CN117343963A - 核酸构建体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文提供了编码抗VEGF的融合蛋白的核酸构建体例如表达载体、以及由所述构建体制成的重组病毒例如重组慢病毒和重组腺相关病毒。本文还提供了上述融合蛋白、核酸构建体和重组病毒在治疗年龄相关性黄斑变性(AMD)例如湿性AMD中的用途。

Description

核酸构建体及其用途
本申请要求于2022年9月29日提交的中国专利申请202211201733.2号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及基因治疗技术领域。具体涉及用于年龄相关性黄斑变性(AMD)例如湿性AMD的核酸构建体。
背景技术
年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)，也称为年龄相关的黄斑变性，是一种与年龄相关的、进行性、不可逆性中心视力丧失的疾病，是全球60岁以上老年人致盲的主要原因。晚期AMD在临床上主要分为两大类：干性和湿性。其中干性AMD以脉络膜下玻璃膜疣沉积和形成地图状萎缩为主要特点。湿性AMD以脉络膜新生血管化(choroidal neovascularization,CNV)、视网膜下腔渗出为特征。新生血管性AMD(neovascular AMD,nAMD)，仅占AMD总数的10％，但其致盲患者数占AMD致盲总人数的90％。
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是调控血管生成和血管渗漏的关键因子，在脉络膜新生血管形成过程中有着重要作用。VEGF属于血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)超家族中的成员。VEGF家族成员包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D及胎盘样生长因子(Placental-like growth factor，PLGF)。其中，VEGF-A与其受体VEGFR-2结合后促使下游大量蛋白活化，导致血管内皮细胞生长、分化和增生，血管通透性增加。此外，VEGF-A也是重要的炎性细胞趋化因子。目前VEGF的病理性表达已经被证实为nAMD的重要致病机制之一。
大量临床试验和实践证明玻璃体腔内注射抗VEGF药物能够有效稳定和改善患者视力，短期疗效显著，成为nAMD患者的一线治疗方案。目前的抗VEGF治疗药物包括雷珠单抗(ranibizumab；Genentech，Inc.)、Eylea(aflibercept；Regeneron Pharmaceuticals，Inc.)、Beovu(brolucizumab；Novartis，Inc.)以及康柏西普(Conbercept；成都康弘生物科技有限公司)等。
但抗VEGF治疗仍存在一些实际的局限性，包括药物的高成本、需要频繁的玻璃体内注射、可能发生并发症、不完全应答和/或某些患者无法维持应答。因此，寻找更有效、更持久的治疗方法，对减少社会和个人的治疗负担有着重要作用。
此外，目前市售的或处于临床实验阶段的抗VEGF药物大多以1:1甚至2:1的比率结合VEGF，其治疗效果有限。因此，亟待开发一种能够以更高的结合比例结合VEGF的抗VEGF的更持久的药物。
发明概述
为解决上述问题，本发明通过在同一表达载体中包含编码融合的多种抗VEGF分子的核苷酸序列，然后将包含该表达载体的病毒颗粒转导到人视觉细胞中，从而在视觉细胞中持续表达高水平的抗VEGF分子。本发明的技术方案能够更高效的阻断VEGF/VEGFR的结合，从而有效地治疗年龄相关的黄斑变性。
相应地，在第一方面，本发明提供了一种核酸构建体例如表达载体，所述核酸构建体包含一种或多种编码VEGF结合区的核苷酸序列，例如编码第一VEGF结合区的第一核苷酸序列和/或编码第二VEGF结合区的第二核苷酸序列，其中所述第一VEGF结合区和/或第二VEGF结合区各自独立地选自衍生自抗VEGF抗体的抗原结合片段和衍生自VEGF受体(VEGFR)的VEGF结合片段，所述VEGF结合片段包含VEGFR的结构域2和结构域3(D2/3)。
本发明还提供了一种核酸构建体例如表达载体，所述核酸构建体包含编码第一VEGF结合区的第一核苷酸序列和编码第二VEGF结合区的第二核苷酸序列，其中所述第一VEGF结合区和第二VEGF结合区各自独立地选自衍生自抗VEGF抗体的抗原结合片段和衍生自VEGF受体(VEGFR)的VEGF结合片段，所述VEGF结合片段包含VEGFR的结构域2和结构域3(D2/3)。
在一些实施方案中，衍生自抗VEGF抗体的抗原结合片段可以选自scFv、Fab、Fab’、F(ab')2、Fd、Fd’、Fv、ds-scFv和dAb。
在一些实施方案中，所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列通过编码接头的核苷酸序列连接。
在一些实施方案中，所述第一VEGF结合区为衍生自抗VEGF抗体的抗原结合片段(例如scFv)，且所述第二VEGF结合区为衍生自另一不同的抗VEGF抗体的抗原结合片段(例如scFv)。
在一些实施方案中，所述第一VEGF结合区为衍生自抗VEGF抗体的抗原结合片段(例如scFv)，且所述第二VEGF结合区为衍生自VEGFR的VEGF结合片段。
在上述核酸构建体的一些实施方案中，所述核酸构建体还包含编码第三VEGF结合区的第三核苷酸序列，所述第三VEGF结合区选自衍生自抗VEGF抗体的抗原结合片段(例如scFv)和/或衍生自VEGFR的VEGF结合片段，所述VEGF结合片段包含VEGFR的D2/3。
在一些优选的实施方案中，所述第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列之间通过编码接头的核苷酸序列连接。
在一些实施方案中，所述第一VEGF结合区为衍生自抗VEGF抗体的抗原结合片段(例如scFv)，所述第二VEGF结合区为衍生自另一不同的抗VEGF抗体的抗原结合片段(例如scFv)，且所述第三VEGF结合区为衍生自VEGFR的VEGF结合片段。
在一些实施方案中，本发明的核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：
(1)scFv1；
(2)D2/3；
(3)D2/3-linker-scFv1；
(4)scFv1-linker-scFv2；
(5)scFv1-linker-D2/3；
(6)scFv1-linker-scFv2-linker-D2/3；
(7)scFv1-linker-D2/3-linker-scFv2；或
(8)D2/3-linker-scFv1-linker-scFv2，
其中，scFv1是编码衍生自抗VEGF抗体的scFv的核苷酸序列，scFv2是编码衍生自另一不同的抗VEGF抗体的scFv的核苷酸序列，D2/3是编码衍生自VEGFR的VEGF结合片段的核苷酸序列，所述VEGF结合片段包含VEGFR的D2/3，linker是编码接头的核苷酸序列，其中每个接头可以相同或不同。
在一些实施方案中，本发明的核酸构建体还可以包含编码抗体的Fc区的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述Fc区可以是选自以下抗体同种型的Fc区：IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。在一些实施方案中，所述Fc区可以是选自以下抗体亚型的Fc区：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在一个优选的实施方案中，所述Fc区为人IgG1的Fc区。
在一些优选的实施方案中，本发明的核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：
(1)scFv1-linker-Fc；
(2)D2/3-linker-Fc；
(3)D2/3-linker-scFv1-Fc；
(4)scFv1-linker-D2/3-Fc；
(5)scFv1-linker-scFv2-Fc；
(6)scFv1-linker-scFv2-linker-D2/3-Fc；
(7)scFv1-linker-D2/3-linker-scFv2-Fc；或
(8)D2/3-linker-scFv1-linker-scFv2-Fc，
其中，scFv1是编码衍生自抗VEGF抗体的scFv的核苷酸序列，scFv2是编码衍生自另一不同的抗VEGF抗体的scFv的核苷酸序列，D2/3是编码衍生自VEGFR的VEGF结合片段的核苷酸序列，所述VEGF结合片段包含VEGFR的D2/3，linker是编码接头的核苷酸序列，其中每个接头可以相同或不同，Fc是编码抗体Fc区的核苷酸序列。
在本发明的核酸构建体的实施方案中，所述抗VEGF抗体可以是任何特异性结合VEGF的抗体。在一些优选的实施方案中，所述抗VEGF抗体选自Brolucizumab，Ranibizumab或Aflibercept。
在一些优选的实施方案中，本发明的核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：
(1)D2/3；
(2)D2/3-Fc；
(3)BrolscFv；
(4)BrolscFv-Fc；
(5)RaniScFv；
(6)RaniScFv-Fc；
(7)D2/3-linker-RaniScFv；
(8)RaniScFv-linker-D2/3；
(9)BrolscFv-linker-RaniScFv-Fc；
(10)BrolscFv-linker-RaniScFv；
(11)RaniScFv-linker-BrolscFv；
(12)RaniScFv-linker-BrolscFv-Fc；
(13)D2/3-linker-RaniScFv-Fc；
(14)RaniScFv-linker-D2/3-Fc；
(15)D2/3-linker-BrolscFv-linker-RaniScFv-Fc；
(16)D2/3-linker-BrolscFv-linker-RaniScFv；
(17)BrolscFv-linker-D2/3-linker-RaniScFv；
(18)BrolscFv-linker-D2/3-linker-RaniScFv-Fc；
(19)RaniScFv-linker-BrolscFv-linker-D2/3；
(20)RaniScFv-linker-BrolscFv-linker-D2/3-Fc；
(21)BrolscFv-linker-D2/3；
(22)BrolscFv-linker-D2/3-Fc；
(23)D2/3-linker-BrolscFv；或
(24)BrolscFv-linker-D2/3，
其中，BrolscFv为编码衍生自Brolucizumab的scFv的核苷酸序列，RaniScFv为编码衍生自Ranibizumab的scFv的核苷酸序列，D2/3为编码衍生自VEGFR的VEGF结合片段的核苷酸序列，所述VEGF结合片段包含VEGFR的D2/3，linker是编码接头的核苷酸序列，其中每个接头可以相同或不同，Fc是编码抗体Fc区的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明的核酸构建体还可以在5’端包含编码N端信号序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述N端信号序列具有SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列。
相应地，在一些实施方案中，本发明的核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：
(1)signal-scFv1-linker-Fc；
(2)signal-D2/3-linker-Fc；
(3)signal-D2/3-linker-scFv1-Fc；
(4)signal-scFv1-linker-D2/3-Fc；
(5)signal-scFv1-linker-scFv2-Fc；
(6)signal-scFv1-linker-scFv2-linker-D2/3-Fc；
(7)signal-scFv1-linker-D2/3-linker-scFv2-Fc；或
(8)signal-D2/3-linker-scFv1-linker-scFv2-Fc，
其中，signal是编码5’端信号序列的核苷酸序列，scFv1是编码衍生自抗VEGF抗体的scFv的核苷酸序列，scFv2是编码衍生自另一不同的抗VEGF抗体的scFv的核苷酸序列，D2/3是编码衍生自VEGFR的VEGF结合片段的核苷酸序列，所述VEGF结合片段包含VEGFR的D2/3，linker是编码接头的核苷酸序列，其中每个接头可以相同或不同，Fc是编码抗体Fc区的核苷酸序列。
在一些优选的实施方案中，本发明的核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：
(1)signal-D2/3；
(2)signal-D2/3-Fc；
(3)signal-BrolscFv；
(4)signal-BrolscFv-Fc；
(5)signal-RaniScFv；
(6)signal-RaniScFv-Fc；
(7)signal-D2/3-linker-RaniScFv；
(8)signal-RaniScFv-linker-D2/3；
(9)signal-BrolscFv-linker-RaniScFv-Fc；
(10)signal-BrolscFv-linker-RaniScFv；
(11)signal-RaniScFv-linker-BrolscFv；
(12)signal-RaniScFv-linker-BrolscFv-Fc；
(13)signal-D2/3-linker-RaniScFv-Fc；
(14)signal-RaniScFv-linker-D2/3-Fc；
(15)signal-D2/3-linker-BrolscFv-linker-RaniScFv-Fc；
(16)signal-D2/3-linker-BrolscFv-linker-RaniScFv；
(17)signal-BrolscFv-linker-D2/3-linker-RaniScFv；
(18)signal-BrolscFv-linker-D2/3-linker-RaniScFv-Fc；
(19)signal-RaniScFv-linker-BrolscFv-linker-D2/3；
(20)signal-RaniScFv-linker-BrolscFv-linker-D2/3-Fc；
(21)signal-BrolscFv-linker-D2/3；
(22)signal-BrolscFv-linker-D2/3-Fc；
(23)signal-D2/3-linker-BrolscFv；或
(24)signal-BrolscFv-linker-D2/3，
其中，signal是编码5’端信号序列的核苷酸序列，BrolscFv为编码衍生自Brolucizumab的scFv的核苷酸序列，RaniScFv为编码衍生自Ranibizumab的scFv的核苷酸序列，D2/3为编码所述衍生自VEGFR的VEGF结合片段的核苷酸序列，所述VEGF结合片段包含VEGFR的D2/3，linker是编码接头的核苷酸序列，其中每个接头可以相同或不同，Fc是编码抗体Fc区的核苷酸序列。
在一些实施方案中，衍生自Brolucizumab的scFv包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的核酸构建体中的编码衍生自Brolucizumab的scFv的核苷酸序列具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:2具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，衍生自Ranibizumab的scFv包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的核酸构建体中的编码衍生自Ranibizumab的scFv的核苷酸序列包含如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:4具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，衍生自VEGFR的VEGF结合片段包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:5具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的核酸构建体中的编码衍生自VEGFR的VEGF结合片段的核苷酸序列包含如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:6具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，抗体Fc区包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:34具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，核酸构建体中包含的编码抗体Fc区的核苷酸序列包含如SEQ ID NO:35所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:35具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
在本发明的核酸构建体包含一个或多个接头的情况下，所述接头可以相同或者不同。在一些实施方案中，所述接头为可切割接头。在另一些实施方案中，所述接头为不可切割的接头。在一些实施方案中，所述接头为柔性接头。在另一些实施方案中，所述接头为刚性接头。
在一些优选的实施方案中，所述接头各自独立地选自(GS)n，(GGS)n，(GGGS)n，(GGGGS)n，(Gly)8，(Gly)6和(EAAAK)n，其中n为1-10，优选n为2-8，更优选n为4或5。
在一些具体的实施方案中，本发明的表达载体从5’端至3’端包含以下结构：D2/3-linker-RaniScFv，其中，RaniScFv为编码衍生自Ranibizumab的scFv的核苷酸序列，D2/3为编码衍生自VEGFR的VEGF结合片段的核苷酸序列，所述VEGF结合片段包含VEGFR的D2/3，linker是编码接头的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明的表达载体编码融合蛋白，所述融合蛋白包含如SEQID NO:13所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:13具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的表达载体包含如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:14具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明的核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：BrolscFv-linker-RaniScFv-Fc，其中，BrolscFv为编码衍生自Brolucizumab的scFv的核苷酸序列，RaniScFv为编码衍生自Ranibizumab的scFv的核苷酸序列，linker是编码接头的核苷酸序列，Fc是编码抗体Fc区的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明的表达载体编码融合蛋白，所述融合蛋白包含如SEQID NO:7所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的表达载体包含如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:8具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明的表达载体从5’端至3’端包含以下结构：BrolscFv-linker-RaniScFv，其中，BrolscFv为编码衍生自Brolucizumab的scFv的核苷酸序列，RaniScFv为编码衍生自Ranibizumab的scFv的核苷酸序列，linker是编码接头的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明的表达载体编码融合蛋白，所述融合蛋白包含如SEQID NO:9所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的表达载体包含如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:10具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明的表达载体从5’端至3’端包含以下结构：D2/3-linker-RaniScFv-Fc，其中，RaniScFv为编码衍生自Ranibizumab的scFv的核苷酸序列，D2/3为编码所述衍生自VEGFR的VEGF结合片段的核苷酸序列，所述VEGF结合片段包含VEGFR的D2/3，linker是编码接头的核苷酸序列，Fc是编码抗体Fc区的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明的表达载体编码融合蛋白，所述融合蛋白包含如SEQID NO:11所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:11具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的表达载体包含如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:12具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明的表达载体从5’端至3’端包含以下结构：D2/3-linker-BrolscFv-linker-RaniScFv-Fc，其中，BrolscFv为编码衍生自Brolucizumab的scFv的核苷酸序列，RaniScFv为编码衍生自Ranibizumab的scFv的核苷酸序列，D2/3为编码所述衍生自VEGFR的VEGF结合片段的核苷酸序列，所述VEGF结合片段包含VEGFR的D2/3，linker是编码接头的核苷酸序列，其中每个接头可以相同或不同，Fc是编码抗体Fc区的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明的表达载体编码融合蛋白，所述融合蛋白包含如SEQID NO:15所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:15具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的表达载体包含如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:16具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明的表达载体从5’端至3’端包含以下结构D2/3-linker-BrolscFv-linker-RaniScFv，其中，BrolscFv为编码衍生自Brolucizumab的scFv的核苷酸序列，RaniScFv为编码衍生自Ranibizumab的scFv的核苷酸序列，D2/3为编码所述衍生自VEGFR的VEGF结合片段的核苷酸序列，所述VEGF结合片段包含VEGFR的D2/3，linker是编码接头的核苷酸序列，其中每个接头可以相同或不同。
在一些实施方案中，本发明的表达载体编码融合蛋白，所述融合蛋白包含如SEQID NO:17所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:17具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的表达载体包含如SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:18具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明的表达载体从5’端至3’端包含以下结构：D2/3-linker-BrolscFv，其中，BrolscFv为编码衍生自Brolucizumab的scFv的核苷酸序列，D2/3为编码所述衍生自VEGFR的VEGF结合片段的核苷酸序列，所述VEGF结合片段包含VEGFR的D2/3，linker是编码接头的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明的表达载体编码融合蛋白，所述融合蛋白包含如SEQID NO:19所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:19具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的表达载体包含如SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:20具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明的表达载体从5’端至3’端包含以下结构：BrolscFv-linker-D2/3，其中，BrolscFv为编码衍生自Brolucizumab的scFv的核苷酸序列，D2/3为编码所述衍生自VEGFR的VEGF结合片段的核苷酸序列，所述VEGF结合片段包含VEGFR的D2/3，linker是编码接头的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明的表达载体编码融合蛋白，所述融合蛋白包含如SEQID NO:21所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:21具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的表达载体包含如SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:22具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明的表达载体还包含启动子序列，用于所述核苷酸序列的表达。在一些实施方案中，所述启动子选自CBH、CMV、CAGG、CAG、RPE65和VMD2启动子。在优选的实施方案中，所述启动子为CAGG。
在一些实施方案中，所述CBH启动子具有如SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述CMV启动子具有如SEQ ID NO:29所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述CAGG启动子具有如SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述CAG启动子具有如SEQ ID NO:31所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述RPE65启动子具有如SEQ ID NO:32所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述VMD2启动子具有如SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明的表达载体为病毒载体。在一些实施方案中，本发明的表达载体为在宿主细胞中能够稳定表达的病毒载体。
在一些实施方案中，本发明的表达载体选自牛乳头瘤病毒载体、EB病毒载体、逆转录病毒载体(例如慢病毒载体)和腺相关病毒载体。
在一些实施方案中，本发明的表达载体为慢病毒表达载体。在一些优选的实施方案中，所述慢病毒载体还包含选自嵌合型LTR启动子、HIV-1包装信号(ψ)、中心聚嘌呤区(cPPT)、Rev应答元件(RRE)、多嘌呤片段(PPT)、土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件(WPRE)、SV40病毒的多腺苷酸化信号(SV40 pA signal)、SV40病毒的复制起始位点(SV40 ori)和自失活长末端重复序列中的一个或多个元件。
在另一些实施方案中，本发明的表达载体为腺相关病毒(AAV)载体。在一些优选的实施方案中，所述腺相关病毒载体还包含选自SV40病毒的多腺苷酸化信号(SV40SL)和反向末端重复序列(ITR)的一个或多个元件。
在第二方面，本发明提供一种病毒颗粒。本发明的病毒颗粒包含如本发明第一方面所述的表达载体。在一些优选的实施方案中，本发明的病毒颗粒是慢病毒颗粒或腺相关病毒颗粒。
在第三方面，本发明提供了一种细胞，所述细胞包含如本发明第一方面所述的表达载体。
在一些实施方案中，本发明的细胞包含本发明所述的腺相关病毒表达载体，并且还包含用于将所述腺相关病毒表达载体组装到病毒颗粒中的血清型质粒和/或辅助质粒。
在另一些实施方案中，本发明的细胞包含本发明所述的慢病毒表达载体，并且还包含用于将所述慢病毒表达载体组装到慢病毒颗粒中的包膜质粒和/或包装质粒。
在第四方面，本发明提供了一种细胞，其已经使用如本发明第二方面所述的病毒颗粒感染。在一些实施方案中，所述的细胞为视网膜细胞。在优选的实施方案中，所述的细胞为人视网膜色素上皮细胞。
在第五方面，本发明提供一种载体系统，其包含本发明所述的表达载体，和任选地一种或多种另外的载体例如质粒。在一些实施方案中，所述载体系统进一步包含宿主细胞，优选地所述宿主细胞是293T细胞。
在一些实施方案中，所述载体系统是慢病毒载体系统。在一些实施方案中，所述慢病毒载体系统包括慢病毒表达载体和辅助质粒。在一些实施方案中，所述辅助质粒包含编码gag和pol蛋白的一个或者多个核苷酸序列以及任选地编码其它病毒包装组件的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述辅助质粒可以包括包装质粒和/或包膜质粒。在一些实施方案中，所述慢病毒载体系统还包括宿主细胞，所述宿主细胞可以为生产慢病毒的细胞，例如可以为293T细胞。
在一些实施方案中，所述载体系统是腺相关病毒(AAV)载体系统。在一些实施方案中，所述AAV载体系统包括AAV表达载体以及血清型质粒和/或辅助质粒。在一些实施方案中，所述辅助质粒包含编码病毒包装组件的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述血清型质粒选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9血清型。在一些实施方案中，所述AAV载体系统还包括宿主细胞，所述宿主细胞可以为生产腺相关病毒的细胞，例如可以为293T细胞。
在第六方面，本发明提供了一种组合物(例如药物组合物)，其包含如本发明第一方面所述的表达载体、如本发明第二方面所述的病毒颗粒、如本发明第三方面或第四方面所述的细胞、或如本发明第五方面所述的载体系统。任选地，本发明的组合物还包含药学上可接受的载剂和/或赋形剂。
在第七方面，本发明提供了一种用于眼内递送的系统，其包括：如本发明第一方面所述的表达载体、如本发明第二方面所述的病毒颗粒、如本发明第三方面或第四方面所述的细胞、如本发明第五方面所述的载体系统、或如本发明第六方面所述的组合物；和b)用于眼内递送的装置。
在一些实施方案中，所述用于眼内递送的装置选自用于玻璃体内递送的装置、用于视网膜下腔递送的装置和用于脉络膜上腔递送的装置。
在第八方面，本发明提供了一种用于受试者中治疗年龄相关性黄斑变性的方法，其包括向受试者的眼内施用如本发明第一方面所述的表达载体、如本发明第二方面所述的病毒颗粒、如本发明第三方面或第四方面所述的细胞、本发明第五方面所述的载体系统、或如本发明第六方面所述的组合物的步骤。在一些实施方案中，所述年龄相关性黄斑变性为湿性黄斑变性。
在一些优选的实施方案中，所述表达载体、病毒颗粒、细胞、载体系统或组合物被施用到所述受试者的玻璃体内和/或视网膜下腔和/或脉络膜上腔。
附图说明
图1示出了基于HIV-1的第三代复制缺陷型的自我失活型假包膜慢病毒载体KL-Kan-BB的图谱。
图2示出了携带不同融合蛋白的或单一抗VEGF剂的编码序列、基于KL-Kan-BB的慢病毒载体的构建体的示意图。
图3示出了腺相关病毒载体pAAV-MCS的图谱。
图4示出了携带不同融合蛋白或或单一抗VEGF剂的编码序列、基于腺相关病毒载体pAAV-MCS的构建体的示意图。
图5示出了本发明的融合蛋白1至融合蛋白8在通过慢病毒或AAV在细胞中进行感染表达后，预期的成熟融合蛋白的分子结构的示意图。
图6示出了慢病毒表达载体pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白3、pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白4和pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白7转染细胞后，通过考马斯亮蓝染色检测的细胞表达的相应抗VEGF蛋白。
图7示出了通过Western Blot检测抗VEGF蛋白表达时的蛋白上样信息。
图8示出了慢病毒表达载体pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白1至pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白8、pKL-Kan-BB-CAGG-Ranibizumab或pKL-Kan-BB-CAGG-Aflibercept转染细胞后，通过Western Blot检测的细胞表达的相应抗VEGF蛋白。
图9示出了慢病毒表达载体pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白1至pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白8、pKL-Kan-BB-CAGG-Ranibizumab或pKL-Kan-BB-CAGG-Aflibercept转染细胞后，通过Western Blot检测的细胞表达的相应抗VEGF蛋白与VEGF的结合情况。
图10示出了分别包含pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白1至pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白8、pKL-Kan-BB-CAGG-Ranibizumab或pKL-Kan-BB-CAGG-Aflibercept构建体的慢病毒颗粒转导细胞后，细胞表达的相应抗VEGF蛋白的水平。
图11示出了分别包含pAAV-MCS-CAGG-融合蛋白1至pAAV-MCS-CAGG-融合蛋白8、pAAV-MCS-CAGG-Ranibizumab或pAAV-MCS-CAGG-Aflibercept构建体的腺相关病毒颗粒转导细胞后，细胞表达的相应抗VEGF蛋白的水平。
图12示出了分别包含pAAV-MCS-CAGG-融合蛋白4、pAAV-MCS-CAGG-Ranibizumab或pAAV-MCS-CAGG-Aflibercept构建体的腺相关病毒颗粒转导细胞后，细胞表达的相应抗VEGF蛋白的水平。
图13示出了分别将AAV稀释液、包含pAAV-MCS-CAGG-融合蛋白4和pAAV-MCS-CAGG-Aflibercept构建体的腺相关病毒颗粒注射到大鼠玻璃体后，4w玻璃体内目标蛋白的表达水平。
图14示出了FFA造影评分方法对眼部进行的分区。
图15示出了对荷兰兔进行造模并给药后2周，左右眼的FFA造影结果。
图16示出了对荷兰兔进行造模并给药后，不同时间点采集的右眼房水中目标蛋白的含量。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。
为了更容易理解本公开，下面首先定义某些术语。在整个说明书中阐述了以下术语和其他术语的附加定义。
如本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物，除非上下文另有明确规定。
在本文中，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即意味着“包括但不限于”)。
如本文所用，“和/或”是指并且包括相关联的所列项目中的一个或多个项目的任意和所有可能组合。例如，组合物包含A和/或B可以解释为组合物包含A、组合物包含B或组合物包含A和B。
所有的数字名称，例如pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围，都是近似值，其以1.0或0.1的增量适当地，或以+/-15％、10％、5％、2％的变化可选地改变(+)或(-)。应当理解，所有的数字名称前面都有术语“约”。还应理解，本文所述的试剂仅是示例性的，并且其等同物是本领域已知的。当涉及可测量值如量或浓度等时，本文所用的术语“约”是指包括指定量的20％、10％、5％、1％、0.5％或0.1％之内的变化。
如本文所用，术语“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”、“核苷酸序列”和“多核苷酸”可以互换使用，并且指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。因此，该术语包括但不限于单链、双链或双链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体或包含、由或基本上由嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基组成的聚合物。
术语“蛋白质”、“肽”、“多肽”和“氨基酸序列”可以互换使用，并且在其最广泛的意义上是指两个或更多个氨基酸亚基、氨基酸类似物或肽模拟物的聚合形式。“蛋白质”、“肽”、“多肽”和“氨基酸序列”含有至少两个氨基酸，并且对氨基酸的最大数目没有限制。本文所用术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括D和L光学异构体和氨基酸类似物。
如本文所用，“表达”是指核酸序列被转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽、氨基酸序列或蛋白质的过程。如果核酸序列来自基因组DNA，则表达可包括在真核细胞中剪接mRNA。
当术语“编码”应用于核酸序列时，是指如果在其天然状态下或当通过本领域技术人员熟知的方法操作时，其可以被转录以产生mRNA和/或被翻译以产生多肽，则称其为“编码”多肽的核酸序列。反义链是这种核酸的互补物，并且可以从其推导出编码序列。
“同源性”或“同一性”是指两个多肽之间或两个核酸序列之间的序列相似性。同一性百分比可以通过比较每个序列中的位置来确定，所述序列可以为了比较的目的而比对。当被比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是相同的。序列之间的同一性程度取决于共享的匹配位置数目。“无关”或“非同源”序列与本发明的序列之一共享小于40％的同一性、小于25％的同一性。通过将核酸或氨基酸序列导入ClustalW(可从https://genome.jp/tools-bin/clustalw/获得)并使用该ClustalW，可以确定本文提供的核酸或氨基酸序列的比对和序列同一性百分比。
本文所用的术语“启动子”是指表达控制序列，其控制基因或转基因的转录的起始和速率。启动子可以是例如组成型的、诱导型的、阻遏型的或组织特异性的。启动子可以含有调节蛋白和分子如RNA聚合酶和转录因子可以结合的遗传元件。
启动子的非限制性示例性包括pol I启动子、pol II启动子、pol III启动子、T7启动子、U6启动子、H1启动子、逆转录病毒劳斯肉瘤病毒LTR启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、延伸因子1α短(EFS)启动子、β葡萄糖醛酸酶(GUSB)启动子、巨细胞病毒(CMV)即早期(IE)增强子和/或启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子或其衍生物如CAG启动子、CB启动子、(人)延伸因子1α-亚基(EF1α)启动子、泛素C(UBC)启动子、朊病毒启动子、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝轻链(NFL)启动子、神经丝重链(NFH)启动子、血小板衍生生长因子(PDGF)启动子、血小板衍生生长因子B链(PDGF-β)启动子、突触蛋白(Syn)启动子、突触蛋白1(Syn1)启动子、甲基-CpG结合蛋白2(MeCP2)启动子、Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)启动子、代谢型谷氨酸受体2(mGluR2)启动子、神经丝轻链(NFL)启动子、神经丝重链(NFH)启动子、β-珠蛋白小基因nβ2启动子、前脑啡肽原(PPE)启动子、脑啡肽(Enk)启动子、兴奋性氨基酸转运蛋白2(EAAT2)启动子、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子、髓鞘碱性蛋白(MBP)启动子、或其功能片段。
本领域已知，可以修饰这些启动子的核苷酸序列以提高或降低mRNA转录的效率。合成来源的启动子可用于普遍存在的或组织特异性表达。此外，病毒来源的启动子，其中一些如上所述，可用于本文公开的方法中，例如CMV、HIV、腺病毒和AAV启动子。在实施方案中，启动子与增强子一起使用可以增加转录效率。增强子的非限制性实例包括间隙类视黄醇结合蛋白(IRBP)增强子、RSV增强子或CMV增强子。
如本文所用，“poly A信号”、“多腺苷酸化信号”或“多聚腺苷酸化信号”是指位于最3’编码区下游的RNA序列，并由RNA切割复合物识别，所述复合物通过RNA聚合酶(如PolII)切割新转录的RNA的3’末端序列，从而可以发生聚腺苷酸化。然后，通过将腺苷一磷酸单元从ATP添加到RNA的新生切割的3’端，聚腺苷酸聚合酶添加并延伸聚A尾。由RNA切割复合物识别的聚A信号序列在不同的真核生物组中存在不同，大多数人聚腺苷酸化位点含有AAUAAA序列，尽管这种序列在植物和真菌mRNA中不太常见。由RNA切割复合物识别以使RNA切割以及随后的聚腺苷酸化的所有这些序列基序都在聚A信号序列的范围内。
示例性的多腺苷酸化信号包括牛生长激素聚腺苷酸化信号(bGH poly A)、小聚A信号(SPA)、人生长激素聚腺苷酸化信号(hGH poly A)、SV40病毒的多腺苷酸化信号(SV40poly A)、兔β珠蛋白聚A序列(rBG poly A)、或它们的变体。
在本文中，术语“患者”和“受试者”可互换使用并且以其常规意义使用，指患有或容易患有可通过施用本发明的病毒载体或病毒颗粒或组合物进行预防或治疗的病症的生物体，并且包括人和非人动物。
在一个实施方式中，受试者是非人动物(例如，黑猩猩和其他猿和猴物种；农场动物，如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，例如狗和猫；实验动物包括啮齿类动物，如小鼠、大鼠和豚鼠；禽类，包括家禽、野禽和猎禽，如鸡、火鸡和其他鸡类、鸭、鹅等)。在一个实施方式中，受试者是哺乳动物。在一个实施方式中，受试者是人。
在本文中，术语“施用”旨在表示将物质递送至受试者，诸如动物或人。施用可以在整个治疗过程中以单一剂量、连续或间歇地进行。确定最有效的施用方式和剂量的方法是本领域技术人员已知的，并且将随着用于治疗的组合物、治疗目的以及被治疗的受试者的年龄、健康或性别等因素而变化。在一些实施方案中，可以进行单次或多次施用，其剂量水平和模式由医师选择，或者在宠物和其它动物的情况下，由兽医选择。
在本文中，术语“治疗”包括：(1)抑制病状、疾病或者病症，即，阻止、减少或者延迟疾病的发展或其复发或者其至少一种临床或者亚临床症状的发展；或者(2)缓解疾病，即，引起病状、疾病或者病症或者其临床或者亚临床症状中的至少一种消退。
在本文中，术语“改善”指与疾病有关的症状的改善，并且可以指至少一种衡量或定量该症状的参数的改善。
在本文中，术语“预防”病状、疾病或者病症包括：预防、延迟或者减少受试者中发展的病状、疾病或者病症的至少一种临床或者亚临床症状出现的发生率和/或可能性，该受试者可能患有或易患该病状、疾病或者病症但尚未经历或者表现出该病状、疾病或者病症的临床或亚临床症状。
在本文中，术语“载体”是指包裹多核苷酸的一个或一系列大分子，其促进多核苷酸在体外或体内递送到靶细胞中。载体的分类包括但不限于质粒、病毒载体、脂质体和其他基因递送载体。待递送的多核苷酸有时被称为“转基因(transgene)”，包含但不限于可以增强、抑制、削弱、保护、触发或预防某些生物学功能和生理机能的某些蛋白质或合成多肽的编码序列、疫苗开发中感兴趣的编码序列(例如表达适于在哺乳动物中引发免疫应答的蛋白、多肽或肽的多核苷酸)、RNAi组分的编码序列(例如，shRNA、siRNA、反义寡核苷酸)，或可选的标记。
如本文所用，“病毒载体”是指能够被包装而重组产生病毒颗粒的载体，其含有将在体内、离体或体外递送至宿主细胞中的多核苷酸。病毒载体的实例包括逆转录病毒载体、AAV载体、慢病毒载体、腺病毒载体、甲病毒载体等。
在本文中，术语“转导”、“转染”和“转化”是指异源多核苷酸被递送至宿主细胞发生转录和翻译产生多肽产物的过程，包括利用重组病毒将异源多核苷酸引入宿主细胞。
在本文中，术语“感染”是指包含多核苷酸组分的病毒或病毒颗粒将多核苷酸递送至细胞中并产生其RNA和蛋白质产物的过程，也可指病毒在宿主细胞中的复制过程。
“感染复数”(缩写为MOI)在本文中是指用病毒感染细胞时加入的病毒与细胞数量的比值。
术语“病毒拷贝数(virus copy number或VCN)”在本文中是指：整合到目标细胞内的病毒载体基因组，它测量基因修饰细胞中存在的转基因的遗传剂量。
术语病毒“滴度”在本文中是指单位体积液体中有感染能力的病毒载体颗粒数目。本文中特指每毫升病毒载体产品中具有确定转导能力的病毒载体颗粒数目，即转导单位(TU)每毫升(TU/ml)。
术语病毒“转导单位(TU)”在本文中是指：能够感染并整合到细胞基因组内的病毒载体颗粒。
术语“表达框架”是指具有编码蛋白质潜能的序列。
在本文中，慢病毒载体(Lentiviral vector)包括在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效的将目的基因(或RNAi)导入动物和人的原代细胞或细胞系。慢病毒载体基因组是正链RNA，其基因组进入细胞后，在细胞浆中被其自身携带的反转录酶反转为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白。
另外，慢病毒载体能有效感染并整合到非分裂细胞中。以上特性使慢病毒载体与其它病毒载体相比，比如不整合的腺病毒载体、整合率低的腺相关病毒载体、只整合分裂细胞的传统逆转录病毒载体，有鲜明的特色。大量文献研究表明，慢病毒载体介导的目的基因长期表达的组织或细胞包括脑、肝脏、肌肉、视网膜、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、巨噬细胞等。慢病毒载体不表达任何HIV-1蛋白，免疫原性低，在注射部位无细胞免疫反应，体液免疫反应也较低，不影响病毒载体的第2次注射。
“腺相关病毒”或“AAV”属于依赖性细小病毒(Dependoparvovirus)属，细小病毒(Parvoviridae)科。AAV是单链DNA病毒，由病毒基因组和衣壳构成。AAV基因组包括rep基因和cap基因，两侧有两个末端反向重复(ITR)。其中，rep基因编码的Rep蛋白与病毒的复制以及包装有关，cap基因编码病毒的衣壳蛋白。“ITR”或“反向末端重复”可以形成T形回文结构，参与AAV的复制和包装过程，其通常是完成AAV的裂解和潜伏生命周期所必需的。AAV本身是复制缺陷型的，在没有辅助病毒存在的情况下只能在宿主细胞呈潜伏状态。因此，AAV载体的生产通常需要辅助质粒(helper)提供参与AAV复制的关键基因以及血清型质粒提供编码AAV颗粒的衣壳蛋白。
目前已经发现的AAV存在十几种常见血清型以及上百种变种，它们的主要区别在于编码衣壳蛋白的cap基因的不同。AAV的血清型主要由衣壳蛋白的结构所决定，这些血清型包括但不限于：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAVrh10、AAV-DJ、AAV-DJ/B、AAV PHP.B、AAV PHP.eB、AAV PHP.S、AAVrh74。
在本文中，“AAV载体”和“重组AAV(rAAV)载体”可以互换使用，意指包含一个或多个异源核酸序列和一个或多个ITR的载体。当AAV载体存在于宿主细胞中时，在辅助质粒和血清型质粒的帮助下，携带目的基因的AAV载体可以被复制并包装到感染性病毒颗粒中。
术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断的范围内适合用于与人和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、变应性应答或其它问题或并发症，与合理的益处/风险比相称的载剂、赋形剂或稀释剂。
用于本发明的组合物中的示例性载剂包括盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。用于本发明的组合物中的示例性赋形剂包括填充剂、粘合剂、崩解剂、包衣剂、吸附剂、抗粘附剂、助流剂、防腐剂、抗氧化剂、调味剂、着色剂、甜味剂、溶剂、共溶剂、缓冲剂、螯合剂、粘度赋予剂、表面活性剂、稀释剂、润湿剂、载体、稀释剂、防腐剂、乳化剂、稳定剂和张力调节剂。本领域技术人员已知选择合适的赋形剂以制备本发明的组合物。通常，合适的赋形剂的选择尤其取决于所使用的活性剂、待治疗的疾病和组合物的期望剂型。
本发明的病毒载体、细胞、递送系统、或病毒颗粒被眼内递送到受试者中。在一些实施方案中，可以通过视网膜下腔递送、脉络膜上腔递送或玻璃体内递送。
视网膜下腔递送的方法是本领域已知的。例如参见WO 2009/105690，其通过提述并入本文。通常，可将本发明所述的表达载体以眼内(视网膜下)注射的组合物的形式在使用手术显微镜的直接观察下递送。
用于玻璃体内注射的步骤是本领域已知的(参见例如Peyman,G.A等(2009)Retina29(7):875-912，和Fagan,X.J和Al-Qureshi,S.(2013)Clin.Experiment.Ophthalmol.41(5):500-7)。简言之，玻璃体内注射的受试者可准备进行瞳孔扩张、眼的消毒和施用麻醉的步骤。本领域已知的任何合适的散瞳剂均可用于瞳孔扩张。可在治疗前证实充分散瞳。灭菌可通过消毒的眼治疗例如含碘溶液如聚维酮碘实现。还可用类似的方案来清洁眼睑、睫毛和附近的任何其他组织(例如皮肤)。可以任何适当的浓度来使用任何合适的麻醉剂，如利多卡因或丙美卡因。麻醉剂可通过本领域已知的任何方法施用，包括但不限于局部滴剂(drop)、凝胶(gel)或胶状物(jelly)，和结膜下施用麻醉剂。在注射前，可将灭菌的眼睑窥器用于清除(clear)所述区域的睫毛。注射的位点可用注射器标记。注射的位点可基于患者的晶状体(lens)来选择。例如，注射位点可距离人工晶状体眼或无晶状体眼患者中的(角膜)缘(limbus)3-3.5mm，和距有晶状体眼患者中的(角膜)缘3.5-4mm。
下面结合附图和实施例对本公开作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本公开而不用于限制本公开的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，系按照本领域已知的常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行操作。
实施例
实施例1.包含抗VEGF的融合蛋白的慢病毒载体和腺相关病毒载体的设计
根据Ranibizumab、Aflibercept(VEGFR D2/3-Fc)和Brolucizumab的序列为基础设计两个或三个VEGF结合区，通过(G4S)5作为接头连接各个VEGF结合区，从而形成融合蛋白。融合蛋白构建体的结构如表1所示。
表1.编码结合VEGF的融合蛋白的构建体的结构
选择CAGG启动子作为这些序列表达的启动子。将这些基因表达框架设计插入基于HIV-1的第三代复制缺陷型的自我失活型假包膜慢病毒载体KL-Kan-BB中。该慢病毒载体骨架的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示。如图1所示，该慢病毒载体包含嵌合型LTR启动子、HIV-1包装信号(ψ)、中心聚嘌呤区(cPPT)、Rev应答元件(RRE)、多嘌呤片段(PPT)、土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件(WPRE)、SV40病毒的多腺苷酸化信号(SV40 pA signal)、SV40病毒的复制起始位点(SV40 ori)和自失活长末端重复序列。
构建多种慢病毒载体，如图2所示，其分别包含编码结合VEGF的融合蛋白(融合蛋白1至融合蛋白8)的核苷酸序列，或包含仅编码衍生自Ranibizumab的scFv的核苷酸序列、或编码衍生自VEGFR的VEGF结合片段即VEGFR D2/3和Fc的核苷酸序列。
将这些携带融合蛋白1至融合蛋白8之一的编码序列的慢病毒载体分别命名为pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白1至pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白8。将仅携带编码衍生自Ranibizumab的scFv的核苷酸序列和编码衍生自VEGFR的VEGF结合片段即VEGFR D2/3和Fc的核苷酸序列的慢病毒载体分别命名为pKL-Kan-BB-CAGG-Ranibizumab和pKL-Kan-BB-CAGG-Aflibercept。
还将这些基因表达框设计插入腺相关病毒载体pAAV-MCS中。腺相关病毒载体pAAV-MCS骨架的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示。如图3所示，该AAV载体包含SV40病毒的多腺苷酸化信号(SV40SL)、反向末端重复序列(ITR)等元件。
构建多种AAV载体，如图4所示，其分别包含编码结合VEGF的融合蛋白(融合蛋白1至融合蛋白8)的核苷酸序列或包含仅编码衍生自Ranibizumab的scFv的核苷酸序列或编码衍生自VEGFR的VEGF结合片段即VEGFR D2/3和Fc的核苷酸序列。将这些携带融合蛋白1至融合蛋白8之一的编码序列的AAV载体分别命名为pAAV-MCS-CAGG-融合蛋白1至pAAV-MCS-CAGG-融合蛋白8。将仅携带编码衍生自Ranibizumab的scFv的核苷酸序列和编码衍生自VEGFR的VEGF结合片段即VEGFR D2/3和Fc的核苷酸序列的AAV载体分别命名为pAAV-MCS-CAGG-Ranibizumab和pAAV-MCS-CAGG-Aflibercept。
这些基因表达载体通过慢病毒或AAV在细胞中进行感染表达后，预期成熟的结合VEGF的融合蛋白的分子结构如图5所示。
实施例2.包含抗VEGF分子的慢病毒载体的构建
将实施例1中设计的包含编码结合VEGF的融合蛋白的基因表达框架及启动子CAGG克隆至慢病毒载体中。慢病毒载体骨架为来源于康霖生物科技(杭州)有限公司的第三代慢病毒骨架——pKL-Kan-BB(核苷酸序列为SEQ ID NO:23)(见图1)。
实施例1设计的包含编码结合VEGF的融合蛋白1的核苷酸序列的基因表达框架构建体1(含CAGG启动子)，经南京金斯瑞生物技术有限公司合成后，通过本领域熟知的同源重组方法克隆至慢病毒表达载体pKL-Kan-BB上的多克隆位点XhoI/SalI之间，克隆完成后测序以确认序列信息，将构建的慢病毒表达载体命名为pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白1。
实施例1设计的包含编码结合VEGF的融合蛋白2至8的核苷酸序列的基因表达框架构建体2至8，经南京金斯瑞生物技术有限公司合成后，通过本领域熟知的同源重组方法分别替换克隆至慢病毒表达载体pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白1上的多克隆位点AgeI/SalI之间，克隆完成后测序以确认序列信息，将构建的慢病毒表达载体分别命名为pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白2至8。
实施例1设计的衍生自Ranibizumab的scFv的核酸编码序列，经南京金斯瑞生物技术有限公司合成后，通过本领域熟知的同源重组方法替换克隆至慢病毒表达载体pKL-Kan-BB-CAGG-scFv1上的多克隆位点AgeI/SalI之间，克隆完成后以测序确认序列信息，命名为pKL-Kan-BB-CAGG-Ranibizumab。
实施例1设计的编码衍生自VEGFR的VEGF结合片段即VEGFR D2/3和Fc的核酸序列，经南京金斯瑞生物技术有限公司合成后，通过本领域熟知的同源重组方法替换克隆至慢病毒表达载体pKL-Kan-BB-CAGG-scFv1上的多克隆位点AgeI/SalI之间，克隆完成后以测序确认序列信息，命名为pKL-Kan-BB-CAGG-Aflibercept。
实施例3：包含抗VEGF分子的基因的AAV载体的构建
将实施例1中设计的包含编码结合VEGF的融合蛋白的核苷酸序列的基因表达框架及启动子CAGG克隆至AAV载体中。AAV载体骨架为来源于康霖生物科技(杭州)有限公司的pAAV-MCS(核苷酸序列SEQ ID NO:24)，见图3。
实施例1设计的包含编码结合VEGF的融合蛋白1的核苷酸序列的基因表达框架构建体1，经南京金斯瑞生物技术有限公司合成后，通过本领域熟知的同源重组方法克隆至腺相关病毒表达载体pAAV-MCS上的多克隆位点MluI/SalI之间，克隆完成后以测序确认序列信息，命名为pAAV-MCS-CAGG-融合蛋白1。
实施例1设计的包含编码结合VEGF的融合蛋白2至8的核苷酸序列的基因表达框架构建体2至8，经南京金斯瑞生物技术有限公司合成后，通过本领域熟知的同源重组方法分别替换克隆至腺相关病毒表达载体pAAV-MCS-CAGG-融合蛋白1的多克隆位点AgeI/SalI之间，克隆完成后以测序确认序列信息，分别命名为pAAV-MCS-CAGG-融合蛋白2至8。
实施例1设计的衍生自Ranibizumab的scFv的核酸编码序列，经南京金斯瑞生物技术有限公司合成后，通过本领域熟知的同源重组方法替换克隆至腺相关病毒表达载体pAAV-MCS-CAGG-融合蛋白1的多克隆位点AgeI/SalI之间，克隆完成后以测序确认序列信息，命名为pAAV-MCS-CAGG-Ranibizumab。
实施例1设计的包含编码衍生自VEGFR的VEGF结合片段即VEGFR D2/3和Fc的核酸序列，经南京金斯瑞生物技术有限公司合成后，通过本领域熟知的同源重组方法替换克隆至腺相关病毒表达载体pAAV-MCS-CAGG-融合蛋白1的多克隆位点AgeI/SalI之间，克隆完成后以测序确认序列信息，命名为pAAV-MCS-CAGG-Aflibercept。
实施例4：包含抗VEGF分子基因的蛋白鉴定
将实施例2中构建的包含编码结合VEGF的融合蛋白的核苷酸序列的慢病毒表达载体(pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白1至pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白8)之一或包含编码衍生自Ranibizumab的scFv或衍生自VEGFR的VEGF结合片段即VEGFR D2/3和Fc的慢病毒表达载体(pKL-Kan-BB-CAGG-Ranibizumab或pKL-Kan-BB-CAGG-Aflibercept)瞬转293T细胞(购自美国模式菌种收集中心(ATCC)，保藏号为CRL-3216)。在该293T细胞系中进行抗VEGF分子基因蛋白的表达。转染方法为PEI阳离子聚合物介导的真核细胞瞬时转染，PEI阳离子聚合物为购自Polysciences的PEI-Max转染试剂(购自Polysciences，货号：24765-1)，转染操作参照生产商推荐标准化操作进行，转染规模为细胞培养用6孔板。
转染完成48小时后，收获蛋白上清。首先在台式吊桶式离心机上，室温4000rpm离心5分钟去除细胞碎片，收集上清冻存于-80℃备用。
通过本领域熟知的方法，对细胞上清进行如下两种Western Blot鉴定：
1.直接用细胞上清上样进行鉴定，具体操作如下：
(1)SDS-PAGE跑胶
分别取1ug融合蛋白3；5ug、1ug、0.5ug融合蛋白4、融合蛋白7进行蛋白跑胶，跑胶结束后进行考马斯亮蓝染色，染色结束后进行脱色过夜。结果见图6。
(2)Western Blot验证
1)取40uL细胞上清+10uL Loading Buffer；另取稀释后融合蛋白3、融合蛋白4、融合蛋白7样品和Loading Buffer混匀后各20uL进行上样，上样信息如图7所示。
2)5％脱脂牛奶封闭，洗三次。
3)根据膜上的Marker印记对膜进行裁剪，不同的膜使用不同抗体进行孵育，具体为孔道1-4使用羊抗人IgG(Fc)(1:10000)进行孵育；孔道6-10使用ProteinL-HRP(1:10000)进行孵育；孔道12使用山羊抗人IgG(Fab)(1:5000)二抗进行孵育；洗三次。
4)曝光。
实验结果(图8)表明细胞瞬转所得的蛋白大小均符合预期，为正确条带。
2.VEGF165蛋白上样对细胞上清进行鉴定
1)取10uL VEGF165蛋白+190uL DPBS+50uL Loading Buffer上样，所用VEGF165蛋白为重组人VEGF165蛋白(近岸蛋白质科技有限公司；货号为C083)，每孔上样20uL，与Marker间隔上样。
2)5％脱脂牛奶封闭，洗三次。
3)根据膜上的Marker印记对膜进行裁剪，每个膜使用含有不同细胞上清的2.5％脱脂牛奶作为一抗进行孵育，洗三次。
4)一抗为含pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白1、pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白3、pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白5、pKL-Kan-BB-CAGG-Aflibercept细胞上清的条带使用羊抗人IgG(Fc)(1:10000)二抗进行孵育；一抗为含pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白2、pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白4、pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白6、pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白7、pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白8细胞上清的条带使用ProteinL-HRP(1:10000)二抗进行孵育；一抗为含pKL-Kan-BB-CAGG-Ranibizumab细胞上清的条带使用山羊抗人IgG(Fab)(1:5000)二抗进行孵育；洗三次。
5)曝光。
实验结果(图9)表明细胞瞬转所得的蛋白均可与VEGF165蛋白结合。
实施例5：包含抗VEGF分子基因的慢病毒载体的病毒包装
将实施例2中构建的包含编码结合VEGF的融合蛋白的核苷酸序列的慢病毒表达载体(pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白1至pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白8)之一或包含编码衍生自Ranibizumab的scFv或衍生自VEGFR的VEGF结合片段即VEGFR D2/3和Fc的慢病毒表达载体(pKL-Kan-BB-CAGG-Ranibizumab或pKL-Kan-BB-CAGG-Aflibercept)，以及包膜质粒(pKL-Kan-Vsvg，其核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示)和包装质粒(pKL-Kan-pLP2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示；和pKL-Kan-pLP1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示)同时共转染293T细胞(购自美国模式菌种收集中心(ATCC)，保藏号为CRL-3216)。在该293T细胞系中进行抗VEGF分子基因治疗慢病毒载体的包装。转染方法为PEI阳离子聚合物介导的真核细胞瞬时转染，PEI阳离子聚合物为购自Polysciences的PEI-Max转染试剂(购自Polysciences，货号：24765-1)，转染操作参照生产商推荐标准化操作进行，转染规模为10cm2细胞培养皿。
转染完成48小时后，收获慢病毒载体。首先在台式吊桶式离心机上，室温4000rpm离心5分钟去除细胞碎片，再将上清在4℃10000g离心4小时获得病毒颗粒沉淀。去除上清后，将1mL DMEM完全培养基加入病毒颗粒沉淀中，以微量进样器重悬病毒颗粒，并将制备好的病毒重悬液分装，冻存于-80℃备用。
首先确定制备好的病毒重悬液的感染滴度，即单位体积液体中有感染能力的病毒载体颗粒数目-TU/ml。其原理为将人CD4+T细胞系(MT4细胞系，购自上海素尔生物科技有限公司)预铺于96孔板中(1E5个细胞/孔)，然后将梯度稀释的待测病毒重悬液添加到96孔板中以感染MT4细胞，随后以定量PCR检测靶细胞中的慢病毒载体拷贝数，通过代入已知感染滴度的EGFP报告基因感染滴度/载体拷贝数标准曲线来推算慢病毒感染靶细胞的感染效率。
报告基因慢病毒载体EGFP(以pCCL-sin-EF1α-WPRE-EGFP按照上述方法包装的慢病毒载体)感染效率标准曲线包括以感染流式测定GFP信号百分比，以及以定量PCR检测感染慢病毒后MT4细胞的VCN。根据流式GFP表达结果和qPCR的VCN结果，绘制转导效率和VCN的线性关系，按直线关系拟合，得出二者的关系方程。
慢病毒生物滴度(TU/mL)＝接种的细胞数量(个)*转导效率(％)*待测慢病毒样本稀释倍数/细胞感染时接种的慢病毒体积(mL)
定量PCR使用的引物探针序列如下所示。
LTR引物探针扩增慢病毒含有的5’LTR基因上的一段序列：
LTR正向引物：CTGTTGTGTGACTCTGGTAACT(SEQ ID NO:36)
LTR探针：5’-AAATCTCTAGCAGTGGCGCCCG-3’(SEQ ID NO:37)
LTR反向引物：TTCGCTTTCAAGTCCCTGTT(SEQ ID NO:38)。
HK引物探针扩增MT4细胞基因组含有的白蛋白(ALB)的一段序列：
HK正向引物：5’-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT-3’(SEQ ID NO:39)
HK探针：5’-CCTGTCATGCCCACACAAATCTCTCC-3’(SEQ ID NO:40)
HK反向引物：5’-ACTCATGGGAGCTGCTGGTTC-3’(SEQ ID NO:41)。
LTR探针的5’端带有FAM荧光基团，3’带有MGB荧光基团。HK探针的5’端带有CY5荧光基团，3’带有BHQ2荧光基团。
各慢病毒滴度结果见表2。
表2包含编码结合VEGF的蛋白的核苷酸序列的慢病毒载体的滴度
慢病毒载体 滴度TU/mL
pKL-Kan-BB-CAGG-Ranibizumab 4.26E+08
pKL-Kan-BB-CAGG-Aflibercept 6.44E+08
pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白1 7.33E+08
pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白2 1.50E+09
pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白3 4.91E+08
pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白5 3.35E+08
pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白4 6.00E+08
pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白6 4.42E+08
pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白7 1.33E+09
pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白8 2.79E+09
实施例6：包含抗VEGF分子基因的AAV载体的病毒包装
将实施例3中构建的包含编码结合VEGF的融合蛋白的核苷酸序列的AAV表达载体(pAAV-MCS-CAGG-融合蛋白1至pAAV-MCS-CAGG-融合蛋白8)之一或包含编码衍生自Ranibizumab的scFv或衍生自VEGFR的VEGF结合片段即VEGFR D2/3和Fc的AAV表达载体(pAAV-MCS-CAGG-Ranibizumab或pAAV-MCS-CAGG-Aflibercept)，以及AAV血清型质粒(pAAV-RC2，购买自CELL BIOLABS,INC，货号：VPK-422)和辅助质粒(pAAV-Helper，购自CELLBIOLABS,INC.；货号：VPK-402)同时共转染293T细胞，在该293T细胞系中进行抗VEGF分子基因治疗AAV载体的包装。转染方法为PEI阳离子聚合物介导的真核细胞瞬时转染，PEI阳离子聚合物为购自Polysciences的PEI-Max转染试剂(购自Polysciences，货号：24765-1)，转染操作参照生产商推荐标准化操作进行，转染规模为15cm2细胞培养皿。
转染完成72小时后，将细胞上清及细胞一起收集至50mL离心管中。首先在台式吊桶式机上，室温4200rpm离心10分钟分离细胞及上清。将上清转移至新的50mL离心管中，再添加MgCl2及核酶，混匀待用。剩余细胞添加核酶和细胞裂解液，室温静置1h，随后室温10000g离心10min转移上清至原先细胞上清中，混匀，进行亲和纯化浓缩，用亲和填料(POROS AAVX亲和树脂,Thermo,货号A36743)填装5mL层析柱，用平衡液(20mmol/L PB，0.15mol/L NaCl，pH7.4±0.2)平衡柱子，平衡后将样品上样，上样完成后用平衡液再平衡5个柱体积，用洗脱缓冲液(0.1mol/L甘氨酸，0.15mol/L NaCl，pH2±0.1)洗脱获得AAV样本约8mL，用100KD超滤管(Milipore，货号UFC8100)浓缩换液至1mL，换液后AAV溶剂为180mMNaCl，10mM PB，0.001％F-68。纯化后样本分装，冻存于-80℃备用。
通过本领域熟知的方法，根据定量PCR结果以及AAV标准品为参照计算出AAV病毒载体的物理滴度。AAV标准品为已知滴度的rAAV2，其包含基因CMV-EGFP(购自ATCC，货号VR-1616)。用AAV裂解液裂解AAV标准品，梯度稀释作为标准品，样品AAV同样用裂解液裂解后根据预估滴度稀释到标准曲线包含的范围，qPCR进行滴度测定，换算到Vg/mL。详细操作步骤如下：
1、标准品制备：取分装好的rAAV2病毒20μL，按病毒体积:裂解液(QuickExtractDNA Extraction Solution，厂家：Lucigen，货号：QE09050)体积＝1:9裂解病毒样本，混合均匀瞬时离心后，使用基因扩增仪执行以下程序：56℃，60min；95℃，10min；裂解后样本作为母液，稀释5倍作为标准曲线的第一个点，然后梯度5倍稀释。标准曲线包括5个点(6.56E+08vg/mL、1.312E+08vg/mL、2.624E+07vg/mL、5.248E+06vg/mL)，提前制备好分装冻存；
2、样本制备：取20uLAAV病毒样本，按病毒体积：裂解液体积＝1：9裂解病毒样本，混合均匀瞬间离心后，使用基因扩增仪执行以下程序：56℃，60min；95℃，10min；裂解后样本根据预估滴度进行用纯水预稀释(如10倍、100倍、1000倍等)，使稀释后样本滴度落在标准曲线范围内；
3、检测：通过qPCR的方法检测AAV共有区域ITR序列，所用引物探针序列如下所列，反应体系见表3，反应程序见表4。
表3qPCR反应体系(Roche LC480)
表4qPCR反应程序
4、计算：根据标准曲线所得样本滴度*预稀释倍数*10(即裂解时稀释10倍)，计算得到样本滴度。
定量PCR使用的引物探针序列为：
ITR正向引物：GGAACCCCTAGTGATGGAGTT(SEQ ID NO:42)
ITR探针：5’-CACTCCCTCTCTGCGCGC-3’(SEQ ID NO:43)
ITR反向引物：CGGCCTCAGTGAGCGA(SEQ ID NO:44)
其中ITR探针的5’端带有FAM荧光基团，3’带有BHQ1荧光基团；
各AAV病毒滴度结果见表5。
表5包含编码结合VEGF的蛋白的核苷酸序列的AAV载体的滴度
AAV载体 滴度Vg/mL
AAV-MCS-CAGG-Ranibizumab 3.09E+13
AAV-MCS-CAGG-Aflibercept 1.15E+13
AAV-MCS-CAGG-融合蛋白1 1.32E+13
AAV-MCS-CAGG-融合蛋白2 1.10E+13
AAV-MCS-CAGG-融合蛋白3 5.00E+12
AAV-MCS-CAGG-融合蛋白4 2.13E+13
AAV-MCS-CAGG-融合蛋白5 2.54E+12
AAV-MCS-CAGG-融合蛋白6 5.08E+12
AAV-MCS-CAGG-融合蛋白7 7.51E+11
AAV-MCS-CAGG-融合蛋白8 5.99E+11
实施例7：用包含编码结合VEGF的蛋白的核苷酸序列的慢病毒颗粒转导细胞后的蛋白表达效率和活性检测
将人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19细胞接种于48孔细胞培养板，每孔5.00E+04个细胞，2小时后将包含不同构建体的慢病毒颗粒分别以MOI 10、15、20、40梯度感染ARPE-19细胞，转导过夜后换液，72小时收集细胞培养上清，冻存于-80℃，用于VEGF-荧光素酶报告基因细胞系检测蛋白表达量水平。
收集的细胞用PBS清洗细胞后4200rpm，5min，离心收集细胞，重悬以20μL快速抽提溶液(QuickExtractTMDNA Extraction Solutionr)(购自Lucigen，货号QE09050)并用PCR仪运行表6所示的程序裂解细胞和抽提总DNA。
表6细胞裂解程序
温度 时间
65℃ 15min
68℃ 15min
95℃ 10min
通过本领域熟知的方法，以定量PCR数据计算出ARPE-19细胞感染慢病毒拷贝数(Vector Copy Number,VCN)，引物探针序列见实施例5，具体操作如下：
1、细胞裂解后样本先用纯水稀释10倍(2uL+18uL)，同时设置单拷贝细胞裂解液样本(该样本为经测序确认仅整合一个慢病毒载体拷贝的293T细胞)
2、用双探针qPCR方法检测，LTR基因为慢病毒通用序列，HK为人源细胞通用管家内参基因，通过两对引物探针反应的Ct值的分析可以对起始模板中慢病毒载体拷贝数/细胞进行计算。反应体系见表7，反应程序见表4。
表7探针法qPCR反应体系配制(20ul反应体系)
3、数据分析：使用双探针法完成qPCR检测，每个样品(孔)可以同时得到LTR的Ct值(设为Ctl)和HK的Ct值(设为Cth)，假设原待检样品中慢病毒载体拷贝总数为x，细胞总数为y(二倍体生物，内参基因数则为2y)。
根据VCN定义可知：①VCN＝x/y；
根据Ct值定义，在两对引物的扩增效率相同的理想条件下，有以下等式成立：②x*(2^Ctl)＝2y*(2^Cth)。
联立①、②式，有VCN＝2*(2^Cth)/(2^Ctl)；
设单拷贝DNA参比品的VCN＝VCN0，为减少试剂、仪器、操作人员等差异带来的误差，最终的VCN还需通过单拷贝参比品的VCN进行校正：VCN＝[2*(2^Cth)/(2^Ctl)]/VCN0。
根据VCN检测结果选择相近VCN的样本进行抗VEGF蛋白表达量水平检测。检测方法为使用VEGF-荧光素酶报告基因细胞系GloResponseTM NFAT-Re-luc2P HEK293 Cell line(Promega)。该细胞系在VEGF蛋白的存在下，KDR(VEGF受体)与之结合，释放出能量，促使细胞表达萤火虫荧光素酶蛋白，随后利用荧光素酶检测试剂盒进行荧光水平检测。而抗VEGF蛋白能与VEGF蛋白进行结合，从而阻断VEGF与细胞结合产生荧光素酶信号。所用VEGF165蛋白为重组人VEGF165蛋白(近岸蛋白质科技有限公司；货号为C083)。所用检测试剂盒为萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(碧云天生物科技；货号为RG006)。具体实验操作步骤如下：
1.使用1％FBS+DMEM培养基稀释VEGF165蛋白至适宜浓度；
2.将上述收集的人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19细胞上清进行梯度稀释，并与等体积已稀释的VEGF165溶液混合均匀后，在室温下孵育30min；
3.VEGF-荧光素酶报告基因细胞系细胞经胰酶(TrypLETMExpress酶，厂家：Thermo，货号：12604039)消化后计数，使用1％FBS+DMEM培养基调整浓度为5E5个细胞/mL；
4. 96孔板每孔加入VEGF-荧光素酶报告基因细胞系细胞80μL(4E4个细胞/孔)以及20μL步骤2中混合液；
5. 37℃培养6h后，使用萤光素酶试剂盒检测荧光值。
根据不同抗VEGF蛋白与VEGF的结合效果不同，其所能检测到的荧光水平强度也不同。即抗VEGF蛋白与VEGF结合量越高，细胞荧光素酶水平越低。
将VCN相近的病毒载体样本进行比较。样本pKL-Kan-BB-Ranibizumab、pKL-kan-BB-CAGG-Aflibercept、pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白1至pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白6为同一批次比较，pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白4和pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白7为同一批次比较，pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白7和pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白8为同一批次比较。
以相近VCN情况下感染了病毒颗粒的ARPE-19的上清液中抗VEGF蛋白结合VEGF的活性水平的数据结果见表8-1、8-2、8-3和图10。
表8-1.上清中结合VEGF的蛋白结合VEGF的活性水平(上清稀释10倍后加入细胞孔)
VCN RLU
pKL-kan-BB-CAGG-Ranibizumab 5.66 1.23E+05
pKL-kan-BB-CAGG-Aflibercept 5.00 1.11E+05
pKL-kan-BB-CAGG-融合蛋白1 4.96 1.16E+05
pKL-kan-BB-CAGG-融合蛋白2 3.73 9.82E+04
pKL-kan-BB-CAGG-融合蛋白3 5.13 1.36E+05
pKL-kan-BB-CAGG-融合蛋白4 5.70 4.21E+04
pKL-kan-BB-CAGG-融合蛋白5 4.83 9.58E+04
pKL-kan-BB-CAGG-融合蛋白6 5.24 4.23E+04
Blank N/A 1.26E6
注：表格中Blank指的是不含抗VEGF蛋白的细胞上清(未感染病毒的细胞上清)，其余与实验组均一致，作为空白对照。下同。
表8-2上清中结合VEGF的蛋白结合VEGF的活性水平(上清稀释5倍后加入细胞孔)
表8-3上清中结合VEGF的蛋白结合VEGF的活性水平(上清稀释5倍后加入细胞孔)
VCN RLU
pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白7 1.70 5.09E+04
pKL-Kan-BB-CAGG-融合蛋白8 1.86 1.81E+05
Blank N/A 1.42E+06
三批实验的数据显示，在VCN接近的条件下，本发明的抗VEGF融合蛋白显示优异的中和效果，尤其是pAAV-MCS-CAGG-融合蛋白4、pAAV-MCS-CAGG-融合蛋白6和pAAV-MCS-CAGG-融合蛋白7。本发明的融合蛋白表达框的设计显著提高了在慢病毒转导的细胞的培养上清中抗VEGF蛋白的表达水平。
实施例8：用包含编码结合VEGF的蛋白的核苷酸序列的AAV病毒颗粒转导ARPE-19细胞后的蛋白表达效率、活性检测
将ARPE-19细胞接种于48孔细胞培养板，每孔5.00E+04个细胞，2小时后将不同构建体的AAV病毒颗粒以MOI 75000感染ARPE-19细胞，转导过夜后换液。72小时后收集细胞培养上清，并冻存于-80℃。将其用于VEGF-荧光素酶报告基因细胞系以检测蛋白表达量水平。具体操作参见实施例7。
AAV-MCS-CAGG-融合蛋白1至AAV-MCS-CAGG-融合蛋白6以及AAV-MCS-CAGG-Ranibizumab和AAV-MCS-CAGG-Aflibercept的AAV病毒载体为同一批次比较，AAV-MCS-CAGG-融合蛋白4、AAV-MCS-CAGG-融合蛋白6、AAV-MCS-CAGG-融合蛋白7、AAV-MCS-CAGG-融合蛋白8为同一批次比较。以相同MOI接种ARPE-19的不同病毒颗粒获得的上清液中抗VEGF蛋白结合VEGF的活性水平的数据见表9-1、表9-2，图11。
表9-1上清中抗VEGF蛋白结合VEGF的活性水平(上清原液加入细胞孔进行反应)
表9-2上清中抗VEGF蛋白结合VEGF的活性水平(上清原液加入细胞孔反应)
两次实验数据显示，相同MOI(7.5E+04)条件下，本发明的抗VEGF融合蛋白显示优异的中和效果，尤其是pAAV-MCS-CAGG-融合蛋白4和pAAV-MCS-CAGG-融合蛋白7。本发明的融合蛋白表达框的设计显著提高了在AAV病毒转导的细胞的培养上清中抗VEGF蛋白的结合VEGFR的活性水平。
此外，在同一MOI条件下，根据达到同一水平RLU的上清液稀释倍数不同，对AAV-CAGG-融合蛋白4、AAV-CAGG-Ranibizumab和AAV-CAGG-Aflibercept的表达量进行了比较。如表10和图12所示。
表10抗VEGF蛋白表达量水平检测
以上结果表明，当AAV-CAGG-融合蛋白4稀释4倍时、AAV-CAGG-Ranibizumab原液、以及AAV-CAGG-aflibercept稀释2倍时，RLU在同一水平。故可认为融合蛋白4：Ranibizumab：Aflibercept的结合VEGFR活性水平的比值为4:1:2。由此可知，用包含VEGFRD2/3和Ranibizumab的融合蛋白4的构建体4的AAV载体转导视觉细胞实现了协同作用。
实施例9：pAAV-CAGG-融合蛋白4病毒载体动物实验蛋白表达量、活性检测
在普通野生型SD大鼠上进行动物实验，单次单眼给予视网膜下或玻璃体腔pAAV-CAGG-融合蛋白4病毒载体给药(详见表11)，其中设置AAV稀释液(组成成分为：180mM NaCl，10mM PB，0.001％ F68)组为对照组。给药完成后，4周处死动物并采集双眼，进行解剖获取玻璃体，进行ELISA及细胞系检测。
动物随机分为3组，按表11进行给药：
表11动物分组及给药
在整个实验过程中，对目标蛋白的表达量进行了ELISA检测及细胞系检测(见图13，表12)，结果表明，AAV-CAGG-融合蛋白4表达量较AAV-CAGG-Aflibercept高，且两者在均稀释成100ng/mL情况下，在细胞系检测中均有较高的蛋白活性水平。
表12大鼠玻璃体内表达量和蛋白活性检测
实施例10：pAAV-CAGG-融合蛋白4病毒载体对AMD模型动物的治疗效果
在pAAV-CAGG-融合蛋白4病毒载体给药前4w(Week-4)对荷兰兔进行玻璃体腔注射DL-α-AAA诱导视网膜新生血管模型。根据适应期造模结果，筛选出视网膜新生血管造模成功动物，单次单眼给予视网膜下或玻璃体腔pAAV-CAGG-融合蛋白4病毒载体给药、阿柏西普眼内注射溶液(来源：VeTTER Pharama-Fertigung GmbH&Co.KG，批号：KT0A3F5，规格：>100uL/瓶，有效期：2023.03.25)以及AAV-CAGG-EGFP注射给药。给药完成后，每周采集双眼房水50uL检测蛋白含量，每月采集双眼玻璃体100uL检测蛋白含量，每两周进行FFA检查。
具体方案如表13所示。
表13主要研究日程
给药前连续3天给动物给予15mg/kg稀释后的环孢素A口服液，给药后，仍每日灌胃给药15mg/kg稀释后的环孢素A口服液至D57。考虑到玻璃体腔注射和视网膜下注射可能造成眼部炎症，给药后连续三天进行护理，给予妥布霉素地塞米松滴眼液(来源：s.a.ALCON-COUVREUR n.v，批号：21I20GB，规格：5mL，有效期：2023.08.31)、氧氟沙星眼膏(来源：沈阳兴齐眼药股份有限公司，批号：211201，规格：3.2g/支，有效期：2023.11.01)和左氧氟沙星滴眼液(来源：SANTEN PHARMACEUTICAL CO.,LTD.NOTO PLANT，批号：CV2099，规格:5mL，有效期：2023.05.31)。考虑到药物表达情况，给药结束后，动物双眼各滴加1滴妥布霉素地塞米松滴眼液(D16开始)，每隔4小时滴加一次，共计3次/天，至D56。
动物随机分为3组，按表14进行给药。
表14动物分组及给药
给药前，经FFA造影确认，所有入组动物双眼均可见明显的视网膜血管扩张、迂曲和渗漏(见表15)。
表15FFA造影汇总评分表
注：
1.OS：左眼；OD：右眼。
2.-：未采集到结果。
3.评分方法：将眼部分为8个区域(具体分区见图14)分别评分，各区域评分标准如下：症状为大血管直，小血管迂曲，无血管扩张，评分为0；症状为大血管迂曲度增加和(或)部分血管扩张，评分为1；症状为大血管间渗漏，血管明显扩张，评分为
2；症状为大、小血管间渗漏，小血管仍可见，评分为3；症状为大血管和小血管之间的渗漏，小血管差/不可见，评分4。各区域评分结束后，将分值相加，即为最终分值。
实验结果(见图15、表15)表明，给药后2周，1101#、2101#和2102#右眼(给药眼)视网膜血管扩张、迂曲和渗漏均消失，其渗漏水平基本恢复到造模前水平，且此水平一直维持到实验期末。3101#右眼(给药眼)仍可见视网膜血管扩张、迂曲，但较给药前迂曲扩张程度也有较大程度减轻，到给药后第4周时扩张、迂曲、渗漏程度也基本恢复到造模前。但给药后第6周发现其视网膜血管又再次扩张、迂曲和渗漏，这主要与阿柏西普的药代动力学、吸收和分布有关。4101#右眼(给药眼)在整个实验期均可见视网膜血管扩张、迂曲和渗漏。整个观察期，4组动物左眼(非给药眼)在血管扩张、迂曲和渗漏程度随着时间的推移而加重。
在整个实验过程中，对目标蛋白的表达量进行了ELISA检测(见图16，表16)。
表16不同时间点ELISA检测结果
由实验结果可知，pAAV-CAGG-融合蛋白4病毒载体在AMD动物模型中能够保持长期高水平的目的蛋白表达，显著抑制了视网膜血管的扩张、迂曲与渗漏，与成品药阿柏西普眼内注射溶液的前期效果一致，说明pAAV-CAGG-融合蛋白4病毒载体对AMD具有显著的治疗效果。
序列表

Claims (35)

1.一种核酸构建体例如表达载体，所述核酸构建体包含一种或多种编码VEGF结合区的核苷酸序列，例如编码第一VEGF结合区的第一核苷酸序列和/或编码第二VEGF结合区的第二核苷酸序列，其中所述第一VEGF结合区和/或第二VEGF结合区各自独立地选自衍生自抗VEGF抗体的抗原结合片段例如scFv和衍生自VEGF受体(VEGFR)的VEGF结合片段，所述VEGF结合片段包含VEGFR的结构域2和结构域3(D2/3)，其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列通过编码接头的核苷酸序列连接。
2.权利要求1的核酸构建体，其中：
所述第一VEGF结合区为衍生自抗VEGF抗体的抗原结合片段，且所述第二VEGF结合区为衍生自另一不同的抗VEGF抗体的抗原结合片段；或
所述第一VEGF结合区为衍生自VEGFR的VEGF结合片段，且所述第二VEGF结合区为衍生自抗VEGF抗体的抗原结合片段。
3.权利要求1的核酸构建体，其中所述核酸构建体还包含编码第三VEGF结合区的第三核苷酸序列，所述第三VEGF结合区选自衍生自抗VEGF抗体的抗原结合片段和/或衍生自VEGFR的VEGF结合片段，所述VEGF结合片段包含VEGFR的结构域2和结构域3(D2/3)，其中所述第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列之间通过编码接头的核苷酸序列连接。
4.权利要求3的核酸构建体，其中：
所述第一VEGF结合区为衍生自抗VEGF抗体的抗原结合片段，所述第二VEGF结合区为衍生自另一不同的抗VEGF抗体的抗原结合片段，且所述第三VEGF结合区为衍生自VEGFR的VEGF结合片段。
5.权利要求1-4中任一项的核酸构建体，其中所述核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：
(1)scFv1；
(2)D2/3；
(3)D2/3-linker-scFv1；
(4)scFv1-linker-scFv2；
(5)scFv1-linker-D2/3；
(6)scFv1-linker-scFv2-linker-D2/3；
(7)scFv1-linker-D2/3-linker-scFv2；或
(8)D2/3-linker-scFv1-linker-scFv2，
其中，scFv1是编码衍生自抗VEGF抗体的scFv的核苷酸序列，
scFv2是编码衍生自另一不同的抗VEGF抗体的scFv的核苷酸序列，
D2/3是编码衍生自VEGFR的VEGF结合片段的核苷酸序列，所述VEGF结合片段包含VEGFR的D2/3，
linker是编码接头的核苷酸序列，其中每个接头可以相同或不同。
6.权利要求1-4中任一项的核酸构建体，其中所述核酸构建体还包含编码抗体的Fc区的核苷酸序列，优选所述Fc区为人IgG1的Fc区。
7.权利要求6的核酸构建体，其中所述核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：
(1)scFv1-linker-Fc；
(2)D2/3-linker-Fc；
(3)D2/3-linker-scFv1-Fc；
(4)scFv1-linker-D2/3-Fc；
(5)scFv1-linker-scFv2-Fc；
(6)scFv1-linker-scFv2-linker-D2/3-Fc；
(7)scFv1-linker-D2/3-linker-scFv2-Fc；或
(8)D2/3-linker-scFv1-linker-scFv2-Fc，
其中，scFv1是编码衍生自抗VEGF抗体的scFv的核苷酸序列，
scFv2是编码衍生自另一不同的抗VEGF抗体的scFv的核苷酸序列，
D2/3是编码衍生自VEGFR的VEGF结合片段的核苷酸序列，所述VEGF结合片段包含VEGFR的D2/3，
linker是编码接头的核苷酸序列，其中每个接头可以相同或不同，
Fc是编码抗体Fc区的核苷酸序列。
8.权利要求1-7中任一项所述的核酸构建体，其中所述抗VEGF抗体选自Brolucizumab，Ranibizumab或Aflibercept；
优选地，所述衍生自Brolucizumab的scFv具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述衍生自Ranibizumab的scFv具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，和/或所述衍生自Aflibercept的scFv具有如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
9.权利要求8的核酸构建体，其中所述核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：
(1)D2/3；
(2)D2/3-Fc；
(3)BrolscFv；
(4)BrolscFv-Fc；
(5)RaniScFv；
(6)RaniScFv-Fc；
(7)D2/3-linker-RaniScFv；
(8)RaniScFv-linker-D2/3；
(9)BrolscFv-linker-RaniScFv-Fc；
(10)BrolscFv-linker-RaniScFv；
(11)RaniScFv-linker-BrolscFv；
(12)RaniScFv-linker-BrolscFv-Fc；
(13)D2/3-linker-RaniScFv-Fc；
(14)RaniScFv-linker-D2/3-Fc；
(15)D2/3-linker-BrolscFv-linker-RaniScFv-Fc；
(16)D2/3-linker-BrolscFv-linker-RaniScFv；
(17)BrolscFv-linker-D2/3-linker-RaniScFv；
(18)BrolscFv-linker-D2/3-linker-RaniScFv-Fc；
(19)RaniScFv-linker-BrolscFv-linker-D2/3；
(20)RaniScFv-linker-BrolscFv-linker-D2/3-Fc；
(21)BrolscFv-linker-D2/3；
(22)BrolscFv-linker-D2/3-Fc；
(23)D2/3-linker-BrolscFv；或
(24)BrolscFv-linker-D2/3，
其中，BrolscFv是编码衍生自Brolucizumab的scFv的核苷酸序列，
RaniScFv是编码衍生自Ranibizumab的scFv的核苷酸序列，
D2/3是编码所述衍生自VEGFR的VEGF结合片段的核苷酸序列，所述VEGF结合片段包含VEGFR的D2/3，
linker是编码接头的核苷酸序列，其中每个接头可以相同或不同，
Fc是编码抗体Fc区的核苷酸序列。
10.权利要求1-9中任一项的权利要求，其中所述衍生自VEGFR的VEGF结合片段具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
11.权利要求1-10中任一项的核酸构建体，其中所述接头为不可切割的接头。
12.权利要求11的核酸构建体，其中所述接头各自独立地为(G1S)n，(G2S)n，(G3S)n或(G4S)n，其中n为1-10，优选n为2-8，更优选n为4或5。
13.权利要求1-12中任一项的核酸构建体，其在所述编码序列的5’端进一步包含编码N端信号序列的核苷酸序列，
优选地，所述N端信号序列具有SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列。
14.权利要求1-13中任一项的核酸构建体，其中所述核酸构建体编码融合蛋白，所述融合蛋白包含选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
15.权利要求1-14中任一项的核酸构建体，其中所述核酸构建体包含选自SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:22的核苷酸序列。
16.权利要求1-15中任一项的核酸构建体，其中所述核酸构建体还包含启动子序列，用于所述核苷酸序列的表达，优选所述启动子为CAGG启动子。
17.权利要求1-16中任一项的核酸构建体，其中所述核酸构建体为病毒载体。
18.权利要求17的核酸构建体，其中所述核酸构建体为慢病毒载体。
19.权利要求18所述的核酸构建体，其中所述慢病毒载体还包含选自嵌合型LTR启动子、HIV-1包装信号(ψ)、中心聚嘌呤区(cPPT)、Rev应答元件(RRE)、多嘌呤片段(PPT)、土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件(WPRE)、SV40病毒的多腺苷酸化信号(SV40 pAsignal)、SV40病毒的复制起始位点(SV40 ori)和自失活长末端重复序列的一个或多个元件。
20.权利要求17的核酸构建体，其中所述核酸构建体为腺相关病毒载体。
21.根据权利要求20所述的核酸构建体，其中所述腺相关病毒载体还包含选自SV40病毒的多腺苷酸化信号(SV40SL)、土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件(WPRE)和反向末端重复序列(ITR)的一个或多个元件。
22.一种病毒颗粒，其包含权利要求1-21中任一项所述的核酸构建体，优选所述病毒颗粒是慢病毒颗粒或腺相关病毒颗粒。
23.细胞，所述细胞包含根据权利要求1-21中任一项所述的核酸构建体。
24.权利要求23的细胞，其中所述核酸构建体是腺相关病毒载体，所述细胞还包含用于将所述核酸构建体组装到病毒颗粒中的血清型质粒和/或辅助质粒。
25.权利要求23的细胞，其中所述核酸构建体是慢病毒载体，所述细胞还包含用于将所述核酸构建体组装到病毒颗粒中的包膜质粒和/或包装质粒。
26.一种载体系统，其包含权利要求1-21所述的核酸构建体，和任选地一种或多种另外的载体例如质粒。
27.权利要求26的载体系统，其中所述核酸构建体是腺相关病毒载体，所述载体系统还包含用于将所述核酸构建体组装到病毒颗粒中的血清型质粒和/或辅助质粒。
28.权利要求27的载体系统，其中核酸构建体是慢病毒载体，所述载体系统还包含用于将所述核酸构建体组装到病毒颗粒中的包膜质粒和/或包装质粒。
29.根据权利要求26-28中任一项所述的载体系统，其进一步包含宿主细胞，优选地所述宿主细胞是293T细胞。
30.一种组合物，其包含根据权利要求1-21中任一项所述的核酸构建体、根据权利要求22所述的病毒颗粒、根据权利要求23-25中任一项所述的细胞或根据权利要求26-29中任一项所述的载体系统，和任选地药学上可接受的载剂和/或赋形剂。
31.一种用于眼内递送的系统，其包括：
a)根据权利要求1-21中任一项所述的核酸构建体、根据权利要求22所述的病毒颗粒、根据权利要求23-25中任一项所述的细胞、根据权利要求26-29中任一项所述的载体系统、或根据权利要求30所述的组合物；和
b)用于眼内递送的装置。
32.根据权利要求31所述的系统，其中所述用于眼内递送的装置选自用于玻璃体内递送的装置、用于视网膜下腔递送的装置和用于脉络膜上腔递送的装置。
33.一种用于预防、改善或治疗受试者中年龄相关性黄斑变性的方法，其包括向受试者的眼内施用根据权利要求1-21中任一项所述的核酸构建体、根据权利要求22所述的病毒颗粒、根据权利要求23-25中任一项所述的细胞、根据权利要求26-29中任一项所述的载体系统、或根据权利要求30所述的组合物的步骤。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述年龄相关性黄斑变性为湿性黄斑变性。
35.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述核酸构建体、病毒颗粒、细胞、载体系统或组合物被施用到所述受试者的玻璃体内和/或视网膜下腔和/或脉络膜上腔。
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