JP2019529385A - Ｃｎｓ障害を治療するための方法及びベクター - Google Patents

Ｃｎｓ障害を治療するための方法及びベクター Download PDF

Info

Publication number
JP2019529385A
JP2019529385A JP2019512292A JP2019512292A JP2019529385A JP 2019529385 A JP2019529385 A JP 2019529385A JP 2019512292 A JP2019512292 A JP 2019512292A JP 2019512292 A JP2019512292 A JP 2019512292A JP 2019529385 A JP2019529385 A JP 2019529385A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
mammal
aav
therapeutic protein
vector
cns
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2019512292A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2019529385A5 (ja
Inventor
キャサリン エー． ハイ，
キャサリン エー． ハイ，
ビバリー エル． デイビッドソン，
ビバリー エル． デイビッドソン，
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Childrens Hospital of Philadelphia CHOP
Spark Therapeutics Inc
Original Assignee
Childrens Hospital of Philadelphia CHOP
Spark Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Childrens Hospital of Philadelphia CHOP, Spark Therapeutics Inc filed Critical Childrens Hospital of Philadelphia CHOP
Publication of JP2019529385A publication Critical patent/JP2019529385A/ja
Publication of JP2019529385A5 publication Critical patent/JP2019529385A5/ja
Priority to JP2022002163A priority Critical patent/JP2022050574A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/775—Apolipopeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/06—Sulfuric ester hydrolases (3.1.6)
    • C12Y301/06004—N-Acetylgalactosamine-6-sulfatase (3.1.6.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01031—Beta-glucuronidase (3.2.1.31)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A01K2217/052—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing gain of function
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • A01K2267/0312—Animal model for Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/14—Dipeptidyl-peptidases and tripeptidyl-peptidases (3.4.14)
    • C12Y304/14009—Tripeptidyl-peptidase I (3.4.14.9)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

哺乳動物のＣＮＳ（例えば、脳）への送達のために、哺乳動物の非中枢神経系（ＣＮＳ）細胞、器官、又は組織に投与することにより、哺乳動物の疾患を治療する方法及び使用が提供される。哺乳動物の疾患を治療する方法及び使用は、特に、哺乳動物の眼球細胞、器官、又は組織への送達のために、哺乳動物の非眼球細胞、器官、又は組織に投与するステップを含む。【選択図】なし

Description

[0002]中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患、例えばアルツハイマー病等の脳の遺伝性疾患の治療は、難問として存続している。脳疾患を治療する際の重要な問題として、治療用タンパク質は、静脈内に送達されたとき、血液脳関門を横断しないこと、又は脳に直接送達されたとき、幅広く分布しないことが挙げられる。従って、アルツハイマー病を治療するための療法が開発される必要がある。
[0003]いくつかの異なるヒトアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）アイソフォームが存在し、脳内でそれらのアイソフォームのうちのいくつかが存在すると、アルツハイマー病（ＡＤ）に対するリスクが高まるが、一方その他のアイソフォームが存在するとＡＤに対するリスクは減少する。ＡｐｏＥε４アイソフォームの存在は、晩期発症型散発性ＡＤに対する強い遺伝的リスク因子である（Casellanoら、Sci Transl Med, 3(89):89ra57 (29June 2011)）。ＡｐｏＥε４対立遺伝子はＡＤリスクを著しく増加させ、また発症年齢を低下させる。一方、ＡｐｏＥε２対立遺伝子の存在は、ＡＤリスクを減少させると思われる。ヒトＡｐｏＥアイソフォームは、ｉｎ ｖｉｖｏでのアミロイドβ（Ａβ）の排出又は合成に差動的に影響を及ぼすことが示唆される。
[0004]特定の実施形態では、本発明は、哺乳動物のＣＮＳ（例えば、脳）への送達のために、哺乳動物の非中枢神経系（ＣＮＳ）細胞、器官、又は組織に投与するステップを含む、哺乳動物の疾患を治療する方法を提供する。特定の実施形態では、本発明は、哺乳動物の眼球細胞、器官、又は組織への送達のために、哺乳動物の非眼球細胞、器官、又は組織に投与するステップを含む、哺乳動物の疾患を治療する方法を提供する。
[0005]哺乳動物には、非ＣＮＳ細胞、器官、又は組織を感染させるのに有効な方式で、ＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子と、一対のＡＡＶ末端逆位反復配列の間に挿入された、治療用タンパク質をコードする核酸を含むベクターとを投与することができる。哺乳動物には、非眼球細胞、器官、又は組織を感染させるのに有効方な式で、ＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子と、一対のＡＡＶ末端逆位反復配列の間に挿入された、治療用タンパク質をコードする核酸を含むベクターとを投与することができる。
[0006]特定の実施形態では、非ＣＮＳ細胞、器官、又は組織、及び非眼球細胞、器官、又は組織として、哺乳動物の内分泌細胞、器官、又は組織が挙げられる。代表的な内分泌細胞、器官、又は組織として、肝臓の細胞、器官、及び組織、並びに膵臓の細胞、器官、及び組織が挙げられる。特定の実施形態では、肝臓の細胞、器官、又は組織は、肝細胞である、又はそれを含む。
[0007]特定の実施形態では、本発明は、防御性ＡｐｏＥアイソフォームを、非齧歯類哺乳動物の非ＣＮＳ細胞、器官、又は組織に（例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）又は脳にではなく）送達又は投与することにより、非齧歯類哺乳動物のＣＮＳに送達する方法を提供する。１つの実施形態では、非ＣＮＳ細胞が哺乳動物の体循環（脈管構造又は血管）中に防御性ＡｐｏＥアイソフォームを分泌するように、非齧歯類哺乳動物内の非ＣＮＳ細胞を感染させるのに有効な方式で、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶカプシドタンパク質を含み、ベクターは、一対のＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）の間に挿入された、防御性ＡｐｏＥアイソフォームをコードする核酸を含む。循環中の防御性ＡｐｏＥアイソフォームは、血液脳関門を横断し、ＣＮＳ（例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）又は脳、例えば脳実質等）に進入する。
[0008]特定の実施形態では、本発明は、ＴＰＰ１（トリペプチジルペプチダーゼＩ）、ＣＬＮ３（バッテニン（Battenin））、ＰＰＴ１（パルミトイルタンパク質チオエステラーゼＩ）、ＣＬＮ６（神経セロイドリポフスチン症タンパク質６）、又はＣＬＮ８を、非齧歯類哺乳動物の非ＣＮＳ細胞、器官、又は組織に（例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）又は脳にではなく）送達又は投与することにより、非齧歯類哺乳動物のＣＮＳに送達する方法を提供する。１つの実施形態では、非ＣＮＳ細胞が哺乳動物の体循環（脈管構造又は血管）中にＴＰＰ１、ＣＬＮ３、ＰＰＴ１、ＣＬＮ６、又はＣＬＮ８を分泌するように、非齧歯類哺乳動物内の非ＣＮＳ細胞を感染させるのに有効な方式で、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶカプシドタンパク質を含み、ベクターは、一対のＡＡＶ末端逆位反復配列の間に挿入された、ＴＰＰ１、ＣＬＮ３、ＰＰＴ１、ＣＬＮ６、又はＣＬＮ８をコードする核酸を含む。循環中のＴＰＰ１、ＣＬＮ３、ＰＰＴ１、ＣＬＮ６、又はＣＬＮ８は、血液脳関門を横断し、ＣＮＳ（例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）又は脳、例えば脳実質等）に進入する。
[0009]特定の実施形態では、本発明は、非齧歯類哺乳動物の非眼球細胞、器官、又は組織に送達又は投与することにより、非齧歯類哺乳動物の眼球細胞、組織又は器官に治療用タンパク質を送達する方法を提供する。１つの実施形態では、非眼球細胞、組織又は器官が哺乳動物の体循環（脈管構造又は血管）中に治療用タンパク質を分泌するように、非齧歯類哺乳動物内の非眼球細胞、組織又は器官を感染させるのに有効な方式で、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶカプシドタンパク質を含み、ベクターは、一対のＡＡＶ末端逆位反復配列の間に挿入された、治療用タンパク質をコードする核酸を含む。循環中の治療用タンパク質は血液脳関門を横断し、眼球細胞、組織、又は器官に進入する。
[0010]特定の実施形態では、本発明は、哺乳動物のＣＮＳ（例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）又は脳、例えば脳実質等）への送達のために、哺乳動物の非ＣＮＳ細胞、器官、又は組織をトランスフェクトする方法を提供する。１つの態様では、方法は、ＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子と、一対のＡＡＶ末端逆位反復配列の間に挿入された、防御性ＡｐｏＥアイソフォームをコードする核酸を含むベクターとを、哺乳動物の内分泌細胞、組織、又は器官に送達又は投与するステップを含み、このステップは、防御性ＡｐｏＥアイソフォームの発現と、それに続く例えば体循環（脈管構造又は血管）を経由する哺乳動物のＣＮＳ（例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）又は脳、例えば脳実質等）への送達のために、内分泌細胞、組織、又は器官（例えば、肝臓及び／又は膵臓）を感染させるのに有効な方式でなされる。別の態様では、方法は、ＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子と、一対のＡＡＶ末端逆位反復配列の間に挿入された、防御性ＡｐｏＥアイソフォームをコードする核酸を含むベクターとを、哺乳動物の肝臓及び／又は膵臓に送達又は投与するステップを含み、このステップは、防御性ＡｐｏＥアイソフォームの発現と、それに続く例えば体循環（脈管構造又は血管）を経由する哺乳動物のＣＮＳ（例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）又は脳、例えば脳実質等）への送達のために、内分泌細胞、組織、又は器官（例えば、肝臓及び／又は膵臓）を感染させるのに有効な方式でなされる。
[0011]本明細書で使用する場合、用語「防御性ＡｐｏＥアイソフォーム」とは、アルツハイマー病の１つ又は複数の症状又は兆候（例えば、物理的、生理学的、生化学的、組織学的、行動学的）を減少させるＡｐｏＥアイソフォームを意味する。防御性ＡｐｏＥアイソフォームとは、アルツハイマー病のリスクを少なくとも５％、例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％等又はそれ超低下させることができるＡｐｏＥアイソフォームも意味する。
[0012]特定の実施形態では、本発明は、リソソーム蓄積症又は障害を治療する方法を提供する。特定の実施形態では、疾患又は障害は、ＴＰＰ１（トリペプチジルペプチダーゼＩ）、ＣＬＮ３（バッテニン）、ＰＰＴ１（パルミトイルタンパク質チオエステラーゼＩ）、ＣＬＮ６（ニューロンセロイドリポフスチン沈着症タンパク質６）、又はＣＬＮ８の発現又は活性における欠乏又は欠陥である。特定の実施形態では、疾患は、神経変性疾患、例えばニューロンセロイドリポフスチン沈着症（ＮＣＬ）等、例えば幼児ＮＣＬ、遅発性幼児ＮＣＬ、若年性ＮＣＬ（バッテン病）、及び成人ＮＣＬ等である。本発明に基づき治療されるその他のリソソーム蓄積症は、ムコ多糖症（ＭＰＳ ＩＶ及びＭＰＳ ＶＩＩ）等のようにその他の組織／器官に影響を及ぼし、並びに本明細書に記載する方法に基づき、ＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子、及び治療用タンパク質をコードする核酸を含むベクターを用いて治療可能である。
[0013]特定の実施形態では、疾患又は障害は、神経変性疾患、例えばニューロンセロイドリポフスチン沈着症（ＮＣＬ）等、例えば幼児ＮＣＬ、遅発性幼児ＮＣＬ、若年性ＮＣＬ（バッテン病）、及び成人ＮＣＬ等である（治療用タンパク質の発現と、それに続く例えば体循環（脈管構造又は血管）を経由する哺乳動物のＣＮＳへの送達のために、肝臓及び／又は膵臓を感染させるのに有効な方式で、一対のＡＡＶ末端逆位反復配列の間に挿入される）。１つの態様では、方法は、ＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子と、一対のＡＡＶ末端逆位反復配列の間に挿入された、ＴＰＰ１、ＣＬＮ３、ＰＰＴ１、ＣＬＮ６、又はＣＬＮ８をコードする核酸を含むベクターとを、哺乳動物の肝臓及び／又は膵臓に送達又は投与するステップを含み、このステップは、ＴＰＰ１、ＣＬＮ３、ＰＰＴ１、ＣＬＮ６、又はＣＬＮ８の発現と、それに続く例えば体循環（脈管構造又は血管）を経由する哺乳動物のＣＮＳ（例えば、脳）への送達のために、肝臓及び／又は膵臓を感染させるのに有効な方式でなされる。
[0014]特定の実施形態では、哺乳動物は非齧歯類哺乳動物である。特定の実施形態では、非齧歯類哺乳動物は、霊長類、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、又はイヌである。特定の実施形態では、哺乳動物はヒトである。特定の実施形態では、霊長類はヒトである。特定の実施形態では、ヒトは、新生児、幼児、子供、ティーンエイジャー、又は若年成人である。
[0015]特定の実施形態では、哺乳動物（例えば、ヒト）は、遺伝子置換又は抑制療法により治療可能なＣＮＳの欠陥又は障害を有する。
[0016]特定の実施形態では、コードされる防御性ＡｐｏＥアイソフォームは、哺乳動物（例えば、霊長類、例えばヒト等）のＡｐｏＥε２に対して少なくとも約７０％又はそれ超の同一性（例えば、７０〜８０％又は８０〜９０％）を有する。特定の実施形態では、コードされる防御性ＡｐｏＥアイソフォームは、哺乳動物（例えば、霊長類、例えばヒト等）のＡｐｏＥε２に対して９０〜１００％の同一性を有する。
[0017]特定の実施形態では、コードされるＴＰＰ１は、哺乳動物（例えば、霊長類、例えばヒト等）のＴＰＰ１に対して少なくとも約７０％又はそれ超の同一性（例えば、７０〜８０％又は８０〜９０％）を有する。特定の実施形態では、コードされるＴＰＰ１は、哺乳動物（例えば、霊長類、例えばヒト等）のＴＰＰ１に対して９０〜１００％の同一性を有する。
[0018]特定の実施形態では、コードされるＣＬＮ３、ＰＰＴ１、ＣＬＮ６、又はＣＬＮ８は、哺乳動物（例えば、霊長類、例えばヒト等）のＣＬＮ３、ＰＰＴ１、ＣＬＮ６、又はＣＬＮ８に対して少なくとも約７０％又はそれ超の同一性（例えば、７０〜８０％又は８０〜９０％）を有する。特定の実施形態では、コードされるＣＬＮ３、ＰＰＴ１、ＣＬＮ６、又はＣＬＮ８は、哺乳動物（例えば、霊長類、例えばヒト等）のＣＬＮ３、ＰＰＴ１、ＣＬＮ６、又はＣＬＮ８に対して９０〜１００％の同一性を有する。
[0019]特定の実施形態では、コードされるガラクトサミン−６−スルファターゼは、哺乳動物（例えば、霊長類、例えばヒト等）のガラクトサミン−６−スルファターゼに対して少なくとも約７０％又はそれ超の同一性（例えば、７０〜８０％又は８０〜９０％）を有する。特定の実施形態では、コードされるガラクトサミン−６−スルファターゼは、哺乳動物（例えば、霊長類、例えばヒト等）のガラクトサミン−６−スルファターゼに対して９０〜１００％の同一性を有する。
[0020]特定の実施形態では、コードされるβ−グルクロニダーゼは、哺乳動物（例えば、霊長類、例えばヒト等）のβ−グルクロニダーゼに対して少なくとも約７０％又はそれ超の同一性（例えば、７０〜８０％又は８０〜９０％）を有する。特定の実施形態では、コードされるβ−グルクロニダーゼは、哺乳動物（例えば、霊長類、例えばヒト等）のβ−グルクロニダーゼに対して９０〜１００％の同一性を有する．
[0021]特定の実施形態では、治療用タンパク質をコードするコドン最適化核酸バリアントがベクターで採用される。特定の態様では、そのようなコドン最適化核酸バリアントは、コードされる治療用タンパク質について、その転写及び／又は翻訳の増加を実現する。そのようなコドン最適化核酸バリアントは、治療用タンパク質をコードする非コドン最適化核酸と比較して、特定のコドン最適化核酸バリアントについて、例えば０．５〜１０倍の発現増加を示し得る。
[0022]特定の実施形態では、治療用タンパク質をコードするシトシン−グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）が低減された核酸バリアントがベクターで採用される。そのようなシトシン−グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）が低減された核酸バリアントとして、治療用タンパク質をコードする非ＣｐＧが低減されたの核酸と比較して、特定のＣｐＧが低減された核酸バリアントについて、例えば０．５〜１０倍の発現増加を示すバリアントが挙げられる。
[0023]１つの実施形態では、治療用タンパク質をコードする核酸バリアントは、該タンパク質をコードするＣｐＧが低減されていない核酸と比較して、シトシン−グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）含有量が低減されている。特別な態様では、核酸バリアントが有するシトシン−グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）は、治療用タンパク質をコードするＣｐＧが低減されていない核酸よりも少なくとも１０個少ない。追加の特別な態様では、核酸バリアントが有するＣｐＧは、２０個以下、１５個以下、１０個以下、又は５個以下である。より特別な態様では、核酸バリアントが有するＣｐＧは、最大で４個、３個、２個、又は１個である。更なる特別な態様では、治療用タンパク質をコードする核酸バリアントは、シトシン−グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を有さない。
[0024]特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＬＫ０１、ＬＫ０２、ＬＫ０３、ＡＡＶ４−１、及び／又はＡＡＶ−２ｉ８のＩＴＲ及び／又はカプシドに基づく、又はそれらに対して配列同一性を有するＩＴＲ及び／又はカプシドを含む。特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＬＫ０１、ＬＫ０２、ＬＫ０３、ＡＡＶ４−１、及び／又はＡＡＶ−２ｉ８のＩＴＲ及び／又はカプシドに対して１００％未満の配列同一性を有するバリアントを含む。バリアントは、アミノ酸の挿入、付加、置換、及び欠損を含む。特別な態様では、バリアントは、国際公開第２０１３／１５８８７９号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３７１７０号）、国際公開第２０１５／０１３３１３号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４７６７０号）、及び米国特許出願公開第２０１３／００５９７３２号（ＬＫ０１、ＬＫ０２、ＬＫ０３等について開示する米国特許出願第１３／５９４，７７３号）に記載されている。
[0025]特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＬＫ０１、ＬＫ０２、ＬＫ０３、ＡＡＶ４−１、及び／又はＡＡＶ−２ｉ８に対して少なくとも７０〜８０％、８０〜９０％、又は９０〜９９％同一の１つ若しくは複数のＩＴＲ及び／又はカプシド（ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３）を含む。特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＬＫ０１、ＬＫ０２、ＬＫ０３、ＡＡＶ４−１、及び／又はＡＡＶ−２ｉ８のＩＴＲ及び／又はカプシドのいずれかに対して、７５％若しくはそれ超の配列同一性（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％等）を有するＩＴＲ（複数可）及び／又はカプシド（複数可）（ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３）を含む。特別な態様では。
[0026]特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２カプシド（ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３）、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＬＫ０１、ＬＫ０２、ＬＫ０３、ＡＡＶ４−１、及び／又はＡＡＶ−２ｉ８に対して１００％の同一性を有する１つ若しくは複数のＩＴＲ及び／又はカプシド（ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３）を含む。
[0027]特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＩＴＲ血清型とは異なるＡＡＶカプシド血清型を含むＡＡＶ血清型又はＡＡＶ偽型を含む。ＩＴＲとカプシドの血清型が異なる場合、ＡＡＶカプシド血清型がＩＴＲ血清型とは異なる偽型ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＬＫ０１、ＬＫ０２、ＬＫ０３、ＡＡＶ４−１、及び／又はＡＡＶ−２ｉ８のＩＴＲ及び／又はカプシドのいずれかに対して、７５％若しくはそれ超の配列同一性（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％等）を有するＩＴＲ（複数可）及び／又はカプシド（複数可）（ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３）から構成され得る。
[0028]特別な態様では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＬＫ０１、ＬＫ０２、ＬＫ０３、ＡＡＶ４−１、及び／又はＡＡＶ−２ｉ８のいずれかに対して１００％の同一性を有するＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３カプシド配列、並びに異なる血清型に由来する１つ又は複数のＩＴＲ、例えば、ＡＡＶ１カプシドを有するＡＡＶ２ＩＴＲ（ＡＡＶ２／１）、ＡＡＶ１カプシドを有するＡＡＶ６ＩＴＲ（ＡＡＶ６／１）、ＬＫ０１カプシドを有するＡＡＶ２ＩＴＲ（ＡＡＶ２／ＬＫ０３）、ＡＡＶ４−１カプシドを有するＡＡＶ２ＩＴＲ（ＡＡＶ２／４−１）、ＬＫ０１カプシドを有するＡＡＶ６ＩＴＲ（ＡＡＶ６／ＬＫ０３）、又はＡＡＶ４−１カプシドを有するＡＡＶ６ＩＴＲ（ＡＡＶ６／４−１）を含む。
[0029]ｒＡＡＶベクターは、シス又はトランスで作用する追加のコンポーネント又はエレメントを含み得る。特別な実施形態では、ｒＡＡＶベクター等のベクターは、イントロン、発現制御エレメント、１つ若しくは複数のＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＬＫ０１、ＬＫ０２、ＬＫ０３、ＡＡＶ４−１、及び／又はＡＡＶ−２ｉ８血清型のいずれか又はその組合せ）、フィラーポリヌクレオチド配列、及び／又はポリＡシグナルを更に含む。特別な態様では、イントロンが治療用タンパク質をコードする核酸内にあり若しくはそれに隣接しており、及び／又は発現制御エレメントが治療用タンパク質をコードする核酸と作動可能に連結しており、及び／又はＡＡＶ ＩＴＲ（複数可）が治療用タンパク質をコードする核酸の５’若しくは３’末端に隣接しており、及び／又はフィラーポリヌクレオチド配列が治療用タンパク質をコードする核酸の５’若しくは３’末端に隣接している。
[0030]特別な実施形態では、発現制御エレメントは、構成的若しくは調節可能な制御エレメント、又は組織特異的発現制御エレメント若しくはプロモーターを含む。特別な態様では、発現制御エレメントはエンハンサーを含む。特定の態様では、発現制御エレメント（例えば、プロモーター又はエンハンサー）は、肝臓の細胞、器官、若しくは組織、又は膵臓の細胞、器官、若しくは組織において発現を引き起こす。特別な態様では、発現制御エレメント（例えば、プロモーター又はエンハンサー）は、肝臓内で発現を引き起こすエレメントを含む（例えば、ＴＴＲプロモーター又は突然変異体ＴＴＲプロモーター）。
[0031]特定の実施形態では、本発明は、哺乳動物内の非ＣＮＳ細胞、器官、又は組織にトランスフェクトしてＣＮＳにおいて治療結果を生み出すのに使用される、一対のＡＡＶ ＩＴＲの間に挿入された、防御性ＡｐｏＥアイソフォームをコードする核酸を含むベクターを含有するｒＡＡＶ粒子を提供する。１つの態様では、使用は哺乳動物におけるアルツハイマー病の治療を目的とする。
[0032]特定の実施形態では、本発明は、哺乳動物内の非ＣＮＳ細胞、器官、又は組織にトランスフェクトしてＣＮＳにおいて治療結果を生み出すのに使用される、一対のＡＡＶ ＩＴＲの間に挿入された、ＴＰＰ１をコードする核酸を含むベクターを含有するｒＡＡＶ粒子を提供する。１つの態様では、使用は哺乳動物におけるニューロンセロイドリポフスチン沈着症の治療を目的とする。
[0033]特定の実施形態では、本発明は、哺乳動物内の非ＣＮＳ細胞、器官、又は組織にトランスフェクトしてＣＮＳにおいて治療結果を生み出すのに使用される、一対のＡＡＶ ＩＴＲの間に挿入された、ＣＬＮ３、ＰＰＴ１、ＣＬＮ６、又はＣＬＮ８をコードする核酸を含むベクターを含有するｒＡＡＶ粒子を提供する。１つの態様では、使用は哺乳動物におけるバッテン病の治療を目的とする。
[0034]特定の実施形態では、本発明は、哺乳動物内の非眼球細胞、器官、又は組織にトランスフェクトして眼球細胞、組織又は器官において治療結果を生み出すのに使用される、一対のＡＡＶ ＩＴＲの間に挿入された、ガラクトサミン−６−スルファターゼをコードする核酸を含むベクターを含有するｒＡＡＶ粒子を提供する。１つの態様では、使用はＭＰＳ ＩＶの治療を目的とする。
[0035]特定の実施形態では、本発明は、哺乳動物内の非眼球細胞、器官、又は組織にトランスフェクトして眼球細胞、組織、又は器官において治療結果を生み出すのに使用される、一対のＡＡＶ ＩＴＲの間に挿入された、β−グルクロニダーゼをコードする核酸を含むベクターを含有するｒＡＡＶ粒子を提供する。１つの態様では、使用は、ＭＰＳ ＶＩＩの治療を目的とする。
[0036]特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、哺乳動物１キログラム当たり、ベクターゲノム約１×１０８〜１×１０１０個、１×１０１０〜１×１０１１個、１×１０１１〜１×１０１２個、１×１０１２〜１×１０１３個、又は１×１０１３〜１×１０１４個（ｖｇ／ｋｇ）の範囲の用量で提供、投与、送達、又は使用される。特定の態様では、ｒＡＡＶベクターは、１キログラム当たりベクターゲノム１×１０１２個（ｖｇ／ｋｇ）未満の用量で投与又は使用される。特定の態様では、ｒＡＡＶベクターは、哺乳動物１キログラム当たりベクターゲノム約５×１０１１個（ｖｇ／ｋｇ）の用量で投与又は使用される。
[0037]より特別な態様では、提供、投与、送達、又は使用されるｒＡＡＶベクターの量は、所望の治療効果を実現するのに、哺乳動物の体重１キログラム当たり、少なくともベクターゲノム（ｖｇ）１×１０１０個（ｖｇ／ｋｇ）であるか、又は哺乳動物の体重１ｋｇ当たり、ｖｇ約１×１０１０〜１×１０１１個の間であるか、又は哺乳動物の体重１ｋｇ当たり、ｖｇ約１×１０１１〜１×１０１２個の間（例えば、約１×１０１１〜２×１０１１ｖｇ／ｋｇ、又は約２×１０１１〜３×１０１１ｖｇ／ｋｇ、又は約３×１０１１〜４×１０１１ｖｇ／ｋｇ、又は約４×１０１１〜５×１０１１ｖｇ／ｋｇ、又は約５×１０１１〜６×１０１１ｖｇ／ｋｇ、又は約６×１０１１〜７×１０１１ｖｇ／ｋｇ、又は約７×１０１１〜８×１０１１ｖｇ／ｋｇ、又は約８×１０１１〜９×１０１１ｖｇ／ｋｇ、又は約９×１０１１〜１×１０１２ｖｇ／ｋｇ）であるか、又は哺乳動物の体重１ｋｇ当たり、ｖｇ約１×１０１２〜１×１０１３個の間である。追加の特別な量は、所望の治療効果を実現するのに、哺乳動物の体重１キログラム当たり、ベクターゲノム（ｖｇ）約５×１０１０〜１×１０１０個（ｖｇ／ｋｇ）の範囲であってもよく、又は哺乳動物の体重１ｋｇ当たり、ｖｇ約１×１０１０〜５×１０１１個の範囲であってもよく、又は哺乳動物の体重１ｋｇ当たり、ｖｇ約５×１０１１〜１×１０１２個の範囲であってもよく、又は哺乳動物の体重１ｋｇ当たり、ｖｇ約１×１０１２〜５×１０１３個の範囲であってもよい。
[0038]特定の実施形態では、発明の方法及び／又は使用は、本明細書に記載するように、哺乳動物内で治療用タンパク質及び／又はｒＡＡＶ粒子に対する実質的な免疫応答を誘発又は生成しない。特定の態様では、哺乳動物は、治療用タンパク質及び／又はｒＡＡＶ粒子に対して実質的な体液性免疫応答を生成しない。特定の態様では、治療用タンパク質及び／又はｒＡＡＶ粒子に対する実質的な免疫応答（例えば、体液性）は、少なくとも連続して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日、週、又は月にわたり生成されない。
[0039]治療の文脈における実質的な免疫応答とは、有効性を有意に低下させる応答と考えられる。従って、ＣＮＳ障害又は疾患の場合、ＣＮＳ障害又は疾患を治療した際に検出可能な有効性が認められない場合には、実質的な免疫応答となる。従って、実質的な免疫応答とは、治療の文脈におおいて、最低限度である免疫応答、又は有効性の喪失若しくは有意な低下を引き起こさない免疫応答を意味しない。
[0040]特定の実施形態では、哺乳動物は、治療用タンパク質及び／又はｒＡＡＶ粒子に対して検出可能な免疫応答を起こさない。特定の実施形態では、哺乳動物は、治療用タンパク質及び／又はｒＡＡＶ粒子に対して検出可能な体液性免疫応答を起こさない。
[0041]特定の実施形態では、哺乳動物は、治療用タンパク質及び／又はｒＡＡＶ粒子に対して、治療用タンパク質の治療効果を遮断するのに十分な免疫応答（例えば、体液性の）を発現しない。特定の態様では、哺乳動物は、少なくとも連続して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日、週、又は月にわたり、治療効果を遮断するのに十分な、治療用タンパク質及び／又はｒＡＡＶ粒子に対する免疫応答（例えば、体液性の）を生成しない。
[0042]特定の実施形態では、空のカプシドが、ｒＡＡＶベクター、方法、及び使用に含まれ得る。所望の場合には、空のＡＡＶカプシドが、ｒＡＡＶベクター調製物に添加可能である、又は本明細書の方法及び使用に基づき、対象に個別に投与可能である。
[0043]特定の実施形態では、空のＡＡＶカプシドが、ｒＡＡＶベクターと共に製剤化され、及び／又は哺乳動物に投与される。特別な態様では、空のＡＡＶカプシドが、ベクターの量と等しい又はそれ未満の量（例えば、空のＡＡＶカプシドに対して約１．０〜１００倍のｒＡＡＶベクター、又は空のＡＡＶカプシドに対するｒＡＡＶベクターの比が約１：１）で製剤化される。その他の特別な態様では、ｒＡＡＶベクターは、過剰の空のＡＡＶカプシド（例えば、ｒＡＡＶベクターに対して１倍を上回る空のＡＡＶカプシド、例えば、ｒＡＡＶベクターに対して１．０〜１００倍の空のＡＡＶカプシド）と共に製剤化される。任意選択で、ＡＡＶ ＮＡｂ力価が低〜陰性の哺乳動物は、より少量の空のカプシド（ｒＡＡＶベクターに対して１〜１０倍の空のＡＡＶカプシド、ｒＡＡＶベクターに対して２〜６倍の空のＡＡＶカプシド、又はｒＡＡＶベクターに対して約４〜５倍の空のＡＡＶカプシド）の投与を受けることができる。
[0044]特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクター、方法、及び使用は、ｒＡＡＶベクター（すなわち、治療用タンパク質をコードする核酸を含有するベクター）の用量又は量を上回る過剰の空のカプシドを組成物中に含む。ｒＡＡＶベクターに対する空のカプシドの比は、１に対して、約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、又はいくつかのその他の比であり得る。
[0045]いくつかの実施形態では、空のカプシドは、ｒＡＡＶベクター中に存在するＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質と同一のタンパク質を含む。その他の実施形態では、空のカプシドは、ｒＡＡＶベクターに見出されるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３タンパク質を含む。任意選択で、空のカプシドのカプシドタンパク質とｒＡＡＶベクターのカプシドが配列において同一でない場合には、それらは同一血清型のタンパク質である。
[0046]特定の実施形態では、空のカプシドがｒＡＡＶベクター、方法、及び使用に含まれ、その場合、ｒＡＡＶベクターは特定の用量又は量である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターの用量は、哺乳動物の体重１ｋｇ当たり、ｖｇ約１×１０１０〜１×１０１１個、又は哺乳動物の体重１ｋｇ当たり、ｖｇ約１×１０１１〜１×１０１２個（例えば、約１×１０１１〜２×１０１１ｖｇ／ｋｇ、又は約２×１０１１〜３×１０１１ｖｇ／ｋｇ、又は約３×１０１１〜４×１０１１ｖｇ／ｋｇ、又は約４×１０１１〜５×１０１１ｖｇ／ｋｇ、又は約５×１０１１〜６×１０１１ｖｇ／ｋｇ、又は約６×１０１１〜７×１０１１ｖｇ／ｋｇ、又は約７×１０１１〜８×１０１１ｖｇ／ｋｇ、又は約８×１０１１〜９×１０１１ｖｇ／ｋｇ、又は約９×１０１１〜１×１０１２ｖｇ／ｋｇ）の間、又は哺乳動物の体重１ｋｇ当たり、ｖｇ約１×１０１２〜１×１０１３個の間、及び空のカプシドである。
[0047]いくつかの実施形態では、所定の用量又は量のｒＡＡＶベクター、又は所定の用量又は量のｒＡＡＶベクターを利用する方法又は使用は、任意選択で過剰の空のカプシドを有する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターの用量は、哺乳動物の体重１ｋｇ当たり、ｖｇ約１×１０１０〜１×１０１１個、又は哺乳動物の体重１ｋｇ当たり、ｖｇ約１×１０１１〜１×１０１２個の間（例えば、約１×１０１１〜２×１０１１ｖｇ／ｋｇ、又は約２×１０１１〜３×１０１１ｖｇ／ｋｇ、又は約３×１０１１〜４×１０１１ｖｇ／ｋｇ、又は約４×１０１１〜５×１０１１ｖｇ／ｋｇ、又は約５×１０１１〜６×１０１１ｖｇ／ｋｇ、又は約６×１０１１〜７×１０１１ｖｇ／ｋｇ、又は約７×１０１１〜８×１０１１ｖｇ／ｋｇ、又は約８×１０１１〜９×１０１１ｖｇ／ｋｇ、又は約９×１０１１〜１×１０１２ｖｇ／ｋｇ）、又は哺乳動物の体重１ｋｇ当たり、ｖｇ約１×１０１２〜１×１０１３個の間、及び過剰の空のカプシドである。ｒＡＡＶベクターの各用量又は量に対する過剰のカプシドは、ｒＡＡＶベクターに対する空のＡＡＶカプシドとして約１．５〜１００倍であり得る。所望の場合には、ｒＡＡＶベクターに対する空のカプシドの比は、１に対して、約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０であり得る。
[0048]特定の実施形態では、投与又は送達は、対象の体循環への輸注又は注射による。特定の実施形態では、投与又は送達は、対象の体循環への静脈内又は動脈内への輸注又は注射による。特定の実施形態では、投与又は送達は、対象の肝門脈への輸注又は注射による。特定の実施形態では、投与又は送達は、対象の体循環への輸注又は注射を実現する、或いは対象の体循環への静脈内又は動脈内輸注又は注射を実現する、或いは対象の肝門脈への輸注又は注射を実現するインプラント又はポンプによる。
[0049]本発明は、非中枢神経系（ＣＮＳ）、又は非眼球細胞、組織、若しくは器官に投与したときに、発現用途で非中枢神経系（ＣＮＳ）、又は非眼球標的細胞、組織、若しくは器官に感染することができ、その後、哺乳動物のＣＮＳ、又は眼球細胞、組織、若しくは器官に対して、異種核酸によりコードされるタンパク質の送達を実現することができるｒＡＡＶベクターの開発に少なくとも一部基づく。非中枢神経系（ＣＮＳ）、又は非眼球細胞、組織、若しくは器官により、コードされたタンパク質が発現すると、コードされたタンパク質が体循環に分泌され、次にコードされたタンパク質が哺乳動物のＣＮＳ、及び／又は眼球細胞、組織、若しくは器官に送達される。従って、本発明は、哺乳動物のＣＮＳ、及び／又は眼球細胞、組織、若しくは器官に対して直接投与せずに、すなわち、哺乳動物のＣＮＳ、又は眼球細胞、組織、若しくは器官以外の細胞、組織又は器官への直接投与により、タンパク質を哺乳動物のＣＮＳ、及び／又は眼球細胞、組織、若しくは器官に送達する方法を提供する。そのような標的細胞、組織、及び器官として、内分泌細胞、組織、及び器官が挙げられる。特定の非限定的な例として、肝臓（例えば、肝細胞）が挙げられる。
[0050]アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科（parvoviridae）ファミリーの小型の非病原性ウイルスである。ＡＡＶは、複製においてヘルパーウイルス依存性であることから、このファミリーの他のメンバーとは区別される。ヘルパーウイルスが存在しない場合には、ＡＡＶは、遺伝子座特異的な様式で第１９番染色体の長腕（ｑ）に一体化し得る。ＡＡＶの約５ｋｂゲノムは、極性がプラス又はマイナスである一本鎖ＤＮＡの１つのセグメントから構成される。ゲノムの末端部は、ヘアピン構造に畳み込まれ、またウイルスＤＮＡ複製の起点として機能し得る短い末端逆位反復配列である。物理的には、パルボウイルスビリオンは、無エンベロープであり、またその正二十面体カプシドは、直径約２０〜３０ｎｍである。
[0051]当業者が理解するように、ＡＡＶビリオンは、ＶＰ１タンパク質と呼ばれる３つの関連タンパク質、及びＶＰ２と呼ばれる２つのより短いタンパク質、及び実質的にＶＰ１のアミノ末端切断型であるＶＰ３から構成される。当業者にとって公知のカプシド及びその他の因子に応じて、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３はそれぞれ、およそ１：１：１０の比でカプシド内に一般的に存在するが、但しこの比、特にＶＰ３の比は顕著に変化する可能性があり、いかなる観点においても限定的と考えるべきではない。
[0052]ＡＡＶゲノムの末端部は、ウイルスＤＮＡ複製の起点として機能するＴ字形のヘアピン構造に畳み込まれる可能性のある短い末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を有する。ＩＴＲ領域内において、ＩＴＲの機能にとって中心的な２つのエレメント、ＧＡＧＣリピートモチーフ及び末端解離部位（ｔｒｓ）が記載されている。リピートモチーフは、ＩＴＲが直線状又はヘアピンのコンホメーションを採るとき、Ｒｅｐと結合することが明らかにされている。この結合は、部位及びストランドに特異的な様式で生ずるｔｒｓにおける切断のためにＲｅｐ６８／７８を配置するように働く。複製におけるそれらの役割に付加して、これら２つのエレメントは、ウイルスの組込みにおいて中心的と思われる。第１９番染色体組込み遺伝子座に含まれるものとして、隣接したｔｒｓを含むＲｅｐ結合部位が挙げられる。このようなエレメントは、遺伝子座特異的な組込みに対して機能的であることが明らかにされている。
[0053]ＡＡＶは、細胞を貫通し、核酸／遺伝物質が細胞中で安定的に維持され得るように核酸／遺伝物質を導入することができるので、遺伝子療法ベクターとして有用である。更に、このようなウイルスは、核酸／遺伝物質を特異的部位、例えば第１９番染色体上の特異的な部位等に導入することができる。ＡＡＶは、ヒトにおける病原性の疾患とは無関係なので、ＡＡＶベクターは、実質的なＡＡＶ病因又は疾患を引き起こすことなく異種ポリヌクレオチド配列（例えば、治療用タンパク質及び薬剤）をヒト患者に送達することができる。
[0054]従って、ｒＡＡＶベクターは、血清型及びバリアントを含め、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、及びｉｎ ｖｉｖｏで細胞内に核酸配列を送達するための手段を提供するが、同核酸配列はタンパク質をコードすることができ、コードされたタンパク質は細胞によって発現するようになる。例えば、組換えＡＡＶベクターは、所望のタンパク質又はペプチド（例えば、防御性ａｐｏＥアイソフォーム）をコードする異種の核酸を含み得る。対象（例えば、哺乳動物）へのベクターの送達又は投与は、従ってコードされたタンパク質を対象に提供する。
[0055]本明細書で使用する場合、ＡＡＶベクターの修飾語、並びに配列物の修飾語、例えば組換え核酸及びポリペプチド等としての用語「組換え」とは、組成物（例えば、ＡＡＶ又は配列）が自然において一般的に生じない方法で操作された（すなわち、工学的に作出された）ことを意味する。組換えＡＡＶベクターの具体的な例として、野生型ウイルス（例えば、ＡＡＶ）中に通常は存在しない（「異種」）核酸ゲノムがウイルスゲノム内に挿入される場合が挙げられる。「組換え」ＡＡＶベクターは、ウイルスゲノムの全部又は一部が、ＡＡＶゲノム核酸に関して非天然の配列、例えば異種核酸配列等と置き換わっているので、ＡＡＶゲノムから区別される。用語「組換え」は、必ずしもＡＡＶベクター、並びに核酸及びポリペプチド等の配列と関連して本明細書で使用されるわけではないが、ＡＡＶ、及び核酸及びポリペプチドを含む配列の組換え形態は、何らかのそのような省略があっても、それによらず明確に含まれる。
[0056]一般的に、ＡＡＶの場合、一方又は両方のＡＡＶゲノム末端逆位反復（ＩＴＲ）配列が、ＡＡＶベクター内に保持される。非天然の配列（例えば、防御性ａｐｏＥアイソフォーム）の組込みにより、従ってＡＡＶベクターは「組換え」ＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターとして定義される。
[0057]組換えＡＡＶベクターはパッケージングされ得る−とは本明細書では、後続するｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、又はｉｎ ｖｉｖｏでの細胞の感染（形質導入）を行うための「粒子」を意味する。組換えＡＡＶベクター配列が、ＡＡＶ粒子中にカプシド化又はパッケージングされる場合、本明細書では、該粒子もまた「ｒＡＡＶ」と呼び得る。そのような粒子は、ベクターゲノムをカプシド化又はパッケージングするタンパク質、ＡＡＶの場合、カプシドタンパク質を含む。
[0058]「ＡＡＶウイルス粒子」又は「ＡＡＶ粒子」とは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質（一般的に、ＡＡＶのすべてのカプシドタンパク質）、及びベクターゲノムと呼ばれるカプシド化核酸から構成されるウイルス粒子を意味する。粒子が異種核酸を含む場合には、それは「ｒＡＡＶ」と一般的に呼ばれる。
[0059]ＡＡＶベクター「ゲノム」とは、最終的にパッケージング又はカプシド化されてＡＡＶ粒子を形成する組換えプラスミド配列の部分を意味する。組換えプラスミドが、組換えＡＡＶベクターを構築又は製造するのに使用される場合には、ＡＡＶベクターゲノムは、組換えプラスミドのベクターゲノム配列に対応しない「プラスミド」の部分を含まない。組換えプラスミドのこの非ベクターゲノム部分は「プラスミド骨格」と呼ばれ、増殖及び組換えＡＡＶ製造に必要とされるプロセスであるプラスミドのクローニング及び増幅にとって重要であるが、それそのものはｒＡＡＶ粒子中にパッケージング又はカプシド化されない。
[0060]特別な実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、及びＡＡＶ−２ｉ８、並びにそのバリアント（例えば、カプシドバリアント、例えばアミノ酸の挿入、付加、及び置換等）に由来するカプシドを含む。ｒＡＡＶベクターの血清型及びバリアントは、カプシドバリアント（例えば、ＬＫ０３、４−１等）を含む。
[0061]ｒＡＡＶの血清型及びｒＡＡＶバリアント（例えば、カプシドバリアント、例えばＬＫ０３、４−１等）は、その他のＡＡＶ血清型と異なる場合もあれば、また異ならない場合もある（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列とは異なる）。本明細書で使用する場合、用語「血清型」は、その他のＡＡＶ血清型と血清学的に異なるカプシドを有するＡＡＶを指すのに使用される特質である。血清学的相違性は、抗体と１つのあるＡＡＶの間の交差反応性が別のＡＡＶと比較して欠いていることから決定される。そのような交差反応性の相違は、カプシドタンパク質配列／抗原決定基における相違に通常起因する（例えば、ＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列の相違に起因する）。カプシドバリアントを含むＡＡＶバリアントが参照ＡＡＶ又はその他のＡＡＶの血清型とは血清学的に異ならない可能性があるとしても、ＡＡＶバリアントは、参照ＡＡＶ又はその他のＡＡＶの血清型と比較して、少なくとも１つのヌクレオチド又はアミノ酸残基において異なる。
[0062]従来の定義によれば、血清型とは、特徴づけが行われた既存の血清型すべてに対して特異的な血清と対比して、目的とするウイルスを中和活性について試験したが、目的とするウイルスを中和する抗体がまだ見出されていないことを意味する。より多くの天然ウイルス単離物が発見され及び／又はカプシド突然変異体が生成されるに従い、現在存在する血清型のいずれとも血清学的に相違する場合もあれば、また相違しない場合もある。従って、新しいウイルス（例えば、ＡＡＶ）が血清学的相違を有さない場合には、この新しいウイルス（例えば、ＡＡＶ）は、サブグループ、又は対応する血清型のバリアントである。多くの場合、中和活性に関する血清学的試験が、カプシド配列が変化した突然変異体ウイルスについて、それが血清型の従来の定義に基づき、別の血清型のウイルスか確認するためになおも実施されている。従って、便宜上、及び繰り返しを避けるために、用語「血清型」とは、血清学的に異なるウイルス（例えば、ＡＡＶ）、並びに所定の血清型においてそのサブグループ又はバリアントに含まれ得る血清学的に異ならないウイルス（例えば、ＡＡＶ）の両方を幅広く意味する。
[0063]組換えＡＡＶベクター（例えば、ｒＡＡＶ）、並びに方法及びその使用には、任意のウイルス株又は血清型が含まれる。非限定的な例として、組換えＡＡＶベクターゲノムは、任意のＡＡＶゲノム、例えば、ＡＡＶ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−ｒｈ７４、−ｒｈ１０、又はＡＡＶ−２ｉ８等に基づく可能性がある。そのようなベクターは、同一の系統若しくは血清型（又はサブグループ若しくはバリアント）に基づく可能性がある、又は相互に異なる可能性がある。非限定的な例として、１つの血清型ゲノムに基づく組換えＡＡＶベクターゲノムは、ベクターをパッケージングするカプシドタンパク質のうちの１つ又は複数と同一であり得る。更に、組換えＡＡＶベクターゲノムは、ベクターをパッケージングするカプシドタンパク質のうちの１つ又は複数とは異なるＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２）血清型ゲノムに基づく可能性があり、その場合、３つのカプシドタンパク質のうちの少なくとも１つは、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、若しくはＡＡＶ−２ｉ８、又はバリアント（例えば、カプシドバリアント、例えば、ＬＫ０３、４−１等）であり得る。
[0064]ＡＡＶベクターは、従って特定の血清型に特徴的な遺伝子／タンパク質配列と同一の遺伝子／タンパク質配列を含む。本明細書で使用する場合、「ＡＡＶ１と関連するＡＡＶベクター」とは、ＡＡＶ１を含む１つ又は複数のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列に対して実質的な配列同一性を有する１つ又は複数のＡＡＶタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列）を意味する。同様に、「ＡＡＶ８と関連するＡＡＶベクター」とは、ＡＡＶ８を含む１つ又は複数のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列に対して実質的な配列同一性を有する１つ又は複数のＡＡＶタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列）を意味する。「ＡＡＶ−Ｒｈ７４と関連するＡＡＶベクター」とは、ＡＡＶ−Ｒｈ７４を含む１つ又は複数のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列に対して実質的な配列同一性を有する１つ又は複数のＡＡＶタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列）を意味する（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３を参照）。別の血清型と関連するそのようなＡＡＶベクター、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、又はＡＡＶ−２ｉ８は、従ってＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、及びＡＡＶ−２ｉ８に由来する１つ又は複数の異なる配列を有する可能性があるが、しかしＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、又はＡＡＶ−２ｉ８のうちの１つ又は複数の遺伝子及び／又はタンパク質に対して実質的な配列同一性を示す可能性、及び／又はそれらのうちの１つ又は複数の機能的な特徴（例えば、細胞／組織の屈動性等）を有する可能性がある。代表的で非限定的なＡＡＶ−Ｒｈ７４及び関連するＡＡＶバリアントとして、実施例６のカプシドバリアント４−１が挙げられる。
[0065]様々な代表的な実施形態では、参照血清型と関連するＡＡＶベクターは、１つ又は複数のＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、又はＡＡＶ−２ｉ８に対して少なくとも７０％又はそれ超（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％等）同一である配列を含む、又はそれから構成されるポリヌクレオチド、ポリペプチド、又はその部分配列を有する。従って、本発明の方法及び使用は、参照ＡＡＶ血清型、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、又はＡＡＶ−２ｉ８等、例えば、ＡＡＶ−Ｒｈ７４遺伝子又はタンパク質配列（例えば、実施例６に記載するＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列）に対して１００％又は１００％未満の配列同一性を示すＡＡＶ配列（ポリペプチド及びヌクレオチド）及びその部分配列を含むが、公知のＡＡＶ遺伝子又はタンパク質、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、又はＡＡＶ−２ｉ８等の遺伝子又はタンパク質等とは異なり、同一ではない可能性がある。
[0066]１つの実施形態では、ＡＡＶポリペプチド又はその部分配列は、参照ＡＡＶ配列又はその部分配列、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、又はＡＡＶ−２ｉ８等（例えば、実施例６に記載するＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列）のいずれかに対して少なくとも７０％又はそれ超、例えば、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％等同一である、すなわち最大１００％同一である配列を含む、又はそれから構成される。特別な態様では、ＡＡＶバリアントは、カプシドバリアント４−１又は実施例６に記載するＬＫ０３ ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３を含む。１つ又は複数の機能的なＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する１つ又は複数の異種核酸配列（導入遺伝子）を含めるために、組換えＡＡＶベクター、バリアント、ハイブリッド、及びキメラの配列が、当業者にとって公知である組換え技術を使用して構築可能である。そのようなｒＡＡＶベクターは、例えば、ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子の全部又は一部が欠損している野生型ＡＡＶ遺伝子のうちの１つ又は複数を有し得るが、組換えベクターの救済、複製、及びそのＡＡＶベクター粒子中へのパッケージングにとって必要であれば、少なくとも１つの機能的な隣接するＩＴＲ配列を保持し得る。ＡＡＶベクターゲノムは、従って複製及びパッケージングのためにシスで必要とされる配列を含む（例えば、機能的なＩＴＲ配列）。
[0067]「ＡＡＶ ＩＴＲ」又は「ＡＡＶ ＩＴＲｓ」とは、ＤＮＡ複製の起点として、及びウイルスに対するパッケージングシグナルとしてシスで共に機能する、ＡＡＶゲノムの各末端に見出される当該技術分野において認められている領域を意味する。ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ ｒｅｐコード領域と共に、２つの隣接するＩＴＲの間に挿入されたヌクレオチド配列からの効率的な切り出し及び救済、並びにその哺乳動物細胞ゲノムへの組込みを実現する。
[0068]ＡＡＶ ＩＴＲのヌクレオチド配列は公知である。「ＡＡＶ ＩＴＲ」は、示される野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠損、又は置換により変化してもよい。更に、ＡＡＶ ＩＴＲは、いくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来し得る。更に、ＡＡＶベクター内の異種核酸配列に隣接する５’及び３’ＩＴＲは、それらが意図した通りに機能する限り、すなわち、宿主細胞ゲノム又はベクターに由来の目的とする配列の切り出し及び救済を可能にし、並びにレシピエント細胞ゲノムへの異種配列の組込みを可能にする限り、同一である必要、又は同一のＡＡＶ血清型若しくは単離物に由来する必要は必ずしもない。
[0069]用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、本明細書では交換可能に使用され、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含む核酸、オリゴヌクレオチドのすべての形態を指す。ポリヌクレオチドには、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びアンチセンスＤＮＡ、及びスプライシングされた又はスプライシングされていないｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及び阻害性のＤＮＡ又はＲＮＡ（ＲＮＡｉ、例えば、小さい又は短いヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小さい又は短い妨害性の（ｓｉ）ＲＮＡ、トランス−スプライシングＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡ）が含まれる。核酸には、天然、合成、及び意図的に改変された又は変更されポリヌクレオチド（例えば、ＣｐＧジヌクレオチドが低減されている）が含まれる。核酸は、単鎖、二本鎖、又は三本鎖、直線状、又は環状であり得る。核酸について考察する際には、特定の核酸の配列又は構造は、５’から３’の方向で配列を提示する規則に基づき本明細書に記載され得る。
[0070]本明細書に記載するｒＡＡＶベクターは、プロモーターと機能的に連結した外因性（異種）核酸を含む。「異種」核酸とは、ベクターの媒介により核酸を細胞、組織、又は器官に移送／送達することを目的として、ＡＡＶベクターに挿入された核酸を意味する。異種核酸は、ＡＡＶ核酸とは異なる、すなわち、ＡＡＶ核酸に関して非天然である。例えば、特定の実施形態では、異種核酸は、防御性ＡｐｏＥアイソフォームをコードする。
[0071]用語「異種」は、本明細書では必ずしも核酸と関連して使用されるわけではないが、修飾語「異種」が存在しない核酸の引用であっても、そのような省略にもかかわらず、それには異種核酸が含まれるように意図されている。細胞内に移送され／送達されたら、ｒＡＡＶベクターに含まれる異種核酸は発現可能である（例えば、適宜転写及び翻訳される）。
[0072]用語「導入遺伝子」は、本明細書では、細胞若しくは生物中に導入されるように意図された、又は細胞若しくは生物中に既に導入されている異種核酸を好都合に引用するために使用される。導入遺伝子として、任意の核酸、例えばポリペプチド又はタンパク質（例えば、防御性ａｐｏＥアイソフォーム）をコードする遺伝子等が挙げられる。
[0073]導入遺伝子を有する細胞では、導入遺伝子は、ｒＡＡＶベクターの「感染」、又は細胞の「形質導入」により導入／移送されている。用語「感染させる」及び「形質導入する」とは、例えばＡＡＶベクターにより、細胞又は宿主生物中に、核酸等の分子を導入することを指す。「感染した」又は「形質導入された」細胞（例えば、哺乳動物内の、例えば、細胞、又は組織若しくは器官の細胞等）とは、核酸（例えば、導入遺伝子）を細胞中に組み込んだ後の細胞内の遺伝的変化を意味する。従って、「感染した」又は「形質導入された」細胞とは、例えば、外因性の分子が導入された細胞又はその複製産物である。細胞（複数可）は増殖可能であり、また導入された核酸は転写可能、及びタンパク質は発現可能である。遺伝子療法の使用及び方法では、形質導入される細胞は対象中にあり得る。
[0074]形質導入され得る細胞として、非ＣＮＳ細胞、組織、又は器官が挙げられる。ＣＮＳ細胞、組織、又は器官として、脳脊髄液（ＣＳＦ）、脳、頭蓋内空間、及び脊髄が挙げられる。従って、非ＣＮＳ細胞、組織、又は器官を指す場合、脳脊髄液（ＣＳＦ）、脳、頭蓋内空間、及び脊髄は除外される。
[0075]形質導入され得る細胞には、非眼球細胞、組織、又は器官も含まれる。眼球細胞、組織、及び器官として、眼及び眼の部分が挙げられる。従って、非眼球細胞、組織、又は器官を指す場合、眼及び眼の部分は除外される。
[0076]非ＣＮＳ及び非眼球細胞の非限定的な例として、肝臓（例えば、肝細胞、類洞内皮細胞）、及び膵臓（例えば、β小島細胞）が挙げられる。その他の例として、骨格筋細胞（例えば、線維芽細胞）が挙げられる。
[0077]「核酸配列」によりコードされる「ポリペプチド」、「タンパク質」、及び「ペプチド」には、天然タンパク質のような完全長天然配列、並びに部分配列、改変された形態、又はバリアントであっても天然の完全長タンパク質の機能性をある程度保持する限り、機能的な部分配列、改変された形態、又は配列バリアントが含まれる。本発明の方法及び使用では、核酸配列によりコードされるそのようなポリペプチド、タンパク質、及びペプチドは、処置される哺乳動物において欠陥性である内因性タンパク質、又はその発現が不十分である、若しくは不足している内因性タンパク質と同一であり得るが、しかしそうである必要はない。
[0078]「治療用の分子」は、１つの実施形態では、細胞又は対象内のタンパク質の不存在又は欠陥に起因する症状を緩和する又は低下させる可能性があるペプチド又はタンパク質である。或いは、導入遺伝子によりコードされる「治療用」ペプチド又はタンパク質は、例えば、遺伝的欠陥を矯正する、遺伝子（の発現又は機能）の不足を矯正するような利益を対象にもたらすペプチド又はタンパク質である。
[0079]本発明に基づき有用な治療用タンパク質をコードする異種核酸の非限定的な例として、ＣＮＳの疾患又は障害を含む、但しこれらに限定されない疾患又は障害の処置で使用され得る異種核酸が挙げられる。具体的な非限定的な例として、防御性ＡｐｏＥアイソフォーム、例えば、ヒトＡｐｏＥε２と少なくとも７０％同一の配列；ＴＰＰ１、例えば、ヒトＴＰＰ１と少なくとも７０％同一の配列；ＣＬＮ３、例えば、ヒトＣＬＮ３と少なくとも７０％同一の配列；ＰＰＴ１、例えば、ヒトＰＰＴ１と少なくとも７０％同一の配列；ＣＬＮ６、例えば、ヒトＣＬＮ６と少なくとも７０％同一の配列；及びＣＬＮ８、例えば、ヒトＣＬＮ８と少なくとも７０％同一の配列が挙げられる。更に具体的な非限定的な例として、ガラクトサミン−６−スルファターゼ、例えば、ヒトガラクトサミン−６−スルファターゼと少なくとも７０％同一の配列、及びβ−グルクロニダーゼ、例えば、ヒトβ−グルクロニダーゼと少なくとも７０％同一の配列が挙げられる。
[0080]ＣＮＳの疾患又は障害の非限定的な例として、アルツハイマー病、リソソーム蓄積症、ニューロンセロイドリポフスチン沈着症（ＮＣＬ）、例えば幼児ＮＣＬ、遅発性幼児ＮＣＬ、若年性ＮＣＬ（バッテン病）、成人ＮＣＬ等、又はムコ多糖症（例えば、ＭＰＳ ＩＶ、又はＭＰＳ ＶＩＩ）が挙げられる。
[0081]本明細書に記載するｒＡＡＶベクターは、発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー）、イントロン、ＩＴＲ（複数可）、ポリ−アデニン（ポリアデニル化とも呼ばれる）配列等の追加のエレメントを任意選択で更に含む。一般的に、発現制御エレメントは、作動可能に連結した核酸の発現に影響を及ぼす配列（複数可）である。本明細書に記載する発現制御エレメントを含む制御エレメント、例えばベクター内に存在するプロモーター及びエンハンサー等は、適切な異種核酸転写、及び該当する場合には翻訳を促進するために含まれている（例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロンに対するスプライシングシグナル、ｍＲＮＡのインフレーム翻訳を可能にする遺伝子の正確なリーディングフレームの維持、及び終止コドン等）。そのようなエレメントは、一般的にシスで作用し、「シス作用性」エレメントと呼ばれるが、但しトランスで作用する場合もある。
[0082]発現のコントロールは、転写、翻訳、スプライシング、メッセージ安定性等のレベルで影響を受ける可能性がある。一般的に、転写を調節する発現制御エレメントは、転写される核酸の５’末端近傍（すなわち、「上流」）に並置される。発現制御エレメントは、転写される配列の３’末端（すなわち、「下流」）、又は転写物内（例えば、イントロン内）に位置する可能性もある。発現制御エレメントは、転写される配列に隣接して、又はそれからある距離（例えば、ポリヌクレオチドから１〜１０、１０〜２５、２５〜５０、５０〜１００、１００〜５００個、又はそれ超のヌクレオチド）、かなりの距離さえも置いて位置する可能性がある。それにもかかわらず、特定のベクター、例えばＡＡＶベクター等の長さ制限に起因して、そのような発現制御エレメントは、転写される核酸からヌクレオチド１〜１０００個以内に一般的に存在する。
[0083]機能的には、エレメント（例えば、プロモーター）が、ポリヌクレオチドの転写、及び必要な場合には転写物の翻訳を調節するように、作動可能に連結した異種核酸の発現がエレメントにより少なくとも部分的に制御可能である。発現制御エレメントの具体例として、転写される配列の５’に通常位置するプロモーターが挙げられる。発現制御エレメントの別の例として、転写される配列の５’、３’、又は転写される配列内に位置し得るエンハンサーが挙げられる。
[0084]「プロモーター」は、本明細書で使用する場合、組換え産物をコードするポリヌクレオチド配列に隣接して位置する核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を意味し得る。プロモーターは、隣接する配列、例えば、異種核酸と作動的に連結しているのが一般的である。プロモーターは、プロモーターが存在しないときの発現量と比較して、異種ポリヌクレオチドからの発現量を一般的に増加させる。
[0085]「エンハンサー」とは、本明細書で使用する場合、異種ポリヌクレオチドに隣接して位置する配列を意味し得る。エンハンサーエレメントは、プロモーターエレメントの上流に一般的に位置するが、但し機能も有し、またＤＮＡ配列（例えば、異種核酸）の下流又はその中に位置する場合もある。従って、エンハンサーエレメントは、１００塩基対、２００塩基対、又は３００若しくはそれ超の塩基対、異種核酸の上流又は下流に位置する場合がある。エンハンサーエレメントは、プロモーターエレメントによりもたらされる発現増加よりも更に異種核酸の発現を増加させるのが一般的である。
[0086]発現制御エレメント（例えば、プロモーター）として、特定の組織又は細胞型において活性なエレメントが挙げられ、本明細書では、「組織特異的発現制御エレメント／プロモーター」と呼ばれる。組織特異的発現制御エレメントは、特定の細胞又は組織（例えば、肝臓、膵臓、筋肉等）において一般的に活性である。発現制御エレメントは、特定の細胞、組織、又は器官型に固有の転写活性化因子タンパク質、又はその他の転写制御因子により認識されるので、発現制御エレメントは、このような細胞、組織、又は器官において一般的に活性である。
[0087]プロモーターは、任意の所望のプロモーターであり得、公知の検討事項、例えばプロモーターと機能的に連結した核酸の発現レベル、及びベクターが使用される細胞型等により選択され得る。プロモーターは、外因性又は内因性のプロモーターであり得る。
[0088]骨格筋において活性なプロモーターの例として、骨格筋型αアクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋クレアチンキナーゼをコードする遺伝子に由来のプロモーター、並びに天然のプロモーターよりも高い活性を有する合成筋型プロモーターが挙げられる（例えば、Liら、Nat. Biotech. 17:241-245 (1999)を参照）。肝臓に対して組織特異的であるプロモーターの例として、ヒトα１−抗トリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター；アルブミン、Miyatakeら、J. Virol., 71:5124-32 (1997)；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Sandigら、Gene Ther. 3:1002-9 (1996)；αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、Arbuthnotら、Hum. Gene. Ther., 7:1503-14(1996)］、骨（オステオカルシン、Steinら、Mol.Biol. Rep., 24:185-96 (1997)；骨シアロタンパク質、Chenら、J. Bone Miner. Res. 11 :654-64 (1996)）、リンパ球（CD2,Hansalら、J. Immunol., 161:1063-8 (1998)；免疫グロブリン重鎖；Ｔ細胞受容体ａ鎖）、及びＴＴＲプロモーターが挙げられる。肝臓において活性なエンハンサーの例として、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）ＨＣＲ−１及びＨＣＲ−２が挙げられる（Allanら、J. Biol. Chem., 272:29113-19 (1997)）。
[0089]発現制御エレメントには、多くの異なる細胞型においてポリヌクレオチドの発現を駆動する能力を有する遍在性又は混在性プロモーター／エンハンサーも含まれる。そのようなエレメントとして、ウイルスプロモーター、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター／エンハンサー配列、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター／エンハンサー配列、及び様々な哺乳動物細胞型において活性なその他のウイルスプロモーター／エンハンサー、又は天然には存在しない合成エレメント（例えば、Boshartら、Cell, 41:521-530 (1985)を参照）、ＳＶ４０プロモーター、ウシパピローマウイルスプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、細胞質β−アクチンプロモーター、及びホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター等が挙げられるが、但しこれらに限定されない。追加のプロモーターとして、誘導性メタロチオネインプロモーター、ＡＡＶプロモーター、例えばＡＡＶｐ５プロモーター、アクチン遺伝子に由来するプロモーター、免疫グロブリン遺伝子、アデノウイルスプロモーター、例えばアデノウイルスの主要後期プロモーター等、誘導性ヒートショックプロモーター、呼吸系発疹ウイルス等が挙げられる。
[0090]発現制御エレメントもまた、調節可能な方式で発現を引き起こすことができ、すなわち、シグナル又は刺激が、作動可能に連結した異種ポリヌクレオチドの発現を増加又は減少させる。シグナル又は刺激に応答して作動可能に連結したポリヌクレオチドの発現を増加させる調節性のエレメントは、「誘導性エレメント」とも呼ばれる（すなわち、シグナルにより誘発される）。特別な例として、ホルモン（例えば、ステロイド）誘導性プロモーターが挙げられるが、但しこれに限定されない。シグナル又は刺激に応答して、作動可能に連結したポリヌクレオチドの発現を減少させる調節性のエレメントは「抑制性エレメント」と呼ばれる（すなわち、シグナルが除去される又は存在しないときに、発現が増加するように、シグナルは発現を減少させる）。一般的に、そのようなエレメントによりもたらされる増加量又は減少量は、存在するシグナル又は刺激の量に比例する；シグナル又は刺激の量が多いほど、発現の増加又は減少も大きくなる。具体的な非限定的な例として、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター；ステロイドホルモン誘導性マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター；Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（国際公開第９８／１００８８号）；テトラサイクリン抑制性の系（Gossenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89:5547-5551 (1992)）；テトラサイクリン誘導性の系（Gossenら、Science. 268:1766-1769 (1995); Harveyら、Curr.Opin. Chem. Biol. 2:512-518 (1998)も参照）；ＲＵ４８６誘導性の系（Wangら、Nat. Biotech. 15:239-243 (1997)、及びWangら、Gene Ther. 4:432-441 (1997)］；及びラパマイシン誘導性の系（Magariら、J. Clin. Invest. 100:2865-2872 (1997); Riveraら、Nat. Medicine. 2:1028-1032 (1996)）が挙げられる。この文脈において有用であり得るその他の調節性の制御エレメントとして、特定の生理学的な状態、例えば、温度、急性期、発達により制御されるエレメントが挙げられる。
[0091]本明細書で使用する場合、用語「作動可能な連結」又は「作動可能に連結した」とは、コンポーネントがその意図した方式で機能することを可能にするというように記載されるコンポーネントの物理的又は機能的な並列配置を意味する。核酸と作動可能に結合している発現制御エレメントの例では、制御エレメントが核酸の発現を調節するという関係にある。より具体的には、例えば、作動可能に連結した２つのＤＮＡ配列とは、２つのＤＮＡが、ＤＮＡ配列のうちの少なくとも一方が、他方の配列に生理学的な効果を発揮することができる関係で配置している（シス又はトランス）ことを意味する。
[0092]ｒＡＡＶベクター及びプラスミドに関係する追加のエレメントとして、例えばパッケージングを改善し、また汚染性の核酸の存在を低下させて、例えば、プラスミド骨格のパッケージングを低下させるための、例えばフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列が挙げられる。ＡＡＶベクターは、約４ｋｂ〜約５．２ｋｂ、又はそれよりわずかに多いのが一般的である定義されたサイズ範囲を有するＤＮＡの挿入物を一般的に許容する。従って、短めの配列の場合、ウイルス粒子中へのＡＡＶベクターのパッケージングが許容される通常のサイズ近傍又は丁度に、ウイルスゲノム配列を長さ調整するために、スタッファー又はフィラーが挿入断片内に組み込まれる。様々な実施形態では、フィラー／スタッファー核酸配列は、核酸の非翻訳（非タンパク質コーディング）セグメントである。ＡＡＶベクターの特別な実施形態では、異種ポリヌクレオチド配列は、４．７ｋｂ未満の長さを有し、またフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列は、異種ポリヌクレオチド配列と組み合わせた（例えば、ベクターに挿入した）とき、全長が約３．０〜５．５ｋｂの間、又は約４．０〜５．０Ｋｂの間、又は約４．３〜４．８Ｋｂの間の長さを有する。
[0093]ＡＡＶ「空のカプシド」は、本明細書で使用する場合、ＡＡＶベクターゲノムを含む「ゲノム含有カプシド」とは対照的に、ベクターゲノムを含まない（従って、用語「空の」）。空のカプシドは、天然（ゲノム含有ＡＡＶベクター）ウイルスと反応する１つ又は複数の抗体と反応するという点においてウイルス様粒子である。
[0094]理論により束縛されるつもりはないが、空のＡＡＶカプシドは、ＡＡＶベクターに対する抗体と結合又は反応し、これによりＡＡＶベクターの不活性化を低下させるデコイとして機能すると考えられている。そのようなデコイは、ＡＡＶベクターを標的とする抗体を吸収するように働き、これにより細胞へのＡＡＶベクター導入遺伝子の形質導入（導入遺伝子の導入）を増加させる又は改善し、次に転写物及び／又はコードされるタンパク質の細胞発現を増加させる。
[0095]空のカプシドは、決定された品質及び量で製造及び精製可能である。例えば、空のカプシド力価は、２８０ｎｍの波長における光学濃度にから、分光光度法により測定可能である（Sommerら、Mol. Ther. 2003 Jan;7(1):122-8に基づく）。
[0096]空のＡＡＶ又は空のカプシドは、時にＡＡＶベクター調製物中に自然に見出される。そのような天然の混合物は、本発明に基づき使用可能であり、或いは所望の場合には、空のカプシド及び／又はベクターの量を増加又は減少させるように操作可能である。例えば、空のカプシドの量は、対象内へのベクター媒介式の遺伝子導入で使用されるように意図されたＡＡＶベクターと反応する抗体について、その阻害効果を低下させるものと期待される量に任意選択で調整可能である。空のカプシドの使用は、米国特許公開第２０１４／０３３６２４５号に記載されている。
[0097]様々な実施形態では、空のＡＡＶカプシドは、ｒＡＡＶベクターと共に製剤化され、及び／又は対象に投与される。特別な態様では、空のＡＡＶカプシドは、ベクターと等量又はそれより少ない量で製剤化される（例えば、空のＡＡＶカプシドに対して約１．０〜１００倍のＡＡＶベクター、又は空のＡＡＶカプシドに対するＡＡＶベクターの比として約１：１）。その他の特別な態様では、ＡＡＶベクターは、過剰の空のＡＡＶカプシドと共に製剤化される（例えば、ＡＡＶベクターに対して１倍を上回る空のＡＡＶカプシド、例えば、ＡＡＶベクターに対して１．０〜１００倍の空のＡＡＶカプシド）。
[0098]いくつかの実施形態では、空のカプシドは、ｒＡＡＶベクター中に存在するものと同一のＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質を含む。その他の実施形態では、空のカプシドは、ｒＡＡＶベクターに見出されるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３タンパク質を含む。一般的には、但し必ずしもそうではないが、空のカプシドのカプシドタンパク質とｒＡＡＶベクターのカプシドが配列において同一でない場合、それらは同一の血清型である。
[0099]適する哺乳動物として、ヒト、ヒト以外の霊長類（類人猿、テナガザル、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、マカク）、飼育動物（イヌ及びネコ）、家畜（家禽、例えば、ニワトリ及びアヒル、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等）、及び実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット）が挙げられる。ヒトとして、胎児、新生児、幼児、若年、及び成人の対象が挙げられる。動物疾患モデルとして、例えば、当業者にとって公知のマウス及びその他の哺乳動物のモデルが挙げられる。
[0100]治療に適する哺乳動物として、不十分な量を産生するリスクを有する若しくはリスクに晒されている動物、又は機能的遺伝子産物（タンパク質）に欠陥を有する、又は疾患を引き起こすおそれがある異常な、部分的に機能的若しくは非機能的な遺伝子産物（タンパク質）を産生する動物が挙げられる。本発明に基づく治療に適する対象には、疾患を引き起こす異常な、又は欠陥のある（突然変異体）遺伝子産物（タンパク質）を産生するリスクを有する又はリスクに晒されている対象も含まれ、該遺伝子産物は、異常な、又は欠陥のある（突然変異体）遺伝子産物（タンパク質）の量、発現、又は機能を低下させたならば、疾患の治療、又は１つ若しくは複数の症状の抑制、又は疾患の良化を実現するように、疾患を引き起こす。
[00100]従って、哺乳動物は、遺伝子置換療法が効果的な状態を有し得る。本明細書で使用する場合、「遺伝子置換療法」とは、タンパク質をコードする核酸のレシピエントへの投与、及びその後の投与した核酸のｉｎ ｓｉｔｕでの発現を意味する。従って、慣用句「遺伝子置換療法が効果的な状態」には、遺伝的疾患等の状態（すなわち、１つ又は複数の遺伝子欠陥に起因する疾患状態）が含まれる。１つの実施形態によれば、哺乳動物のレシピエントは遺伝的疾患を有し、またｒＡＡＶベクターは、疾患を治療するための治療用タンパク質をコードする異種核酸を含む。
[0101]本発明は、細胞、組織、又は器官に対して、一対のＡＡＶ末端逆位反復配列の間に挿入された核酸を含むベクターを含有するｒＡＡＶ粒子を投与し、これにより核酸を細胞、組織、又は器官に送達するステップを含む、核酸を非ＣＮＳ細胞、組織、又は器官に送達する方法、及び核酸を非眼球細胞、組織又は器官に送達する方法を提供する。ｒＡＡＶ粒子は、任意の所望の時間、細胞と接触したまま存続することができ、一般的には、粒子は投与されると無期限に存続することができる。ＣＮＳ及び／又は眼球の細胞、組織、又は器官に投与されないことを前提として、局所的若しくは局部的、又は全身的手段を含む、任意の手段により細胞への投与が実現可能である。
[0102]ｒＡＡＶベクターは、防御性ＡｐｏＥアイソフォームタンパク質をコードする異種核酸を含み得る。ｒＡＡＶベクターは、非ＣＮＳ及び／又は非眼球細胞に感染し、防御性ＡｐｏＥアイソフォームタンパク質が発現及び分泌される。発現及び分泌された防御性ＡｐｏＥアイソフォームタンパク質は、循環内に進入し、次にＣＮＳに進入する。
[0103]ｒＡＡＶ発現ベクターは公知の技術を使用して構築可能であり、転写方向で作動的に連結したコンポーネントとして、少なくとも転写開始領域、目的とするＤＮＡ、及び転写終了領域を含む制御エレメントを備える。制御エレメントは、哺乳動物細胞内で機能的であるように選択される。得られたコンストラクトは、作動的に連結したコンポーネントを含有し、機能的なＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する（５’及び３’）。
[0104]ｒＡＡＶビリオンを製造するには、ＡＡＶ発現ベクターを、公知の技術を使用して、例えばトランスフェクション等により適する宿主細胞に導入する。いくつかのトランスフェクション技術が当技術分野において一般的に公知である。例えば、Sambrook ら、(1989) Molecular Cloning, alaboratory manual、Cold Spring Harbor Laboratories、New Yorkを参照。特に適するトランスフェクション法として、リン酸カルシウムでの共沈、培養細胞中への直接マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介式の遺伝子移入、脂質媒介式の形質導入、及び高速微細噴射法を使用する核酸送達が挙げられる。
[0105]「ＡＡＶ ｒｅｐコード領域」とは、複製タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０をコードするＡＡＶゲノムの領域である。このようなＲｅｐ発現産物は、ＡＡＶのＤＮＡ複製起点の認識、結合、及びニッキング、ＤＮＡヘリカーゼ活性、及びＡＡＶ（又はその他の異種）プロモーターからの転写調節を含む多くの機能を有することが明らかにされている。Ｒｅｐ発現産物は、その全体がＡＡＶゲノムの複製に必要とされる。ＡＡＶ ｒｅｐコード領域の適するホモログとして、ＡＡＶ２ ＤＮＡ複製を媒介することがやはり公知であるヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）ｒｅｐ遺伝子が挙げられる。
[0106]ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶ発現ベクターのトランスフェション前、又はそれと同時にＡＡＶヘルパーコンストラクトを宿主細胞にトランスフェクトすることにより、宿主細胞に導入可能である。ＡＡＶヘルパーコンストラクトは、従って、生産的ＡＡＶ感染に必要なＡＡＶ機能の喪失を補うために、ＡＡＶ ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子について少なくとも一過性の発現を実現するのに使用される。ＡＡＶヘルパーコンストラクトは、ＡＡＶ ＩＴＲを欠いており、またそれ自体を複製することも、パッケージングすることもできない。このようなコンストラクトは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、又はビリオンの形態であり得る。いくつかのＡＡＶヘルパーコンストラクト、例えば、Ｒｅｐ及びＣａｐ発現産物の両方をコードする、一般的に使用されているプラスミドｐＡＡＶ／Ａｄ、及びｐＩＭ２９＋４５等が記載されている。Ｒｅｐ及び／又はＣａｐ発現産物をコードするいくつかのその他のベクターも記載されている。
[0107]発明のｒＡＡＶベクター、組成物、薬剤、薬物、生物学的製剤（タンパク質）は、医薬組成物、例えば、薬学的に許容される担体又は添加剤に組み込み可能である。そのような医薬組成物は、特に、対象へのｉｎ ｖｉｖｏでの投与及び送達に有用である。
[0108]別途定義されなければ、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者により一般的に理解される意味と同一の意味を有する。本明細書に記載する方法及び材料と類似した又は同等の方法及び材料も、本発明の実践又は試験において利用可能であるが、好適な方法及び材料が本明細書に記載されている。
[0109]本明細書で引用されたすべての出願、公開資料、特許、及びその他の参考資料、ＧｅｎＢａｎｋの引用、及びＡＴＣＣの引用は参考としてそのまま援用されている。矛盾する場合、本明細書が、定義を含めコントロールする。
[0110]本明細書に開示するすべての特性は、任意の組合せで組み合わせ可能である。本明細書に開示する各特性は、同一、同等、又は類似した目的を果たす代替特性に置き換わり得る。従って、別途明記されなければ、開示される特性（例えば、改変された核酸、ベクター、プラスミド、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター、ベクターゲノム、又はｒＡＡＶウイルス粒子）は、同等又は類似した特性の属の例である。
[0111]本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容される」及び「生理学的に許容される」とは、１つ又は複数の投与経路、ｉｎ ｖｉｖｏでの送達又は接触に適する、生物学的に許容される処方物、気体、液体、若しくは固体、又はその混合物を意味する。「薬学的に許容される」又は「生理学的に許容される」組成物は、生物学的に又はそれ以外で忌避されない物質であり、例えば、物質は相当程度の忌避されない生物学的効果を引き起こさずに対象に投与され得る。従って、そのような医薬組成物は、例えばｒＡＡＶベクター又はｒＡＡＶ粒子を対象に投与するのに使用され得る。
[0112]そのような組成物として、医薬品投与又はｉｎ ｖｉｖｏでの接触又は送達に適合する溶媒（水性又は非水性）、溶液（水性又は非水性）、エマルジョン（例えば、水中油型又は油中水型）、懸濁物質、シロップ、エリキシル剤、分散及び懸濁媒体、コーティング、等張及び吸収促進又は遅延剤が挙げられる。水性及び非水性の溶媒、溶液、及び懸濁物質は、懸濁剤及び増粘剤を含み得る。そのような薬学的に許容される担体として、錠剤（コーティング有り又はコーティング無し）、カプセル（ハード又はソフト）、ミクロビーズ、粉末、顆粒、及び結晶が挙げられる。補助的な活性化合物（例えば、防腐剤、抗菌性、抗ウイルス性、及び抗真菌性の薬剤）もまた組成物に組み込み可能である。
[0113]医薬組成物は、様々な経路による投与に適する担体、賦形剤、又は添加剤を含む。非経口投与に適する組成物は、活性化合物の水性及び非水性の溶液、懸濁物質、又はエマルジョンを含み、その調製物は、一般的に無菌であり、また意図したレシピエントの血液と等張であり得る。非限定的な実例として、水、生理食塩水、デキストロース、フルクトース、エタノール、動物油、植物油、又は合成油が挙げられる。
[0114]本発明の組成物、方法、及び使用に適する医薬組成物及び送達システムは、当技術分野において公知である（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2003) 20版、Mack Publishing Co., Easton, PA;Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) 18版、Mack Publishing Co., Easton, PA;The Merck Index (1996) 12版、Merck PublishingGroup, Whitehouse, NJ; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms(1993), Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.; Ansel and Stoklosa, PharmaceuticalCalculations (2001) 11版、Lippincott Williams &Wilkins, Baltimore, MD;及びPoznanskyら、Drug Delivery Systems (1980), R. L.Juliano編、Oxford, N.Y., pp. 253-315を参照）。
[0115]「単位用量」又は「単位投与剤形」とは、本明細書で使用する場合、治療される対象に対する一元的投与として適する、物理的に分離した単位を意味する；事前決定量を含有する各単位は、任意選択で医薬担体（添加剤、賦形剤、媒体、又は充填剤）と関連するが、１つ又は複数の用量で投与される場合、所望の効果（例えば、予防的又は治療的効果）を生み出すように計算される。単位投与剤形は、例えば、アンプル及びバイアル内に含めることができ、それは液体組成物、又は凍結乾燥（freeze-dried）又は凍結乾燥（lyophilized）状態の組成物；無菌の液体担体を含み得るが、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与又は送達前に添加され得る。個々の単位投与剤形は、複数回投与用キット又は容器に含まれ得る。ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶ粒子、及びその医薬組成物は、投与を容易にし、用量を均一化させるために単一又は複数の単位投与剤形内に包装され得る。
[0116]様々な検出方法が、疾患の状態又は改善を確認するのに利用可能である。そのような検出方法として免疫検出法が挙げられる。免疫検出方法として、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）、免疫放射線アッセイ法、蛍光イムノアッセイ法、化学発光アッセイ法、生物発光アッセイ法、及びウェスタンブロット法が挙げられる。その他の方法も当業者にとって公知である。様々な有用な免疫検出方法が科学文献に記載されてきた。
[0117]一般的に、免疫結合法は、Ａβタンパク質を含有すると疑われるサンプルを取得すること、及び場合に応じて、免疫複合体の形成を可能にするのに有効な条件下で、サンプルを、第１抗体、すなわちＡβに対して特異的なモノクロナール又はポリクロナールと接触させることを含む。
[0118]免疫結合法は、サンプル中のＡβタンパク質の量を検出及び／又は定量する方法、並びに結合プロセス期間中に形成されたあらゆる免疫複合体の検出及び／又は定量化を含む。ここでは、Ａβタンパク質を含有すると疑われるサンプルを取得し、サンプルを抗体と接触させ、次に特異的条件下で形成された免疫複合体の量を検出及び定量化することができる。
[0119]免疫複合体（一次免疫複合体）の形成を可能にする条件、及び十分な期間で生体サンプルを抗体と接触させることとは、一般的に、抗体組成物をサンプルに単に添加すること、及び抗体が存在するいずれかの抗原と免疫複合体を形成する、すなわちそれと結合するだけの期間、混合物をインキュベートすることである。この後、サンプル−抗体組成物、例えば血液、血漿、若しくは血清サンプル等、又は組織切片、ＥＬＩＳＡプレート、ドットブロット又はウェスタンブロットが、非特異的に結合したあらゆる抗体種を取り除くように処理され（例えば、洗浄され）、一次免疫複合体内の特異的に結合した分子のみが検出可能となるようにするのが一般的である。
[0120]一般的に、免疫複合体形成の検出法は当技術分野において公知であり、また非常に多くのアプローチを適用することにより実現され得る。このような方法は、標識又はマーカー、例えば放射性、蛍光性、生物学的、及び酵素的なタグ等のうちのいずれかを検出することに基づくのが一般的である。そのような標識の使用に関する米国特許として、米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、同第３，９９６，３４５号、同第４，２７７，４３７号、同第４，２７５，１４９、及び同第４，３６６，２４１号が挙げられる。もちろん、当技術分野において公知なように、二次結合リガンド、例えば第２抗体、及び／又はビオチン／アビジンリガンド結合構成等の使用を採用することもできる。
[0121]上記のように、タンパク質検出分子（すなわち、結合リガンド、例えば抗体又は抗体断片等）そのものが、検出可能な標識と連結することができ、その場合、次にこの標識を単に検出し、これにより、組成物内の一次免疫複合体の量について決定及び／又は定量化が可能となる。或いは、一次免疫複合体内で結合状態となる第１抗体は、該抗体に対して結合親和力を有する第２の結合リガンドによって検出され得る。この場合、第２の結合リガンドは、検出可能な標識と連結し得る。第２の結合リガンドそのものは多くの場合抗体であり、従って「二次」抗体と呼ばれる場合もある。一次免疫複合体は、二次免疫複合体の形成を可能にする効果的な条件下で、十分な期間、標識化二次結合リガンド又は抗体と接触する。二次免疫複合体は、次に非特異的に結合した標識化二次抗体又はリガンドのすべてを取り除くために洗浄するのが一般的であり、二次免疫複合体内の残りの標識が次に検出される。
[0122]更なる方法は、２ステップアプローチによる一次免疫複合体の検出を含む。第１の結合リガンドに対して結合親和力を有する抗体等の第２の結合リガンドが、上記のような二次免疫複合体の形成に使用される。洗浄後、二次免疫複合体は、第２の抗体に対して結合親和力を有する第３の結合リガンド又は抗体と免疫複合体（三次免疫複合体）の形成を可能にするのに十分な条件下及び期間で、再度接触する。第３のリガンド又は抗体は、検出可能な標識と連結し、形成された三次免疫複合体の検出を可能にし得る。この系は、所望の場合にはシグナル増幅を提供し得る。
[0123]これまでに詳記したように、イムノアッセイ法は結合アッセイ法である。特定のイムノアッセイ法は、当技術分野において公知の様々な種類の酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡｓ）及び／又はラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）である。組織切片を使用する免疫組織化学検出法もまた有用である。検出法はそのような技術に限定されず、及び／又はウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、ＦＡＣＳ分析法等も利用可能であるものと直ちに認識される。
[0124]代表的なＥＬＩＳＡでは、抗体が、タンパク質親和性を示す選択された表面、例えばマイクロタイタープレート内のウェル等に固定化される。次に、ＡＰタンパク質を含有すると疑われる試験組成物、例えば臨床サンプル等（例えば、対象から得られる生体サンプル）が、ウェルに添加される。結合及び／又は非特異的に結合した免疫複合体を取り除く洗浄の後、抗体結合抗原が検出され得る。検出は、検出可能な標識と連結した別の（二次）抗体の添加により一般的に達成される。この種のＥＬＩＳＡは、単純な「サンドイッチＥＬＩＳＡ」である。また検出は、第２抗体の添加、その後の第２抗体に対して結合親和力を有する第３抗体であって、検出可能な標識と連結した第３抗体の添加により達成される場合もある。
[0125]別の代表的なＥＬＩＳＡでは、抗原を含有すると疑われるサンプルがウェル表面に固定化され、及び／又は次に結合剤と接触する。結合、及び／又は非特異的に結合した免疫複合体を取り除く洗浄の後、結合した抗結合剤が検出される。最初の結合剤が検出可能な標識と連結している場合、免疫複合体は直接検出され得る。やはり、免疫複合体が、第１の結合剤に対して結合親和力を有する第２抗体であって、検出可能な標識と連結した第２抗体を使用して検出され得る。
[0126]抗原が固定化された別のＥＬＩＳＡは、検出のための抗体競合の使用と関係する。このＥＬＩＳＡでは、抗原に対する標識化抗体がウェルに添加され、結合可能にし、及び／又はその標識により検出される。未知のサンプル中の抗原の量は、次にサンプルを抗原に対する標識化抗体と混合することにより、コーティングされたウェルを用いたインキュベーション期間中に決定される。サンプル中に抗原が存在すると、ウェルとの結合に利用可能な抗原に対する抗体の量が低下するように作用し、従って最終的なシグナルを低下させる。これは、未標識の抗体が、抗原がコーティングされたウェルに結合し、標識化抗体との結合に利用可能な抗原の量をやはり低下させるような、未知のサンプル中の抗原に対する抗体の検出にも適する。
[0127]採用されたフォーマットを問わず、ＥＬＩＳＡは、共通する所定の特徴、例えばコーティング、インキュベーション及び結合、非特異的に結合した種を取り除く洗浄、及び結合した免疫複合体の検出及び／又は定量化等を有する。
[0128]ＥＬＩＳＡでは、直接的な手順よりはむしろ二次又は三次検出手段を使用することの方が、おそらくはより慣例的である。従って、ウェルへのタンパク質又は抗体の結合、バックグラウンドを低下させる非反応性物質でのコーティング、及び未結合の物質を取り除く洗浄を行った後、固定化表面を、免疫複合体（抗原／抗体）形成を可能にするのに有効な条件下で試験される生体サンプルと接触させる。免疫複合体の検出では、次に標識された二次結合リガンド又は抗体、及び標識化三次抗体又は第３の結合リガンドと関連する二次結合リガンド又は抗体等が、以下同様に採用される。
[0129]「免疫複合体（抗原／抗体）形成を可能にする条件下」とは、結合を可能にする又は促進する条件を意味する。そのような条件は、サンプル、例えばＡＰタンパク質、τオリゴマー等、及び／又は抗体組成物を、ＢＳＡ、ウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／ツイーン等の溶液で希釈することを含み得る。このような添加された薬剤も、非特異的なバックグラウンドの低下を支援する傾向を有する。
[0130]「適する」条件とは、結合を可能にするのに十分な温度で、又は期間、インキュベーションが行われることも意味する。代表的で非限定的なインキュベーションステップは、約１〜２〜４時間程度、好ましくは２５℃〜２７℃ほどの温度であり、又は一晩約４℃程度であり得るのが一般的である。
[0131]ＥＬＩＳＡのすべてのインキュベーションステップを行った後、接触表面を洗浄して非複合体形成物質を取り除く。洗浄手順の例には、ＰＢＳ／ツイーン、又はホウ酸塩バッファー等の溶液を用いた洗浄が含まれる。試験サンプルと最初に結合した物質の間で特異的免疫複合体が形成され、後続する洗浄を行った後、微量であっても免疫複合体の量が決定され得る。
[0132]検出手段を提供するために、第２又は第３の抗体が検出を実現する関連標識を有し得る。これは、適切な発色基質と共にインキュベートすると発色を引き起こす酵素であり得る。従って、例えば、第１及び第２の免疫複合体を、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はハイドロジェンペルオキシダーゼ結合抗体と、更なる免疫複合体形成が起こりやすい期間及び条件下で接触させ、又はインキュベーションすることができる（例えば、ＰＢＳ含有溶液、例えばＰＢＳ−ツイーン等の中、室温で２時間インキュベーション）。
[0133]標識抗体とインキュベートし、後続する未結合物質を取り除く洗浄を行った後、例えば、発色基質、例えば尿素、又はブロモクレゾールパープル、又は２，２’−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）、又は酵素標識としてペルオキシダーゼの場合はＨ２Ｏ２等とインキュベートすることにより、標識の量が定量化される。定量化は、次に例えば可視スペクトル分光光度計を使用して生成した色の程度を測定することにより達成される。
[0134]本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈において別途明示されない限り複数形の指示物を含む。従って、例えば、「核酸（ａ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」という場合、複数のそのような核酸を含み、「ベクター（ａ ｖｅｃｔｏｒ）」という場合、複数のそのようなベクターを含み、「ウイルス（ａ ｖｉｒｕｓ）」又は「粒子（ｐａｒｔｉｃｌｅ）」という場合、複数のそのようなビリオン／粒子を含む。
[0135]本明細書で使用する場合、すべての数値又は数値範囲には、そのような範囲内の整数、及び範囲内の数値又は整数の端数が、文脈において別途明示されない限り含まれる。従って、説明目的で、８０％又はそれ超の同一性という場合、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％等、並びに８１．１％、８１．２％、８１．３％、８１．４％、８１．５％等、８２．１％、８２．２％、８２．３％、８２．４％、８２．５％等が以下同様に含まれる。
[0136]より多くの（より大きな）又はより少ない整数には、参照する数字より大きい又は小さい任意の数字がそれぞれ含まれる。従って、例えば、１００未満という場合、それには９９、９８、９７等から最終的に１の数までが含まれる；及び１０未満には、９、８、７等から最終的に１の数まで含まれる。
[0137]本明細書で使用する場合、すべての数値又は範囲には、数値の端数、及びそのような範囲内の整数、及びそのような範囲内の整数の端数が、文脈において別途明示されない限り含まれる。従って、説明目的で、数値範囲、例えば１〜１０等という場合、それには、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、並びに１．１、１．２、１．３、１．４、１．５等が以下同様に含まれる。１〜５０の範囲という場合、従ってそれには、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０等、５０を含むそれまでの数値、並びに１．１、１．２、１．３、１．４、１．５等、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５等が以下同様に含まれる。
[0138]一連の範囲という場合、それには、一連のうちの異なる範囲において、その境界の数値を組み合わせた範囲が含まれる。従って、説明目的で、例えば、１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜７５０、７５０〜１，０００、１，０００〜１，５００、１，５００〜２，０００、２，０００〜２，５００、２，５００〜３，０００、３，０００〜３，５００、３，５００〜４，０００、４，０００〜４，５００、４，５００〜５，０００、５，５００〜６，０００、６，０００〜７，０００、７，０００〜８，０００、又は８，０００〜９，０００、の一連の範囲には、１０〜５０、５０〜１００、１００〜１，０００、１，０００〜３，０００、２，０００〜４，０００等の範囲が含まれる。
[0139]本発明は、非常に多くの実施形態及び態様を記載するのに肯定的言語を使用して本明細書に一般的に開示されている。また本発明には、特定の主題、例えば物質又は材料、方法ステップ及び条件、プロトコール、又は手順等が全部又は一部除外される実施形態も特に含まれる。例えば、本発明の特定の実施形態又は態様では、材料及び／又は方法ステップが除外されている。従って、本発明は何を含まないかについて本明細書では一般的に表現されないが、本発明において明確に除外されない態様であれば、それにもかかわらず本明細書の開示の対象となる。
[0140]本発明のいくつかの実施形態について記載してきた。それにもかかわらず、本発明の精神及び範囲から逸脱せずに、本発明が様々な利用及び条件になじむように、当業者は本発明に様々な変更及び改変を加えることができる。従って、下記の実施例では説明することが意図されており、主張する本発明の範囲を限定するものではない。
下記の実施例１は国際公開第２０１５／０７７４７３号に記載される：アミロイド沈着の進行における変化。
[0141]この実施例は、アデノ随伴ウイルス血清４型（ＡＡＶ４）の脳室内注射を通じて異なるＡｐｏＥアイソフォームを過剰発現させた後、ａｐｐ／ｐｓマウスにおけるアミロイド沈着の進行の変化について試験した。
[0142]ＡｐｏＥのε４対立遺伝子（ＡｐｏＥε４）は、アルツハイマー病（ＡＤ）における第１の遺伝的リスク因子である一方、ＡｐｏＥの稀なε２対立遺伝子（ＡｐｏＥε２）の遺伝質はこのリスクを約半分に低下させる。しかし、ほぼ１７年前のこのような強い遺伝的な手がかりの発見にもかかわらず、ＡｐｏＥがリスクをもたらす機構は不明確なままである。
[0143]異なるＡｐｏＥアイソフォーム（ＡｐｏＥε２、ε３、及びε４）が線維性アミロイドプラークの形成及び安定性にどのように影響を及ぼすか解明するために、各ＡｐｏＥアイソフォームをコードするＡＡＶ４ベクターを７月齢のＡＰＰ／ＰＳマウスの脳室内に注射した。Ｉｎ ｖｉｖｏでの多重光子画像法を使用して、アミロイド沈着物の集団を、ベースライン時、及びＡｐｏＥへの曝露後２カ月間にわたり追跡し、従って生存動物におけるアミロイドーシスの進行について動的考察を可能にした。
[0144]アミロイドプラーク沈着の動力学は、各アイソフォームによって変化することが認められ、２カ月後にＡｐｏＥε３と比較して、ＡｐｏＥε４が注射されたマウスでは老人斑が３８％増加したが、一方ＡｐｏＥε２で処置されたマウスではアミロイド沈着物数について１５％の減少が認められた。死後分析により、このような結果が確認され、また皮質においてプラークをデコレートするヒトＡｐｏＥタンパク質の存在が明らかとなったが、これは実質全体にわたるタンパク質の大規模な拡散、及びＡβペプチドが沈着した部位における該タンパク質の限局性の蓄積を反映する。指摘すべき重要事項として、このＡｐｏＥε４タンパク質の含有量増加もまたアミロイド沈着物周辺のより重度のシナプス消失と関連したことが挙げられる。
[0145]全体として、本データは、異なるＡｐｏＥアイソフォームが過剰に生成すると、疾患の進行に影響を及ぼすことが可能なこと、及びＡＤ患者における認知障害と最もよく相関するいくつかのパラメーターのうちの１つであるシナプス消失の範囲について調節可能であることを実証した。
１．ＡＡＶ４−ＡｐｏＥの脳室内注射はｈｕＡｐｏＥの安定な発現を引き起こし、脳内における組換えヒトＡｐｏＥ（ｈｕＡｐｏＥ）タンパク質の持続的な検出を実現した。
[0146]要するに、ＡＡＶ４ベクターを注射したＡＰＰ／ＰＳマウスにおいて、ＧＦＰ及びｈｕＡｐｏＥを免疫検出した。ＧＦＰシグナルが、脳室エリア全体（上側パネル）及び脳室内側を覆う細胞、並びにヒトＡＰＯＥにおいて認めることができた。
[0147]本アプローチを評価するために、ＡＡＶ４−Ｖｅｎｕｓ（コントロール）、−ＡｐｏＥ２、−ＡｐｏＥ３、及び−ＡｐｏＥ４を野生型マウスの脳室内に注射した。注射から２カ月後、アミロイド沈着物周辺の皮質実質内でヒトＡｐｏＥタンパク質を検出することができた（３Ｈ１抗体に注目；非特異的バックグラウンドのみがＡＡＶ４−ＧＦＰ注射マウスに認められた）。従って、有意なレベルのヒトＡｐｏＥがＥＬＩＳＡにより脳内で検出され、Ｖｅｎｕｓ及びＡｐｏＥに対する免疫組織学的染色により、脳室内側を覆う細胞による異なる導入遺伝子の発現を確認した。
[0148]導入遺伝子のｍＲＮＡレベルを評価するために、ｑＲＴ−ＰＣＲ実験を実施した。標準曲線から、内因性ＧＡＰＤＨのレベルに基づきｈｕＡｐｏＥ ｍＲＮＡの濃度を決定することができた。２又は５カ月間曝露したマウスから得たサンプルが含まれた。ヒトＡＰＯＥを特異的に検出するように設計されたＥＬＩＳＡアッセイを脳ホモジネートにおいて実施した（国際公開第２０１５／０７７４７３号に示す図１Ａ）。ヒトＡＰＯＥに対して特異的なＥＬＩＳＡにより定量化され（国際公開第２０１５／０７７４７３号に示す図１Ｂ）、及びウェスタンブロットにより確認されるように、低レベルの組換えタンパク質が、ＡＡＶ４−ＧＦＰ処置動物との比較において、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ注射マウスにおいて検出することができた。
２．各ＡＰＯＥアイソフォームの過剰発現は、アミロイドーシスの進行に差動的に影響を及ぼす。
[0149]Ｉｎ ｖｉｖｏでの二光子画像法を使用して、生存動物におけるアミロイド沈着物を経時的に追跡した。要するに、ＡＰＰ／ＰＳマウス（７月齢）に、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、及びＶｅｎｕｓをコードするＡＡＶ４ベクターを定位的に注射した。１週間後、頭蓋窓を移植し、開頭後、アミロイド沈着物を経時的に画像化した。２カ月後、動物を絶命せしめ、死後分析を実施した。
[0150]ＡＡＶ４−ＡｐｏＥ２、ＡＡＶ４−ＡｐｏＥ３、又はＡＡＶ４−ＡｐｏＥ４を注射したＡＰＰ／ＰＳマウスの二光子画像を調製した。メトキシ−Ｘ０４（５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した後、アミロイドプラークを検出することができ、テキサスレッドデキストラン（分子量７０，０００Ｄａ；１２．５ｍｇ／ｍｌの無菌ＰＢＳ）を外側尾静脈中に注射して蛍光血管造影図を得た。画像を、注射後１週間（＝Ｔ０）、１カ月、及び２カ月に取得した。同一視野を経時的に撮影して病変の進行を追跡した。いくつかの新しいアミロイド沈着物が現れたが、そのいくつかは、２カ月の期間においてもはや検出できなかった。
[0151]Ｉｎ ｖｉｖｏ画像の完全分析は、アミロイド沈着物の数は、ＡＡＶ４−ＡｐｏＥ４注射ＡＰＰ／ＰＳマウスにおいて、ＡＡＶ４−ＡｐｏＥ３及びＡＡＶ４−Ｖｅｎｕｓ処置動物の両方と比較してそれより有意に急速に増加することを示している。対照的に、ＡＡＶ４−ＡｐｏＥ２を使用したとき、わずかではあるが有意なプラーク密度の減少が測定される（国際公開第２０１５／０７７４７３号に示す図２）。ＡＡＶ４−ＡｐｏＥ４を注射したＡＰＰ／ＰＳマウスにおいて、プラークがより大きくなる傾向が認められるが（ｐ＜０．０６）、全体的として、プラークのサイズは一定のままである。Ｉｎ ｖｉｖｏでの画像化の要約されたデータは、各ＡＰＯＥアイソフォームが過剰発現すると、ｉｎ ｖｉｖｏでのアミロイド沈着の進行に対して差動的に影響を及ぼすことを示す。ＡＡＶ４−ＡｐｏＥ２を注射すると、アミロイド密度の若干の減少を経時的に引き起こすが、ＡＡＶ４−ＡｐｏＥ４を注射するとアミロイドーシスを更に悪化させる。
３．アミロイドプラークのサイズは、各ＡｐｏＥアイソフォームに応じて変化する。
[0152]Ｉｎ ｖｉｖｏでの二光子画像法は、２カ月間にわたり、各アミロイド沈着物のサイズ変化について、その追跡を可能にした。プラークのサイズは、安定なままであるか、経時的に増加又は減少し得る。Ｔ１／Ｔ０とＴ２／Ｔ１の間のサイズ比の分布は、ＡＡＶ４−ＡｐｏＥ４を注射したマウスでは、その他の群と比較して、アミロイドプラークがそれよりも大きくなる傾向が認められることを示している（国際公開第２０１５／０７７４７３号に示す図３）。
４．アミロイド負荷の死後評価より、アミロイド沈着に対するＡｐｏＥ２及びＡｐｏＥ４の効果が確認される。
[0153]ＡＡＶ４注射から２カ月後、死後の立体解析学的評価より、ＡＡＶ４−ＡｐｏＥ４注射した動物は、皮質内により高密度のアミロイドプラークを有する一方、その他の群の間では相違を検出することはできないことが判明した（国際公開第２０１５／０７７４７３号に示す図４Ａ）。このようなアミロイド沈着物数の増加は、プラークをＴｈｉｏＳ又はＢａｍ１０で標識したときに認められる。但し、Ｂａｍ１０とＴｈｉｏＳの間の比の変化は検出されなかった。注射から５カ月後、各ＡｐｏＥアイソフォームの効果は、２カ月と比較してそれより顕著である（国際公開第２０１５／０７７４７３号に示すように図４Ｂ）。マウスにＡＡＶ４−ＡｐｏＥ４を注射したとき、沈着物の密度の有意な増加を認めたが、一方ＡｐｏＥ２について逆の効果を検出した。やはり、Ｂａｍ１０とＴｈｉｏＳの間の比の変化は検出されなかった。
５．各ＡｐｏＥアイソフォームは、アミロイド沈着物周辺のシナプス密度に対して差動的に影響を及ぼす。
[0154]アレイトモグラフィーを使用して、アミロイド沈着物周辺のプレ及びポストシナプスエレメントの密度を正確に決定した。この新しい画像化法は、組織分子構造を高分解能で画像化する能力をもたらす。アレイトモグラフィーは、試料の超薄切片化（７０ｎｍ）、免疫染色、及び３Ｄ再構成に基づく。アミロイドプラーク及びポストシナプスマーカーＰＳＤ９５について染色されたアレイトモグラフィーサンプルの代表的な画像。アレイトモグラフィー画像は、ポストシナプスマーカーＰＳＤ９５の数の減少がアミロイド沈着物周辺に認められるが、しかしこの効果は、プラークから離れたところでは消滅することを示している。プラーク近傍又は遠方におけるプレシナプスマーカー（シナプシン−１）及びポストシナプスマーカーの定量を、ＡＡＶ４を注射したマウスの各群において決定した（国際公開第２０１５／０７７４７３号に示す図５Ａ〜Ｄ）。プレ及びポストシナプスエレメントについて広範囲にわたる定量化を行い、シナプシン１及びＰＳＤ９５の密度の減少は、アミロイドプラークと関連すること、この効果はＡＰＰ／ＰＳ１マウスの脳内でＡｐｏＥ４が過剰発現したときに劇的に増幅されることを確認した（国際公開第２０１５／０７７４７３号に示す図５Ｃ、図５Ｄ）。ＡｐｏＥ４の過剰発現は、その他の群との比較においてアミロイド沈着物近傍の脊椎喪失の増加と関連する。逆に、シナプシン斑の密度は、ＡｐｏＥ２で処置した動物の方がプラーク周辺においてより高い。
結論
[0155]ＡＡＶウイルス血清４型を脳室内に注射すると、大脳の実質全体を通じて可溶性の組換えタンパク質の持続的且つ慢性的な過剰生成を引き起こした。ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、及びＡｐｏＥ４の過剰発現は、ＡＰＰ／ＰＳマウスにおける病理学の経過に対して差動的に影響を及ぼし、そのため、ＡｐｏＥ４を注射したとき、ＡｐｏＥ３と比較してアミロイド負荷の進行が有意に高まった。反対に、ＡｐｏＥ２は、保護効果と関連し、いくつかのアミロイド沈着物は注射から２カ月後にはもはや検出不可能である。死後の免疫組織学的分析では、ＡｐｏＥ４の有害な作用を確認した。ＡｐｏＥ４が持続的に過剰生成すると、アミロイド沈着物周辺に認められたシナプス消失がＡｐｏＥ３と比較して増悪したが、ＡｐｏＥ２の効果は軽度であった。本試験は、ＡｐｏＥアイソフォーム、アミロイドーシスの進行、及びシナプス消失の間のｉｎ ｖｉｖｏにおける直接的な関連性を実証した。
下記の実施例２は国際公開第２０１５／０７７４７３号に記載されており、ＣＳＦ送達によるＣＮＳ障害の治療奏功を示す：大型哺乳動物における脳脊髄液（ＣＳＦ）を経由するＣＮＳ障害の処置。
[0156]脳障害、例えばアルツハイマー病等に対する遺伝子療法を実現するために、哺乳動物において治療用酵素レベルが長期にわたり定常状態を実現することができるか確認する必要があった。上衣細胞（脳内の脳室内側を覆う細胞）に形質導入し、脳脊髄液（ＣＳＦ）中に標的酵素を分泌させ得ることが発見された。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ４）は、マウスモデルの上衣に高効率で形質導入することができることが確認された（Davidsonら、PNAS, 28:3428-3432, 2000）。マウスでは、疾患脳内に貯えられた基質レベルがＡＡＶ４処置後に正常化することが認められた。
[0157]ＣＳＦ内の酵素レベルが定常状態を実現するために、ベクターのグローバルな送達が有効に実施可能か調査した。最初に、より大きな哺乳動物の脳内の上衣細胞（脳室内側を覆う細胞）に形質導入することができるベクターを見出す必要があった。ＬＩＮＣＬのイヌモデル及びＬＩＮＣＬのヒト以外の霊長類モデルにおいて試験を実施した。ＬＩＮＣＬのイヌは出生時正常であるが、しかし約７カ月目頃に神経学的兆候、約５〜６カ月において試験可能な認知障害、１０〜１１カ月において発作、及び進行性の視覚喪失を発症する。
[0158]アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、そのサイズが小さく（２０ｎｍ）、そのほとんどの遺伝物質が、ウイルス遺伝子が存在しないように、及び複製不能であるように除去され（「抜き出され」）得るので、これをベクターとして選択した。アデノ随伴ウイルス４型（ＡＡＶ４）ベクターが、β−グルクロニダーゼ欠損症により引き起こされたムコ多糖症ＶＩＩ型（ＭＰＳ ＶＩＩ）のマウスモデルにおいて、グローバルな機能的及び病理学的改善を媒介し得るかこれまでに試験された（Liuら、J. Neuroscience, 25(41):9321-9327, 2005）。β−グルクロニダーゼをコードする組換えＡＡＶ４ベクターを、確立された疾患を有するＭＰＳ ＶＩＩマウスの側脳室中に片側的に注射した。形質導入された上衣は、高レベルの組換え酵素を発現し、分泌酵素は大脳及び小脳構造、並びに脳幹を貫通した。免疫組織化学試験により、組換え酵素と脳微小血管系の密接な関係が明らとなり、β−グルクロニダーゼが血管内側を覆う血管周囲腔を経由して脳実質に到達したことを示唆する。嫌悪連想学習を文脈的恐怖条件付けにより試験した。年齢が一致した異型接合性のコントロールと比較して、罹患マウスは条件性恐怖反応及び文脈的判別の障害を示した。この行動の欠陥は、ＡＡＶ４β−グルクロニダーゼで処置したＭＰＳ ＶＩＩマウスでは、遺伝子移入後６週間経過して反転した。データは、上衣細胞は、脳実質周辺及びＣＳＦに酵素を分泌する供給源としての役割を果たし得ることを示す。
[0159]しかし、驚くべきことに、この試験を大型の哺乳動物（すなわち、イヌ及びヒト以外の霊長類）に拡張すると、ＡＡＶ４ベクターはこの動物の上衣を標的としたとき、有効ではなかった。むしろ、ＡＡＶ２ベクターを使用する必要があった。要するに、ＴＰＰ１をコードするｒＡＡＶ２（ＡＡＶ２−ＣＬＮ２）を作成し、脳室内に注射して上衣に形質導入した（Liuら、J. Neuroscience, 25(41):9321-9327, 2005）。ＴＰＰ１は、ＬＩＮＣＬにおいて酵素欠損性である。データは、ＮＨＰ脳内に上衣形質導入すると、ＣＳＦにおいて酵素の有意な増加を引き起こすことを示唆した。結果は、様々な脳領域においてＴＰＰ１活性レベルが上昇したことを示唆した（縦軸はコントロールの活性に対する割合（％）を示す）（国際公開第２０１５／０７７４７３号に示す図７）。
[0160]処置した最初のイヌでは、ベクターの送達は最適ではなかったが、しかし脳内でＣＬＮ２活性をなおも示した。次のイヌは、定位脳手術によりＩＣＶ送達を受けた。処置したイヌの認知能力は、Ｔ字迷路成績により測定されるように、未処置のイヌよりも有意に改善したことが判明した（国際公開第２０１５／０７７４７３号に示す図８）。更に、ＬＩＮＣＬのイヌモデルにおけるＡＡＶ２−ＣＬＮ２のＩＣＶ送達効果は非常に顕著であった。未処置（−／−）動物では大型の脳室が存在する一方、未処置コントロール及び処置した動物の脳は脳室を示さなかった。ＬＩＮＣＬのイヌの脳室にＡＡＶ．ＴＰＰ１を送達した後、検出可能な酵素活性が、小脳及び上部脊髄を含む様々な脳領域において認められた。生存している追加の罹患したイヌ２例では、脳萎縮が有意に減弱され、寿命が延び、認知機能が改善した。最終的に、ＮＨＰにおいて、この方法は、野生型よりも２〜５倍高いＴＰＰ１活性レベルを実現可能であることを示す。
[0161]いくつかのＡＡＶベクターを作成し、ＩＴＲとカプシドの最適な組合せを決定する試験を行った。５つの異なる組合せを生成し、ＡＡＶ２ ＩＴＲが最も有効であることを確認した：ＡＡＶ２／１（すなわち、ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ１カプシド）、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／４、ＡＡＶ２／５、及びＡＡＶ２／８。大型哺乳動物（イヌ及びＮＨＰ）では、ＡＡＶ２／２がかなり良好に機能し、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／１、及びＡＡＶ２／４がそれに続くことを発見した。ウイルスベクターの有効性の順番はマウスで観察された順番とは反対であるため、これは非常に驚きであった。
[0162]従って、本研究により、脳室内側を覆う細胞は、脳全体にわたる分布のためのＣＳＦ内組換え酵素供給源となり得ること、並びにＡＡＶ２／２は、イヌ及び非ヒト霊長類において、ＣＬＮ２（ＴＰＰ１）をコードする遺伝子などの治療剤を投与するための有効な媒体であることが示された。
下記の実施例３は国際公開第２０１５／０７７４７３号に記載されており、ＡＡＶベクターによりＣＮＳに送達された異なるＡｐｏＥアイソフォームの効果を示す：遺伝子移入により送達されたヒトＡＰＯＥアイソフォームは、アミロイド沈着、排出、及び神経毒性に影響を及ぼすことによりアルツハイマー病を差動的に調節する。
[0163]アルツハイマー病（ＡＤ）は最も頻度の高い加齢性神経変性障害であり、主要な公衆衛生上の懸念となっている。ＡＤの遅発性散発性の形態と関連する感受性遺伝子の中でも、アポリポタンパク質Ｅε４（ＡＰＯＥ遺伝子；ＡｐｏＥタンパク質）対立遺伝子は、並外れて最も重要な遺伝的リスク因子である。ＡＰＯＥε４が１コピー存在しても、最も一般的なＡＰＯＥε３対立遺伝子と比較して、疾患発症リスクを実質的に３倍増加させる一方、２コピーでは１２倍増加させる。興味深いことに、ＡＰＯＥε２は逆の効果を有し、防御因子でもあり、この特別な対立遺伝子の遺伝質は、ＡＰＯＥ３／３と比較して、ＡＤの年齢調整リスクを約半分に減少させる。認知症の発症の平均年齢もこれらのリスクプロファイルに対応しており、ＡＰＯＥ４／４保因者は６０代半ばに発症し、ＡＰＯＥ２／３保因者は９０代前半に発症する（ほぼ３０年のずれ）一方、ＡＰＯＥ３／３個体は発症年齢がその間、つまり１９７０代半ばである。
[0164]ＡｐｏＥがＡＤに影響を与える機構については議論の余地がある。該疾患の稀な常染色体優性形態に関わりを持つすべての公知遺伝子がＡβペプチドの産生に関与しているので、患者の海馬及び皮質における老人斑を含有するＡβ蓄積は、ＡＤにおいて中心的な役割を果たすと考えられている。興味深いことに、ＡＰＯＥ遺伝子型は、ＡＤ患者におけるアミロイド沈着の程度、並びに剖検サンプル内で検出された神経毒性可溶性オリゴマーＡβの量に強く影響を及ぼすことが明らかにされた。ＡｐｏＥアイソフォームは、脳血管の完全性に対して差動的に影響を及ぼし、血液脳関門を通過するＡβペプチドの流出に影響を及ぼし、従って血管周辺のアミロイド凝集体の蓄積（脳アミロイド血管症又はＣＡＡ）を調節することが示唆されている。更に、ＡｐｏＥはまた、神経変性及び神経可塑性に直接関与している。これらの状況において、ＡｐｏＥ２の効果はそれほど調べられていない。
[0165]ヒトＡＰＯＥ２、−Ｅ３、及び−Ｅ４を発現する遺伝子工学的に作出された動物は、アミロイド負荷についてヒトと類似したランク順を有し、これは、異なるＡｐｏＥアイソフォームがプラークの開始及び／又は成長に影響を及ぼすという仮説と一致している。しかし、既存のアミロイド沈着物及び現存する神経変性に対するＡｐｏＥ媒介性の効果の機構を精査するために、更なる試験が必要とされる。この知識のギャップを克服するために、様々なＡＰＯＥ対立遺伝子（又はＧＦＰコントロール）を発現するアデノ随伴ウイルスベクターを側脳室に注射して、主に上衣に形質導入し、次いでこれが、ＡｐｏＥを脳脊髄液及び間質液内に送達する生体工場として作用するという、遺伝子移入アプローチを使用した。次いで、生体内多光子顕微鏡法を使用して、様々なＡｐｏＥアイソフォームがプラークの形成、成長、及びＡｐｏＥ２の場合には溶解に与える効果を追跡し、並びにｉｎ ｖｉｖｏでの微小透析アプローチを使用して、ＩＳＦにおけるＡｐｏＥ及びＡβの生化学的変動をモニタリングし、またアレイトモグラフィーを使用してＡβ関連神経毒性の変化を評価した。
[0166]ＡｐｏＥアイソフォームは、ＩＳＦにおける可溶性オリゴマーＡβのレベル、Ａβ線維化及び沈着のペース、一旦形成された後のアミロイド沈着物の安定性、それらの排出、並びにプラーク周辺の神経毒性効果の程度に影響を及ぼす。実際、ＡｐｏＥ４で処置したＡＤマウスは、可溶性Ａβの量の増加、より高密度の線維性プラーク、シナプスエレメント消失の増悪、及び各沈着物周辺の神経突起ジストロフィーの数の増加を示すのに対して、ＡｐｏＥ２では相対的防御効果が観察された。これらのデータは、ＡＰＯＥ対立遺伝子が、主にＡβを通じてＡＤに対するその効果を媒介するという仮説を裏付けており、治療標的としてのＡｐｏＥが注目される。
結果
ＡＡＶ４−ＡＰＯＥを脳室内注射すると、脳においてＡＰＯＥ発現が安定化し、ヒトＡｐｏＥが持続的に産生される
[0167]アポリポタンパク質Ｅは自然に分泌されるタンパク質であり、アストロサイト及びミクログリア細胞によって主に産生され、脳実質全体にわたり拡散することができる。本発明者らは、ＧＦＰ（コントロール）又は各ＡＰＯＥ対立遺伝子をコードするＡＡＶ血清４型を、７月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスの側脳室に注射することによって、この特性の利点を利用した。大脳領域がＡＤの特徴的病変によって冒されていることを考慮すると、この戦略は複数回の実質内注射と比較して大きな利点をもたらした。
[0168]注射から２カ月後、脈絡叢及び脳室の内側を覆う上衣において形質導入細胞が検出され、従ってＡＡＶ４ベクターの機能性が確認された。それぞれの種に対して特異的な抗体を使用して、ＥＬＩＳＡ（国際公開第２０１５／０７７４７３号に示す図９Ａ、９Ｂ及び１５Ａ）及びウェスタンブロットによって、ヒト及びマウスＡｐｏＥタンパク質の両方についても検出した。ヒトアポリポタンパク質Ｅの濃度が、平均で総タンパク質１ｍｇ当たり２０μｇに達したことを観察したが（国際公開第２０１５／０７７４７３号に示す図９Ａ）、これは、内因性マウスａｐｏＥの約１０％を占める（国際公開第２０１５／０７７４７３号に示す図９Ｂ）。この小幅な追加量のヒトＡｐｏＥが存在しても、内因性マウスａｐｏＥタンパク質のレベルを検出可能に変化させなかった（国際公開第２０１５／０７７４７３号に示す図１５Ａ）。少ないが統計的に有意な減少が、ＡＡＶ４注射から２〜５カ月後に観察された（国際公開第２０１５／０７７４７３号に示す図１５Ｂ）。それにもかかわらず、ヒトタンパク質のレベルは、コントロール群と比較して検出可能なままであったが、これは、ＡＡＶ４が媒介する形質導入により、実質全体にわたり分泌型の組換えタンパク質の持続的産生プラットフォームが提供されたことを示唆している。実際、内因性マウスａｐｏＥタンパク質が蓄積することが公知の皮質マントル全体にわたり、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスのアミロイド沈着物周辺において、ヒトＡｐｏＥタンパク質が検出可能であった。
[0169]次に、きわめて生物学的に活性なＡβ可溶性種も含有する細胞外コンパートメントである間質液（ＩＳＦ）におけるヒトＡｐｏＥの存在を評価した。全脳ライセートにおいて検出されたＡｐｏＥの量は比較的少量であるので、各ＡＡＶ４−ＡＰＯＥベクターをいくつかのａｐｏＥ ＫＯマウスに注射し、高感度であるが非種特異的な抗体を使用してヒトタンパク質の存在を追跡した。微小透析技術を使用して、ａｐｏＥ ＫＯ注射動物のＩＳＦにおけるＡｐｏＥの存在を確認した。
[0170]全体として、これらのデータから、ＡＡＶ４の単回脳室内注射が、脳実質全体にわたり、及びＩＳＦ内において、目的とするタンパク質の持続的な産生を引き起こすのに十分であったこと、並びに上衣／脈絡叢が、治療に役立ち得るタンパク質を脳に送達するための「生物学的ポンプ」として使用することができることが確認される。
ＡｐｏＥアイソフォームの輸注は、アミロイドペプチド及びプラーク沈着に差動的に影響を及ぼす
[0171]ＧＦＰ又は様々なＡｐｏＥアイソフォームを発現するベクターをＡＰＰ／ＰＳ１マウスに形質導入し、その５カ月後に安楽死させた。アミロイドプラーク負荷の分析により、５カ月後において、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４を注射した動物の皮質において、ＡＰＯＥ２を発現する動物と比較して、アミロイド沈着密度の有意な増加が観察されたことが判明した。ＡＡＶ４−ＧＦＰ及びＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３処置マウスにおけるプラーク密度は中間レベルで互いに相違しなかった（国際公開第２０１５／０７７４７３号に示す図１６Ａ）。
[0172]ギ酸抽出物から測定したＡβ４０及びＡβ４２ペプチドの濃度は、アミロイドプラーク含有量について観察された変化に類似しており、そのようなことから、５カ月後には、ＡＰＯＥ４対立遺伝子を発現するマウスにおいてアミロイドペプチドの濃度増加が判明したが（国際公開第２０１５／０７７４７３号に示す図１６Ｂ）、ＡＰＯＥ２では逆の効果が検出された。ＴＢＳ可溶性画分内のＡβ４０及びＡβ４２ペプチドの含有量は、各ＡＡＶ−ＡＰＯＥの注射によって同様に影響を受けた（国際公開第２０１５／０７７４７３号に示す図１６Ｃ）。更に、凝集Ａβペプチドと可溶性Ａβペプチドの間の比は、ＡｐｏＥに曝露しても変化しないままであり、従って、それぞれ異なるヒトＡｐｏＥアイソフォームの過剰発現が、線維性及び可溶性のアミロイド種の両方を同時に調節することを示唆している。
[0173]各ＡｐｏＥアイソフォームを２カ月間だけ過剰発現させると、引き起こされる効果は５カ月試験で観察された効果よりも小さい。それにもかかわらず、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４注射マウスの皮質領域内では、その他の実験群と比較して、アミロイドプラーク密度の有意な増加が観察された（国際公開第２０１５／０７７４７３号に示す図１６Ａ）。これは、ギ酸画分に含まれるＡＰの量に匹敵し（国際公開第２０１５／０７７４７３号に示す図１６Ｃ）、この特定のバリアントの優れた効果を実証する。ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２又はＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４のそれぞれを２カ月間発現させた場合、ＴＢＳ可溶性Ａβ４０／４２種のみがより低くなるか又はより高くなる傾向を示した（データは示さず）。
[0174]ヒトＡｐｏＥアイソフォームの存在が、Ａβの線維化の程度においてその初期変化を反映し得るか確認するために、注射から２カ月後に、Ｂａｍ１０（すべてのアミロイド沈着物を標識する）及びＴｈｉｏ−Ｓ（高密度コアのみを染色する）を使用して、ＡＰの強力な免疫染色間の比についても測定した。３つのアイソフォーム間で変化は検出されず、これは、このタイムフレームでは、実験群全体を通じて高密度で拡散性のアミロイド沈着物集団の分布に対する差動的効果が存在しなかったことを示唆している（国際公開第２０１５／０７７４７３号に示す図１６Ｂ）。これらのデータは、ＡｐｏＥバリアントに対して、より長期間曝露すると、より短期の曝露よりもアミロイド沈着に対して強い効果を有することを示している。
[0175]ＡｐｏＥは、血液脳関門を横断するＡβ輸送において役割を果たしていることが示唆されている。ＡｐｏＥアイソフォームに曝露すれば、血液脳関門を通過するＡＰペプチドの流出が調節可能か試験するために、各注射動物の血漿中のＡβ４０濃度を測定した。ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ３及びＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４を脳室内注射した両マウスにおけるヒトＡβの血漿含有量が、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２及びＡＡＶ４−ＧＦＰの場合と比較してそれより少なかったことが観察された（国際公開第２０１５／０７７４７３号に示す図１０Ｄ）。これは、Ｅ３及びＥ４バリアントの両方がＡＰを中枢神経系コンパートメント内に保持するのに役立つことを示唆しており、脳実質においてＡｐ濃度の相対的な増加が観察されたこと、及びＡｐｏＥに起因してＡＰの半減期が強化されることを示唆するこれまでのデータと一致している。
[0176]ＡＰＯＥ４保因者は神経血管機能障害により罹患しやすく、また血液脳関門の破壊が、アミロイド沈着が存在しない場合であっても、ＡＰＯＥ４トランスジェニックマウスにおいてよく見られることが最近明らかにされた。ＡＰＰ／ＰＳを対象にＡＡＶ４−ＡＰＯＥを脳室内注射すると、ＢＢＢの完全性を損ない得るかを評価するために、プルシアンブルーによる死後染色を実施した。すべての群において、いくつかのヘモジデリン陽性局所領域が脳全体にまばらに広がって存在していたにもかかわらず、動物実験群のいずれの間においても明らかな差異は観察されなかった。
ＡｐｏＥアイソフォームの発現は、アミロイドーシス進行の動力学を調節する
[0177]５カ月後、ＡｐｏＥ４はアミロイド沈着物の密度増加に関連したのに対して、ＡｐｏＥ２では逆の効果が観察された。これは、アミロイドβの沈着、排出、又はその両方の速度の変化を反映している可能性がある。ＡｐｏＥバリアントがアミロイドーシスの動的進行にどのように影響を与えるか評価するために、ｉｎ ｖｉｖｏでの二光子画像法を使用し、アミロイドプラークの形成及び排出の動力学を追跡した。７月齢の時点でマウスにＡＡＶ４ベクターを脳室内注射し、１回目のイメージングセッションを実施するために、注射から１週間後に頭蓋窓を移植した（Ｔ０）。１カ月（Ｔ１）及び２カ月（Ｔ２）後、アミロイド沈着物を同一視野内で画像化した。２回目のイメージングセッションの後、死後分析のためにマウスを安楽死させた。
[0178]アミロイド沈着物の大部分は安定のままであったが、２カ月の期間にわたり偶発的な新規プラークを小さな視体積内で検出することができた。また更に、ごく稀ではあるが、実験開始時に画像化されたメトキシ陽性プラークを１又は２カ月後に検出することができなかったが、これは、一部のプラークが排出された可能性を示唆している。経時的に、アミロイド沈着物の体積密度が全体的に増加し、Ｔ２における密度はＴ１の密度よりも平均２３％高いことが観察された。２カ月後、ＡｐｏＥ４で処置したＡＰＰ／ＰＳ１マウスでは、アミロイド進行速度がより速かった一方、ＡｐｏＥ２に曝露した動物では、アミロイド沈着物の密度がＧＦＰ（０．６６）、ＡｐｏＥ３（０．６７）、及びＡｐｏＥ４（０．７４）と比べて有意に減少した（国際公開第２０１５／０７７４７３号に示す図１１Ａ、１１Ｂ）。重要なこととして、ＡｐｏＥ２の変化はベースラインからの減少を反映しおり、免疫が介在しないプラークの能動的排出を直接に、しかも初めて示すものである。ＡＰＯＥトランスジェニック動物から得られたデータとは対照的に、これらの結果は、アミロイド沈着が既に始まった後であっても、ＡｐｏＥ量のわずかな増加を誘発すれば、進行中のアミロイド形成プロセスに影響を与えることができることを実証している。
[0179]次に、個々の沈着物の断面積についてＴ１／Ｔ０とＴ２／Ｔ１との比を測定することにより、単一のアミロイドプラークの成長を評価した。Ｔ１（Ｔ１／Ｔ０の比）において群間の差異が検出されたが、Ｔ２（Ｔ２／Ｔ１の比、国際公開第２０１５／０７７４７３号に示す図１２）においては検出されず、これは、ヒトＡｐｏＥバリアントが存在すると、曝露後の最初の１カ月間のプラーク成長に主に影響を与えるが、その後はこのパラメーターに差異がないことを示唆している。特に、ＡｐｏＥ４処置マウスでは、アミロイド沈着物のサイズは、ＡｐｏＥ２及びＡｐｏＥ３の両方の場合と比較してそれよりも有意に大きく成長したが、これは、プラークの数だけでなく、それらのサイズもこの対立遺伝子によって増悪したことを示唆している。従って、ＡｐｏＥ４は、ＡＰペプチドのシーディング、並びに既存のプラークのサイズの両方に影響を及ぼす。
アミロイド沈着物周辺のシナプス密度は、ＡｐｏＥ２と比較してＡｐｏＥ３及びＡｐｏＥ４アイソフォームによって増悪する
[0180]シナプス消失は認知機能障害と最も良好に相関するパラメーターである。本発明者らは、ＡｐｏＥ４が存在すると、ヒトＡＤ患者の脳内シナプスオリゴマーＡβのレベルがより高くなることと関連すること、及びＡｐｏＥ３と比較して、アミロイドプラーク周辺のシナプス密度の有意な減少を引き起こすことを最近明らかにした（R. M. Koffieら、Apolipoprotein E4 effects inAlzheimer’s disease are mediated by synaptotoxicoligomeric amyloid-beta. Brain 135, 2155 (Jul, 2012); T. Hashimotoら、Apolipoprotein E, Especially Apolipoprotein E4, Increases theOligomerization of Amyloid beta peptides. J Neurosci 32, 15181 (Oct 24, 2012)）。更に、最近のｉｎ ｖｉｔｒｏでの証拠より、ＡｐｏＥ４は、Ａβ誘発性のシナプス消失に対してそれを防御することができなかったことが実証された（M. Buttiniら、Modulation of Alzheimer-likesynaptic and cholinergic deficits in transgenic mice by human apolipoprotein Edepends on isoform, aging, and overexpression of amyloid beta peptides but noton plaque formation. J Neurosci 22, 10539 (Dec 15, 2002); A. Sen, D. L. Alkon,T. J. Nelson, Apolipoprotein E3 (ApoE3) but not ApoE4 protects against synapticloss through increased expression of protein kinase C epsilon. J Biol Chem 287,15947 (may 4, 2012)）。従って、各ＡｐｏＥアイソフォームの連続的で広範囲の分布は、ＡＰＰ／ＰＳマウスの脳内Ａβの沈着及び排出の動力学だけではなく、アミロイド沈着物周辺のシナプスの完全性にも差動的に影響を与え得るという仮説を立てた。
[0181]超薄組織切片の免疫蛍光染色に基づく高分解能技術であるアレイトモグラフィーを使用して、プレ及びポストシナプスエレメント（それぞれシナプシン−１及びＰＳＤ９５）の密度を決定した（K. D. Micheva, S. J. Smith, Array tomography: a new tool for imagingthe molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron 55, 25(Jul 5, 2007); R. M. Koffieら、Oligomeric amyloid betaassociates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapseloss near senile plaques. Proc Natl Acad Sci USA, 106, 4012 (Mar 10, 2009)）。アミロイドオリゴマー種は、アミロイド沈着物の近傍において高度に濃縮されていることが明らかにされたので、これまでに確立されたプロトコールを使用して、プラークの遠方（５０μｍ超）又は近傍（５０μｍ未満）において、シナプシン−１及びＰＳＤ９５の斑点を定量した（R. M. Koffieら、Oligomeric amyloid betaassociates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapseloss near senile plaques. Proc Nall Acad Sci USA 106, 4012 (Mar 10, 2009)）。ＡＰＯＥ３又はＡＰＯＥ４を発現させたとき、プラーク付近においてプレシナプスエレメント消失の増悪を観察したが、これは、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２又はＡＡＶ４−ＧＦＰの注射後にはあてはまらなかった（国際公開第２０１５／０７７４７３号に示す図１３Ａ）。対照的に、ＧＦＰ、ＡｐｏＥ２、及びＡｐｏＥ３を注射したマウス間ではポストシナプス斑の密度は不変のままであった一方、ＡｐｏＥ４処置動物は、アミロイド沈着物周辺において有意なＰＳＤ９５の消失を示し、従って、Ａβの神経毒性効果に対するＡｐｏＥ４の有害効果を増強した（国際公開第２０１５／０７７４７３号に示す図１３Ｃ）。シナプスエレメントの密度をアミロイド沈着物から遠方に位置するエリア（５０μｍ超）において評価したところ、群間で差異を検出することができず、これは、ヒトＡｐｏＥバリアントそれ自体にシナプス密度に対する効果は認められないが、ＡｐｏＥアイソフォームはＡβ誘発性の神経毒性に対して重要な効果を有することを示唆している。従って、ＡｐｏＥ３及びＡｐｏＥ４で観察された相対的なシナプス消失は、各プラーク周辺（その端部から５０μｍ未満の距離）のＡβペプチドの存在に直接関係している。
[0182]追加の神経病理学的パラメーターとして、ＡＡＶ４を注射したＡＰＰ／ＰＳ１マウス内のアミロイド沈着物と関連する神経炎性ジストロフィーの数についても評価した。沈着物周辺のスパイン密度の減少に加えて、老人斑は、神経突起の湾曲が増加したニューロピル、及び膨張性ジストロフィーの出現というより一般的な変化を引き起こす。これらの病理学的変化は、プラーク表面から５０μｍ以内の領域に富化した可溶性オリゴマーＡβ種に起因する可能性が高い。ＡｐｏＥ４が過剰に発現すると、ＧＦＰ、ＡｐｏＥ２、及びＡｐｏＥ３と比較して、アミロイド沈着物に関連するＳＭＩ３１２陽性神経炎性ジストロフィーの形成が増悪することが観察された（国際公開第２０１５／０７７４７３号に示す図１３Ｃ）。この結果より、ＡｐｏＥ４アイソフォームが最も強力な効果を有し、プラーク形成を調節するだけでなく、アミロイド関連の神経毒性にも影響を及ぼすという観察結果が確認される。
ヒトＡｐｏＥタンパク質は、ＡＤの別のマウスモデルの間質液に含まれるオリゴマーＡβ種の量を変化させる
[0183]次に、ＩＳＦ内に異なるＡｐｏＥアイソフォームが存在すると、それと同一の細胞外コンパートメントに含まれる可溶性アミロイド種の量を変化させ得るかという問題に取り組んだ。異なるトランスジェニックマウス系統において、本発明者らのこれまでの知見を検証するために、別のＡＤモデルであるＴｇ２５７６マウスに注射することを選択する。Ｔｇ２５７６マウスは、スウェーデン突然変異を含有する突然変異形態のＡＰＰを過剰発現し、所定の年齢において、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスよりもはるかに軽度の表現型を示す。１６〜１８月齢の動物コホートに注射したところ、アミロイド沈着物がＡＡＶ４−ＡＰＯＥ形質導入時に既に存在していた。遺伝子移入から３カ月後、微小透析プローブを海馬に挿入し、サンプルを採取して、ＩＳＦ内の各ＡＰＯＥバリアントに関連する初期の変化について特徴づけを行った。
[0184]ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ４を注射した後、特異的８２Ｅ１／８２Ｅ１ＥＬＩＳＡアッセイ法を使用して測定したＡβオリゴマー種の濃度が、ＡＡＶ４−ＡＰＯＥ２の場合と比較して有意に高かった（４２±７％）ことが観察されたが（国際公開第２０１５／０７７４７３号に示す図１４）、これは、ＡｐｏＥの存在が、この細胞外コンパートメントにおけるアミロイド凝集物の性質を調節し得ることを示唆している。更に、ＩＳＦにおいてＡβ４０とＡβ４２の全体について評価したところ、同じ傾向が観察されたが有意には至らず（国際公開第２０１５／０７７４７３号に示す図１７Ａ）、これは、ＩＳＦ内に異なるＡｐｏＥアイソフォームが存在する方が、全体的な量よりも、アミロイドペプチドの凝集状態に対して若干大きな影響を及ぼすことを示唆している。
[0185]予想通り、様々なＡｐｏＥアイソフォームに曝露したＴｇ２５７６マウスから得た脳の死後生化学的分析により、ＡｐｏＥ４処置動物では、ギ酸画分内のＡβ４２濃度が有意に増加したことが明らかとなり（国際公開第２０１５／０７７４７３号に示す図１７Ｂ）、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける本発明者らの観察結果が第２のトランスジェニックモデルにおいても確認された。
[0186]総合すると、これらの生化学的指標は、Ｔｇ２５７６マウスにおいてＡｐｏＥが発現すると、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスで観察された変化と類似した変化が、アミロイド生物学において誘発されることを示唆している。重要なことに、このような神経毒性種がシナプス末端と直接相互作用し得る場合、初期変化が、ＩＳＦ内のｏＡβ含有量において観察されている。
実施例４：実施例１〜３から導かれる結論
[0187]実施例１〜３内の上記試験は国際公開第２０１５／０７７４７３号に記載されており、防御性ＡｐｏＥアイソフォームをコードする導入遺伝子を含むＡＡＶベクターをアルツハイマー病動物モデルのＣＮＳ中に投与したときのその治療有効性を示している。従って、上記試験は、ＡＡＶベクターによりＣＮＳに送達された防御性ＡｐｏＥアイソフォームはアルツハイマー病の治療法となる、という提案を裏付ける。
実施例５：ＡｐｏＥを検出するための代表的なアッセイ法
ＡＰＯＥ ＥＬＩＳＡ
[0188]特異的ＥＬＩＳＡアッセイ法を、ヒトＡＰＯＥタンパク質及び内因性マウスＡＰＯＥタンパク質の両方を検出するのに使用した。要するに、ＥＬＩＳＡプレートを、１．５μｇ／ｍｌのヤギ抗ＡＰＯＥ抗体（マウスＡＰＯＥを検出するため）、又は１．５μｇ／ｍｌのＷＵＥ４抗体（ヒトＡＰＯＥを検出するため）を用いて一晩コーティングし、ＰＢＳ中で希釈した１％脱脂乳を用いて３７℃で１．５時間ブロックした。ヒト組換えａｐｏＥタンパク質（ヒト特異的アッセイ用、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ社）、又は脳抽出物から内作したマウス標準（マウス特異的アッセイ用）を標準として使用し、サンプルをＥＬＩＳＡバッファー（ＰＢＳに溶解した０．５％ＢＳＡ及び０．０２５％ツイーン２０）中で希釈し、一晩インキュベートした。洗浄後、ヒトに対して特異的（ヤギ−ａｐｏｅ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；１：１０，０００）、又はマウスに対して特異的（Ａｂｃａｍ ａｂ２０８７４；１：２，０００）検出抗体をそれぞれ使用し、その後該当するＨＲＰ結合二次抗体と共に１．５時間インキュベーションした。ＴＭＢ基質を使用してシグナルの顕色を実施した後、Ｈ３ＰＯ４を使用して溶液を停止した。比色分析結果を４５０ｎｍで測定した。
Ａβの定量化
[0189]Ａβ４０及びＡβ４２の濃度を、製造業者の指示に基づき、ＢＮＴ−７７／ＢＡ−２７（Ａβ４０用）及びＢＮＴ−７７／ＢＣ−０５（Ａβ４２用）サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｗａｋｏ社）により測定した。捕捉及び検出の両方について同一のＮ末端（残基１〜１６）抗体を用いた８２Ｅ１／８２Ｅ１サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を使用して、Ａβオリゴマーを定量した（W. Xiaら、A specific enzyme-linkedimmunosorbent assay for measuring beta-amyloid protein oligomers in humanplasma and brain tissue of patients with Alzheimer disease. Arch Neurol 66, 190(Feb, 2009)）。
実施例６：代表的なＡＡＶカプシド配列
ＡＡＶ−ＬＫ０３ ＶＰ１カプシド（配列番号１）：
Figure 2019529385
ＡＡＶ４−１ ＶＰ１カプシドのアミノ酸配列（配列番号２）：
Figure 2019529385
ＡＡＶ４−１ ＶＰ２カプシドのアミノ酸配列（配列番号３）：
Figure 2019529385
ＡＡＶ４−１ ＶＰ３カプシドのアミノ酸配列（配列番号４）：
Figure 2019529385
〔関連出願〕
[0001]本出願は、２０１６年９月２日出願の米国仮特許出願第６２／３８３，２７４号の優先権を主張する。掲載されているすべてのテキスト、表、及び配列を含む上記出願の全内容は、参照として本明細書に組み込まれている。

Claims (46)

  1. 治療用タンパク質を哺乳動物の中枢神経系に送達する方法であって、
    ＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子と、一対のＡＡＶ末端逆位反復配列の間に挿入された、前記治療用タンパク質をコードする核酸を含むベクターとを、前記哺乳動物の非中枢神経系（ＣＮＳ）細胞、器官、又は組織に投与するステップを含み、
    前記ステップは、前記非ＣＮＳ細胞、器官、又は組織が、前記哺乳動物の中枢神経系に治療用タンパク質が送達されている前記哺乳動物の循環中に前記治療用タンパク質を発現及び分泌するように、前記哺乳動物内の前記非ＣＮＳ細胞、器官、又は組織を感染させるのに有効な方式でなされる、方法。
  2. 哺乳動物における中枢神経系（ＣＮＳ）疾患を治療する方法であって、
    ＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子と、一対のＡＡＶ末端逆位反復配列の間に挿入された、治療用タンパク質をコードする核酸を含むベクターとを、前記哺乳動物の非中枢神経系（ＣＮＳ）細胞、器官、又は組織に投与するステップを含み、
    前記ステップは、前記非ＣＮＳ細胞、器官、又は組織が、前記哺乳動物の中枢神経系に治療用タンパク質が送達されている前記哺乳動物の循環中に前記治療用タンパク質を発現及び分泌するように、前記哺乳動物内の前記非ＣＮＳ細胞、器官、又は組織を感染させるのに有効な方式でなされる、方法。
  3. 哺乳動物における中枢神経系（ＣＮＳ）疾患を治療する方法であって、ＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子と、一対のＡＡＶ末端逆位反復配列の間に防御性ＡｐｏＥアイソフォームをコードする核酸を含むベクターとを、前記哺乳動物の非中枢神経系（ＣＮＳ）細胞、器官、又は組織に投与するステップを含み、前記ステップは、肝臓の細胞が、前記哺乳動物の中枢神経系に防御性ＡｐｏＥアイソフォームが送達されている前記哺乳動物の循環中に前記防御性ＡｐｏＥアイソフォームを発現及び分泌するように、前記哺乳動物内の前記肝臓の細胞を感染させるのに有効な方式でなされる、方法。
  4. 哺乳動物における眼球の疾患を治療する方法であって、ＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子と、一対のＡＡＶ末端逆位反復配列の間に挿入された、前記治療用タンパク質をコードする核酸を含むベクターとを、前記哺乳動物の非眼球細胞、器官、又は組織に投与するステップを含み、前記ステップは、前記非眼球細胞、器官、又は組織が、前記哺乳動物の眼球の器官又は組織に治療用タンパク質が送達されている前記哺乳動物の循環中に前記治療用タンパク質を発現及び分泌するように、前記哺乳動物内の前記非眼球細胞、器官、又は組織を感染させるのに有効な方式でなされる、方法。
  5. 前記哺乳動物が、アルツハイマー病、リソソーム蓄積症、ニューロンセロイドリポフスチン沈着症（ＮＣＬ）、例えば幼児ＮＣＬ、遅発性幼児ＮＣＬ、若年性ＮＣＬ（バッテン病）、成人ＮＣＬ、又はムコ多糖症（例えば、ＭＰＳ ＩＶ又はＭＰＳ ＶＩＩ）等のうちの１つ若しくは複数の症状を有する、呈する、又はそれらを有するリスクに晒されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記治療用タンパク質又は防御性ＡｐｏＥアイソフォームが、前記哺乳動物に有益な効果又は治療効果をもたらす量で発現される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記治療用タンパク質又は防御性ＡｐｏＥアイソフォームが、ＣＮＳ疾患の物理的、生理学的、ＣＮＳ／脳の病態生理学、生化学的、組織学的、又は行動学的特徴に対して、前記哺乳動物に有益な効果又は治療効果をもたらす量で発現される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記治療用タンパク質が、防御性ＡｐｏＥアイソフォームである、請求項１、２及び４のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記防御性ＡｐｏＥアイソフォームが、ヒトＡｐｏＥε２と少なくとも７０％同一である、請求項３又は８に記載の方法。
  10. 循環性ＡｐｏＥ４のレベルが、総循環性ＡｐｏＥレベルと比較して低減される、請求項３又は８に記載の方法。
  11. 前記治療用タンパク質が、ＴＰＰ１である、請求項１、２及び４のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記ＴＰＰ１が、ヒトＴＰＰ１と少なくとも７０％同一である、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記治療用タンパク質が、ＣＬＮ３、ＰＰＴ１、ＣＬＮ６、又はＣＬＮ８である、請求項１、２及び４のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記ＣＬＮ３、ＰＰＴ１、ＣＬＮ６、又はＣＬＮ８が、ヒトＣＬＮ３、ＰＰＴ１、ＣＬＮ６、又はＣＬＮ８と少なくとも７０％同一である、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記治療用タンパク質が、ガラクトサミン−６−スルファターゼである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記ガラクトサミン−６−スルファターゼが、ヒトガラクトサミン−６−スルファターゼと少なくとも７０％同一である、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記治療用タンパク質が、β−グルクロニダーゼである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記β−グルクロニダーゼが、ヒトβ−グルクロニダーゼと少なくとも７０％同一である、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記治療用タンパク質をコードする核酸が、前記治療用タンパク質をコードするシトシン−グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）が低減されていない核酸と比較して、ＣｐＧが低減されている、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記治療用タンパク質をコードする核酸が、前記治療用タンパク質をコードする野生型核酸と比較して、シトシン−グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）が低減されている、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記ベクターが、イントロン、発現制御エレメント、フィラーポリヌクレオチド配列、及び／又はポリＡシグナルのうちの１つ若しくは複数、又はその組合せを更に含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 一対のＩＴＲが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＬＫ０１、ＬＫ０２、ＬＫ０３、ＡＡＶ４−１、ＡＡＶ−２ｉ８のＩＴＲのうちのいずれかの配列又はその混合物に由来する又はそれを含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＬＫ０１、ＬＫ０２、ＬＫ０３、ＡＡＶ４−１、ＡＡＶ−２ｉ８のＩＴＲのうちのいずれかの配列又はその混合物に由来する又はそれを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記非ＣＮＳ細胞、器官、若しくは組織、又は非眼球細胞、器官、若しくは組織が、哺乳動物の内分泌細胞、器官、又は組織を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  25. 前記非ＣＮＳ細胞、器官、若しくは組織、又は非眼球細胞、器官、若しくは組織が、肝臓の細胞、肝臓又は肝臓の組織、及び膵臓の細胞、膵臓又は膵臓の組織を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  26. 前記非ＣＮＳ細胞、器官、若しくは組織、又は非眼球細胞、器官、若しくは組織が、肝臓の肝細胞又は膵島を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  27. 前記肝臓の細胞が、肝臓の肝細胞を含む、請求項３に記載の方法。
  28. 前記ｒＡＡＶ粒子が、前記哺乳動物１キログラム当たり、ベクターゲノム約１×１０８〜１×１０１０個、１×１０１０〜１×１０１１個、１×１０１１〜１×１０１２個、１×１０１２〜１×１０１３個、又は１×１０１３〜１×１０１４個（ｖｇ／ｋｇ）の範囲の用量で投与される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記ｒＡＡＶ粒子が、前記哺乳動物１キログラム当たり、ベクターゲノム１×１０１２個（ｖｇ／ｋｇ）未満の用量で投与される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記ｒＡＡＶ粒子が、前記哺乳動物１キログラム当たり、ベクターゲノム約５×１０１１個（ｖｇ／ｋｇ）の用量で投与される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
  31. 所望の治療効果を実現するために、投与される前記ｒＡＡＶ粒子が、前記哺乳動物の体重１キログラム当たり、少なくともベクターゲノム（ｖｇ）１×１０１０個（ｖｇ／ｋｇ）であるか、又は前記哺乳動物の体重１ｋｇ当たり、ｖｇ約１×１０１０〜１×１０１１個の間であるか、又は前記哺乳動物の体重１ｋｇ当たり、ｖｇ約１×１０１１〜１×１０１２個の間（例えば、約１×１０１１〜２×１０１１ｖｇ／ｋｇ、又は約２×１０１１〜３×１０１１ｖｇ／ｋｇ、又は約３×１０１１〜４×１０１１ｖｇ／ｋｇ、又は約４×１０１１〜５×１０１１ｖｇ／ｋｇ、又は約５×１０１１〜６×１０１１ｖｇ／ｋｇ、又は約６×１０１１〜７×１０１１ｖｇ／ｋｇ、又は約７×１０１１〜８×１０１１ｖｇ／ｋｇ、又は約８×１０１１〜９×１０１１ｖｇ／ｋｇ、又は約９×１０１１〜１×１０１２ｖｇ／ｋｇ）であるか、又は前記哺乳動物の体重１ｋｇ当たり、ｖｇ約１×１０１２〜１×１０１３個の間である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記哺乳動物が、前記治療用タンパク質及び／又は前記ｒＡＡＶ粒子に対する実質的な免疫応答を起こさない、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記哺乳動物が、前記治療用タンパク質及び／又は前記ｒＡＡＶ粒子に対する実質的な体液性免疫応答を起こさない、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記哺乳動物が、少なくとも連続して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日、週、又は月にわたり、前記治療用タンパク質及び／又は前記ｒＡＡＶ粒子に対する実質的な免疫応答を起こさない、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記哺乳動物が、前記治療用タンパク質及び／又は前記ｒＡＡＶ粒子に対する検出可能な免疫応答を起こさない、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記哺乳動物が、前記治療用タンパク質及び／又は前記ｒＡＡＶ粒子に対する検出可能な体液性免疫応答を起こさない、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記哺乳動物が、少なくとも連続して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日、週、又は月にわたり、前記治療用タンパク質及び／又は前記ｒＡＡＶ粒子に対する検出可能な体液性免疫応答を起こさない、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記哺乳動物が、前記哺乳動物において前記治療用タンパク質の治療効果を遮断するのに十分な、前記治療用タンパク質及び／又は前記ｒＡＡＶ粒子に対する免疫応答を起こさない、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記哺乳動物が、少なくとも連続して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日、週、又は月にわたり、前記哺乳動物において治療効果を遮断するのに十分な、前記治療用タンパク質及び／又は前記ｒＡＡＶ粒子に対する免疫応答を生成しない、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
  40. 空のＡＡＶカプシドの投与を更に含む、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記空のＡＡＶカプシドが、前記ｒＡＡＶ粒子と共に製剤化され、前記哺乳動物に投与される、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記空のＡＡＶカプシドが、ｒＡＡＶベクター粒子の量と等しい又はそれ未満の量で投与又は製剤化される、請求項４０又は４１に記載の方法。
  43. 前記空のＡＡＶカプシドが、空のＡＡＶカプシドｒＡＡＶ粒子の約１．０〜１００倍過剰に投与又は製剤化される、請求項４０又は４１記載の方法。
  44. 前記投与するステップが、対象の体循環中への輸注又は注射を含む、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記投与するステップが、対象の体循環中への静脈内又は動脈内の輸注又は注射を含む、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記投与するステップが、対象の肝門脈中への輸注又は注射を含む、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
JP2019512292A 2016-09-02 2017-09-01 Ｃｎｓ障害を治療するための方法及びベクター Pending JP2019529385A (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022002163A JP2022050574A (ja) 2016-09-02 2022-01-11 Ｃｎｓ障害を治療するための方法及びベクター

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662383274P 2016-09-02 2016-09-02
US62/383,274 2016-09-02
PCT/US2017/049959 WO2018045347A1 (en) 2016-09-02 2017-09-01 Methods and vectors for treating cns disorders

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022002163A Division JP2022050574A (ja) 2016-09-02 2022-01-11 Ｃｎｓ障害を治療するための方法及びベクター

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2019529385A true JP2019529385A (ja) 2019-10-17
JP2019529385A5 JP2019529385A5 (ja) 2020-09-17

Family

ID=61309371

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2019512292A Pending JP2019529385A (ja) 2016-09-02 2017-09-01 Ｃｎｓ障害を治療するための方法及びベクター
JP2022002163A Pending JP2022050574A (ja) 2016-09-02 2022-01-11 Ｃｎｓ障害を治療するための方法及びベクター

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022002163A Pending JP2022050574A (ja) 2016-09-02 2022-01-11 Ｃｎｓ障害を治療するための方法及びベクター

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20190192693A1 (ja)
EP (1) EP3506930A4 (ja)
JP (2) JP2019529385A (ja)
CN (1) CN110121356A (ja)
BR (1) BR112019004353A2 (ja)
CA (1) CA3035628A1 (ja)
MX (1) MX2019002518A (ja)
WO (1) WO2018045347A1 (ja)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201508026D0 (en) 2015-05-11 2015-06-24 Ucl Business Plc Capsid
IL313246A (en) * 2018-06-28 2024-08-01 Univ North Carolina Chapel Hill CLN5 optimized genes and expression cassettes and their use
WO2020068990A1 (en) 2018-09-26 2020-04-02 California Institute Of Technology Adeno-associated virus compositions for targeted gene therapy
BR112021009370A2 (pt) * 2018-11-14 2021-08-17 Regenxbio Inc. método de tratamento da doença de batten cln2, composição farmacêutica e kit
CA3121211A1 (en) * 2018-11-28 2020-06-04 Prevail Therapeutics, Inc. Gene therapies for neurodegenerative disease
WO2021061909A1 (en) * 2019-09-24 2021-04-01 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Method of targeting neuronal apoe to treat a neurocognitive disorder
WO2021076941A1 (en) * 2019-10-16 2021-04-22 Cornell University Gene therapy for alzheimer's disease
AU2021351720A1 (en) * 2020-10-01 2023-05-11 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods of detecting anti-aav antibodies
CN112852881B (zh) * 2021-02-09 2023-08-15 南京贝思奥生物科技有限公司 利用细胞穿膜肽增强腺相关病毒在中枢神经系统转导效率的方法
TW202426479A (zh) * 2022-10-10 2024-07-01 美商星火治療公司 Apoe基因療法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012057363A1 (ja) * 2010-10-27 2012-05-03 学校法人自治医科大学 神経系細胞への遺伝子導入のためのアデノ随伴ウイルスビリオン
WO2015077473A1 (en) * 2013-11-20 2015-05-28 University Of Iowa Research Foundation Methods and compositions for treating amyloid deposits

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7135339B2 (en) * 2003-11-20 2006-11-14 University Of Iowa Research Foundation Methods for producing and using in vivo pseudotyped retroviruses using envelope glycoproteins from lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV)
CN104540952A (zh) * 2012-05-18 2015-04-22 衣阿华大学研究基金会 用于治疗淀粉状蛋白沉积的方法和组合物
EP3024497B1 (en) * 2013-07-26 2021-01-13 University of Iowa Research Foundation Methods and compositions for treating brain diseases
EP3261440B1 (en) * 2015-02-20 2022-04-06 University of Iowa Research Foundation Methods and compositions for treating genetic eye diseases

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012057363A1 (ja) * 2010-10-27 2012-05-03 学校法人自治医科大学 神経系細胞への遺伝子導入のためのアデノ随伴ウイルスビリオン
WO2015077473A1 (en) * 2013-11-20 2015-05-28 University Of Iowa Research Foundation Methods and compositions for treating amyloid deposits

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANN. NEUROL. (2014) VOL.76, SUUPL.18, S176(PL1-6), JPN6019050804, ISSN: 0004918488 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2022050574A (ja) 2022-03-30
US20190192693A1 (en) 2019-06-27
WO2018045347A1 (en) 2018-03-08
EP3506930A4 (en) 2020-09-23
CA3035628A1 (en) 2018-03-08
EP3506930A1 (en) 2019-07-10
MX2019002518A (es) 2019-07-18
BR112019004353A2 (pt) 2019-05-28
CN110121356A (zh) 2019-08-13
AU2017318717A1 (en) 2019-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2019529385A (ja) Ｃｎｓ障害を治療するための方法及びベクター
JP7190352B2 (ja) 認知保護を提供しつつ疾患の発症及び進行を遅らせるための遺伝子治療を用いた神経変性疾患の治療方法
JP6422897B2 (ja) Ｃｎｓターゲティングａａｖベクターおよびその使用方法
US20210346519A1 (en) Hybrid regulatory elements
JP6469000B2 (ja) アミロイドの沈着を処置するための方法および組成物
EP1879623A2 (en) Gene therapy for spinal cord disorders
US11795476B2 (en) AAV/UPR-plus virus, UPR-plus fusion protein, genetic treatment method and its use in the treatment of neurodegenerative diseases, such as Parkinson's disease and Huntington's disease, among others
JP6592435B2 (ja) アミロイド沈着を処置するための方法および組成物
US20220185862A1 (en) Dna-binding domain transactivators and uses thereof
EP3574091B1 (en) Expression vector for cholesterol 24-hydrolase in therapy of polyglutamine repeat spinocerebellar ataxias
AU2017318717B2 (en) Methods and vectors for treating CNS disorders
JP2022518867A (ja) アルファヘルペスウイルスプロモーター配列を含む組換え核酸
US20230279405A1 (en) Dna-binding domain transactivators and uses thereof
JP2024123093A (ja) 筋萎縮性側索硬化症の治療におけるコレステロール２４―ヒドロラーゼの発現ベクター
CN112852881A (zh) 利用细胞穿膜肽增强腺相关病毒在中枢神经系统转导效率的方法
BR112016011258B1 (pt) Métodos e composiçôes para o tratamento de depósitos de amiloide

Legal Events

Date Code Title Description
RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20190913

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20200804

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20200804

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20210713

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20211004

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220111

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20220531

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220929

C60 Trial request (containing other claim documents, opposition documents)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60

Effective date: 20220929

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20220929

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20221020

C21 Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21

Effective date: 20221025

A912 Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912

Effective date: 20221118

C211 Notice of termination of reconsideration by examiners before appeal proceedings

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C211

Effective date: 20221122

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20240702