KR20210143869A - 트랜스진 발현을 위한 조작된 아데노-연관 (aav) 벡터 - Google Patents

Abstract

예를 들어, CNS, PNS, 내이, 심장, 또는 망막에서의 트랜스진 발현을 위한 조작된 AAV 벡터, 및 그의 사용 방법이 본원에 기재된다. 또한, 목적하는 세포 유형에서 트랜스진 발현을 매개하는 새로운 조작된 AAV 벡터를 발견하는 방법이 제공된다.

Description

트랜스진 발현을 위한 조작된 아데노-연관 (AAV) 벡터

우선권 주장

본 출원은 2019년 3월 28일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/825,703을 우선권 주장한다. 상기의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.

연방정부 지원된 연구 또는 개발

본 발명은 미국 국립 보건원에 의해 수여된 허가 번호 AG047336 및 DC017117 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.

기술 분야

예를 들어, CNS, PNS, 내이, 심장, 또는 망막에서의 트랜스진 발현을 위한 조작된 AAV 벡터, 및 그의 사용 방법이 본원에 기재된다. 또한, 목적하는 세포 유형에서 트랜스진 발현을 매개하는 새로운 조작된 AAV 벡터를 발견하는 방법이 제공된다.

AAV9 벡터는 전신 전달 후 CNS에의 전달을 위한 주목할 만한 잠재성을 나타내어 척수 근육 위축증을 갖는 소아과 환자에서 임상적 성공을 발생켰지만¹, 고 용량의 AAV 벡터의 전신 주사는 형질도입된 세포를 제거할 수 있는 T-세포 반응의 유도를 초래할 수 있다². 원숭이에서, AAV9-유사 벡터의 고 전신 용량은 전신 염증에 기인한 동물의 독성 및 사망을 초래하였다는 한 보고가 있다³. 근육 이영양증을 치료하기 위한 고 용량 AAV9를 사용한 최근의 I상 임상 시험은 한 환자에서 벡터 주입 후 면역 반응으로 인해 FDA에 의해 보류되었다. 고 용량이 요구되는 이유는 실질적인 수의 표적 세포에서 적당한 트랜스진 발현을 제공하는 벡터 게놈 카피당 기초의 AAV의 상대적으로 낮은 효율에 기인한다. 따라서, 보다 낮은 용량에서 보다 효율적인 형질도입을 허용하는 새로운 AAV 캡시드를 개발하는 것은 안전성 문제, 예컨대 면역독성을 저하시키면서 보다 양호한 치료 효능을 발생시킬 것이다.

신규 바이러스 클론을 확인하기 위한 2-부분 발현 카세트를 갖는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터 게놈을 사용하는 방법이 본원에 기재된다. 첫번째는 관심의 프로모터 하에서의 Cre-리콤비나제 카세트이다. 두번째 부분은 바이러스 게놈의 제1 섹션에 대해 "시스로" 클로닝된 조작된 캡시드 유전자의 발현을 구동하는 AAV 프로모터이다. 바이러스 벡터는 상류 loxP/정지 부위를 갖는 리포터 유전자 (예를 들어, 녹색 형광 단백질)를 발현하는 세포를 사용한 트랜스진 발현 (고도로 민감성 Cre 발현)을 위해 선택되며, 따라서 AAV 벡터-전달된 Cre가 정지 부위를 제거할 때까지 리포터 발현을 방지한다. 리포터 유전자 양성 세포는 단리될 수 있고, 회수된 AAV 캡시드 서열은 효율적인 트랜스진 발현을 매개할 보다 높은 가능성을 가질 것이다. 또한, 중추 신경계 (CNS) 및 말초 신경계 (PNS), 심장, 간, 및 내이에서 효율적인 발현을 구동하는 조작된 바이러스 서열이 본원에 기재된다.

따라서, 서열 STTLYSP (서열식별번호(SEQ ID NO): 1) 또는 FVVGQSY (서열식별번호: 2)로부터의 적어도 4개의 인접한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 AAV 캡시드 단백질이 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 서열 STTLYSP (서열식별번호: 1) 또는 FVVGQSY (서열식별번호: 2)로부터의 적어도 5개의 인접한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 서열 STTLYSP (서열식별번호: 1) 또는 FVVGQSY (서열식별번호: 2)로부터의 적어도 6개의 인접한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 대안적으로, AAV 캡시드 단백질은 도 2a 또는 7c에 나타내어진 서열 (서열식별번호: 17-150)로부터의 적어도 4, 5, 또는 6개의 인접한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, AAV는 AAV9이다.

일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 AAV9 VP1을 포함한다.

일부 실시양태에서, 서열은 VP1/VP2 계면 (아미노산 138)에서의 서열식별번호: 6의 아미노산 588 및 589에 상응하는 위치 또는 583-590 사이의 임의의 부위에서 캡시드 내로 삽입된다.

또한, 본원에 기재된 바와 같은 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산이 본원에서 제공된다.

추가적으로, 본원에 기재된 캡시드 단백질을 포함하며, 바람직하게는 야생형 VP1, VP2, 또는 VP3 캡시드 단백질을 포함하지 않는 AAV가 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, AAV는 트랜스진, 바람직하게는 치료 트랜스진을 추가로 포함한다.

추가로, 트랜스진을 세포, 예를 들어, 생체내 또는 생체외/시험관내 세포에 전달하는 방법이 제공된다. 방법은 세포를 본원에 기재된 바와 같은 AAV와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 뉴런 (임의로 후근 신경절 뉴런 또는 나선 신경절 뉴런), 성상세포, 심근세포, 또는 근세포, 성상세포, 아교 세포, 내부 유모 세포, 외부 유모 세포, 지지 세포, 내이의 섬유세포, 광수용체, 개재뉴런, 망막 신경절, 또는 망막 색소 상피이다.

일부 실시양태에서, 세포는 살아있는 대상체, 예를 들어, 포유동물 대상체, 바람직하게는 인간에 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 뇌, 척수, 후근 신경절, 심장, 내이, 눈, 또는 근육, 및 이들의 조합으로부터 선택된 조직에 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 알츠하이머병; 파킨슨병; X-연관 부신백질이영양증; 카나반병 ; 니만 픽병; 척수 근육 위축증; 헌팅톤병; 코넥신-26; 어셔 유형 3A; 어셔 유형 2D; 유모 세포-관련 청각 상실; 유모 세포-관련 청각 상실 (DFNB7/11); 내부 유모 세포-관련 청각 상실 (DFNB9); 어셔 유형 1F; 어셔 유형 1B; 색소성 망막염 (RP; 비-증후군성); 레베르 선천성 흑암시; 레베르 유전성 시신경병증; 어셔 증후군 (RP; 난청을 갖는 증후군성); 뒤시엔느 근육 이영양증; 동종이식편 혈관병증; 또는 A형 및 B형 혈우병을 갖는다. 본원에 기재된 방법 및 조성물은 상태의 1종 이상의 증상을 개선시키거나, 그의 위험을 감소시키거나, 그의 발병을 지연시키는데 충분한 치료 트랜스진을 운반하는 AAV의 치료 유효량의 투여에 의해 이들 상태를 치료하는데 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 세포는 대상체의 뇌에 있고, AAV는 비경구 전달; 뇌내; 또는 경막내 전달에 의해 투여된다.

일부 실시양태에서, 경막내 전달은 요추 주사, 대수조 주사, 또는 실질내 주사를 통한 전달이다.

일부 실시양태에서, AAV는 비경구 전달에 의해, 바람직하게는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내, 또는 근육내 전달을 통해 전달된다.

일부 실시양태에서, 세포는 대상체의 눈에 있고, AAV는 망막하 또는 유리체내 주사에 의해 투여된다.

일부 실시양태에서, 세포는 대상체의 내이에 있고, AAV는 정원창 막 위로의 또는 이를 통한 적용을 통해, 정원창, 골성 난원창 내의 창, 또는 반고리관에 인접한 외과적으로 천공된 와우개창술을 통해 와우에 투여된다.

또한, 하기를 포함하는 라이브러리 구축물 AAV가 본원에서 제공된다: (i) 프로모터에 의해 구동된 Cre 리콤비나제를 코딩하는 서열; (ii) Cre 카세트의 하류의 프로모터에 의해 구동된 캡시드의 아미노산 (aa) 588-589를 코딩하는 서열 사이에 삽입된 본원에 기재된 바와 같은 펩티드, 예를 들어, 칠량체 펩티드를 갖는 AAV9 캡시드 단백질을 코딩하는 서열. 일부 실시양태에서, 펩티드는 랜덤 펩티드 서열 또는 사전-선택된 펩티드 서열을 포함한다.

추가로, 본원에 기재된 바와 같은 복수의 라이브러리 구축물을 포함하는 라이브러리가 제공된다. 일부 실시양태에서, 펩티드 서열이 랜덤인 경우, 라이브러리는 칠량체의 모든 가능한 변이체를 코딩하는 서열을 갖는 라이브러리 구축물을 포함한다.

추가로, 사전-선택된 세포 유형에서 트랜스진 발현을 매개하는 조작된 캡시드를 확인하는 방법이 본원에서 제공된다. 방법은 (a) 제23항 또는 제24항의 라이브러리를 비-인간 모델 동물, 바람직하게는 포유동물에게 투여하며, 여기서 모델 동물의 세포는 리포터 서열의 상류의 loxP-플랭킹된 STOP 카세트를 발현하는 것인 단계; (b) 사전-선택된 세포 유형의 세포를 단리하는 단계; (c) 리포터 서열이 발현되는 세포를 선택하는 단계; (d) 리포터 서열이 단계 (c)로부터 발현되는 선택된 세포로부터 라이브러리 구축물의 적어도 부분, 바람직하게는 칠량체를 포함하는 부분을 단리하는 단계; 및 (e) 단계 (d)에서 단리된 라이브러리 구축물에서 칠량체의 신원을 결정하며, 여기서 단리된 칠량체는 사전-선택된 세포 유형에서 트랜스진 발현을 매개할 수 있는 것인 단계를 포함한다.

일부 실시양태에서, 리포터 서열은 형광 리포터 단백질을 코딩한다.

일부 실시양태에서, 모델 동물은 리포터 서열의 상류의 loxP-플랭킹된 STOP 카세트에 대해 트랜스제닉이거나, 또는 리포터 서열의 상류의 loxP-플랭킹된 STOP 카세트는 제2 구축물로부터 발현될 수 있다.

일부 실시양태에서, 라이브러리 구축물에서 칠량체의 신원을 결정하는 것은 DNA 시퀀싱 분석을 사용하는 것을 포함한다.

일부 실시양태에서, 방법은 또한 단계 (e) 전에 및/또는 후에 단계 (d)에서 단리된 라이브러리 구축물로부터 PCR을 사용하여 전체 캡시드 서열을 임의로 포함하는 칠량체 서열을 포함하는 서열을 증폭시키고; 증폭된 서열을 라이브러리 벡터의 제2 세트로 다시 클로닝하고; 라이브러리 벡터의 제2 세트를 재패키징하고; 라이브러리 벡터의 제2 세트에 대해 단계 (a)-(d) 또는 (a)-(e)를 수행하는 것을 포함한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에서 사용하기 위한 방법 및 물질이 본원에 기재되며; 관련 기술분야에 공지된 다른 적합한 방법 및 물질은 또한 사용될 수 있다. 물질, 방법, 및 실시예는 단지 예시적이며, 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 본원에 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 엔트리, 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 지배할 것이다.

본 발명의 다른 특색 및 이점은 하기 상세한 설명 및 도면으로부터, 및 청구범위로부터 명백할 것이다.

도 1a-b. 표적 조직에서 효율적인 트랜스진 발현이 가능한 신규 AAV 캡시드의 선택을 위한 i트랜스듀스(iTransduce) 라이브러리. a. 라이브러리 구축물의 2-성분 시스템. 1. Cre 리콤비나제는 최소 닭 베타 액틴 (CBA) 프로모터에 의해 구동된다. 2. Cre 카세트의 하류에 클로닝된 aa 588-589 사이에 삽입된 랜덤 칠량체 펩티드를 갖는 p41 프로모터 구동된 AAV9 캡시드. b. 선택 전략. i. 캡시드 상에 발현된 상이한 펩티드 삽입물 (상이한 색상에 의해 나타내어짐)로 구성된 i트랜스듀스 라이브러리를 Gt(ROSA)26Sor 유전자좌 내로 삽입된 tdTomato 리포터 유전자의 상류의 loxP-플랭킹된 STOP 카세트를 갖는 Ai9 트랜스제닉 마우스 내로 i.v. 주사한다. 관심의 세포에 진입할 수 있지만 세포를 기능적으로 형질도입하지 않는 (Cre 발현 없음) AAV 캡시드는 tdTomato 발현을 켜지 않는다. 기능적 형질도입을 매개할 (Cre를 발현할) 수 있는 캡시드는 tdTomato 발현을 켤 것이다. ii. 세포를 관심의 기관 (예를 들어 뇌)으로부터 단리하고, 형질도입된 세포를 tdTomato 발현 및 임의로 세포 마커에 대해 분류한다. iii. 캡시드 DNA를 분류된 세포로부터 PCR-증폭시키고, 라이브러리 벡터로 다시 클로닝하고, 선택의 또 다른 라운드를 위해 재패키징한다. DNA 시퀀싱 분석을 각각의 라운드 후에 이용하여 선택 과정을 모니터링한다.
도 2a-b. 전신 주사 후 뇌 형질도입을 위한 생체내 선택의 2 라운드 후의 AAV-S 및 AAV-F의 확인. 도넛 차트는 차세대 시퀀싱에 의해 결정된 특정 펩티드 삽입물의 빈도를 지시한다. a. 제조 후의 그러나 주사 전의 라운드 2 벡터 서열의 표 (서열식별번호: 17-86). b. 라운드 2 주사 후에 i트랜스듀스 단리에서 나타나는 펩티드 빈도의 도넛 차트 (서열식별번호: 1-3). "기타"는 총 풀의 1% 미만으로서 나타나는 서열 변이체를 지시한다 ((a)에서, 1% 미만으로 나타나는 라운드 2 스크린 후에 단리된 변이체는 또한 강조된다). *는 정지 코돈을 지시한다.
도 3a-f. AAV-F는 전신 주사 후에 마우스의 뇌를 효율적으로 형질도입한다. a. 캡시드의 형질도입 잠재성을 비교하는데 사용된 단일-가닥 AAV-GFP 발현 카세트. ITR, 역위 말단 반복부; CBA, 하이브리드 CMV 인핸서/닭 베타 액틴 프로모터; WPRE, 마멋 간염 바이러스 전사후 조절 요소; pA, 폴리 A 신호 (SV40 및 소 성장 호르몬 유래 둘 다). b. 1x10¹¹ vg (저 용량)의 AAV9, AAV9-PHP.B, AAV-S, 또는 AAV-F로 형질도입된 C57BL/6 마우스 (수컷)로부터의 전체 뇌 시상 섹션의 대표적 저 배율 화상. c. 8x10¹¹ vg (고 용량)의 C57BL/6 수컷에서의 각각의 벡터의 주사 후의 뇌의 시상 섹션의 대표적 화상. d. 보다 고 용량 (8x10¹¹ vg/마우스)으로 정맥내로 투여된 4가지 벡터의 각각에 의해 형질도입된 척수의 예시 섹션. e. 저 (좌측 패널) 및 고 (우측 패널) 용량으로 형광에 의해 커버된 섹션의 백분율에 의한 각각의 벡터로부터의 천연 GFP 발현의 정량. f. 보다 고 용량으로의 뇌에서의 형질도입의 다영역 비교. 터키(Tukey) 다중 비교 검정을 갖는 1-원 ANOVA 후 ***, p< 0.001; ****, p < 0.0001 (n=3 각각의 군).
도 4a-e. 뉴런 및 성상세포 형질도입 및 생체분포의 AAV 벡터 비교. a. 뉴런 (NeuN) 및 b. 성상세포 (글루타민 신테타제, GS)에 대한 마커로의 공동-면역염색 후의 AAV9, AAV-PHP.B, AAV-S 및 AAV-F 형질도입된 세포 (GFP 양성)의 고 배율 화상, 병합된 세포는 또한 DAPI에 의한 핵 염색을 포함한다. c. 1x10¹¹ vg의 각각의 벡터의 i.v. 전달 후의 형질도입된 피질 성상세포 및 뉴런의 백분율의 입체학적 평가. P < 0.0001 1-원 ANOVA. (*) 및 (**)는 터키 다중 비교 검정 후의 각각의 벡터 군 사이의 유의한 차이를 나타낸다 (n=3마리의 마우스/군). d. GAPDH 게놈 DNA 수준 (투입 DNA)에 의해 정규화된 벡터 게놈의 qPCR에 의해 측정된 바와 같은 뇌 및 간에서의 벡터의 생체분포. e. C57BL/6 수컷에서의 8x10¹¹ vg으로의 정맥내 투여 후의 말초 기관에서의 AAV9, AAV9-PHP.B, AAV-S, 및 AAV-F의 형질도입. 망막 화상: RPE, 망막 색소 상피; ONL; 외핵층; OPL, 외얼기층; INL, 내핵층; IPL, 내얼기층; GCL, 신경절 세포층. ****, p < 0.0001 (n=3마리의 마우스/군, 터키 다중 비교 검정을 갖는 1-원 ANOVA).
도 5a-c. AAV-F는 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스에서 및 또한 BALB/c 마우스에서 고 형질도입 효율을 매개한다. a. 1x10¹¹ vg/마우스로 AAV-F에 의해 형질도입된 수컷 및 암컷 마우스 (n=3)에서의 시상 뇌 섹션에 걸친 GFP 신호의 대표적 화상. b. 1x10¹¹ vg/ 마우스로 AAV-F (좌측) 또는 AAV9-PHP.B (우측)로 주사된 수컷 BALB/c 마우스의 시상 뇌 섹션. DAPI는 PHP.B-처리된 뇌 섹션을 가시화하기 위해 GFP와 함께 반대염색으로서 제공되었다. c. 형광에 의해 커버된 섹션의 백분율에 의한 각각의 벡터로부터의 내인성 GFP 발현의 정량. **, p < 0.01. 독립표본 t-검정 (n=3마리의 마우스/군).
도 6a-b. AAV-F는 인간 피질 뉴런에서 AAV9보다 더 높은 형질도입 효율을 매개한다. a. AAV-F에 의해 형질도입된 태아-유래 1차 인간 뉴런에서의 GFP 발현. 뉴런을 β-튜불린에 대한 항체로 공동-표지하여 형질도입을 정량화하였다. b. AAV9, AAV-S 및 AAV-F에 의한 인간 뉴런의 형질도입 효율의 정량. *, p < 0.05.
도 7a-c. i트랜스듀스 라이브러리는 Cre 재조합을 기능적으로 유발하고, cap 유전자에서의 7-mer 펩티드-코딩 삽입물의 PCR 증폭은 조직으로부터 구제될 수 있다. a. Ai9 floxed/STOP tdTomato 트랜스제닉 마우스에서의 비선택된 i트랜스듀스 라이브러리로의 형질도입 후의 조직에서의 tdTomato DAB 염색의 예 (우측 패널). PBS를 대조군으로서 주사하였다 (좌측 패널). 적색 화살표는 형질도입된 세포의 예를 지시한다. b. 야생형 및 트랜스제닉 비형질도입된 마우스에 비한, 뇌를 포함한 다양한 조직으로부터의 Cap 유전자의 삽입물-함유 영역을 구제하는 PCR의 예. c. 선택의 제1 라운드 후에 본 변이체의 스펙트럼을 예시하는 표, 가장 빈번한 변이체는 강조됨 (서열식별번호: 87-150). "기타"는 그룹화된 서열 변이체를 지시하며, 이들 각각은 총 풀의 1% 미만으로서 나타난다. *는 정지 코돈을 지시한다.
도 8a-b. 라운드 2에서의 Cre-기반 선택은 형질도입-적격 AAV를 밝혀낸다. a. tdTomato-양성 세포의 유동 세포계측법 분석. 마우스 뇌의 분리 후, 세포 현탁액을 분석하고, 전방 및 측방 산란 (FSC, SSC)에 기반하여 유도된 게이팅으로 tdTomato 양성 세포에 대해 분류하여 비-생존 세포 (총 이벤트)를 배제하여, 단지 단일 세포 (싱글렛)만을 포획하고, 마지막으로 tdTomato 발현에 대해 (tdTomato +/- 세포) 분류하였다. AAV 라이브러리-형질도입된 뇌로부터 tdTomato-양성 세포를 분류하기 위해, 게이팅을 음성 대조군 (PBS-주사된 Ai9) 및 양성 대조군 (hSyn-Cre 뉴런-특이적 카세트를 운반하는 AAV9-PHP.B로 형질도입된 Ai9 마우스)에 기반하여 확립하였다. b. Cre-의존적 재조합 이벤트를 라운드 2 라이브러리의 주사 후에 간 및 뇌에서의 tdTomato에 대한 DAB 면역염색 후에 검출한다 (PBS 또는 AAV9-PHP.B hSyn-Cre 주사에 비해). 화살표는 AAV 라이브러리 주사된 마우스의 뇌에서의 양성 세포 (성상세포)를 지시한다.
도 9a-b. 저 (1x10 ¹¹ vg) 또는 고 용량의 벡터 (8x10 ¹¹ vg)의 정맥내 전달 후의 AAV-F 및 AAV-S에 의한 뇌의 형질도입. 시상 섹션에서의 내인성 (비염색된) GFP 형광을 입증하는, n=3마리의 마우스에서의 AAV9, AAV9-PHP.B, AAV-S 및 AAV-F에 의한 형질도입 후의 뇌에서의 형질도입 프로파일. 마우스를 1x10¹¹ vg (a) 또는 8x10¹¹ vg (b)로 투여하였다. 각각의 군에서의 각각의 섹션을 개별 마우스로부터 취한다.
도 10a-b. (a) AAV-F는 마우스 뇌에서 뉴런의 다수의 하위유형을 형질도입한다. AAV-F에 의해 구동된 GFP 발현을 뇌 및 CNS의 상이한 영역에 걸쳐 폭넓은 범위의 뉴런 하위유형에서 검출하였다. CamKII, 흥분성 뉴런. GAD67, 억제성 뉴런. 티로신 히드록실라제 (TH), 푸르킨예 뉴런. 콜린 아세틸트랜스퍼라제 (ChAT), 운동 뉴런 (백색 화살표는 각각의 하위유형에 대한 형질도입된 뉴런의 예를 나타낸다). (b) 1x10 ¹¹ vg/마우스에서 AAV-F는 효율적인 형질도입을 매개하는 반면, AAV9는 그렇지 않다. 도 3b로부터의 마우스로부터의 대표적 10x 화상은 AAV-F 및 AAV9로 주사된 마우스로부터의 선조체, 해마, 및 소뇌에서의 GFP 발현을 나타낸다.
도 11. 전신 전달 후의 AAV-F의 생체분포. AAV9와 비교하여 AAV-F 생체분포가 골격근, 심장, 및 척수 조직에서 나타내어진다. 생체분포를 벡터 게놈의 qPCR에 의해 측정하고, 샘플을 동등한 투입에 대한 GAPDH 게놈 DNA에 대해 정규화하였다. n.s, 유의하지 않음. *, p < 0.05 (n=3마리의 마우스/군, 삼중으로 실행된 각각의 마우스 샘플, 양측 t-검정).
도 12a-e. 투과 전자 현미경 (TEM)에 의한 비어있는 캡시드의 정량화. a-d. AAV9 및 AAV-F 제제의 전자 현미경사진의 대표적 화상 부분. AAV9 (a,b) 및 AAV-F (c,d)의 각각의 2가지 제제를 각각의 제제에 대한 5개의 화상에 걸쳐 전체 대 비어있는 캡시드를 카운팅함으로써 정량화하였다 (비어있는 캡시드의 예는 화살표에 의해 지시된다). e. AAV9 및 AAV-F 제제에 대한 비어있는 캡시드 백분율의 정량화. n.s: 유의하지 않음 (p = 0.54, 독립표본 t-검정).
도 13. AAV-F 및 AAV-S의 직접 두개내 주사 후의 지속된 신경 형질도입. AAV-F (상부 패널) 또는 AAV-S (하부 패널)의 직접 피질내 및 해마내 주사 (AAV-F 및 AAV-S에 대해 각각 1.65x10¹⁰ 및 5.6x10¹⁰ gc/주사 부위) 후의 마우스 뇌 시상 섹션에 걸친 GFP 형광 신호 (및 DAPI)의 대표적 화상. 스케일 바: 전체 뇌의 저-배율 화상에 대해 1000μm 및 피질 및 해마의 보다 고-배율 화상에 대해 200 μm.
도 14a-f. AAV-F 벡터의 요추 경막내 주사 후의 척수 및 뇌의 광범위한 형질도입. 단일 가닥 AAV-CBA-GFP 발현 카세트를 패키징하는 10 마이크로리터의 AAV9 (1.25x10¹¹ vg) 또는 AAV-F (8.8x10¹⁰ vg)를 성체 마우스 (n=2/벡터)의 요추 영역에서 경막내로 주사하였다. 3주 후, 마우스를 희생시키고, 척수 및 뇌를 항-GFP 면역염색 후에 GFP 발현에 대해 분석하였다. (a) 상부 화상: AAV-F로의 (그러나 AAV9로는 아님) 뇌의 왕성한 형질도입을 나타내는 전체 관상 뇌 섹션 스캔. 하부 화상: AAV-F 및 AAV9로의 척수의 전체 섹션 스캔. AAV-F 주사된 마우스는 매우 높은 GFP 신호를 나타내었다. AAV9는 둘 다의 마우스에서 매우 낮은 발현을 나타내었다. 모든 화상은 33ms의 노출 시간에서 취해졌으며; AAV-F에 대해 4ms에서의 추가의 화상을 특색을 보다 잘 해상하기 위해 취하였다. 섹션 한계의 백색 윤곽은 섹션이 희미한 경우 포함된다. 열거되지 않은 경우, 스케일 바는 250μm와 동등하다. (b-d) AAV9 (b) 및 AAV-F (c,d)로 처리된 마우스로부터의 척수의 고 배율 화상. GFAP는 성상세포-특이적 염색 및 뉴런에 대한 NeuN을 지시한다. 척수의 영역은 각각의 화상의 상부 우측에 지시된다. 하부 패널에서의 화상은 상부 화상에서의 영역에서 박스친 부분의 보다 고 배율 화상이다. (e, f) 경막내 주사 후의 AAV-F 형질도입된 뇌의 고 배율 화상. (e)는 성상세포를 나타내고, (f)는 AAV-F에 의해 형질도입된 뉴런을 나타낸다. AAV9는 경막내 주사 후에 뇌의 검출가능한 형질도입을 매개하지 않았다. SC, 척수; CC, 뇌량, CP, 미상 피각.
도 15a-d. 내이에의 AAV-S-CBA-GFP 투여 후의 GFP 형광. (a,b): AAV-S로 형질도입된 와우 감각 상피의 대표적 화상 (63x 배율). (c): 나선연에서의 형질도입. (d): 나선 신경절 영역에서의 형질도입. Z 및 화살표는 Z-스택의 상이한 층을 지시한다. OHC: 외부 유모 세포. IHC: 내부 유모 세포.
도 16a-b. 내이 섬유세포 및 척수를 효율적으로 형질도입하는 AAV 캡시드를 선택하기 위한 비-트랜스제닉 NHP에서의 i트랜스듀스 라이브러리의 사용. (a) i. 시노몰구스 원숭이 (또는 다른 비-인간 영장류)를 GJB2-구동된 floxed-Stop-tdTomato 카세트를 코딩하는 AAV9-PHP.B와 함께 AAV 캡시드 라이브러리로 공동-주사한다. ii. AAV9-PHP.B는 AAV 라이브러리 캡시드가 Cre를 발현하는 경우 섬유세포 (음영에 의해 지시됨)에서 tdTomato를 선택적으로 발현할 것이다. iii. 내이를 분리하고, iv. tdTomato 양성 섬유세포를 유동-분류한다. v. 잠재적으로 기능적 캡시드를 분류된 세포로부터의 회수된 DNA로부터 PCR-증폭시키고, 라이브러리를 재패키징하고, 선택의 또 다른 라운드를 수행한다. 차세대 DNA 시퀀싱 분석을 각각의 라운드 후에 이용하여 선택 과정을 모니터링한다. 약어: TM, 덮개막; OC, 코르티 기관; SL, 나선 인대. (b). i. 시노몰구스 원숭이 (또는 다른 비-인간 영장류)를 CBA-구동된 floxed-Stop-mPlum 카세트를 코딩하는 AAV9-와 함께 AAV 캡시드 라이브러리로 공동-주사한다. ii., iii. AAV9는 AAV 라이브러리 캡시드가 Cre를 발현하는 경우 척수 (음영에 의해 지시됨)에서 mPlum을 발현할 것이다. 척수를 분리하고, mPlum 양성 세포를 유동-분류한다. iv. 잠재적으로 기능적 캡시드를 분류된 세포로부터의 회수된 DNA로부터 PCR-증폭시키고, 라이브러리를 재패키징하고, 선택의 또 다른 라운드를 수행한다. 차세대 DNA 시퀀싱 분석을 각각의 라운드 후에 이용하여 선택 과정을 모니터링한다.

표적 세포에의 트랜스진의 효율적인 전달에 대한 유망한 접근법은 AAV 벡터 캡시드 변이체의 풀, 또는 라이브러리를 생체내 선택 과정으로 처리하는 과정을 통해서이다 - 진정한 "적자 생존" 접근법^4-8. 랜덤 올리고머 뉴클레오티드를 사용하여 짧은 (6-9 아미노산) 랜덤 펩티드를 캡시드 표면 상의 노출된 영역 내로 삽입하는 AAV 라이브러리 접근법은 고유한 특성, 예컨대 표적 조직의 강화된 형질도입을 갖는 새로운 AAV 캡시드 변이체를 확인하는데 있어서의 성공을 입증하였다^{9, 10}. AAV 라이브러리의 한 가지 주요한 한계는 선택 과정의 말단 판독이 기능적 트랜스진 발현을 매개하는 캡시드를 그렇지 않은 것들로부터 항상 구별하지는 않는다는 것이다. AAV 형질도입은 세포 수용체 결합 및 진입으로부터 핵 수송까지의 다수의 단계, 제2-가닥 합성 및 마지막으로 유전자 및 단백질 발현을 수반하는 과정이다¹¹. CREATE로 지칭되는 통상적인 AAV 라이브러리 접근법에 대한 최근의 진보는 Cre-민감성 AAV 게놈을 조작하였으며, 이는 Cre-발현 트랜스제닉 동물의 맥락에서 핵에 성공적으로 트래피킹한 캡시드를 선택적으로 단리하는 것을 가능하게 하였다¹². Cre/loxP 시스템의 힘을 이용하는 i트랜스듀스로 지칭되는 그의 한 예인 캡시드 선택 시스템이 본원에 기재된다. Cre 트랜스제닉 마우스를 사용하는 대신, AAV를 Cre-발현 카세트와 함께 펩티드 삽입물을 갖는 둘 다의 캡시드를 코딩하도록 조작하였다. 이어서 선택을 Cre-민감성 형광 리포터를 갖는 마우스에서 수행하여 트랜스진 발현을 포함한 형질도입의 전체 과정을 매개하는 캡시드의 선택을 가능하게 하였다. 라이브러리의 생체내 선택은 CNS의 주목할 만한 형질도입 효율을 매개하는 AAV 캡시드, 및 내이에서 형질도입을 매개하는 또 다른 캡시드의 확인을 발생시켰다.

i트랜스듀스 시스템을 사용하여, 본 발명자들은 각각 뮤린 CNS (시험된 2가지 주) 및 내이에서 고도로 효율적인 트랜스진 발현을 매개하는 본원에서 AAV-F 및 AAV-S로 지칭되는 2가지 새로운 AAV 캡시드를 단리하였다. AAV-F 캡시드는 또한 1차 인간 뉴런의 왕성한 형질도입을 매개하였다.

흥미롭게도, 발현-기반 선택을 사용하여, NGS 판독물의 97%를 나타낸 3가지 펩티드 클론 (STTLYSP (서열식별번호: 1), FVVGQSY (서열식별번호: 2), 및 FQPCP* (서열식별번호: 3))이 확인되었다. FQPCP*는 정지 코돈을 가졌기 때문에, 이 게놈은 제조 동안 또 다른 캡시드에서 교차-패키징된 것으로 추론되었는데, 이는 AAV 라이브러리로 발생하는 것으로 언급된 현상이다¹⁵. 이는 또한 STTLYSP (서열식별번호: 1, "AAV-S")에 대한 경우일 수 있다 (도 2). AAV-S는 결함성 벡터가 아니었는데, 이는 그것이 말초 기관 (도 4e) 및 내이 (도 15)의 왕성한 형질도입을 매개하였기 때문이다. 이는 그렇게 높은 제조 효율을 가졌기 때문에 (표 4), AAV-S는 교차-패키징될 경향을 가졌을 수 있다. 한편, AAV-F (FVVGQSY (서열식별번호: 2))는 형질도입에서 극도로 효율적이었으며, NGS로부터의 단지 2개의 유망한 후보 중 하나였다 (도 2). 이들 후보 둘 다는 라운드 2 라이브러리 풀에서 매우 낮은 수준으로 검출가능하였다 (도 2) - 따라서, 본 발명자들은 그들의 풍부화가 기존의 편향에 기인하지 않았음을 확인할 수 있었다.

본 발명자들은 세포 유형 (전체 뇌)에 대한 애그노스틱 접근법을 사용하여 i트랜스듀스 시스템의 입증을 수행하였기 때문에, AAV-F가 AAV9에 의해 형질도입된 세포인 성상세포 및 뉴런에 대해 고도로 향성이었음은 놀랍지 않다. 장래의 연구에서 본 발명자들은 AAV 라이브러리 벡터로부터 Cre 발현을 구동하는 세포 특이적 프로모터 뿐만 아니라 통상적인 AAV 벡터 형질도입에 대해 불응성인 세포를 형질도입할 수 있는 캡시드를 단리하는 자기 세포 분류를 조합할 것이다.

임상적 후보 AAV 벡터를 선택하는 i트랜스듀스 시스템의 잠재성에 추가로, 이는 연구 도구로서 사용하기 위한 벡터를 확인하는데 사용될 수 있다. 최근에 확인된 AAV-PHP.B 캡시드는 뮤린 뇌를 유전자 변형시키는 효율적인 벡터로서 역할을 하였다¹². 그러나, 이는 BALB/c 또는 BALB/c 관련 마우스 계통을 형질도입하지 않는다^{13, 14 16}. 흥미롭게도, AAV-F의 정맥내 주사 후 BALB/c 및 C57BL/6 뮤린 뇌의 왕성한 형질도입이 관찰되었다. 이는 AAV9에 대한 강화된 형질도입의 메커니즘이 AAV-PHP.B 및 AAV-F 사이에 상이함을 지시한다. 이는 또한 AAV-F가 대중적인 BALB/c 주에서의 CNS 연구를 위한 효율적인 도구로서 이용되는 것을 가능하게 한다 (labome.com/method/Laboratory-Mice-and-Rats.html). 추가적으로, 본원에서 나타난 바와 같이, AAV-F는 또한 직접 및 경막내 볼루스 주사 둘 다 후 CNS에서 왕성한 트랜스진 발현을 매개할 수 있고, AAV-S는 내이에서 트랜스진 발현을 매개할 수 있다.

보다 큰 동물에서의 장래의 연구는, 예를 들어, 전임상 연구에서 AAV-F를 추가로 시험하기 위해 수행될 수 있다. 용량 에스컬레이션 연구는 NHP에서 PHP.B로 관찰된 바와 같이¹⁴, AAV-F의 용량-관련 독성에 대해 시험하기 위해 수행될 수 있다. 선택의 반복적 라운드는 형질도입 효율의 보다 양호한 교차-종 번역을 허용하기 위해 상이한 종 (예를 들어 마우스, 이어서 래트)에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 이는 마우스에서, 이어서 floxed STOP tdTomato 트랜스제닉 래트에서 수행될 수 있다¹⁷. 대안적으로, i트랜스듀스 라이브러리의 직접 선택은 트랜스제닉 마모셋에서^{18, 19} 또는 심지어 다른 비-인간 비-트랜스제닉 영장류에서 수행될 수 있다 (도 16a 및 b).

최적화된 캡시드 서열을 확인하는 방법

"바이러스 벡터 라이브러리"는 선택적 압력 (생체내 또는 시험관내) 하에서 관심의 표적 세포/조직/기관에 대해 특이적인 바이러스의 클론의 단리를 구동할 수 있는 바이러스의 풀링된 변이체이다. 현재 라이브러리 기술의 한 가지 한계는 많은 후보 바이러스 클론이 트랜스진 발현 (벡터의 필요한 최종 기능)을 매개하지 않는다는 것이다. 이 한계에 대한 주요 이유는 벡터-매개 트랜스진 발현에 기반한 벡터 선택을 허용하도록 고안된 전략이 없었다는 것이다. 2-부분 발현 카세트를 갖는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터 게놈을 사용하는 방법이 본원에 기재된다. 첫번째는 관심의 프로모터 하에서의 Cre-리콤비나제 카세트이다. 두번째 부분은 바이러스 게놈의 제1 섹션에 대해 "시스로" 클로닝된 캡시드 유전자의 발현을 구동하는 AAV 프로모터이다. 바이러스 벡터는 이제 상류 loxP/정지 부위를 갖는 리포터 유전자 (예를 들어, 녹색 형광 단백질)를 발현하는 세포를 사용하여 트랜스진 발현 (고도로 민감성 Cre 발현)을 위해 선택될 수 있으며, 따라서 AAV 벡터-전달된 Cre가 정지 부위를 제거할 때까지 리포터 발현을 방지한다. 리포터 유전자 양성 세포는 단리될 수 있고, 회수된 AAV 캡시드 서열은 효율적인 트랜스진 발현을 매개할 보다 높은 가능성을 가질 것이다.

따라서, (i) 프로모터, 예를 들어, 최소 닭 베타 액틴 (CBA) 프로모터에 의해 구동된 Cre 리콤비나제; (ii) Cre 카세트의 하류의 캡시드 단백질 내로 삽입된 본원에 기재된 바와 같은 펩티드, 예를 들어, 랜덤 칠량체 펩티드 또는 선택된 칠량체 펩티드를 코딩하는 서열을 갖는 프로모터 (예를 들어, p41 프로모터)-구동된 AAV9 캡시드 서열을 포함하는 라이브러리 구축물 AAV가 본원에서 제공된다. 바람직하게는 펩티드는 캡시드의 아미노산 (aa) 588-589를 코딩하는 서열 사이에 삽입되지만, 이는 또한 그것이 바이러스의 기능을 방해하지 않고, 선택된 세포의 감염을 촉진시키는데 있어서 그의 활성을 유지하는 한, 다른 곳에, 예를 들어, VP1/VP2 계면 (아미노산 138) 또는 583-590 사이의 임의의 부위에서 삽입될 수 있다. CBA 프로모터는 대부분의 세포 유형에서 Cre를 구동하는 강한 활성 프로모터이다. P41 프로모터는 Cap 유전자 발현을 구동하는 AAV 특이적 천연 프로모터이다. 사용될 수 있는 다른 프로모터는 시냅신 프로모터, GFAP 프로모터, CD68 프로모터, F4/80 프로모터, CX3CR1 프로모터, CD3 또는 CD4 프로모터, CMV 프로모터, 간 특이적 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않으며; 다른 예는 하기 열거된다. 구축물은 또한 Cre cDNA의 말단에 및 cap DNA의 말단에 정지 코돈을 포함할 수 있다. Cre 카세트 및 cap 카세트 뒤에는 폴리 A 신호가 있다. Cre 리콤비나제는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Van Duyne, Microbiol Spectr. 2015 Feb;3(1):MDNA3-0014-2014]을 참조한다. 도 1a는 예시적인 라이브러리 구축물을 제공한다.

또한, 라이브러리 (즉, 복수의 라이브러리 구축물을 포함하는 조성물)가 본원에서 제공된다. 랜덤 칠량체 서열이 사용되는 경우, 바람직하게는 라이브러리는 칠량체의 모든 또는 거의 모든 가능한 변이체를 코딩하는 서열을 갖는 구축물을 포함한다.

도 1b(i)에 예시된 방법은 캡시드 상에 발현된 상이한 펩티드 삽입물 (회색의 상이한 음영에 의해 나타내어짐)로 구성된 라이브러리를 모델 동물, 예를 들어, 포유동물, 예컨대 마우스 (예를 들어, Ai9 트랜스제닉 마우스), 토끼, 래트, 또는 원숭이에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 모델 동물은 Gt(ROSA)26Sor 유전자좌 내로 임의로 삽입된 리포터 서열, 예를 들어, 형광 리포터 단백질 서열, 예를 들어, tdTomato 리포터 유전자의 상류에 loxP-플랭킹된 STOP 카세트를 포함한다. 모델 동물은 트랜스제닉일 수 있거나, 리포터 서열의 상류의 loxP-플랭킹된 STOP 카세트는 제2 구축물, 예를 들어, 동물 모델에게 투여된 (예를 들어, 라이브러리 구축물 전에, 후에, 또는 그와 공동으로 투여된) 제2 AAV로부터 발현될 수 있다. 관심의 세포에 진입하지만 세포를 기능적으로 형질도입하지 않는 (Cre 발현 없음) 임의의 AAV 캡시드는 보고된 발현을 켜지 않는다. 기능적 형질도입을 매개할 (Cre를 발현할) 수 있는 캡시드는 tdTomato 발현을 켤 것이다. 도 1b(ii)에 나타내어진 바와 같이, 세포는 관심의 기관 (예를 들어, 뇌, 눈, 귀, 망막, 심장 등)으로부터 단리되고, 이어서 형질도입된 세포는 이어서 리포터 유전자 발현 및 임의로 세포 마커에 대해 분류될 수 있다. 도 1b(iii)에 나타내어진 바와 같이, 캡시드 DNA는, 예를 들어, 임의로, 분류된 세포로부터의 서열을 PCR-증폭시키고, 이들을 라이브러리 벡터로 다시 클로닝하고, 선택의 또 다른 라운드를 위해 재패키징함으로써 얻어지고 분석된다. DNA 시퀀싱 분석을 각각의 라운드 후에 이용하여 선택 과정을 모니터링할 수 있다.

프로모터

본원에 기재된 라이브러리 구축물은 2가지 프로모터를 포함한다; Cre 리콤비나제를 유도하는 하나, 및 AAV 캡시드 서열을 유도하는 두번째 것.

대부분의 세포 유형에서 발현을 구동하는 소위 "편재적" 프로모터, 예를 들어, 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 (임의로 CMV 인핸서를 가짐), 닭 베타-액틴 (CBA) 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (RSV) LTR 프로모터 (임의로 RSV 인핸서를 가짐), SV40 프로모터, 디히드로폴레이트 리덕타제 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 (PGK) 프로모터, EF1알파 프로모터, 유비퀴틴 C (UBC), B-글루쿠로니다제 (GUSB), 및 CMV 극/초기 유전자 인핸서/CBA 프로모터를 포함한 다수의 프로모터 서열이 관련 기술분야에 공지되어 있다.

Cre-리콤비나제의 발현은 또한 조직-특이적 프로모터, 예를 들어, 그 중에서도 CNS, 간, 심장, 와우, 망막, 또는 T 세포에 대한 조직-특이적 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 일부 실시양태에서, CNS에 대한 조직 특이적 프로모터는 뉴런, 대식세포/미세아교세포 프로모터 및 성상세포 프로모터를 포함한다. 시냅신 프로모터 (뉴런), 뉴런-특이적 에놀라제 (NSE) (뉴런), MeCP2 (메틸-CPG 결합 단백질 2) (뉴런), 아교세포 원섬유성 산성 단백질 (GFAP) (성상세포), 핍지교세포 전사 인자 1 (Olig1) (핍지교세포), CNP (2',3'-시클릭-뉴클레오티드 3'-포스포디에스테라제) (넓음), 또는 CBh (하이브리드 CBA 또는 CBA 프로모터를 갖는 MVM 인트론) (넓음)를 포함한 다수의 조직 특이적 프로모터가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, US20190032078을 참조한다. 대식세포/미세아교세포 프로모터는 C-X3-C 모티프 케모카인 수용체 1 (CX3CR1) 프로모터, CD68 프로모터, 이온화 칼슘 결합 어댑터 분자 1 (IBA1) 프로모터, 막횡단 단백질 119 (TMEM119) 프로모터, 스팔트 유사 전사 인자 1 (SALL1) 프로모터, 부착 G 단백질-커플링된 수용체 E1 (F4/80) 프로모터, 골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 음성 대조군 영역 결실된, d1587rev 프라이머-결합 부위 치환된 (MND) 프로모터; 인테그린 서브유닛 알파 M (ITGAM; CD11b- 골수 세포 (호중구, 단핵구, 및 대식세포)) 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 내이에서의 발현을 위해, 프로모터는, 예를 들어, PKG, CAG, 프레스틴, Atoh1, POU4F3, Lhx3, Myo6, α9AchR, α10AchR, 온코모드, 또는 myo7A 프로모터일 수 있으며; 문헌 [Ryan et al., Adv Otorhinolaryngol. 2009; 66: 99-115]을 참조한다.

리포터 단백질

다수의 리포터 단백질이 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 녹색 형광 단백질 (GFP), 녹색 형광 단백질의 변이체 (GFP10), 강화된 GFP (eGFP), TurboGFP, GFPS65T, TagGFP2, mUKGEmerald GFP, 슈퍼폴더 GFP, GFPuv, 불안정화 EGFP (dEGFP), 아자미 그린, mWasabi, Clover, mClover3, mNeonGreen, NowGFP, Sapphire, T-Sapphire, mAmetrine, 광활성화가능한 GFP (PA-GFP), Kaede, Kikume, mKikGR, tdEos, 덴드라2(Dendra2), mEosFP2, Dronpa, 청색 형광 단백질 (BFP), eBFP2, 아주라이트 BFP, mTagBFP, mKalamal, mTagBFP2, shBFP, 시안 형광 단백질 (CFP), eCFP, Cerulian CFP, SCFP3A, 불안정화 ECFP (dECFP), CyPet, mTurquoise, mTurquoise2, mTFPI, 광전환가능한 CFP2 (PS-CFP2), TagCFP, mTFP1, mMidoriishi-Cyan, 아쿠아마린, mKeima, mBeRFP, LSS-mKate2, LSS-mKatel, LSS-mOrange, CyOFP1, Sandercyanin, 적색 형광 단백질 (RFP), eRFP, mRaspberry, mRuby, mApple, mCardinal, mStable, mMaroonl, mGarnet2, tdTomato, mTangerine, mStrawberry, TagRFP, TagRFP657, TagRFP675, mKate2, HcRed, t-HcRed, HcRed-Tandem, mPlum, mNeptune, NirFP, Kindling, 원적외선 형광 단백질, 황색 형광 단백질 (YFP), eYFP, 불안정화 EYFP (dEYFP), TagYFP, Topaz, Venus, SYFP2, mCherry, PA-mCherry, Citrine, mCitrine, Ypet, IANRFP-AS83, mPapayal, mCyRFP1, mHoneydew, mBanana, mOrange, Kusabira Orange, Kusabira Orange 2, mKusabira Orange, mOrange 2, mKO_K, mKO2, mGrapel, mGrape2, zsYellow, eqFP611, Sirius, Sandercyanin, shBFP-N158S/L173I, 근적외선 단백질, iFP1.4, iRFP713, iRFP670, iRFP682, iRFP702, iRFP720, iFP2.0, mIFP, TDsmURFP, miRFP670, 브릴리언트 바이올렛(Brilliant Violet) (BV) 421, BV 605, BV 510, BV 711, BV786, PerCP, PerCP/Cy5.5, DsRed, DsRed2, mRFPl, 포실로포린, 레닐라(Renilla) GFP, 몬스터(Monster) GFP, paGFP, 또는 피코빌리단백질, 또는 이들의 임의의 하나의 생물학적 활성 변이체 또는 단편을 포함한다.

키트

또한, 랜덤 칠량체 서열을 갖는 또는 갖지 않는 본원에 기재된 바와 같은 1종 이상의 라이브러리 구축물 AAV를 포함하는 키트가 본원에서 제공된다. 키트는 또한 리포터 서열의 상류의 loxP-플랭킹된 STOP 카세트를 포함하는 구축물을 포함할 수 있다.

조작된 AAV 캡시드 단백질

본 방법은 AAV, 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV8, 또는 AAV9의 캡시드 내로 삽입되는 경우 특정된 세포에서 트랜스진 발현을 매개하는 AAV의 능력을 변경시키는 2가지 펩티드 서열을 확인하였다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 적어도 7개의 아미노산의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열 (STTLYSP (서열식별번호: 1) 또는 FVVGQSY (서열식별번호: 2)의 적어도 4개, 예를 들어, 5, 6, 또는 7개의 인접한 아미노산을 포함한다.

역위 서열을 포함하는 펩티드, 예를 들어, PSYLTTS (서열식별번호: 4) 및 YSQGVVF (서열식별번호: 5)가 또한 사용될 수 있다. 대안적으로, 펩티드는 도 2a 또는 7c에 나타내어진 서열 (서열식별번호: 17-150)로부터의 적어도 4, 5, 또는 6개의 인접한 아미노산을 포함할 수 있다.

AAV

본 방법에 사용하기 위한 바이러스 벡터, 키트 및 조성물은 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같은 캡시드 펩티드 및 임의로 표적 조직에서의 발현을 위한 트랜스진을 포함하는 재조합 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 알파바이러스, 및 렌티바이러스를 포함한다.

본 방법에서 핵산의 전달에 유용한 바람직한 바이러스 벡터 시스템은 아데노-연관 바이러스 (AAV)이다. AAV는 25 nm 캡시드를 갖는 아주 작은 비-외피화된 바이러스이다. 어떤 질환도 야생형 바이러스와 연관되는 것으로 공지되어 있지 않거나 나타나지 않았다. AAV는 단일-가닥 DNA (ssDNA) 게놈을 갖는다. AAV는 장기 에피솜 트랜스진 발현을 나타내는 것으로 나타났으며, AAV는 뇌에서, 특히 뉴런에서 우수한 트랜스진 발현을 입증하였다. 외인성 DNA를 위한 공간은 약 4.7 kb로 제한된다. 문헌 [Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985)]에 기재된 것과 같은 AAV 벡터는 세포 내로 DNA를 도입하는데 사용될 수 있다. 다양한 핵산은 AAV 벡터를 사용하여 상이한 세포 유형 내로 도입되었다 (예를 들어 문헌 [Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470 (1984)]; [Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1985)]; [Wondisford et al., Mol. Endocrinol. 2:32-39 (1988)]; [Tratschin et al., J. Virol. 51:611-619 (1984)];및 [Flotte et al., J. Biol. Chem. 268:3781-3790 (1993)] 참조). 다수의 대안적인 AAV 변이체가 있으며 (100개 초과가 클로닝되었음), AAV 변이체는 목적하는 특징에 기반하여 확인되었다. 일부 실시양태에서, AAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AV6.2, AAV7, AAV8, rh.8, AAV9, rh.10, rh.39, rh.43 또는 CSp3이며; CNS 용도를 위해, 일부 실시양태에서 AAV는 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, 또는 AAV9이다. 한 예로서, AAV9는 혈액-뇌 장벽을 다소 효율적으로 가로지르는 것으로 나타났다. 본 방법을 사용하여, AAV 캡시드는 캡시드 단백질 내로의, 예를 들어 아미노산 588 및 589 사이의 AAV9 캡시드 단백질 VP1 내로의 본원에 기재된 바와 같은 펩티드 서열의 삽입에 의해, BBB를 가로지르는, 또는 특이적 조직 내로의 침투를 증가시키도록 유전자 조작될 수 있다.

예시적인 야생형 AAV9 캡시드 단백질 VP1 (Q6JC40-1) 서열은 하기와 같다:

따라서, 본원에 기재된 펩티드 서열 중 1종 이상을 포함하는 AAV, 예를 들어, 본원에 기재된 서열을 포함하는 캡시드 단백질, 예를 들어, 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2를 포함하는 캡시드 단백질을 포함하는 AAV가 본원에서 제공되고, 여기서 펩티드 서열은, 예를 들어, 아미노산 588 및 589 사이의 서열 내로 삽입되었다.

AAV의 예시적인 서열은 하기 제공된다. 삽입된 펩티드 서열은 단백질 서열에서 볼드체 및 이중-밑줄쳐 강조되고, DNA 서열에서 볼드체 및 대문자화된다.

AAV 서열은 본원에 제시된 참조 AAV 서열에 대해, 예를 들어, 적어도 80, 85, 90, 95, 97, 또는 99% 동일할 수 있으며, 예를 들어, 세포에서 트랜스진 발현을 매개하는 AAV의 능력을 감소시키지 않는 바람직한 변이체를 포함할 수 있다. 2개의 아미노산 서열의, 또는 2개의 핵산 서열의 퍼센트 동일성을 결정하기 위해, 서열은 최적 비교 목적을 위해 정렬된다 (예를 들어, 최적 정렬을 위해 제1 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 다에 갭이 도입될 수 있고, 비-상동성 서열은 비교 목적을 위해 무시될 수 있다). 바람직한 실시양태에서, 비교 목적을 위해 정렬되는 참조 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 적어도 80%이고, 일부 실시양태에서 적어도 90% 또는 100%이다. 이어서 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 비교된다. 제1 서열에서의 위치가 제2 서열에서의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유되는 경우, 분자는 그 위치에서 동일하다 (본원에 사용된 아미노산 또는 핵산 "동일성"은 아미노산 또는 핵산 "상동성"과 등가이다). 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수, 및 각각의 갭의 길이를 고려하여, 서열에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 함수이다.

서열의 비교 및 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 디폴트 파라미터, 예를 들어, 12의 갭 페널티, 4의 갭 연장 페널티, 및 5의 격자이동 갭 페널티를 갖는 블로섬(Blossum) 62 점수화 매트릭스를 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지 (월드 와이드 웹 상에서 gcg.com에서 입수가능함)에서의 GAP 프로그램 내로 포함된 니들만 및 운쉬(Needleman and Wunsch) ((1970) J. Mol. Biol. 48:444-453) 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.

트랜스진

일부 실시양태에서, AAV는 또한 트랜스진 서열 (즉, 이종 서열), 예를 들어, 예컨대, 본원에 기재된 바와 같은 또는 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 치료제, 또는 리포터 단백질, 예를 들어, 형광 단백질, 검출가능한 생성물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소, 또는 세포 표면 항원을 코딩하는 트랜스진을 포함한다. 트랜스진은 바람직하게는 표적 조직에서의 트랜스진의 발현을 촉진시키는/구동하는 서열에 연결된다.

치료제로서 사용하기 위한 예시적인 트랜스진은 뉴런 세포자멸사 억제성 단백질 (NAIP), 신경 성장 인자 (NGF), 아교세포-유래 성장 인자 (GDNF), 뇌-유래 성장 인자 (BDNF), 섬모 신경영양 인자 (CNTF), 티로신 히드록실라제 (TH), GTP-시클로히드롤라제 (GTPCH), 아미노산 데카르복실라제 (AADC), 아스파르토아실라제 (ASPA), 혈액 인자, 예컨대 β-글로빈, 헤모글로빈, 조직 플라스미노겐 활성화제, 및 응고 인자; 콜로니 자극 인자 (CSF); 인터류킨, 예컨대 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 등; 성장 인자, 예컨대 각질세포 성장 인자 (KGF), 줄기 세포 인자 (SCF), 섬유모세포 성장 인자 (FGF, 예컨대 염기성 FGF 및 산성 FGF), 간세포 성장 인자 (HGF), 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 골 형태형성 단백질 (BMP), 표피 성장 인자 (EGF), 성장 분화 인자-9 (GDF-9), 간암 유래 성장 인자 (HDGF), 미오스타틴 (GDF-8), 신경 성장 인자 (NGF), 뉴로트로핀, 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 트롬보포이에틴 (TPO), 전환 성장 인자 알파 (TGF-α), 전환 성장 인자 베타 (TGF-β) 등; 가용성 수용체, 예컨대 가용성 TNF-α 수용체, 가용성 VEGF 수용체, 가용성 인터류킨 수용체 (예를 들어, 가용성 IL-1 수용체 및 가용성 유형 II IL-1 수용체), 가용성 감마/델타 T 세포 수용체, 가용성 수용체의 리간드-결합 단편 등; 효소, 예컨대 α-글루코시다제, 이미글루카라제, 및 β-글루코세레브로시다제; 효소 활성화제, 예컨대 조직 플라스미노겐 활성화제; 케모카인, 예컨대 IP-10, 인터페론-감마에 의해 유도된 모노카인 (Mig), Groa/IL-8, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, MCP-1, PF-4 등; 혈관신생제, 예컨대 혈관 내피 성장 인자 (VEGF, 예를 들어, VEGF121, VEGF165, VEGF-C, VEGF-2), 전환 성장 인자-베타, 염기성 섬유모세포 성장 인자, 신경아교종-유래 성장 인자, 안지오게닌, 안지오게닌-2 등; 항-혈관신생제, 예컨대 가용성 VEGF 수용체; 단백질 백신; 신경활성 펩티드, 예컨대 신경 성장 인자 (NGF), 브라디키닌, 콜레시스토키닌, 가스틴, 세크레틴, 옥시토신, 고나도트로핀-방출 호르몬, 베타-엔도르핀, 엔케팔린, 물질 P, 소마토스타틴, 프로락틴, 갈라닌, 성장 호르몬-방출 호르몬, 봄베신, 디노르핀, 와르파린, 뉴로텐신, 모틸린, 티로트로핀, 신경펩티드 Y, 황체형성 호르몬, 칼시토닌, 인슐린, 글루카곤, 바소프레신, 안지오텐신 II, 티로트로핀-방출 호르몬, 혈관활성 장 펩티드, 수면 펩티드 등; 혈전용해제; 심방 나트륨이뇨 펩티드; 렐락신; 아교세포 원섬유성 산성 단백질; 난포 자극 호르몬 (FSH); 인간 알파-1 안티트립신; 백혈병 억제 인자 (LIF); 전환 성장 인자 (TGF); 조직 인자, 황체형성 호르몬; 대식세포 활성화 인자; 종양 괴사 인자 (TNF); 호중구 화학주성 인자 (NCF); 신경 성장 인자; 메탈로프로테이나제의 조직 억제제; 혈관활성 장 펩티드; 안지오게닌; 안지오트로핀; 피브린; 히루딘; IL-1 수용체 길항제 등을 포함한다. 관심의 단백질의 일부 다른 예는 섬모 신경영양 인자 (CNTF); 뉴로트로핀 3 및 4/5 (NT-3 및 4/5); 아교 세포 유래 신경영양 인자 (GDNF); 방향족 아미노산 데카르복실라제 (AADC); 혈우병 관련 응고 단백질, 예컨대 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X; 디스트로핀 또는 미니-디스트로핀; 리소좀 산 리파제; 페닐알라닌 히드록실라제 (PAH); 글리코겐 저장 질환-관련 효소, 예컨대 글루코스-6-포스파타제, 산 말타제, 글리코겐 탈분지 효소, 근육 글리코겐 포스포릴라제, 간 글리코겐 포스포릴라제, 근육 포스포프룩토키나제, 포스포릴라제 키나제 (예를 들어, PHKA2), 글루코스 수송제 (예를 들어, GLUT2), 알돌라제 A, β-에놀라제, 및 글리코겐 신타제; 리소좀 효소 (예를 들어, 베타-N-아세틸헥소스아미니다제 A); 및 이들의 임의의 변이체를 포함한다.

트랜스진은 또한 항체, 예를 들어, 예컨대, PD-L1, PD-1, CTLA-4 (세포독성 T-림프구-연관 단백질-4; CD152); LAG-3 (림프구 활성화 유전자 3; CD223); TIM-3 (T-세포 이뮤노글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3; HAVCR2); TIGIT (Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T-세포 면역수용체); B7-H3 (CD276); VSIR (V-세트 면역조절 수용체, 일명 VISTA, B7H5, C10orf54); BTLA 30 (B- 및 T-림프구 감쇠제, CD272); GARP (당단백질 A 반복 우성); PVRIG (PVR 관련 이뮤노글로불린 도메인 함유); 또는 VTCN1 (V-세트 도메인 함유 T 세포 활성화 억제제 1, 일명 B7-H4)에 대한 면역 체크포인트 억제성 항체를 코딩할 수 있다.

다른 트랜스진은 표적 유전자의 발현을 변경시키는/감소시키는 작은 또는 억제성 핵산, 예를 들어, siRNA, shRNA, miRNA, 안티센스 올리고, 또는 유전자 발현을 변경시키는 긴 비-코딩 RNA (예를 들어, WO2012087983 및 US20140142160 참조), 또는 CRISPR Cas9/cas12a 및 가이드 RNA를 포함할 수 있다.

바이러스는 또한 트랜스진의 발현을 촉진시키는 1종 이상의 서열, 예를 들어 1종 이상의 프로모터 서열; 인핸서 서열, 예를 들어 5' 비번역 영역 (UTR) 또는 3' UTR; 폴리아데닐화 부위; 및/또는 인슐레이터 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 뇌 조직 특이적 프로모터, 예를 들어 뉴런-특이적 또는 아교세포-특이적 프로모터이다. 특정 실시양태에서, 프로모터는 뉴런 핵 (NeuN), 아교세포 원섬유성 산성 단백질 (GFAP), MeCP2, 선종성 결장 폴립증 (APC), 이온화 칼슘-결합 어댑터 분자 1 (Iba-1), 시냅신 I (SYN), 칼슘/칼모둘린-의존성 단백질 키나제 II, 튜불린 알파 I, 뉴런-특이적 에놀라제 및 혈소판-유래 성장 인자 베타 쇄로부터 선택된 유전자의 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 범-세포 유형 프로모터, 예를 들어, 시토메갈로바이러스 (CMV), 베타 글루쿠로니다제, (GUSB), 유비퀴틴 C (UBC), 또는 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터이다. 마멋 간염 바이러스 전사후 반응 요소 (WPRE)는 또한 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, AAV는 또한 표적 조직, 예를 들어, CNS에의 전달을 증가시키거나, 오프-조직 표적화를 감소시키는 1개 이상의 추가의 돌연변이, 예를 들어, CNS, 심장, 또는 근육 전달이 의도되는 경우 간 전달을 감소시키는 돌연변이 (예를 들어, 문헌 [Pulicherla et al. (2011) Mol Ther 19:1070-1078)]에 기재된 바와 같음); 또는 예를 들어, 문헌 [Chen et al. (2008) Nat Med 15:1215-1218] 또는 [Xu et al., (2005) Virology 341:203-214] 또는 US9102949; US 9585971; 및 US20170166926에 기재된 바와 같이 다른 펩티드의 첨가를 갖는다. 또한 sfn.org/~/media/SfN/Documents/Short%20Courses/ 2011%20Short%20Course%20I/2011_SC1_Gray.ashx에서 입수가능한 문헌 [Gray and Samulski (2011) "Vector design and considerations for CNS applications," in Gene Vector Design and Application to Treat Nervous System Disorders ed. Glorioso J., editor. (Washington, DC: Society for Neuroscience;) 1-9]을 참조한다.

사용 방법

본원에 기재된 방법 및 조성물은 임의의 조성물, 예를 들어, 관심의 서열을 조직에, 예를 들어, 중추 신경계 (뇌), 심장, 근육, 말초 신경계 (예를 들어, 후근 신경절 또는 척수)에, 또는 내이 또는 망막에 전달하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 특이적 뇌 영역, 예를 들어, 피질, 소뇌, 해마, 흑색질, 편도에의 전달을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은, 예를 들어, 지주막하 공간 또는 경막외 공간 내로의 요추 전달을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 뉴런, 성상세포, 또는 아교 세포에의 전달을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 내부 및/또는 외부 유모 세포, 나선 신경절 뉴런, 지지 세포, 또는 내이의 섬유세포에의 전달을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 망막의 광수용체, 개재뉴런, 망막 신경절 세포 (예를 들어, AAV-F를 사용함), 또는 망막 색소 상피 (RPE) (예를 들어, AAV-S를 사용함)에의 전달을 포함한다.

일부 실시양태에서, 방법 및 조성물, 예를 들어, AAV는 핵산 서열을 질환, 예를 들어, CNS의 질환을 갖는 대상체에 전달하는데 사용되며; 예를 들어, US9102949; US 9585971; 및 US20170166926을 참조한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 표 1-3에 열거된 상태를 가지며; 일부 실시양태에서, 벡터는 표 1-3에 열거된 상응하는 질환을 치료하기 위해 표 1-3에 열거된 치료제를 전달하는데 사용된다. 치료제는 예를 들어 바이러스 벡터를 통해 핵산으로서 (여기서 핵산은 치료 단백질을 코딩하는 핵산 또는 다른 핵산, 예컨대 안티센스 올리고, siRNA, shRNA 등임); 또는 본원에 기재된 바와 같은 펩티드와의 융합 단백질/복합체로서 전달될 수 있다.

본원에 기재된 방법 및 조성물은 상태의 1종 이상의 증상을 개선시키거나, 그의 위험을 감소시키거나, 그의 발병을 지연시키는데 충분한 치료 트랜스진을 운반하는 AAV의 치료 유효량의 투여에 의해, 이를 필요로 하는 대상체에서 이들 상태를 치료하는데 사용될 수 있다.

표 1. CNS 표적 (AAV-F, AAV-S)

표 2. 내이 표적 (AAV-S)

*어셔 증후군은 상기와 같은 둘 다의 난청, 및 색소성 망막염을 통한 실명을 초래한다.

표 3. 말초 표적 (AAV-F, AAV-S)

제약 조성물 및 투여 방법

본원에 기재된 방법은 활성 성분으로서 AAV를 포함하는 제약 조성물의 사용을 포함한다.

제약 조성물은 전형적으로 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 본원어 사용된 언어 "제약상 허용되는 담체"는 제약 투여와 상용성인 염수, 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다.

제약 조성물은 전형적으로 그의 의도된 투여 경로와 상용성이도록 제제화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어, 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내, 경막내, 근육내, 또는 주사 또는 주입 투여를 포함한다. 따라서, 전달은 전신 또는 국소화될 수 있다. 예를 들어, 내이 내로의 전달을 위해, 정원창 막 위로의 또는 그를 통한 적용을 통한, 정원창, 골성 난원창에서의 창, 또는 반고리관에 인접한 외과적으로 천공된 와우개창술을 통한 와우 내로의 전달이 사용될 수 있고 (예를 들어, 문헌 [Kim et al., Mol Ther Methods Clin Dev. 2019 Jan 11;13:197-204]; [Ren et al., Front Cell Neurosci. 2019; 13: 323] 참조); 망막 내로의 전달을 위해, 망막하 또는 유리체내 주사가 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ochakovski et al., Front Neurosci. 2017; 11: 174]; [Xue et al., Eye (Lond). 2017 Sep;31(9):1308-1316] 참조).

적합한 제약 조성물을 제제화하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed., 2005]; 및 [the books in the series Drugs and the Pharmaceutical Sciences: a Series of Textbooks and Monographs (Dekker, NY)]을 참조한다. 예를 들어, 비경구 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기 성분을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 염수 용액, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항박테리아제, 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이트화제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 긴장성의 조정을 위한 작용제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 수산화나트륨으로 조정될 수 있다. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰풀, 일회용 시린지 또는 다중 용량 바이알에 동봉될 수 있다.

주사가능한 용도에 적합한 제약 조성물은 멸균 수용액 (수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함할 수 있다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리 염수, 정균수, 크레모포르(Cremophor) EL™ (바스프(BASF), 미국 뉴저지주 파시파니) 또는 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 포함한다. 모든 경우, 조성물은 멸균성이어야 하며, 용이한 시린지성이 존재하는 정도로 유체이어야 한다. 이는 제조 및 저장의 조건 하에서 안정해야 하며, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입도의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물이 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우, 등장화제, 예를 들어, 당, 다가알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 유발될 수 있다.

멸균 주사가능한 용액은 필요에 따라 상기 열거된 성분 중 하나 또는 그의 조합으로 적절한 용매에서 필요한 양으로 활성 화합물을 혼입시키고, 이어서 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 활성 화합물을 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 더하기 임의의 추가의 목적하는 성분의 분말을 그의 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 생성하는 진공 건조 및 동결-건조이다.

한 실시양태에서, 치료 화합물은 치료 화합물을 신체로부터의 급속한 제거에 대해 보호할 담체, 예컨대 삽입물 및 미세캡슐화 전달 시스템을 포함한 제어 방출 제제로 제조된다. 생체분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 다가무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제제는 표준 기술을 사용하여 제조되거나, 상업적으로, 예를 들어, 알자 코포레이션(Alza Corporation) 및 노바 파마슈티칼스, 인크.(Nova Pharmaceuticals, Inc.)로부터 얻어질 수 있다. 리포솜 현탁액 (세포 항원에 대한 모노클로날 항체를 갖는 선택된 세포에 표적화된 리포솜을 포함함)은 또한 제약상 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이들은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 따라, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,522,811에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.

제약 조성물은 투여를 위한 지시서와 함께 키트, 용기, 팩, 또는 디스펜서에 포함될 수 있다. 예를 들어, 키트는 본원에 기재된 바와 같은 펩티드를 포함하는 AAV를 포함하는 조성물을 포함할 수 있다.

실시예

본 발명은 청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않는 하기 실시예에 추가로 기재된다.

물질 및 방법

달리 언급되지 않는 한, 하기 물질 및 방법이 하기 실시예에 사용되었다.

AAV 라이브러리 구축.

i트랜스듀스 플라스미드: pAAV-CBA-Cre- ^mut -p41-Cap9del

본 발명자들은 2개의 발현 카세트를 시스로 함유하는 pAAV-CBA-Cre^mut-p41-Cap9del로 지칭되는 i트랜스듀스 라이브러리 백본 플라스미드를 구축하였다: 1) 본 발명자들이 편재적 프로모터 CBA 하에서 돌연변이체 Cre cDNA (초기에 존재하는 AgeI 부위를 제거하는 Pro15 아미노산을 코딩하는 CCG ->CCT)를 도입한 CBA-Cre^mut, 2) AAV5 p41 프로모터 (진뱅크(GenBank) AF085716.1의 잔기 1680-1974) 하에서 AAV9 캡시드 유전자 및 AAV2 rep 유전자의 스플라이싱 서열 (¹²에 기재된 것과 유사함)로 구성된 p41-Cap9del.

KpnI 및 SalI 제한 부위에 의해 플랭킹된 돌연변이체 Cre cDNA (Cre^mut) 및 p41-CAP9(del)-폴리A 단편 둘 다를 진스크립트(GenScript)에 의해 합성하고, puC57 백본 내로 클로닝하였다. 본 발명자들은 먼저 본 발명자들의 pAAV-CBA-WPRE 백본에서의 eGFP-WPRE 대신 돌연변이체 Cre cDNA (단편 KpnI-블런트, SalI) (초기에 존재하는 eGFP-WPRE 단편을 제거한 NcoI-블런트/SalI로 개방됨)를 서브클로닝함으로써 pAAV-CBA-Cre^mut-폴리A 플라스미드를 구축하였다. 이어서 본 발명자들은 고유한 XbaI 부위의 생성을 허용하는 Cap9 서열에서의 K449R 돌연변이를 함유하고, XbaI 및 AgeI 제한 부위 사이의 447 bp Cap 서열이 결실된 p41-Cap9del 단편을 도입하였다.

랜덤 7-mer 펩티드 cap 단편을 생성하고 PCR에 의해 회수된 CAP9 단편을 서브클로닝하기 위한 플라스미드: pUC57-Cap9-XbaI/KpnI/AgeI.

본 발명자들은 먼저 진스크립트 (미국 뉴저지주 피스캐터웨이)에 의해 합성되고 pUC57-Kan 플라스미드 내로 서브클로닝된 XbaI/AgeI 부위 사이에 AAV9 캡시드 서열의 447 bp 영역 (pAAV-CBA-Cre^mut-p41-Cap9del에서 소실되는 서열)을 가졌다. 이 캡시드 서열은 문헌 [Deverman et al. 2015]에 의해 기재된 바와 같이 WT AAV9의 제한 소화 제거를 허용하는 이 447 bp 영역 WT AAV9 cap에서의 EarI 부위의 동일한 제거를 함유한다. 이는 또한 고유한 KpnI 부위를 생성한다. pUC57-Cap9-XbaI/KpnI/AgeI의 cap 단편을 사용하여 AAV9 VP1의 아미노산 588 및 589를 코딩하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된 랜덤 21-mer 뉴클레오티드 서열 (7-mer 펩티드를 코딩함)의 초기 라이브러리를 생성하였다. 본 발명자들은 문헌 [Deverman et al. (2015)]의 그것과 유사한 전략을 사용하였다. 간략하게, pUC57-Cap9-XbaI/KpnI/AgeI은 cap DNA를 증폭시키고 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 랜덤 21-mer 서열을 삽입하는 주형으로서 역할을 하였다. 프라이머 정보: XF-연장 (5'GTACTATCTCTCTAGAACtattaacggttc3'; 서열식별번호: 11) 및 역방향 프라이머 588iRev 5' (GTATTCCTTGGTTTTGAACCCAACCGGTCTGCGCCTGTGCXMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNTTGGGCACTCTGGTGGTTTGTG 3'; 서열식별번호: 12) (여기서 MNN 반복부는 랜덤화 21-mer 뉴클레오티드를 지칭함) (IDT로부터 구입됨). XF-연장 및 588iRev를 퓨전(Phusion) 폴리머라제 (NEB)로 PCR에 및 주형으로서 pUC57-Cap9-XbaI/KpnI/AgeI을 사용하였다. 447 bp PCR 생성물을 XbaI 및 AgeI로 37℃에서 밤새 소화시키고, 이어서 생성물을 겔 정제하였다 (퀴아젠(Qiagen)). 유사하게, pAAV-CBA-Cre- ^mut -p41-Cap9del을 XbaI 및 AgeI로 소화시키고, 겔 정제하였다. 다음으로, T4 DNA 리가제 (NEB)로의 라이게이션 반응 (실온에서 1시간)을 3:1 cap 삽입물 대 벡터 몰비로 사용하여 수행하였다. 후속 라이게이션된 플라스미드는 pAAV-CBA-Cre- ^mut -p41-Cap9-7mer로 지칭되었으며, AAV9 VP1의 588 및 589를 코딩하는 뉴클레오티드 사이의 cap 유전자에 삽입된 랜덤 7-mer 펩티드를 갖는 플라스미드의 풀을 함유하였다.

이 플라스미드 (pUC57-Cap9-XbaI/KpnI/AgeI)를 또한 뇌 조직으로부터 PCR에 의해 증폭된 CAP9 단편을 서브클로닝하기 위한 본 발명자들의 수용자 플라스미드로서 사용하였다. 본 발명자들은 SacI 및 NsiI로의 소화 및 라이게이션에 의해 pUC57 플라스미드에서 상류 KpnI 부위를 제거하였다. 이는 캡시드 단편에서의 KpnI 부위가 고유한 것을 허용하였다. 하기를 참조한다.

Rep 발현 플라스미드.

본 발명자들은 문헌 [Deverman et al.]¹²에서의 것과 유사한 전략을 사용하여 pAR9-Cap9-stop/AAP/Rep로 지칭되는 rep 발현 플라스미드를 구축하였다. 전체 cDNA를 진스크립트에 의해 합성하고, pUC57-Kan 플라스미드 내로 클로닝하였다. AAP 및 rep 발현을 유지하면서, 모 AAV9 캡시드가 제조되지 않도록 VP1, VP2, VP3에 대한 시작 코돈 대신 정지 코돈을 삽입하였다.

AAV 라이브러리 제조 및 정제.

각각의 제조를 위해, 본 발명자들은 15-cm 조직 배양 디쉬를 1.5x10⁷개 293T 세포/디쉬로 플레이팅하였다. 다음 날, 세포를 인산칼슘 방법을 사용하여 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드 (pAdΔF6, 플레이트당 26 μg), rep 플라스미드 (pAR9-Cap9-stop/AAP/Rep, 플레이트당 12 μg) 및 ITR-플랭킹된 AAV 라이브러리 (pAAV-CBA-Cre-mut/p41-Cap9-7mer, 플레이트당 1 μg)로 형질감염시켜 AAV의 제조를 유도하였다. 형질감염 다음 날에, 배지를 2% FBS를 함유하는 DMEM으로 교체하였다. AAV를 아이오딕산올 밀도-구배 초원심분리를 사용하여 세포 용해물로부터 정제하였다. PBS로의 완충제 교환을 ZEBA 스핀 칼럼 (7K MWCO; 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))을 사용하여 수행하고, 추가의 농축을 아미콘 울트라(Amicon Ultra) 100kDa MWCO 한외여과 원심분리 장치 (밀리포어(Millipore))를 사용하여 수행하였다. 벡터를 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 본 발명자들은 AAV 제제 중의 AAV 게놈 카피 (vg)를 택맨(TaqMan) qPCR을 사용하여 ITR-서열 특이적 프라이머 및 프로브로 정량화하였다^{20, 21}.

라이브러리의 차세대 시퀀싱.

차세대 시퀀싱을 플라스미드 AAV9 라이브러리 풀에 대해, 뿐만 아니라 캡시드의 패키징 후에 수행하였다. 시퀀싱을 또한 cap 단편 (유동 세포계측법에 의해 분류된 뇌 조직으로부터의 또는 단리된 tdTomato-양성 세포로부터의)의 PCR 회수 후에 수행하였다. 선택의 각각의 라운드를 위해, 삽입물-함유 영역에 상응하는 바이러스 DNA를 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)로부터의 퓨전 고-충실도 PCR 키트를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다 (정방향 프라이머: 5'-AATCCTGGACCTGCTATGGC-3' (서열식별번호: 13), 역방향 프라이머: 5'-TGCCAAACCATACCCGGAAG-3' (서열식별번호: 14)). PCR 증폭을 Q5 폴리머라제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 사용하여 수행하였다. 고유한 바코드 어댑터를 각각의 샘플에 어닐링하고, 샘플을 일루미나 마이섹(Illumina Miseq) (150bp 판독물) 상에서 시퀀싱하였다. 샘플당 대략 50-100,000개의 판독물을 분석하였다. 서열 출력 파일을 초기에 패스트QC(FastQC) (bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)를 사용하여 품질-체크하고, 파이톤(Python)에서 사용자-작성된 프로그램 상에서 분석하였다. 간략하게, 서열을 삽입물의 존재 또는 부재에 기반하여 비닝하고; 이어서 삽입물-함유 서열을 기준선 참조 서열과 비교하고, 오류-무함유 판독물을 각각의 검출된 고유한 삽입물의 발생에 기반하여 표화하였다. 삽입물을 번역하고 정규화하였다.

동물.

모든 동물 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 국립 보건원 지침에 의해 제시된 가이드라인에 따라 연구 동물 관리에 대한 매사추세츠 종합 병원 소위원회에 의해 승인되었다. 본 발명자들은 모두 미국 메인주 바 하버 소재 더 잭슨 래버러토리(The Jackson Laboratory)로부터의 성체 연령 (8-10주령) Ai9 (주 # 007909), C57BL/6 (주 # 000664), 및 BALB/c (주 # 000651) 마우스를 사용하였다. 모든 동물을 주사 후 3주에 안락사시키고, 경심 관류시키고, 조직을 수확하고, PBS 중 4% 포름알데히드에서 고정시키거나, 액체 질소에서 순간 동결시키거나, 유동 세포계측법을 위해 분리하였다.

뇌-향성 캡시드의 생체내 선택.

Ai9 마우스를 결과 섹션에서 지시된 vg으로의 용량으로 정맥내로 (꼬리 정맥) 주사하고, 주사 후 3주에, 마우스를 안락사시키고, 조직을 수확하였다.

마우스를 이소플루란에 의해 깊게 마취시키고, 참수시켰다. 라운드 1을 위해, 뇌를 빠르게 해부하고, 2개의 관상 섹션 (2 mm 두께)을 수확하였다. 한 섹션은 전체 뇌 DNA를 추출하는데 사용하였다 (DN이지 혈액 및 조직 키트, 퀴아젠, 독일 힐덴). 다른 관상 섹션은 면역조직학을 위해 4% PFA에서 고정시키고, 파라핀 포매하였다 (tdtomato-양성 세포를 로크랜드 이뮤노케미칼스(Rockland Immunochemicals)로부터의 토끼 항-RFP 항체를 사용하여 DAB 염색에 의해 선택의 각각의 라운드 후에 검출하였다). 라운드 2를 위해, 뇌 조직을 이어서 레이저 블레이드로 1 mm3 조각으로 커팅하고, 신경 세포를 파파인 분리 (파파인 디소시에이션 시스템(Papain Dissociation System), 워딩턴)에 의해 제조업체의 지시서에 따라 단리하였다. 분리 후, 미엘린을 제거하고 (밀테니(Miltenyi)로부터의 미엘린 제거 비드 II, 인간, 마우스, 래트), Td-토마토 양성 세포를 S3eTM 세포 분류기 (바이오-래드(Bio-Rad))에 의해 분류하였다. 세포를 제1 설정 게이트에 의해 분류하여 세포외 데브리스를 제외하고 단지 싱글렛에 대해 선택하였다. AAV9-PHP.B-Cre 주사된 Ai9 (양성 대조군) 및 PBS 주사된 Ai9 마우스 (음성 대조군)로부터의 세포 현탁액을 사용하여 게이트를 설정하여 tdTomato-양성 및 음성 세포를 분류하였다. 분류 후, tdTomato-양성 세포를 원심분리에 의해 즉시 펠릿화하고, DNA를 아크투러스 피코퓨어(ARCTURUS PicoPure) DNA 추출 키트 (써모피셔)를 사용하여 추출하였다.

DNA 추출 후, Cap9 삽입물 (7mer 펩티드를 코딩하는 21-mer 서열을 함유함)을 하기 프라이머를 사용하여 증폭시켰다: Cap9_Kpn/Age_For: 5'-AGCTACCGACAACAACGTGT-3' (서열식별번호: 15) 및 Cap9_ Kpn/Age_Rev: 5'- AGAAGGGTGAAAGTTGCCGT-3' (서열식별번호: 16) (퓨전 고-충실도 PCR 키트, 뉴 잉글랜드 바이오랩스). 이어서 앰플리콘을 정제하고 (모나크(Monarch) PCR & DNA 클린업 키트, 뉴 잉글랜드 바이오랩스), KpnI, AgeI 및 BanII에 의해 소화시키고, Cap9 KpnI-AgeI 단편 (144 bp)을 아가로스 겔 정제한 후 (모나크 DNA 겔 추출 키트, 뉴 잉글랜드 바이오랩스), pUC57-Cap9-XbaI/AgeI/KpnI 플라스미드에서 라이게이션하였다 (KpnI 및 AgeI로 개방되고, 송아지 이노시톨 포스파타제, 뉴 잉글랜드 바이오랩스로 탈인산화됨). 라이게이션 생성물을 전기적격 DH5알파 박테리아 (뉴 잉글랜드 바이오랩스) 내로 형질전환시키고, 전체 형질전환물을 LB-암피실린 배지에서 밤새 성장시켰다. pUC57-Cap9-XbaI/AgeI/KpnI 플라스미드를 맥시 프렙 (퀴아젠)에 의해 정제하였다. 플라스미드를 XbaI/AgeI에 의해 소화시켜 447 bp cap 단편을 방출시키고, 이를 AAV 라이브러리 제조의 다음 라운드를 위해 겔 정제하고, 유사하게 커팅된 pAAV-CBA-Cre-mut/p41-Cap9del로 라이게이션하였다.

벡터 제조를 위한 AAV-F 및 AAV-S 펩티드 삽입물을 함유하는 AAV rep/cap 플라스미드.

관심의 트랜스진 (예를 들어 GFP)을 코딩하는 벡터의 제조를 위한 관심의 펩티드 삽입물을 제시하는 AAV9 캡시드를 코딩하는 rep/cap 플라스미드를 생성하기 위해, 본 발명자들은 AAV9 rep/cap 플라스미드를 펩티드 서열 삽입을 위한 VP3 아미노산 588 부위에 플랭킹된 단편을 제거하는 BsiWI 및 BaeI로 소화시켰다. 다음으로, 본 발명자들은 인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies) (IDT, 미국 아이오와주 코랄빌)로부터 BsiWI/BaeI 커팅된 AAV9를 갖는 중첩하는 깁슨(Gibson) 상동성 아암 뿐만 아니라 VP3의 아미노산 588 뒤에 프레임 내에서 관심의 펩티드를 코딩하는 21-mer 뉴클레오티드 서열을 함유하는 997 bp dsDNA 단편을 주문하였다. 마지막으로, 본 발명자들은 깁슨 어셈블리(Gibson Assembly)® 마스터 믹스(Master Mix) (NEB, 미국 매사추세츠주 입스위치)를 사용하여 깁슨 어셈블리를 수행하여 삽입물을 함유하는 펩티드를 AAV9 rep/cap 플라스미드 내로 라이게이션하였다.

형질도입 분석을 위한 AAV 벡터.

각각의 제조를 위해, 본 발명자들은 15-cm 조직 배양 디쉬를 1.5x10⁷개 293T 세포/디쉬로 플레이팅하였다. 다음 날, 세포를 인산칼슘 방법을 사용하여 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드 (pAdΔF6, 플레이트당 26 μg), rep/cap 플라스미드 (AAV9, AAV-F, AAV-S; 플레이트당 12 μg) 및 ITR-플랭킹된 트랜스진 카세트 플라스미드 (단일-가닥 AAV-CBA-GFP-WPRE²², 10 μg/플레이트)로 형질감염시켜 AAV의 제조를 유도하였다. 형질감염 다음 날에, 배지를 2% FBS를 함유하는 DMEM으로 교체하였다. AAV를 아이오딕산올 밀도-구배 초원심분리를 사용하여 세포 용해물로부터 정제하였다. PBS로의 완충제 교환을 ZEBA 스핀 칼럼 (7K MWCO; 써모 피셔 사이언티픽)을 사용하여 수행하고, 추가의 농축을 아미콘 울트라 100kDa MWCO 한외여과 원심분리 장치 (밀리포어)를 사용하여 수행하였다. 벡터를 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 본 발명자들은 AAV 제제 중의 AAV 게놈 카피를 택맨 qPCR을 사용하여 BGH 폴리A-서열 특이적 프라이머 및 프로브로 정량화하였다²³.

동물 안락사 및 조직 수확

마우스 (각각의 도면에 지시된 주)를 멸균 PBS에 희석된 시험된 AAV 벡터 (저 용량: 4x10¹²vg/kg 및 고 용량: 3.2x10¹³vg/kg) 200 μl로 측방 꼬리 정맥을 통해 서서히 주사한 후, 출혈이 멈출 때까지 주사 부위를 부드럽게 손으로 클램핑하였다. 주사 후 3주에, 마우스를 안락사시키고, 멸균 차가운 포스페이트 완충 염수 (PBS)로 경심 관류하였다. 다음으로, 뇌를 2개의 반구로 세로로 이등분하였다. 한 반구는 PBS에 희석된 15% 글리세롤/4% 파라포름알데히드에서 48시간 동안, 이어서 또 다른 48-72시간 동안 동결보존을 위해 30% 글리세롤에서 후-고정시켰다. 고-용량 코호트에 대해, 심장, 근육 (비복근) 및 망막의 작은 조각을 또한 면역조직학을 위해 프로세싱하였다. 본 발명자들은 AAV-S, AAV-F, 및 AAV9의 3개의 독립적인 제제를 제조하였다 (표 I). 마우스에서의 형질도입 결과는 각각의 벡터의 한 제제로부터의 것이었지만, 본 발명자들은 이들 결과를 2회의 보다 독립적인 실험에서 되풀이하였다.

AAV-CBA-GFP 형질도입된 신경 및 뉴런 세포 집단의 면역조직학 및 고-배율 화상화

관상 부유 섹션 (40μm)을 크리오스타트 마이크로톰을 사용하여 커팅하였다. 트리스-완충 염수 (TBS) 완충제에서 글리세롤을 세정한 후, 동결섹션을 TBS 중 0.5% 트리톤(Triton) X-100 (아메리칸바이오(AmericanBio))으로 실온에서 30분 동안 투과화하고, TBS 중 5% 정상 염소 혈청 (또는 정상 당나귀 혈청) 및 0.05% 트리톤으로 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 1차 항체를 TBS 중 2.5% NGS 및 0.05% 트리톤에서 4℃에서 밤새 인큐베이션한 반면, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488 또는 -Cy3 접합된 2차 항체 (잭슨 이뮤노리서치 래버러토리즈(Jackson ImmunoResearch laboratories), 미국 발티모어)를 다음 날 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이 연구에 사용된 1차 항체는 닭 항-GFP (아베스 랩스(Aves Labs), 미국 티가드), 마우스 항-NeuN (EMD 밀리포어, 미국 벌링톤); 토끼 항-글루타민 신테타제 (앱캠(Abcam), 미국 캠브리지); 토끼 항-Olig2 (EMD 밀리포어, 미국 벌링톤); 토끼 항-Iba1 (와코(Wako), 일본); 토끼 항-CamKII (앱캠, 미국 캠브리지); 마우스 항-GAD67 (EMD 밀리포어, 미국 벌링톤); 토끼 항-ChAT (EMD 밀리포어, 미국 벌링톤); 마우스 항-칼빈딘 (앱캠, 미국 캠브리지) 및 토끼 항-TH (노브스 바이올로지칼스(Novus Biologicals), 미국 리틀톤)이었다. 섹션을 DAPI를 갖는 벡타쉴드(Vectashield) 실장 배지 (벡터 래버러토리즈(Vector Laboratories), 미국 벌링게임)로 실장하였다.

각각의 벡터에 의해 형질도입된 신경 세포 유형을 확인하고 AAV-F에 의해 표적화된 다양한 뉴런 하위-유형을 조사하기 위해, 액시오비전(AxioVision) 소프트웨어 및 60X 대물렌즈가 구비된 자이스 액시오 이미저(Zeiss Axio Imager) Z 에피형광 현미경을 사용하여 GFP 및 각각의 세포 마커 사이의 공편재화를 나타내는 고-해상도 화상을 취하였다.

글로벌 GFP 신호 커버리지의 화상화 및 정량화

뇌 및 간 섹션에서의 전체 천연 GFP 형광 신호를 정량화하기 위해, 로봇식 슬라이드 스캐너 버추얼(Virtual) 슬라이드 현미경 VS120 (올림푸스(Olympus))을 사용하여 올림푸스 UPLSAPO 10x 대물렌즈를 사용한 것 상의 슬라이드의 전체 배치를 화상화하였다. 가변성을 감소시키기 위해, 슬라이드의 전체 배치를 한 섹션에서 화상화하였다. GFP에 대한 초기 노출 시간을 형광 신호가 모든 실험 군에 걸쳐 저- 및 과-포화되지 않고 전체 배치 스캔 전반에 걸쳐 변화되지 않은 채 남아 있도록 설정하였다. 슬라이드의 순서는 무작위화되고 최종 통계적 분석까지 맹검으로 남아 있었다. 이어서 올림푸스 셀센스 스탠다드(cellSens Standard) 소프트웨어를 사용하여 각각의 뇌 섹션에서의 퍼센트 GFP 커버리지를 분석하였다. 관심의 영역 (ROI)은 초기에 "ROI-폴리곤" 툴을 사용하여 정의되었고, 본 발명자들은 분석된 모든 슬라이드에 대해 GFP 채널 상의 유사한 검출 역치를 적용한 후, 이 초기 ROI 내의 GFP-양성 영역을 정량화하였다 (역치는 모든 마우스 뇌의 분석을 위해 유사한 수준에서 설정되었지만, 모든 마우스 간 섹션 및 모든 래트 뇌 섹션의 분석을 위해 상이한 역치가 적용되었다). 이어서 ROI의 총 표면에 따라 GFP-양성 영역의 백분율을 계산하였다. 자가형광 신호를 본 발명자들의 분석에서 고려하였는데, 이는 본 발명자들이 자가형광 수준 초과의 eGFP 형광 광도에 대한 역치를 설정하였기 때문이다 (단지 AAV-GFP 형질도입된 세포로부터의 신호만이 고려된 것을 보장함). 추가로, 본 발명자들은 섹션의 맨 가장자리를 회피하여 각각의 뇌 섹션에 대한 각각의 ROI를 그렸는데, 이는 그것들이 또한 높은 수준의 자가형광을 제공할 수 있었기 때문이다. 심실 공간을 또한 본 발명자들의 분석으로부터 배제하였다. 마지막으로, 3회의 기술적 반복실험 (뇌 섹션)을 마우스당 측정하고, 모든 측정을 분석의 최종 단계까지 맹검으로 수행하였다.

형질도입된 성상세포 및 뉴런의 백분율의 입체학-기반 정량적 분석

입체학-기반 연구를 GFP 및 NeuN (뉴런 마커) 또는 GFP 및 GS (글루타민 신테타제, 범-성상세포 마커)에 대한 뇌 섹션을 공동-염색한 후에, 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다^{24, 25}. 본 발명자들은 미세아교세포 및 핍지교세포를 이 분석에 포함시키지 않았는데, 이는 그들 세포 유형이 주목할 만한 양으로 형질도입되지 않았기 때문이다. AAV-형질도입된 뉴런 및 성상세포의 백분율의 입체학적 평가를 DP70 디지털 CCD 카메라, X-사이트(X-Cite) 형광 램프, 및 연관된 CAST 입체학 소프트웨어 버전 2.3.1.5가 구비된 올림푸스 BX51 에피형광 현미경 (올림푸스, 일본 도쿄)의 동력 스테이지를 사용하여, 초기에 주사된 벡터의 정보 제거 후에 맹검으로 수행하였다. 피질을 초기에 4x 대물렌즈 하에서 윤곽화하였다. 선택된 영역의 랜덤 샘플링을 CAST 소프트웨어의 광학 디섹터 프로브를 사용하여 한정하였다. AAV9, AAV9-PHP.B, AAV-S 및 AAV-F 형질도입된 성상세포 또는 뉴런의 백분율을 평가하기 위해, 입체학-기반 카운트를 20X 대물렌즈 하에서, "고 형질도입" AAV에 대한 피질의 표면에 대해 10%, 및 "저 형질도입" AAV에 대해 20%의 사행 샘플링으로 수행하였다 (그러한 경우 GFP 양성 세포의 비빈번함을 고려함). 각각의 카운팅 프레임에 대해, 성상세포 (GS 양성 세포) 또는 뉴런 (NeuN 양성 세포)의 총 수, 및 그들 집단 각각 중에서, GFP 양성 세포의 백분율을 평가하였다. 단지 카운팅 프레임 내에 DAPI-양성 핵을 갖는 아교 및 뉴런 세포만을 고려하였다.

뇌 및 간에서의 벡터 게놈 정량화

1개의 뇌 반구 및 간의 작은 조각을 벡터 게놈 생체분포를 위한 AAV 게놈 단리를 위해 신선 동결시켰다. 신선 동결된 뇌 및 간 샘플에 대해, 본 발명자들은 DN이지 혈액 및 조직 키트 (퀴아젠)를 제조업체의 지시서에 따라 사용하여 10 mg의 조직으로부터 게놈 및 AAV 벡터 DNA를 단리하였다. DNA를 나노드롭(NanoDrop) ND-1000 분광광도계 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 사용하여 정량하였다. 다음으로, 50 ng의 게놈 DNA를 주형으로서 사용하여, 본 발명자들은 트랜스진 발현 카세트의 폴리A 영역에 대한 프로브 및 프라이머를 사용하여 택맨 qPCR을 수행하였다 (정제된 AAV 벡터를 적정하는데 사용된 동일한 검정). 각각의 샘플에 대해 동등한 게놈 DNA 투입을 보장하기 위해, 본 발명자들은 GAPDH 게놈 DNA (써모 피셔 사이언티픽, 검정 ID Mm01180221_g1; 유전자 기호 Gm12070)를 검출하는 택맨 프로브 및 프라이머 세트를 사용하여 각각의 샘플에 대해 별개의 qPCR을 수행하였다. 각각의 기관/조직에 대해, 본 발명자들은 하기 식을 사용하여 GAPDH Ct 값의 임의의 차이를 고려함으로써 각각의 샘플에 대한 AAV 벡터 게놈 카피를 조정하였다: (AAV 벡터 게놈 카피)/(2^ΔCt). ΔCt 값은 하기 식에 의해 계산하였다: 관심의 샘플의 GAPDH Ct 값 - 가장 낮은 양의 GAPDH (가장 높은 Ct 값)를 가진 샘플의 평균 GAPDH Ct 값. 데이터를 50 ng 게놈 DNA당 AAV 벡터 게놈으로서 표현하였다.

인간 뉴런 형질도입:

1차 인간 태아 신경 줄기 세포 (NSC)를 NIH 윤리 가이드라인을 철저히 준수하여 출생 결함 연구 실험실 (유니버시티 오브 워싱턴(University of Washington), 미국 워싱턴주 시애틀)로부터 얻었다. 단리 절차는 약간의 변형과 함께 이전에 상세화되었다²⁶. 간략하게, 뇌 조직을 행크(Hank) 균형 염 용액 (HBSS)에 희석된 0.25% 트립신, DN아제 (90 단위/mL)에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 조직을 적정하고, 4℃ 열-불활성화된 소 태아 혈청 내로 옮기고, 500g에서 20분 동안 원심분리하였다. 펠릿을 10 μg의 염기성 섬유모세포 성장 인자 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies)), 100 μg의 표피 성장 인자 (라이프 테크놀로지스), 5 μg의 백혈병 억제 인자 (EMD 밀리포어), 60 ng/mL의 N-아세틸시스테인 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)), 4 mL의 신경 생존 인자-1 보충물 (론자(Lonza)), 5 mL의 100x N-2 보충물 (라이프 테크놀로지스), 100 U의 페니실린, 100 μg/mL의 스트렙토마이신 (라이프 테크놀로지스), and 2.5 μg/mL의 푼기존 (라이프 테크놀로지스)으로 보충된 x-비보(x-Vivo) 15 (페놀 레드 및 겐타미신이 없음; 론자)로 이루어진 NSC 완전 배지에 재현탁시켰다. 이어서 상청액을 40-μm 세포 여과기 (코닝 라이프 사이언스(Corning Life Science))를 통해 여과하였다. 직경이 40 μm보다 큰 신경구를 애큐타제(Accutase)로 분리시켰다 (10분). 신경 분화 배지는 1x 신경기저 배지, 2% B-27 혈청-무함유 보충물, 및 2 mM 글루타맥스(GlutaMAX)-I 보충물 (모두 인비트로젠(Invitrogen)으로부터)로 이루어졌고, 인간 재조합 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF) (10 ng/mL; 페프로테크(Peprotech))로 보충되었다.

분화 NSC를 분화 배지 중의 챔버 슬라이드에서 2주 동안 성장시키고, 이어서 GFP를 코딩하는 지시된 AAV 벡터 (7x10^{9 vg}/웰 첨가됨, 150 vg/세포)로 처리하였다. 형질도입 후 1주에, 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 1x 포스페이트-완충 염수 (PBS; 인비트로젠) 중 0.05% 트리톤 X-100 (시그마-알드리치)으로 투과화하였다. 세포를 뉴런-특이적 부류 III β-튜불린 (1:50; 앱캠)에 대한 1차 모노클로날 항체 (TU-20)로 염색하였다. 알렉사 플루오르 594 (1:200 희석됨; 인비트로젠)에 접합된 2차 항체를 1시간 동안, 이어서 DAPI를 30분 동안 첨가하였다. 이어서 슬라이드를 프로롱(ProLong) 페이딩방지 시약 (인비트로젠)으로 실장하였다. 최대 투사 화상을 니콘(Nikon) A1R 공초점 현미경을 사용하여 포획된 Z-스택으로부터 생성하였다.

Z-스택을 이마리스(Imaris)에 로딩하고, 표면 모듈을 사용하여 화상이 3D 볼륨이 되게 하였다. GFP+ 뉴런 (채널 1-그린 하에서) 및 부류 III β-튜불린 양성 뉴런 (채널 2-레드 하에서)을 카운팅하였다. 이마리스 공편재화 모듈을 사용하여, 상기에 대해 이중 양성인 뉴런의 집단을 결정하였다.

통계

데이터의 통계적 분석을 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어 (버전 8.00)를 사용하여 수행하였다. 1-원 ANOVA 검정, 이어서 터키 다중 비교 검정을 상이한 군 AAV9, AAV9-PHP.B, AAV-S 및 AAV-F에 걸쳐 수행하였다. p<0.05의 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 결과는 평균 ± S.E.M.으로 나타내어진다. 유사한 분석을 뇌 및 간에서 AAV 게놈의 생체분포 검정, 뿐만 아니라 인간 뉴런의 형질도입을 수행하였다.

벡터의 직접 정위 주사

성체 C57BL/6 마우스를 케타민/크실라진 (각각 100mg/kg 및 50mg/kg 체중)의 복강내 주사에 의해 마취시키고, 정위 프레임 (코프 인스트루먼츠(Kopf Instruments), 미국 터헝가) 상에 위치시켰다. 벡터의 주사를 피질 (체성감각 피질) 및 해마에서 수행하였다. 총 3μl의 바이러스 현탁액을 0.15μl/분의 속도로 및 10-μl 해밀턴(Hamilton) 시린지 (시그마-알드리치, 미국 세인트 루이스)에 부착된 33-게이지 샤프한 바늘을 사용하여 주사하였다 (AAV-F 및 AAV-S에 대해 각각 주사 부위당 1.65x10¹⁰ 및 5.6x10¹⁰gc). 주사 부위의 정위 좌표를 정수리점으로부터 계산하였다 (피질 좌표: 전후 -1mm, 중외측 ± 1mm 및 배복위 -0.8mm; 해마 좌표: 전후 -2mm, 중외측 ± 1.7mm 및 배복위 -2.5mm).

경막내 볼루스 전달 (IT 볼루스)

성체 C57BL/6 마우스를 이소플루란에 의한 마취 하에 두었다. 요추 영역 위의 피부를 면도하고 세정한 후, 3~4 cm 정중-시상 절개를 근육 및 척추를 노출시킨 피부를 통해 수행하였다. 카테터를 L4-L5 척추 영역 사이에 삽입하고, 33-게이지 스틸 바늘을 갖는 기밀 해밀턴 시린지에 부착시켰다. 10 마이크로리터의 AAV9-CBA-GFP (1.25X10¹¹ vg) 벡터 또는 AAV-F-CBA-GFP (8.8x10¹⁰ vg)를 2 μl/분의 속도로 서서히 주사하였다. 마우스를 주사 후 3주에 희생시켰다.

전체 척수 및 뇌 섹션의 저 배율 화상화를 위해, 본 발명자들은 항-GFP (인비트로젠, 카탈로그 번호 G10362, 희석 1:250)로 밤새 염색하고, 이어서 2차 항체 염색 및 도 3에 대해서와 같이 화상화를 수행하였다.

뇌 및 척수에서의 세포 유형의 면역염색을 위해, 고정된 조직 섹션을 PBS로 세척하고, 염소 혈청으로 차단하고, PBS 중 0.3% 트리톤으로 투과화하였다. 표적 항체를 차단 완충제에 희석하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다.

1차 항체: 항-GFP: 카탈로그 번호 ab1218 (앱캠): 희석, 1:1000

GFAP: 카탈로그 번호 catz0334, (다코(Dako)); 희석, 1:500

NeuN: 카탈로그 번호 ab177487, (앱캠); 희석, 1:300

밤샘 인큐베이션 후, 슬라이드를 0.1% 트윈(Tween)을 갖는 PBS로 광범위하게 세척하였다. 플루오로크롬-접합된 2차 항체 (1:500 희석)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 슬라이드를 PBS로 세척하고, DAPI 실장 용액 (써모피셔, 카탈로그 번호 P36931)을 사용하여 실장하였다. 슬라이드를 자이스(Zeiss) LSM 800 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 화상화하였다.

투과 전자 현미경검사

탄소-코팅된 그리드 (일렉트론 마이크로스코피 사이언시스(Electron Microscopy Sciences), EMS)를 20초 동안 25 mA 글로우 방전에의 노출에 의해 친수성으로 만들었다. 각각의 AAV 벡터 제제에 대해, 5μl를 그리드 상으로 1분 동안 흡착시키고, 1% 우라닐 아세테이트 (EMS #22400)로 20초 동안 염색하였다. 그리드를 테크나이G(TecnaiG)² 스피리트 바이오트윈(Spirit BioTWIN)에서 조사하고, AMT 2k CCD 카메라로 화상화하였다. 작업을 하바드 메디컬 스쿨 일렉트론 마이크로스코피 퍼실러티(Harvard Medical School Electron Microscopy Facility)에서 수행하였다. 카운트를 하기와 같이 수행하였다: 각각의 벡터 제제의 5개의 대표적 화상을 취하였으며; 모든 전체 및 비어있는 캡시드를 포토샵(Photoshop) (CS6)에서 카운트 툴을 사용하여 카운팅하였다. 비어있는 캡시드 백분율을 각각의 화상에 대해 계산하고, 플롯팅하였다.

실시예 1. i트랜스듀스- 발현-기반 AAV 라이브러리의 디자인

먼저, 본 발명자들은 닭 베타 액틴 (CBA)-구동된 Cre 리콤비나제 및 p41프로모터-구동된 AAV9 캡시드로 구성된 AAV2 ITR- 플랭킹된 발현 카세트로 이루어진 AAV 라이브러리 플라스미드를 구축하였다 (도 1a에서의 개략도). 슈도랜덤 21-염기 뉴클레오티드를 PCR을 통해 아미노산 588/589를 코딩하는 AAV9 VP1 뉴클레오티드 사이에 삽입하였다. 바이러스 패키징 전에, 본 발명자들은 이 플라스미드 라이브러리를 저-깊이 차세대 시퀀싱 (NGS)을 사용하여 시퀀싱하고, 대다수의 플라스미드에서의 21-mer 삽입물의 존재 및 변이체 편향의 결여를 확인하였다 (데이터는 나타내지 않음). 이어서 본 발명자들은 캡시드 라이브러리를 패키징하고, NGS를 수행하여 벡터 생성 과정이 선택을 위한 충분한 다양성을 유지하였음을 확인하였다. i트랜스듀스는 그 자신의 cap 유전자 뿐만 아니라 Cre-발현 구축물 둘 다를 운반하는 각각의 고유한 캡시드에 의존한다 (도 1b). floxed-STOP tdTomato 카세트를 운반하는 트랜스제닉 마우스 (Ai9)를 AAV 라이브러리로 정맥내로 주사한다 (도 1b-i). 세포를 성공적으로 형질도입하는 캡시드는 임의의 표적 기관 또는 세포 유형에서 tdTomato 발현을 가능하게 하며 (특이적 Cre 트랜스제닉 마우스 계통의 이용가능성에 의존하지 않음); 이어서 이들 tdTomato-양성 세포를 관심의 조직으로부터 유동 분류할 수 있다 (임의로, 세포-특이적 마커와 함께, 도 1b-ii). 이들 세포로부터 회수된 바이러스 DNA는 트랜스진 발현에 대한 모든 세포외 및 세포내 생물학적 장벽을 효과적으로 극복할 수 있는 캡시드 변이체에 상응할 것이다 (도 1b-iii).

실시예 2. 기능적 캡시드를 확인하기 위한 트랜스진 발현을 사용한 새로운 AAV9 캡시드 변이체의 선택

i트랜스듀스 라이브러리 전략을 시험하기 위해, 본 발명자들은 개념 증명 선택을 수행하여 전신 주사 후 뇌 세포를 형질도입하는 능력을 갖는 AAV 캡시드 변이체를 단리하려고 시도하였다. 라이브러리의 1.27x10¹¹개의 벡터 게놈 (vg, 5x10¹²vg/kg)을 1마리의 성체 수컷 및 1마리의 암컷 Ai9 마우스의 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 주사하고, 주사 후 3주에 마우스를 희생시켰으며; 간, 뇌, 비장, 및 신장의 섹션을 커팅하고, tdTomato의 면역염색을 수행하였다. 본 발명자들은 간에서 tdTomato 양성 세포 (가능성 있게는 간세포)를 용이하게 검출하였으며, 뇌 뿐만 아니라 다른 기관에서 tdTomato 양성 세포 (뉴런 및 성상세포 둘 다)가 산란되었다 (도 7a). 본 발명자들은 또한 본 발명자들이 21-염기 삽입물을 함유하는 cap DNA를 PCR에 의해 회수할 수 있는지 여부를 시험하였으며, 본 발명자들은 라이브러리로 주사된 마우스에서 10개의 기관/조직에서 특이적 밴드를 검출하였지만, 대조군, 비-주사된 마우스에서는 그렇지 않았다 (도 7b). 본 발명자들은 암컷 및 수컷 마우스로부터의 나머지 뇌 조직을 풀링하고, DNA를 선택의 제1 라운드를 위해 초기에 총 뇌 조직으로부터 추출하였다. 본 발명자들은 21-mer 삽입물을 함유하는 cap DNA를 증폭시키고, 그들의 신원 및 판독물 카운트를 NGS를 사용하여 분석하였다. 본 발명자들은 비선택된 라이브러리와 및 간으로부터 회수된 변이체와 비교하는 경우 선택의 단일 라운드 후 뇌 조직으로부터 수확된 라이브러리 집단에서 특이적 펩티드의 실질적 풍부화를 관찰하였다 (도 7c 및 데이터는 나타내지 않음). 다음으로, 본 발명자들은 바이러스 DNA의 삽입물-함유 영역을 단리하고, 이를 다시 AAV 플라스미드 백본 내로 재-클로닝하고, 선택의 제2 라운드를 위해 캡시드를 재패키징하였다 ("뇌-풍부화된 캡시드 라이브러리").

선택의 제2 라운드를 위해, 2마리의 Ai9 마우스 (1마리의 수컷, 1마리의 암컷)를 라운드 1로부터 회수된 라이브러리로 주사하고 (1.91x10¹⁰ vg의 용량, 7.64x10¹¹vg/kg), 3주 후에 희생시켰다. 주사 전에, 변이체 영역을 함유하는 서열을 증폭시키고, 기존의 편향이 벡터 풀 내로 도입되지 않았음을 보장하기 위해 NGS에 의해 시퀀싱하였다 (도 2). 뇌 조직을 분리하여 tdTomato-양성 세포를 분류하기 위한 세포 현탁액을 유동 세포계측법에 의해 얻었다. 본 발명자들은 3,834개의 tdTomato-양성 세포 (초기 세포 현탁액의 0.043%)를 유동 분류하였으며, 이는 성공적인 형질도입을 지시하였다 (도 8a-b). tdTomato 분류된 세포로부터의 바이러스 DNA를 증폭시키고, 이전에 수행된 바와 같이 시퀀싱하였다 (도 2). tdTomato-양성 세포로부터 단리된 바이러스 DNA는 단지 3개의 펩티드, STTLYSP, FVVGQSY, 및 FQPCP* (여기서 *는 정지 코돈을 지시함)에 의해 나타내어진 판독물의 97%를 나타내었다 (도 2b). 본 발명자들은 생체내에서의 기능적 평가를 위해 이들 중 2개, STTLYSP (AAV-S로 용어화됨) 및 FVVGQSY (AAV-F로 용어화됨)를 선택하였다 (본 발명자들은 FQPCP*의 평가를 제외하였는데, 이는 그것이 교차-패키징의 생성물일 가능성이 있었기 때문이다). 도 2에서 보는 바와 같이, 이들 서열 둘 다는 라운드 2 라이브러리에서 낮은 수준으로 검출가능하였지만 (각각의 변이체에 대해 판독물의 ~0.4%), 선택 후 뇌에서 고도로 풍부화되었다.

실시예 3. AAV-F 캡시드는 뮤린 CNS에서 효율적인 트랜스진 발현을 매개한다.

AAV의 캡시드 상에 발현된 이들 펩티드가 AAV 벡터에 의한 효율적인 트랜스진 발현을 매개할 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 본 발명자들은 단일-가닥 CBA 프로모터-구동된 GFP 발현 카세트를 패키징하는 이들 캡시드 (AAV-S 및 AAV-F)를 제조하였다 (도 3a). 비교를 위해, 본 발명자들은 모 AAV9 벡터 및 지정된 진화에 의해 생성된 7-mer 펩티드 삽입 (TLAVPFK)을 갖는 가장 폭넓게 연구된 AAV9 변이체인 AAV9-PHP.B를 포함시켰다¹². 모든 벡터는 잘 제조되었으며, AAV9보다 약간 더 낮은 제조 효율을 제공하였다 (표 4).

표 4. AAV 캡시드의 제조 효율*

*모든 캡시드는 단일-가닥 AAV2 ITR-플랭킹된 AAV-CBA-GFP-WPRE 트랜스진 카세트를 패키징하였다

성체 수컷 C57BL/6J 마우스를 저 용량 또는 고 용량 (각각 1x10¹¹ vg 및 8x10¹¹ vg의 벡터; 대략 4x10¹² 및 3.2x10¹³ vg/kg)의 하기 벡터 중 하나로 측방 꼬리 정맥을 통해 주사하였다: AAV9, AAV9-PHP.B, AAV-S 및 AAV-F (n=각각 3). 주사 후 3주에, 마우스를 희생시키고, 기관을 내인성 (비염색된) GFP 형광 분석을 위해 수확하였다. 본 발명자들은 일련의 시상 뇌 섹션 (동물당 3개의 섹션이 분석되었음)에서 GFP 신호의 퍼센트 커버리지를 정량하였다. 주목할 만하게, AAV-F는 모 AAV9 벡터에 비해 각각 1x10¹¹ vg 및 8x10¹¹ vg에서 119배 (p<0.0001) 및 68배 (p=0.0004) 증가된 GFP 형광 커버리지를 입증하였다 (도 3b, c, e, f; 도 9a-b). AAV9 및 AAV-S는 유사한 GFP 커버리지 수준을 나타내었다 (도 3b, c, e, f). AAV9-PHP.B는 AAV-F에 비해 저 용량에서 약간 더 높은 GFP 커버리지를 제공한 반면, 8x10¹¹ vg 용량에서는 유사한 수준의 GFP 커버리지가 관찰되었다 (도 3b, c, e, f). AAV9-PHP.B와 유사하게, AAV-F는 척수를 주목할 만한 효율로 형질도입하였다 (도 3d). 뇌의 대부분의 영역은 AAV-F에 의해 효과적으로 표적화되었으며, 피질, 해마, 선조체, 소뇌 및 후각 신경구에서 왕성한 GFP 신호가 관찰되었다 (도 3f).

AAV-S 및 AAV-F에 의해 표적화되는 세포 유형의 상세한 인식을 얻기 위해, 본 발명자들은 다음으로 GFP 및 뉴런 (NeuN), 성상세포 (글루타민 신테타제, GS), 미세아교세포 (Iba-1) 및 핍지교세포 (Olig2)의 마커로의 일련의 공동-면역염색을 수행하였다. AAV-F 및 AAV-S는, 다른 2가지 참조 벡터와 유사하게, 주로 뉴런 및 성상세포를 형질도입하였다 (어떠한 변이체도 미세아교세포 또는 핍지교세포를 효과적으로 형질도입하는 것으로 보이지 않았다, 도 4a, b). 1x10¹¹ vg 용량에서의 피질에서의 뉴런 및 성상세포의 입체학적 정량은 성상세포에서 65 및 뉴런에서 171의 인자에 의해 통상적인 AAV9와 비교하여 AAV-F의 효율적인 형질도입 잠재성을 확인시켜 준 반면, AAVS 및 AAV9 사이의 차이는 유의하지 않았다 (GFP 양성 성상세포의 퍼센트는 각각 AAV9에 대해 0.63%±0.24% 및 AAV-S에 대해 0.36±0.15%였고; GFP 양성 뉴런의 퍼센트는 AAV9에 대해 0.039%±0.0.02% 및 AAV-S에 대해 0.029±0.002%였고; 모든 ± 수는 평균의 표준 오차, SEM을 나타낸다). 중요하게는, AAV-F는 AAV9-PHP.B (28.21±0.25%)보다 유의하게 더 많은 성상세포 (40.78±0.73%)를 표적화하였고, 뉴런에 대해 그 역도 사실이었으며 (AAV-F에 대해 6.67±0.5% 및 AAV9-PHP.B에 대해 10.59±0.16%, 도 4c), 이는 마우스에서 그들 2가지 벡터 사이의 약간 상이한 향성을 시사한다. 추가로, AAV-F는 흥분성 (CamKII 양성) 및 억제성 (GAD67 양성) 피질 뉴런, 선조체에서 도파민성 뉴런 (티로신 히드록실라제, TH를 발현함), 소뇌에서 푸르킨예 뉴런 (칼빈딘 양성) 및 척수에서 운동 뉴런 (콜린 아세틸트랜스퍼라제 마커, ChAT를 발현함, 도 10a.)을 포함한 다양한 뉴런 하위-유형을 형질도입하였다. 피질에서의 입체학적 카운트 (도 4c) 및 고 용량의 AAV-F 대 AAV9의 화상 (도 3f)과 일치하게, 본 발명자들은 선조체, 해마, 및 소뇌에서 1x10¹¹ vg/마우스의 용량에서 AAV-F로 뉴런 및 성상세포의 효율적인 형질도입을 관찰하였지만, AAV9에서는 그렇지 않았다 (도 10b).

AAV-F로의 뇌에서의 높은 수준의 GFP 트랜스진 발현이 뇌에서의 보다 높은 수준의 AAV 게놈에 상응하는지 여부를 보다 잘 이해하기 위해, 본 발명자들은 간 및 뇌로부터 벡터 및 뮤린 게놈 DNA를 단리하고, 8x10¹¹ vg 투여된 마우스에 대한 qPCR을 수행하였다. AAV-F는 AAV9에 비해 뇌에서 AAV 게놈의 20배 강화 (p<0.0001)를 나타내었다 (도 4d). 보고된 바와 같이, AAV9-PHP.B는 AAV9에 비해 뇌에서 훨씬 더 많은 (25배) 양의 AAV 게놈을 가진 반면, AAV-S는 GFP 형광 데이터와 유사하게 낮은 수준을 가졌다 (도 3). PHP.B는 간에서 AAV9 및 AAV-F보다 약간 더 낮은 발현 수준을 나타내었다 (AAV-S는 그렇지 않지만; 도 4d). AAV-F는 간에서 AAV9와 유사한 수준을 나타내었으며, AAV-S는 보다 낮은, 그러나 비-유의한 하향 경향을 나타내었다. 본 발명자들은 또한 몇몇 다른 기관 - 골격근, 심장, 및 척수에서 AAV9에 비해 AAV-F의 생체분포를 조사하였다 (도 11). 본 발명자들은 근육 및 심장에서 2가지 벡터 사이의 유의한 차이를 관찰하지 못하였다 (심장에서 AAV-F에 관하여 상향 경향이 보였지만). 뇌에서의 발현으로부터 예상될 것인 바와 같이, AAV-F는 AAV9에 비해 척수에서 유의하게 더 높은 발현 수준을 나타내었다 (p < 0.05, t-검정).

전신 주사 후의 말초 기관에서의 트랜스진 발현을 조사하기 위해, 본 발명자들은 간, 심장, 골격근, 및 망막에서 GFP 형광을 분석하였다 (도 4e). 놀랍지 않게, 모든 벡터는 간을 효율적으로 형질도입하였다. 심장 및 골격근에서, AAV-S는 AAV9 및 AAV-F보다 더 많은 수의 밝은 GFP 신호/섹션을 생성하였다. 모든 캡시드는 정맥내 전달로 예상된 바와 같이 망막의 낮은 형질도입을 매개하였다. 흥미롭게도, AAV-9 및 AAV-S는 뉴런 망막을 형질도입하지 않은 반면, 망막 색소 상피 (RPE)에서 일관된 발현이 관찰되었다. AAV9-PHP.B 및 AAV-F 둘 다는 망막, 가장 현저하게는 신경절 세포 층 (GCL)에서의 세포에서 다수의 층을 형질도입하였다. GFP 발현은 또한 내핵층 (INL)에서 관찰되었고, 외얼기층 (OPL)에서 실질적인 발현이 나타났으며, 이는 양극성 또는 억제성 수평 세포 형질도입을 반영할 수 있다.

마우스에서의 AAV 벡터에 의한 형질도입은 성별 및 마우스 주 사이에 실질적으로 다양할 수 있기 때문에, 본 발명자들은 가장 효율적인 캡시드, AAV-F가 암컷 C57BL/6 뿐만 아니라 수컷 BALB/c의 전신 주사 후 뇌를 효율적으로 형질도입할 수 있는지 여부를 조사하였다. 마우스를 1x10^{11 vg} (4x10¹² vg/kg)으로 주사하였으며, 본 발명자들은 주 또는 성별과 독립적인 왕성하고 효율적인 형질도입을 관찰하였다 (도 5a-c). 이들 결과는 이전에 보고된 바와 같이 BALB/c 주에서 전신 전달 후에 중추 신경계를 형질도입하는데 있어서 AAV9-PHP.B의 효능의 결여와 대조되었다 (도 5b, c.) ^{13, 14}

아이오딕산올 밀도 구배 정제는 대다수의 비어있는 캡시드를 제거하는 반면, AAV-F에서의 과량의 비어있는 캡시드가 AAV9에 비해 뇌에 대한 그의 증가된 생체분포를 설명할 수 있는지를 조사하기 위해, 본 발명자들은 AAV-F의 2가지 별개의 제제에 대해 투과 전자 현미경검사 (TEM)를 수행하고, 이들을 AAV9의 2가지 독립적인 제제와 비교하였다. 도 12a-e에서 보는 바와 같이, 본 발명자들은 AAV-F 및 AAV9 사이에 비어있는 캡시드 수준의 유의한 차이를 관찰하지 못하였다 (AAV9 및 AAV-F에 대해 각각 평균 4.63±1.99% 대 5.2±2.18% 비어있는 캡시드, 평균 ± SD, p = 0.54, 독립표본 t-검정).

다음으로, 본 발명자들은 AAV-F가 다른 투여 경로를 통해 CNS 형질도입을 위한 벡터로서 유용성을 가질 것인지 여부를 시험하였다. 본 발명자들은 먼저 성체 C57BL/6 마우스의 직접 해마 주사 후에 뇌에서 트랜스진 발현을 매개하는 AAV-S 및 AAV-F를 시험하였다. 본 발명자들은 둘 다의 캡시드가 주로 뉴런에서 직접 주사 후 GFP의 광범위한 발현을 달성함을 밝혀내었다 (도 13). 척수를 형질도입하는 AAV 벡터의 경막내 주사는 이 구획을 치료하는데 유망한 것으로 나타났다. 한 가지 문제점은 벡터의 요추 주사 후 뇌로의 벡터의 제한된 분산이다. 본 발명자들은 성체 C57BL/6 마우스에서 척수의 요추 영역 내로의 벡터의 볼루스 경막내 주사 후에 AAV9 및 AAV-F를 비교하였다. 주사 후 3주에, 마우스를 희생시키고, 척수 및 뇌를 분석하였다. 주목할 만하게, AAV-F는 백색 및 회색 물질 둘 다를 형질도입하여, AAV9에 비해 척수 전반에 걸쳐 훨씬 더 강한 GFP 발현을 발생시켰다. 한편, AAV9 형질도입은 주로 백색 물질에 제한되었다. 현저하게, 본 발명자들은 또한 AAV-F로 주사된 마우스의 뇌에서 성상세포 및 뉴런의 형질도입을 검출하였지만, AAV9에서는 그렇지 않았다 (도 14).

실시예 4. AAV-F는 인간 뉴런의 강화된 형질도입을 매개한다

선택을 마우스에서 수행하였기 때문에, 본 발명자들은 AAV-F의 왕성한 형질도입 특징이 또한 인간 세포로 번역되었는지를 분석하였다. 1차 인간 줄기 세포-유래 뉴런을 모두 GFP를 코딩하는 동등한 용량의 AAV9, AAV-S 및 AAV-F로 형질도입하였다. 1주 후에 이들을 고정시키고, 부류 III β 튜불린으로 염색하고, GFP 양성 뉴런의 백분율에 대해 분석하였다. 주목할 만하게, AAV-F는 AAV9보다 3배 더 높은 뉴런의 62%를 형질도입하였다 (p<0.05) (도 6a, b). AAV-S는 AAV9에 비해 형질도입 효율의 약간, 그러나 통계적으로 유의한 (p<0.05) 증가를 생성하였다 (도 6a).

실시예 5. AAV-S는 내이를 고 효율로 형질도입한다

최근 특이적 기관 및 세포 유형을 고 효율로 표적화하도록 디자인된 새로운 AAV 벡터의 개발이 나타났다. 이들 중 많은 것은 특정 AAV 혈청형의 형질도입 특성을 변형시키는 7-mer 펩티드 삽입을 이용한다. 그러나, 이들 벡터는 종종 치료하기 곤란한 것들, 예컨대 내이를 포함한 다른 조직을 형질도입하도록 다른 목적으로 고쳐질 수 있다. 내이 내의 특정 세포 유형 - 예컨대 유모 세포 - 를 형질도입하는 것은 도전으로 남아 있으며, 많은 통상적인 AAV 벡터는 유모 세포의 한 부류인 외부 유모 세포 (OHC)를 일관되게 표적화하는데 실패하였다.

상기 언급된 바와 같이, 하나 (AAV-F)는 전신 주사 후 큰 유망함 및 높은 CNS 발현을 나타낸 반면, 다른 것 (AAV-S)은 그렇지 않았다. 전신적으로 주사된 AAV-S는 혈액-뇌 장벽을 효과적으로 가로지르지 않았지만, 이는 심장, 간, 및 근육을 포함한 다양한 조직을 형질도입하였다. 뇌 내로의 직접 주사 후, AAV-S는 뉴런에서 심지어 상대적으로 낮은 용량에서도 높은 국소 형질도입 효율을 나타내었다. 내이에서의 그의 형질도입 특성을 검정하기 위해, 본 발명자들은 CBA 프로모터 하에서 EGFP를 유도하는 단일-가닥 발현 카세트를 코딩하는 AAV-S를 제조하고, 이를 신생아 (P1) 마우스에서 정원창을 통해 주사하였다. 본 발명자들은 AAV-S가 와우의 유모 세포를 극도로 잘 형질도입함을 밝혀내었다. 내부 및 외부 유모 세포 둘 다는 시험된 용량 (2x10¹⁰ VG)에서 최대 100% 및 99%의 효율로 형질도입되었다 (도 15a, b). 본 발명자들은 또한 나선연 및 나선 신경절의 유의한 형질도입을 관찰하였다 (도 15c, d). 전체적으로, 본 발명자들은 AAV-S가 내이의 유전자 요법에 사용될 수 있음을 여기서 보여준다.

실시예 6. 섬유세포를 효율적으로 형질도입하는 캡시드를 단리하기 위한 비-트랜스제닉 성체 영장류에서의 선택을 위한 i트랜스듀스 시스템의 사용

섬유세포-표적화 AAV 캡시드에 대한 선택의 2-3 라운드를 비-인간 영장류, 예를 들어, 시노몰구스 원숭이에서 수행한다. 섬유세포-선택적, 형질도입-적격 AAV 캡시드를 확인하기 위해, 선택을 GJB2-floxed-STOP-tdTomato 카세트 (크기는 AAV 캡시드 내부에 적합함)를 코딩하는 AAV9-PHP.B와 함께 i트랜스듀스 AAV 라이브러리를 공동-주사함으로써 수행한다. NHP 내이에서, AAV9-PHP.B-CBA-GFP는 섬유세포, HC, 및 나선 신경절 뉴런 영역을 포함한 와우의 많은 세포를 형질도입한다. 이 선택 전략 (도 16a 참조)에서, tdTomato 발현은 본질적으로 내이 트랜스제닉 NHP를 생성하는 GJB2 프로모터 하에서 섬유세포에 제한된다. 섬유세포에 진입하고 tdTomato를 켜는 AAV 캡시드를 분리된 와우로부터 유동 분류하고, 캡시드 DNA를 NGS에 대해 회수하고, 클로닝하여 섬유세포에서 AAV 매개된 발현을 허용하는 펩티드 서열을 확인한다. 개별 펩티드 풍부화에 이어서, 언제 선택의 추가의 라운드를 정지할지 알려주는 상기 기재된 바와 같은 딥-시퀀싱이 이어진다 (가능성 있게는 특정 펩티드가 판독물의 >25%를 나타내는 경우).

대안적으로 또는 추가로, AAV 캡시드를 표적화하는 척수 세포에 대한 선택의 2-3 라운드를 비-인간 영장류, 예를 들어, 시노몰구스 원숭이에서 수행한다. 척수-선택적, 형질도입-적격 AAV 캡시드를 확인하기 위해, 선택을 CBA-floxed-STOP-mPlum 카세트 (크기는 AAV 캡시드 내부에 적합함)를 코딩하는 AAV9와 함께 i트랜스듀스 AAV 라이브러리를 공동-주사함으로써 수행한다. NHP 척수에서, AAV9-는 뉴런 및 성상세포를 포함한 세포를 형질도입한다. 이 선택 전략 (도 16b 참조)에서, 척수 세포에 진입하고 mPlum 형광을 켜는 AAV 캡시드를 분리된 척수로부터 유동 분류하고, 캡시드 DNA를 NGS에 대해 회수하고, 클로닝하여 척수의 세포에서 AAV 매개된 발현을 허용하는 펩티드 서열을 확인한다. 개별 펩티드 풍부화에 이어서, 언제 선택의 추가의 라운드를 정지할지 알려주는 상기 기재된 바와 같은 딥-시퀀싱이 이어진다 (가능성 있게는 특정 펩티드가 판독물의 >25%를 나타내는 경우).

후보 캡시드 클론이 확인되면, GFP 카세트를 코딩하는 캡시드를 전과 같이 벡터화한다. 다음으로, 캡시드를 직접 정원창 막 (RMW) 주사 (예를 들어, 16a에 나타내어진 바와 같음), 또는 경막내 주사 (예를 들어, 16b에 나타내어진 바와 같음) 후에 표적 세포의 형질도입에 대해 시험한다.

다른 실시양태

본 발명을 그의 상세한 설명과 함께 기재하였지만, 상기 설명은 첨부된 청구범위의 범주에 의해 한정되는 본 발명의 범주를 예시하는 것이지 제한하는 것이 아닌 것으로 의도됨이 이해되어야 한다. 다른 측면, 이점, 및 변형은 하기 청구범위의 범주 내에 있다.

SEQUENCE LISTING <110> THE GENERAL HOSPITAL CORPORATION PRESIDENT AND FELLOWS OF HARVARD COLLEGE <120> ENGINEERED ADENO-ASSOCIATED (AAV) VECTORS FOR TRANSGENE EXPRESSION <130> 29539-0390WO1 <140> PCT/US2020/025720 <141> 2020-03-30 <150> 62/825,703 <151> 2019-03-28 <160> 149 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Ser Thr Thr Leu Tyr Ser Pro 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Phe Val Val Gly Gln Ser Tyr 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Phe Gln Pro Cys Pro 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Pro Ser Tyr Leu Thr Thr Ser 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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900 ctcatcaaca acaactgggg attccggcct aagcgactca acttcaagct cttcaacatt 960 caggtcaaag aggttacgga caacaatgga gtcaagacca tcgccaataa ccttaccagc 1020 acggtccagg tcttcacgga ctcagactat cagctcccgt acgtgctcgg gtcggctcac 1080 gagggctgcc tcccgccgtt cccagcggac gttttcatga ttcctcagta cgggtatctg 1140 acgcttaatg atggaagcca ggccgtgggt cgttcgtcct tttactgcct ggaatatttc 1200 ccgtcgcaaa tgctaagaac gggtaacaac ttccagttca gctacgagtt tgagaacgta 1260 cctttccata gcagctacgc tcacagccaa agcctggacc gactaatgaa tccactcatc 1320 gaccaatact tgtactatct ctcaaagact attaacggtt ctggacagaa tcaacaaacg 1380 ctaaaattca gtgtggccgg acccagcaac atggctgtcc agggaagaaa ctacatacct 1440 ggacccagct accgacaaca acgtgtctca accactgtga ctcaaaacaa caacagcgaa 1500 tttgcttggc ctggagcttc ttcttgggct ctcaatggac gtaatagctt gatgaatcct 1560 ggacctgcta tggccagcca caaagaagga gaggaccgtt tctttccttt gtctggatct 1620 ttaatttttg gcaaacaagg aactggaaga gacaacgtgg atgcggacaa agtcatgata 1680 accaacgaag aagaaattaa aactactaac ccggtagcaa cggagtccta tggacaagtg 1740 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Sequence: Synthetic primer <400> 15 agctaccgac aacaacgtgt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 16 agaagggtga aagttgccgt 20 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 17 cagcctcgtc ttactgagct t 21 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 18 Gln Pro Arg Leu Thr Glu Leu 1 5 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 19 agtcatttta gtaattctat g 21 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 20 Ser His Phe Ser Asn Ser Met 1 5 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 21 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Synthetic peptide <400> 52 Gln Tyr Leu Phe His Ile Phe 1 5 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 53 ggtgctggga ctcttacttc t 21 <210> 54 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 54 Gly Ala Gly Thr Leu Thr Ser 1 5 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 55 cctctttcgc gtgttgcttt g 21 <210> 56 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 56 Pro Leu Ser Arg Val Ala Leu 1 5 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 57 actactgcta agacgactgg g 21 <210> 58 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 58 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 83 tcgactacgt ggaagtctga t 21 <210> 84 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 84 Ser Thr Thr Trp Lys Ser Asp 1 5 <210> 85 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 85 ttgcagaaga tggctgttcc g 21 <210> 86 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 86 Leu Gln Lys Met Ala Val Pro 1 5 <210> 87 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 87 acggggtgta agtgttcgca g 21 <210> 88 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 88 Thr Gly Cys Lys Cys Ser Gln 1 5 <210> 89 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial 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Claims (29)

1. 서열 STTLYSP (서열식별번호: 1) 또는 FVVGQSY (서열식별번호: 2)로부터의 적어도 4개의 인접한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 AAV 캡시드 단백질.
2. 제1항에 있어서, 서열 STTLYSP (서열식별번호: 1) 또는 FVVGQSY (서열식별번호: 2)로부터의 적어도 5개의 인접한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 AAV 캡시드 단백질.
3. 제1항에 있어서, 서열 STTLYSP (서열식별번호: 1) 또는 FVVGQSY (서열식별번호: 2)로부터의 적어도 6개의 인접한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 AAV 캡시드 단백질.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, AAV가 AAV9인 AAV 캡시드 단백질.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, AAV9 VP1을 포함하는 AAV 캡시드 단백질.
6. 제5항에 있어서, 서열이 서열식별번호: 6의 아미노산 588 및 589에 상응하는 위치에 삽입된 것인 AAV 캡시드 단백질.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산.
8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 캡시드 단백질을 포함하며, 바람직하게는 야생형 VP1, VP2, 또는 VP3 캡시드 단백질을 포함하지 않는 AAV.
9. 제8항에 있어서, 트랜스진, 바람직하게는 치료 트랜스진을 추가로 포함하는 AAV.
10. 세포를 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 AAV와 접촉시키는 것을 포함하는, 트랜스진을 세포에 전달하는 방법.
11. 제10항에 있어서, 세포가 뉴런 (임의로 후근 신경절 뉴런 또는 나선 신경절 뉴런), 성상세포, 심근세포, 또는 근세포, 성상세포, 아교 세포, 내부 유모 세포, 외부 유모 세포, 지지 세포, 내이의 섬유세포, 광수용체, 개재뉴런, 망막 신경절, 또는 망막 색소 상피인 방법.
12. 제11항에 있어서, 세포가 살아있는 대상체에 있는 것인 방법.
13. 제11항에 있어서, 대상체가 포유동물 대상체인 방법.
14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 뇌, 척수, 후근 신경절, 심장, 내이, 눈, 또는 근육, 및 이들의 조합으로부터 선택된 조직에 있는 것인 방법.
15. 제14항에 있어서, 대상체가 알츠하이머병; 파킨슨병; X-연관 부신백질이영양증; 카나반병; 니만 픽병; 척수 근육 위축증; 헌팅톤병; 코넥신-26; 어셔 유형 3A; 어셔 유형 2D; 유모 세포-관련 청각 상실; 유모 세포-관련 청각 상실 (DFNB7/11); 내부 유모 세포-관련 청각 상실 (DFNB9); 어셔 유형 1F; 어셔 유형 1B; 색소성 망막염 (RP; 비-증후군성); 레베르 선천성 흑암시; 레베르 유전성 시신경병증; 어셔 증후군 (RP; 난청을 갖는 증후군성); 뒤시엔느 근육 이영양증; 동종이식편 혈관병증; A형 및 B형 혈우병을 갖는 것인 방법.
16. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 대상체의 뇌에 있고, AAV가 비경구 전달; 뇌내; 또는 경막내 전달에 의해 투여되는 것인 방법.
17. 제16항에 있어서, 경막내 전달이 요추 주사, 대수조 주사, 또는 실질내 주사를 통한 전달인 방법.
18. 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, AAV가 비경구 전달에 의해, 바람직하게는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내, 또는 근육내 전달을 통해 전달되는 것인 방법.
19. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 대상체의 눈에 있고, AAV가 망막하 또는 유리체내 주사에 의해 투여되는 것인 방법.
20. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 대상체의 내이에 있고, AAV가 정원창 막 위로의 또는 이를 통한 적용을 통해, 정원창, 골성 난원창 내의 창, 또는 반고리관에 인접한 외과적으로 천공된 와우개창술을 통해 와우에 투여되는 것인 방법.
21. 하기를 포함하는 라이브러리 구축물 AAV:
    (i) 프로모터에 의해 구동된 Cre 리콤비나제를 코딩하는 서열;
    (ii) Cre 카세트의 하류의 프로모터에 의해 구동된 캡시드의 아미노산 (aa) 588-589를 코딩하는 서열 사이에 삽입된 칠량체 펩티드를 갖는 AAV9 캡시드 단백질을 코딩하는 서열.
22. 제21항에 있어서, 칠량체가 랜덤 칠량체 펩티드 또는 사전-선택된 칠량체 펩티드를 포함하는 것인 라이브러리 구축물 AAV.
23. 제21항 또는 제22항의 복수의 라이브러리 구축물을 포함하는 라이브러리.
24. 제23항에 있어서, 라이브러리가 칠량체의 모든 가능한 변이체를 코딩하는 서열을 갖는 라이브러리 구축물을 포함하는 것인 라이브러리.
25. 하기 단계를 포함하는, 사전-선택된 세포 유형에서 트랜스진 발현을 매개하는 조작된 캡시드를 확인하는 방법:
    (a) 제23항 또는 제24항의 라이브러리를 비-인간 모델 동물, 바람직하게는 포유동물에게 투여하며, 여기서 모델 동물의 세포는 리포터 서열의 상류의 loxP-플랭킹된 STOP 카세트를 발현하는 것인 단계;
    (b) 사전-선택된 세포 유형의 세포를 단리하는 단계;
    (c) 리포터 서열이 발현되는 세포를 선택하는 단계;
    (d) 리포터 서열이 단계 (c)로부터 발현되는 선택된 세포로부터 라이브러리 구축물의 적어도 부분, 바람직하게는 칠량체를 포함하는 부분을 단리하는 단계; 및
    (e) 단계 (d)에서 단리된 라이브러리 구축물에서 칠량체의 신원을 결정하며, 여기서 단리된 칠량체는 사전-선택된 세포 유형에서 트랜스진 발현을 매개할 수 있는 것인 단계.
26. 제25항에 있어서, 리포터 서열이 형광 리포터 단백질을 코딩하는 것인 방법.
27. 제25항에 있어서, 모델 동물이 리포터 서열의 상류의 loxP-플랭킹된 STOP 카세트에 대해 트랜스제닉이거나, 또는 리포터 서열의 상류의 loxP-플랭킹된 STOP 카세트가 제2 구축물로부터 발현될 수 있는 것인 방법.
28. 제25항에 있어서, 라이브러리 구축물에서 칠량체의 신원을 결정하는 것이 DNA 시퀀싱 분석을 사용하는 것을 포함하는 것인 방법.
29. 제25항에 있어서, 단계 (e) 전에 및/또는 후에
    단계 (d)에서 단리된 라이브러리 구축물로부터 PCR을 사용하여 전체 캡시드 서열을 임의로 포함하는 칠량체 서열을 포함하는 서열을 증폭시키고;
    증폭된 서열을 라이브러리 벡터의 제2 세트로 다시 클로닝하고;
    라이브러리 벡터의 제2 세트를 재패키징하고;
    라이브러리 벡터의 제2 세트에 대해 단계 (a)-(d) 또는 (a)-(e)를 수행하는 것
    을 추가로 포함하는 방법.

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