(热熔解测定)分析t＝0样品，以确定衣壳熔解温度。较高的熔解温度与较高的病毒衣壳热稳定性有关。终点样品(t＝90天)也通过反相高效液相层析(RP-HPLC)和差速离心沉降(DCS)进行分析，并且与t＝0对照进行比较。
结果和结论
在完成研究后，所有样品都通过QPA进行分析，并且效力损失通过减去t＝0值表达为Δ。根据本发明的配制品B(空心菱形)显著(p＝1.44E-05)胜过对照配制品(实心环)，导致两种腺病毒随着时间以及较长预测的保质期内(表1)更少降解(图1和2)。用统计分析系统(SAS软件)，使用时间和时间的平方作为固定效应，在效力数据上拟合线性(Ad26)和二次(Ad35)模型。同时固定的‘时间’效应代表效力的线性减少，固定的‘时间*时间’效应代表这种减少的曲率。两种效应都被用于模型中，以评估其意义。考虑到模型的复杂性及其拟合准确度，赤池信息量准则(AIC)是针对统计模型的相对质量的量度。AIC愈小，模型拟合愈佳。在线性模型中，斜率代表效力衰减速度。通过比较斜率，可以鉴别最佳缓冲液(最低斜率)。
保质期与时间点相对应，在该时间点期间此间期的下限在给定的规格下通过(即，效力的降低)。针对于二次模型，为了计算保质期，取平均值周围两侧95％置信区间。对于保质期评估仅保持下界导致单变量较低置信区间的97.5％置信水平。将截距(反映了t＝0处的效力)平均化并且从原始数据和模型中去除。针对两种配制品计算保质期。
表1：在25℃下衍生自降解曲线统计分析的保质期(图1和图2)。
配制品B与对照
Ad26-保质期 长36.1％
Ad35-保质期 长50.0％
RP-HPLC并没有显示出腺病毒蛋白修饰或氧化的任何迹象。DCS并没有揭示任何聚集迹象。此外，根据本发明的配制品，与对照配制品相比，导致了针对Ad26(图3)和Ad35(图4)熔解温度的显著增加，指示配制品B中腺病毒增加的稳定性。
实例2
实验设计和方法
在实例1中描述的实验后，将配制品B通过添加或省略一种或若干种组分(NaCl、乙醇、EDTA或其组合)进行修饰，产生了8种实验配制品(A至H，参见表2)，将这些配制品与对照配制品(埃文斯等人中描述，并且上文指定的)相比较。所有配制品包含5％HBCD、20mM柠檬酸盐和0.02％PS-80。如表2中所指示的，这些配制品进一步包括75mM NaCl、0.1mM EDTA和/或0.5％乙醇(EtOH)。将腺病毒(Ad26)在这9种配制品中在25℃下孵育69天，或在35℃下孵育16天或进行30次冻/融循环随后进行搅拌(在室温下1天)。通过QPA评估效力损失，并且表达为Δ(减去t＝0)Ct(循环阈值)值。此外，在350nm下的吸光度读作针对浊度的度量，并且测量内源荧光以检测构象蛋白变化和聚集。最后，进行TMA和vp-QPCR来确定熔解温度和vp/IU比。
表2：配制品组合物。所有的配制品都包含5％HBCD、20mM柠檬酸盐和0.02％PS-80，一些补充有NaCl：75mM，EDTA：0.1mM和/或乙醇(EtOH)：0.5％(w/w)。
Figure BDA0002491885860000171
结果和结论
基于在图5中显示的25℃稳定性结果，可以总结出添加NaCl与EDTA(C和D)或乙醇(E和F)的组合显然有益于病毒的稳定性，其中乙醇显然胜过EDTA。出乎意料地，在具有或不具有NaCl的情况下，EDTA和乙醇的组合并不会导致更稳定的配制品(G和H)。这与从现有技术中预期的相反，例如阿尔塔拉斯等人，2005，和埃文斯等人，2004，其中EDTA/EtOH的具体组合通常被称为是自由基氧化抑制剂，于此为腺病毒稳定性的强增强剂。
转变至更严格的模型，在35℃下持续16天，辨别能力变得更加明显，如图6中可以看到的。明显地，添加NaCl改进了稳定性并且在图6中确认了乙醇的有益作用。出人意料地，EDTA与乙醇一起的组合，在具有或不具有NaCl的情况下，对病毒稳定性具有明显的负效果。这违背了EDTA/EtOH组合作为自由基氧化抑制剂表现良好的普遍看法(例如，阿尔塔拉斯等人，2005，和埃文斯等人，2004)。综上所述，两种热应激源在此具体配制品中显示与EDTA或乙醇组合的NaCl的有益效果。
为了调研具有不同降解途径的配制品的表现，将所述配制品(A至H)暴露于冻/融循环和搅拌应激下(图7)。所观察到的效果是明显的并且是意想不到的。明显地，EDTA(C和D)没有任何作用。在其他方面，乙醇强烈保护免受冻/融的损害，并且因此作为冷冻保护剂(E至H)。
这些不可预测的结果已经通过在350nm下在比浊法测定中的吸光度读数来确认(图8)。在没有乙醇的配制品中，与t＝0相比，冻/融(图8中的空心方块)导致浊度的降低。这种降低最可能是由于病毒粒子的崩解造成的。与这些观察到的一致，加速的温度应激(图8中黑色三角)也导致在没有乙醇的配制品中的浊度降低，然而具有乙醇的配制品，确切地配制品F，与t＝0(图8中黑圈)样品相比没有显示出显著变化。
此外，内源荧光(图9)进一步确认了之前的观察。不具有乙醇的配制品在冻/融应激后与t＝0(图9中空白方块)相比导致了色氨酸荧光的大幅下降，指示病毒衣壳中严重的构象变化。形成鲜明对比，具有乙醇的配制品保护了病毒免受这种应激源。热应激对包含乙醇的配制品仅具有轻微的影响。
与对照配制品相比，TMA数据揭示了配制品F的熔解温度的显著增加(图10)，这指示了在配制品F中更稳定的病毒衣壳。
重要的是，在暴露于加速温度(25℃)后，与配制品F相比，反映了病毒制剂的感染比例的vp/IU比(指示病毒粒子的质量)在对照配制品中显示出更高值(较少感染粒子/粒子总量)，参见表3。这显示出配制品F与对照配制品相比能够以更大的方式保持腺病毒的感染性。
表3：在25℃下，在t＝0和t＝61处的配制品F和对照配制品的vp/IU比
Figure BDA0002491885860000181
实例3.
实验设计和方法
为了定义配制品缓冲液设计空间，针对各赋形剂评估稳固性范围。在已经选择因素后，如在表4中报道的，针对各组分定义实验范围。
遵循实验设计(DOE)方法来绘制实验空间。使用具有六种因素中每种的低或高水平的设计(表4)，制备15种配制品-包括三个中心点-来以高统计功效研究各因素的作用和在因素之间的可能的相互作用(表5)。
表4：用于编制研究的实验空间的因素和水平
Figure BDA0002491885860000182
Figure BDA0002491885860000191
表5.实验设计。遵循用于编制研究的实验空间的因素和水平，独立制备十五种配制品，包括三个中心点(灰色行)。
Figure BDA0002491885860000192
为了评估各赋形剂和pH的适合的水平(配制品稳固性)，将各组填充在玻璃小瓶中，并且经受10次冻/融(F/T)循环，随后在室温(RT)下以200rpm搅拌1天并且在35℃下储存7天(加速降解模型)。然后将通过QPA得到的效力(n＝3)用作读数。
使用PD-10柱(GE医疗)，将Ad26制剂经缓冲液交换进表5中列出的各种配制品中。收集每种配制品的洗出液，无菌过滤并且在2℃-8℃下储存于玻璃瓶中。取样用于通过vp-QPCR确定病毒滴度，并且将所有的滴度都用适合的配制品调节至1x 1011vp/mL。随后，将配制品填充至玻璃小瓶(0.75mL/小瓶)中，加塞并加帽。将t＝0样品(对照，6个小瓶/组)直接在≤-65℃下储存。随后，将四个小瓶/组(n＝4)孵育，冻/融，搅拌并储存在35℃下持续7天(表6)，直到通过QPA以每种样品一式三份进行样品分析。
结果和结论
在完成研究后，通过QPA分析所有的样品，并且效力的损失表达为减去t＝0值的Δ。此数据被用来进行统计分析。
统计分析的输出是成功概率，其中成功定义为符合规格的稳定的配制品，该规格被设定为选定的关键质量属性(CQA)：效力。等效性检验在T0和应激后之间进行：以比较等效性，验收标准在可容忍的最大效力损失(IU/mL)上定义：在此实验中，容忍的效力损失定义为Δ效力限≥-0.30log IU/mL。
所获得的实验数据显示在表6中，并且基于效力，被用来减少实验域并且计算设计空间。
数据包含45项观察值。存在已经被一式三份测试的12种不同缓冲液，并且另外一种已经单独制备了三次，并且每个独立制剂都一式三份进行了测试(中心点)。
表6：针对各配制品的表达为Δ效力(log_IU/mL)的实验值
Figure BDA0002491885860000201
Figure BDA0002491885860000211
已对数据进行以下模型的拟合：
Δ_log_效力[i]～N(μ[i]，σ)；
针对(i在1:Nobs中){
μ[i]<-α_0+
α_H*pH[i]+
α_柠檬酸盐*柠檬酸盐[i]+
α_HBCD*HBCD[i]+
α_EtOH*EtOH[i]+
α_PS_80*PS_80[i]+
α_NaCl*NaCl[i]+
α_HBCD2*HBCD[i]*HBCD[i]+
α_PS_802*PS_80[i]*PS_80[i]+
α_pH_HBCD*pH[i]*HBCD[i]+
α_pH_NaCl*pH[i]*NaCl[i]+
α_r_批次[批次[i]]；
其中α-r-批次代表随机批次和σ残留误差。
为了从模型中获得预测，以获得一个基于风险的设计空间方法，已经采用贝叶斯框架，因为在给出配制品参数的情况下，CQA的预测联合分布可以容易得出(参见彼得森(Peterson)等人，莱夫伦(Lebrun)等人)。使用以下概率陈述，定义基于风险的设计空间：
Figure BDA0002491885860000221
换言之，设计空间是实验域的区域χ(通常称为知识空间)，其中在给出观测数据的情况下，CQA在规格内的后验概率(Λ)，高于规定的质量水平π。这种注释使得在统计模型中所包括的不确定性的包含变成隐性。概率是共同符合规格的保障的直接量度。为了计算这种概率，统计模型可以写为以下通用的线性方程。针对第j个CQA，调整模型：
yi＝xbi+ei，其中
Figure BDA0002491885860000222
其中yi是应用至第i个CQA的任何变化式，以便获得良好的统计性质(例如，同一性、log或对数变换)，i＝1,…,7。估计模型参数bi和
Figure BDA0002491885860000227
(参见上文)。
方程(1)的后验概率从新应答的预测分布计算，鉴定为以下学生分布(Student’sdistribution)(为了简单起见下标指数i)：
Figure BDA0002491885860000223
此三种参数的学生分布具有n-p自由度(针对n观察值和p模型参数)，是以平均回归线
Figure BDA0002491885860000228
为中心，从
Figure BDA0002491885860000229
的普通最小二乘法估计来计算。
Figure BDA0002491885860000224
其中参数a是残差平方和，即
Figure BDA0002491885860000225
因此，S定义了学生分布的规模。方差估计值计算为S/(n-p)。
为了探索实验域，建议不要创建5个因素网格(因为维数问题：如果评估2种水平/因素，它将导致25大小的网格；如果10种水平/因素，它将导致105大小的网格，等等)。相反，创建一些随机样品并且如下探索：
a)在实验域中选择大量随机(在χ上均匀分布)操作条件(因素设置)
Figure BDA0002491885860000226
b)针对各操作条件：进行大量的模拟：
针对各CQA，从如在方程(3)中预测的分布中抽取n*样品
Figure BDA0002491885860000231
c)从CQA预测的不同模拟，在规格内计算样本的比例
在给出关键质量属性及其规格的情况下，该比例是用以获得质量输出的后验概率估计。最终，建议从视觉上评估在二维空间中的结果的投影对图上的随机操作分布，以鉴定设计空间(图11)
然后调整计算，并且减少因素范围来最大化在这些范围中针对CQA效力的成功概率(表7)，这反映了所谓的正常操作范围(NOR)和设计空间。表7中示出的范围确保具有稳定配制品的最高成功概率。因此，这些范围确保了最佳的产物稳定性。
表7.具有选定因素范围(NOR)的设计空间
配制品因素 规格
pH 5.9-6.2
柠檬酸盐(mM) 10-25
HBCD(w/w) 4-6
EtOH(w/w) 0.3-0.45
PS-80(w/w) 0.018-0.035
NaCl(mM) 70-100
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Claims (17)

1.一种针对腺病毒的液体配制品，其包括：
a)重组腺病毒；
b)柠檬酸盐缓冲液；
c)羟丙基-β-环糊精(HBCD)；
d)盐；
e)非离子型洗涤剂；
其中所述配制品具有范围在5.5和6.5之间的pH。
2.根据权利要求1所述的配制品，其中该柠檬酸盐浓度范围在5mM和30mM之间。
3.根据权利要求1或2所述的配制品，其中该HBCD的浓度范围在1％(w/w)至10％(w/w)之间。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的配制品，其中该盐是氯化钠。
5.根据权利要求4所述的配制品，其中该氯化钠浓度范围在20mM至约200mM之间。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的配制品，其中该非离子型洗涤剂是聚山梨酯-80。
7.根据权利要求6所述的配制品，其中该聚山梨酯-80浓度范围在0.005％(w/w)至0.5％(w/w)之间。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的配制品，其中所述配制品具有范围在5.7和6.3之间的pH，并且包括浓度范围在5和30mM之间的柠檬酸盐；浓度范围在1％(w/w)和10％(w/w)之间的HBCD；浓度范围在20mM和200mM之间的NaCl；浓度范围在0.01％(w/w)和0.05％(w/w)之间的聚山梨酯-80。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的配制品，其中该配制品进一步包括2-碳醇或4-碳醇。
10.根据权利要求9所述的配制品，其中该2-碳醇或4-碳醇是乙醇。
11.根据权利要求10所述的配制品，其中该乙醇浓度范围在0.1％(w/w)至1％(w/w)之间。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的配制品，其中所述配制品具有范围在5.7和6.3之间的pH，并且包括浓度范围在5和30mM之间的柠檬酸盐；浓度范围在1％(w/w)和10％(w/w)之间的HBCD；浓度范围在20mM和200mM之间的NaCl；浓度范围在0.01％(w/w)和0.05％(w/w)之间的聚山梨酯-80；以及浓度范围在0.2％(w/w)和0.6％(w/w)之间的乙醇。
13.根据权利要求12所述的配制品，其中所述配制品具有6的pH，并且包括浓度为20mM的柠檬酸盐；浓度为5％(w/w)的HBCD；浓度为80mM的NaCl；浓度为0.025％(w/w)的聚山梨酯-80以及浓度为0.4％(w/w)的乙醇。
14.根据权利要求10-12中任一项所述的配制品，其中所述配制品具有范围在5.9和6.2之间的pH，并且包括浓度范围在10和25mM之间的柠檬酸盐；浓度范围在4％(w/w)和6％(w/w)之间的HBCD；浓度范围在70mM和100mM之间的NaCl；浓度范围在0.018％(w/w)和0.035％(w/w)之间的聚山梨酯-80；以及浓度范围在0.3％(w/w)和0.45％(w/w)之间的乙醇。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的配制品，其中所述配制品适用于肠胃外使用。
16.一种保存腺病毒的方法，该方法包括制备根据权利要求1-15中任一项所述的配制品。
17.一种保存腺病毒的方法，该方法包括制备根据权利要求1-15中任一项所述的配制品，并且将所述配制品储存于范围在2℃和8℃之间的温度下。
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