CN117363656A - 核酸构建体及其用途 - Google Patents
核酸构建体及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117363656A CN117363656A CN202311296135.2A CN202311296135A CN117363656A CN 117363656 A CN117363656 A CN 117363656A CN 202311296135 A CN202311296135 A CN 202311296135A CN 117363656 A CN117363656 A CN 117363656A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleic acid
- acid construct
- seq
- nucleotide sequence
- linker
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 114
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 108
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 108
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 133
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 133
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 77
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 53
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 50
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 48
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 43
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 43
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 39
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 38
- 102100038955 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 Human genes 0.000 claims description 31
- 101001098868 Homo sapiens Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 Proteins 0.000 claims description 30
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 30
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 29
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 28
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 27
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 25
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 25
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 23
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 claims description 22
- 229960004539 alirocumab Drugs 0.000 claims description 21
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 17
- 229960002027 evolocumab Drugs 0.000 claims description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 13
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 13
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 claims description 11
- 208000000563 Hyperlipoproteinemia Type II Diseases 0.000 claims description 10
- 102100024640 Low-density lipoprotein receptor Human genes 0.000 claims description 10
- 206010045261 Type IIa hyperlipidaemia Diseases 0.000 claims description 10
- 108091093126 WHP Posttrascriptional Response Element Proteins 0.000 claims description 10
- 201000001386 familial hypercholesterolemia Diseases 0.000 claims description 10
- 241000972680 Adeno-associated virus - 6 Species 0.000 claims description 8
- 241001164825 Adeno-associated virus - 8 Species 0.000 claims description 8
- 208000031226 Hyperlipidaemia Diseases 0.000 claims description 8
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 5
- 241001492404 Woodchuck hepatitis virus Species 0.000 claims description 4
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 claims description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 claims description 3
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 claims description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 claims description 2
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 claims 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 abstract description 33
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 18
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 abstract description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 97
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 39
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 29
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 24
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 23
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 19
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 18
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 18
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 17
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 16
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 15
- 108010028554 LDL Cholesterol Proteins 0.000 description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 229940121710 HMGCoA reductase inhibitor Drugs 0.000 description 12
- 102000000853 LDL receptors Human genes 0.000 description 12
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 12
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 11
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 10
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 9
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 9
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 8
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 8
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 8
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 8
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 8
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000013461 design Methods 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 6
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 229940017164 repatha Drugs 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 5
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101001111338 Homo sapiens Neurofilament heavy polypeptide Proteins 0.000 description 4
- 101000979333 Homo sapiens Neurofilament light polypeptide Proteins 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 102100024007 Neurofilament heavy polypeptide Human genes 0.000 description 4
- 102100023057 Neurofilament light polypeptide Human genes 0.000 description 4
- 241000566242 Ochrotomys Species 0.000 description 4
- 229940127355 PCSK9 Inhibitors Drugs 0.000 description 4
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 4
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 4
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 4
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 4
- -1 cell Substances 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002471 hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor Substances 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 4
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 3
- 102100036912 Desmin Human genes 0.000 description 3
- 108010044052 Desmin Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 210000005045 desmin Anatomy 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 239000013608 rAAV vector Substances 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- CABVTRNMFUVUDM-VRHQGPGLSA-N (3S)-3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C[C@@](O)(CC(O)=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 CABVTRNMFUVUDM-VRHQGPGLSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001655883 Adeno-associated virus - 1 Species 0.000 description 2
- 241000202702 Adeno-associated virus - 3 Species 0.000 description 2
- 241000580270 Adeno-associated virus - 4 Species 0.000 description 2
- 241001634120 Adeno-associated virus - 5 Species 0.000 description 2
- 241001164823 Adeno-associated virus - 7 Species 0.000 description 2
- 241000649045 Adeno-associated virus 10 Species 0.000 description 2
- 241000649046 Adeno-associated virus 11 Species 0.000 description 2
- 241000649047 Adeno-associated virus 12 Species 0.000 description 2
- 241000300529 Adeno-associated virus 13 Species 0.000 description 2
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 102000004657 Calcium-Calmodulin-Dependent Protein Kinase Type 2 Human genes 0.000 description 2
- 108010003721 Calcium-Calmodulin-Dependent Protein Kinase Type 2 Proteins 0.000 description 2
- 101150044789 Cap gene Proteins 0.000 description 2
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 2
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 101710177611 DNA polymerase II large subunit Proteins 0.000 description 2
- 101710184669 DNA polymerase II small subunit Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 101000834253 Gallus gallus Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 2
- 102000053171 Glial Fibrillary Acidic Human genes 0.000 description 2
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 2
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- URLZCHNOLZSCCA-VABKMULXSA-N Leu-enkephalin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=CC=C1 URLZCHNOLZSCCA-VABKMULXSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 2
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 2
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 102100037935 Polyubiquitin-C Human genes 0.000 description 2
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010056354 Ubiquitin C Proteins 0.000 description 2
- 108010062497 VLDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 2
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 2
- 230000001906 cholesterol absorption Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012858 packaging process Methods 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 229940028952 praluent Drugs 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 101150066583 rep gene Proteins 0.000 description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N (2s,4r)-4-[(3r,5s,6r,7r,8s,9s,10s,13r,14s,17r)-6-ethyl-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2-methylpentanoic acid Chemical compound C([C@@]12C)C[C@@H](O)C[C@H]1[C@@H](CC)[C@@H](O)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)C[C@H](C)C(O)=O)CC[C@H]21 HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[6-amino-2-[[2-[[2-[[5-amino-2-[[2-[[1-[2-[[6-amino-2-[(2,5-diamino-5-oxopentanoyl)amino]hexanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)p Chemical compound C1CCN(C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CCC(N)=O)C1C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102100022900 Actin, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102100026031 Beta-glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 101100043731 Caenorhabditis elegans syx-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000909256 Caldicellulosiruptor bescii (strain ATCC BAA-1888 / DSM 6725 / Z-1320) DNA polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 101100535673 Drosophila melanogaster Syn gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010000720 Excitatory Amino Acid Transporter 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100031562 Excitatory amino acid transporter 2 Human genes 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010008177 Fd immunoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 102000017011 Glycated Hemoglobin A Human genes 0.000 description 1
- 108010014663 Glycated Hemoglobin A Proteins 0.000 description 1
- 108010023302 HDL Cholesterol Proteins 0.000 description 1
- 108700010908 HIV-1 proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 101000933465 Homo sapiens Beta-glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 238000008214 LDL Cholesterol Methods 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 102100036837 Metabotropic glutamate receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010010914 Metabotropic glutamate receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016193 Metabotropic glutamate receptors Human genes 0.000 description 1
- 102000006890 Methyl-CpG-Binding Protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010072388 Methyl-CpG-Binding Protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101100368134 Mus musculus Syn1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010028391 Musculoskeletal Pain Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 241000701945 Parvoviridae Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 102100040990 Platelet-derived growth factor subunit B Human genes 0.000 description 1
- 101710103494 Platelet-derived growth factor subunit B Proteins 0.000 description 1
- 102000015623 Polynucleotide Adenylyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010024055 Polynucleotide adenylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710180553 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 Proteins 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000902592 Pyrococcus furiosus (strain ATCC 43587 / DSM 3638 / JCM 8422 / Vc1) DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000007022 RNA scission Effects 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 102000001435 Synapsin Human genes 0.000 description 1
- 108050009621 Synapsin Proteins 0.000 description 1
- 102000017299 Synapsin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108050005241 Synapsin-1 Proteins 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 1
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical group C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 238000009098 adjuvant therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000181 anti-adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000003911 antiadherent Substances 0.000 description 1
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 230000036996 cardiovascular health Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- WCZVZNOTHYJIEI-UHFFFAOYSA-N cinnoline Chemical compound N1=NC=CC2=CC=CC=C21 WCZVZNOTHYJIEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 108010022197 lipoprotein cholesterol Proteins 0.000 description 1
- 230000008604 lipoprotein metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 108010038421 metabotropic glutamate receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000030147 nuclear export Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229940043515 other immunoglobulins in atc Drugs 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 108010089520 pol Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000009103 reabsorption Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 208000020029 respiratory tract infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 102000029752 retinol binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000053 retinol binding Proteins 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 238000013391 scatchard analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 231100000402 unacceptable toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
- C12N5/0686—Kidney cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Abstract
本发明提供了核酸构建体及其用途，该核酸构建体编码抗PCSK9的融合蛋白。本发明还提供了由所述核酸构建体制成的重组病毒例如重组腺相关病毒和重组慢病毒、以及所述核酸构建体和重组病毒在治疗高血脂性疾病中的用途。
Description
技术领域
本发明属于基因治疗领域，具体涉及用于高血脂性疾病基因治疗的核酸构建体。该核酸构建体可用于对家族性高胆固醇血症、动脉粥样硬化等疾病的基因治疗。
背景技术
据国家心血管病中心发布的《中国心血管健康与疾病报告2019》显示，我国心血管病(CVD)患病率处于持续上升阶段。事实上，CVD死亡占居民总死亡原因的40％，远高于肿瘤及其他疾病。CVD最常见的就是动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)，占所有病因的95％以上。
家族性高胆固醇血症(FH)是一种与早期动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)和高死亡率密切相关的遗传疾病，其是脂蛋白代谢的遗传性疾病，也是最常见的遗传性代谢疾病之一。FH的根本原因是低密度脂蛋白受体(LDL-R)或调节其代谢的蛋白质的遗传缺陷，导致肝脏对低密度脂蛋白(LDL)的摄取异常低。因此，导致循环中的胆固醇积累，从而导致心血管疾病风险升高。
目前治疗高血脂症(包括FH)的方式主要有他汀类药物和非他汀类药物，另外还有抗体类的PCSK9抑制剂，它们在治疗效果上有各自的优势，但同时也存在相应的缺陷。他汀类药物通过抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶来降低总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。多项研究清楚地表明，他汀类药物可以降低LDL-C水平，从而降低患者发生CVD的风险，并降低临床ASCVD患者的死亡率和疾病进展。他汀类药物是治疗高脂血症包括用于FH的主要药物。然而，虽然他汀类药物通常耐受性良好，但它们会带来许多不良反应，包括胃肠道事件、肌肉骨骼疼痛、呼吸道感染和头痛。他汀类药物也可能与升高的血糖和糖化血红蛋白(A1C)水平有关。他汀类药物禁用于活动性肝病患者，以及不明原因和慢性肝酶转氨酶升高的患者。这就导致了不适用他汀类药物的患者需要寻求其他药物的治疗。
对于对他汀类药物反应不佳或对他汀类药物不耐受的患者，可以使用几种非他汀类药物作为辅助治疗。其中包括胆汁酸、纤维酸、烟酸、胆固醇吸收和合成抑制剂，以及PCSK9抑制剂。非他汀类药物主要通过结合胆汁酸、阻碍胆汁酸重吸收和肠肝循环、增加胆固醇向胆汁酸的转化以及增加肝脏LDL-R的数量来降低胆固醇、降低甘油三酯、升高HDL-C、降低极低密度脂蛋白(VLDL)水平、抑制肠道中的胆固醇吸收等方式来达到降低脂蛋白的效果。
前蛋白转化酶枯草溶菌素/Kexin 9型(PCSK9)是一种由肝细胞产生的丝氨酸蛋白酶。PCSK9通过与肝细胞表面的LDL-R结合，随后诱导LDL-R的溶酶降解来阻止LDL-R再循环。这导致LDL在循环中积累，并最终促进动脉粥样硬化。因此，只要能够阻断PCSK9与LDL-R的结合，进而阻断PCSK9介导的LDL-R在肝内降解，就能增加肝细胞表面LDL-R的水平，从而促进LDL-C的摄取和清除，降低血浆内LDL-C的水平。依据这个理念，目前已批准用于阻断PCSK9的抗体药有两种，分别是赛诺菲和再生元联合研发的阿莫罗布单抗(Alirocumab(Praluent))以及安进开发的依洛尤单抗(Evolocumab(Repatha))，用于杂合子FH(HeFH)成人或需要额外降低LDL-C的临床ASCVD患者。PCSK9抑制剂具有良好的降脂效果，但同时也存在一些弊端，比如容易引起过敏反应，从而导致用药中断。而且，Evolocumab(Repatha)的半衰期是11-17天，Alirocumab(Praluent)的半衰期是17-20天(Chanukya Dahagam,AdityaGoud,Abdelhai Abdelqader1,et al.PCSK9 inhibitors and their role in high-riskpatients in reducing LDL cholesterol levels:alirocumab.Future Cardiol.2016；12(2):149-57.)，导致患者需要每半个月左右注射一次药物。
因此，目前仍需开发出针对高血脂性疾病的新型药物，在保证良好的治疗效果的同时延长药效持续时间、避免对患者多次给药带来的不便。
发明内容
本发明依据阻断PCSK9与LDL-R的结合可达到降低LDL-C的原理，创造性地发明了用于治疗高血脂症的重组腺相关病毒(rAAV)载体和重组慢病毒载体，该载体携带编码抗PCSK9的融合蛋白的基因，可通过在体给药的方式使机体持续不断产生抗PCSK9的融合蛋白，从而降低机体中的PCSK9含量，提高LDL-R含量，达到降低LDL-C含量的目的。
相应地，在第一方面，本发明提供了核酸构建体，所述核酸构建体包含一种或多种编码PCSK9结合区的核苷酸序列，例如编码第一PCSK9结合区的第一核苷酸序列和/或编码第二PCSK9结合区的第二核苷酸序列，其中所述第一PCSK9结合区和/或第二PCSK9结合区各自独立地选自衍生自抗PCSK9抗体的抗原结合片段例如scFv，其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列通过编码接头的核苷酸序列或内部核糖体进入位点(IRES)连接。
本发明还提供了一种核酸构建体，所述核酸构建体包含编码第一PCSK9结合区的第一核苷酸序列和编码第二PCSK9结合区的第二核苷酸序列，其中所述第一PCSK9结合区和第二PCSK9结合区各自独立地选自衍生自抗PCSK9抗体的scFv，其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列通过编码接头的核苷酸序列或内部核糖体进入位点(IRES)连接。
在一些实施方案中，本发明的核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：
(1)scFv1-linker-scFv2；或
(2)scFv1；
其中，scFv1是编码衍生自抗PCSK9抗体的scFv的核苷酸序列，
scFv2是编码衍生自另一不同的抗PCSK9抗体的scFv的核苷酸序列，linker是编码接头的核苷酸序列或内部核糖体进入位点(IRES)。
在一些实施方案中，本发明的核酸构建体还包含编码抗体的Fc区的核苷酸序列。在一些优选的实施方案中，所述Fc区为人IgG1的Fc区、人IgG2的Fc区或人IgG4的Fc区。
在一些实施方案中，本发明的核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：
(1)scFv1-linker-scFv2-Fc；
(2)scFv1-linker-Fc；或
(3)scFv1-Fc；
其中，scFv1是编码衍生自抗PCSK9抗体的scFv的核苷酸序列，
scFv2是编码衍生自另一不同的抗PCSK9抗体的scFv的核苷酸序列，linker是编码接头的核苷酸序列或内部核糖体进入位点(IRES)，
Fc是编码抗体的Fc区的核苷酸序列。
在本发明的核酸构建体的实施方案中，所述抗PCSK9抗体可以是任何特异性结合PCSK9的抗体。在一些优选的实施方案中，所述抗PCSK9抗体选自Alirocumab和Evolocumab。
在一些实施方案中，本发明的核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：
(1)AlirscFv-linker-EvolscFv-Fc；
(2)EvolscFv-linker-AlirscFv-Fc；
(3)AlirscFv-linker-Fc；
(4)EvolscFv-linker-Fc；
(5)AlirscFv-Fc；或
(6)EvolscFv-Fc；
其中，AlirscFv是编码衍生自Alirocumab的scFv的核苷酸序列，
EvolscFv是编码衍生自Evolocumab的scFv的核苷酸序列，
linker是编码接头的核苷酸序列或内部核糖体进入位点(IRES)，
Fc是编码抗体的Fc区的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明的核酸构建体还可以在5’端包含编码N端信号肽的核苷酸序列。
相应地，在一些实施方案中，本发明的核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：
(1)signal-scFv1-linker-scFv2-Fc；
(2)signal-scFv1-linker-Fc；或
(3)signal-scFv1-Fc；
其中，signal是编码信号肽的核苷酸序列，
scFv1是编码衍生自抗PCSK9抗体的scFv的核苷酸序列，
scFv2是编码衍生自另一不同的抗PCSK9抗体的scFv的核苷酸序列，linker是编码接头的核苷酸序列或内部核糖体进入位点(IRES)，
Fc是编码抗体的Fc区的核苷酸序列。
在一些优选的实施方案中，本发明的核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：
(1)signal-AlirscFv-linker-EvolscFv-Fc；
(2)signal-EvolscFv-linker-AlirscFv-Fc；
(3)signal-AlirscFv-linker-Fc；
(4)signal-EvolscFv-linker-Fc；
(5)signal-AlirscFv-Fc；或
(6)signal-EvolscFv-Fc；
其中，signal是编码信号肽的核苷酸序列，
AlirscFv是编码衍生自Alirocumab的scFv的核苷酸序列，
EvolscFv是编码衍生自Evolocumab的scFv的核苷酸序列，
linker是编码接头的核苷酸序列或内部核糖体进入位点(IRES)，
Fc是编码抗体的Fc区的核苷酸序列。
在一些优选的实施方案中，所述衍生自Alirocumab的scFv包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:24具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些优选的实施方案中，编码衍生自Alirocumab的scFv的核苷酸序列包含如SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:25具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
在一些优选的实施方案中，所述衍生自Evolocumab的scFv包含如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:26具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些优选的实施方案中，编码衍生自Evolocumab的scFv的核苷酸序列包含如SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:27具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
适用于本发明的信号肽可以选自SAP信号肽、IHC信号肽、ILC信号肽、AP信号肽、CSP信号肽、IL2信号肽、TPA信号肽、L1信号肽、H7信号肽和H1信号肽。
在一些实施方案中，所述SAP信号肽包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述IHC信号肽包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述ILC信号肽包含如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述AP信号肽包含如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述CSP信号肽包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述IL2信号肽包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述TPA信号肽包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述L1信号肽包含如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述H7信号肽包含如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述H1信号肽包含如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
在一些优选的实施方案中，本发明的核酸构建体编码的信号肽包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的核酸构建体中包含的接头是可切割接头。在另一些实施方案中，本发明的核酸构建体中包含的接头是不可切割接头。在一些实施方案中，所述不可切割接头时柔性接头。
在一些优选的实施方案中，接头选自选自(G1S)n，(G2S)n，(G3S)n和(G4S)n，其中n为1-10，优选n为2-8，更优选n为4或5。在一些更优选的实施方案中，接头为(G4S)n，其中n为3、4或5。
在一些优选的实施方案中，本发明的核酸构建体中编码的Fc区包含如SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些优选的实施方案中，本发明的核酸构建体中编码抗体Fc区的核苷酸序列包含如SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:33所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:33具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明的核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：AlirscFv-linker-EvolscFv，其中，AlirscFv是编码衍生自Alirocumab的scFv的核苷酸序列，EvolscFv是编码衍生自Evolocumab的scFv的核苷酸序列，linker是编码接头的核苷酸序列。
在一些优选的实施方案中，本发明的核酸构建体编码融合蛋白，所述融合蛋白包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:34具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些优选的实施方案中，本发明的核酸构建体包含如SEQ ID NO:35所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:35具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明的核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：AlirscFv-linker-EvolscFv-IgG1的结构，其中，AlirscFv是编码衍生自Alirocumab的scFv的核苷酸序列，EvolscFv是编码衍生自Evolocumab的scFv的核苷酸序列，linker是编码接头的核苷酸序列，IgG1是编码人IgG1Fc区的核苷酸序列。
在一些优选的实施方案中，本发明的核酸构建体编码融合蛋白，所述融合蛋白包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:36具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些优选的实施方案中，本发明的核酸构建体包含如SEQ ID NO:37所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:37具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明的核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：AlirscFv-linker-EvolscFv-IgG2，其中，AlirscFv是编码衍生自Alirocumab的scFv的核苷酸序列，EvolscFv是编码衍生自Evolocumab的scFv的核苷酸序列，linker是编码接头的核苷酸序列，IgG2是编码人IgG2 Fc区的核苷酸序列。
在一些优选的实施方案中，本发明的核酸构建体编码融合蛋白，所述融合蛋白包含如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:38具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些优选的实施方案中，本发明的核酸构建体包含如SEQ ID NO:39所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:39具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明的核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：AlirscFv-linker-EvolscFv-IgG4，其中，AlirscFv是编码衍生自Alirocumab的scFv的核苷酸序列，EvolscFv是编码衍生自Evolocumab的scFv的核苷酸序列，linker是编码接头的核苷酸序列，IgG4是编码人IgG4 Fc区的核苷酸序列。
在一些优选的实施方案中，本发明的核酸构建体编码融合蛋白，所述融合蛋白包含如SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:40具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些优选的实施方案中，本发明的核酸构建体包含如SEQ ID NO:41所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:41具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明的核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：EvolscFv-linker-AlirscFv，其中，AlirscFv是编码衍生自Alirocumab的scFv的核苷酸序列，EvolscFv是编码衍生自Evolocumab的scFv的核苷酸序列，linker是编码接头的核苷酸序列。
在一些优选的实施方案中，本发明的核酸构建体编码融合蛋白，所述融合蛋白包含如SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:42具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些优选的实施方案中，本发明的核酸构建体包含如SEQ ID NO:43所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:43具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明的核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：EvolscFv-linker-AlirscFv-IgG1，其中，AlirscFv是编码衍生自Alirocumab的scFv的核苷酸序列，EvolscFv是编码衍生自Evolocumab的scFv的核苷酸序列，linker是编码接头的核苷酸序列，IgG1是编码人IgG1 Fc区的核苷酸序列。
在一些优选的实施方案中，本发明的核酸构建体编码融合蛋白，所述融合蛋白包含如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:44具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些优选的实施方案中，本发明的核酸构建体包含如SEQ ID NO:45所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:45具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明的核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：EvolscFv-linker-AlirscFv-IgG2，其中，AlirscFv是编码衍生自Alirocumab的scFv的核苷酸序列，EvolscFv是编码衍生自Evolocumab的scFv的核苷酸序列，linker是编码接头的核苷酸序列，IgG2是编码人IgG2 Fc区的核苷酸序列。
在一些优选的实施方案中，本发明的核酸构建体编码融合蛋白，所述融合蛋白包含如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:46具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些优选的实施方案中，本发明的核酸构建体包含如SEQ ID NO:47所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:47具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明的核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：EvolscFv-linker-AlirscFv-IgG4，其中，AlirscFv是编码衍生自Alirocumab的scFv的核苷酸序列，EvolscFv是编码衍生自Evolocumab的scFv的核苷酸序列，linker是编码接头的核苷酸序列，IgG4是编码人IgG4 Fc区的核苷酸序列。
在一些优选的实施方案中，本发明的核酸构建体编码融合蛋白，所述融合蛋白包含如SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:48具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些优选的实施方案中，本发明的核酸构建体包含如SEQ ID NO:49所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:49具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明的核酸构建体还包含用于所述编码序列表达的启动子。在一些实施方案中，启动子选自CMV启动子、CBH启动子、EF1α启动子、CAG启动子、CAGG启动子、CASI启动子、desmin启动子、TMCK启动子、MCK启动子、MHCK7启动子、PGK启动子和TTR启动子中的任何一种。在一些优选的实施方案中，启动子选自CBH启动子和CAG启动子。
在一些实施方案中，所述CMV启动子包含如GenBank登录号MN996867.1第235-818位所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述CBH启动子包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述EF1α启动子包含如GenBank登录号KY447299.1第529-1710位所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述CAG启动子包含如GenBank登录号KC152483.1第200-1096位所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述CAGG启动子包含如GenBank登录号GU299216.1第63-1664位所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述CASI启动子包含如GenBank登录号ON512571.1第80-1104位所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述desmin启动子包含如GenBank登录号M63391.1第2194-3233位所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述TMCK启动子包含如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述MCK启动子包含如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述MHCK7启动子包含如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述PGK启动子包含如GenBank登录号JF313343.1第683-1192位所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述TTR启动子包含如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明的核酸构建体为病毒载体。在一些实施方案中，本发明的核酸构建体为在宿主细胞中能够稳定表达的病毒载体。
在一些实施方案中，本发明的核酸构建体选自牛乳头瘤病毒载体、EB病毒载体、逆转录病毒载体(例如慢病毒载体)和腺相关病毒载体。
在一些实施方案中，本发明的核酸构建体为腺相关病毒载体。在一些优选的实施方案中，所述腺相关病毒载体还包含选自SV40病毒的多腺苷酸化信号(SV40SL)、土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件(WPRE)和反向末端重复序列(ITR)的一个或多个元件。
在一些实施方案中，本发明的核酸构建体为慢病毒载体。在一些优选的实施方案中，所述慢病毒载体还包含选自嵌合型LTR启动子、HIV-1包装信号(ψ)、中心聚嘌呤区(cPPT)、Rev应答元件(RRE)、多嘌呤片段(PPT)、土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件(WPRE)、SV40病毒的多腺苷酸化信号(SV40SL)、SV40病毒的复制起始位点(SV40 ori)和自失活长末端重复序列的一个或多个元件。
在第二方面，本发明提供了病毒颗粒，其包含如本发明第一方面的核酸构建体。在一些优选的实施方案中，本发明的病毒颗粒是腺相关病毒颗粒或慢病毒颗粒。
在一些优选的实施方案中，本发明的病毒颗粒是腺相关病毒颗粒，所述腺相关病毒颗粒为AAV8或AAV6血清型。
在第三方面，本发明提供了细胞，其包含如本发明第一方面的核酸构建体。
在一些实施方案中，本发明的细胞包含本发明所述的腺相关病毒载体，所述细胞还包含用于将所述腺相关病毒载体组装到病毒颗粒中的血清型质粒和/或辅助质粒。在一些优选的实施方案中，所述血清型质粒为AAV8或AAV6血清型质粒。
在一些实施方案中，本发明的细胞包含本发明所述的慢病毒载体，所述细胞还包含用于将所述慢病毒载体组装到病毒颗粒中的包膜质粒和/或包装质粒。
在第四方面，本发明提供了载体系统，其包含如本发明第一方面的核酸构建体，和任选地一种或多种另外的载体。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的载体为质粒载体。
在一些实施方案中，所述载体系统是腺相关病毒载体系统。在一些实施方案中，所述腺相关病毒载体系统包括腺相关病毒载体，以及用于将所述腺相关病毒载体组装到病毒颗粒中的血清型质粒和/或辅助质粒。在一些实施方案中，所述血清型质粒选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAVrh10、AAV-DJ、AAV-DJ/B、AAV PHP.B、AAV PHP.eB、AAV PHP.S和AAVrh74血清型质粒。在一些优选的实施方案中，所述血清型质粒为AAV8或AAV6血清型质粒。
在一些优选的实施方案中，本发明的腺相关病毒载体系统中的血清型质粒包含如SEQ ID NO:6或7所示的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:6或7具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明的腺相关病毒载体系统中的辅助质粒包含如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:8具有至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述腺相关病毒载体系统还包括宿主细胞，所述宿主细胞可以为生产腺相关病毒颗粒的细胞，例如293T细胞。
在一些实施方案中，所述载体系统是慢病毒载体系统。在一些实施方案中，所述慢病毒载体系统包括慢病毒载体，以及用于将所述慢病毒载体组装到病毒颗粒中的包膜质粒和/或包装质粒。在一些实施方案中，所述包膜质粒和/或包装质粒包含编码gag和pol蛋白的一个或者多个核苷酸序列以及任选地编码其它病毒包装组件的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述慢病毒载体系统还包括宿主细胞，所述宿主细胞可以为生产慢病毒颗粒的细胞，例如293T细胞。
在第五方面，本发明提供了组合物，其包含如本发明第一方面的核酸构建体、如本发明第二方面的病毒颗粒、如本发明第三方面的细胞或如本发明第四方面的载体系统，和任选地药学上可接受的载剂和/或赋形剂。
在第六方面，本发明提供了试剂盒，其包含如本发明第一方面的核酸构建体、如本发明第二方面的病毒颗粒、如本发明第三方面的细胞、如本发明第四方面的载体系统或如本发明第五方面的组合物，以及用于肌肉注射或静脉注射的装置。
在第七方面，本发明提供了用于预防、改善或治疗受试者中高血脂性疾病的方法，其包括向所述受试者施用如本发明第一方面的核酸构建体、如本发明第二方面的病毒颗粒、如本发明第三方面的细胞、如本发明第四方面的载体系统或如本发明第五方面的组合物的步骤。在一些实施方案中，所述高血脂性疾病选自家族性高胆固醇血症和动脉粥样硬化。
在一些优选的实施方案中，本发明的表达载体、病毒颗粒、细胞、载体系统或组合物通过肌肉注射或静脉注射施用于受试者。
在第八方面，本发明提供了如本发明第一方面的核酸构建体、如本发明第二方面的病毒颗粒、如本发明第三方面的细胞、如本发明第四方面的载体系统或如本发明第五方面的组合物在制备用于治疗受试者中高血脂性疾病的药物中的用途。在一些实施方案中，所述高血脂性疾病选自家族性高胆固醇血症和动脉粥样硬化。
本发明的表达载体、病毒颗粒、细胞、载体系统或组合物在预防、改善或治疗受试者的高血脂性疾病方面具有以下优势：
1.传统的抗体给药后，在人体内半衰期比较短，因此，抗体药物需要每两周至一个月注射一次，给患者带来了很多不便。本发明采用重组AAV载体或慢病毒载体携带抗PCSK9的融合蛋白的基因，使之能在机体内长期、持续表达抗PCSK9的融合蛋白，无需多次给药，便可治疗高血脂症(通过降低PCSK9、增加LDL-R，从而降低LDL-C)。
2.无需经历抗体体外表达后复杂的处理环节，包括细胞培养、稳定表达抗体的细胞株的筛选、大规模培养、抗体的纯化、质控等，使用本技术只需得到纯化的重组AAV病毒或慢病毒，直接注射到患者的体内，即完成了给药环节。
3.PCSK9的抗体类抑制剂目前有两种(Alirocumab、Evolocumab)，本发明将两种抗体分子设计成scFv融合蛋白，给患者注射本发明的重组病毒颗粒后，患者体内表达的scFv融合蛋白同时拥有两种PCSK9抗体的功能，为治疗患者提供了一种新思路。
附图说明
图1显示了rAAV构建体的设计思路。
图2显示了pAAV-Amp载体的质粒图谱。
图3显示了scFv构建体的预期结构示意图。
图4显示了scFv结构的rAAV构建体质粒瞬时转染293T细胞后细胞培养基的蛋白检测结果。
图5显示了具有不同scFv结构的构建体及不同血清型的rAAV感染C2C12细胞后的蛋白表达检测结果。
图6显示了携带scFv结构的构建体的rAAV感染高表达hPCSK9-flag的HepG2细胞后，细胞培养基中游离hPCSK9-flag的浓度。“W”代表WPRE。
图7显示了携带scFv结构的构建体的rAAV感染普通HepG2细胞后，细胞表达的scFv融合蛋白对外加的PCSK9蛋白的结合作用。
图8显示了携带scFv结构的构建体的rAAV在C57小鼠中降低LDL-C及T-CHO的效果。
图9显示了携带scFv结构的构建体的rAAV在金黄地鼠中降低LDL-C的效果。Repatha为产品药，作为阳性对照。
图10显示了重组慢病毒构建体的设计思路。
图11显示了pKL-Kan载体的质粒图谱。
图12显示了scFv结构的重组慢病毒构建体质粒瞬时转染293T细胞后细胞培养基的蛋白检测结果。
图13显示了具有不同scFv结构的构建体的重组慢病毒感染293T细胞后的蛋白表达检测结果。
图14显示了携带scFv结构的构建体的慢病毒感染293T细胞后，细胞表达的scFv融合蛋白对外加的PCSK9蛋白的结合作用。“W”代表WPRE。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。
为了更容易理解本公开，下面首先定义某些术语。在整个说明书中阐述了以下术语和其他术语的附加定义。
如本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物，除非上下文另有明确规定。
在本文中，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即意味着“包括但不限于”)。
在本文中，“和/或”是指并且包括相关联的所列项目中的一个或多个项目的任意和所有可能组合。例如，组合物包含A和/或B可以解释为组合物包含A、组合物包含B或组合物包含A和B。
所有的数字名称，例如pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围，都是近似值，其以1.0或0.1的增量适当地，或以+/-15％、10％、5％、2％的变化可选地改变(+)或(-)。应当理解，所有的数字名称前面都有术语“约”。还应理解，本文所述的试剂仅是示例性的，并且其等同物是本领域已知的。当涉及可测量值如量或浓度等时，本文所用的术语“约”是指包括指定量的20％、10％、5％、1％、0.5％或0.1％之内的变化。
术语“蛋白质”、“肽”、“多肽”和“氨基酸序列”可以互换使用，并且在其最广泛的意义上是指两个或更多个氨基酸亚基、氨基酸类似物或肽模拟物的聚合形式。“蛋白质”、“肽”、“多肽”和“氨基酸序列”含有至少两个氨基酸，并且对氨基酸的最大数目没有限制。本文所用术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括D和L光学异构体和氨基酸类似物。
在本文中，术语“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”、“核苷酸序列”和“多核苷酸”可以互换使用，并且指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。因此，该术语包括但不限于单链、双链或双链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA RNA杂交体或包含、由或基本上由嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基组成的聚合物。
在本文中，“表达”是指核酸序列被转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽、氨基酸序列或蛋白质的过程。如果核酸序列来自基因组DNA，则表达可包括在真核细胞中剪接mRNA。
当术语“编码”应用于核酸序列时，是指如果在其天然状态下或当通过本领域技术人员熟知的方法操作时，其可以被转录以产生mRNA和/或被翻译以产生多肽，则称其为“编码”多肽的核酸序列。反义链是这种核酸的互补物，并且可以从其推导出编码序列。
“同源性”或“同一性”是指两个多肽之间或两个核酸序列之间的序列相似性。同一性百分比可以通过比较每个序列中的位置来确定，所述序列可以为了比较的目的而比对。当被比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是相同的。序列之间的同一性程度取决于共享的匹配位置数目。“无关”或“非同源”序列与本发明的序列之一共享小于40％的同一性、小于25％的同一性。通过将核酸或氨基酸序列导入ClustalW(可从https://genome.jp/tools bin/clustalw/获得)并使用该ClustalW，可以确定本文提供的核酸或氨基酸序列的比对和序列同一性百分比。
本文所用的术语“启动子”是指表达控制序列，其控制基因或转基因的转录的起始和速率。启动子可以是例如组成型的、诱导型的、阻遏型的或组织特异性的。启动子可以含有调节蛋白和分子如RNA聚合酶和转录因子可以结合的遗传元件。
启动子的非限制性示例性包括pol I启动子、pol II启动子、pol III启动子、T7启动子、U6启动子、H1启动子、逆转录病毒劳斯肉瘤病毒LTR启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、延伸因子1α短(EFS)启动子、β葡萄糖醛酸酶(GUSB)启动子、巨细胞病毒(CMV)即早期(IE)增强子和/或启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子或其衍生物如CAG启动子、CB启动子、(人)延伸因子1α-亚基(EF1α)启动子、泛素C(UBC)启动子、朊病毒启动子、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝轻链(NFL)启动子、神经丝重链(NFH)启动子、血小板衍生生长因子(PDGF)启动子、血小板衍生生长因子B链(PDGF-β)启动子、突触蛋白(Syn)启动子、突触蛋白1(Syn1)启动子、甲基-CpG结合蛋白2(MeCP2)启动子、Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)启动子、代谢型谷氨酸受体2(mGluR2)启动子、神经丝轻链(NFL)启动子、神经丝重链(NFH)启动子、β-珠蛋白小基因nβ2启动子、前脑啡肽原(PPE)启动子、脑啡肽(Enk)启动子、兴奋性氨基酸转运蛋白2(EAAT2)启动子、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子、髓鞘碱性蛋白(MBP)启动子、或其功能片段。
本领域已知，可以修饰这些启动子的核苷酸序列以提高或降低mRNA转录的效率。合成来源的启动子可用于普遍存在的或组织特异性表达。此外，病毒来源的启动子，其中一些如上所述，可用于本文公开的方法中，例如CMV、HIV、腺病毒和AAV启动子。在实施方案中，启动子与增强子一起使用可以增加转录效率。增强子的非限制性实例包括间隙类视黄醇结合蛋白(IRBP)增强子、RSV增强子或CMV增强子。
在本文中，“poly A信号”、“多聚腺苷酸化信号”或“多腺苷酸化信号”是指位于最3’编码区下游的RNA序列，并由RNA切割复合物识别，所述复合物通过RNA聚合酶(如Pol II)切割新转录的RNA的3’末端序列，从而可以发生聚腺苷酸化。然后，通过将腺苷一磷酸单元从ATP添加到RNA的新生切割的3’端，聚腺苷酸聚合酶添加并延伸聚A尾。多聚腺苷酸尾(或聚A尾)保护mRNA免受核酸外切酶攻击，并且对转录终止、mRNA的细胞核输出以及后续翻译都十分重要。
示例性的多聚腺苷酸化信号包括牛生长激素聚腺苷酸化信号(bGH poly A)、小聚A信号(SPA)、人生长激素聚腺苷酸化信号(hGH poly A)、SV40病毒的多腺苷酸化信号(SV40polyA)、兔β珠蛋白聚A序列(rBG poly A)、或它们的变体。
在本文中，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，其具有特异性结合特定抗原的能力。抗体通常在每条重链和轻链中包含可变区和恒定区。抗体重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)和补体系统的成分如C1q(补体激活经典途径中的第一组分)。因此，大多数抗体具有共同形成与抗原结合的抗体部分的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。
本文所使用的术语“抗体”应以其最广泛的意义来理解，并且包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、抗体片段和含有至少两个抗原结合区的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。抗体可以含有另外的修饰，如非天然存在的氨基酸、Fc区中的突变、以及糖基化位点的突变。抗体还包括翻译后修饰的抗体、含有抗体的抗原决定簇的融合蛋白、以及含有对抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要这些抗体表现出期望的生物活性即可。
在本文中，术语“单克隆抗体”通常是指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即集群中的个别抗体是相同的，除了可能存在的少量的自然突变。单克隆抗体通常针对单个抗原位点具有高度特异性。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们可以通过杂交瘤培养合成，不受其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以在杂交瘤细胞中制备，或者可以通过重组DNA方法制备。
在本文中，术语抗体的“抗原结合片段”是指抗体的一个或多个片段，其保留特异性结合抗原(例如，本发明所述的PCSK9蛋白)的能力。已经表明，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来执行。
术语抗体的“抗原结合片段”的实例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fab’片段，其本质上是具有部分铰链区的Fab；(iv)Fd片段，其由VH和CH1结构域组成；(v)Fd’片段，其具有VH和CH1结构域以及在CH1结构域的C端的一个或多个半胱氨酸残基；(vi)Fv片段，其由抗体单臂的VL和VH结构域组成；(vii)dAb片段，其由VH结构域组成；(viii)单独的互补决定区(CDR)；(ix)纳米抗体，含有单个可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，但可以使用重组方法通过合成接头连接它们，使它们能够形成单条蛋白质链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv))。此类单链抗体也意在涵盖在术语抗体的“抗原结合片段”内。此外，该术语还包括包含一对串联Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)的“直链抗体”，其与互补的轻链多肽以及保留抗原结合活性的任何修饰形式的前述片段共同形成抗原结合区域。
这些抗原结合片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。
在本文中，术语“结合”或“特异性结合”是指两种分子之间如抗体和其靶抗原之间的非随机结合反应。抗体的结合特异性可以基于亲和力和/或亲合力来确定。亲和力由抗原与抗体解离的平衡常数(KD)表示，是抗原决定簇和抗体的抗原结合位点之间的结合强度的量度：KD的值越小，抗原决定簇和抗体之间的结合强度就越强。替代地，亲和力也可以表示为亲和力常数(KA)，其为1/KD。亲合力是抗体和相关抗原之间的结合强度的量度。亲合力涉及抗原决定簇和抗体的抗原结合位点之间的亲和力以及抗体上存在的相关结合位点的数量。
抗体与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以以任何已知的合适方式来确定，包括例如Scatchard分析和/或竞争性结合测定，如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和夹心竞争测定，以及本领域已知的其不同变型。
与本发明所述的抗体或其抗原结合片段相比，具有一个或多个氨基酸修饰的等同物也涵盖在本发明的范围内，条件是该一个或多个氨基酸修饰不影响或基本上不影响抗体或其抗原结合片段与抗原特异性结合的能力。在本文中，氨基酸修饰可以是氨基酸取代、氨基酸缺失或氨基酸插入。氨基酸取代可以是保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代。保守取代(也称为保守突变、保守置换或保守变异)是蛋白质中的氨基酸置换，其将给定氨基酸改变为具有相似生化性质(例如电荷、疏水性或大小)的不同氨基酸。在本文中，“保守取代”是指氨基酸残基被另一个生物学上相似的残基置换。保守取代的实例包括一个疏水残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代另一个；或一个带电荷或极性残基取代另一个，如精氨酸取代赖氨酸，谷氨酸取代天冬氨酸，谷氨酰胺取代天冬酰胺等。保守取代的其它示例性实例包括以下变化：丙氨酸变为丝氨酸；天冬酰胺变为谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸变为谷氨酸；半胱氨酸变为丝氨酸；甘氨酸变为脯氨酸；组氨酸变为天冬酰胺或谷氨酰胺；赖氨酸变为精氨酸、谷氨酰胺或谷氨酸；苯丙氨酸变为酪氨酸，丝氨酸变为苏氨酸；苏氨酸变为丝氨酸；色氨酸变为酪氨酸；酪氨酸变为色氨酸或苯丙氨酸；等等。
术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。
在本文中，“病毒载体”是指能够被包装而重组产生病毒颗粒的载体，其含有将在体内、离体或体外递送至宿主细胞中的多核苷酸。病毒载体的实例包括逆转录病毒载体、AAV载体、慢病毒载体、腺病毒载体、甲病毒载体等。
在本文中，术语“细胞”通常是指可以或已经含有包括本发明所述的核酸分子的质粒或载体，或者能够表达本发明所述的抗体或融合蛋白的个体细胞、细胞系或细胞培养物。所述细胞可以包括单个宿主细胞的子代。由于天然的、意外的或故意的突变，子代细胞与原始亲本细胞在形态上或在基因组上可能不一定完全相同，但能够表达本申请所述的抗体融合蛋白的即可。所述细胞可以通过使用本申请所述的载体体外转染细胞而得到。所述细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)，也可以是真核细胞(例如酵母细胞，例如COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，HeLa细胞，HEK293细胞，COS-1细胞，NS0细胞或骨髓瘤细胞)。在某些情形中，所述细胞可以是哺乳动物细胞。例如，所述哺乳动物细胞可以是CHO-K1细胞。在本文中，术语“重组细胞”通常是指在其中引入了重组表达载体的细胞。所述重组宿主细胞不仅包括某种特定的细胞，还包括这些细胞的后代。
在本文中，术语“转导”、“转染”和“转化”是指将异源多核苷酸递送至宿主细胞发生转录和翻译产生多肽产物的过程，包括利用重组病毒将异源多核苷酸引入宿主细胞。
在本文中，术语“感染”是指包含多核苷酸组分的病毒或病毒颗粒将多核苷酸递送至细胞中并产生其RNA和蛋白质产物的过程，也可指病毒在宿主细胞中的复制过程。
“感染复数”(缩写为MOI)在本文中是指用病毒感染细胞时加入的病毒与细胞数量的比值。
术语病毒“滴度”在本文中是指单位体积液体中有感染能力的病毒载体颗粒数目。本文中特指每毫升病毒载体产品中具有确定转导能力的病毒载体颗粒数目，即转导单位(TU)每毫升(TU/ml)。
在本文中，术语“表达框架”或“表达盒”是指具有编码蛋白质潜能的多核苷酸序列，其可以包含启动子、编码序列、终止子、以及任选的增强子、非翻译区(UTR)、内含子、多聚腺苷酸化信号等元件。
“腺相关病毒”或“AAV”属于依赖性细小病毒(Dependoparvovirus)属，细小病毒(Parvoviridae)科。AAV是单链DNA病毒，由病毒基因组和衣壳构成。AAV基因组包括rep基因和cap基因，两侧有两个末端反向重复(ITR)。其中，rep基因编码的Rep蛋白与病毒的复制以及包装有关，cap基因编码病毒的衣壳蛋白。“ITR”或“反向末端重复”可以形成T形回文结构，参与AAV的复制和包装过程，其通常是完成AAV的裂解和潜伏生命周期所必需的。AAV本身是复制缺陷型的，在没有辅助病毒存在的情况下只能在宿主细胞呈潜伏状态。因此，AAV载体的生产通常需要辅助质粒(phelper)提供参与AAV复制的关键基因以及血清型质粒提供编码AAV颗粒的衣壳蛋白。
目前已经发现的AAV存在十几种常见血清型以及上百种变种，它们的主要区别在于编码衣壳蛋白的cap基因的不同。AAV的血清型主要由衣壳蛋白的结构所决定，这些血清型包括但不限于：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAVrh10、AAV-DJ、AAV-DJ/B、AAV PHP.B、AAV PHP.eB、AAV PHP.S、AAVrh74。
在本文中，“AAV载体”和“重组AAV(rAAV)载体”可以互换使用，意指包含一个或多个异源核酸序列和一个或多个ITR的载体。当AAV载体存在于宿主细胞中时，在辅助质粒和血清型质粒的帮助下，携带目的基因的AAV载体可以被复制并包装到感染性病毒颗粒中。
在本文中，慢病毒载体(Lentiviral vector)包括在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体，它能高效的将目的基因(或RNAi)导入动物和人的原代细胞或细胞系。慢病毒载体基因组是正链RNA，其基因组进入细胞后，在细胞浆中被其自身携带的反转录酶反转为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白。
慢病毒载体能有效感染并整合到非分裂细胞中，该特性使慢病毒载体与其它病毒载体相比，比如不整合的腺病毒载体、整合率低的腺相关病毒载体、只整合分裂细胞的传统逆转录病毒载体，有鲜明的特色。大量文献研究表明，慢病毒载体介导的目的基因长期表达的组织或细胞包括脑、肝脏、肌肉、视网膜、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、巨噬细胞等。慢病毒载体不表达任何HIV-1蛋白，免疫原性低，在注射部位无细胞免疫反应，体液免疫反应也较低，不影响病毒载体的第2次注射。
在本文中，术语“患者”和“受试者”可互换使用并且以其常规意义使用，指患有或容易患有可通过施用本发明的病毒载体或病毒颗粒或组合物进行预防或治疗的病症的生物体，并且包括人和非人动物。
受试者可以是非人动物(例如，黑猩猩和其他猿和猴物种；农场动物，如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，例如狗和猫；实验动物包括啮齿类动物，如小鼠、大鼠和豚鼠；禽类，包括家禽、野禽和猎禽，如鸡、火鸡和其他鸡类、鸭、鹅等)。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方式中，受试者是人。
在本文中，术语“施用”旨在表示将物质递送至受试者，诸如动物或人。施用可以在整个治疗过程中以单一剂量、连续或间歇地进行。确定最有效的施用方式和剂量的方法是本领域技术人员已知的，并且将随着用于治疗的组合物、治疗目的以及被治疗的受试者的年龄、健康或性别等因素而变化。在一些实施方案中，可以进行单次或多次施用，其剂量水平和模式由医师选择，或者在宠物和其它动物的情况下，由兽医选择。
在本文中，术语“治疗”包括：(1)抑制病状、疾病或者病症，即，阻止、减少或者延迟疾病的发展或其复发或者其至少一种临床或者亚临床症状的发展；或者(2)缓解疾病，即，引起病状、疾病或者病症或者其临床或者亚临床症状中的至少一种消退。
在本文中，术语“改善”指与疾病有关的症状的改善，并且可以指至少一种衡量或定量该症状的参数的改善。
在本文中，术语“预防”病状、疾病或者病症包括：预防、延迟或者减少受试者中发展的病状、疾病或者病症的至少一种临床或者亚临床症状出现的发生率和/或可能性，该受试者可能患有或易患该病状、疾病或者病症但尚未经历或者表现出该病状、疾病或者病症的临床或亚临床症状。
术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断的范围内适合用于与人和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、变应性应答或其它问题或并发症，与合理的益处/风险比相称的载剂、赋形剂或稀释剂。
术语“药物组合物”通常是指这样的制剂，其以允许活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对将施用所述组合物的对象具有不可接受的毒性的另外的成分。所述组合物是无菌的。“无菌”组合物是灭菌的，或不含所有活的微生物及它们的孢子。
用于本发明的药物组合物中的示例性载剂包括盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。用于本发明的组合物中的示例性赋形剂包括填充剂、粘合剂、崩解剂、包衣剂、吸附剂、抗粘附剂、助流剂、防腐剂、抗氧化剂、调味剂、着色剂、甜味剂、溶剂、共溶剂、缓冲剂、螯合剂、粘度赋予剂、表面活性剂、稀释剂、润湿剂、载体、稀释剂、防腐剂、乳化剂、稳定剂和张力调节剂。本领域技术人员已知选择合适的赋形剂以制备本发明的组合物。通常，合适的赋形剂的选择尤其取决于所使用的活性剂、待治疗的疾病和组合物的期望剂型。
术语“试剂盒”通常是指包含用于施用本发明的核酸构建体、病毒载体或药物组合物以治疗或预防相关疾病的组分的包装产品。试剂盒的组分可包含在分开的小瓶中(即具有分开部分的试剂盒)，或在单个小瓶内提供。试剂盒可包含试剂，诸如缓冲剂、蛋白稳定试剂、信号产生体系(例如，荧光信号生成体系)、抗体、对照蛋白、以及测试容器。试剂盒还可以包含实施所述方法的说明书。在本发明的一些实施方案中，试剂盒还可以包含施用装置，该施用装置能够以合适的方式将试剂盒中的药物活性成分(例如本发明的抗体或其抗原结合片段)施用于受试者。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通过按照本领域的常规条件，例如，Sambrook和Russeii等人，分子克隆：实验室手册(第三版)(2001)，CSHL出版社中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另有说明，否则以下实施例中所用的实验材料和试剂均可商购获得。
实施例
实施例1：抗PCSK9抗体scFv结构rAAV构建体的设计
设计并优化目的蛋白的基因表达框，将基因表达框插入腺相关病毒载体pAAV-Amp中，即可获得可表达所需蛋白的重组腺相关病毒的构建体质粒(图1)。pAAV-Amp载体来源于康霖生物科技(杭州)有限公司，其包含SV40病毒的多腺苷酸化信号(SV40SL)、反向末端重复序列(ITR)等元件(图2)。
以抗PCSK9抗体Alirocumab的scFv和Evolocumab的scFv为基础设计scFv结构的rAAV构建体，其中目的scFv以融合蛋白形式表达，其排列方式见表1，预测的融合蛋白结构如图3所示。
表1.目的scFv排列方式
设计包含编码上述融合蛋白的核苷酸序列在内的基因表达框，表达框可以包括选自以下的元件的组合：启动子、kozak序列、信号肽、目的scFv融合蛋白、WPRE(SEQ ID NO:23)、UTR(SEQ ID NO:12)、IgG1 Fc、IgG2 Fc和IgG4 Fc。
其中，启动子可以选择CMV启动子(GenBank:MN996867.1，235-818)、CBH启动子(SEQ ID NO:1)、EF1α启动子(GenBank:KY447299.1，529-1710)、CAG启动子(GenBank:KC152483.1，200-1096)、CAGG启动子(GenBank:GU299216.1，63-1664)、CASI启动子(GenBank:ON512571.1，80-1104)、desmin启动子(GenBank:M63391.1，2194-3233)、TMCK启动子(SEQ ID NO:2)、MCK启动子(SEQ ID NO:3)、MHCK7启动子(SEQ ID NO:4)、PGK启动子(GenBank:JF313343.1，683-1192)和TTR启动子(SEQ ID NO:5)中的任何一种。信号肽可以是SAP信号肽(SEQ ID NO:13)、IHC信号肽(SEQ ID NO:14)、ILC信号肽(SEQ ID NO:15)、AP信号肽(SEQ ID NO:16)、CSP信号肽(SEQ ID NO:17)、IL2信号肽(SEQ ID NO:18)、TPA信号肽(SEQ ID NO:19)、L1信号肽(SEQ ID NO:20)、H7信号肽(SEQ ID NO:21)和H1信号肽(SEQID NO:22)中的任何一种。
Alirocumab scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，其编码核苷酸序列如SEQID NO:25所示；Evolocumab scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示。IgG1 Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示，其编码核苷酸序列如SEQID NO:29所示，IgG2 Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示，其编码核苷酸序列如SEQ IDNO:31所示，IgG4 Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO:33所示。
实施例2：抗PCSK9抗体scFv结构rAAV构建体的构建
将实施例1中设计的scFv的基因表达框克隆至rAAV载体中，rAAV载体构建体骨架来源于康霖生物科技(杭州)有限公司的pAAV-Amp。
获得实施例1设计的抗PCSK9抗体的基因表达框的序列片段：编码信号肽tpa+Alirocumab scFv(VL+VH)、信号肽tpa+Evolocumab scFv(VL+VH)、IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG4Fc的序列由通用生物系统(安徽)有限公司合成，启动子、UTR、WPRE等元件的序列片段通过本领域熟知的聚合酶链式反应(PCR)扩增获得。
将所获得的片段通过本领域熟知的同源重组的方法克隆至腺相关病毒表达载体pAAV-Amp上的多克隆位点MluI/XhoI之间，克隆完成后以测序确认序列信息，根据不同元件的组合对rAAV进行命名，比如pAAV-amp-CAG-UTR-tpa-scFv(EA)-IgG4-WPRE等。
将获得的rAAV构建体质粒瞬时转染293T细胞，48h后获得293T细胞的上清，取20μL上清经SDS-PAGE电泳后，将表达的融合蛋白转移到PVDF膜上。以HRP标记的羊抗人IgG Fc抗体(购自KPL，货号：01-10-06)作为二抗进行Western blotting实验或者分别以hPCSK9-HIS蛋白(购自sino，货号：11054-K08H)、anti-PCSK9兔抗体(购自sino，货号：10594-T24)、HRP标记的羊抗兔IgG(H+L)抗体(购自KPL，货号：5220-0283)作为一、二、三抗进行Westernbloting实验。实验结果(图4)显示，rAAV构建体质粒在体外瞬时转染细胞后均能有效地表达目的蛋白，并将成熟的融合蛋白分泌到细胞培养上清中。
实施例3：抗PCSK9抗体scFv结构rAAV的病毒包装
将实施例2构建的rAAV构建体质粒(比如pAAV-amp-CAG-UTR-tpa-scFv(EA)-IgG4-WPRE等)、AAV血清型质粒(pAAV-RC8，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示或pAAV-RC6.2FF，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示)和辅助质粒(pAAV-Helper，其核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示)同时共转染293T细胞(购自美国模式菌种收集中心(ATCC)，保藏号为CRL-3216)，在该293T细胞系中进行rAAV的病毒包装。转染方法为PEI阳离子聚合物介导的真核细胞瞬时转染，PEI阳离子聚合物为购自Polysciences的PEI-Max转染试剂(购自Polysciences，货号：24765-1)，转染操作参照生产商推荐标准化操作进行，转染规模为15cm2细胞培养皿。
转染完成72小时后，将细胞上清及细胞一起收集至50mL离心管中。首先在台式吊桶式机上，室温4200rpm离心10分钟分离细胞及上清。上清转移至新的50mL离心管中添加MgCl2及核酶，混匀待用。剩余细胞添加核酶和细胞裂解液，室温静置1h，随后室温10000g离心10min转移上清至原先细胞上清中，混匀，进行亲和纯化浓缩，用亲和填料(POROS AAVX亲和树脂，Thermo，货号A36743)填装5mL层析柱，用平衡液(20mmol/L PB，0.15mol/L NaCl，pH7.4±0.2)平衡柱子，平衡后样品上样，上样完成后平衡液再平衡5个柱体积，用洗脱缓冲液(0.1mol/L glycine，0.15mol/L NaCl，pH2±0.1)洗脱AAV样本约8mL，用100KD超滤管(Milipore，货号UFC8100)浓缩换液至1mL，换液后AAV溶剂为180mM NaCl，10mM PB，0.001％F-68。纯化后样本分装冻存于-80℃冰箱。
通过本领域熟知的方法，根据定量PCR结果以及AAV标准品为参照计算出rAAV病毒的物理滴度，rAAV标准品为已知滴度的AAV2，包含基因为CMV-EGFP(购自ATCC，货号VR-1616)，用AAV裂解液裂解AAV标准品，梯度稀释作为标准品，样品rAAV同样用裂解液裂解后根据预估滴度稀释到保准曲线包含的范围，qPCR进行滴度测定，换算到VG/mL。
定量PCR使用的引物探针序列为：
ITR-正向引物：GGAACCCCTAGTGATGGAGTT(SEQ ID NO:9)
ITR探针：5’-CACTCCCTCTCTGCGCGC-3’(SEQ ID NO:10)
ITR-反向引物：CGGCCTCAGTGAGCGA(SEQ ID NO:11)
其中ITR探针中5’端带有FAM荧光基团，3’带有BHQ1荧光基团。
实施例4：抗PCSK9抗体scFv结构rAAV病毒的表达检测
将实施例3中经过包装纯化工艺后获得的rAAV病毒，在C2C12细胞系中验证其在细胞内的表达情况。根据rAAV载体重悬液滴度，以MOI为5E4将rAAV接种于24孔细胞培养板中预铺于板中并已分化的C2C12细胞系中，于感染3天后收取细胞上清用于以下实验：
收集rAAV感染的C2C12细胞上清，取20μL上清经SDS-PAGE电泳后，将表达的抗体转移到PVDF膜上，以HRP标记的羊抗人IgG Fc抗体(购自KPL，货号：01-10-06)作为一抗进行Western blotting实验，实验结果(图5)显示，重组腺相关病毒在体外转导细胞后均能有效地表达目的蛋白，并将成熟的融合蛋白分泌到细胞培养上清中。
实施例5：抗PCSK9抗体scFv结构rAAV的体外降脂效果
将实施例3包装产生的rAAV产品以病毒感染复数(MOI)为2E5感染可高表达hPCSK9-flag蛋白的HepG2细胞，72h后收细胞培养上清，通过本领域熟知的ELISA检测方法检测细胞培养基中游离hPCSK9-flag的浓度变化。如表2、图6所示，不同血清型的rAAV产品均能有效降低细胞培养基中hPCSK9-flag的浓度。
表2.不同rAAV感染后培养基中游离PCSK9的浓度
注：W代表WPRE。
将实施例3包装产生的rAAV产品以病毒感染复数(MOI)为2E5感染普通的HepG2细胞，72h后向其中加入500ng/mL蛋白hPCSK9-flag，孵育6h后收细胞培养上清，通过本领域熟知的ELISA检测方法检测细胞培养基中游离hPCSK9-flag的浓度变化。如表3、图7所示，不同血清型的rAAV产品均能有效降低细胞培养基中hPCSK9-flag的浓度。
表3.rAAV感染后表达scFv融合蛋白对外加PCSK9的结合效果
注：W代表WPRE。
实施例6：抗PCSK9抗体scFv结构rAAV的体内降脂效果
将实施例3包装产生的rAAV产品按相同剂量(注射剂量为5E12vg/kg)注射至C57小鼠中，随后定期检测C57小鼠的血脂变化。结果显示scFv结构rAAV能有效降低C57小鼠血清中的低密度脂蛋白胆固醇和总胆固醇浓度(图8)，且能维持长期效果。
为了比较该rAAV产品与已上市的产品药(Repatha)的药效差异，将实施例3包装产生的rAAV产品按相同剂量(注射剂量为5E12vg/kg)以肌肉注射的方式注射至金黄地鼠中，阳性对照组Repatha(15mg/kg)则在rAAV注射3天后注射，随后检测金黄地鼠的血脂变化。结果显示，与PBS对照组相比，scFv结构的rAAV能有效降低金黄地鼠血浆中的低密度脂蛋白胆固醇浓度，该剂量下的效果优于或等于15mg/kg成品药的效果，且持续时间比成品药持续时间更长(图9)。
实施例7：抗PCSK9抗体scFv结构重组慢病毒(LV)构建体的设计
设计并优化目的蛋白的基因表达框，将基因表达框插入慢病毒载体pKL-Kan中，即可获得可表达所需蛋白的重组慢病毒的构建体质粒(图10)。慢病毒载体构建体骨架来源于康霖生物科技(杭州)有限公司自备第3代慢病毒骨架pKL-Kan(图11)。
参考rAAV构建体的设计方案，选取部分方案进行重组慢病毒构建体的设计。
实施例8：抗PCSK9抗体scFv结构重组慢病毒(LV)构建体的构建
将实施例7中设计的scFv基因表达框克隆至慢病毒载体中，慢病毒载体构建体骨架来源于康霖生物科技(杭州)有限公司的pKL-Kan。
获得实施例7设计的抗PCSK9抗体的基因表达框的序列片段：通过本领域熟知的聚合酶链式反应(PCR)，以实施例2获得的rAAV构建体质粒为模板，设计相应的引物扩增获得。
将所获得的片段通过本领域熟知的同源重组的方法克隆至慢病毒载体pKL-Kan上CPPT/CST与3’LTR序列之间，克隆完成后以测序确认序列信息，根据不同元件的组合对重组慢病毒进行命名，比如pKL-lenti-kana-CBH-scFv(AE1)-WPRE等。
将获得的重组慢病毒构建体质粒瞬时转染293T细胞，48h后获得293T细胞的上清，取40μL上清经SDS-PAGE电泳后，将表达的抗体转移到PVDF膜上。以HRP标记的羊抗人IgG Fc抗体(购自KPL，货号：01-10-06)作为二抗进行Western bloting实验。实验结果(见图12)显示，重组慢病毒构建体质粒在体外瞬时转染细胞后均能有效地表达目的蛋白，并将成熟的抗体蛋白分泌到细胞培养上清中。
实施例9：抗PCSK9抗体scFv结构慢病毒(LV)的包装与表达检测
采用本领域熟知的慢病毒包装纯化工艺，将实施例8中构建的抗PCSK9抗体scFv结构慢病毒构建体质粒生产成慢病毒，并检测出该慢病毒的滴度。
将包装纯化后获得的重组慢病毒，以感染复数(MOI)为10感染293T细胞，48h后获得293T细胞的上清，取40μL上清经SDS-PAGE电泳后，将表达的抗体转移到PVDF膜上。以HRP标记的羊抗人IgG Fc抗体(购自KPL，货号：01-10-06)作为二抗进行Western bloting实验。实验结果(见图13)显示，重组慢病毒在体外感染293T细胞后均能有效地表达目的蛋白，并将成熟的抗体蛋白分泌到细胞培养上清中。
实施例10：抗PCSK9抗体scFv结构慢病毒的体外药效
将实施例9包装产生的LV产品以病毒感染复数(MOI)为10感染293T细胞，48h后向实验组和对照组(未感染LV的细胞)细胞中加入500ng/mL的PCSK9-flag蛋白，孵育2小时后收取细胞上清，通过本领域熟知的ELISA检测方法检测细胞培养基中游离hPCSK9-flag的浓度变化，一抗为anti-PCSK9兔抗体(购自sino，货号：10594-T24)，二抗是HRP标记的羊抗兔IgG(H+L)抗体(购自KPL，货号：5220-0283)。如图14所示，LV产品均能降低细胞培养基中hPCSK9-flag的含量。上述结果说明，包含本发明的scFv结构的慢病毒能够有效降低PCSK9蛋白的浓度，从而在降低机体LDL-C、预防或治疗高血脂性疾病方面具有良好的应用前景。
序列表
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
Claims (31)
1.核酸构建体，所述核酸构建体包含一种或多种编码PCSK9结合区的核苷酸序列，例如编码第一PCSK9结合区的第一核苷酸序列和/或编码第二PCSK9结合区的第二核苷酸序列，其中所述第一PCSK9结合区和/或第二PCSK9结合区各自独立地选自衍生自抗PCSK9抗体的抗原结合片段例如scFv，其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列通过编码接头的核苷酸序列或内部核糖体进入位点(IRES)连接。
2.权利要求1的核酸构建体，其中所述核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：
(1)scFv1-linker-scFv2；或
(2)scFv1；
其中，scFv1是编码衍生自抗PCSK9抗体的scFv的核苷酸序列，
scFv2是编码衍生自另一不同的抗PCSK9抗体的scFv的核苷酸序列，
linker是编码接头的核苷酸序列或内部核糖体进入位点(IRES)。
3.权利要求1或2的核酸构建体，其中所述核酸构建体还包含编码抗体的Fc区的核苷酸序列；
优选地，所述Fc区为人IgG1的Fc区、人IgG2的Fc区或人IgG4的Fc区。
4.权利要求3的核酸构建体，其中所述核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：
(1)scFv1-linker-scFv2-Fc；
(2)scFv1-linker-Fc；或
(3)scFv1-Fc；
其中，scFv1是编码衍生自抗PCSK9抗体的scFv的核苷酸序列，
scFv2是编码衍生自另一不同的抗PCSK9抗体的scFv的核苷酸序列，
linker是编码接头的核苷酸序列或内部核糖体进入位点(IRES)，
Fc是编码抗体的Fc区的核苷酸序列。
5.权利要求1-4中任一项的核酸构建体，其中所述抗PCSK9抗体选自阿莫罗布单抗(Alirocumab)和依洛尤单抗(Evolocumab)；
优选地，所述衍生自Alirocumab的scFv包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，所述衍生自Evolocumab的scFv包含如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。
6.权利要求5的核酸构建体，其中所述核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：
(1)AlirscFv-linker-EvolscFv-Fc；
(2)EvolscFv-linker-AlirscFv-Fc；
(3)AlirscFv-linker-Fc；
(4)EvolscFv-linker-Fc；
(5)AlirscFv-Fc；或
(6)EvolscFv-Fc；
其中，AlirscFv是编码衍生自Alirocumab的scFv的核苷酸序列，
EvolscFv是编码衍生自Evolocumab的scFv的核苷酸序列，
linker是编码接头的核苷酸序列或内部核糖体进入位点(IRES)，
Fc是编码抗体的Fc区的核苷酸序列。
7.权利要求1-6中任一项的核酸构建体，其中所述接头为不可切割的接头。
8.权利要求7的核酸构建体，其中所述接头选自(G1S)n，(G2S)n，(G3S)n和(G4S)n，其中n为1-10，优选n为2-8，更优选n为4或5。
9.权利要求3-8中任一项的核酸构建体，其中所述抗体的Fc区包含如SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。
10.权利要求1-9中任一项的核酸构建体，其中所述核酸构建体编码融合蛋白，所述融合蛋白包含选自SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:48的氨基酸序列。
11.权利要求1-10中任一项的核酸构建体，其中所述核酸构建体包含选自SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:47和SEQ ID NO:49的核苷酸序列。
12.权利要求1-11中任一项的核酸构建体，其中所述一种或多种编码PCSK9结合区的核苷酸序列的5’端进一步包含编码信号肽的核苷酸序列；
优选地，所述信号肽选自：SAP信号肽、IHC信号肽、ILC信号肽、AP信号肽、CSP信号肽、IL2信号肽、TPA信号肽、L1信号肽、H7信号肽和H1信号肽；
更优选地，所述信号肽为TPA信号肽。
13.权利要求1-12中任一项的核酸构建体，其中所述核酸构建体还包含用于所述编码序列表达的启动子，优选所述启动子选自CBH启动子和CAG启动子。
14.权利要求1-13中任一项的核酸构建体，其中所述核酸构建体为病毒载体。
15.权利要求14的核酸构建体，其中所述病毒载体为腺相关病毒载体。
16.权利要求15的核酸构建体，其中所述腺相关病毒载体还包含选自SV40病毒的多腺苷酸化信号(SV40SL)、土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件(WPRE)和反向末端重复序列(ITR)的一个或多个元件。
17.权利要求14的核酸构建体，其中所述病毒载体为慢病毒载体。
18.权利要求17的核酸构建体，其中所述慢病毒载体还包含选自嵌合型LTR启动子、HIV-1包装信号(ψ)、中心聚嘌呤区(cPPT)、Rev应答元件(RRE)、多嘌呤片段(PPT)、土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件(WPRE)、SV40病毒的多腺苷酸化信号(SV40SL)、SV40病毒的复制起始位点(SV40 ori)和自失活长末端重复序列的一个或多个元件。
19.病毒颗粒，其包含权利要求1-18中任一项的核酸构建体；
优选地，所述病毒颗粒是腺相关病毒颗粒或慢病毒颗粒。
20.权利要求19的病毒颗粒，其中所述腺相关病毒颗粒为AAV8或AAV6血清型。
21.细胞，其包含权利要求1-18中任一项的核酸构建体。
22.权利要求21的细胞，其中所述核酸构建体是腺相关病毒载体，所述细胞还包含用于将所述核酸构建体组装到病毒颗粒中的血清型质粒和/或辅助质粒；
优选地，所述血清型质粒为AAV8或AAV6血清型质粒。
23.权利要求21的细胞，其中所述核酸构建体是慢病毒载体，所述细胞还包含用于将所述核酸构建体组装到病毒颗粒中的包膜质粒和/或包装质粒。
24.载体系统，其包含权利要求1-18中任一项所述的核酸构建体，和任选地一种或多种另外的载体。
25.权利要求24的载体系统，其中所述核酸构建体是腺相关病毒载体，所述载体系统还包含用于将所述核酸构建体组装到病毒颗粒中的血清型质粒和/或辅助质粒；
优选地，所述血清型质粒为AAV8或AAV6血清型质粒。
26.权利要求24的载体系统，其中所述核酸构建体是慢病毒载体，所述载体系统还包含用于将所述核酸构建体组装到病毒颗粒中的包膜质粒和/或包装质粒。
27.权利要求24-26中任一项的载体系统，其进一步包含宿主细胞；
优选地；所述宿主细胞是293T细胞。
28.组合物，其包含权利要求1-18中任一项的核酸构建体、权利要求19或20的病毒颗粒、权利要求21-23中任一项的细胞或权利要求24-27中任一项的载体系统，和任选地药学上可接受的载剂和/或赋形剂。
29.试剂盒，其包含权利要求1-18中任一项的核酸构建体、权利要求19或20的病毒颗粒、权利要求21-23中任一项的细胞、权利要求24-27中任一项的载体系统或权利要求28的组合物，以及用于肌肉注射或静脉注射的装置。
30.用于预防、改善或治疗受试者中高血脂性疾病的方法，其包括向所述受试者施用权利要求1-18中任一项的核酸构建体、权利要求19或20的病毒颗粒、权利要求21-23中任一项的细胞、权利要求24-27中任一项的载体系统或权利要求28的组合物的步骤。
31.权利要求30的方法，其中所述高血脂性疾病选自家族性高胆固醇血症和动脉粥样硬化。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311296135.2A CN117363656A (zh) | 2023-09-28 | 2023-09-28 | 核酸构建体及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311296135.2A CN117363656A (zh) | 2023-09-28 | 2023-09-28 | 核酸构建体及其用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117363656A true CN117363656A (zh) | 2024-01-09 |
Family
ID=89395629
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311296135.2A Pending CN117363656A (zh) | 2023-09-28 | 2023-09-28 | 核酸构建体及其用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117363656A (zh) |
-
2023
- 2023-09-28 CN CN202311296135.2A patent/CN117363656A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11732246B2 (en) | Compositions useful in treatment of ornithine transcarbamylase (OTC) deficiency | |
| JP7021786B2 (ja) | キャプシド修飾ｒＡＡＶ３ベクター組成物およびヒト肝がんの遺伝子治療における使用方法 | |
| CN112004820B (zh) | 具有增强的人胰腺向性的新型重组腺相关病毒衣壳 | |
| US10385320B2 (en) | Recombinant adeno-associated virus capsids with enhanced human skeletal muscle tropism | |
| US8574583B2 (en) | AAV capsid library and AAV capsid proteins | |
| AU2017257169B2 (en) | Evasion of neutralizing antibodies by a recombinant adeno-associated virus | |
| JP2019509032A (ja) | 既存のヒト中和抗体に対して耐性である新規組換えアデノ随伴ウイルスカプシド | |
| WO2019154939A1 (en) | Hybrid regulatory elements | |
| US20220372512A1 (en) | Methods and aav vectors for in vivo transduction | |
| KR20190123752A (ko) | 척수근 위축증의 치료에 유용한 조성물 | |
| CN113518824A (zh) | 新的aav变体 | |
| WO2018057916A1 (en) | Novel humanized anti-ebola antibodies useful in preventing ebola infections | |
| CN113121651A (zh) | 新型低中和抗体腺相关病毒衣壳蛋白 | |
| JP7334996B2 (ja) | グルコーストランスポーター１発現用アデノ随伴ウイルスベクター | |
| US20220265853A1 (en) | Adeno-associated virus virion for gene transfer to human liver | |
| CN116983434B (zh) | 用于基因治疗的核酸构建体及其用途 | |
| CN117363656A (zh) | 核酸构建体及其用途 | |
| WO2024067776A1 (zh) | 核酸构建体及其用途 | |
| US20230340526A1 (en) | Novel aav3b variants that target hepatocytes and evade the humoral immune response | |
| WO2023178171A2 (en) | Cassettes of anti-complement component 3 antibody, vectorization and theraputic application | |
| WO2023147304A1 (en) | Aav capsids for improved heart transduction and detargeting of liver | |
| TW202325720A (zh) | 經修飾aav蛋白殼及載體 | |
| CN116790615A (zh) | 一种用于过敏性疾病的基因治疗载体核酸构建体及其使用方法 | |
| CN117003833A (zh) | 肝脏特异性的腺相关病毒血清型及应用 | |
| KR20230104136A (ko) | 조성물 및 이의 용도 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 40096820 Country of ref document: HK |