CN109641944A - 优化的小型抗肌萎缩蛋白基因和表达盒和它们的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及编码小型抗肌萎缩蛋白质的多核苷酸、包含所述多核苷酸的病毒载体，以及使用所述病毒载体将小型抗肌萎缩蛋白递送到细胞或受试者的方法。

Description

优化的小型抗肌萎缩蛋白基因和表达盒和它们的用途
关于联邦赞助的研究和开发的声明
本发明是在由国立卫生研究院(National Institutes of Health)拨款的基金号AR050595、AR056394和AR056953的政府支持下完成的。政府拥有本发明中的某些权利。
技术领域
本发明涉及编码小型抗肌萎缩蛋白质(mini-dystrophin protein)的多核苷酸、包含所述多核苷酸的病毒载体，以及使用所述病毒载体将小型抗肌萎缩蛋白递送到细胞或受试者的方法。
背景技术
杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是一种严重的、X染色体连锁的进行性神经肌肉疾病，每3,600到9200个新生男婴中就有约一个受其影响。该病症是因抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因中的移码突变破坏抗肌萎缩蛋白质的表达而导致的。由于缺乏抗肌萎缩蛋白质，骨骼肌以及最终心肌和呼吸肌(例如，肋间肌和膈肌)退化而导致过早死亡。进行性肌无力和肌萎缩始于童年，从小腿和骨盆开始，然后扩散到上臂。其他症状包括某些反射丧失、步态蹒跚、频繁跌倒、难以从坐位或卧位爬起、爬楼梯困难、整体姿势改变、呼吸受损和心肌病。许多孩子无法快速奔跑或跳跃。萎缩的肌肉，特别是腓肠肌群(以及不太常见的臀部、肩膀和手臂中的肌肉)，可能会因脂肪和结缔组织的积聚而肥大，使它们看起来比它们的实际情况更大和更健康(称为假性肥大)。骨质疏松和脊柱侧凸很常见。最终，大多数情况下在12到15岁之间失去独立行走能力，并且轮椅变得必要。随着疾病的进展，膈肌中有助于呼吸和咳嗽的肌肉变得更无力。受影响的个体会经历呼吸困难、呼吸道感染和吞咽问题。几乎所有DMD患者都将发展成心肌病。由心脏损害而加剧的肺炎是最常见的死亡原因，其经常发生在三十岁之前。
贝克型肌肉萎缩症(Becker muscular dystrophy,BMD)的症状不如DMD严重，但仍会导致过早死亡。与DMD相比，BMD的特征在于迟发性骨骼肌无力。虽然DMD患者在13岁之前依赖轮椅，但是BMD患者在16岁后失去行走并需要轮椅。与对应的DMD患者不同，BMD患者还表现出颈部屈肌肌力的保持。尽管骨骼肌受累较轻，但DMD相关的扩张型心肌病(DCM)引起的心衰是BMD中发病的常见原因，并且也是死亡的最常见原因，其平均发生在40多岁。
抗肌萎缩蛋白是由dmd基因编码的细胞质蛋白质，并且用于将细胞骨架肌动蛋白丝与膜蛋白连接。通常，主要位于骨骼肌和心肌中的抗肌萎缩蛋白质，在脑中表达量较少，其通过将收缩装置的肌动蛋白连接到围绕每根肌纤维的结缔组织层而在肌纤维收缩期间充当减震器。在肌肉中，抗肌萎缩蛋白定位于肌纤维膜的细胞质面处。
dmd基因在1987年被首次鉴别，是已知最大的人类基因，为约2.5Mb。该基因位于X染色体上的位置Xp21处，并且含有79个外显子。导致DMD或BMD的最常见突变是一个或多个外显子的大缺失突变(60-70％)，但是重复突变(5-10％)和单核苷酸变异(包括小缺失或插入、单碱基变化和剪接位点变化，占患有DMD的男性中的致病性变异的约25％-35％，并且占患有BMD的男性中的致病性变异的约10％-20％)也可引起致病性抗肌萎缩蛋白变异。
在DMD中，突变往往导致移码，从而导致过早终止密码子和截短的、非功能性的或不稳定的蛋白质。无义点突变也可导致具有相同结果的过早终止密码子。虽然引起DMD的突变可以影响任何外显子，但是外显子2-20和45-55是大缺失和重复突变的常见热点。框内缺失导致较不严重的贝克型肌肉萎缩症(BMD)，其中患者表达截短的、具有部分功能的抗肌萎缩蛋白。
全长抗肌萎缩蛋白是一种大(427kDa)蛋白质，该蛋白质包含许多有助于其功能的亚结构域。这些亚结构域从氨基末端朝向羧基末端依次包括N-末端肌动蛋白结合结构域、中央所谓的“棒”结构域、富含半胱氨酸的结构域，以及最后是羧基末端结构域或区域。棒结构域由4个富含脯氨酸的铰链结构域(缩写为H)和24个血影蛋白样重复序列(缩写为R)按以下顺序组成：第一铰链结构域(H1)、3个血影蛋白样重复序列(R1、R2、R3)、第二铰链结构域(H2)、16个另外的血影蛋白样重复序列(R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19)、第三铰链结构域(H3)、5个另外的血影蛋白样重复序列(R20、R21、R22、R23、R24)，以及最后是第四铰链结构域(H4)。朝向蛋白质羧基末端的亚结构域参与连接至与抗肌萎缩蛋白相关的糖蛋白复合物(dystrophin-associated glycoprotein complex,DGC)，一种形成细胞骨架与细胞外基质之间的关键连接的大蛋白质复合物。
尚无治疗明确地停止或逆转DMD的进展。使用皮质类固醇的治疗是目前的治疗标准，但该治疗只会使进展减慢一到两年。最近，监管机构批准了许多用于DMD的新药。这些包括引起过早终止密码子通读(read-through)的阿他卢仑(ataluren)和导致外显子51跳读的eteplirsen，从而产生内部缺失的、具有部分功能的抗肌萎缩蛋白。然而，这些药物的作用机制预计不会对所有DMD患者有帮助，并且需要进一步的证据来明确证明它们对DMD的临床疗效。
随着过去10-15年中使用腺相关病毒(AAV)介导的基因疗法潜在治疗各种罕见疾病的进展，重新希望和关注AAV可用于治疗DMD和不太严重的抗肌萎缩蛋白病(即，与dmd基因突变相关的其他肌肉疾病)。由于AAV载体的有效负载大小的限制，注意力已集中于产生抗肌萎缩蛋白的较小版本，即微型抗肌萎缩蛋白或小型抗肌萎缩蛋白，其消除了非必需亚结构域，同时保持全长蛋白质的至少一些功能。AAV介导的小型抗肌萎缩蛋白基因疗法已经在DMD动物模型mdx小鼠中显示出前景，在肌肉中广泛表达并且具有肌肉功能改善的证明(参见例如Wang等人，J.Orthop.Res.27:421(2009))。然而，当在GRMD DMD狗模型中尝试使用微型抗肌萎缩蛋白载体的相关实验时，需要强大的免疫抑制药物来实现肌肉细胞的显著转导(Yuasa等人，Gene Ther.14:1249(2007))。类似地，当用设计用于表达小型抗肌萎缩蛋白的AAV载体治疗人DMD患者时，在六名患者中的仅两名患者中检测到最小蛋白质，而在三名患者中刺激出了针对小型抗肌萎缩蛋白质的T细胞应答(Bowles等人，Mol Ther.20(2):443-455(2012))。
因此，本领域需要这样的编码小型抗肌萎缩蛋白的AAV载体，所述AAV载体在患有DMD的受试者的转导细胞中以高水平表达，同时最小化对小型抗肌萎缩蛋白质的免疫应答。
发明内容
本文公开和例示了小型抗肌萎缩蛋白质、用于表达此类小型抗肌萎缩蛋白质的密码子优化的基因、用于用此类基因转导细胞的AAV载体，以及使用此类AAV载体进行预防和治疗的方法，特别是用于预防和治疗有需要的受试者的抗肌萎缩蛋白病的方法。在这些实施方案中的一些实施方案中，本公开的AAV载体能够在转导的细胞中引导显著水平的小型抗肌萎缩蛋白的产生，同时不引起针对小型抗肌萎缩蛋白的免疫应答或仅引起针对小型抗肌萎缩蛋白的微弱免疫应答。
以下阐述本公开的发明的某些非限制性实施方案(E)。在具体实施方式包括实施例和附图中进一步详细描述了这些和相关的实施方案。
E1.一种小型抗肌萎缩蛋白质，其包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：N末端，肌动蛋白结合结构域(ABD)，铰链H1，棒R1和R2，铰链H3，棒R22、R23和R24，铰链H4，富含半胱氨酸(CR)的结构域，以及野生型人肌肉抗肌萎缩蛋白质(SEQ ID NO:25)的羧基末端(CT)结构域的一部分，其中所述CT结构域不包含野生型抗肌萎缩蛋白质的羧基末端的最后三个氨基酸残基。
E2.根据E1所述的小型抗肌萎缩蛋白质，其中所述N末端和肌动蛋白结合结构域(ABD)一起包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号1-240；铰链H1包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号253-327；棒R1包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号337-447；棒R2包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号448-556；铰链H3包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号2424-2470；棒R22包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号2687-2802；棒R23包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号2803-2931；棒R24包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号2932-3040；铰链H4包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号3041-3112；CR结构域包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号3113-3299；并且所述CT结构域的所述部分包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号3300-3408。
E3.根据E1和E2中任一项所述的小型抗肌萎缩蛋白质，其中所述小型抗肌萎缩蛋白包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
E4.一种小型抗肌萎缩蛋白质，其包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：N末端，肌动蛋白结合结构域(ABD)，铰链H1，棒R1、R2、R22、R23和R24，铰链H4，富含半胱氨酸(CR)的结构域，以及野生型人肌肉抗肌萎缩蛋白质(SEQ ID NO:25)的羧基末端(CT)结构域的一部分，其中所述CT结构域不包含野生型抗肌萎缩蛋白质的羧基末端的最后三个氨基酸残基。
E5.根据E4所述的小型抗肌萎缩蛋白质，其中所述N末端和肌动蛋白结合结构域(ABD)一起包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号1-240；铰链H1包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号253-327；棒R1包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号337-447；棒R2包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号448-556；棒R22包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号2687-2802；棒R23包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号2803-2931；棒R24包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQID NO:25的氨基酸编号2932-3040；铰链H4包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号3041-3112；所述CR结构域包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号3113-3299；并且所述CT结构域的所述部分包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQID NO:25的氨基酸编号3300-3408。
E6.根据E4和E5中任一项所述的小型抗肌萎缩蛋白质，其中所述小型抗肌萎缩蛋白质包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
E7.一种编码根据E1-E3所述的小型抗肌萎缩蛋白质的多核苷酸。
E8.一种编码根据E4-E6所述的小型抗肌萎缩蛋白质的多核苷酸。
E9.根据E7和E8中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸的核碱基序列由编码全长人肌肉抗肌萎缩蛋白的天然野生型基因的编码序列组装而成，所述核碱基序列的示例由NCBI参考序列NM_004006.2提供。
E10.根据E9所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸的核碱基序列由SEQ ID NO:26提供。
E11.根据E7-E10中任一项所述的多核苷酸，其中所述核碱基序列是密码子优化的。
E12.根据E11所述的多核苷酸，其中与所述野生型序列相比，所述密码子优化降低或增加GC含量。
E13.根据E11所述的多核苷酸，其中与所述野生型序列相比，所述密码子优化降低或增加CpG二核苷酸的数量。
E14.根据E11所述的多核苷酸，其中所述密码子优化消除了一个或多个潜在剪接位点。
E15.根据E11所述的多核苷酸，其中所述密码子优化消除除了所述小型抗肌萎缩蛋白质的所述编码序列的开始处的核糖体进入位点之外的一个或多个核糖体进入位点。
E16.根据E11所述的多核苷酸，其中所述密码子优化将一个或多个罕用密码子替换为在旨在表达所述小型抗肌萎缩蛋白基因的类型和/或种类的细胞中以更高频率出现的密码子。
E17.根据E12所述的多核苷酸，其中所述密码子优化使所述GC含量与野生型相比增加并且使基因表达水平增加至少50％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、900％、1000％或更多。
E18.根据E12所述的多核苷酸，其中所述密码子优化使所述GC含量与野生型相比增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多。
E19.根据E12所述的多核苷酸，其中所述GC含量为约或至少45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％或更多。
E20.根据E13所述的多核苷酸，其中所述密码子优化使所述CpG二核苷酸的数量与所述野生型相比减少或增加约或至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或更多。
E21.根据E20所述的多核苷酸，其中所述CpG二核苷酸的数量如果减少的话，则以足以完全或部分抑制由于CpG基序甲基化引起的基因表达沉默的量减少。
E22.根据E11所述的多核苷酸，其中所述密码子优化使所述小型抗肌萎缩蛋白基因关于高度表达的人基因的密码子适应指数(CAI)增加到为至少0.70、0.71、0.72、0.73、0.74、0.75、0.76、0.77、0.78、0.79、0.80、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98或0.99的值。
E23.根据E11-E22中任一项所述的多核苷酸，其中所述核碱基序列是人密码子优化的。
E24.根据E11-E22中任一项所述的多核苷酸，其中所述核碱基序列是犬密码子优化的。
E25.根据E23所述的多核苷酸，其中所述人密码子优化的序列由SEQ ID NO:1，或与SEQ ID NO:1至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一的核碱基序列提供。
E26.根据E23所述的多核苷酸，其中所述人密码子优化的序列由SEQ ID NO:2，或与SEQ ID NO:2至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一的核碱基序列提供。
E27.根据E24所述的多核苷酸，其中所述犬密码子优化的序列由SEQ ID NO:3，或与SEQ ID NO:3至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一的核碱基序列提供。
E28.一种载体，其包含根据E7-E27中任一项所述的多核苷酸。
E29.根据E28所述的载体，其中所述多核苷酸与遗传控制区可操作地连接。
E30.根据E29所述的载体，其中所述遗传控制区是启动子。
E31.根据E30所述的载体，其中所述启动子是肌肉特异性的，因为与其他类型的细胞如肝细胞相比，所述启动子在肌肉细胞中更具活性。
E32.根据E30-E31中任一项所述的载体，其中所述遗传控制区还包含增强子。
E33.根据E30-E32中任一项所述的载体，其中所述启动子和(如果存在的话)增强子来自肌肉肌酸激酶(CK)基因。
E34.根据E33所述的载体，其中所述CK基因来自小鼠或人。
E35.根据E33所述的载体，其中所述遗传控制区是小鼠CK7增强子和启动子。
E36.根据E29-E36中任一项所述的载体，其中所述遗传控制区包含选自组SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:16的核碱基序列。
E37.根据E28-E36中任一项所述的载体，其中所述多核苷酸与转录终止子区可操作地连接。
E38.根据E37所述的载体，其中所述转录终止子区包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17的核碱基序列。
E39.根据E28-E38中任一项所述的载体，其中所述载体是AAV病毒载体基因组并且包含侧翼AAV反向末端重复序列(ITR)。
E40.根据E39所述的载体，其中所述ITR均为AAV2 ITR。
E41.根据E39和E40中任一项所述的载体，其中所述载体的所述核碱基序列由选自以下组的核碱基序列提供：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:18。
E42.一种重组AAV(rAAV)粒子，其包含AAV衣壳和根据E39-E41中任一项所述的载体。
E43.根据E42所述的rAAV粒子，其中所述AAV衣壳是AAV9衣壳。
E44.一种rAAV粒子，其包含具有横纹肌嗜性的AAV衣壳和用于表达人小型抗肌萎缩蛋白质的载体基因组。
E45.根据E44所述的rAAV粒子，其中所述AAV衣壳来自AAV9血清型。
E46.根据E44和E45中任一项所述的rAAV粒子，其中所述载体基因组包含编码所述人小型抗肌萎缩蛋白质的人密码子优化的核酸序列。
E47.根据E44-E46中任一项所述的rAAV粒子，其中所述人小型抗肌萎缩蛋白质从N末端到C末端依次包含来自全长人肌肉抗肌萎缩蛋白质的以下亚结构域或其部分：N末端结构域、肌动蛋白结合结构域(ABD)、铰链H1、棒R1、棒R2、铰链H3、棒R22、棒R23、棒R24、铰链H4、富含半胱氨酸(CR)的结构域，以及羧基末端(CT)结构域的一部分，其中所述CT结构域的所述部分不包含来自抗肌萎缩蛋白的最后3个氨基酸。
E48.根据E44-E47中任一项所述的rAAV粒子，其中所述人小型抗肌萎缩蛋白质包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
E49.根据E44-E46中任一项所述的rAAV粒子，其中所述人小型抗肌萎缩蛋白质从N末端到C末端依次包含来自全长人肌肉抗肌萎缩蛋白质的以下亚结构域或其部分：N末端结构域、肌动蛋白结合结构域(ABD)、铰链H1、棒R1、棒R2、棒R22、棒R23、棒R24、铰链H4、富含半胱氨酸(CR)的结构域，以及羧基末端(CT)结构域的一部分，其中所述CT结构域的所述部分不包含来自抗肌萎缩蛋白的最后3个氨基酸。
E50.根据E44-E46和E49中任一项所述的rAAV粒子，其中所述人小型抗肌萎缩蛋白质包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
E51.根据E44-E47中任一项所述的rAAV粒子，其中编码所述人小型抗肌萎缩蛋白质的所述人密码子优化的核酸序列包含SEQ ID NO:1的核酸序列。
E52.根据E44-E46、E49和E50中任一项所述的rAAV粒子，其中编码所述人小型抗肌萎缩蛋白质的所述人密码子优化的核酸序列包含SEQ ID NO:3的核酸序列。
E53.根据E44-E52中任一项所述的rAAV粒子，其中所述载体基因组还包含为所述密码子优化的核酸序列侧翼的AAV反向末端重复序列(ITR)。
E54.根据E53所述的rAAV粒子，其中所述AAV ITR是AAV2 ITR。
E55.根据E44-E54中任一项所述的rAAV粒子，其中所述载体基因组还包含与所述人密码子优化的核酸序列可操作地连接的肌肉特异性转录调控元件。
E56.根据E55所述的rAAV粒子，其中所述肌肉特异性转录调控元件位于5′AAV2ITR与所述人密码子优化的核酸序列之间。
E57.根据E55和E56中任一项所述的rAAV粒子，其中所述肌肉特异性转录调控元件来源于人或小鼠肌酸激酶(CK)基因。
E58.根据E55-E57中任一项所述的rAAV粒子，其中所述肌肉特异性转录调控元件包含增强子和启动子。
E59.根据E55-E58中任一项所述的rAAV粒子，其中所述肌肉特异性转录调控元件是小鼠CK7增强子和启动子。
E60.根据E55-E59中任一项所述的rAAV粒子，其中所述肌肉特异性转录调控元件包含SEQ ID NO:16的核酸序列。
E61.根据E44-E60中任一项所述的rAAV粒子，其中所述载体基因组还包含位于所述密码子优化的核酸序列与3′AAV2 ITR之间的转录终止序列。
E62.根据E61所述的rAAV粒子，其中所述转录终止序列包含多腺苷酸化信号。
E63.根据E44-E62中任一项所述的rAAV粒子，其中所述载体基因组以5'到3'顺序包含：第一AAV2 ITR、与编码人小型抗肌萎缩蛋白质的人密码子优化的核酸序列可操作地连接的肌肉特异性转录调控元件、转录终止序列和第二AAV2 ITR。
E64.根据E63所述的rAAV粒子，其中所述肌肉特异性转录调控元件包含SEQ IDNO:16的核酸序列。
E65.根据实施方案E63或E64所述的rAAV粒子，其中所述人密码子优化的核酸序列包含SEQ ID NO:1的核酸序列。
E66.根据实施方案E63-E65所述的rAAV粒子，其中转录终止序列包含SEQ ID NO:17的核酸序列。
E67.根据E44-E48、E51和E53-E66中任一项所述的rAAV粒子，其中所述载体基因组包含SEQ ID NO:18的核酸序列或其反向互补序列。
E68.根据E44-E48、E51和E53-E66中任一项所述的rAAV粒子，其中所述载体基因组基本上由SEQ ID NO:18的核酸序列或其反向互补序列组成。
E69.根据E44-E48、E51和E53-E66中任一项所述的rAAV粒子，其中所述载体基因组由SEQ ID NO:18的核酸序列或其反向互补序列组成。
E70.一种重组AAV粒子，其包含AAV9衣壳和载体基因组，所述载体基因组包含SEQID NO:18的核酸序列或其反向互补序列。
E71.一种重组AAV粒子，其包含AAV9衣壳和载体基因组，所述载体基因组基本上由SEQ ID NO:18的核酸序列或其反向互补序列组成。
E72.一种重组AAV粒子，其包含AAV9衣壳和载体基因组，所述载体基因组由SEQ IDNO:18的核酸序列或其反向互补序列组成。
E73.一种药物组合物，其包含根据E42-E72中任一项所述的rAAV粒子和药学上可接受的载剂。
E74.一种治疗抗肌萎缩蛋白病的方法，包括向需要治疗抗肌萎缩蛋白病的受试者施用治疗有效量的根据E73所述的组合物。
E75.根据E42-E72中任一项所述的重组AAV(rAAV)粒子或根据E73所述的组合物在制备用于治疗患有抗肌萎缩蛋白病的受试者的药物中的用途。
E76.根据E42-E72中任一项所述的rAAV粒子或根据E73所述的组合物，用于治疗患有抗肌萎缩蛋白病的受试者。
E77.根据E74-E76中任一项所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中所述抗肌萎缩蛋白病是杜氏肌营养不良症(DMD)、贝克型肌肉萎缩症(BMD)或DMD相关的扩张型心肌病。
E78.根据E74-E77中任一项所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中所述受试者是男性或女性人受试者。
E79.根据E74-E78中任一项所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中所述受试者在首次用所述组合物治疗或施用所述组合物时是能走动的。
E80.根据E74-E79中任一项所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中所述受试者在首次用所述组合物治疗或施用所述组合物时是约或至少4岁、5岁、6岁、7岁、8岁、9岁、10岁、11岁、12岁、13岁、14岁、15岁或16岁。
E81.根据E74-E79中任一项所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中与未治疗的对照相比，所述方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物有效地在肌细胞的肌纤维膜处恢复抗肌萎缩蛋白相关的蛋白质复合物。
E82.根据E74-E79中任一项所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中与未治疗的对照相比，所述方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物有效地改善心脏中的营养不良组织病理学。
E83.根据E74-E79中任一项所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中与未治疗的对照相比，所述方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物有效地抑制肢体肌肉和膈肌中的纤维化。
E84.根据E74-E79中任一项所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中与未治疗的对照相比，所述方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物有效地减小肌肉病变评分。
E85.根据E74-E79中任一项所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中与未治疗的对照相比，所述方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物有效地减轻肌肉疲劳。
E86.根据E74-E79中任一项所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中与未治疗的对照相比，所述方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物有效地增加Dmdmdx大鼠的最大绝对或相对前肢握力。
E87.根据E74-E79中任一项所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中所述方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物有效地增加骨骼肌、心肌或膈肌中小型抗肌萎缩蛋白mRNA或蛋白质的可检测水平。
E88.根据E74-E79中任一项所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中所述方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物有效地使受试者血液中的平均MMP-9水平降低到为健康对照中的平均MMP-9水平的约15倍、14倍、13倍、12倍、11倍、10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍或2倍以内。
E89.根据E74-E79中任一项所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中所述方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物有效地使受试者血液中的平均ALT、AST或LDH水平降低到为健康对照中的平均ALT、AST或LDH水平的约7倍、6倍、5倍、4倍、3倍或2倍以内。
E90.根据E74-E79中任一项所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中所述方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物有效地使受试者血液中的平均总CK水平降低到为健康对照中的平均总CK水平的约50倍、48倍、46倍、44倍、42倍、40倍、38倍、36倍、34倍、32倍、30倍、28倍、26倍、24倍、22倍、20倍、18倍、16倍、14倍、12倍、10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍，或2倍以内。
E91.根据E74-E79中任一项所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中所述方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物有效地使得在所述载体施用的3个月、6个月、9个月、12个月、15个月、18个月、21个月、24个月、27个月、30个月、33个月或36个月后，受试者的平均6分钟步行距离(6MWD)与未治疗对照的平均6MWD相比增加至少5米、10米、15米、20米、25米、30米、35米、40米、45米、50米、55米、60米、65米、70米、75米、80米、85米、90米、95米、或100米。
E92.根据E74-E79中任一项所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中所述方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物有效地使得在所述载体施用的3个月、6个月、9个月、12个月、15个月、18个月、21个月、24个月、27个月、30个月、33个月或36个月后，进行4阶梯爬升测试所需的平均时间与未治疗对照的平均时间相比缩短至少0.2秒、0.4秒、0.6秒、0.8秒、1.0秒、1.2秒、1.4秒、1.6秒、1.8秒、2.0秒、2.2秒、2.4秒、2.6秒、2.8秒、3.0秒、3.2秒、3.4秒、3.6秒、3.8秒、或4.0秒。
E93.根据E74-E79中任一项所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中所述方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物有效地使得在所述载体施用的3个月、6个月、9个月、12个月、15个月、18个月、21个月、24个月、27个月、30个月、33个月或36个月后，已丧失行走能力的受试者的平均比例与已丧失行走能力的未治疗对照的平均比例相比降低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或65％。
E94.根据E74-E79中任一项所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中所述方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物有效地使得在所述载体施用的3个月、6个月、9个月、12个月、15个月、18个月、21个月、24个月、27个月、30个月、33个月或36个月后，受试者的下肢平均脂肪分数与未治疗对照的下肢平均脂肪分数相比降低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％。
E95.根据E88-E94中任一项所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中所述对照与所述受试者是年龄和性别匹配的。
E96.根据E91-E94中任一项所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中所述受试者和未治疗对照根据年龄、在先皮质类固醇治疗和/或6MWT的基线表现被分层。
E97.根据E74-E79中任一项所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中所述方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物有效地使得在所述载体施用的3个月、6个月、9个月、12个月、15个月、18个月、21个月、24个月、27个月、30个月、33个月或36个月后，受试者的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％的骨骼肌纤维表达小型抗肌萎缩蛋白质。
E98.根据E97中任一项所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中所述骨骼肌纤维存在于从所述受试者的二头肌、三角肌或四头肌获得的活组织切片(biopsy)中。
E99.根据E74-E98中任一项所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中所述方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物使得在所述载体施用的1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月、25个月、26个月、27个月、28个月、29个月、30个月、31个月、32个月、33个月、34个月、35个月或36个月后，在小于或等于约0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％的受试者中存在针对小型抗肌萎缩蛋白质的细胞免疫应答或肌肉炎症。
E100.根据E74-E99中任一项所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中所述方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物在不需要所治疗受试者中的伴随免疫抑制的情况下是有效的。
E101.根据E74-E76中任一项所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中所述受试者是Dmdmdx大鼠，并且所述方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物有效地使得与仅施用媒介物的年龄匹配的对照相比，注射后3个月或6个月时血清AST、ALT、LDH或总肌酸激酶的水平降低。
E102.根据E74-E76中任一项所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中所述受试者是Dmdmdx大鼠，并且所述方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物有效地使得与仅施用媒介物的年龄匹配的对照相比，注射后3个月或6个月时股二头肌、膈肌或心肌中的纤维化减少。
E103.根据E74-E76中任一项所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中所述受试者是Dmdmdx大鼠，并且所述方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物有效地使得与仅施用媒介物的年龄匹配的对照相比，注射后3个月或6个月时前肢握力增加。
E104.根据E74-E76中任一项所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中所述受试者是Dmdmdx大鼠，并且所述方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物有效地使得与仅施用媒介物的年龄匹配的对照相比，注射后3个月或6个月时肌肉疲劳降低，如在测试前肢握力的5次密集试验中所测量的。
E105.根据E74-E76中任一项所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中所述受试者是Dmdmdx大鼠，并且所述方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物有效地使得与仅施用媒介物的年龄匹配的对照相比，注射后6个月时如使用超声心动描记术测量的左心室射血分数增加。
E106.根据E74-E76中任一项所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中所述受试者是Dmdmdx大鼠，并且所述方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物有效地使得与仅施用媒介物的年龄匹配的对照相比，注射后3个月或6个月时如使用超声心动描记术测量的早期左心室充盈速度比晚期左心室充盈速度的比(即，E/A比率)增加。
E107.根据E74-E76中任一项所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中所述受试者是Dmdmdx大鼠，并且所述方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物有效地使得与仅施用媒介物的年龄匹配的对照相比，注射后3个月或6个月时等容舒张时间(IVRT)或在峰值E速度与其返回基线之间的以毫秒计的时间缩短，其中所述E波减速时间(DT)是使用超声心动描记术测量的。
E108.根据E74-E76所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中所述受试者是Dmdmdx大鼠，并且所述方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物有效地在注射后3个月或6个月时，在不诱导针对小型抗肌萎缩蛋白质的细胞免疫应答的情况下转导股二头肌、膈肌、心肌或其他横纹肌，并表达由opti-Dys3978基因编码的小型抗肌萎缩蛋白质。
E109.根据E74-E76中任一项所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中所述受试者是Dmdmdx大鼠，并且所述方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物有效地使得与仅施用媒介物的年龄匹配的对照相比，注射后6个月时部分或完全地逆转左心室舒张末期直径的增加。
E110.根据E74-E100中任一项所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中所述受试者还用有效治疗抗肌萎缩蛋白病的至少第二药剂治疗，或者所述组合物还包含所述有效治疗抗肌萎缩蛋白病的至少第二药剂，所述第二药剂的示例包括引起DMD基因的外显子跳读的反义寡核苷酸、抗肌生成抑制蛋白抗体、促进无义突变的核糖体通读的药剂、抑制提前终止密码子的药剂、合成代谢类固醇，或皮质类固醇(诸如但不限于强的松(prednisone)、地夫可特(deflazacort)或泼尼松龙(prednisolone))。
E111.根据E74-E110中任一项所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中所述组合物全身施用，诸如通过静脉内注射而全身施用；或局部施用，诸如直接施用于肌肉。
E112.根据E74-E111中任一项所述的方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物，其中在所述方法、用途、用于用途的rAAV粒子或组合物中使用的rAAV粒子的剂量选自由以下组成的剂量的组：1×1012vg/kg、2×1012vg/kg、3×1012vg/kg、4×1012vg/kg、5×1012vg/kg、6×1012vg/kg、7×1012vg/kg、8×1012vg/kg、9×1012vg/kg、1×1013vg/kg、2×1013vg/kg、3×1013vg/kg、4×1013vg/kg、5×1013vg/kg、6×1013vg/kg、7×1013vg/kg、8×1013vg/kg、9×1013vg/kg、1×1014vg/kg、1.5×1014vg/kg、2×1014vg/kg、2.5×1014vg/kg、3×1014vg/kg、3.5×1014vg/kg、4×1014vg/kg、5×1014vg/kg、6×1014vg/kg、7×1014vg/kg、8×1014vg/kg和9×1014vg/kg，其中vg/kg代表每千克受试者体重的载体基因组。
E113.根据E73所述的组合物，其进一步包含与所述rAAV粒子为相同AAV血清型的空衣壳，其中空衣壳与rAAV粒子的浓度比为约或至少0.5:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1或更大。
E114.一种在细胞中表达小型抗肌萎缩蛋白质的方法，其包括使所述细胞与根据E42-E72中任一项所述的rAAV粒子接触。
E115.根据E114所述的方法，其中所述细胞是肌细胞。
E116.根据E115所述的方法，其中所述肌细胞来自骨骼肌、膈肌或心脏。
E117.一种制备根据E42-E72中任一项所述的rAAV粒子的方法，包括将根据E39-E41中任一项所述的载体、AAV rep基因、AAV cap基因和用于辅助功能基因导入生产细胞，孵育所述细胞，以及纯化由所述细胞产生的所述rAAV粒子。
E118.根据E117所述的方法，其中所述生产细胞是附着型的。
E119.根据E117所述的方法，其中所述生产细胞是非附着型的。
E120.根据E117-E119中任一项所述的方法，其中所述载体包含在一个质粒中，所述AAV rep基因和AAV cap基因包含在第二质粒中，并且所述辅助功能基因包含在第三质粒中，其中将所有三种质粒导入包装细胞中。
E121.根据E117-E120中任一项所述的方法，其中所述导入步骤通过转染实现。
E122.根据E117-E121中任一项所述的方法，其中所述生产细胞是HEK 293细胞。
E123.根据E117-E122中任一项所述的方法，其中所述生产细胞在无血清培养基中生长。
E124.根据E117-E123中任一项所述的方法，其中所述AAV cap基因编码AAV9 VP1蛋白质、AAV9 VP2蛋白质和AAV9 VP3蛋白质。
E125.根据E117-E124中任一项所述的方法，其中使用密度梯度超速离心或柱色谱法纯化所述rAAV粒子。
E126.一种通过根据E117-E125中任一项所述的方法产生的rAAV粒子。
附图说明
图1显示了高度截短的小型抗肌萎缩蛋白基因的构建。野生型肌肉抗肌萎缩蛋白具有四个主要结构域：N末端结构域(N)；中央棒区域，该中央棒区域包含24个棒重复序列(R)和四个铰链(H)；富含半胱氨酸(CR)的结构域，以及羧基末端(CT)结构域。通过缺失大部分中央棒和铰链以及大多数CT结构域来构建小型抗肌萎缩蛋白基因。将小型抗肌萎缩蛋白基因进行密码子优化、全合成、随后克隆到基因5'端的CMV启动子或肌肉特异性合成杂合启动子与基因3'端的小poly(A)序列之间。然后将含有启动子、密码子优化的小型抗肌萎缩蛋白基因和polyA信号的该基因区段克隆到含有左AAV反向末端重复序列(ITR)和右AAV ITR的质粒中，使得该基因区段的侧翼为所述ITR。
图2显示密码子优化有效地增强了小型抗肌萎缩蛋白基因的表达。上部图显示了对(A)未转染的293细胞或用(B)原始未优化的小型抗肌萎缩蛋白Dys3978载体质粒或(C)经优化的小型抗肌萎缩蛋白Dys3978载体质粒转染后的293细胞中的小型抗肌萎缩蛋白的免疫荧光(IF)染色。下部图显示了经转染的293细胞中的小型抗肌萎缩蛋白的蛋白质印迹。左边的印迹使用等量的细胞裂解物，并且经优化的cDNA显示出压倒性的表达。右侧的印迹使用来自用经优化的小型抗肌萎缩蛋白cDNA转染的293细胞的细胞裂解物的100倍稀释液，而未优化的样品未被稀释。应注意，经优化的样品的信号在100倍稀释后仍然更强。
图3显示用AAV9载体治疗的抗肌萎缩蛋白/肌营养相关蛋白(utrophin)双敲除(dKO)小鼠中的人小型抗肌萎缩蛋白表达的IF染色。将来自野生型对照小鼠C57BL/10(C57)、未治疗的dKO小鼠和用AAV9-CMV-Hopti-Dys3978治疗的dKO小鼠(T-dKO)的肌肉和心脏样品切薄片并用也识别小鼠野生型抗肌萎缩蛋白和人小型抗肌萎缩蛋白质两者的抗体染色。在所有检查的样品中实现了高效表达。
图4显示了作为AAV9-CMV-Hopti-Dys3978治疗的结果的dKO小鼠体重的归一化。在4月龄时从野生型对照B10小鼠(C57BL/10)、未治疗的mdx小鼠、未治疗的dKO小鼠和用载体治疗的dKO小鼠获得数据。
图5显示作为AAV9-CMV-Hopti-Dys3978治疗的结果，dKO小鼠的握力和跑台运动得到改善。在3月龄时从野生型对照B10小鼠(C57BL/10)、未治疗的mdx小鼠、未治疗的dKO小鼠和用载体治疗的dKO小鼠(T-dKO)获得数据。
图6A-6B显示作为AAV9-CMV-Hopti-Dys3978治疗的结果，dKO小鼠的营养不良病理学得到改善。(图6A)将来自野生型对照C57BL/10小鼠、未治疗的dKO小鼠和用载体治疗的dKO(T-dKO)小鼠的胫骨前肌的冷冻切片(8μm)进行苏木精和伊红(H&E)染色以用于组织病理学(放大10倍)。(图6B)对肌肉质量(mass)、心脏质量、中央定位核的百分比和血清肌酸激酶活性的定量分析。
图7显示用人密码子优化的小型抗肌萎缩蛋白Dys3978载体(AAV9-CMV-Hopti-Dys3978)治疗的dKO小鼠与未治疗的dKO小鼠和野生型小鼠相比的存活曲线。大于50％的经治疗dKO小鼠存活超过80周(实验的持续时间)。
图8显示了作为AAV9-CMV-Hopti-Dys3978治疗的结果，dKO小鼠的心脏功能得到改善。对野生型对照C57BL/10小鼠、未治疗的mdx小鼠和用AAV9载体治疗的dKO小鼠进行血液动力学分析。未治疗的dKO小鼠病得太重而无法在过程中维持。从不使用多巴酚丁胺攻击或使用多巴酚丁胺攻击的三组小鼠收集数据。
图9A-9B显示作为AAV9-CMV-Hopti-Dys3978治疗的结果，dKO小鼠的心电图(ECG)得到改善。(图9A)在用载体治疗的dKO小鼠中，ECG的PR间期得到改善。(图9B)分析的定量数据。进行实验以仔细监测三组的心率，使得ECG不受心率变化的影响。*p<0.05。
图10显示了mdx小鼠中尾静脉注射含有CMV或hCK启动子的AAV9-Hopti-Dys3978载体后，非组织特异性CMV启动子和肌肉特异性hCK启动子在驱动人密码子优化的小型抗肌萎缩蛋白Dys3978方面的比较。使用IF染色时，人小型抗肌萎缩蛋白Dys3978在肢体肌肉中和也在心肌中表现出稳健的表达。似乎hCK启动子比CMV启动子更有效。
图11显示了在隔离肢体静脉灌注AAV9-CMV-Hopti-Dys3978载体之后，GRMD狗“Jelly”的后肢的磁共振成像(MRI)图像。在右后腿中加压灌注载体，所述右后腿在腹股沟区域放置有束紧的止血带。发白的信号指示载体溶液保留在被灌注的肢体中。
图12显示了在GRMD狗“Jelly”中注射载体后2个月时的人小型抗肌萎缩蛋白Dys3978表达的IF染色。检查右后肢和左后肢中5种不同肌群的活组织检查样品。未注射的左腿也具有可检测的dys3978，表明AAV9载体已经从注射部位移动到对侧腿。
图13显示了在GRMD狗“Jelly”中注射载体后7个月时人小型抗肌萎缩蛋白Dys3978表达的IF染色。检查右后肢和左后肢中4种不同肌群的活组织检查样品。未注射的左腿也具有可检测的Dys3978，表明AAV9载体已经从注射部位移动到对侧腿。在相同样品上进行Dys3978的蛋白质印迹分析。
图14显示了在GRMD狗“Jelly”中注射载体后12个月时人小型抗肌萎缩蛋白Dys3978表达的IF染色。检查右后肢和左后肢中4种不同肌群的活组织检查样品和1个前肢样品。未注射的左腿也具有可检测的Dys3978，表明AAV9载体已经从注射部位移动到对侧腿。
图15显示了在GRMD狗“Jelly”中注射载体后2年时人小型抗肌萎缩蛋白Dys3978表达的IF染色。检查右后肢和左后肢中2种不同肌群的活组织检查样品。应注意，未注射的左腿似乎比经注射的腿具有更多可检测的Dys3978。
图16显示人小型抗肌萎缩蛋白Dys3978的IF染色。从GRMD狗“Jelly”检查了右后肢和左后肢两者中两种另外的(与图15相比)肌群的活组织检查样品和一个前肢样品。还在载体注射后2年时收集了样品。
图17显示了在来自GRMD狗“Jelly”的进行载体注射后4年时、在未注射的左后腿中人小型抗肌萎缩蛋白Dys3978的IF染色。
图18显示了在GRMD狗“Jelly”中载体注射后超过8年时的人小型抗肌萎缩蛋白Dys3978的IF染色。检查了5种不同肌群和心脏的尸检肌肉样品。
图19显示了在GRMD狗“Jelly”中载体注射后超过8年时的人小型抗肌萎缩蛋白Dys3978和内源性回复突变抗肌萎缩蛋白的IF染色。将三种不同肌群的尸检肌肉样品用识别人抗肌萎缩蛋白和狗抗肌萎缩蛋白两者的抗体(上部图)或仅识别狗回复突变抗肌萎缩蛋白的抗体(下部图)染色。回复突变抗肌萎缩蛋白阳性肌纤维用箭头突出显示。回复突变纤维是罕见的肌纤维，其在人DMD患者以及mdx小鼠和GRMD狗中针对抗肌萎缩蛋白质阳性染色。回复突变纤维发生的确切机制尚不完全清楚，但可能涉及罕见肌细胞中的外显子跳读，该外显子跳读产生具有由抗体探针识别的表位的缩短的抗肌萎缩蛋白。参见例如Lu,QL等人,J Cell Biol 148:985-96(2000)。
图20显示了在AAV9载体注射后超过8年时，在尸检中存在于GRMD狗“Jelly”的肌肉样品中的人小型抗肌萎缩蛋白Dys3978的蛋白质印迹分析。蛋白质印迹显示人小型抗肌萎缩蛋白Dys3978存在于所有检查的骨骼肌中。来自年龄和性别匹配的名为“Molly”的正常狗的肌肉用作阳性对照，该阳性对照进行连续2倍稀释以指示抗肌萎缩蛋白质的定量。野生型全长抗肌萎缩蛋白的分子量为约400kDa，而小型抗肌萎缩蛋白Dys3978蛋白质的分子量为约150kDa。
图21显示了注射AAV9-CMV-Hopti-Dys3978载体和全身基因表达后GRMD狗“Jelly”中的肌肉收缩力得到改善。顶部曲线表示正常狗的肌力，而底部曲线表示未治疗的GRMD狗的肌力。延伸到更多时间点的两条曲线代表狗“Jelly”的肌力。用AAV9-CMV-犬-小型抗肌萎缩蛋白Dys3849载体(Wang等人，PNAS 97(25):13714-9(2000))治疗的另外两只GRMD狗也检查了肌力，并显示出改善(“Jasper”和“Peridot”)。
图22显示了GRMD狗“Dunkin”中进行AAV9-hCK-Copti-Dys3978载体注射后4个月时人小型抗肌萎缩蛋白表达的肌肉活检IF染色。通过静脉内注射递送载体以实现全身基因表达。检查后肢中4种不同肌群的活组织检查样品。应注意在所有肌群中检测到几乎均匀的小型抗肌萎缩蛋白Dys3978。
图23显示了GRMD狗“Dunkin”中进行AAV9-hCK-Copti-Dys3978载体注射后14个月时人小型抗肌萎缩蛋白表达的IF染色。取出尸检样品并检查。应注意在心脏和所有肌群中检测到了广泛且稳健水平的小型抗肌萎缩蛋白Dys3978。放大了4倍。
图24显示了GRMD狗“Dunkin”中进行AAV9-hCK-Copti-Dys3978载体注射后14个月时检测到具有稳健水平的人小型抗肌萎缩蛋白的膈肌肌肉的IF染色。
图25显示了GRMD狗“Dunkin”中进行AAV9-hCK-Copti-Dys3978载体注射后14个月时检测到具有稳健水平的人小型抗肌萎缩蛋白的腓骨长肌的IF染色。
图26显示了GRMD狗“Dunkin”中进行AAV9-hCK-Copti-Dys3978载体注射后14个月时检测到具有稳健水平的人小型抗肌萎缩蛋白的半膜肌的IF染色。
图27显示了GRMD狗“Dunkin”中进行AAV9-hCK-Copti-Dys3978载体注射后14个月时检测到具有稳健水平的人小型抗肌萎缩蛋白的心脏左心室(LV)肌肉的IF染色。
图28显示了载体注射后4个月和14个月时通过蛋白质印迹检测GRMD狗“Dunkin”的肌肉样品中的人小型抗肌萎缩蛋白Dys3978。来自年龄匹配的正常狗的肌肉用作阳性对照，该阳性对照进行连续2倍稀释以指示抗肌萎缩蛋白质的定量。野生型全长抗肌萎缩蛋白的分子量为约400kDa，而小型抗肌萎缩蛋白Dys3978的分子量为约150kDa。应注意，在肝脏中未检测到小型抗肌萎缩蛋白Dys3978。
图29显示了在载体注射后14个月时通过蛋白质印迹检测GRMD狗“Dunkin”的心脏(LV)样品中的人小型抗肌萎缩蛋白Dys3978表达。来自年龄匹配的正常狗的心脏样品用作阳性对照，该阳性对照进行连续2倍稀释以指示抗肌萎缩蛋白质的定量。
图30显示了各种肌群的如通过人小型抗肌萎缩蛋白Dys 3978以及γ-肌聚糖(r-SG)的IF染色所示的抗肌萎缩蛋白相关蛋白质复合物的恢复。
图31显示了对各种肌肉和组织中的AAV9-CMV-Copti-Dys3978载体DNA拷贝的分析。进行定量PCR(qPCR)以确定AAV载体DNA基因组拷贝数，所述拷贝数基于每二倍体细胞进行归一化。
图32显示了与年龄匹配的正常且未治疗的GRMD狗相比，AAV9-CMV-Copti-Dys3978载体GRMD狗“Dunkin”的心脏中的营养不良组织病理学得到改善。HE染色。
图33显示了AAV9-CMV-Copti-Dys3978载体GRMD狗“Dunkin”的膈肌中的营养不良组织病理学得到改善。与年龄匹配的正常且未治疗的GRMD狗相比。HE染色。
图34显示了与年龄匹配的未治疗的GRMD狗相比，AAV9-CMV-Copti-Dys3978载体GRMD狗“Dunkin”的肢体肌肉中的营养不良组织病理学得到改善。HE染色。
图35显示了与年龄匹配的未治疗的GRMD狗相比，GRMD狗“Dunkin”的肢体肌肉和膈肌中的纤维化得到抑制。马森三色(Mason Trichrome)蓝染。
图36A提供了显微照片，显示了使用针对抗肌萎缩蛋白的DYSB抗体对从用PBS治疗的WT大鼠模拟(左侧图)、模拟治疗的DMD大鼠(中间图)和用AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体治疗的Dmdmdx大鼠(右侧图)获得的股二头肌进行的免疫标记。纤维周围的黑色轮廓线显示抗肌萎缩蛋白在WT大鼠中和小型抗肌萎缩蛋白在用载体治疗的Dmdmdx大鼠中的肌膜下定位。
图36B提供显微照片，显示了用苏木精和伊红(HES)染色的股二头肌，获自模拟治疗的WT大鼠(左侧图)、模拟治疗的Dmdmdx大鼠(中间图)和用AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体治疗的DMD大鼠(右侧图)。显示了坏死纤维簇(*)和肌内膜轻度纤维化(以黑色箭头指示)。
图36C提供显微照片，显示了用针对抗肌萎缩蛋白的DYSB抗体对从模拟治疗的WT大鼠(左侧图)、模拟治疗的Dmdmdx大鼠(中间图)和用AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体治疗的Dmdmdx大鼠(右侧图)获得的心肌进行的免疫标记。纤维周围的黑色轮廓线显示抗肌萎缩蛋白在WT大鼠中和小型抗肌萎缩蛋白在用载体治疗的Dmdmdx大鼠中的肌膜下定位。
图36D提供显微照片，显示了用HES染色的心肌，该心肌是从模拟治疗的WT大鼠(左侧图)、模拟治疗的Dmdmdx大鼠(中间图)和用AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体治疗的Dmdmdx大鼠(右侧图)获得的。中间图显示了纤维化的病灶(以空心箭头指示)，并且右侧图显示了单核细胞浸润的病灶。
图37显示了用媒介物(缓冲液)治疗的WT大鼠以及用媒介物和随时间增加剂量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体治疗的Dmdmdx大鼠至给药后25周时的平均体重(以克计)。“WT”是指野生型大鼠；“DMD”是指Dmdmdx大鼠；“n”是指样品量；“D”是指自给药以后的天数；“W”是指自给药以后的周数；“E”是指定系数乘以十的指定指数幂的符号(因此，“1E13”代表1×1013，“3E13”代表3×1013，“1E14”代表1×1014，“3E14”代表3×1014)；“vg/kg”代表每千克体重的载体基因组；“w/o HAS”是指载体在不含人血清白蛋白(HSA)的PBS中施用的治疗组。在图表的右侧，在25周时，从上到下的平均体重数据的顺序与图例中列出的治疗组的从上到下顺序相同(除了用在不含HSA的媒介物中施用的1×1014vg/kg载体治疗Dmdmdx大鼠之外，针对该治疗的数据收集在从研究开始13周时结束)。这些相同的缩写用于本文的其他图中。
图38A提供了经染色以进行组织学检查的来自Dmdmdx大鼠的骨骼肌的示例性显微照片，显示了用于评估由抗肌萎缩蛋白缺乏造成的肌肉病变严重程度的半定量评分方案。在骨骼肌中，例如所图示的骨骼肌，评分0对应于没有病变；1对应于存在一些再生活性，如由中央成核纤维和再生小病灶所证明的；2对应于存在单独的或成小簇的退化纤维；并且3对应于由纤维化或脂肪组织进行的组织重构和纤维替代。心脏评分使用了不同的标准，如文中所述。
图38B单独地显示了注射后3个月时大鼠的总DMD病变评分(即，股二头肌、胸肌、膈肌和心肌的病变分项分数的平均值)，以及每种治疗组中所有大鼠的平均值，并将它们进行比较以显示病变评分中载体剂量响应的降低。“WT模拟”是指用媒介物治疗的WT大鼠，“KO模拟”是指用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠，“KO 1E13”、“3E13”和“1E14”是指用以vg/kg计的所示剂量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体治疗的Dmdmdx大鼠。条形上方的字母表示基础数据与上方出现该相同字母的其他条形不具有统计学差异。相反，上方出现不同字母的条形彼此具有统计学差异。使用Kruskal-Wallis检验和Dunn检验计算统计学。
图39A提供了来自用不断增加剂量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体治疗的Dmdmdx大鼠和阴性对照的股二头肌样品的代表性切片。用特异性结合全长大鼠抗肌萎缩蛋白和人小型抗肌萎缩蛋白的抗体以及对结缔组织染色的麦胚凝集素缀合物对样品进行双重标记。顶部图是来自注射后3个月处死的动物的显微照片。底部图是来自注射后6个月处死的动物的显微照片。
图39B提供了来自用不断增加剂量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体治疗的Dmdmdx大鼠和阴性对照的股二头肌肌肉样品的随机切片中对于抗肌萎缩蛋白质存在呈染色阳性的纤维的百分比。包括注射后3个月和6个月的数据。条形上方的字母表示基础数据与上方出现该相同字母的其他条形不具有统计学差异。相反，上方出现不同字母的条形彼此具有统计学差异。使用方差分析(ANOVA analysis)和Fisher事后双侧检验计算统计学。
图39C提供了来自用不断增加剂量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体治疗的Dmdmdx大鼠和阴性对照的股二头肌肌肉样品的随机切片中对于结缔组织存在呈染色阳性的面积百分比。包括注射后3个月和6个月的数据。条形上方的字母表示基础数据与上方出现该相同字母的其他条形不具有统计学差异。相反，上方出现不同字母的条形彼此具有统计学差异。使用方差分析和Fisher事后双侧检验计算统计学。
图40A提供了来自用不断增加剂量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体治疗的Dmdmdx大鼠和阴性对照的膈肌样品的代表性切片，所述大鼠和阴性对照在注射后3个月处死。用特异性结合全长大鼠抗肌萎缩蛋白和人小型抗肌萎缩蛋白的抗体以及对结缔组织染色的麦胚凝集素缀合物对样品进行双重标记。
图40B提供了来自用不断增加剂量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体治疗的Dmdmdx大鼠和阴性对照的膈肌样品的随机切片中对抗肌萎缩蛋白存在呈染色阳性的纤维的百分比。包括注射后3个月和6个月的数据。条形上方的字母表示基础数据与上方出现该相同字母的其他条形不具有统计学差异。相反，上方出现不同字母的条形彼此具有统计学差异。使用方差分析和Fisher事后双侧检验计算统计学。
图40C提供了来自用不断增加剂量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体治疗的Dmdmdx大鼠和阴性对照的膈肌样品的随机切片中对结缔组织存在呈染色阳性的面积百分比。包括注射后3个月和6个月的数据。条形上方的字母表示基础数据与上方出现该相同字母的其他条形不具有统计学差异。相反，上方出现不同字母的条形彼此具有统计学差异。使用方差分析和Fisher事后双侧检验计算统计学。
图41A显示了取自用不断增加剂量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体(顶部图)治疗的Dmdmdx大鼠和阴性对照(底部图)的心脏的距顶点三分之一处的代表性横切片，所述大鼠和阴性对照在注射后3个月和6个月处死。将组织学切片用天狼猩红染色以允许结缔组织可视化。中间图包含取自用载体和媒介物治疗的Dmdmdx大鼠的心肌的代表性切片，所述切片用特异性结合全长大鼠抗肌萎缩蛋白和人小型抗肌萎缩蛋白的抗体以及对结缔组织染色的麦胚凝集素缀合物进行了双重标记。
图41B提供了来自用不断增加剂量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体治疗的Dmdmdx大鼠和阴性对照的心肌样品的随机切片中针对抗肌萎缩蛋白质的存在被染色的纤维的百分比。包括注射后3个月和6个月的数据。条形上方的字母表示基础数据与上方出现该相同字母的其他条形不具有统计学差异。相反，上方出现不同字母的条形彼此具有统计学差异。使用方差分析和Fisher事后双侧检验计算统计学。
图41C提供了来自用不断增加剂量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体治疗的Dmdmdx大鼠和阴性对照的心肌样品的随机切片中针对结缔组织存在被染色的面积百分比。包括注射后3个月和6个月的数据。条形上方的字母表示基础数据与上方出现该相同字母的其他条形不具有统计学差异。相反，上方出现不同字母的条形彼此具有统计学差异。使用方差分析和Fisher事后双侧检验计算统计学。
图42A提供了用不断增加剂量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体治疗的Dmdmdx大鼠与用媒介物治疗的Dmdmdx和WT大鼠相比较，通过重复五次密集握力测试测量的关于肌肉疲劳的数据。在7-9周龄时注射的大鼠注射后3个月时或当所述大鼠约4.5月龄时进行测试。图表显示了在试验1与5之间测量的前肢握力的降低(表示为试验1力的百分比)。结果表示为平均值±SEM。统计学比较了用载体治疗的Dmdmdx大鼠与接受媒介物的WT大鼠(*p<0.05；***p<0.001)和接受媒介物的Dmdmdx大鼠(¤¤p<0.01；¤¤¤p<0.001)，所述接受媒介物的WT大鼠和接受媒介物的Dmdmdx大鼠均为阴性对照。
图42B提供了用不断增加剂量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体治疗的Dmdmdx大鼠与用媒介物治疗的Dmdmdx和WT大鼠相比较，通过重复五次密集握力测试测量的关于肌肉疲劳的数据。在7-9周龄时注射的大鼠注射后6个月时，或当所述大鼠约7.5月龄时进行测试。图表显示了在试验1与5之间测量的前肢握力的减小(表示为试验1力的百分比)。结果表示为平均值±SEM。
图43提供了在施用媒介物或AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体的WT大鼠和Dmdmdx大鼠中注射后6个月时，来自通过M型超声心动描记术获得的长轴图像的、在舒张期期间测量的左心室(LV)舒张末期直径。显示的描述性统计学是平均值±SEM。
图44提供了来自在施用媒介物或AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体的WT大鼠和Dmdmdx大鼠中注射后6个月时，来自通过M型超声心动描记术获得的长轴图像的、在舒张期期间测量的射血分数。所示的描述性统计学是平均值±SEM，并且“$”符号表示上方放置有该符号的数据与用媒介物(缓冲液)治疗的Dmdmdx大鼠的数据之间存在统计学上显著的差异(p<0.05)。
图45A提供了在施用媒介物或AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体的WT大鼠和Dmdmdx大鼠中注射后3个月时，使用具有心尖四腔取向的脉冲多普勒测量的E/A比率。所示的描述性统计学是平均值±SEM，并且“*”符号表示上方放置有该符号的数据与用媒介物(缓冲液)治疗的WT大鼠的数据之间存在统计学上显著的差异(p<0.05)。
图45B提供了在施用媒介物或AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体的WT大鼠和Dmdmdx大鼠中注射后6个月时，使用具有心尖四腔取向的脉冲多普勒测量的E/A比率。所示的描述性统计学是平均值±SEM，并且“**”符号表示上方放置有该符号的数据与用媒介物(缓冲液)治疗的WT大鼠的数据之间存在统计学上显著的差异(p<0.01)。
图46A提供了在施用媒介物或AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体的WT大鼠和Dmdmdx大鼠中注射后3个月时，使用具有心尖四腔取向的脉冲多普勒测量的等容舒张时间。显示的描述性统计学是平均值±SEM。
图46B提供了在施用媒介物或AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体的WT大鼠和Dmdmdx大鼠中注射后6个月时，使用具有心尖四腔取向的脉冲多普勒测量的等容舒张时间。所示的描述性统计学是平均值±SEM，并且“$”符号表示上方放置有该符号的数据与用媒介物(缓冲液)治疗的Dmdmdx大鼠的数据之间存在统计学上显著的差异(p<0.05)。
图47提供了在施用媒介物或AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体的WT大鼠和Dmdmdx大鼠中注射后6个月时，使用具有心尖四腔取向的脉冲多普勒测量的减速时间。所示的描述性统计学是平均值±SEM，并且“*”符号表示上方放置有该符号的数据与用媒介物(缓冲液)治疗的WT大鼠的数据之间存在统计学上显著的差异(p<0.05)。
图48A显示了注射后3个月时，不断增加剂量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体对Dmdmdx大鼠的血液AST水平的影响。结果表示为平均值±SEM。使用非参数Kruskal Wallis检验和事后Dunn多重比较检验进行统计学分析。统计学比较了用载体治疗的Dmdmdx大鼠与作为阴性对照的接受缓冲液(媒介物)的WT大鼠(**p<0.01，*p<0.05)。
图48B显示了注射后6个月时不同剂量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体对Dmdmdx大鼠的血液AST水平的影响。结果表示为平均值±SEM。使用非参数Kruskal Wallis检验和事后Dunn多重比较检验进行统计学分析。统计学比较了用载体治疗的Dmdmdx大鼠与作为阴性对照的接受缓冲液(媒介物)的WT大鼠(***p<0.001，**p<0.01)。
图49A显示了注射后3个月时不同剂量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体对Dmdmdx大鼠的血液ALT水平的影响。结果表示为平均值±SEM。使用非参数Kruskal Wallis检验和事后Dunn多重比较检验进行统计学分析。统计学比较了用载体治疗的Dmdmdx大鼠与作为阴性对照的接受缓冲液(媒介物)的WT大鼠(***p<0.001，*p<0.05)或接受缓冲液的Dmdmdx大鼠(##p<0.01，#p<0.05)。
图49B显示了注射后6个月时不同剂量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体对Dmdmdx大鼠的血液ALT水平的影响。结果表示为平均值±SEM。使用非参数Kruskal Wallis检验和事后Dunn多重比较检验进行统计学分析。统计学比较了用载体治疗的Dmdmdx大鼠与作为阴性对照的接受缓冲液(媒介物)的WT大鼠(**p<0.01)。
图50A显示了注射后3个月时不同剂量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体对Dmdmdx大鼠的血液LDH水平的影响。结果表示为平均值±SEM。使用非参数Kruskal Wallis检验和事后Dunn多重比较检验进行统计学分析。统计学比较了用载体治疗的Dmdmdx大鼠与作为阴性对照的接受缓冲液(媒介物)的WT大鼠(***p<0.001，**p<0.01)或接受缓冲液的Dmdmdx大鼠(#p<0.05)。
图50B显示了注射后6个月时不同剂量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体对Dmdmdx大鼠的血液LDH水平的影响。结果表示为平均值±SEM。使用非参数Kruskal Wallis检验和事后Dunn多重比较检验进行统计学分析。统计学比较了用载体治疗的Dmdmdx大鼠与作为阴性对照的接受缓冲液(媒介物)的WT大鼠(**p<0.01)。
图51A显示了注射后3个月时不同剂量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体对Dmdmdx大鼠的血液总肌酸激酶(CK)水平的影响。结果表示为平均值±SEM。使用非参数Kruskal Wallis检验和事后Dunn多重比较检验进行统计学分析。统计学比较了用载体治疗的Dmdmdx大鼠与接受缓冲液(媒介物)的WT大鼠，或者比较了施用3×1014vg/kg载体的Dmdmdx大鼠与接受缓冲液或1×1013vg/kg载体的Dmdmdx大鼠(##p<0.01)。
图51B显示了注射后6个月时不同剂量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体对Dmdmdx大鼠的血液总肌酸激酶(CK)水平的影响。结果表示为平均值±SEM。使用非参数Kruskal Wallis检验和事后Dunn多重比较检验进行统计学分析。统计学比较了用载体治疗的Dmdmdx大鼠与作为阴性对照的接受缓冲液(媒介物)的WT大鼠(***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05)，或者比较了施用3×1014vg/kg载体的Dmdmdx大鼠与接受1×1013vg/kg载体的Dmdmdx大鼠($p<0.05)。
图52A提供了媒介物或载体的注射日(D0)与注射后3个月处死时之间的总肌酸激酶(CK)进展。实心条形表示来自D0的数据，而阴影条形表示3个月时的数据。结果表示为平均值±SEM。
图52B提供了媒介物或载体的注射日(D0)与注射后6个月处死时之间的总肌酸激酶(CK)进展。实心条形表示来自D0的数据，而阴影条形表示6个月时的数据。结果表示为平均值±SEM。
图53A提供了用1×1014vg/kg的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体治疗的年龄较大的Dmdmdx大鼠与用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠和WT大鼠相比较的平均绝对最大前肢握力。在4月龄时注射的大鼠注射后3个月时，或当所述大鼠约7月龄时进行测试。结果表示为平均值±SEM。统计学比较了用载体治疗的Dmdmdx大鼠与用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠(*p<0.01)。
图53B提供了用1×1014vg/kg的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体治疗的年龄较大的Dmdmdx大鼠与用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠和WT大鼠相比较的相对于体重的平均最大前肢握力。在4月龄时注射的大鼠注射后3个月时，或当所述大鼠约7月龄时进行测试。结果表示为平均值±SEM。统计学比较了用载体治疗的Dmdmdx大鼠与用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠(*p<0.01)。
图53C显示了对用1×1014vg/kg的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体治疗的年龄较大的Dmdmdx大鼠与用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠和WT大鼠相比较的前肢握力的进展，该前肢握力作为肌肉疲劳的度量。通过测量5次平均最大握力来进行测试，其中各次试验之间具有短间期。在4月龄时注射的大鼠注射后3个月时，或当所述大鼠约7月龄时进行测试。结果是相对于体重且作为平均值±SEM提供的。统计学比较了用载体治疗的Dmdmdx大鼠与接受媒介物的WT大鼠(*p<0.05)和接受媒介物的Dmdmdx大鼠(¤¤p<0.01)，并且比较了用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠的后续试验与试验1(§§p<0.01，§§§p<0.001)。
图54A提供了用1×1014vg/kg的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体治疗的年龄较大的Dmdmdx大鼠与用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠和WT大鼠相比较的平均绝对最大前肢握力。在6月龄时注射的大鼠注射后3个月时，或当所述大鼠约9月龄时进行测试。结果表示为平均值±SEM。统计学比较了用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠与用媒介物治疗的WT大鼠(**p<0.01)。
图54B提供了用1×1014vg/kg的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体治疗的年龄较大的Dmdmdx大鼠与用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠和WT大鼠相比较的相对于体重的平均最大前肢握力。在6月龄时注射的大鼠注射后3个月时，或当所述大鼠约9月龄时进行测试。结果表示为平均值±SEM。统计学比较了用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠与用媒介物治疗的WT大鼠(*p<0.05)，或比较了用载体治疗的Dmdmdx大鼠与用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠(¤p<0.05)。
图54C显示了对用1×1014vg/kg的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体治疗的年龄较大的Dmdmdx大鼠与用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠和WT大鼠相比较的前肢握力的进展，该前肢握力作为肌肉疲劳的度量。通过测量5次平均最大握力来进行测试，其中各次试验之间具有短间期。在6月龄时注射的大鼠注射后3个月时，或当所述大鼠约9月龄时进行测试。结果是相对于体重且作为平均值±SEM提供的。统计学比较了用载体治疗的Dmdmdx大鼠与接受媒介物的Dmdmdx大鼠(¤p<0.05)，比较了用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠与接受媒介物的WT大鼠(**p<0.01，***p<0.001)，以及比较了用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠的试验5与试验1(§§p<0.01)。
图55A-55C提供了小型抗肌萎缩蛋白质Δ3990(SEQ ID NO:27)与小型抗肌萎缩蛋白质Dys3978(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列之间的比对。
图56A-56I提供了编码小型抗肌萎缩蛋白Δ3990的核酸序列(SEQ ID NO:28)与编码小型抗肌萎缩蛋白Dys3978的人密码子优化的核酸序列(称为Hopti-Dys3978；SEQ IDNO:1)之间的比对，所述编码小型抗肌萎缩蛋白Δ3990的核酸序列(SEQ ID NO:28)来源于编码人抗肌萎缩蛋白质的野生型核酸序列。
具体实施方式
现在将参考附图描述本发明，附图中显示了本发明的优选实施方案。然而，本发明可以以不同的形式具体实施，并且不应该被解释为限于在此阐述的实施方案。相反，提供这些实施方案是为了使本公开完全和完整，并且将本发明的范围完全传达给本领域的技术人员。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。本文中用于描述本发明的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而不旨在限制本发明。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都全文以引用方式并入。
除非另外特别指明，否则本文中的核苷酸序列仅以从左到右为5'到3'方向的单链呈现。核苷酸和氨基酸在本文中以由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的方式表示，或者(对于氨基酸)由单字母代码或三字母代码表示，所述两种表示均符合37 CFR§1.822和已建立的用法。参见例如PatentIn User Manual，99-102，99-102(1990年11月)(U.S.Patentand Trademark Office(美国专利商标局))。
除非另外指明，否则可以使用本领域的技术人员已知的标准方法来构建重组细小病毒构建体和AAV(rAAV)构建体、表达细小病毒Rep和/或Cap序列的包装载体，以及瞬时和稳定转染的包装细胞。此类技术是本领域的技术人员已知的。参见例如SAMBROOK等人，分子克隆：实验室手册(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)，第2版(Cold SpringHarbor,NY,1989)；AUSUBEL等人，分子生物学中的现有方案(CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY)(Green Publishing Associates,Inc.和John Wiley&Sons,Inc.,NewYork)。
此外，本发明还预期在本发明的一些实施方案中，可排除或省略本文所述的任何特征或特征组合。
为了进一步说明，如果例如说明书指示特定氨基酸可选自A、G、I、L和/或V，则该语言还指示该氨基酸可以选自这些氨基酸的任何子集，例如A、G、I或L；A、G、I或V；A或G；只有L；等等，如同每个此类子组合在此明确阐述一样。此外，该语言还指示可以放弃指定氨基酸中的一种或多种氨基酸。例如，在特定实施方案中，氨基酸不是A、G或I；不是A；不是G或V；等等，如同每个此类可能的放弃在此明确阐述一样。
定义
以下术语用于本文的说明书和所附权利要求书中。
除非上下文另外明确指明，否则单数形式“一(a/an)”也旨在包括复数形式。
此外，如本文所用的术语“约”当指诸如多核苷酸或多肽序列的长度的量、剂量、时间、温度等可测量值时，旨在涵盖指定量的20％、10％、5％、1％、0.5％，或甚至0.1％的变化。
同样如本文所用，“和/或”是指并且涵盖相关所列项目中的一者或多者的任何和所有可能组合，以及在替代性地解释时(“或”)的组合的缺乏。
如本文所用的术语“腺相关病毒”(AAV)包括但不限于AAV 1型(AAV1)、AAV 2型(AAV2)、AAV 3型(AAV3，包括3A型和3B型)、AAV 4型(AAV4)、AAV 5型(AAV5)、AAV 6型(AAV6)、AAV 7型(AAV7)、AAV 8型(AAV8)、AAV 9型(AAV9)、AAV 10型(AAV10)、AAV 11型(AAV11)、AAV 12型(AAV12)、AAV 13型(AAV13)、禽AAV ATCC VR-865、禽AAV株DA-1、Bb1、Bb2、Ch5、Cy2、Cy3、Cy4、Cy5、Cy6、Hu1、Hu10、Hu11、Hu13、Hu15、Hu16、Hu17、Hu18、Hu19、Hu2、Hu20、Hu21、Hu22、Hu23、Hu24、Hu25、Hu26、Hu27、Hu28、Hu29、Hu3、Hu31、Hu32、Hu34、Hu35、Hu37、Hu39、Hu4、Hu40、Hu41、Hu42、Hu43、Hu44、Hu45、Hu46、Hu47、Hu48、Hu49、Hu51、Hu52、Hu53、Hu54、Hu55、Hu56、Hu57、Hu58、Hu6、Hu60、Hu61、Hu63、Hu64、Hu66、Hu67、Hu7、Hu9、HuLG15、HuS17、HuT17、HuT32、HuT40、HuT41、HuT70、HuT71、HuT88、Pi1、Pi2、Pi3、Rh1、Rh10、Rh13、Rh2、Rh25、Rh32、Rh33、Rh34、Rh35、Rh36、Rh37、Rh38、Rh40、Rh43、Rh48、Rh49、Rh50、Rh51、Rh52、Rh53、Rh54、Rh55、Rh57、Rh58、Rh61、Rh62、Rh64、Rh74、Rh8、蛇AAV、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、绵羊AAV、山羊AAV、虾AAV、AAV1.1、AAV2.5、AAV6.1、AAV6.3.1、AAV9.45、RHM4-1(WO 2015/013313中的SEQ ID NO:5)、AAV2-TT、AAV2-TT-S312N、AAV3B-S312N、AAV-LK03，以及目前已知的或随后发现的任何其他AAV。参见例如Fields等人，VIROLOGY，第2卷，第69章(第4版，Lippincott-Raven Publishers)。衣壳可以来源于美国专利号7,906,111；Gao等人，2004,J.Virol.78:6381；Moris等人，2004,Virol.33:375；WO 2013/063379；WO 2014/194132中公开的许多AAV血清型；并且包括在WO 2015/121501中公开的真实型AAV(AAV-TT)变体，以及在WO 2015/013313中公开的RHM4-1、RHM15-1至RHM15-6及其变体，并且本领域的技术人员将知道可能存在执行相同或相似的功能或者可能包含来自两个或更多个AAV衣壳的组分的尚未识别的其他变体。全部的AAV cap蛋白质包含VP1、VP2和VP3。包含编码AAV衣壳蛋白质的核苷酸序列的开放阅读框可包含少于全部的AAV cap蛋白质，或者可以提供全部的AAV cap蛋白质。
以及现在已知或随后发现的任何其他AAV。参见例如FIELDS等人，VIROLOGY，第2卷，第69章(第4版，Lippincott-Raven Publishers)。已经鉴别出了许多相对新的AAV血清型和进化枝(参见例如Gao等人，(2004)J.Virol.78:6381；Moris等人，(2004)Virol.33-:375).
AAV是一种小的无包膜病毒，具有直径约20-30nm的二十面体衣壳。AAV在没有来自其他病毒(例如，腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒和人乳头瘤病毒)的所谓辅助蛋白的贡献的情况下无法复制，因此被归入细小病毒科内的特殊属中，称为依赖病毒属(因为它们依赖于其他病毒进行复制)。尽管已发现了许多不同的AAV血清型，并且许多人产生抗一种或多种AAV血清型的抗体(表明AAV感染的广泛历史)，但已知没有疾病是由AAV引起的，表明AAV对人是非致病性的。
尽管已经发现了许多不同的AAV血清型，但是最佳表征的一种AAV血清型是AAV2，并且以下对AAV生物学的论述集中于一些已经关于AAV2习得的内容。其他AAV血清型的生命周期被认为是相似的，尽管细节可能不同。提供AAV2或任何其他AAV血清型在细胞内感染和复制的具体细节仅仅是为了帮助理解本文公开的发明，而不是以任何方式限制它们的范围。即使稍后发现所述信息中的某些信息不正确或不完整，也不应将其解释为减损本文公开和要求保护的发明的实用性或实现。关于AAV生命周期的进一步信息可以在M.Goncalves,Virol J 2:43(2005)，MD Weitzman和RM Linden，腺相关病毒生物学(Adeno-Associated Virus Biology)，第1章，第1-23页，腺相关病毒方法和方案(Adeno-Associated Virus Methods and Protocols)，RO Snyder和P Moullier编辑，HumanaPress(2011)，GE Berry和A Asokan，Curr Opin Virol 21:54-60(2016)，以及其中引用的参考文献中找到。
AAV2的野生型基因组是长度为约4.7千碱基的线性DNA。虽然大多数是单链的，但是基因组的5'和3'末端由所谓的反向末端重复序列(ITR)组成，每个ITR为145个碱基对长并且含有回文序列，所述回文序列通过经典的Watson-Crick碱基配对自退火而形成T形发夹结构。这些结构中的一种结构含有游离的3'羟基，该游离的3'羟基依赖于细胞DNA聚合酶而允许通过自引发链置换机制启动病毒DNA复制。参见例如M.Goncalves，腺相关病毒：从缺陷病毒到有效载体(Adeno-associated virus:from defective virus to effectivevector)，Virology J 2:43(2005)。由于单链病毒基因组在受感染细胞中被复制然后被包装到衣壳中的机制，正(有义或编码)和负(反义或非编码)链以相同的效率包装成单独的粒子。
除了侧翼ITR外，野生型AAV2基因组还包含两种基因rep和cap，这两种基因通过有效使用替代启动子和剪接而分别编码四种复制蛋白质(Rep 78、Rep 68、Rep 52和Rep 40)和三种衣壳蛋白质(VP1、VP2和VP3)。大型复制蛋白质Rep 78和Rep 68是多功能的并且在AAV转录、病毒DNA复制和病毒基因组到人染色体19中的位点特异性整合中起作用。较小的Rep蛋白质参与将病毒基因组包装到受感染的细胞核中的病毒衣壳内。这三种衣壳蛋白质是通过选择性剪接和使用选择性翻译起始位点的组合产生的，因此所有三种蛋白质都朝向它们的羧基末端共享序列，但是VP2包含VP3没有的附加氨基末端序列，并且VP1包含VP2和VP3均没有的附加氨基末端序列。据估计，衣壳以约1:1:10的VP1:VP2:VP3化学计量比含有总共60种衣壳蛋白质，但是这些比可以明显不同。
尽管AAV具有相对较小的尺寸并且因此携带异源基因的较小能力，但AAV已被鉴别为基因疗法的主要病毒载体。与已提出作为基因疗法载体的其他病毒相比，使用AAV的优点包括AAV具有支持在转导细胞中进行长期基因表达、转导分裂细胞和非分裂细胞、取决于血清型转导各种不同类型细胞的能力，不能在没有辅助病毒的情况下进行复制，并且明显缺乏与野生型感染相关的致病性。
由于它们的小尺寸，AAV衣壳可以物理地容纳长度为至多约4.7-5.0千碱基的单链DNA基因组。在不修饰基因组的情况下，没有足够的空间来包含异源基因(诸如治疗性蛋白质的编码序列)和基因调控元件(诸如启动子和任选的增强子)。为了产生更多空间，可以去除rep基因和cap基因并用所需的异源序列替换，只要保留侧翼ITR即可。rep基因和cap基因的功能可以反式提供在不同的DNA件上。相比之下，ITR是唯一必须与异源序列顺式保持的AAV病毒元件。将ITR与异源基因组合并将rep基因和cap基因取出到缺乏ITR的不同质粒也可以防止在产生用于基因疗法的AAV载体的同时产生感染性的野生型AAV。去除rep和cap也意味着用于基因疗法的AAV载体不能在它们转导的细胞中复制。
在一些实施方案中，AAV载体的基因组是侧翼为AAV ITR的线性单链DNA。必须通过细胞DNA聚合酶将单链DNA基因组转化为双链形式，然后所述基因组才能够支持异源基因的转录和翻译，所述细胞DNA聚合酶利用自引发ITR中的一个自引发ITR的游离3'-OH来启动第二链合成。在替代实施方案中，相反极性的全长单链基因组可以退火以产生全长双链基因组，并且当携带相反极性基因组的多个AAV载体同时转导同一细胞时可以产生。在形成双链载体基因组后，通过任何机制，细胞基因转录机制可以作用于双链DNA以表达异源基因。
在其他实施方案中，载体基因组可以设计为自身互补的(scAAV)，在每个末端具有野生型ITR并且在中间具有突变的ITR。参见例如McCarty,DM等人，腺相关病毒末端重复序列(TR)突变体产生自身互补载体以克服体内转导的限速步骤(Adeno-associated virusterminal repeat(TR)mutant generates self-complementary vectors to overcomethe rate-limiting step to transduction in vivo).Gene Ther.10:2112–18(2003)。已经提出，在进入细胞后，自身互补的AAV基因组可以从中间的ITR开始自退火以形成双链基因组，而不需要进行从头DNA复制。显示该方法导致异源基因的更有效转导和更快表达，但使得可以使用的异源基因的量减少了约一半。
已经开发了产生用于基因疗法的AAV载体的不同策略，但最常见的一种策略是三重转染技术，在该技术中将三种不同的质粒转染到生产细胞中。参见例如N.Clement和J.Grieger,Mol Ther Methds Clin Dev,3:16002(2016)，Grieger,JC等人，Mol Ther 24(2):287-97(2016)，以及其中引用的参考文献。在该技术中，建立包含载体基因组序列的质粒，所述载体基因组序列包含例如异源启动子和任选的增强子，以及用于表达所需RNA或蛋白质的异源基因，侧翼为左ITR和右ITR。将载体质粒共转染到生产细胞(诸如HEK293细胞)中，其中第二质粒含有rep基因和cap基因，并且第三质粒含有复制和包装载体基因组到AAV衣壳中所需的腺病毒(或其他病毒)辅助基因。在该技术的备选实施方案中，rep、cap和腺病毒辅助基因都位于相同的质粒上，并且将两种质粒共转染到生产细胞中。腺病毒辅助基因的示例包括E1a、E1b、E2a、E4orf6和VA RNA基因。对于许多AAV血清型，AAV2 ITR可以替代天然ITR，而不会显著损害载体基因组被复制并包装到非AAV2衣壳中的能力。该种被称为假分型的方法仅需要使用含有来自其他血清型的rep基因和cap基因的rep/cap质粒。因此例如，AAV基因疗法载体可以使用AAV9衣壳和含有侧接有异源基因(诸如小型抗肌萎缩蛋白)的AAV2 ITR的载体基因组(其可以命名为“AAV2/9”)。在细胞产生AAV粒子后，可以使用本领域已知的标准技术收集和纯化所述AAV粒子，诸如以CsCl梯度超速离心，或使用各种类型的色谱柱。
本发明的细小病毒粒子和基因组可以来自但不限于AAV。各种AAV血清型和自主型细小病毒的基因组序列，以及天然ITR、Rep蛋白质和衣壳亚基的序列是本领域中已知的。此类序列可以在文献中或在诸如GenBank的公共数据库中找到。参见例如GenBank登录号NC_002077、NC_001401、NC_001729、NC_001863、NC_001829、NC_001862、NC_000883、NC_001701、NC_001510、NC_006152、NC_006261、AF063497、U89790、AF043303、AF028705、AF028704、J02275、J01901、J02275、X01457、AF288061、AH009962、AY028226，AY028223、AY631966、AX753250、EU285562、NC_001358、NC_001540、AF513851、AF513852和AY530579；所述GenBank登录号的公开内容以引用方式并入本文以教导细小病毒和AAV核酸序列以及氨基酸序列。还参见例如Bantel-Schaal等人，(1999)J.Virol.73:939；Chiorini等人，(1997)J.Virol.71:6823；Chiorini等人，(1999)J.Virol.73:1309；Gao等人，(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 99:11854；Moris等人，(2004)Virol.33-:375-383；Mori等人，(2004)Virol.330:375；Muramatsu等人，(1996)Virol.221:208；Ruffing等人，(1994)J.Gen.Virol.75:3385；Rutledge等人，(1998)J.Virol.72:309；Schmidt等人，(2008)J.Virol.82:8911；Shade等人，(1986)J.Virol.58:921；Srivastava等人，(1983)J.Virol.45:555；Xiao等人，(1999)J.Virol.73:3994；国际专利公开WO 00/28061、WO 99/61601、WO 98/11244；以及美国专利号6,156,303；所述参考文献的公开内容以引入方式并入本文用于教导细小病毒序列和AAV核酸序列以及氨基酸序列。来自AAV1、AAV2和AAV3的ITR序列由Xiao,X.,(1996)，“腺相关病毒(AAV)DNA复制和整合的表征(Characterizationof Adeno-associated virus(AAV)DNA replication and integration)，”博士论文，University of Pittsburgh,Pittsburgh,PA(匹兹堡大学，匹兹堡，PA)(其全文并入本文)提供。
如本文所用，AAV对细胞的“转导”是指AAV介导将遗传物质转移到细胞内。参见例如FIELDS等人，VIROLOGY，第2卷，第69章(第3版，Lippincott-Raven Publishers)。
术语“5'部分”和“3'部分”是用于定义两个或更多个元件之间的空间关系的相对术语。因此例如，多核苷酸的“3'部分”表示多核苷酸的一个区段在另一个区段的下游。术语“3'部分”并不旨在指明该区段必须位于多核苷酸的3'末端，或者甚至必须位于多核苷酸的3'半部，尽管它可能是在多核苷酸的3'半部。同样地，多核苷酸的“5'部分”表示多核苷酸的一个区段在另一区段的上游。术语“5'部分”并不旨在指明该区段必须位于多核苷酸的5'末端，或者甚至必须位于多核苷酸的5'半部，尽管它可能是在多核苷酸的5'半部。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“多肽”涵盖肽和蛋白质。
“多核苷酸”是核苷酸的线性序列，其中每个单体单元的3'-位通过磷酸基团与相邻单体单元的5'-位连接。多核苷酸可以是RNA(仅含有RNA核苷酸)、DNA(仅含有DNA核苷酸)、RNA和DNA杂合体(含有RNA核苷酸和DNA核苷酸)，以及含有天然存在的和/或非天然存在的核苷酸的其他杂合体。多核苷酸中核苷酸的线性碱基序列称为“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核碱基序列”，或者有时仅称为多核苷酸的“序列”。通常，所述碱基序列提供为从多核苷酸的5'末端开始并在多核苷酸的3'末端结束。如本领域中已知的，多核苷酸可以采用诸如自身互补区的二级结构。多核苷酸还可以通过经典的Watson-Crick碱基配对或本领域的普通技术人员熟悉的其他机制而与完全或部分互补的多核苷酸杂交。
如本文所用，“基因”是编码多肽或蛋白质的多核苷酸区段，通常但不一定是DNA。在一些实施方案中，基因可被内含子中断。在一些实施方案中，由于诸如可变剪接、使用替代起始密码子之类的机制或本领域的普通技术人员熟悉的其他生物学机制，多核苷酸可编码多于一种多肽或蛋白质。术语“开放阅读框”，缩写为“ORF”，是指编码多肽或蛋白质的多核苷酸部分。
如本文所用的术语“密码子优化的”是指这样的基因编码序列，所述基因编码序列已通过用针对相同(同义)氨基酸的密码子取代编码序列(例如，在野生型序列中，包括例如抗肌萎缩蛋白或小型抗肌萎缩蛋白的编码序列)中通常存在的一个或多个密码子而被优化以增加表达。以这种方式，由该基因编码的蛋白质是相同的，但该基因或相应mRNA的基础核碱基序列是不同的。在一些实施方案中，优化用更频繁出现的同义密码子取代一个或多个罕用密码子(即，在特定物种的细胞中相对不频繁出现的tRNA密码子)，以提高翻译效率。例如，在人密码子优化中，将编码序列中的一个或多个密码子用在人细胞中更频繁出现的针对相同氨基酸的密码子取代。密码子优化还可以通过可以提高转录和/或翻译效率的其他机制来增加基因表达。策略包括但不限于增加总GC含量(即，鸟嘌呤和胞嘧啶在整个编码序列中的百分比)、降低CpG含量(即，CG或GC二核苷酸在编码序列中的数目)、去除潜在的剪接供体或受体位点，和/或添加或去除核糖体进入位点，诸如Kozak序列。理想地，密码子优化的基因表现出改善的蛋白质表达，例如，与由在其他方面类似的细胞中的野生型基因提供的蛋白质的表达水平相比，由密码子优化的基因编码的蛋白质在细胞中以可检测的更高水平表达。
如本文所用的术语“序列同一性”具有本领域中的标准含义。如本领域中已知的，许多不同的程序可用于鉴别多核苷酸或多肽是否与已知序列具有序列同一性或相似性。序列同一性或相似性可以使用本领域已知的标准技术来确定，所述标准技术包括但不限于Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部序列同一性算法；通过Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48:443(1970)的序列同一性比对算法；通过Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性搜索方法；通过这些算法(威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,WI)的计算机化具体实施；由Devereux等人，Nucl.Acid Res.12:387(1984)描述的最佳拟合序列程序，该最佳拟合序列程序优选使用默认设置；或通过检查。
有用算法的一个示例是PILEUP。PILEUP使用渐进的双序列比对从一组相关序列中创建多重序列比对。它还可以绘制树图，所述树图显示了用于创建比对的聚类关系。PILEUP使用Feng和Doolittle,J.Mol.Evol.35:351(1987)的渐进比对方法的简化；该方法类似于由Higgins和Sharp,CABIOS 5:151(1989)所描述的方法。
有用算法的另一个示例是在Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403(1990)和Karlin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873(1993)中描述的BLAST算法。特别有用的BLAST程序是从Altschul等人，Meth.Enzymol.,266:460(1996)；blast.wustl/edu/blast/README.html获得的WU-BLAST-2程序。WU-BLAST-2使用多个搜索参数，所述搜索参数优选设置为默认值。参数是动态值，并且由程序本身根据特定序列的组成和正在搜索关注序列所针对的特定数据库的组成来建立；然而，可以调整这些值以增加灵敏度。
另一种有用的算法是有空位的BLAST，如由Altschul等人，Nucleic AcidsRes.25:3389(1997)报道的。
氨基酸序列同一性百分比值由匹配的相同残基的数量除以比对区域中“较长”序列的残基总数而确定的。“较长”序列是在比对区域中具有最多实际残基的序列(由WU-Blast-2引入以最大化比对得分的空位被忽略)。
以类似的方式，核酸序列同一性百分比定义为候选序列中核苷酸残基与本文特别公开的多核苷酸中的核苷酸相同的百分比。
比对可以包括在待比对的序列中引入空位。另外，对于含有比本文特别公开的多核苷酸更多或更少的核苷酸的序列，应理解，在一个实施方案中，序列同一性百分比将基于相对于核苷酸总数的相同核苷酸的数目来确定。因此，例如，在一个实施方案中，比本文特别公开的序列更短的序列的序列同一性将使用所述较短序列中的核苷酸数目来确定。在同一性百分比计算中，相对权重未分配给序列变异的各种表现形式，诸如插入、缺失、替换等。
在一个实施方案中，仅同一被评分为正(+1)，并且包括空位的所有形式的序列变异被分配值“0”，这消除了如下所述的序列相似性计算对加权标度或参数的需要。例如，可以通过将匹配的相同残基的数量除以“较短”序列在比对区域中的残基总数并乘以100来计算序列同一性百分比。“较长”序列是在比对区域中具有最多实际残基的序列。
“基本同源性”或“基本相似性”是指当提及一个核酸或其片段时，表明当其以适当的核苷酸插入或缺失与另一核酸(或其互补链)最佳比对时，在该序列的至少约95％至99％中存在核苷酸序列同一性。
如本文所用，“分离的”多核苷酸(例如，“分离的DNA”或“分离的RNA”)是指这样的多核苷酸，所述多核苷酸与天然存在的生物或病毒的至少一些其他组分(例如，细胞或病毒结构组分或通常发现与该多核苷酸相关的其他多肽或核酸)分离或基本上不含前述至少一些其他组分。
同样，“分离的”多肽是指这样的多肽，所述多肽与下述分离或基本上不含下述：天然存在的生物或病毒的至少一些其他组分(例如，细胞或病毒结构组分或通常发现与该多肽相关的其他多肽或核酸)。
“治疗性多肽”是可以缓解或减轻由细胞或受试者中的蛋白质缺失或缺陷引起的症状的多肽。或者，“治疗性多肽”是在其他方面赋予受试者益处的多肽，所述益处为例如抗癌作用或对移植物存活率的改善。
如本文所用的术语“经修饰的”当应用于多核苷酸或多肽序列时是指序列由于一个或多个缺失、添加、替换或它们的任何组合而与野生型序列不同。
如本文所用，“分离”或“纯化”(或语法等同物)病毒载体意指病毒载体至少部分地与起始材料中的至少一些其他组分分离。
术语“治疗(treat/treating/treatment)”(及其语法变体)意指受试者病情的严重程度降低、至少部分改善或稳定，和/或在至少一种临床症状方面实现了某些缓解、缓和、减轻或稳定化，和/或疾病或病症的进展延迟。
术语“预防(prevent/preventing/prevention)”(及其语法变体)是指预防和/或延迟受试者的疾病、病症和/或临床症状的发作，和/或相对于没有本发明方法的情况下，疾病、病症和/或临床症状的发作严重性降低。预防可以是完全的，例如完全没有疾病、病症和/或临床症状。预防也可以是部分的，使得受试者的疾病、病症和/或临床症状的发生和/或发作的严重性小于在没有本发明的情况下会发生的。
如本文所用的“治疗有效”量是足以为受试者提供一些改善或益处的量。或者说，“治疗有效”量是将对受试者的至少一种症状提供一些缓解、缓和、减轻或稳定化的量。本领域的技术人员将理解，疗效不需要是完全的或治愈的，只要为受试者提供一些益处即可。
如本文所用的“预防有效”量是这样的量，所述量足以预防和/或延迟受试者的疾病、病症和/或临床症状发作，和/或相对于没有本发明方法的情况下会发生的，使受试者的疾病、病症和/或临床症状发作的严重性减轻和/或延迟。本领域的技术人员将理解，预防水平不需要是完全的，只要向受试者提供一些益处即可。
术语“异源”或“外源”核苷酸或核酸序列在本文中可互换使用，并且是指非天然存在于病毒或细胞中的核酸序列。在一些实施方案中，异源核酸包含编码所关注多肽或非翻译RNA(例如，用于递送到细胞或受试者)的开放阅读框。
如本文所用的术语“病毒载体(virus vector/viral vector)”、“基因递送载体”或有时仅“载体”是指这样的病毒体(virion)或病毒粒子，所述病毒体或病毒粒子作为核酸递送运载体起作用并且包含包装在所述病毒体或病毒粒子内的载体基因组。载体可以是感染性的或非感染性的。非感染性载体在没有外源添加因子的情况下不能自我复制。载体可以是包含AAV衣壳的AAV粒子或病毒体，在所述AAV衣壳中包装有AAV载体基因组。这些载体在本文中也可称为“重组AAV”(缩写为“rAAV”)载体、粒子或病毒体。
载体基因组是用于包装在载体粒子或病毒体内以递送到细胞(该细胞可称为“靶细胞”)内的多核苷酸。通常，将载体基因组工程化为含有异源核酸序列(诸如基因)，以供递送到靶细胞中。载体基因组还可含有一个或多个核酸序列，该一个或多个核酸序列作为调控元件起作用以控制异源基因在靶细胞中的表达。载体基因组还可含有载体产生和/或功能所需的野生型或经修饰的病毒核酸序列，所述载体产生和/或功能为诸如但不限于载体基因组在宿主中复制和包装到载体粒子内。在一些实施方案中，载体基因组是“AAV载体基因组”，其能够被包装到AAV衣壳中。在一些实施方案中，AAV载体基因组包含一个或两个反向末端重复序列(ITR)，所述ITR与异源基因为顺式以支持复制和包装。AAV载体生产所需的所有其他结构和非结构蛋白编码序列可以反式提供(例如，从质粒，或通过将序列稳定整合到宿主细胞中)。在某些实施方案中，AAV载体基因组包含至少一个ITR(例如，AAV ITR)，任选地两个ITR(例如，两个AAV ITR)，所述ITR通常位于载体基因组的5'末端和3'末端并且侧接异源核酸序列，而不必与异源核酸序列邻接。ITR可以彼此相同或不同，并且可以来自相同或不同的AAV血清型。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”、“转化细胞”和“转导细胞”，包括初次转化细胞和由初次转化细胞衍生的后代，而与传代次数无关。为了生产AAV载体，某些宿主细胞可以用作“生产”细胞或“包装”细胞，所述细胞含有组装包含衣壳和载体基因组的功能性病毒粒子所需的所有基因。如本领域的普通技术人员应理解的，不同的宿主细胞可以有用地用作生产细胞，诸如HEK293细胞或Pro10细胞系，但是其他细胞也是可能的。病毒体装配所需的基因包括如本文其他地方所述的载体基因组、AAV rep基因和AAVcap基因，以及来自其他病毒(包括但不限于腺病毒)的某些辅助基因。正如普通技术人员所理解的，可以将AAV生产的必需基因以各种方式(包括但不限于转染一个或多个质粒)引入生产细胞，然而，所述基因中的某些基因可能已经存在于所述生产细胞中(整合到基因组中或运载在附加体上)。
术语“反向末端重复序列”或“ITR”包括任何回文病毒末端重复序列或合成序列，所述序列形成发夹结构并作为反向末端重复序列起作用(即，介导某些病毒功能，诸如复制、病毒包装、整合和/或前病毒拯救等)。ITR可以是AAV ITR或非AAV ITR。例如，非AAV ITR序列(诸如其他细小病毒(例如，犬细小病毒、牛细小病毒、小鼠细小病毒、猪细小病毒、人细小病毒B-19)的ITR序列)的非AAV ITR序列)或充当SV40复制起点的SV40发夹可用作ITR，所述ITR可以通过截短、替换、缺失、插入和/或添加进一步修饰。此外，ITR可以是部分或完全合成的，诸如如在Samulski等人的美国专利号5,478,745中所述的“双D序列”。还参见FIELDS等人，VIROLOGY，第2卷，第69章和第70章(第4版，Lippincott-Raven Publishers)。
“AAV反向末端重复序列”或“AAV ITR”可以来自任何AAV，包括但不限于血清型1、2、3a、3b、4、5、6、7、8、9、10、11或13、蛇AAV、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、绵羊AAV、山羊AAV、虾AAV，或现在已知或随后发现的任何其他AAV。AAV ITR不需要具有天然末端重复序列(例如，天然AAV ITR序列可以通过插入、缺失、截短和/或错义突变而改变)，只要末端重复序列介导所需功能，例如复制、病毒包装、持续感染和/或前病毒拯救等。AAV2 ITR的序列为145个碱基对长，并且在本文中提供为SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15。
“顺式基序”包括保守序列，诸如在基因组序列的末端处或附近存在且被识别用于复制起始的保守序列；可能用于转录起始、剪接或终止的内部位置处的潜在启动子或序列。
关于侧接有其他元件的序列，“侧接”表示相对于该序列在上游和/或下游，即5'和/或3'存在一个或多个侧翼元件。术语“侧接”并非旨在表示序列必然是邻接的。例如，在编码转基因的核酸与侧翼元件之间可能存在间插序列。“侧接”有两个其他元件(例如，TR)的序列(例如，转基因)表示一个元件位于该序列的5'，而另一个元件位于该序列的3'；然而，它们之间可能存在间插序列。
细胞的“转染”意味着将遗传物质导入细胞中以便对所述细胞进行遗传修饰。转染可以通过本领域已知的各种手段完成，诸如磷酸钙、聚乙烯亚胺、电穿孔等。
“基因转移”或“基因递送”是指将外源DNA可靠地插入宿主细胞中的方法或系统。此类方法可导致非整合转移DNA的瞬时表达，转移的复制子(例如附加体)的染色体外复制和表达，或转移的遗传物质整合到宿主细胞的基因组DNA中。
“转基因”用于表示整合入载体(包括病毒载体)用于递送到靶细胞(在本文中也称为“宿主细胞”)并包括在所述靶细胞中表达的任何异源核苷酸序列；以及相关的表达控制序列，诸如启动子。本领域的技术人员应理解，将基于促进转基因在靶细胞中表达的能力来选择表达控制序列。转基因的示例是编码治疗性多肽的核酸。
本发明的病毒载体还可以是“靶向”病毒载体(例如，具有定向嗜性)和/或“杂合”细小病毒(即，其中病毒ITR和病毒衣壳来自不同的细小病毒)，如在国际专利公开WO 00/28004和Chao等人，(2000)Mol.Therapy 2:619中所述。
此外，病毒衣壳或基因组元件可含有其他修饰，包括插入、缺失和/或替换。
如本文所用，细小病毒或AAV“Rep编码序列”表示编码介导病毒复制和新病毒粒子产生的细小病毒或AAV非结构蛋白质的核酸序列。细小病毒和AAV复制基因和蛋白质已在例如FIELDS等人，VIROLOGY，第2卷，第69章和第70章(第4版，Lippincott-Raven Publishers)中描述。
“Rep编码序列”不需要编码所有的细小病毒或AAV Rep蛋白质。例如，对于AAV，Rep编码序列不需要编码所有四种AAV Rep蛋白质(Rep78、Rep 68、Rep52和Rep40)，事实上，据信AAV5仅表达剪接的Rep68和Rep40蛋白质。在代表性实施方案中，Rep编码序列至少编码病毒或载体基因组复制和包装成新病毒体所必需的那些复制蛋白质。Rep编码序列通常将编码至少一种大Rep蛋白质(即，Rep78/68)和一种小Rep蛋白质(即，Rep52/40)。在特定实施方案中，Rep编码序列编码AAV Rep78蛋白质和AAV Rep52和/或Rep40蛋白质。在其他实施方案中，Rep编码序列编码Rep68蛋白质和Rep52蛋白质和/或Rep40蛋白质。在又一个实施方案中，Rep编码序列编码Rep68蛋白质和Rep52蛋白质、Rep68蛋白质和Rep40蛋白质、Rep78蛋白质和Rep52蛋白质，或Rep78蛋白质和Rep40蛋白质。
如本文所用的术语“大Rep蛋白质”是指Rep68和/或Rep78。要求保护的本发明的大Rep蛋白质可以是野生型或合成的。野生型大Rep蛋白质可来自任何细小病毒或AAV，包括但不限于血清型1、2、3a、3b、4、5、6、7、8、9、10、11或13，或现在已知或随后发现的任何其他AAV。合成的大Rep蛋白质可以通过插入、缺失、截短和/或错义突变而改变。
在天然AAV基因组中，由单个基因通过使用两种不同的启动子和可变剪接来编码不同的Rep蛋白质。然而，出于AAV载体生产的目的，Rep蛋白质可以在生产细胞中从单个基因表达，或者从不同的多核苷酸表达，每种待表达的Rep蛋白质一种序列。因此，例如，可以工程化Rep编码基因以使p5启动子或p19启动子失活，以便相应的经修饰基因表达仅小Rep蛋白质或仅大Rep蛋白质。当病毒启动子中的一种病毒启动子在宿主细胞中无活性时(在这种情况下可以替代地使用组成型活性的启动子)，或者在希望在单独的转录和/或翻译控制元件的控制下以不同水平表达Rep蛋白质的情况下，从不同基因表达大Rep蛋白质和小Rep蛋白质可以是有利的。例如，在一些实施方案中，可能有利的是相对于小Rep蛋白质(例如，Rep78/68)下调大Rep蛋白质的表达以避免对宿主细胞的毒性(参见例如Urabe等人，(2002)Human Gene Therapy 13:1935)。
如本文所用，细小病毒或AAV“cap编码序列”编码形成功能性细小病毒或AAV衣壳(即，可包装DNA并感染靶细胞)的结构蛋白。通常，cap编码序列将编码全部细小病毒或AAV衣壳亚基，但是可以编码少于全部的衣壳亚基，只要生产功能性衣壳即可。通常但非必要地，cap编码序列将存在于单个核酸分子上。
自主型细小病毒和AAV的衣壳结构更详细地描述于BERNARD N.FIELDS等人，VIROLOGY，第2卷，第69章和第70章(第4版，Lippincott-Raven Publishers)中。
“微型抗肌萎缩蛋白”或“小型抗肌萎缩蛋白”是包含存在于全长肌肉抗肌萎缩蛋白或其同种型中的某些亚结构域或所述亚结构域的部分的工程化蛋白质，所述工程化蛋白质在肌细胞中表达时具有抗肌萎缩蛋白的至少一些功能性。微型抗肌萎缩蛋白和小型抗肌萎缩蛋白小于全长肌肉抗肌萎缩蛋白(Dp427m)。相对于全长肌肉抗肌萎缩蛋白，微型抗肌萎缩蛋白和小型抗肌萎缩蛋白可在N末端、C末端、内部或它们的任何组合中含有缺失。
如本文所用，“抗肌萎缩蛋白病”是由DMD中的致病性变异引起的肌肉疾病，DMD是编码蛋白质抗肌萎缩蛋白的基因。抗肌萎缩蛋白病表现为取决于基础遗传病变的性质的表型谱。该谱的温和端包括但不限于以下表型：肌酸磷酸激酶(CK)血清浓度的无症状增加，以及伴有肌红蛋白尿的肌肉痉挛。该谱的严重结局包括但不限于渐进性肌肉疾病杜氏肌营养不良症(DMD)和贝克型肌肉萎缩症(BMD)(其中骨骼肌主要受影响，心脏受到较小程度的影响)以及DMD相关的扩张型心肌病(DCM)(其中心脏主要受影响)。
小型抗肌萎缩蛋白多核苷酸、表达盒和载体
本公开提供了密码子优化的小型抗肌萎缩蛋白基因序列和含有所述密码子优化的小型抗肌萎缩蛋白基因序列的表达盒。此类基因和表达盒在其他应用中可用于对需要的受试者进行预防或治疗抗肌萎缩蛋白病(诸如DMD)的基因治疗。在转导的肌细胞中表达小型抗肌萎缩蛋白质能够复制和替代通常可归因于全长抗肌萎缩蛋白的至少一些功能，诸如支持细胞外基质与细胞骨架之间的机械强连接。
密码子优化的序列经设计用以适应细小病毒载体(例如，AAV载体)的尺寸限制，以及与未优化序列相比提供小型抗肌萎缩蛋白的增强表达。在一些实施方案中，经优化的小型抗肌萎缩蛋白序列在动物的肌细胞或肌肉中提供小型抗肌萎缩蛋白的增加表达，所述小型抗肌萎缩蛋白的增加表达比非密码子优化的抗肌萎缩蛋白序列的表达高至少约5％，例如至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、200％、300％、400％或500％或更多，其中所述非密码子优化的序列基于编码野生型人全长肌肉抗肌萎缩蛋白的mRNA，如NCBI参考序列NM_004006.2所例示，该参考序列通以引用方式并入。
因此，本发明的一个方面涉及编码小型抗肌萎缩蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：(a)SEQ ID NO:1或与其至少约90％同一的序列的核苷酸序列；(b)SEQ ID NO:2或与其至少约90％同一的序列的核苷酸序列；或(c)SEQ ID NO:3或与其至少约90％同一的序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1到SEQ ID NO:3中一者的核苷酸序列至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一。在某些实施方案中，所述多核苷酸的长度在病毒载体的容量内，所述病毒载体为例如细小病毒载体，例如AAV载体。在一些实施方案中，所述多核苷酸为约5000个、4900个、4800个、4700个、4600个、4500个、4400个、4300个、4200个、4100个或约4000个核苷酸或更少。
在一些实施方案中，由所述多核苷酸编码的小型抗肌萎缩蛋白质包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：N末端，铰链H1，棒R1和R2，铰链H3，棒R22、R23和R24，铰链H4，富含半胱氨酸的结构域(CR结构域)，以及在一些实施方案中野生型抗肌萎缩蛋白质的羧基末端结构域(CT结构域)的全部或一部分。在其他实施方案中，由所述多核苷酸编码的小型抗肌萎缩蛋白质包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：N末端，肌动蛋白结合结构域(ABD)，铰链H1，棒R1和R2，棒R22、R23和R24，铰链H4，CR结构域，以及在一些实施方案中野生型抗肌萎缩蛋白质的CT结构域的全部或一部分。在其他实施方案中，小型抗肌萎缩蛋白质不包含野生型抗肌萎缩蛋白质(SEQ ID NO:25)的C末端的最后三个氨基酸。在某些实施方案中，所述多核苷酸编码这样的小型抗肌萎缩蛋白质，所述小型抗肌萎缩蛋白质包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8或与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的核苷酸序列至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的序列的氨基酸序列。
抗肌萎缩蛋白的核苷酸序列是本领域中公知的，并且可以在序列数据库例如GenBank中找到。例如，人抗肌萎缩蛋白mRNA序列可在GenBank登录号M18533或NCBI参考序列NM_004006.2处找到，所述序列的全部内容以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，多核苷酸是用于产生抗肌萎缩蛋白质的表达盒的一部分。表达盒可以进一步包含用于增加抗肌萎缩蛋白表达的表达元件。
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸与启动子可操作地连接。启动子可以是组成型启动子或组织特异性或组织偏好型的启动子，诸如肌肉特异性或肌肉偏好型的启动子。在一些实施方案中，启动子是肌酸激酶启动子，例如包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成的启动子：SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸与多腺苷酸化元件可操作地连接。在一些实施方案中，所述多腺苷酸化元件包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列。
在一些实施方案中，多核苷酸是表达盒的一部分，所述表达盒包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：与启动子和多腺苷酸化元件可操作地连接的多核苷酸。在某些实施方案中，基因表达盒包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：SEQ ID NO:9到SEQ ID NO:12中任一者或与其至少约90％同一的序列的核苷酸序列，例如至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一。
本发明的另一方面涉及包含本发明多核苷酸的载体。合适的载体包括但不限于质粒、噬菌体、噬菌粒、病毒载体(例如，AAV载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体、甲病毒或杆状病毒载体)、细菌人工染色体(BAC)，或酵母人工染色体(YAC)。例如，核酸可包含以下各项，由以下各项组成或基本上由以下各项组成：包含5'和/或3'末端重复序列(例如，5'和/或3'AAV末端重复序列)的AAV载体。在一些实施方案中，载体是病毒载体，例如细小病毒载体，例如AAV载体，例如AAV9载体。病毒载体可以进一步包含含有重组病毒模板的核酸，其中所述核酸被细小病毒衣壳包裹。本发明进一步提供了包含本发明的多核苷酸的重组细小病毒粒子(例如，重组AAV粒子)。下面进一步论述了病毒载体和病毒粒子。
在某些实施方案中，病毒载体与所述经修饰载体衍生自的载体相比，表现出改进的组织嗜性。在一个实施方案中，细小病毒载体表现出对于骨骼肌、心肌和/或膈肌的系统嗜性。在其他实施方案中，与包含野生型衣壳蛋白质的病毒载体相比，细小病毒载体具有降低的肝脏嗜性。根据本领域的普通技术人员的知识，可以通过改变某些病毒衣壳氨基酸(例如，存在于AAV衣壳VP1、VP2和/或VP3蛋白质中的那些病毒衣壳氨基酸)来改变组织嗜性。
在一些实施方案中，载体基因组是自身互补的或双链体的，并且含有此类载体基因组的AAV病毒体称为scAAV载体。scAAV载体描述于国际专利公开WO 01/92551(该专利的公开内容全文以引用方式并入本文)。使用scAAV表达小型抗肌萎缩蛋白可以提供转导细胞的数量的增加、每个转导细胞的拷贝数的增加或两者的增加。
本发明的另一方面涉及包含本发明的多核苷酸和/或载体的转化细胞。所述细胞可以是体外细胞、离体细胞或体内细胞。
本发明的另一方面涉及包含本发明的多核苷酸和/或载体和/或转化细胞的非人转基因动物。在一些实施方案中，转基因动物是实验动物，例如疾病的动物模型，例如肌肉萎缩症的动物模型。
本发明的另一方面涉及由本发明的多核苷酸编码的小型抗肌萎缩蛋白质。所述小型抗肌萎缩蛋白质含有功能性抗肌萎缩蛋白质所需的所有序列。抗肌萎缩蛋白的结构域是本领域中公知的，并且序列可以在序列数据库例如GenBank中找到。例如，人抗肌萎缩蛋白氨基酸序列可以在NCBI参考序列:NP_003997.1和GenBank登录号AAA53189处找到，所述序列的全部内容以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，小型抗肌萎缩蛋白质包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：N末端，铰链H1，棒R1和R2，铰链H3，棒R22、R23和R24，铰链H4，CR结构域，以及在一些实施方案中CT结构域的全部或一部分，其中小型抗肌萎缩蛋白质不包含野生型抗肌萎缩蛋白质(SEQ ID NO:25)的C末端的最后三个氨基酸。根据这些实施方案中的一些实施方案，N末端肌动蛋白结合结构域包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25(全长人抗肌萎缩蛋白质的氨基酸序列)的氨基酸编号1-240；H1包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号253-327；R1包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号337-447；R2包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号448-556；H3包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号2424-2470；R22包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号2687-2802；R23包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号2803-2931；R24包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号2932-3040；H4包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ IDNO:25的氨基酸编号3041-3112；CR结构域包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号3113-3299；并且CT结构域包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号3300-3408。在某些实施方案中，小型抗肌萎缩蛋白质包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：SEQ ID NO:7的氨基酸序列。对此和相关构建体的进一步描述包括在本文的实施例1中。
在一些实施方案中，小型抗肌萎缩蛋白质包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：N末端，铰链H1，棒R1和R2，棒R22、R23和R24，铰链H4，CR结构域，以及在一些实施方案中CT结构域的全部或一部分。在某些实施方案中，小型抗肌萎缩蛋白质不包含野生型抗肌萎缩蛋白质的C末端的最后三个氨基酸。根据这些实施方案中的一些实施方案，N末端肌动蛋白结合结构域包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25(全长人抗肌萎缩蛋白质的氨基酸序列)的氨基酸编号1-240；H1包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号253-327；R1包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号337-447；R2包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQID NO:25的氨基酸编号448-556；R22包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号2687-2802；R23包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号2803-2931；R24包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号2932-3040；H4包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号3041-3112；富含半胱氨酸的结构域包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号3113-3299；并且羧基末端结构域包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号3300-3408。在某些实施方案中，小型抗肌萎缩蛋白质包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
本发明的又一方面涉及在细胞中生产小型抗肌萎缩蛋白的方法，所述方法包括使所述细胞与本发明的多核苷酸或载体接触，由此在所述细胞中产生小型抗肌萎缩蛋白。所述细胞可以是体外细胞、离体细胞或体内细胞，例如细胞系或原代细胞。通过导入编码蛋白质的多核苷酸来在细胞中生产所述蛋白质的方法是本领域中公知的。
本发明的另一方面涉及在受试者中生产小型抗肌萎缩蛋白质的方法，所述方法包括将本发明的多核苷酸、载体和/或转化细胞递送给受试者，从而在所述受试者中生产小型抗肌萎缩蛋白质。
本发明的另一方面涉及治疗有需要的受试者的肌肉萎缩症的方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明的多核苷酸、载体和/或转化细胞递送给受试者，从而治疗受试者的肌肉萎缩症。肌肉萎缩症可以是任何形式的肌肉萎缩症，例如杜氏肌营养不良症或贝克型肌肉萎缩症。
重组病毒载体
本发明的病毒载体可用于将编码小型抗肌萎缩蛋白的多核苷酸递送到体外细胞、离体细胞和体内细胞内。具体地，病毒载体可以有利地用于将编码小型抗肌萎缩蛋白的多核苷酸递送或转移到动物(包括哺乳动物)细胞内。
病毒载体还可以包含异源核酸，所述异源核酸与宿主染色体上的基因座具有同源性并与之重组。例如，该方法可用于校正宿主细胞中的遗传缺陷。
作为另一种替代方案，编码小型抗肌萎缩蛋白的多核苷酸可用于在体外细胞、离体细胞和体内细胞中生产小型抗肌萎缩蛋白质。例如，可以将病毒载体导入培养的细胞中并从所述细胞分离表达的小型抗肌萎缩蛋白质。
本领域的技术人员将理解，编码小型抗肌萎缩蛋白的多核苷酸可以与适当的控制序列可操作地缔合。例如，多核苷酸可以与表达控制元件可操作地缔合，所述表达控制元件为诸如转录/翻译控制信号、复制起点、多腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点(IRES)、启动子和/或增强子等。
本领域的技术人员将理解，可以使用多种启动子和任选的增强子元件，具体取决于所需的水平和组织特异性表达。启动子/增强子可以是组成型或诱导型的，具体取决于所需的表达模式。启动子/增强子可以是天然的或外源的，并且可以是天然的或合成的序列。外源是指转录起始区在导入所述转录起始区的野生型宿主中不存在。如果使用增强子的话，则增强子可以选自与启动子相同的基因和物种、选自与启动子不同物种的直向同源基因，选自与启动子相同物种的不同基因，或选自与启动子不同物种的不同基因。
在特定实施方案中，启动子/增强子元件对于靶细胞或待治疗的受试者可以是天然的。在代表性的实施方案中，启动子/增强子元件可以对于异源核酸序列是天然的。启动子/增强子元件通常选择为使其在所关注的靶细胞中起作用。此外，在特定实施方案中，启动子/增强子元件是哺乳动物启动子/增强子元件。启动子/增强子元件可以是组成型或诱导型的。
诱导型表达控制元件通常在那些需要提供对异源核酸序列表达的调控的应用中是有利的。用于基因递送的诱导型启动子/增强子元件可以是组织特异性或组织偏好型的启动子/增强子元件，并且包括肌肉特异性或肌肉偏好型(包括心肌、骨骼肌和/或平滑肌特异性或偏好型)启动子/增强子元件。其他诱导型启动子/增强子元件包括激素诱导型和金属诱导型元件。示例性诱导型启动子/增强子元件包括但不限于Tet开/关元件、RU486诱导型启动子、蜕皮激素诱导型启动子、雷帕霉素(rapamycin)诱导型启动子和金属硫蛋白启动子。
在其中编码小型抗肌萎缩蛋白的多核苷酸在靶细胞中转录且然后翻译的实施方案中，通常包括特异性起始信号以有效翻译插入的蛋白质编码序列。这些外源翻译控制序列可以包括ATG起始密码子和相邻序列，可以为天然的和合成的多种来源。
根据本发明的病毒载体提供了将编码小型抗肌萎缩蛋白的多核苷酸递送到包括分裂细胞和非分裂细胞在内的广泛细胞中的手段。病毒载体可用于将多核苷酸递送到体外细胞内，例如以在体外产生小型抗肌萎缩蛋白或用于离体基因疗法。病毒载体还可额外用于将多核苷酸递送到有需要的受试者的方法中，例如以表达小型抗肌萎缩蛋白。以这种方式，所述蛋白质可以在受试者体内产生。受试者可能因为具有功能性小型抗肌萎缩蛋白缺陷而需要小型抗肌萎缩蛋白。此外，可以因为在受试者中产生小型抗肌萎缩蛋白可以赋予一些有益效果来实践该方法。
病毒载体还可用于在培养的细胞或受试者中产生小型抗肌萎缩蛋白(例如，使用受试者作为生物反应器来产生蛋白质或观测蛋白质对受试者的影响，例如结合筛选方法观测)。
通常，本发明的病毒载体可用于递送编码小型抗肌萎缩蛋白的多核苷酸，以治疗和/或预防递送小型抗肌萎缩蛋白有益于的任何疾病状态。示例性疾病状态包括但不限于肌肉萎缩症，包括杜氏肌营养不良症和贝克型肌肉萎缩症。
根据本发明的病毒载体可用于诊断和筛选方法，由此编码小型抗肌萎缩蛋白的多核苷酸在细胞培养系统或者转基因动物模型中瞬时或稳定地表达。
如对于本领域的技术人员将显而易见的，本发明的病毒载体还可用于各种非治疗目的，包括但不限于用于评估基因靶向、清除、转录、翻译等的方案中。病毒载体也可用于评估安全性(传播性、毒性、免疫原性等)的目的。例如，该数据在评估临床疗效之前由美国食品和药物管理局视为监管审批过程的一部分。
根据本公开的用于治疗抗肌萎缩蛋白病(诸如DMD)的AAV载体或粒子的某些实施方案，本公开提供了包含来自具有横纹肌嗜性的AAV血清型的AAV衣壳的AAV载体或粒子，所述横纹肌包括但不限于骨骼肌，包括膈肌和心肌。具有横纹肌嗜性的天然存在的AAV衣壳的非限制性示例是AAV1、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9。然而，其他实施方案包括未知是否天然存在但是已经出于产生新的AAV衣壳的明确目的而被工程化的AAV衣壳，所述新的AAV衣壳与其他组织相比优先转导横纹肌。此类工程化衣壳是本领域中已知的，但本公开包括尚待开发的新的肌肉特异性AAV衣壳。肌肉特异性工程化AAV衣壳的非限制性示例报道于Yu,CY等人，Gene Ther 16(8):953-62(2009),Asokan,A等人，Nat Biotech 28(1):79-82(2010(描述了AAV2i8),Bowles,DE等人，Mol Therapy 20(2):443-455(2012)(描述了AAV 2.5)，以及Asokan,A等人，Mol Ther 20(4):699-708(2012)中。对于许多天然和非天然存在的AAV血清型，包括VP1、VP2和VP3蛋白质在内的衣壳蛋白质的氨基酸序列是本领域中已知的。在一个非限制性示例中，AAV9血清型的氨基酸序列提供为SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
用于治疗抗肌萎缩蛋白病(诸如DMD)的本公开的AAV粒子包括用于表达具有抗肌萎缩蛋白亚结构域的小型抗肌萎缩蛋白质的载体基因组，所述小型抗肌萎缩蛋白质被选择为在转导的肌细胞中至少部分地恢复由缺失的全长抗肌萎缩蛋白质供应的功能。根据一些实施方案，小型抗肌萎缩蛋白质由来自全长野生型人抗肌萎缩蛋白质的亚结构域构建。在一些实施方案中，小型抗肌萎缩蛋白质从N末端到C末端以如下顺序包含来自人抗肌萎缩蛋白质的以下亚结构域：N末端肌动蛋白结合结构域(ABD)；H1铰链结构域；R1和R2血影蛋白样重复序列结构域；H3铰链结构域；R22、R23和R24血影蛋白样重复序列结构域；H4铰链结构域；富含半胱氨酸(CR)的结构域；以及羧基末端(CT)结构域。根据这些实施方案中的一些实施方案，N末端肌动蛋白结合结构域包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25(全长人抗肌萎缩蛋白质的氨基酸序列)的氨基酸编号1-240；H1包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号253-327；R1包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号337-447；R2包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号448-556；H3包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号2424-2470；R22包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号2687-2802；R23包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号2803-2931；R24包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号2932-3040；H4包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ IDNO:25的氨基酸编号3041-3112；CR结构域包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号3113-3299；并且CT结构域包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号3300-3408。根据某些实施方案，小型抗肌萎缩蛋白质具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
用于治疗抗肌萎缩蛋白病(诸如DMD)的本发明的AAV粒子的载体基因组包括用于表达小型抗肌萎缩蛋白的基因。通常，载体基因组将缺乏通常存在于野生型AAV中的rep基因和cap基因，以为表达小型抗肌萎缩蛋白的基因提供空间。在一些实施方案中，该基因编码具有来自全长人抗肌萎缩蛋白质的以下亚结构域的小型抗肌萎缩蛋白质：ABD-H1-R1-R2-H3-R22-R23-R24-H4-CRD-CTD。在一些实施方案中，CTD仅是野生型肌肉抗肌萎缩蛋白中存在的CTD的一部分，并且在一些实施方案中，不包含野生型肌肉抗肌萎缩蛋白(SEQ IDNO:25)中存在的最后三个氨基酸。在某些实施方案中，该基因编码具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的人小型抗肌萎缩蛋白质。
根据一些实施方案，编码人小型抗肌萎缩蛋白质的基因是关于将施用本公开的AAV粒子以实现基因疗法的受试者的物种进行密码子优化的。不希望受理论束缚，相信密码子优化提高转导细胞能够将基因转录成mRNA和/或将mRNA翻译成蛋白质的效率，从而相较于非密码子优化的小型抗肌萎缩蛋白编码基因的表达增加产生的小型抗肌萎缩蛋白质的量。在一些非限制性实施方案中，密码子优化是人密码子优化，但是可以关于其他物种(包括犬)进行密码子优化。
在一些实施方案中，密码子优化将与某一物种(诸如人)中存在的相对罕见的tRNA配对的一个或多个密码子替换为针对相同氨基酸与更普遍的tRNA配对的同义密码子。这种方法可以提高翻译效率。在其他实施方案中，密码子优化消除了某些可能影响转录或翻译效率的顺式作用基序。密码子优化的非限制性示例包括在编码序列的预期起始处添加强Kozak序列，或消除预期起始密码子下游的内部核糖体进入位点。可通过密码子优化消除的其他顺式作用基序包括内部TATA盒；chi位点；ARE、INS和/或CRS序列元件；重复序列和/或RNA二级结构；潜在的剪接供体和/或受体位点、分支点；以及SalI位点。
在某些实施方案中，密码子优化相对于小型抗肌萎缩蛋白基因组装自的野生型序列增加GC含量(即，核酸序列中存在的G核碱基和C核碱基的数目，通常表示为百分比)。在一些实施方案中，所述GC含量比相应的野生型基因的GC含量高至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更高。在相关实施方案中，密码子优化基因的GC含量为约或至少45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％或更高。
在一些实施方案中，密码子优化增加了编码小型抗肌萎缩蛋白质的基因的密码子适应指数(CAI)。CAI是特定物种中同义密码子使用偏好的度量。特定物种的CAI值(范围从0到1)与基因表达水平正相关。参见例如Sharp,PM和W-H Lie,Nuc Acids Res 15(3):1281–95(1987)。根据某些实施方案，密码子优化使小型抗肌萎缩蛋白基因关于高度表达的人基因将CAI增加到为至少0.70、0.71、0.72、0.73、0.74、0.75、0.76、0.77、0.78、0.79、0.80、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98或0.99的值。
在其他实施方案中，密码子优化减少小型抗肌萎缩蛋白编码序列中CpG二核苷酸的数量。不希望受任何特定操作理论的束缚，相信CpG二核苷酸处的甲基化可使基因转录沉默，以使得减少基因序列中CpG二核苷酸的数量可降低甲基化水平，从而导致提高的转录效率。因此，在密码子优化的小型抗肌萎缩蛋白基因的一些实施方案中，CpG二核苷酸的数量与小型抗肌萎缩蛋白基因组装自的野生型序列相比减少约或至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或更多。
人密码子优化的人小型抗肌萎缩蛋白基因的非限制性示例由SEQ ID NO:1的DNA序列提供。该DNA序列为3978个核碱基长(包含终止密码子)，在本文中称为Hopti-Dys3978，但是该特定术语仅出于方便使用而非旨在为限制性的。由SEQ ID NO:1编码的小型抗肌萎缩蛋白质序列被称为Dys3978，由SEQ ID NO:7提供。犬密码子优化的人小型抗肌萎缩蛋白基因的示例由SEQ ID NO:3提供，SEQ ID NO:3也编码Dys3978。如本文另外详细描述的，SEQID NO:7的小型抗肌萎缩蛋白编码序列是从野生型全长人肌肉抗肌萎缩蛋白基因(如NCBI参考序列NM_004006.2所例示，该参考序列以引用方式并入)的子序列组装而成，所述子序列对应于抗肌萎缩蛋白质(SEQ ID NO:25)中存在的某些亚结构域。所得基因序列在本文中提供为SEQ ID NO:26，所述基因序列然后进行人密码子优化，从而得到SEQ ID NO:1的DNA序列。不受限制地，与密码子优化之前的基因序列相比，密码子优化增加了GC含量，减少了不频繁密码子的使用(即，增大了密码子适应指数(CAI))，并且包括强翻译起始位点(Kozak共有序列或类似序列)。
用于治疗抗肌萎缩蛋白病(诸如DMD)的本公开的AAV粒子的载体基因组还包括在编码小型抗肌萎缩蛋白质的密码子优化基因侧翼的AAV反向末端重复序列(ITR)。在一些实施方案中，ITR来自与衣壳相同的AAV血清型(例如但不限于与AAV9衣壳一起使用的AAV9ITR)，但是在其他实施方案中，可以使用来自不同血清型的AAV ITR。例如，来自AAV2血清型的ITR可以与来自不同的非AAV2血清型的AAV衣壳组合用于载体基因组中。非限制性示例包括使用AAV2 ITR以及来自AAV1、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9血清型或不同的天然或非天然存在的AAV血清型的衣壳。在特定的非限制性示例中，AAV2 ITR可以与来自AAV9血清型的衣壳组合使用。从载体基因组的正或有义DNA链的角度来看，左侧5'端或上游AAV2 ITR的序列被提供为SEQ ID NO:14的DNA序列，而右侧3'端或下游AAV2 ITR的序列被提供为SEQ ID NO:15的DNA序列。
用于治疗抗肌萎缩蛋白病(诸如DMD)的本公开的AAV载体的载体基因组还包括转录调控元件，所述转录调控元件与编码小型抗肌萎缩蛋白质的基因可操作地连接，使得载体基因组一旦转化为其双链形式就可在转导细胞中表达小型抗肌萎缩蛋白基因。转录调控元件通常包括启动子，但任选地包含一个或多个增强子元件，所述增强子元件可用于增强自启动子的转录起始速率。
转录调控元件关于小型抗肌萎缩蛋白编码序列的可操作连接意谓转录调控元件可作用以控制基因的转录和表达，而不一定需要任何特定的结构或空间关系。因为本公开的载体基因组通常作为单链DNA分子包装到AAV衣壳中，所以应该理解，在载体基因组转变成双链形式之前，可操作的连接可能不起作用。通常，启动子将位于编码小型抗肌萎缩蛋白质的基因序列的5'端或上游，但是其他转录调控元件，诸如增强子，可位于基因的5'端或其他位置，诸如3'端。
在一些实施方案中，转录调控元件可以是强组成型活性启动子，诸如在感染真核细胞的某些病毒中发现的启动子。本领域的公知示例包括来自巨细胞病毒(CMV)的启动子，但是其他启动子也是已知的，诸如来自劳斯氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus,RSV)的启动子。强病毒启动子例如CMV或RSV通常不是组织特异性的，因此如果使用强病毒启动子的话，则小型抗肌萎缩蛋白质将不仅在肌细胞中表达，而且还在由本公开的AAV粒子转导的任何其他细胞类型(诸如肝脏)中表达。因此，在其他实施方案中，肌肉特异性转录调控元件可用于减少在也可以由本公开的AAV粒子转导的非肌细胞(诸如肝细胞)中表达的小型抗肌萎缩蛋白质的量。
肌肉特异性转录调控元件可来源于来自任何物种(包括哺乳动物物种)的肌肉特异性基因，诸如但不限于人或小鼠肌肉基因。肌肉特异性转录调控元件通常将包括至少来自肌肉特异性基因的启动子以及来自相同或不同的肌肉特异性基因的一个或多个增强子。此类增强子可以源自天然基因的许多部分，诸如位于基因的5'端或3'端的增强子，或甚至存在于内含子中的增强子。肌肉特异性转录调控元件可以从肌肉特异性基因整体取出并插入质粒中以产生本公开的AAV载体基因组，或者可以经工程化以调节它们的活性并尽可能地减小它们的大小。
肌肉特异性转录调控元件可来源于的肌肉特异性基因的非限制性示例包括肌肉肌酸激酶基因、肌球蛋白重链基因或肌球蛋白轻链基因，或来自骨骼肌的α1肌动蛋白基因，但是其他基因也是可能的。这些基因可以来自人、小鼠或其他物种。
已经产生用于基因疗法应用的肌肉特异性转录调控元件在本领域中有所描述，并且可以用于本公开的AAV载体中以用于治疗肌肉萎缩症。在非限制性示例中，Hauser描述了来源于小鼠肌酸激酶(MCK)基因的被称为CK4、CK5和CK6的肌肉特异性转录调控元件(Hauser,MA等人，Mol Therapy 2(1):16-25(2000))；Salva描述了来源于MCK基因的被称为CK1和CK7的肌肉特异性转录调控元件，以及MHCK1和MHCK7，其另外包括来自小鼠α-MHC基因的增强子(Salva,MZ等人，Mol Therapy 15(2):320-9(2007))，Wang描述了被称为enh358MCK、dMCK和tMCK的肌肉特异性转录调控元件(Wang,B等人，Gene Therapy 15:1489-9(2008))。在本公开的AAV载体中使用其他肌肉特异性转录调控元件来治疗肌肉萎缩症也是可能的。
可以在本公开的AAV载体中使用以用于治疗肌肉萎缩症的肌肉特异性转录调控元件的非限制性示例包括各自如在本领域中所述的CK4、CK5、CK6、CK1、CK7、MHCK1、MHCK7、enh358MCK、dMCK和tMCK，或在本文中公开的具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:16的DNA序列的那些。也可以使用其他肌肉特异性转录调控元件。
用于治疗抗肌萎缩蛋白病(诸如DMD)的本公开的AAV载体的载体基因组还包括位于小型抗肌萎缩蛋白基因编码序列的3'端的转录终止序列。包含转录终止序列确保编码小型抗肌萎缩蛋白质的mRNA转录物将由转导细胞适当地多聚腺苷酸化，从而确保将信使有效翻译成蛋白质。不希望受任何特定操作理论的限制，对哺乳动物转录终止序列的研究鉴别出了基因的3’UTR中的共有序列，所述共有序列用于终止转录和生长转录物的信号多聚腺苷酸化。具体地，这些序列通常包含基序AATAAA，之后是15-30个核苷酸，然后是CA。参见例如N.Proudfoot,Genes Dev 25:1770-82(2011)。其他基序，诸如上游元件(USE)和下游元件(DSE)可能有助于一些基因中的转录终止。许多转录终止序列是本领域中已知的，并且可以用于本公开的AAV载体中。非限制性示例包括来自SV40病毒早期或晚期基因的多腺苷酸化信号(SV40早期或晚期polyA)或来自牛生长激素基因的多腺苷酸化信号(bGH polyA)。来自任何物种的其他基因的转录终止序列可用于本公开的AAV载体中。或者，合成的转录终止序列可经设计并用于发出转录终止和多腺苷酸化的信号。可以在本公开的AAV载体中使用的转录终止序列的其他非限制性示例包括本文公开为具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:17的DNA序列的那些转录终止序列。
根据某些非限制性实施方案，本公开提供了用于治疗抗肌萎缩蛋白病(诸如DMD)的AAV病毒粒子或载体，所述AAV病毒粒子或载体包含AAV衣壳和编码小型抗肌萎缩蛋白质的载体基因组。在一些实施方案中，小型抗肌萎缩蛋白质包含来自全长人抗肌萎缩蛋白质的以下亚结构域：ABD-H1-R1-R2-H3-R22-R23-R24-H4-CRD-CTD。在一些实施方案中，CTD仅是野生型肌肉抗肌萎缩蛋白中存在的CTD的一部分，并且在一些实施方案中不包含野生型肌肉抗肌萎缩蛋白(SEQ ID NO:25)中存在的最后三个氨基酸。根据某些实施方案，编码SEQID NO:7的小型抗肌萎缩蛋白质的基因是人密码子优化的并且具有SEQ ID NO:1的DNA序列。在一些实施方案中，AAV衣壳来自AAV9血清型。
如本文其他地方所述，单链AAV载体基因组以大致相等比例的正链或负链包装到衣壳中。因此，载体或粒子的实施方案包括其中的载体基因组处于正链极性(即，具有有义或编码DNA链的核碱基序列)的AAV粒子，以及其中的载体基因组处于负链极性(即，具有反义或模板DNA链的核碱基序列)的AAV粒子。鉴于正链的核碱基序列处于其常规的5'到3'顺序，负链的处于其5'到3'顺序的核碱基序列可以确定为正链的核碱基序列的反向互补序列。
在载体的一些实施方案中，载体基因组当处于正极性时包含来源于肌酸激酶基因的肌肉特异性转录调控元件，所述肌肉特异性转录调控元件具有SEQ ID NO：16的DNA序列，所述DNA序列位于SEQ ID NO:1的5'端并且与SEQ ID NO:1可操作地连接，所述SEQ ID NO:1是编码小型抗肌萎缩蛋白质的人密码子优化基因的DNA序列。包含相应负链的粒子也是可能的，其中从其5'末端的核碱基序列将是前述正链的序列的反向互补序列。在其他实施方案中，载体基因组当处于正极性时包含第一AAV2 ITR，之后是位于SEQ ID NO:1的DNA序列的5'端并且与SEQ ID NO:1的DNA序列可操作地连接的SEQ ID NO:16的DNA序列，以及位于小型抗肌萎缩蛋白基因的3'端、包含SEQ ID NO:17的DNA序列的转录终止序列，之后是第二AAV2 ITR。包含相应负链的粒子也是可能的，其中从其5'末端的核碱基序列将是前述正链的序列的反向互补序列。
在载体的某些其他实施方案中，载体基因组当处于正极性时以5'到3'顺序包含第一AAV2 ITR，由SEQ ID NO:16的DNA序列限定的转录调控元件序列，用于表达小型抗肌萎缩蛋白的人密码子优化的基因序列，由与转录调控元件可操作连接的SEQ ID NO:1的DNA序列限定的基因序列，由SEQ ID NO:17的DNA序列限定的转录终止序列，以及第二AAV2 ITR。包含相应负链的粒子也是可能的，其中从其5'末端的核碱基序列将是前述正链的序列的反向互补序列。
根据一个特定的非限制性实施方案，用于治疗抗肌萎缩蛋白病(诸如DMD)的AAV载体在本文中可称为AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA，包含来自AAV9血清型的衣壳以及在本文中可称为hCK.Hopti-Dys3978.spA的载体基因组，所述载体基因组当处于正极性时包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：SEQ ID NO:18的DNA序列，或者所述载体基因组当处于负极性包含以下各项，基本上由以下各项组成或由以下各项组成：SEQ IDNO:18的DNA序列的反向互补序列(即，当载体基因组序列以5'到3'读取时)。
产生病毒载体的方法
本公开还提供了产生AAV载体的方法。在一个特定实施方案中，本发明提供了一种产生重组细小病毒粒子的方法，所述方法包括在足以复制和包装重组AAV粒子的条件下，向允许AAV复制和包装的细胞提供重组AAV载体基因组，由此由所述细胞产生rAAV粒子，所述重组AAV载体基因组包含小型抗肌萎缩蛋白基因、相关遗传控制元件和侧翼AAV ITR，以及AAV复制和包装功能(诸如由AAV rep基因和AAV cap基因提供的那些)。足以复制和包装rAAV粒子的条件包括但不限于辅助功能，诸如来自腺病毒和/或疱疹病毒的辅助功能。允许AAV复制和包装的细胞在本文中称为包装细胞或生产细胞，所述术语由更广泛的术语宿主细胞涵盖。RAAV粒子载体基因组、复制和包装功能以及(必要时)辅助功能可通过病毒载体或非病毒载体(诸如质粒)提供，并且可稳定或瞬时地存在于包装细胞内，整合到细胞基因组中或在附加体中。
本公开的重组AAV载体可以通过技术人员已知的若干方法制备(参见例如WO2013/063379)。一种示例性方法描述于Grieger等人，2015,Molecular Therapy 24(2):287-297中，该参考文献的内容以引用方式并入。简而言之，HEK293细胞的有效转染用作起始点，其中来自合格的临床主细胞库的附着性HEK293细胞系用于在摇瓶和WAVE生物反应器中在允许快速和可扩展的rAAV粒子生产的不含动物组分悬浮条件下生长。在一些实施方案中，通过使用三重转染方法(例如，WO 96/40240)，悬浮HEK293细胞系能够在转染后48小时收获时产生每细胞多于1×105个含有载体基因组(vg)的粒子，或大于1×1014vg/L的细胞培养物。三重转染是指以下事实：包装细胞用三种质粒转染：一种质粒编码AAV rep基因和AAVcap基因，另一种质粒编码各种辅助功能物(例如，腺病毒或HSV蛋白质，诸如E1a、E1b、E2a、E4和VA RNA，并且另一种质粒编码载体基因组，即小型抗肌萎缩蛋白基因及其各种控制元件，所述各种控制元件侧接有AAV ITR。为了实现所需的产量，可以优化许多变量，诸如选择支持生长和转染的相容的无血清悬浮培养基，选择转染试剂、转染条件和细胞密度。载体可以从培养基中和/或通过裂解细胞收集，然后使用经典密度梯度超速离心技术或使用柱色谱技术或其他技术纯化。
包装功能包括用于病毒载体复制和包装的基因。因此，例如，包装功能可以根据需要包括病毒基因表达、病毒载体复制、从整合状态拯救病毒载体、病毒基因表达和将病毒载体包装到病毒粒子中所必需的功能。包装功能物可以使用遗传构建体(诸如质粒或扩增子、杆状病毒或HSV辅助构建体)一起或单独地供应到包装细胞。包装功能可以在包装细胞内的染色体外存在，但也可以整合到细胞的染色体DNA中。示例包括编码AAV Rep蛋白质和AAVCap蛋白质的基因。Rep基因和cap基因可一起作为相同病毒或非病毒载体的部分而提供到包装细胞。例如，rep序列和cap序列可以由杂合腺病毒载体(例如，插入到经缺失的腺病毒载体的E1a或E3区)或疱疹病毒载体(诸如EBV载体)提供。或者，AAV rep基因和AAV cap基因可以单独提供。Rep基因和cap基因也可以稳定地整合到包装细胞的基因组中，或存在于附加体上。通常，rep基因和cap基因将不会侧接有ITR，以避免将这些序列包装到rAAV载体粒子中。
辅助功能包括建立包装细胞的有效感染所需的辅助病毒元件，这是启动病毒载体包装所必需的。示例包括足以导致病毒载体包装的来源于腺病毒、杆状病毒和/或疱疹病毒的功能。例如，腺病毒辅助功能将通常包括腺病毒组分E1a、E1b、E2a、E4和VA RNA。可以通过用所需病毒感染包装细胞来供应包装功能。或者，可以避免使用感染性病毒，由此可以使用非病毒载体如质粒或扩增子将包装功能一起或单独地供应到包装细胞。参见例如在Rabinowitz等人，2002,J.Virol.76:791中所述的pXR辅助质粒，以及在Grimm等人，1998,Human Gene Therapy 9:2745-2760中描述的pDG质粒。包装功能可以在包装细胞内的染色体外存在，但也可以整合到细胞的染色体DNA中(例如，HEK 293细胞中的E1或E3)。
可以采用将携带辅助功能的核苷酸序列导入细胞宿主中以进行复制和包装的任何方法，所述方法包括但不限于电穿孔、磷酸钙沉淀、显微注射、阳离子或阴离子脂质体，以及脂质体与核定位信号的组合。在通过使用病毒载体进行转染或使用辅助病毒进行感染来提供辅助功能的实施方案中；可以使用产生病毒感染的标准方法。
本领域中已知的任何合适的允许细胞或包装细胞可用于生产经包装的病毒载体。哺乳动物细胞或昆虫细胞是优选的。在本发明的实践中可用于产生包装细胞的细胞的示例包括例如人细胞系，诸如VERO、WI38、MRC5、A549、HEK 293细胞(其在组成型启动子的控制下表达功能性腺病毒E1)、B-50细胞或任何其他HeLa细胞、HepG2、Saos-2、HuH7和HT1080细胞系。在一个方面，包装细胞能够在悬浮培养中生长，尤其是在无血清生长培养基中生长。在一个实施方案中，包装细胞是在无血清培养基中悬浮生长的HEK293。在另一个实施方案中，包装细胞是在美国专利号9,441,206中描述并作为ATCC号PTA 13274保藏的HEK293细胞。许多rAAV粒子包装细胞系是本领域中已知的，包括但不限于WO 2002/46359中公开的那些。
用作包装细胞的细胞系包括昆虫细胞系，特别是当使用杆状病毒载体来导入如本文所述的rAAV粒子生产所需的基因时。可以根据本公开使用允许AAV复制并且可以在培养物中维持的任何昆虫细胞。示例包括草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)，诸如Sf9或Sf21细胞系；果蝇属(Drosophila spp.)细胞系；或蚊细胞系，例如来源于白纹伊蚊(Aedesalbopictus)的细胞系。
在已经产生和纯化本公开的AAV载体粒子后，它们可以经滴定以制备用于施用于受试者的组合物，诸如患有肌肉萎缩症的人受试者。AAV载体滴定可以使用本领域中已知的方法完成。在某些实施方案中，可以使用定量PCR(qPCR)使用针对载体基因组中的序列(例如，AAV2 ITR序列(如果存在的话)，或载体基因组中的其他序列)的引物来滴定AAV载体粒子。通过对已知浓度的标准品稀释液(诸如含有载体基因组序列的质粒)进行平行qPCR，可以产生标准曲线，从而允许将AAV载体的浓度计算为每单位体积(诸如微升或毫升)的载体基因组(vg)的数量。或者，含有基因组的AAV载体粒子的数量可以使用斑点印迹法使用针对载体基因组的合适探针来确定。这些技术进一步描述于Gray,SJ等人，重组腺相关病毒载体的生产及其在体外和体内施用中的用途(Production of recombinant adeno-associatedviral vectors and use in in vitro and in vivo administration)，Curr ProtocNeurosci(2011)和Werling NJ等人，Gene Ther Meth 26:82-92(2015)中。一旦确定了原种中AAV载体基因组的浓度，就可以用合适的缓冲液将其稀释或透析以用于制备用于施用于受试者的组合物。
治疗方法
本公开提供了通过向需要治疗抗肌萎缩蛋白病的受试者施用治疗有效剂量或量的本公开的AAV载体来治疗抗肌萎缩蛋白病的方法，所述本公开的AAV载体诸如但不限于称为AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA的载体。在一些实施方案中，抗肌萎缩蛋白病是肌肉萎缩症，包括但不限于杜氏肌营养不良症(DMD)、贝克型肌肉萎缩症(BMD)、DMD相关的扩张型心肌病(DCM)，以及女性有症状携带者状态。因此，在一些实施方案中，本公开提供了通过向需要治疗肌肉萎缩症的受试者施用治疗有效剂量或量的本公开的AAV载体来治疗肌肉萎缩症的方法，所述本公开的AAV载体诸如但不限于称为AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA的载体。在相关实施方案中，本公开提供了治疗需要治疗的受试者的杜氏肌营养不良症(DMD)、贝克型肌肉萎缩症(BMD)、DMD相关的扩张型心肌病(DCM)以及女性有症状携带者状态的方法。
还提供了本公开的AAV载体或药物组合物在制备用于本文公开的治疗方法的药物中的用途。此外，提供了用于本文公开的治疗方法中的本公开的AAV载体或药物组合物。
对患有抗肌萎缩蛋白病(诸如DMD)的受试者的治疗不需要导致被认为是有效的治愈，其中治愈被定义为停止疾病进展，或部分或完全恢复受试者的肌肉功能。相反，本公开的AAV载体的治疗有效剂量或量是用于减轻或改善患有抗肌萎缩蛋白病(诸如DMD)的受试者的症状、减缓所述受试者的进展或改善所述受试者的生活质量的剂量或量。根据某些非限制性实施方案，对患有抗肌萎缩蛋白病的受试者的治疗可以改善他们的运动性、延迟他们丧失行走或其他运动性的时间，并且在严重的抗肌萎缩蛋白病(诸如DMD)的情况下延长患有该病症的受试者的寿命。
本公开的治疗方法可用于治疗患有抗肌萎缩蛋白病(诸如DMD)的男性或女性受试者。在女性的情况下，可以向有症状携带者或向患有完全发展疾病的罕见女性受试者提供治疗。本公开的方法还可以用于治疗任何年龄的患有抗肌萎缩蛋白病的受试者，包括小于1岁，或约或至少1岁，或约或至少2岁、3岁、4岁、5岁、6岁、7岁、8岁、9岁、10岁、11岁、12岁、13岁、14岁、15岁、16岁、17岁、18岁、19岁、20岁、21岁、22岁、23岁、24岁、25岁、26岁、27岁、28岁、29岁、30岁或更大年龄的受试者。受试者在接受治疗时可以是能走动的，也可以是不能走动的。
无论基础遗传病变如何(例如，小型抗肌萎缩蛋白基因中的缺失，重复，剪接位点变体或无义突变)，只要病变导致天然人抗肌萎缩蛋白基因的功能降低或丧失，本公开的治疗方法就可用于治疗患有抗肌萎缩蛋白病的受试者。
在本公开的某些实施方案中，用治疗有效剂量或量的AAV小型抗肌萎缩蛋白载体治疗受试者将降低与肌肉萎缩症的存在或进展相关的一种或多种生物标志物的组织浓度。
根据某些实施方案，生物标志物是从受损的骨骼肌或心肌细胞释放到血液(包括血清或血浆)中的某些酶。非限制性示例包括肌酸激酶(CK)、转氨酶丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)，以及乳酸脱氢酶(LDH)，所述酶的平均水平均已知在患有DMD的受试者中升高。
在一些实施方案中，治疗有效剂量或量的本公开的AAV小型抗肌萎缩蛋白载体有效地将DMD患者的血液中升高的ALT水平降低到为通常在相似年龄和性别的健康受试者中存在的ALT水平的约7倍、6倍、5倍、4倍、3倍或2倍以内。在其他实施方案中，治疗有效剂量或量的本公开的AAV小型抗肌萎缩蛋白载体有效地将DMD患者的血液中升高的AST水平降低到为通常在相似年龄和性别的健康受试者中存在的AST水平的约7倍、6倍、5倍、4倍、3倍或2倍以内。在一些实施方案中，治疗有效剂量或量的本公开的AAV小型抗肌萎缩蛋白载体有效地将DMD患者的血液中升高的LDH水平降低到为通常在相似年龄和性别的健康受试者中存在的LDH水平的约7倍、6倍、5倍、4倍、3倍或2倍以内。并且在一些其他实施方案中，治疗有效剂量或量的本公开的AAV小型抗肌萎缩蛋白载体有效地将DMD患者的血液中升高的总CK水平降低到为通常在相似年龄和性别的健康受试者中存在的总CK水平的约50倍、48倍、46倍、44倍、42倍、40倍、38倍、36倍、34倍、32倍、30倍、28倍、26倍、24倍、22倍、20倍、18倍、16倍、14倍、12倍、10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍或2倍以内。还已经发现与细胞外基质退化或重塑相关的酶基质金属蛋白酶-9(MMP-9)在DMD患者的血液中升高。参见例如Nadaraja,VD等人，Neuromusc.Disorders 21:569-578(2011)。因此，在一些实施方案中，治疗有效剂量或量的本公开的AAV小型抗肌萎缩蛋白载体有效地将DMD患者的血液中升高的MMP-9水平降低到为通常在相似年龄和性别的健康受试者中存在的MMP-9水平的约15倍、14倍、13倍、12倍、11倍、10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍或2倍以内。
在其他实施方案中，治疗有效剂量或量的本公开的AAV小型抗肌萎缩蛋白载体可如上所述有效改变ALT、AST、LDH、CK和MMP-9的水平，单独地或与这些相同生物标志物或其他生物标志物中的一种或多种相组合。因此，在一个示例性的非限制性实施方案中，治疗有效剂量或量的本公开的AAV小型抗肌萎缩蛋白载体有效降低ALT和AST、ALT和LDH、AST和CK、或AST和MMP-9等。
在本公开的一些治疗方法中，AAV载体的有效剂量或量是在6分钟步行测试(6MWT)中改善平均受试者表现的剂量或量。6MWT已被确立为患有肌肉萎缩症，特别是DMD的人受试者的肌肉功能和运动性的可重现且有效的度量。参见例如McDonald,CM等人，Muscle Nerve41(4):500-10(2010)；Henricson,E等人，PLOS Currents Musc Dys，2013年7月8日；McDonald,CM等人，Muscle Nerve 48:343-56(2013)。在该测试中，记录受试者可以从静止开始在6分钟期间连续且无需帮助地行走的以米计的距离。该距离也称为6分钟步行距离(6MWD)。在该测试的一些应用中，可以在几天的时段内对单个受试者进行多于一次测试，并将结果取平均值。6MWT由于其优点而已在涉及能走动的DMD患者的药物试验中被采用作为主要临床终点。参见例如Bushby,K等人，Muscle Nerve 50:477-87(2014)；Mendell,JR等人，Ann Neurol 79:257-71(2016)；Campbell,C等人，Muscle Nerve 55(4):458-64(2017)。通常，在这些试验中，治疗组中的每个受试者在数月或数年的时段内使用6MWT测试其行走，以确定是否存在治疗效果。
根据本公开的治疗方法的一些实施方案，通过比较本公开的AAV载体对所治疗受试者(诸如患有DMD的那些受试者)的平均6MWT表现的治疗效果与患有相同类型的抗肌萎缩蛋白病(诸如DMD)的未治疗对照受试者的平均6MWT表现来统计地确定治疗功效。此类对照可以已经包括在用于评估本公开的AAV载体的治疗功效的相同研究中，或者可以是从对DMD或其他抗肌萎缩蛋白病的进展的自然史研究中得到的类似受试者。对照可以是年龄匹配的(或者分层为例如但不限于比某一阈值年龄更年轻或更老的受试者，所述阈值年龄为诸如6岁、7岁、8岁、9岁或10岁)，在预先皮质类固醇治疗的状态方面匹配的(即，是否进行了预先皮质类固醇治疗，或先前治疗的时间长度)，在任何治疗之前的6MWT方面的基线表现匹配的(可能除了使用皮质类固醇之外)(或者分层为例如但不限于基线表现低于和高于某一阈值的那些受试者，所述阈值为诸如200m、250m、300m、350m、400m、450m或500m)，或确定为临床相关的某一其他属性。
根据本公开的治疗方法的某些实施方案，治疗有效剂量或量的本公开的AAV载体有效地使得在施用载体后3个月、6个月、9个月、12个月、15个月、18个月、21个月、24个月、27个月、30个月、33个月或36个月时，患有抗肌萎缩蛋白病(诸如DMD)的受试者的平均6MWD与类似的匹配或分层对照相比增加约或至少5米、10米、15米、20米、25米、30米、35米、40米、45米、50米、55米、60米、65米、70米、75米、80米、85米、90米、95米、或100米或更大。在这些实施方案的一些实施方案中，AAV载体包含AAV9衣壳和包含编码小型抗肌萎缩蛋白质的人密码子优化基因的基因组，所述AAV载体诸如但不限于命名为AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA的载体。
根据本公开的治疗方法的某些实施方案，治疗有效剂量或量的本公开的AAV载体有效地使得在施用所述载体后30天、60天、90天、120天、150天、180天、210天、240天、270天、300天、330天、360天、390天、420天、450天、480天、510天、540天、570天、600天、630天、660天、690天或720天时，患有抗肌萎缩蛋白病(诸如DMD)的受试者的平均6MWD与类似的匹配或分层对照相比增加约或至少5米、10米、15米、20米、25米、30米、35米、40米、45米、50米、55米、60米、65米、70米、75米、80米、85米、90米、95米、或100米或更大。在这些实施方案的一些实施方案中，AAV载体包含AAV9衣壳和包含编码小型抗肌萎缩蛋白质的人密码子优化基因的基因组，所述AAV载体诸如但不限于命名为AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA的载体。
作为6MWT的替代方案，治疗功效可以表示为受试者爬升4个标准大小阶梯所耗费的时间的缩短，该测试被称为4阶梯爬升测试。该试验已用于评估皮质类固醇治疗对DMD患者的有效性。Griggs,RC等人，Arch Neurol 48(4):383-8(1991)。因此，根据本公开的治疗方法的某些实施方案，治疗有效剂量或量的本公开的AAV载体有效地使得在施用所述载体后3个月、6个月、9个月、12个月、15个月、18个月、21个月、24个月、27个月、30个月、33个月或36个月时，患有抗肌萎缩蛋白病(诸如DMD)的受试者进行4阶梯爬升测试所耗费的平均时间与类似的匹配或分层对照相比缩短约或至少0.2秒、0.4秒、0.6秒、0.8秒、1.0秒、1.2秒、1.4秒、1.6秒、1.8秒、2.0秒、2.2秒、2.4秒、2.6秒、2.8秒、3.0秒、3.2秒、3.4秒、3.6秒、3.8秒、或4.0秒或更多。在这些实施方案的一些实施方案中，AAV载体包含AAV9衣壳和包含编码小型抗肌萎缩蛋白质的人密码子优化基因的基因组，所述AAV载体诸如但不限于命名为AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA的载体。
在本公开的治疗方法的相关实施方案中，治疗有效剂量或量的本公开的AAV载体有效地使得在施用所述载体后30天、60天、90天、120天、150天、180天、210天、240天、270天、300天、330天、360天、390天、420天、450天、480天、510天、540天、570天、600天、630天、660天、690天或720天时，患有抗肌萎缩蛋白病(诸如DMD)的受试者进行4阶梯爬升测试所耗费的平均时间与类似的匹配或分层对照相比缩短约或至少0.2秒、0.4秒、0.6秒、0.8秒、1.0秒、1.2秒、1.4秒、1.6秒、1.8秒、2.0秒、2.2秒、2.4秒、2.6秒、2.8秒、3.0秒、3.2秒、3.4秒、3.6秒、3.8秒、或4.0秒或更多。在这些实施方案的一些实施方案中，AAV载体包含AAV9衣壳和包含编码小型抗肌萎缩蛋白质的人密码子优化基因的基因组，所述AAV载体诸如但不限于命名为AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA的载体。
治疗功效还可以表示为与对照相比在治疗后特定时间内随时间推移经历行走丧失的受试者的百分比的降低。行走丧失被定义为持续依赖轮椅使用的开始。因此，根据本公开的治疗方法的其他实施方案，治疗有效剂量或量的本公开的AAV载体有效地使得在施用于患有抗肌萎缩蛋白病(诸如DMD)的受试者后3个月、6个月、9个月、12个月、15个月、18个月、21个月、24个月、27个月、30个月、33个月或36个月时，已经丧失行走的受试者的平均数量与类似的匹配或分层对照相比减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或更多。在这些实施方案的一些实施方案中，AAV载体包含AAV9衣壳和包含编码小型抗肌萎缩蛋白质的人密码子优化基因的基因组，所述AAV载体诸如但不限于命名为AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA的载体。
在本公开的治疗方法的一些实施方案中，治疗有效剂量或量的本公开的AAV载体可有效延迟具有抗肌萎缩蛋白病(诸如DMD)的受试者中一种或多种症状的发作。症状发作前的诊断可以通过对DMD基因突变的产前、围产期或出生后遗传测定来完成。根据某些实施方案，用本公开的AAV载体治疗有效地使得DMD的一种或多种症状的发作与类似的匹配或分层对照相比延迟至少或约3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、12个月、14个月、15个月、16个月、18个月、20个月、22个月、24个月、25个月、26个月、28个月、30个月、32个月、34个月、35个月、36个月、38个月、40个月、42个月、44个月、45个月、46个月、48个月、50个月、52个月、54个月、55个月、56个月、28个月、60个月、62个月、64个月、65个月、66个月、68个月、70个月、72个月、74个月、75个月、76个月、78个月、或80个月或更长时间。如普通技术人员所理解的，DMD的早期症状包括但不限于行走能力的延迟(到约18个月的平均年龄，相比之下不患有DMD的婴儿为平均12-15个月)；难以跳跃、奔跑或爬楼梯；易摔倒；近端肌无力，例如通过在从地板上坐起时表现的高尔斯手法(Gowers’maneuver)来证明；由于假性肥大而增大的小腿；由于受试者用脚趾和/或脚前掌(balls of feet)行走而步态蹒跚；倾向于通过凸肚和缩肩保持平衡；以及认知障碍，诸如接受性语言、表达性语言、视觉空间能力、精细动作技能、注意力和记忆能力降低。在这些实施方案的一些实施方案中，AAV载体包含AAV9衣壳和包含编码小型抗肌萎缩蛋白质的人密码子优化基因的基因组，所述AAV载体诸如但不限于命名为AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA的载体。
治疗功效还可以表示为与未治疗的对照相比，经历替代瘦肌肉组织的脂肪组织的量增加的用载体治疗的受试者百分比随时间降低。在一些实施方案中，这种朝向肥胖增加的进展可以使用对DMD患者的腿部肌肉的MRI分析来确定并且表示为脂肪含量(fatfraction,FF)，如在Willcocks,RJ等人，对大型杜氏肌营养不良症群组中的磁共振生物标志物的多中心前瞻性纵向研究(Multicenter prospective longitudinal study ofmagnetic resonance biomarkers in a large Duchenne muscular dystrophy cohort)，Ann Neurol 79:535-47(2016)中进一步解释的。在相关的实施方案中，如通过MRI确定的，用本公开的AAV载体治疗DMD受试者有效地使得其下肢的平均FF在治疗后3个月、6个月、9个月、12个月、15个月、18个月、21个月、24个月、27个月、30个月、33个月或36个月时与匹配对照相比降低约或至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或更多。在这些实施方案的一些实施方案中，AAV载体包含AAV9衣壳和包含编码小型抗肌萎缩蛋白质的人密码子优化基因的基因组，所述AAV载体诸如但不限于命名为AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA的载体。
在一些实施方案中，本公开的AAV载体的治疗有效剂量或量是导致在治疗后3个月、6个月、9个月、12个月、15个月、18个月、21个月、24个月、27个月、30个月、33个月或36个月时至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或更多的骨骼肌纤维表达小型抗肌萎缩蛋白质的量。对于小型抗肌萎缩蛋白质表达呈阳性的肌纤维的百分比可以通过用能够特异性结合小型抗肌萎缩蛋白质的针对抗肌萎缩蛋白的抗体对来自所治疗受试者的活检肌肉切片进行免疫标记来确定。合适的免疫标记技术在实施例中描述，并且是本领域的普通技术人员熟悉的。可以从中获取活组织检查的所治疗受试者的示例性肌肉包括二头肌、三角肌和四头肌，但是也可以对其他肌肉进行活组织检查。在这些实施方案的一些实施方案中，AAV载体包含AAV9衣壳和包含编码小型抗肌萎缩蛋白质的人密码子优化基因的基因组，所述AAV载体诸如但不限于命名为AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA的载体。
在一些实施方案中，用于治疗抗肌萎缩蛋白病(诸如肌肉萎缩症，诸如DMD)的本公开的AAV载体的剂量或量被确定为治疗有效的并且同时在所治疗受试者中不引起对小型抗肌萎缩蛋白质特异的细胞(T细胞)免疫应答，或仅在低百分比的此类受试者中存在所述免疫应答。可以通过以下方式来确定针对小型抗肌萎缩蛋白质的T细胞应答的存在或程度：使用ELISPOT测定来检测从受试者血液中分离的外周血单核细胞(PBMC)，所述PBMC响应于暴露于覆盖小型抗肌萎缩蛋白质氨基酸序列的重叠肽库而产生γ干扰素(IFNγ)。在某些实施方案中，阳性IFNγ应答的阈值可以设定为每百万个测试的PBMC大于50个斑点形成细胞。使用其他测定来检测针对小型抗肌萎缩蛋白质的T细胞应答也是可能的，包括但不限于检测从用载体治疗的受试者获得的表达小型抗肌萎缩蛋白质的肌肉或其他组织的活组织检查中的T细胞浸润。受试者可以是人受试者或动物受试者，诸如DMD的动物模型，诸如mdx小鼠、mdx大鼠或GRMD狗模型。在其他实施方案中，用于治疗抗肌萎缩蛋白病(诸如肌肉萎缩症，诸如DMD)的本公开的AAV载体的剂量或量被确定为治疗有效的并且同时不引起针对衣壳、载体基因组(或其任何组分)、或由转导细胞表达的小型抗肌萎缩蛋白质的炎症反应，或仅在低百分比的此类受试者中存在所述炎症反应。不希望受任何特定操作理论的束缚，响应于AAV载体的炎症可能由先天性免疫应答引起。可以使用磁共振成像检测用载体治疗的受试者的肌肉中的炎症(如果存在任何炎症的话)。参见例如J Garcia,Skeletal Radiol29:425-38(2000)和Schulze,M等人，Am J Radiol 192:1708-16(2009)。受试者可以是人受试者或动物受试者，诸如DMD的动物模型，诸如mdx小鼠、mdx大鼠或GRMD狗模型。在上述实施方案中的一些实施方案中，在治疗后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月、25个月、26个月、27个月、28个月、29个月、30个月、31个月、32个月、33个月、34个月、35个月或36个月时，或在治疗后某一其他时间时确定细胞免疫应答或炎症的存在或不存在。在相关实施方案中，对小型抗肌萎缩蛋白质表现出细胞免疫应答的低百分比受试者将小于或等于施用载体的受试者的约0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在这些实施方案的一些实施方案中，AAV载体包含AAV9衣壳和包含编码小型抗肌萎缩蛋白质的人密码子优化基因的基因组，所述AAV载体诸如但不限于命名为AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA的载体。
在相关实施方案中，用于治疗抗肌萎缩蛋白病(诸如肌肉萎缩症，诸如DMD)的本公开的AAV载体的剂量或量是治疗有效的，而不需要在所治疗的受试者中进行伴随免疫抑制。因此，在某些实施方案中，对患有抗肌萎缩蛋白病(诸如DMD)的受试者的治疗是有效的，而不需要在用AAV载体治疗之前、期间或之后向受试者施用一种或多种免疫抑制药物(除了类固醇治疗外，类固醇治疗是目前的治疗标准)。示例性免疫抑制药物包括但不限于钙调神经蛋白抑制剂(诸如他克莫司(tacrolimus)和环孢菌素)、抗增殖剂(诸如霉酚酸酯、来氟米特(leflunomide)和硫唑嘌呤)或mTOR抑制剂(诸如西罗莫司(sirolimus)和依维莫司(everolimus))。
如在实施例中更详细地探索的，可以在杜氏肌营养不良症的动物模型中测试本公开的AAV载体(包括但不限于命名为AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA的载体)的功效，并且将结果用于预测此类载体在人DMD患者中的有效剂量。本领域已知各种动物模型，包括mdx小鼠模型、金毛猎犬肌肉萎缩症模型，以及最近的Dmdmdx大鼠模型，该Dmdmdx大鼠模型在实施例中更详细地描述。
基于Dmdmdx大鼠模型，可以关于大鼠疾病病程的各种生物学参数和方面建立本公开的AAV载体，包括命名为AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA的载体的有效剂量。
因此，根据本公开的某些实施方案，使用至少1×1014vg/kg或3×1014vg/kg剂量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA治疗Dmdmdx大鼠有效地使得在注射后3个月或6个月时与对照相比血清AST、ALT、LDH或总肌酸激酶水平降低。
在其他实施方案中，使用至少1×1014vg/kg或3×1014vg/kg剂量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA治疗Dmdmdx大鼠有效地使得在注射后3个月或6个月时与对照相比股二头肌、膈肌或心肌中的纤维化减少。
在其他实施方案中，使用至少1×1014vg/kg或3×1014vg/kg剂量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA治疗Dmdmdx大鼠有效地使得在注射后3个月或6个月时与对照相比前肢握力增加。
根据其他实施方案，使用至少1×1014vg/kg或3×1014vg/kg剂量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA治疗Dmdmdx大鼠有效地使得在注射后3个月或6个月时与对照相比在5次密集的测试前肢握力的试验中测量的肌肉疲劳降低。
在一些其他实施方案中，使用至少1×1014vg/kg或3×1014vg/kg剂量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA治疗Dmdmdx大鼠有效地使得在注射后6个月时与对照相比使用超声心动描记术测量的左心室射血分数增大。
在其他实施方案中，使用至少1×1014vg/kg或3×1014vg/kg剂量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA治疗Dmdmdx大鼠有效地使得在注射后3个月或6个月时与对照相比使用超声心动描记术测量的早期与晚期左心室充盈的速度比(即，E/A比率)增大。
根据一些实施方案，使用至少1×1014vg/kg或3×1014vg/kg剂量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA治疗Dmdmdx大鼠有效地使得在注射后3个月或6个月时与对照相比使用超声心动描记术测量的等容舒张时间(IVRT)或在峰值E速度与其返回到基线之间的以毫秒计的时间(即，E波减速时间(DT))缩短。
在每个前述实施方案中，在一些实施方案中可以测试用载体治疗的动物中生理学测量值与对照动物相比的增大或减小的统计显著性。选择应用哪种统计测试在本领域的普通技术人员的知识范围内。当采用p值作为评定统计显著性的方式时，此类p值一旦被计算出就可以与预定义的显著性水平进行比较，并且如果p值小于显著性水平，则治疗效果可以确定为具有统计显著性。在一些实施方案中，显著性水平可以预定义为0.25、0.20、0.15、0.10、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.005，或某一其他显著性水平。因此，在显著性水平被预定义为0.05的示例性非限制性实施方案中，则计算出p值<0.05将被解释为表示载体治疗组与对照组之间存在统计学上显著的差异。
在每个前述实施方案中，对照可以是未经治疗或仅用媒介物而不是载体治疗的相同性别和遗传背景的年龄匹配的动物。然而，其他对照也是可能的。
在一些其他实施方案中，用至少3×1014vg/kg的剂量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA治疗Dmdmdx大鼠，到注射后3个月或6个月，有效地转导股二头肌、膈肌、心肌或其他横纹肌并且表达由opti-Dys3978基因编码的小型抗肌萎缩蛋白质，而不诱导针对小型抗肌萎缩蛋白质的细胞免疫应答。可以通过以下方式来评定针对小型抗肌萎缩蛋白质的细胞免疫应答：从测试动物中分离脾细胞或血淋巴细胞(诸如外周血单核细胞(PBMC))，将所述细胞与来自覆盖小型抗肌萎缩蛋白质氨基酸序列的重叠肽库的肽(例如，各自重叠10个氨基酸的15个氨基酸长的肽)在池(例如，5个池)中一起孵育，以及确定细胞是否响应于暴露于所述肽而产生γ干扰素(IFNγ)。可以根据本领域的普通技术人员的知识使用ELISPOT测定来确定IFNγ的产生。参见例如Smith,JG等人，Clin Vaccine Immunol 8(5):871-9(2001)，Schmittel A等人，J Immunol Methods 247:17-24(2001)和Marino,AT等人，测量对重组AAV基因转移的免疫应答(Measuring immune responses to recombinant AAVgene transfer)，第11章，第259-72页，腺相关病毒方法和方案，RO Snyder和P Moullier编辑，Humana Press(2011)。在某些实施方案中，阳性IFNγ应答的阈值可以设定为每百万个测试细胞大于50个斑点形成细胞，或者在其他实施方案中为使用阴性对照(例如，仅没有添加肽的培养基)检测到的斑点形成细胞数量的至少3倍，因此在这些阈值以下将视为阴性应答。
在本公开的治疗方法的一些实施方案中，用于治疗抗肌萎缩蛋白病(诸如DMD)的AAV载体与至少第二被确立或据信有效治疗抗肌萎缩蛋白病(诸如DMD)的药剂一起施用于需要治疗抗肌萎缩蛋白病(诸如DMD)的受试者。AAV载体的组合施用意指在用第二药剂治疗之前、同时或之后治疗受试者。根据某些实施方案，将AAV载体与反义寡核苷酸组合施用，所述反义寡核苷酸引起DMD基因的外显子跳读，例如跳读抗肌萎缩蛋白基因的外显子51，或抗肌萎缩蛋白基因的某一其他外显子。导致跳读抗肌萎缩蛋白基因的外显子51的药剂包括drisapersen和eteplirsen，但是其他药物也是可能的。在其他实施方案中，AAV载体与抑制受试者中肌生成抑制蛋白功能的药剂组合施用，所述药剂为诸如抗肌生成抑制蛋白抗体，该抗肌生成抑制蛋白抗体的示例提供于美国专利号7,888,486、8,992,913和8,415,459中。在其他实施方案中，在受试者的抗肌萎缩蛋白病可以归因于抗肌萎缩蛋白基因中的无义突变的情况下，将AAV载体与促进无义突变的核糖体通读的药剂(诸如阿他卢仑)组合施用，或与抑制提前终止密码子的药剂(诸如氨基糖苷类，诸如庆大霉素(gentamicin))组合施用。在其他实施方案中，将AAV载体与合成代谢类固醇(诸如氧甲氢龙(oxandrolone))组合施用。并且在其他实施方案中，将AAV载体与皮质类固醇组合施用，所述皮质类固醇诸如但不限于强的松、地夫可特或泼尼松龙。在这些方法的一些实施方案中，AAV载体是AAV9载体，所述AAV9载体包含包括编码小型抗肌萎缩蛋白质的人密码子优化基因的基因组，所述AAV载体为诸如但不限于命名为AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA的载体。
药物制剂和施用方式
根据本发明的病毒载体和衣壳可用于兽医和人类医学应用两者中。合适的受试者包括禽类和哺乳动物两者。如本文所用的术语“禽类”包括但不限于鸡、鸭、鹅、鹌鹑、火鸡、野鸡、鹦鹉、长尾小鹦鹉等。如本文所用的术语“哺乳动物”包括但不限于人、非人灵长类动物、牛、绵羊、山羊、马、猫，犬科动物、兔形目动物等。人受试者包括新生儿、婴儿、青少年和成人。任选地，受试者“需要”本发明的方法，例如是因为受试者具有以下疾病或被认为具有患上以下疾病的风险：包括本文所述的那些或将受益于多核苷酸(包括本文所述的那些多核苷酸)的递送的疾病。作为进一步的选择，受试者可以是实验动物和/或疾病的动物模型。
在特定实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含在药学上可接受的载剂中的本发明的病毒载体(诸如rAAV粒子)和/或衣壳，以及任选地其他药用试剂、药剂、稳定剂、缓冲剂、载剂、佐剂、稀释剂等。对于注射，载剂通常是液体。对于其他施用方法，载剂可以是固体或液体。对于吸入施用，载体将是可吸入的，并且任选地可以是固体或液体粒子形式。
“药学上可接受的”是指无毒或在其他方面无不良的材料，即该材料可以施用于受试者而不会引起任何不希望的生物学效应。
本发明的一个方面是将编码小型抗肌萎缩蛋白的多核苷酸转移到体外细胞的方法。可以根据适合于特定靶细胞的标准转导方法，以适当的感染复数将病毒载体导入细胞中。施用的病毒载体的滴度可以根据靶细胞类型和数量以及特定的病毒载体而变化，并且可以由本领域的技术人员在无需过多实验的情况下确定。在代表性实施方案中，将至少约103个感染单位，更优选至少约105个感染单位导入细胞。
病毒载体所导入的细胞可以是任何类型的，包括但不限于肌细胞(例如，骨骼肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和/或膈肌细胞)、干细胞、生殖细胞等。在代表性实施方案中，细胞可以是任何祖细胞。作为另一种可能性，细胞可以是干细胞(例如，肌肉干细胞)。此外，如上所述，细胞可以来自任何物种的来源。
可以将病毒载体导入体外细胞中，以便将经修饰的细胞施用于受试者。在特定实施方案中，已从受试者中取出细胞，将病毒载体导入所述细胞中，然后将所述细胞施用回于受试者。从受试者中取出细胞以进行离体操纵，然后导入回受试者的方法是本领域中已知的(参见例如美国专利号5,399,346)。或者，可以将重组病毒载体导入来自供体受试者的细胞内、培养细胞内或任何其他合适来源的细胞内，并将所述细胞施用于有需要的受试者(即，“受体”受试者)。
用于离体基因递送的合适细胞如上所述。施用于受试者的细胞的剂量将根据受试者的年龄、状况和物种、细胞类型、细胞表达的核酸、施用方式等而变化。通常，将在药学上可接受的载剂中每剂量施用至少约102个到约108个细胞或至少约103个到约106个细胞。在特定实施方案中，将用病毒载体转导的细胞以治疗有效或预防有效量与药物载剂一起施用于受试者。
本发明的另一方面是将病毒载体施用于受试者的方法。将根据本发明的病毒载体和/或衣壳施用于有需要的人受试者或动物可以通过本领域已知的任何手段进行。任选地，将病毒载体和/或衣壳以治疗有效或预防有效剂量在药学上可接受的载剂中递送。
待施用于受试者的病毒载体和/或衣壳的剂量取决于施用方式、待治疗和/或预防的疾病或病症、单个受试者的状况、特定病毒载体或衣壳、以及待递送的核酸等，并且可以按常规方式确定。用于实现治疗效果的示例性剂量为至少约105个、106个、107个、108个、109个、1010个、1011个、1012个、1013个、1014个、1015个转导单位，任选地约108-1013个转导单位的滴度。
在特定实施方案中，可以采用多于一次施用(例如，两次、三次、四次或更多次施用)以在各种间期时段(例如，每天、每周、每月、每年等)内实现期望水平的基因表达。
在某些实施方案中，本公开的AAV载体或粒子可以在包含相同或不同血清型的空AAV衣壳的组合物中施用于受试者。空衣壳是包含典型布置和比率的VP1、VP2和VP3衣壳蛋白质，但不含载体基因组的AAV衣壳。不希望受任何特定操作理论的束缚，假设空衣壳的存在可降低针对AAV载体衣壳的免疫应答，并且由此提高转导效率。空衣壳可以在AAV载体制剂中天然存在，或者以已知量添加以实现空衣壳比AAV载体(即，含有载体基因组的衣壳)的已知比率。空衣壳的制备、纯化和定量在本领域的普通技术人员的知识范围内。包含本公开的AAV载体和空衣壳的组合物可以配制为相对于AAV载体具有过量的空衣壳，或相对于空衣壳具有过量的含有AAV载体的基因组。因此，在一些实施方案中，本公开的组合物包含本公开的AAV载体和相同或不同血清型的空衣壳，其中空衣壳与AAV载体的比率为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10到1，或某一其他比率。
在其他实施方案中，本公开提供了用于治疗抗肌萎缩蛋白病(诸如肌肉萎缩症、诸如DMD)的AAV载体粒子的示例性有效剂量，所述示例性有效剂量定量为每千克受试者体重(kg)的载体基因组(vg)，缩写为vg/kg。根据某些实施方案，本公开的AAV载体，包括包含AAV9衣壳和包含编码小型抗肌萎缩蛋白质的人密码子优化基因的基因组的那些AAV载体(诸如但不限于命名为AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA的载体)的有效剂量为约1×1012vg/kg、2×1012vg/kg、3×1012vg/kg、4×1012vg/kg、5×1012vg/kg、6×1012vg/kg、7×1012vg/kg、8×1012vg/kg、9×1012vg/kg、1×1013vg/kg、2×1013vg/kg、3×1013vg/kg、4×1013vg/kg、5×1013vg/kg、6×1013vg/kg、7×1013vg/kg、8×1013vg/kg、9×1013vg/kg、1×1014vg/kg、1.5×1014vg/kg、2×1014vg/kg、2.5×1014vg/kg、3×1014vg/kg、3.5×1014vg/kg、4×1014vg/kg、5×1014vg/kg、6×1014vg/kg、7×1014vg/kg、8×1014vg/kg或9×1014vg/kg，或某一其他剂量。在这些实施方案中的任何实施方案中，AAV载体可以单独在药学上可接受的组合物中施用于受试者，或者与相同衣壳血清型的空衣壳一起以约0.5:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1或某一其他比率的空衣壳与载体比率在药学上可接受的组合物中施用于受试者。
示例性施用方式包括口服、直肠、透粘膜、鼻内、吸入(例如，通过气溶胶)、经颊(例如，舌下)、阴道、鞘内、眼内、经皮、内皮内、子宫内(或卵内)，肠胃外(例如，静脉内、皮下、皮内、颅内、肌内(包括施用于骨骼肌、膈肌和/或心肌)、胸膜内、脑内和关节内)、局部(例如，施用于皮肤和粘膜表面两者，包括气道表面，以及经皮施用)、淋巴管内等，以及直接组织或器官注射(例如，施用于骨骼肌、心肌或膈肌)。
可以施用到受试者的任何部位，包括但不限于选自由以下各项组成的组的部位：骨骼肌、平滑肌、心脏和膈肌。
根据本发明施用于骨骼肌包括但不限于施用于四肢(例如，上臂、下臂、大腿和/或小腿)、背部、颈部、头部(例如，舌头)、胸部、腹部、骨盆/会阴和/或手指中的骨骼肌。合适的骨骼肌包括但不限于小指展肌(在手中)、小趾展肌(在脚中)、拇展肌、第五指(趾)展肌(abductor ossis metatarsi quinti)、外展拇短肌、外展拇长肌、内收短肌、拇收肌、长收肌、大收肌、拇内收肌、肘肌、前斜角肌、膝关节肌、肱二头肌、股二头肌、肱肌、肱桡肌、颊肌、喙肱肌、皱眉肌、三角肌、口角降肌、降下唇肌、二腹肌、背侧骨间肌(在手中)、背侧骨间肌(在脚中)、桡侧腕短伸肌、桡侧腕长伸肌、尺侧腕伸肌、小指伸肌、指伸肌、趾短伸肌、趾长伸肌、拇短伸肌(extensor hallucis brevis)、拇长伸肌(extensor hallucis longus)、食指伸肌、伸拇短肌(extensor pollicis brevis)、伸拇长肌(extensor pollicis longus)、桡侧腕屈肌、尺侧腕屈肌、小指短屈肌(在手中)、小趾短屈肌(在脚中)、趾短屈肌、趾长屈肌、指深屈肌、指浅屈肌、拇短屈肌(flexor hallucis brevis)、拇长屈肌(flexor hallucislongus)、屈拇短肌(flexor pollicis brevis)、屈拇长肌(flexor pollicis longus)、额肌、腓肠肌、颏舌骨肌、臀大肌、臀中肌、臀小肌、股薄肌、颈髂肋肌、腰髂肋肌、胸髂肋肌、髂肌、下孖肌、下斜肌、下直肌、冈下肌、棘间肌、横突间肌、翼外肌、外直肌、背阔肌、提口角肌、提上唇肌、上唇鼻翼提肌、提上睑肌、肩胛提肌、长回旋肌、头最长肌、颈最长肌、胸最长肌、头长肌、颈长肌、蚓状肌(在手中)、蚓状肌(在脚中)、咬肌、翼内肌、内直肌、中斜角肌、多裂肌、下颌舌骨肌、头下斜肌、头上斜肌、闭孔外肌、闭孔内肌、枕肌、肩胛舌骨肌、小指对掌肌、拇指对掌肌、眼轮匝肌、口轮匝肌、骨间掌侧肌、掌短肌、掌长肌、耻骨肌、胸大肌、胸小肌、腓骨短肌、腓骨长肌、第三腓骨肌、梨状肌、骨间足底肌、跖肌、颈阔肌、腘肌、后斜角肌、旋前方肌、旋前圆肌、腰大肌、股方肌、足底方肌、头前直肌、头侧直肌、头后大直肌、头后小直肌、股直肌、大菱形肌、小菱形肌、笑肌、缝匠肌、小斜角肌、半膜肌、头半棘肌、颈半棘肌、胸半棘肌、半腱肌、前锯肌、短回旋肌、比目鱼肌、头棘肌、颈棘肌、胸棘肌、头夹肌、颈夹肌、胸锁乳突肌、胸骨舌骨肌、胸骨甲状肌、茎舌骨肌、锁骨下肌、肩胛下肌、上孖肌、上斜肌、上直肌、旋后肌、冈上肌、颞肌、阔筋膜张肌、大圆肌、小圆肌、胸肌、甲状舌骨肌、胫骨前肌、胫骨后肌、斜方肌、肱三头肌、股中间肌、股外侧肌、股内侧肌、颧大肌和颧小肌，以及本领域中已知的任何其他合适的骨骼肌。
病毒载体可以通过静脉内施用、动脉内施用、腹腔内施用、肢体灌注(任选地，腿和/或手臂的隔离肢体灌注；参见例如Arruda等人，(2005)Blood 105:3458-3464)和/或直接肌内注射而递送到骨骼肌。在特定实施方案中，通过肢体灌注，任选地隔离肢体灌注(例如，通过静脉内或关节内施用)而将病毒载体和/或衣壳施用于受试者(例如，患有肌肉萎缩症例如DMD的受试者)的肢体(手臂和/或腿)。在本发明的实施方案中，本发明的病毒载体和/或衣壳可以有利地在无需采用“流体动力学”技术的情况下施用。现有技术载体的组织递送(例如，到肌肉)通常通过流体动力学技术(例如，静脉内/大体积静脉内施用)来增强，所述流体动力学技术增大脉管系统中的压力并促进载体穿过内皮细胞屏障的能力。在特定实施方案中，本发明的病毒载体和/或衣壳可以在不存在流体动力学技术的情况下施用，所述流体动力学技术为诸如高体积灌注和/或升高的血管内压(例如，大于正常的收缩压，例如与正常收缩压相比，血管内压增加小于或等于5％、10％、15％、20％、25％)。这些方法可以减少或避免与流体动力学技术相关的副作用，诸如水肿、神经损伤和/或筋膜室综合征。
施用于心肌包括施用于左心房、右心房、左心室、右心室和/或隔膜。病毒载体和/或衣壳可通过静脉内施用、动脉内施用(诸如主动脉内施用)、直接心脏注射(例如，注射到左心房、右心房、左心室、右心室内)和/或冠状动脉灌注而递送到心肌。
施用于膈肌可以通过任何合适的方法进行，包括静脉内施用、动脉内施用和/或腹膜内施用。
施用于平滑肌可以通过任何合适的方法进行，包括静脉内施用、动脉内施用和/或腹膜内施用。在一个实施方案中，施用可以是到存在于平滑肌中、平滑肌附近和/或平滑肌上的内皮细胞。
还可以通过递送包含病毒载体和/或衣壳的贮库来实现到靶组织的递送。在代表性实施方案中，将包含病毒载体和/或衣壳的贮库植入骨骼肌、平滑肌、心肌和/或膈肌组织中，或者组织可与包含病毒载体和/或衣壳的膜或其他基质接触。此类可植入的基质或基底描述于美国专利号7,201,898中。
在特定实施方案中，将根据本发明的病毒载体施用于骨骼肌、膈肌和/或心肌(例如，以治疗和/或预防肌肉萎缩症)。
在代表性实施方案中，本发明用于治疗和/或预防骨骼肌、心肌和/或膈肌的病症。
在代表性实施方案中，本发明提供了治疗和/或预防有需要的受试者的肌肉萎缩症的方法，所述方法包括：向哺乳动物受试者施用治疗或预防有效量的本发明的病毒载体，其中所述病毒载体包含编码抗肌萎缩蛋白、小型抗肌萎缩蛋白或微型抗肌萎缩蛋白的异源核酸。在特定实施方案中，病毒载体可以如本文其他地方所述施用于骨骼肌、膈肌和/或心肌。
注射剂可以按常规形式制备，所述常规形式是液体溶液或悬浮液、适合在注射前在液体中溶解或悬浮的固体形式，或者是乳液。或者，可以按局部而非全身方式，例如以贮库或缓释制剂施用本发明的病毒载体和/或病毒衣壳。此外，病毒载体和/或病毒衣壳可以附着于可手术植入的基质上而进行递送(例如，如美国专利公开号2004-0013645中所述)。
已经描述了本发明，将在以下实施例中更详细地解释本发明，以下实施例仅出于说明目的而包括在本文中，并且不旨在限制本发明。
实施例1
密码子优化的人小型抗肌萎缩蛋白基因的合成
先前我们通过人肌肉抗肌萎缩蛋白cDNA的PCR克隆产生了许多人抗肌萎缩蛋白基因的小型版本，从而产生了在中心棒结构域中具有大缺失并且几乎完全缺失抗肌萎缩蛋白编码序列的C末端区域的小型抗肌萎缩蛋白基因(Wang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA97:13714(2000)；美国专利号7,001,761和7,510,867)。这些小型抗肌萎缩蛋白基因被测试出在DMD mdx小鼠模型中在体内具有高功能性(Watchko等人，Human Gene Therapy 13:1451(2002))。这些小型抗肌萎缩蛋白质中名为Δ3990的一种在美国专利号7,510,867中描述为SEQ ID NO:6。Δ3990的蛋白质序列和编码其的DNA在本文中分别由SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28提供。
对Δ3990小型抗肌萎缩蛋白的修饰还经设计、经密码子优化并经活性测试。该新的人小型抗肌萎缩蛋白称为Dys3978，长度为1325个氨基酸，并且包含来自野生型全长人肌肉抗肌萎缩蛋白(SEQ ID NO:25)的下列部分或亚结构域：N末端和肌动蛋白结合结构域(ABD)，铰链H1，棒R1和R2，铰链H3，棒R22、R23和R24，铰链H4，富含半胱氨酸的结构域(CR结构域)和羧基末端结构域(CT结构域)的部分。该蛋白质的氨基酸序列由SEQ ID NO:7提供，并在图1中示意性地显示。为了降低潜在的免疫原性，使Δ3990蛋白质C末端的最后四个氨基酸缺失。在产生Δ3990时，已经通过将抗肌萎缩蛋白羧基末端结构域的氨基末端的一部分(在P3409处结束)与抗肌萎缩蛋白的最后三个氨基酸(3683-3685，或DTM)连接而形成了该序列。这段四个氨基酸没有已知的功能，并且可以作为新的表位起作用，因为该序列不存在于野生型抗肌萎缩蛋白中。此外，Δ3990中的氨基酸位置2处的缬氨酸(不存在于野生型抗肌萎缩蛋白中，而是由在Δ3990的起始密码子周围产生共有Kozak起始序列而产生)被改变为通常存在于抗肌萎缩蛋白中的亮氨酸。因此，Δ3990与Dys3978之间存在5个氨基酸差异。图55A-55C中提供了Δ3990与Dys3978之间的氨基酸序列比对。
通过组合来自野生型抗肌萎缩蛋白编码序列的、对应于上述蛋白质亚结构域的子序列而构建编码Dys3978的基因。所得基因由SEQ ID NO:26提供。为了增加Dys3978的表达，使用人密码子算法对基因序列进行密码子优化。所得人密码子优化基因，称为Hopti-Dys3978，被提供为SEQ ID NO:1。还产生了编码Dys3978的犬密码子优化基因，该基因被称为Copti-Dys3978，其序列被提供为SEQ ID NO:3。比较Hopti-Dys3978的DNA序列与编码Δ3990的非密码子优化基因的比对提供于图56A-56I中。
除了其他变化外，对编码Dys3978的基因的密码子优化使总GC含量从非密码子优化基因中的约46％增加到人密码子优化基因(即，Hopti-Dys3978)中的约61％。增加GC含量可导致哺乳动物细胞中的mRNA水平增加。参见例如Grzegorz,K等人，PLoS Biol,4(6):e180(2006)；和Newman,ZR等人，PNAS,E1362-71(2016)。密码子优化还增大了密码子适应指数(CAI)，并且包括在编码序列的开始处添加Kozak共有转录起始识别位点。
为了检查人密码子优化是否可以增强基因表达，将Hopti-Dys3978基因克隆到含有组成型活性CMV启动子和小合成多腺苷酸化(polyA)信号序列(SEQ ID NO:6)的AAV载体表达盒中。在转染到人HEK 293细胞内之后，含有Hopti-Dys3978基因的载体质粒显示出比编码Dys3978的非优化基因令人惊讶的更多蛋白质表达，如使用针对抗肌萎缩蛋白质的免疫荧光染色和蛋白质印迹法定性确定的(图2)。
还产生了编码在结构上与Dys3978类似(除了不存在铰链H3之外)的人小型抗肌萎缩蛋白的基因，并对该基因进行了密码子优化。该基因被称为Hopti-Dys3837(SEQ ID NO:2)，编码被称为Dys3837的1278个氨基酸的人小型抗肌萎缩蛋白(SEQ ID NO:8)，其也示意性地示于图1中。
对于本文所述的其他实验，将人和犬密码子优化的Dys3978基因置于以下鉴别出的来源于肌肉肌酸激酶基因的两种不同的合成的肌肉特异性启动子和增强子组合中的一种组合的控制下：
1)合成的杂合肌特异性启动子(hCK)(SEQ ID NO:4)；以及
2)合成的杂合肌特异性启动子+(hCKplus)(SEQ ID NO:5)；
为了在实验中使用，使用标准分子克隆技术构建以下载体。将特定启动子、小型抗肌萎缩蛋白基因和polyA序列的基因表达盒克隆到含有表达盒侧翼为AAV2反向末端重复序列(ITR)的AAV载体质粒骨架中。
1)AAV-CMV-Hopti-Dys3978
2)AAV-hCK-Hopti-Dys3978(SEQ ID NO:9)
3)AAV-hCK-Hopti-Dys3837(SEQ ID NO:10)
4)AAV-hCKplus-Hopti-Dys3837(SEQ ID NO:11)
5)AAV-hCK-Copti-Dys3978(SEQ ID NO:12)
实施例2
抗肌萎缩蛋白/抗肌萎缩蛋白相关蛋白双敲除小鼠中的CMV-Hopti-Dys3978
杜氏肌营养不良症(DMD)患者中的抗肌萎缩蛋白的损失导致破坏性的骨骼肌退化和心肌病。仅缺乏抗肌萎缩蛋白的Mdx小鼠具有更轻微的表型，而缺乏抗肌萎缩蛋白及其同源抗肌萎缩蛋白相关蛋白的双敲除(dKO)小鼠表现出在DMD患者中看到的类似严重的营养不良临床症状。先前已经证实，用3×1011vg/小鼠的AAV1-CMV-Δ3990(未经密码子优化)对新生纯合dKO小鼠进行腹腔内注射能够部分恢复生长、功能且延长寿命达几个月(在22周时50％的存活率)(参见来自Wang等人，J.Orthop.Res,27:421(2009)的图6B)。在此，使用AAV9作为衣壳来评估全身递送人密码子优化的Hopti-Dys3978基因的治疗效果。结果表明，将AAV9-CMV-Hopti-Dys3978以约2×1013vg/kg单次全身施用(IP)到1周龄的新生dKO小鼠中导致小型抗肌萎缩蛋白基因在骨骼肌和整个心肌中广泛表达(图3)。AAV9治疗的dKO小鼠显示出接近正常的生长曲线和体重(图4)和如通过握力和跑台运动测试评估的显著改善的肌肉功能(图5)。经治疗的dKO小鼠还显示出营养不良病理现象的改善(图6A-6B)和总体健康的极大改善。与用表达非密码子优化的Δ3990的AAV1载体治疗的dKO小鼠相比，用Hopti-Dys3978基因治疗的dKO小鼠显示出更长的寿命(50％存活率：22周对比超过80周)(图7)。出乎意料的是，雄性和雌性dKO小鼠的生育力恢复(表1)，表明总体功能得到改善并且可能也改善了平滑肌功能。
表1
小型抗肌萎缩蛋白恢复dKO小鼠的生育力
繁殖对：
未治疗的dKO小鼠完全不育。然而，由AAV-CMV-Hopti-Dys3978在经治疗的dKO(T-dKO)小鼠的雄性和雌性中均恢复了生育力。
上述结果表明，密码子优化的Hopti-Dys3978基因的全身递送比非密码子优化的Δ3990基因更有效。
重要的是，还观测到了心脏功能的巨大改善。在4月龄时使用Millar压力-容积系统通过血液动力学分析评估心脏中的治疗效果。未治疗的dKO小鼠勉强存活超过4个月。非常小的体型、脊柱后凸和严重的肌肉和心脏功能障碍使得dKO小鼠病得太严重而不能承受血液动力学分析程序。因此，将AAV9治疗的dKO小鼠与未治疗的年龄匹配mdx小鼠进行比较，所述mdx小鼠由于完整的抗肌萎缩蛋白相关蛋白基因而具有更轻度的表型，该完整的抗肌萎缩蛋白相关蛋白基因已知在该模型中补偿抗肌萎缩蛋白的缺乏。虽然通过超声心动描记术进行的测量显示mdx小鼠当与C57/B10野生型小鼠相比时在基线条件下没有明显的心脏缺陷，但如在基线处通过血液动力学测量的，它们确实显示出明显缺陷(图8，空心条形图)。本文的结果显示，用AAV9治疗的dKO小鼠显示出与mdx小鼠相似的基线心脏血液动力学，包括收缩末期压力、舒张末期容积、等容收缩最大速率(dp/dt最大)和等容舒张最大速率(dp/dt最小)。然而，在用多巴酚丁胺攻击后，经处理的dKO小鼠显示出与mdx小鼠相似的基线心脏血液动力学，包括收缩末期压力、舒张末期容积、等容收缩最大速率(dp/dt最大和dp/dt最小)，而用AAV9治疗的dKO小鼠在所检查的每个参数方面的表现明显优于mdx小鼠(图8，实心条形图)。此外，超过50％的mdx小鼠在30min的多巴酚丁胺攻击窗口内死亡，这与我们先前的报道一致(Wu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:14814(2008))。与此形成鲜明对比的是，由于用AAV9治疗的dKO小鼠中小型抗肌萎缩蛋白转基因的心脏表达，多巴酚丁胺诱导的心衰在很大程度上得到了预防。超过90％的用AAV9治疗的dKO小鼠在30min的窗口中的多巴酚丁胺应激测试下存活。最后，心电图(ECG)中显示的常见PR间期不足也得到了改善(图9A-9B)。PR间期是从P波开始到QRS复合波开始的时间。总的来说，这些结果证明了AAV9-CMV-Hopti-Dys3978基因疗法对严重DMD小鼠模型中的心肌病的有效性。
实施例3
mdx小鼠中的hCK-Hopti-Dys3978
为了检查杂合的合成肌肉特异性启动子hCK是否能够有效驱动Dys3978基因表达，将该启动子与由非特异性CMV强启动子驱动的相同构建体进行比较。在尾静脉注射相应载体后对mdx小鼠中小型抗肌萎缩蛋白表达的免疫荧光染色显示，两种启动子，即hCK和CMV，在肌肉和心脏中递送相等的表达水平(图10)。
实施例4
DMD犬模型金毛猎犬肌肉萎缩症(GRMD)狗中的CMV-Hopti-Dys3978
基于对mdx小鼠和抗肌萎缩蛋白/抗肌萎缩蛋白相关蛋白双KO(dKO)小鼠的研究，在大型动物DMD模型金毛猎犬肌肉萎缩症(GRMD)狗中测试相同的载体AAV9-CMV-Hopti-Dys3978。具体地，将载体施用于2.5月龄的GRMD狗“Jelly”，然后在注射后随访超过8年。
实验程序：向GRMD狗“Jelly”(2.5月龄的雌性；6.3kg；血清CK：在治疗前20262单位/L)通过右后肢以1×1013vg/kg的剂量注射AAV9-CMV-Hopti-Dys3978载体。在全身麻醉下，将橡皮止血带置于近侧骨盆末端(腹股沟区域)处以覆盖右后肢的大部分肌肉。使用设置为1ml/秒注射速度的Harvard泵经由大隐静脉注射AAV9载体。载体体积为20ml/kg体重(总共130ml)。在注射开始计10分钟后释放止血带。如通过触诊显示的，注射肢体中的肌肉变得更硬。后肢上的MRI图像在注射后约1小时收集，并确认了所注射的肢体中的载体流体(图11)。在整个8年以上的观测中，在任何时间点都没有使用诸如类固醇之类的免疫抑制剂。在载体注射后长达4年的5个时间点进行肌肉活检程序。最后的尸检在8岁零4个月时完成，此时“Jelly”仍然是可走动的，但比之前活动少得多。
结果：免疫荧光(IF)染色显示在直至最终尸检时检查的大多数肌肉样品中的长期小型抗肌萎缩蛋白表达。有趣的是，最初注射的肢体(注射后2个月活检时)具有比未注射肢体更低的表达，表明程序相关的炎症和CMV启动子的部分失活(图12)。然而，尽管在经注射的肢体中出现了初始炎症，但是人小型抗肌萎缩蛋白表达在“Jelly”中持续了8年。在随后的时间点(载体注射后7个月、1年、2年和4年时)的肌肉活组织检查以及对人小型抗肌萎缩蛋白的免疫荧光染色和蛋白质印迹显示持久的基因表达(图13-17)。虽然小型抗肌萎缩蛋白阳性肌纤维的百分比在不同肌肉中不同，但某些肌肉在尸检时具有超过90％的肌纤维呈阳性(图18)。对小型抗肌萎缩蛋白和回复突变肌纤维(抗C末端抗体)的共染色显示两者共存(图19)。在约20％的心肌细胞中也观测到了小型抗肌萎缩蛋白(图18)。总体基因表达很大程度上是稳定的。例如，颅缝匠肌中的阳性肌纤维贯穿从2个月和7个月到1年、4年和8年的6个时间点保持相当(比较图12、图13、图14、图17和图18)。蛋白质印迹法证实了IF染色结果(图20)。
与未治疗的狗相比，收缩力测量显示出部分改善(图21)。“Jelly”在整个超过8年的治疗后观测时段期间仍是保持可走动的，并在最后一年因心肌病而被安乐死。在尸检和由病理学家检查时，在任何组织中均未发现肿瘤。DNA测序显示，如最近所报道的，“Jelly”没有携带如最近报道的在两种轻度表型的GRMD狗中发现的疾病修饰锯齿形1突变(Vieira等人，Cell163:1204(2015))。
实施例5
GRMD狗中的hCK-Copti-Dys3978
在该研究中，将AAV9-hCK-Copti-Dys3978载体(驱动犬密码子优化的人小型抗肌萎缩蛋白3978的经修饰的肌酸激酶启动子)用于名为“Dunkin”的GRMD狗中。该基因编码与其他研究中使用的相同的人小型抗肌萎缩蛋白Dys3978蛋白质，但是经过了犬密码子优化。DNA序列与人密码子优化基因94％同一。在人HEK 293细胞中比较CK-Copti-Dys3978(犬密码子优化的)与CK-Hopti-Dys3978(人密码子优化的)的转染实验揭示了基本相同的表达水平。在mdx小鼠中比较两种构建体的多个实验也显示出基本上相同的表达水平。
实验程序：经由大隐静脉以4×1013vg/kg的剂量向GRMD狗“Dunkin”(雌性，2.5月龄，6.5g)静脉内注射AAV9-hCK-Copti-Dys3978载体。狗在注射期间没有打麻醉剂。没有明显的不良反应或行为改变。在载体注射后4个月进行肌肉活检，并在注射后14个月时进行尸检。
结果：通过对从注射后4个月活检(图22)到注射后14个月尸检(图23-26为关于尸检)的骨骼肌样品上的小型抗肌萎缩蛋白3978进行免疫荧光染色而观测到了非常高水平和几乎均匀的小型抗肌萎缩蛋白表达。
通过IF染色也观测到了心肌中显著高水平的小型抗肌萎缩蛋白(图27)。来自CK启动子的表达似乎比来自CMV启动子的表达更强且更均匀。
蛋白质印迹分析证实了IF染色结果。在骨骼肌中，小型抗肌萎缩蛋白水平大多高于来自正常狗对照的野生型抗肌萎缩蛋白的正常水平(图28)。心脏中Dys3978的水平是野生型抗肌萎缩蛋白水平的大致一半(图29)。
从犬密码子优化基因Copti-Dys3978表达Dys3978有效地恢复了包含γ-肌聚糖的抗肌萎缩蛋白相关的蛋白质复合物(图30)。
载体DNA拷贝数的定量PCR显示出与小型抗肌萎缩蛋白质表达水平一致的趋势(图31)。
在所有检查的样品中均未发现先天性免疫应答或细胞免疫应答。这与AAV9-CMV-opH-dys3978的结果非常不同，表明肌肉特异性hCK启动子不仅强而且还比CMV启动子更安全。
如通过针对心脏(图32)、膈肌(图33)和肢体肌肉(图34)的组织学H&E染色显示的，营养不良病理学在很大程度上得到了改善。三色马森蓝染也显示肢体肌肉和膈肌中的纤维化显著减少(图35)。
实施例6
用于体内实验的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体的制备
在实施例7、8和9中进一步描述的Dmdmdx大鼠研究中使用的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体包含AAV9衣壳和表达盒，所述表达盒被设计成表达人抗肌萎缩蛋白质的小型化形式，所述人抗肌萎缩蛋白质的小型化形式包含N末端区域、铰链1(H1)、棒1(R1)、棒2(R2)、铰链3(H3)、棒22(R22)、棒23(R23)、棒24(R24)、铰链4(H4)、富含半胱氨酸(CR)的结构域，以及来自全长人Dp427m抗肌萎缩蛋白质(SEQ ID NO:25)的羧基末端(CT)结构域的部分，这些结构域是功能最低限度所需的结构域。小型抗肌萎缩蛋白质的蛋白质序列被提供为SEQ ID NO:7的氨基酸序列，其由作为SEQ ID NO:1的核酸序列提供的人密码子优化的DNA序列编码。，AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体的载体基因组被提供为SEQ ID NO:18的核酸序列，或当单链基因组以其负极性包装时，被提供为其反向互补序列。
载体基因组包含5'和3'侧翼AAV2反向末端重复序列(ITR)(分别具有SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的DNA序列)、用以充当肌肉特异性转录调控元件(hCK；具有SEQ ID NO:16的DNA序列)的来源于肌酸激酶(CK)基因的合成杂合增强子和启动子、3978碱基对长的编码上述人小型抗肌萎缩蛋白的人密码子优化基因(即，Hopti-Dys3978基因)，以及包含多腺苷酸化(polyA)信号的小合成转录终止序列(spA；具有SEQ ID NO:17的DNA序列)。
使用三重转染技术和来源于HEK 293细胞的无血清非附着性细胞系来制造载体。所使用的质粒包括用于表达腺病毒辅助蛋白质的辅助质粒，所述腺病毒辅助蛋白质是载体有效复制和包装所需的、表达AAV2 rep基因和AAV9衣壳蛋白的包装质粒，以及含有上述表达盒的序列的第三质粒。
使细胞从工作细胞库样品中生长并扩增，并且一旦达到足够的体积和细胞密度，就使用转染试剂转染细胞。在孵育以允许从转染细胞产生载体后，裂解细胞以释放载体，澄清裂解物，并使用核酸酶处理步骤去除污染核酸以纯化载体，然后进行碘克沙醇(iodixanol)分步梯度离心、阴离子交换色谱、针对制剂缓冲液的透析、无菌过滤，然后在2-8℃下储存。
实施例7
单剂量AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA对DMD大鼠模型的影响
该实施例描述了在最近开发的Dmdmdx大鼠模型中测试AV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA，Dmdmdx大鼠模型与经典的mdx小鼠和GRMD狗模型相比具有某些优势。Larcher,T.等人，抗肌萎缩蛋白缺陷大鼠的表征：杜氏肌营养不良症的新模型(Characterizationof dystrophin deficient rats:a new model for Duchenne muscular dystrophy).PLoS One.2014；9(10):e110371。具体地，在Dmdmdx大鼠模型中，骨骼和心脏疾病都存在于早期阶段并且以与在人中观测到的疾病进展类似的顺序方式发展。
在这些研究中，通过静脉(IV)注射向5-6周龄的雄性Dmdmdx大鼠全身施用单剂量(1×1014个载体基因组/千克体重，或vg/kg)的悬浮于PBS中的Dys3978载体到尾静脉中。作为对照，也以这种方式处理来自相同遗传背景(Sprague Dawley)的野生型(“WT”)大鼠。在对大鼠基因型或治疗群组不知情的情况下进行所有程序以避免偏倚。用载体治疗三只Dmdmdx大鼠和4只WT大鼠，而3只Dmdmdx大鼠和2只WT大鼠仅施用PBS以作为阴性对照(模拟物治疗)。注射后3个月时，对动物实施安乐死并进行尸检，以通过组织学和免疫细胞化学对抗肌萎缩蛋白质表达进行组织分析。
对于组织病理学评估，将组织样品在10％中性缓冲福尔马林中固定，包埋在石蜡中，并且在用苏木精-伊红-番红花(HES)染色之前切成5μm厚切片。对于抗肌萎缩蛋白免疫标记，将另外的样品(肝脏、心脏、股二头肌、胸肌和膈肌)冷冻并切成8μm厚切片。将针对抗肌萎缩蛋白的小鼠单克隆抗体NCL-DYSB(Novocastra Laboratories，Newcastle on Tyne，UK)用于抗肌萎缩蛋白检测和小型抗肌萎缩蛋白质检测(1:50)两者，因为该抗体不区分全长野生型抗肌萎缩蛋白和经工程化的小型抗肌萎缩蛋白。所有尸检和组织学观测均以盲法进行。
通过组织学检查，在用PBS治疗的WT大鼠和用载体治疗的WT大鼠的骨骼肌或心肌中未观测到病变。在所有Dmdmdx大鼠中，存在显示出单个坏死、再生小纤维簇、分散的巨大透明纤维、红细胞不均、中央成核，肌内膜纤维化和散发性肥胖(sporadic adiposis)的骨骼肌纤维病变，并且所述骨骼肌纤维病变是DMD骨骼肌的特征。与仅用PBS治疗的Dmdmdx大鼠相比，用载体治疗的Dmdmdx大鼠中这些病变的发生率和强度全局降低。在心脏中，在用PBS治疗的Dmdmdx大鼠中的一只大鼠(大鼠49)中存在多灶性坏死、单核细胞局灶性浸润和轻度局灶性广泛纤维化的病变，所述病变是DMD心肌的特征。在用载体治疗的所有Dmdmdx大鼠中，心肌表现是相似的并且显示出如在接受PBS的Dmdmdx大鼠中所见的轻度单核细胞局灶性浸润，但是相比之下，在用载体治疗的Dmdmdx大鼠的心脏中未观测到纤维化病灶。
使用免疫细胞化学，WT大鼠显示为在骨骼肌、膈肌和心肌纤维中检测到肌膜下抗肌萎缩蛋白，并且所检测到的抗肌萎缩蛋白的定位在用载体治疗的大鼠与仅PBS治疗的大鼠之间没有差异。然而，使用该测定无法确认用载体治疗的WT大鼠中的小型抗肌萎缩蛋白检测，因为所使用的针对抗肌萎缩蛋白的抗体不能区分野生型抗肌萎缩蛋白和小型抗肌萎缩蛋白质。相比之下，DMDmdx大鼠中的一只大鼠(大鼠49)显示出具有可检测的肌膜下抗肌萎缩蛋白的罕见骨骼肌纤维(从约5％到10％)，这与在该模型中存在具有约5％频率的分散回复突变纤维的先前描述(Larcher等人，PlosOne,2014)一致。然而，在来自该大鼠的膈肌或心肌纤维中未检测到抗肌萎缩蛋白。在所有用Dys3978载体治疗的Dmdmdx大鼠中，在约80％到95％的骨骼肌纤维中、约30％到50％的膈肌纤维中、以及约70％到80％的心肌纤维中也检测到了肌膜下抗肌萎缩蛋白，尽管没有进行系统计数。在这些大鼠中，非常罕见的骨骼肌纤维(每个肌肉切片1或2个)显示出了一些细胞质原纤维间抗肌萎缩蛋白。在用载体治疗的WT大鼠和Dmdmdx大鼠中都没有炎性细胞浸润或坏死增加的迹象，炎性细胞浸润或坏死增加可能表明已经通过载体转导或小型抗肌萎缩蛋白的产生而刺激了细胞免疫应答。
总之，全身施用1×1014vg/kg的AAV9.hCK.opti-Dys3978.spA载体后3个月后，相比PBS，在用载体治疗的WT大鼠未观测到肌肉组织的组织学改变，表明在健康动物中小型抗肌萎缩蛋白质的表达被良好地耐受。此外，Dmdmdx大鼠的载体治疗导致在所研究的所有肌肉(股二头肌、胸肌、膈肌和心肌)的纤维中小型抗肌萎缩蛋白显著且普遍的检测，所述小型抗肌萎缩蛋白具有与WT大鼠肌肉中类似的肌膜下定位模式。来自载体的小型抗肌萎缩蛋白Dys3978的表达与纤维化和坏死的减少有关(图36A-36D)。
实施例8
在注射后3个月和6个月时确定的增加剂量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA对Dmdmdx大鼠的影响
该实施例描述了用增加剂量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA治疗杜氏肌营养不良症动物模型Dmdmdx大鼠，以及在施用后3个月和6个月时测量效果的结果。
通过静脉注射到阴茎背静脉中在7-8周龄时向大鼠给药，所述静脉注射导致测试制品的全身施用。在10-12只Dmdmdx大鼠中测试了以下四种不同的载体剂量：1×1013vg/kg(5只大鼠在3个月时间点，并且6只大鼠在6个月时间点)、3×1013vg/kg(6只大鼠在3个月时间点，并且5只大鼠在6个月时间点)、1×1014vg/kg(7只大鼠在3个月时间点，并且6只大鼠在6个月时间点)，以及3×1014vg/kg(5只大鼠在3个月时间点，并且5只大鼠在6个月时间点)。此外，Dmdmdx大鼠和WT大鼠各自仅接受媒介物(1x PBS、215mM NaCl、1.25％人血清白蛋白、5％(w/v)山梨糖醇)以作为阴性对照(6只Dmdmdx大鼠在3个月时间点，4只Dmdmdx大鼠在6个月时间点，5只WT大鼠在3个月时间点，并且7只WT大鼠在6个月时间点)。还包括5只未治疗的(即，没有载体且没有媒介物)Dmdmdx大鼠以作为进一步的阴性对照。在注射后3个月和6个月时，对来自每个测试组的大鼠实施安乐死并进行尸检以取得组织样品用于进一步分析。在处死之前，在测试动物中进行心脏功能和握力测试以评定载体治疗对DMD疾病进展的影响。
应注意，载体剂量可以在文本和附图中以两种不同的数值等效方式表示。因此，“1×1013”等同于“1E13”，“3×1013”等同于“3E13”，“1×1014”等同于“1E14”，并且“3×1014”等同于“3E14”。
体重
在治疗之后并且在处死之前，每个治疗组中的大鼠在第一周每天称重，之后每周称重直至处死。每个治疗组中所有大鼠的平均重量列于表2(注射前至注射后9周)和表3(注射后10-25周)，并在图37中绘制成针对时间的图。在该图中，误差条表示平均值的标准误差(SEM)，该SEM也在表中报告。在所有时候，WT大鼠的平均重量超过Dmdmdx大鼠的平均重量，包括用载体治疗的那些Dmdmdx大鼠的平均重量。由于Dmdmdx大鼠间年龄差异和体质量的自然变化，剂量与体重之间没有一致的相关性，直到注射后4周时，此时除了最高剂量组中的大鼠之外的所有用载体治疗的Dmdmdx大鼠的体重均高于未治疗的Dmdmdx大鼠，但低于WT大鼠。到注射后12周时，剂量效应在所有治疗组中都是明显的，其中体重与测试的所有剂量下的载体剂量成比例，直到研究结束。
用AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体治疗的Dmdmdx大鼠中的载体转导和RNA及蛋白质表达的定量
材料和方法
使用标准分子生物学技术，以通过定量PCR(qPCR)定量转基因拷贝数、通过逆转录酶qPCR(RT-qPCR)定量小型抗肌萎缩蛋白mRNA转录物的相对表达水平，以及通过蛋白质印迹分析定性地定量小型抗肌萎缩蛋白质表达的量。
对于qPCR，使用来自Qiagen的Gentra Puregene试剂盒从组织中纯化基因组DNA(gDNA)。然后使用StepOne PlusTM实时PCR系统(AppliedThermo FisherScientific)、使用50ng gDNA一式两份地分析样品。所有反应均在双链体中进行，最终体积为20μL，含有模板DNA、Premix Ex taq(Ozyme)、0.3μL的ROX参比染料(Ozyme)，0.2μmol/L的各引物和0.1μmol/L的探针。
使用设计用于扩增小型抗肌萎缩蛋白转基因的某一区域的引物和探针来确定载体拷贝数：
正向：5’-CCAACAAAGTGCCCTACTACATC-3’SEQ ID NO:19
逆向：5’-GGTTGTGCTGGTCCAGGGCGT-3’SEQ ID NO:20
探针：5’-FAM-CCGAGCTGTATCAGAGCCTGGCC-TAMRA-3’SEQ ID NO:21
使用设计用于扩增大鼠HPRT1基因的引物和探针确定内源gDNA拷贝数：
正向：5’-GCGAAAGTGGAAAAGCCAAGT-3’SEQ ID NO:22
逆向：5’-GCCACATCAACAGGACTCTTGTAG-3’SEQ ID NO:23
探针：
5’-JOE-CAAAGCCTAAAAGACAGCGGCAAGTTGAAT-TAMRA-3’SEQ ID NO:24
对于每个样品，将阈值循环(Ct)值与用不同稀释度的线性化标准质粒(含有小型抗肌萎缩蛋白表达盒或大鼠HPRT1基因)获得的Ct值进行比较。通过分析从来自对照动物的组织样品中提取的50ng gDNA(该gDNA掺有不同稀释度的标准质粒)进行分析，核查了在gDNA存在下不存在qPCR抑制。使用双链qPCR(在相同反应中扩增2个序列)，并且结果表示为每二倍体基因组的载体基因组(vg/dg)。测试的灵敏度为0.003vg/dg。
对于RT-qPCR，用试剂(Thermo Fisher Scientific)从组织样品中提取总RNA，然后用来自TURBO不含DNA试剂盒(Thermo Fischer Scientific)的不含RNA酶的DNA酶I进行处理。使用随机引物(Thermo Fischer Scientific)和M-MLV逆转录酶(ThermoFischer Scientific)逆转录总RNA(500ng)，最终体积为25μL。然后使用与用于通过qPCR来定量转基因拷贝数的相同的小型抗肌萎缩蛋白和大鼠HPRT1特异性引物和探针对经1/15稀释的cDNA进行双链qPCR分析。通过分析从来自对照动物的组织样品获得的cDNA(掺有不同稀释度的标准质粒)，核查了在cDNA存在下不存在qPCR抑制。将每种RNA样品的Ct值与用不同稀释度的标准质粒(含有小型抗肌萎缩蛋白表达盒或大鼠HPRT1基因)获得的Ct值进行比较。结果以相对数量(RQ)表示：
RQ＝2-ΔCt＝2-(Ct靶-Ct内源性对照)
对于每种RNA样品，不存在DNA污染还通过分析在反应混合物中不添加逆转录酶的情况下获得的“cDNA样样品”得到证实。
对于对所表达的蛋白质水平的蛋白质印迹分析，使用含有蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich)的RIPA缓冲液从组织样品中提取总蛋白质。将蛋白质提取物(对于股二头肌、心脏和隔膜50μg或对于肝脏100μg)加载到Novex 3-8％Tris乙酸酯凝胶上，并使用大蛋白质印迹试剂盒(Thermo Fischer Scientific)进行分析。在装载前使用最终浓度为200mM的DTT减少蛋白质。然后将膜在5％脱脂乳、1％NP40(Sigma-Aldrich)在TBST(tris缓冲盐水，0.1％吐温20(Tween 20))的溶液中封闭，并与特异性针对抗肌萎缩蛋白质的外显子10和11的针对抗肌萎缩蛋白的抗体(1:100，MANEX 1011C单克隆抗体)和第二抗小鼠IgG HRP缀合抗体(1:2000，Dako)杂交。对于蛋白质加载对照，相同的膜也与抗大鼠α-微管蛋白抗体(1:10000，Sigma)和第二抗小鼠IgG HRP缀合抗体(1:2000，Dako)杂交。用ECL化学发光分析系统(Thermo Fisher Scientific)使免疫印迹可视化。
注射后3个月和6个月时人小型抗肌萎缩蛋白转基因拷贝数
在下表中描述了在用载体和媒介物治疗的Dmdmdx大鼠和在仅施用媒介物的WT大鼠的全血、脾、心脏、股二头肌、胸肌、膈肌和肝脏中的转基因拷贝数(作为每二倍体基因组的载体基因组(vg/dg))的测试结果。注射后3个月时的数据提供在表4中，并且注射后6个月时的数据提供在表5中。数据是来自单个测试动物的结果的平均值。
表4
注射后3个月
表5
注射后6个月
在仅注射媒介物的Dmdmdx大鼠或WT大鼠中未检测到qPCR信号，证实这些动物未接受任何载体，并且在注射后3和6个月时未在全血中检测到qPCR信号。
在注射后3个月和6个月时在注射载体的Dmdmdx大鼠中检测到了小型抗肌萎缩蛋白DNA。所研究组织中的转基因拷贝数遵循肝脏>心脏>股二头肌≈膈肌≈胸肌>脾脏的流行模式。在所分析的组织中，肝脏是迄今为止最有效转导的，其中在施用3×1014vg/kg载体的大鼠中载体拷贝数达到平均80-110vg/dg。肝脏中的载体拷贝数为心脏中的7-45倍，为股二头肌、膈肌或胸肌中的40-300倍。在心脏中，载体拷贝数在给予1×1014vg/kg载体的大鼠中平均为约1.0vg/dg并且在给予3×1014vg/kg的载体大鼠中平均为约5.0vg/dg。在1×1014vg/kg的剂量下，股二头肌和胸肌中的转基因拷贝数相似并且不超过约0.5vg/dg。当载体剂量增加到3×1014vg/kg时，平均转基因拷贝数增加到约1.2vg/dg。由于在已经接受两种最高剂量水平的载体间4只动物中某些异常高的结果，数据对于膈肌是特别多变的，其中转基因拷贝数的范围为约9-15vg/dg。如果排除这些偏离数据点，那么在3个月时间点和6个月时间点两者处的膈肌转导效率相对较低，转基因拷贝数在1×1014vg/kg剂量下平均为约0.2-0.4vg/kg，并且在3×1014vg/kg剂量下平均为约1.05-1.3vg/kg。
注射后3个月和6个月时人小型抗肌萎缩蛋白mRNA的表达
每个治疗组随机选择2至4只动物来通过RT-qPCR进行分析，以定量在处死时获得的股二头肌、膈肌、心脏、脾和肝脏样品中的人小型抗肌萎缩蛋白mRNA转录物的水平。分别在表6和表7中提供了从在注射后3个月和6个月时处死的测试动物获得的结果。数据表示为小型抗肌萎缩蛋白mRNA相对于来自大鼠HPRT1基因的mRNA的相对量(RQ)。
无论剂量如何，在来自阴性对照组(用媒介物治疗的WT大鼠和Dmdmdx大鼠)的任何组织中或在用载体治疗的动物的脾中均未检测到转录物。在所检查的所有其他组织中检测到了载体来源的转录物，所述转录物的水平倾向于以剂量响应方式增加，尽管数据具有一定可变性。组织中的转录物水平遵循股二头肌>心脏≈膈肌>肝脏的模式。如上所述，肝脏是所取样的组织间转导最多的组织，其载体拷贝数在为股二头肌中的约60-130倍变化。尽管如此，肝脏中的小型抗肌萎缩蛋白mRNA水平比股二头肌中低约5-15倍，这是在载体中使用的启动子的高肌肉特异性活性的证据。
注射后3个月和6个月时人小型抗肌萎缩蛋白质的表达
还使用蛋白质印迹法对被随机选择用于分析确定人小型抗肌萎缩蛋白mRNA水平的相同动物进行分析以确定小型抗肌萎缩蛋白质的水平。在阴性对照组(用媒介物治疗的WT大鼠和Dmdmdx大鼠)中的动物的任何组织中都未检测到小型抗肌萎缩蛋白质。在3个月时间点和6个月时间点两者处，在施用载体的Dmdmdx大鼠的股二头肌、心脏和膈肌中检测到了小型抗肌萎缩蛋白质。与施用较高水平载体的大鼠相比，在所测试的最低剂量(1×1013vg/kg)下，在组织样品中较低频率地检测到小型抗肌萎缩蛋白质。这些结果定性地汇总在表8中。
表8
在通过蛋白质印迹法检测到的蛋白质的量与载体剂量之间以及与相同组织样品中的小型抗肌萎缩蛋白mRNA的量之间存在正相关。需要为约1.5的小型抗肌萎缩蛋白mRNARQ以允许检测蛋白质。与在肝脏中测得的低水平的小型抗肌萎缩蛋白转录物一致，即使在使用最高载体剂量时，在该组织中也未检测到小型抗肌萎缩蛋白质。
组织病理学评估
在处死WT大鼠和Dmdmdx大鼠后立即获取组织样品进行组织病理学和免疫细胞化学分析。
材料和方法
在注射后3和6个月时的整体尸检评估期间获得用媒介物治疗的WT大鼠、用媒介物和载体治疗的Dmdmdx大鼠的组织样品。还从7-9周龄时处死的未治疗Dmdmdx大鼠获得样品，以充当基线比较。立即将组织在福尔马林中固定以用于组织病理学，或快速冷冻以用于免疫组织化学(免疫标记)并储存直至进行处理。对于组织病理学，将组织样品在10％中性缓冲福尔马林中固定，包埋在石蜡中，并且在用苏木精-伊红-番红花(HES)染色之前切片(5μm)。将石蜡包埋的心脏组织的另一切片染色以用天狼猩红F3B(Sigma-Aldrich Chimie SARL,Lyon,FR)使胶原可视化。为了通过免疫标记鉴别抗肌萎缩蛋白和结缔组织，将样品冷冻并切片(8μm)。在免疫标记研究中使用特异性结合大鼠抗肌萎缩蛋白以及人小型抗肌萎缩蛋白opti-Dys3978的小鼠单克隆抗体NCL-DYSB(1:50，Novocastra Laboratories,Newcastleon Tyne,UK)以使抗肌萎缩蛋白质可视化。使用Alexa Fluor 555麦胚凝集素(WGA)缀合物(1:500,Molecular Probes,Eugene,OR)以使结缔组织可视化。将细胞核用DRAQ5(1:1000,BioStatus Ltd,Shepshed,UK)染色。盲法执行尸检和组织学检查。
使用Nikon成像软件(Nikon,Champigny sur Marne,France)对心脏切片中的天狼猩红苦味酸(picrosirius)阳性区域进行定量。使用ImageJ开源图像处理软件(v 2.0.0-rc-49/1.51a)对DYSB阳性纤维和WGA阳性区域进行定量。
结果
对注射后3个月和6个月时肌肉中DMD病变的组织病理学分析
用显微镜检查组织学染色的组织样品，并系统地记录与DMD表型相关的病变。如图38A所示，对骨骼肌和心肌中的病变进行半定量评分。在骨骼肌(股二头肌、胸肌和膈肌)中，评分0对应于无明显病变；评分1对应于存在一些再生活性，如由中央成核纤维和再生病灶所证明的；评分2对应于单独的或成小簇的退行性纤维；并且评分3对应于组织重构和经由纤维组织或脂肪组织的纤维替代。在心脏中，评分基于纤维化强度(评分1对应于较低的纤维化强度，并且评分2对应于较高的纤维化强度)和退行性纤维的存在(评分为3)。将每只大鼠的总病变评分计算为动物的股二头肌、胸肌、膈肌和心肌的评分的平均值。每个治疗组内各大鼠的病变评分也取平均。
在注射后3个月时按照治疗组分组的各大鼠的总病变评分和平均值示于图38B中，其中WT模拟是指用媒介物治疗的WT大鼠，该大鼠的病变评分为0。KO模拟是指用媒介物治疗的DMDmdx大鼠，而KO 1E13、KO 3E13和KO 1E14是指用以vg/kg计的所示剂量(即，分别为1×1013、3×1013和1×1014)治疗的DMDmdx大鼠。如可以看出的，通过载体治疗以剂量响应方式降低了Dmdmdx大鼠中与营养不良表型相关的肌肉病变的患病率。
病变评分的统计分析(通过使用Dunn检验进行多次配对比较)揭示了治疗组之间的以下差异。在股二头肌样品中，在注射后3个月时在用媒介物治疗的WT大鼠与用两种最高剂量(1×1014vg/kg和3×1014vg/kg)的载体治疗的Dmdmdx大鼠之间没有显著的病变评分差异，并且在注射后6个月时在用媒介物治疗的WT大鼠与用所测试的四种剂量中的任何一种剂量的载体治疗的Dmdmdx大鼠之间没有显著差异。在胸肌和膈肌的样品中，在注射后3个月时在用媒介物治疗的WT大鼠与用所测试的三种最高载体剂量(3×1013vg/kg、1×1014vg/kg和3×1014vg/kg)治疗的DMDmdx大鼠之间没有显著的病变评分差异，并且在注射后6个月时在用媒介物治疗的WT大鼠与用所有四种载体剂量治疗的Dmdmdx大鼠之间没有显著的评分差异。最后，在心肌中，在所述两个时间点处，在用媒介物治疗的WT大鼠与用所有四种剂量的载体治疗的Dmdmdx大鼠之间均没有显著的病变评分差异。
注射后3个月和6个月时的组织形态学
用特异性结合大鼠抗肌萎缩蛋白和从载体表达的人小型抗肌萎缩蛋白的DYSB抗体标记组织样品后，针对股二头肌、膈肌和心肌计算每只大鼠的三个随机选择显微镜视野中的阳性染色肌纤维的百分比。此外，计算三个随机选择的显微镜视野中的用WGA缀合物阳性染色的区域，以确定来自股二头肌和膈肌的冷冻组织样品中结缔组织纤维化的程度。在相关分析中，通过在组织学制备中定量定量用天狼猩红阳性染色的区域来确定心脏横切片中结缔组织(胶原)的量。这些研究的结果提供在图39A-39C、图40A-40C和图41A-41C中。
图39A显示了来自用媒介物治疗的WT大鼠(WT+缓冲液)、用媒介物治疗的DMDmdx大鼠(DMD+缓冲液)和用载体以1×1013vg/kg、3×1013vg/kg、1×1014vg/kg和3×1014vg/kg的不断增加剂量治疗的Dmdmdx大鼠(分别为DMD+1E13、DMD+3E13、DMD+1E14和DMD+3E14)的股二头肌样品的染色组织切片的代表性显微照片。顶部图的照片来自在注射后3个月获取的样品，并且底部图来自在注射后6个月获取的样品。图39B是显示3个月和6个月时间点时，来自各自用媒介物治疗的WT大鼠和Dmdmdx大鼠和用不断增加剂量的载体治疗的Dmdmdx大鼠的股二头肌样品中的小型抗肌萎缩蛋白阳性纤维的百分比的图。还包括来自未治疗的7-9周龄Dmdmdx大鼠的结果(“DMD病理状态”)。图39C是显示来自3个月和6个月时间点的类似治疗的WT大鼠和Dmdmdx大鼠以及未治疗的7-9周龄Dmdmdx大鼠的股二头肌样品中结缔组织占据的百分比面积(作为纤维化的度量)的图。在图中，误差条上的相同字母表示数据之间没有统计学上显著的差异，而没有共同的字母表示存在显著差异(例如，上面都有“a”的两个条形图彼此之间没有显著差异)。
图40A显示了来自用媒介物治疗的WT大鼠(WT+缓冲液)、用媒介物治疗的DMDmdx大鼠(DMD+缓冲液)和用载体以1×1013vg/kg、3×1013vg/kg、1×1014vg/kg和3×1014vg/kg的不断增加剂量治疗的Dmdmdx大鼠(分别为DMD+1E13、DMD+3E13、DMD+1E14和DMD+3E14)的膈肌样品的染色组织切片的代表性显微照片，所有的膈肌样品都是在注射后3个月时获取的。图40B是显示3个月和6个月时间点时，来自各自用媒介物治疗的WT大鼠和Dmdmdx大鼠和用不断增加剂量的载体治疗的Dmdmdx大鼠的膈肌样品中的小型抗肌萎缩蛋白阳性纤维的百分比的图。还包括来自未治疗的7-9周龄Dmdmdx大鼠的结果(“DMD病理状态”)。图40C是显示来自3个月和6个月时间点的类似治疗的WT大鼠和Dmdmdx大鼠以及未治疗的7-9周龄Dmdmdx大鼠的膈肌样品中结缔组织占据的百分比面积(作为纤维化的度量)的图。在图中，误差条上的相同字母表示数据之间没有统计学上显著的差异，而没有共同的字母表示存在显著差异(例如，上面都有“a”的两个条形图彼此之间没有显著差异)。
图41A显示了来自用媒介物治疗的WT大鼠(WT+缓冲液)、用媒介物治疗的DMDmdx大鼠(DMD+缓冲液)和用载体以1×1013vg/kg、3×1013vg/kg、1×1014vg/kg和3×1014vg/kg的不断增加剂量治疗的DMDmdx大鼠(分别为DMD+1E13、DMD+3E13、DMD+1E14和DMD+3E14)的心肌样品的染色组织切片的代表性显微照片。顶部图和底部图分别显示了从在注射后3个月和6个月处死的测试动物获取的在组织学上制备并用天狼猩红染色的顶点三分之一心脏横切片。黑色条表示长度为2mm。中间图显示在3个月时间点处获取的心肌样品中用针对抗肌萎缩蛋白的抗体和WGA缀合物进行免疫标记。图41B是显示在3个月和6个月时间点时，来自各自用媒介物治疗的WT大鼠和Dmdmdx大鼠和用不断增加剂量的载体治疗的Dmdmdx大鼠的心肌样品中的小型抗肌萎缩蛋白阳性纤维的百分比的图。还包括来自未治疗的7-9周龄Dmdmdx大鼠的结果(“DMD病理状态”)。图41C是显示来自3个月和6个月时间点的类似治疗的WT大鼠和Dmdmdx大鼠以及未治疗的7-9周龄Dmdmdx大鼠的心肌样品中结缔组织占据的百分比面积(作为纤维化的度量)的图。在图中，误差条上的相同字母表示数据之间没有统计学上显著的差异，而没有共同的字母表示存在显著差异(例如，上面都有“a”的两个条形图彼此之间没有显著差异)。
数据统计分析(方差分析和Fisher事后双侧检验)表明，在注射后3个月和6个月时，在用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠与以所有载体剂量治疗的Dmdmdx大鼠之间在股二头肌和心脏的抗肌萎缩蛋白标记中存在显著差异。在膈肌中，在注射后3个月时在所测试的两个最高剂量下差异是显著的，而在注射后6个月时在所测试的三个最高剂量下差异是显著的。用媒介物治疗的WT大鼠与用3×1014vg/kg治疗的Dmdmdx大鼠之间的比较显示，在注射后3个月时的股二头肌或在注射后6个月时的心肌中没有显著差异。
在来自用媒介物治疗的WT大鼠的肌肉中，所有肌肉纤维显示出使用DYSB抗体的强烈均匀肌膜下标记。在来自用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠的肌肉中，一小部分分散的回复突变纤维显示出相似的标记(在注射后3个月和6个月时分别为：股二头肌3.7±2.4％和7.3±2.3％；膈肌0.7±1.5％和5.8±1.3％；心肌，0.0±0.0％和0.1±0.1％)。在施用载体的Dmdmdx大鼠中，对抗肌萎缩蛋白染色呈阳性的纤维的百分比在所有观测的肌肉中都增加，其中纤维显示出弱到强烈的肌膜下标记。要求三分之二的纤维的标记被认为是阳性的。在3个月和6个月的时间点，股二头肌和心肌之间的抗肌萎缩蛋白阳性纤维的百分比都相似，所述百分比高于膈肌中的百分比。在用载体治疗的Dmdmdx大鼠中，通过由结缔组织占据的面积测量的纤维化病灶的数量和大小在骨骼肌中减小，并且纤维化的强度在心肌中降低。
在7-9周龄时处死的未治疗Dmdmdx大鼠中，在股二头肌或心肌中没有明显的纤维化，但在膈肌中已经有明显的结缔组织扩张。与WT大鼠相比，用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠在骨骼肌中显示出肌内膜和肌束膜空间的局灶性或全身性增厚，这指示纤维化。在心脏中，这些大鼠在心室和室间隔外膜下区域中显示出分散且广泛的纤维化病灶。在严重的情况下，观测到改变心脏形状的透壁纤维化。与用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠相比，在注射后3个月时在用3×1013vg/kg载体以及更高剂量治疗的Dmdmdx大鼠的股二头肌中并且在注射后6个月时在用3×1014vg/kg载体治疗的Dmdmdx大鼠的膈肌中存在纤维化病灶的数量和大小的显著减小。在心脏中，发现在用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠与两个时间点处用所有载体剂量治疗的Dmdmdx大鼠之间存在显著的纤维化差异。在注射后3个月时，在用媒介物治疗的WT大鼠与用3×1013vg/kg以及更高剂量的载体治疗的Dmdmdx大鼠之间未观测到显著的纤维化差异。观测到的纤维化量与载体剂量呈负相关(对于股二头肌p＝0.019；对于膈肌p＝0.004；对于心肌p＝0.003，均根据线性回归)。
在用载体进行的Dmdmdx大鼠治疗中，在所分析的所有肌肉(股二头肌、膈肌和心脏)中诱导了小型抗肌萎缩蛋白表达，并且表达小型抗肌萎缩蛋白的纤维的百分比与载体剂量正相关(根据线性回归p<0.001)。用载体治疗的Dmdmdx大鼠中小型抗肌萎缩蛋白阳性纤维的数量在股二头肌和心脏中比在膈肌中更高，表明在生物分布或表达效率方面存在一定异质性。无论剂量如何，小型抗肌萎缩蛋白表达都在其肌膜下定位方面相似，并且即使在所分析的最高剂量3×1014vg/kg时也未检测到异常定位。在一些纤维中，沿着肌纤维膜检测到了不连续的抗肌萎缩蛋白染色，尽管该观测的频率随着载体剂量的增加而降低。
注射后3个月与注射后6个月之间的小型抗肌萎缩蛋白阳性肌纤维数量的比较显示，在治疗组之间对于股二头肌没有显著差异。在膈肌中，在1×1014vg/kg的剂量下在注射后3个月与注射后6个月之间存在显著的增长，而在心肌中，在1×1013vg/kg、3×1013vg/kg和1×1014vg/kg的剂量下在所述两个时间点之间存在显著的增长。
某些经典DMD相关肌肉病变的发生率和程度在治疗组之间不同。例如，与仅接受媒介物的那些Dmdmdx大鼠相比，用载体治疗的Dmdmdx大鼠中存在更少的坏死或退行性纤维，并且在所有Dmdmdx大鼠中观测到新再生的纤维，但它们的数量趋于随着载体剂量的增加而减少。
握力和肌肉疲劳测量
在注射后3和6个月时测试注射媒介物或不断增加剂量的载体的Dmdmdx大鼠的前肢握力。注射媒介物的WT大鼠被包括作为阴性对照。大鼠在7-9周龄时进行注射，以便在它们约4.5月龄和7.5月龄时进行握力测试。测量了最大握力和作为疲劳指示的重复试验后握力两者。
材料和方法
使用附接到力传感器的握力计(Bio-GT3,BIOSEB,法国)测量当大鼠的前爪被放在T形棒(T-bar)上并轻轻向后拉直到大鼠松开它们的抓握时产生的峰值力。按顺序执行五次测试，其中每次测试之间具有短等待时间(20-40秒)，并且获取第一次确定与最后一次确定之间的强度降低以作为疲劳指数。结果以克(g)表示，并针对体重归一化(g/g BW)。由对基因型和治疗组不知情的实验者执行握力测试测量。数据表示为平均值±SEM，并且使用非参数Kruskal-Wallis检验进行统计学评估以分析各组之间的差异。在检测到显著的总体效应的情况下，使用Dunn事后检验评定各组之间的差异。使用Friedman检验然后是Dunn事后检验分析握力的演变。使用GraphPad Prism 5(GraphPad Software Inc.,La Jolla,CA)执行所有数据分析。在图中，置信水平为95％、99％和99.9％的显著差异分别由一个、两个和三个符号表示。
结果
在注射后3个月时处死的大鼠的握力测试结果在表9和表10中提供。如表9中所示，与用媒介物治疗的WT大鼠相比，用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠表现出绝对握力的降低(即，未针对体质量差异进行校正)(降低24±2％)。相比之下，用载体治疗的DMDmdx大鼠与用媒介物治疗的DMDmdx大鼠对照相比表现出绝对握力的剂量依赖性增加。在两种最低剂量1×1013vg/kg和3×1013vg/kg下，握力分别增加了13±7％和24±8％，但是没有达到统计显著性，而在两种最高剂量1×1014vg/kg和3×1014vg/kg下，握力分别增加了40±9％和55±6％，这确实达到了统计显著性(分别为p<0.01和p<0.001)。同样如表9所示，当针对体质量差异校正前肢握力时，当WT大鼠和Dmdmdx大鼠都用媒介物治疗时，WT大鼠和Dmdmdx大鼠的握力之间没有统计学显著差异。然而，用载体治疗的DMDmdx大鼠与用媒介物治疗的DMDmdx大鼠相比在相对握力方面存在剂量响应增加，该剂量响应增加在所测试的两种最高剂量1×1014vg/kg和3×1014vg/kg处达到统计显著性(分别为增加27±8％，p<0.05，以及增加39±6％，p<0.001)。
还在五次密集的重复试验期间测量前肢握力，以确定载体治疗可能影响已知在Dmdmdx大鼠模型中发生的肌肉疲劳的程度。如图42A所示，用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠在第一次试验与第五次试验之间表现出明显的前肢力量降低(降低63±5％)，而用媒介物治疗的WT大鼠在第五次试验之后与在第一次试验之后一样强，这是在此模型中之前看到的效果(Larcher等人，2014)。
相比之下，与仅用媒介物治疗的相似大鼠相比，在用载体治疗的Dmdmdx大鼠中观测到了剂量依赖性改善。如表10所示，在所测试的两种最低剂量(1×1013vg/kg和3×1013vg/kg)下，在表现出握力降低之前存在延迟，这表明了疲劳的降低，至少是在试验中早期时。然而，在较低剂量下，到第五次试验时，在用载体治疗的DMDmdx大鼠的握力与仅用媒介物治疗的DMDmdx大鼠的握力之间仍然不存在统计学上显著的差异。然而，即使在这些较低剂量下，握力逐渐减弱的强烈趋势仍然很明显。在两种最高剂量1×1014vg/kg和3×1014vg/kg下，DMDmdx大鼠表现为与用媒介物治疗的WT大鼠相比在疲劳程度方面没有统计学上显著的差异。换句话说，在五次试验后，这些用载体治疗的Dmdmdx大鼠无法与野生型区分。事实上，在所有试验中，用最高载体剂量治疗的Dmdmdx大鼠的平均握力高于WT对照的平均握力，尽管该差异不是在统计学上显著的。
注射后6个月时处死的大鼠的握力测试结果在表11和表12中提供。如表11所示，与用媒介物治疗的WT大鼠相比，用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠表现出握力降低(即，未针对体质量差异进行校正)(绝对握力降低38±3％)。当以绝对项测量时，该差异是在统计学上显著的，而当以相对项测量时则不是在统计学上显著的。相比之下，用载体治疗的DMDmdx大鼠与用媒介物治疗的DMDmdx大鼠对照相比表现出绝对握力的剂量依赖性增加。在两种最低剂量1×1013vg/kg和3×1013vg/kg下，握力分别增加了20±5％和21±6％，但是没有达到统计显著性，而在两种最高剂量1×1014vg/kg和3×1014vg/kg下，握力分别增加了39±9％和41±5％，这确实达到了统计显著性(分别为p<0.05和p<0.01)。
与注射后3个月时处死的Dmdmdx大鼠类似，注射后6个月时处死的用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠也在第一次试验与第五次试验之间表现出显著的前肢力量降低(降低57±3％)(图42B)，尽管该差异当与使用用媒介物治疗的WT大鼠时所观测到的五次试验中的握力轻微降低相比不是在统计学上显著的，这最可能是由于这些研究中涉及的样本量较小。
相比之下，与仅用媒介物治疗的相似大鼠相比，在用载体治疗的Dmdmdx大鼠中观测到了剂量依赖性改善。如表12所示，虽然两种最低剂量(1×1013vg/kg和3×1013vg/kg)没有显著影响多次试验中的握力下降，但是在两种最高剂量(1×1014vg/kg和3×1014vg/kg)下，所述DMDmdx大鼠表现出与用媒介物治疗的WT大鼠相比在疲劳程度方面没有统计学上显著的差异。此外，在最高剂量下，每次试验时用载体治疗的DMDmdx大鼠的握力在统计学上明显高于用媒介物治疗的DMDmdx大鼠。换句话说，在五次试验后，这些用载体治疗的Dmdmdx大鼠无法与野生型区分。事实上，在所有试验中，用最高载体剂量治疗的Dmdmdx大鼠的平均握力高于WT对照的平均握力，尽管该差异不是在统计学上显著的。
基于这些研究，很明显的是，在注射后3个月和6个月时，1×1014vg/kg的载体剂量足以逆转由Dmdmdx大鼠表现出的握力降低和由多次密集握力试验引起的肌肉疲劳。此外，3×1014vg/kg的载体剂量实际上将Dmdmdx大鼠的握力和抗疲劳性改善到超过相同遗传背景的WT大鼠的水平。
心脏功能
在注射后3个月和6个月(分别为约5月龄和8月龄)时测试Dmdmdx大鼠和WT对照的心脏功能，以确定载体治疗是否能够改善对大鼠DMD模型中的肌肉萎缩症疾病进展的结构或功能影响。使用二维超声心动描记术，在注射后3个月和6个月时测量游离壁舒张厚度、LV舒张末期直径、LV射血分数和E/A比率。
材料和方法
由对基因型和治疗组不知情的实验者进行超声心动图测量。使用具有14MHz换能器的Vivid 7 Dimension超声(GE Healthcare)对测试动物执行二维(2D)超声心动描记术。为了观测可能的结构重塑，在舒张期间根据使用M型超声心动描记术获得的长轴和短轴图像来测量左心室舒张末期直径和游离壁舒张末期厚度。通过射血分数评定收缩功能，并且通过使用具有心尖四腔取向的脉冲多普勒获取心室充盈速度的经二尖瓣流量测量值来确定E/A比率、等容舒张时间和E波减速时间(舒张功能障碍指标，进一步在下文解释)，以确定舒张功能。
E/A比率是在心房排空和心室充盈的两个阶段期间从左心房到左心室的血液运动的峰值速度的比率。血液分两步从左心房转移到左心室。在第一种情况下，当二尖瓣由于舒张的心室所产生的负压而打开时，左心房中的血液被动地移动进入下方的心室。在该初始动作期间血液移动的速度被称为“E”，针对早期心室充盈速度。在稍后的时间，左心房收缩以排出心房中的任何剩余血液，并且在此阶段的血液移动速度被称为“A”，针对心房心室充盈速度。E/A比率是早期(E)与晚期(A)心室充盈速度的比率。在健康的心脏中，E/A比率大于1。然而，在杜氏营养不良症肌病中，左心室壁变硬，从而减少心室舒张和拉动心房血液，从而减缓早期(E)充盈速度并降低E/A比率。等容舒张时间(IVRT)是主动脉瓣关闭到通过打开二尖瓣而心室充盈开始之间的间隔，或者是在舒张开始后直到心室充盈开始的时间。比正常IVRT更长表明心室舒张性差，这已在人DMD患者(RC Bahler等人，J Am SocEchocardiogr 18(6),666-73(2005)；LW Markham等人，J Am Soc Echocardiogr 19(7),865-71(2006))和DMD狗模型(V Chetboul等人，Eur Heart J 25(21),1934-39(2004)；VChetboul等人，Am J Vet Res 65(10),1335-41(2004))中描述，并且先于与DMD相关的扩张型心肌病。最后，E波减速时间(DT)对应于峰值E速度与其返回基线之间的以毫秒计的时间，其增加指示舒张功能障碍。
结果
在注射后3个月和6个月时，在均用媒介物治疗的WT大鼠和Dmdmdx大鼠之间没有游离壁舒张厚度方面的显著差异，表明该测量没有提供关于在所检查的年龄时该模型中的疾病病程的信息。然而，在注射后6个月而不是3个月时，与WT对照相比，用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠中存在左心室舒张末期直径增加的趋势，这在Dmdmdx大鼠用载体治疗时被逆转，尽管未达到统计学上的显著性(图43)。
为了评定收缩功能，测量左心室(LV)射血分数。在注射后3个月时的Dmdmdx大鼠中没有发现差异，但是在注射后6个月时，仅施用媒介物的Dmdmdx大鼠表现出降低的LV射血分数，该LV射血分数降低通过用载体治疗而被阻止，尽管该差异仅在一种较低剂量3×1013vg/kg时具有统计学显著性(图44)。
为了评定舒张功能障碍，使用多普勒超声心动描记术来测量早期(E)和舒张晚期(A)速度、E/A比率、等容舒张时间(IVRT)和减速时间(DT)。在注射后3个月时，用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠的E/A比率与WT对照相比在统计学上显著降低，并且具有表明在用最高载体剂量3×1014vg/kg治疗的Dmdmdx大鼠中恢复到正常E/A比率的趋势，尽管该差异没有达到统计学显著性(图45A)。在注射后6个月时，用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠的E/A比率与WT对照相比也显著降低，并且与较早时间点一样，存在表明载体的一些治疗效果的趋势，尽管数据变化很大并且没有达到统计显著性(图45B)。
在注射后3个月时，用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠中的IVRT与WT对照相比升高，并且存在表明用载体治疗的Dmdmdx大鼠中IVRT的剂量响应性降低的轻微趋势，尽管数据差异中都没有达到统计学显著性(图46A)。在注射后6个月时，用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠具有与WT对照相比显著更高的IVRT，而载体治疗导致表明IVRT恢复到正常水平的强烈趋势，该IVRT在最低载体剂量1×1013vg/kg下达到统计学显著性(图46B)。
最后，由于使用麻醉方案的技术困难，DT只能在年龄较大的大鼠中测量。然而，当在注射后6个月检查时，用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠中的DT与WT对照相比显著升高，并且在所有测试剂量下进行载体治疗后存在恢复到正常值的强烈趋势(图47)。
尽管数据存在可变性，但这些研究的结果有力地表明5月龄和8月龄Dmdmdx大鼠的心脏存在舒张功能障碍，该舒张功能障碍可以通过用AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体治疗而至少部分地逆转。
血液化学
在治疗之前和处死时，获取来自大鼠的血液样品并储存以供最终分析。进行测试以确定尿素、肌酸酐、碱性磷酸酶(ALK)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌钙蛋白I和针对小型抗肌萎缩蛋白和AAV9衣壳的抗体的血清浓度。ALT、AST、CK和LDH都是从受损肌细胞释放到血液中的酶，并且已知在人DMD患者中升高。
在注射后3个月和6个月时，不同实验组之间的尿素、肌酸酐、ALK、总血清蛋白质、总胆红素和肌钙蛋白I的水平没有显著差异。相比之下，与WT大鼠相比，用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠的AST、ALT、LDH和总CK水平都升高，并且对载体治疗有不同程度的响应。
在注射后3个月和6个月时，与WT大鼠相比，用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠中的AST水平升高，尽管由于数据的可变性，仅在6个月时间点处存在显著性。当Dmdmdx大鼠用载体治疗时，在注射后3个月时在1×1014vg/kg和3×1014vg/kg剂量组中并且在注射后6个月时在3×1014vg/kg剂量组中观测到了朝较低AST水平的趋势(尽管有宽的个体间变异性)。同样，由于数据的可变性，这些差异没有达到统计显著性。这些结果示于图48A和图48B中，分别报告了注射后3个月和6个月时间点的数据。
ALT、LDH和总CK水平的模式都以类似的方式响应于年龄和载体治疗。在注射后3个月时，与WT大鼠相比，用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠中的ALT、LDH和总CK水平都显著升高。用小型抗肌萎缩蛋白载体治疗Dmdmdx大鼠导致表明相对于用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠，ALT、LDH和总CK水平剂量响应性降低的趋势，这在一些情况下所述降低实现了统计显著性。这些结果分别示于图49A、图50A和图51A中。在注射后6个月时，数据中存在表明如下的趋势：与WT大鼠相比用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠中ALT和LDH水平升高，该趋势在所测试的最高载体剂量处被逆转，但是差异都不是统计学上显著的。这些结果分别示于图49B和图50B中。相比之下，与注射后3个月时观测到的模式类似，在注射后6个月时用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠中的总CK与WT大鼠相比显著升高，并且载体治疗导致朝降低水平的趋势，该趋势在所测试的最高载体剂量下实现了统计显著性(图51B)。
还在注射当天和注射后3个月和6个月时比较治疗组内的总CK水平。如图52A和图52B所示，施用媒介物的WT大鼠中的血液总CK水平一致地较低，而所有Dmdmdx大鼠中的CK水平均下降，所述Dmdmdx大鼠包括仅用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠和用最低载体剂量治疗的Dmdmdx大鼠。相比之下，对于用三种最高剂量的载体治疗的Dmdmdx大鼠，3个月和6个月后的CK水平降低要大得多。这些观测结果与人DMD的自然病程一致，其中CK水平虽然与对照相比升高，但是由于肌肉被脂肪和纤维组织替代而随着疾病的进展下降，但在所测试的较高载体剂量下还具有剂量响应治疗效果。
还观测到CK同工酶的差异。在用药前，CK-MM同种型在Dmdmdx大鼠中占优势(平均>90％)，而CK-MM同种型和CK-BB同种型在WT大鼠中相当(平均40-60％)，并且CK-MB水平在WT中高于在Dmdmdx大鼠中(4-6％对比≈1％)。在注射后3个月和6个月时，用1×1013vg/kg以上的载体剂量治疗的Dmdmdx大鼠显示出CK-BB同种型比例的略微增加和CK-MM同种型比例的略微降低，具有朝向剂量相关效应的趋势。在用载体治疗的Dmdmdx大鼠中未观测到CK-MB同种型比例的明显改变。
免疫学
在治疗前和注射后3个月和6个月时测量用AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体治疗的Dmdmdx大鼠的体液免疫应答和细胞免疫应答，并与阴性对照和阳性对照比较。在注射媒介物或载体之前，以及在注射后3个月进行安乐死时获得血清样品。在注射后3个月和6个月安乐死时收获脾细胞以用于分析T细胞应答。
通过对从测试动物获得并以1:500稀释的血清进行蛋白质印迹分析而定性地评定对小型抗肌萎缩蛋白质表达的体液应答。来自所有大鼠，无论是WT还是Dmdmdx大鼠的血清，当施用媒介物时或在接受载体之前对于针对小型抗肌萎缩蛋白质的抗体都是阴性的。相比之下，大多数用载体治疗的Dmdmdx大鼠，即使是在1×1013vg/kg的最低剂量下，也产生了在蛋白质印迹中结合小型抗肌萎缩蛋白的IgG抗体。80％-100％的在注射后3个月处死的Dmdmdx大鼠和60％-100％的在注射后6个月处死的Dmdmdx大鼠产生了依赖于剂量的特异性针对小型抗肌萎缩蛋白质的IgG。
通过ELISA测试针对AAV9载体衣壳的抗体的存在。来自用媒介物治疗的WT大鼠和Dmdmdx大鼠的血清没有可检测的与AAV9反应的IgG。相比之下，用载体治疗的所有大鼠，无论剂量如何或是否在注射后3个月或6个月处死，都产生滴度高于1:10240的抗AAV9 IgG，1:10240是所测试的最高稀释度。还使用表达使用发光计检测的LacZ报道基因的重组AAV9载体，用细胞转导抑制测定来测试针对AAV9的中和抗体。滴度定义为抑制转导>50％的最低稀释度。在来自已经接受载体的所有Dmdmdx大鼠的血清中都检测到针对AAV9的中和抗体，而无论剂量如何或是否在注射后3个月或6个月时处死，但在注射之前的相同动物或已经仅接受媒介物的WT大鼠和Dmdmdx大鼠中没有检测到针对AAV9的中和抗体。滴度范围为1:5000至≥1:500000，没有明显的剂量效应。
使用IFNγELISpot测定对从用媒介物治疗的WT大鼠和Dmdmdx大鼠以及已接受载体的Dmdmdx大鼠分离的脾细胞评估对载体的细胞免疫应答的存在。使用覆盖整个opti-dys3978蛋白质序列的重叠肽库(长度为15个氨基酸，重叠10个氨基酸，总共263个肽)和大鼠特异性IFNγ-ELISpotBASIC试剂盒(Mabtech)测试对载体基因组表达的人小型抗肌萎缩蛋白质的T细胞应答。阴性对照由未刺激的脾细胞组成，而阳性对照由用有丝分裂原伴刀豆球蛋白A刺激的细胞组成。IFNγ分泌被定量为每106个细胞的斑点形成细胞(SFC)数，并且阳性应答定义为>50SFC/106个细胞或为阴性对照获得的值的至少3倍。在注射后3个月或6个月时，在从任何测试动物(包括从以最高载体剂量3×1014vg/kg治疗的Dmdmdx大鼠)获得的脾细胞中未发现针对来源于小型抗肌萎缩蛋白质的任何肽序列的特异性T细胞应答。
还使用针对来源于AAV9的肽序列(由10个氨基酸重叠的15聚体分成3个池)筛选的IFNγELISpot测定来测试针对AAV9衣壳的T细胞应答。16％-60％的在注射后3个月处死的用载体治疗的Dmdmdx大鼠和16％-66％的在注射后6个月处死的用载体治疗的Dmdmdx大鼠存在阳性IFNγ应答，该阳性IFNγ应答与载体剂量正相关。相比之下，用媒介物治疗的所有WT大鼠和Dmdmdx大鼠对针对AAV9衣壳的T细胞应答均为阴性。
实施例9
用AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA治疗的年龄较大的Dmdmdx大鼠的握力
上述实施例8中描述的研究是在7-9周龄的幼鼠中开始的。该实施方案描述了分别在4月龄和6月龄时首次用AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体治疗的年龄较大的Dmdmdx大鼠的肌肉功能分析。Sprague Dawley大鼠的平均寿命为24-36个月。这些实验的目的是确定在Dmdmdx大鼠的生命后期用载体治疗是否可能有效。阳性结果将表明用载体治疗年龄较大的人DMD患者，诸如年龄较大的儿童、青少年、或甚至年轻的成年人，也可能改善他们的肌肉功能。
本实施例中描述的实验使用与实施例8中所述类似的材料和方法进行。更具体地，用1×1014vg/kg的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA载体单独治疗4月龄和6月龄的Dmdmdx大鼠(每个年龄组n＝6)。作为阴性对照，仅用媒介物分别治疗4月龄和6月龄的WT大鼠和Dmdmdx大鼠(每个年龄组n＝6)。在注射后3个月时，如前所述测试大鼠的握力。与较年轻的大鼠一样，测试了最大前肢握力和在每次试验之间具有短等待时间的多次重复试验间的握力。后一项测试旨在测量肌肉疲劳。
如图53A所示，在注射后3个月时，与用媒介物治疗的4月龄WT大鼠相比，在4个月龄时用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠的最大前肢握力平均略低，尽管差异未达到统计显著性。相比之下，在4月龄时注射1×1014vg/kg载体的Dmdmdx大鼠与在相同年龄时仅用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠相比具有更大的平均最大前肢握力，该差异确实达到了统计显著性。用载体治疗的大鼠的强度甚至大于WT大鼠，尽管该差异在统计学上不显著。当数据针对体重标准化时结果是相似的，如图53B所示。在图53A和图53B中，符号“¤¤”指示用载体治疗对比用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠之间存在统计学显著差异(p<0.01)。
关于肌肉疲劳，如图53C所示，在4个月时用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠在第2次抓握测试后表现出疲劳，而WT大鼠即使在4次测试后也没有表现出疲劳。相比之下，用载体治疗的4个月大的Dmdmdx大鼠在第1次和第5次握力测试之间表现出最小的(如果有的话)肌肉疲劳。与用媒介物治疗的WT大鼠相比，用载体治疗的Dmdmdx大鼠也显得整体上更强状。在图53C中，符号“*”指示用载体治疗的Dmdmdx大鼠与用媒介物治疗的WT大鼠之间存在统计学上显著的差异(p<0.05)；“¤¤”指示用载体治疗对比用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠之间存在统计学上显著的差异(p<0.01)；并且“§§”和“§§§”指示用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠分别在第4次和第5次握力测试时与第1次握力测试相比具有统计学上显著的差异(分别为p<0.01和p<0.001)。
如图54A所示，在注射后3个月时，与用媒介物治疗的6个月大的WT大鼠相比，在6月龄时用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠的最大前肢握力显著较低。这种效果即使当结果针对体重归一化时也保持，如图54B所示。在6月龄时用1×1014vg/kg载体治疗DMDmdx大鼠与仅用媒介物治疗的DMDmdx大鼠相比增大了平均最大前肢握力，该差异当针对体重归一化时达到了统计学显著性(图54B)。在图54A和图54B中，符号“*”和“**”指示在用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠和WT大鼠之间存在统计学上显著的差异(分别为p<0.05和p<0.01)；并且“¤”指示在用载体治疗的对比用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠之间存在统计学上显著的差异(p<0.05)。
关于肌肉疲劳，如图54C所示，在6个月时用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠在第2次抓握测试后表现出疲劳，而WT大鼠即使在4次测试后也没有表现出疲劳。与在4个月大时治疗的大鼠相比，用载体治疗的6个月大的Dmdmdx大鼠在多次握力测试间表现出一定的力量降低，尽管与用媒介物治疗的对照Dmdmdx大鼠所观测到的程度不同。同样与在4月龄时治疗的大鼠进行的测试不同，在实验过程中，WT大鼠的力量似乎大于在6个月时用载体治疗的Dmdmdx大鼠的力量。在图54C中，符号“**”和“***”指示用载体治疗的Dmdmdx大鼠与用媒介物治疗的WT大鼠之间存在统计学上显著的差异(分别为p<0.01和p<0.001)；“¤”指示用载体治疗对比用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠之间存在统计学上显著的差异(p<0.05)；并且“§§”指示用媒介物治疗的Dmdmdx大鼠在第5次握力测试时与第1次握力测试相比具有统计学上显著的差异(p<0.01)。
序列表
<110> 班布疗法公司
北卡罗米纳大学查佩尔希尔分校
<120> 优化的小型抗肌萎缩蛋白基因和表达盒和它们的用途
<130> PC45290A
<150> US 62/352,675
<151> 2016-06-21
<150> US 62/516,449
<151> 2017-06-07
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3978
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hopti-Dys3978基因
<400> 1
atgctttggt gggaggaagt ggaggactgc tacgagagag aggacgtgca gaagaaaacc 60
ttcaccaagt gggtgaacgc ccagttcagc aagttcggca agcagcacat cgagaacctg 120
ttcagcgacc tgcaggatgg caggagactg ctggacctgc tggagggcct gaccggccag 180
aagctgccca aggagaaggg cagcaccaga gtgcacgccc tgaacaacgt gaacaaggcc 240
ctgagagtgc tgcagaacaa caacgtggac ctggtgaaca tcggcagcac cgacatcgtg 300
gacggcaacc acaagctgac cctgggcctg atctggaaca tcatcctgca ctggcaggtg 360
aagaacgtga tgaagaacat catggccggc ctgcagcaga ccaacagcga gaagatcctg 420
ctgagctggg tgaggcagag caccagaaac tacccccagg tgaacgtgat caacttcacc 480
acctcctgga gcgacggcct ggccctgaac gccctgatcc acagccacag acccgacctg 540
ttcgactgga acagcgtggt gtgtcagcag agcgccaccc agagactgga gcacgccttc 600
aacatcgcca gataccagct gggcatcgag aagctgctgg accccgagga cgtggacacc 660
acctaccccg acaagaaaag catcctcatg tacattacca gcctgttcca ggtgctgccc 720
cagcaggtgt ccatcgaggc catccaggaa gtggaaatgc tgcccaggcc ccccaaagtg 780
accaaggagg agcacttcca gctgcaccac cagatgcact acagccagca gatcacagtg 840
agcctggccc agggctatga gagaaccagc agccccaagc ccagattcaa gagctacgcc 900
tacacccagg ccgcctacgt gaccacctcc gaccccacca gaagcccctt ccccagccag 960
cacctggagg cccccgagga caagagcttc ggcagcagcc tgatggagag cgaagtgaac 1020
ctggacagat accagaccgc cctggaggaa gtgctgtcct ggctgctgag cgccgaggac 1080
accctgcagg cccagggcga gatcagcaac gacgtggaag tggtgaagga ccagttccac 1140
acccacgagg gctacatgat ggatctgacc gcccaccagg gcagagtggg caatatcctg 1200
cagctgggca gcaagctgat cggcaccggc aagctgagcg aggacgagga gaccgaagtg 1260
caggagcaga tgaacctgct gaacagcaga tgggagtgcc tgagagtggc cagcatggag 1320
aagcagagca acctgcacag agtgctgatg gacctgcaga accagaagct gaaggagctg 1380
aacgactggc tgaccaagac cgaggagcgg accagaaaga tggaggagga gcccctgggc 1440
cccgacctgg aggacctgaa gagacaggtg cagcagcaca aagtgctgca ggaggacctg 1500
gagcaggagc aggtgcgcgt gaacagcctg acccacatgg tggtggtcgt ggacgagagc 1560
agcggcgacc acgccacagc cgccctggaa gagcagctga aagtgctggg cgacagatgg 1620
gccaatattt gtaggtggac cgaggacaga tgggtgctgc tgcaggacca gcccgacctg 1680
gcccctggcc tgaccaccat cggcgccagc cccacccaga ccgtgaccct ggtgacccag 1740
cccgtggtga caaaggagac cgccatcagc aagctggaga tgcccagctc cctgatgctg 1800
gaagtgccca cccaccgcct gctccagcag ttccccctgg acctggagaa gttcctggcc 1860
tggctgaccg aggccgaaac caccgccaat gtgctccagg acgccactag aaaggagagg 1920
ctgctggagg acagcaaggg cgtgaaagag ctgatgaagc agtggcagga tctgcagggc 1980
gaaatcgagg cccacaccga cgtgtaccac aacctggacg agaacagcca gaagattctg 2040
aggagcctgg agggcagcga cgacgccgtc ctgctccaga ggaggctgga caacatgaac 2100
ttcaagtgga gcgagctgcg gaagaagagc ctgaacatcc ggagccacct ggaagccagc 2160
agcgaccagt ggaagagact gcacctgagc ctgcaggagc tgctggtgtg gctgcagctg 2220
aaggacgacg agctgagcag acaggccccc atcggcggcg acttccccgc cgtgcagaag 2280
cagaacgacg tgcaccgggc cttcaagagg gagctgaaaa ccaaggaacc cgtgatcatg 2340
agcaccctgg agacagtgcg gatcttcctg accgagcagc ccctggaggg actggagaag 2400
ctgtaccagg agcccagaga gctgcccccc gaggagagag cccagaacgt gaccaggctg 2460
ctgagaaagc aggccgagga agtgaatacc gagtgggaga agctgaatct gcacagcgcc 2520
gactggcaga gaaagatcga cgagaccctg gagagactcc aggaactgca ggaagccacc 2580
gacgagctgg acctgaagct gagacaggcc gaagtgatca agggcagctg gcagcctgtg 2640
ggcgatctgc tgatcgactc cctgcaggat cacctggaga aagtgaaggc cctgcggggc 2700
gagatcgccc ccctgaagga gaatgtgagc cacgtgaacg acctggccag acagctgacc 2760
accctgggca tccagctgag cccctacaac ctgagcacac tggaggatct gaacacccgg 2820
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gacttcggcc ctgcctccca gcacttcctg agcaccagcg tgcagggccc ctgggagaga 2940
gccatctccc ccaacaaagt gccctactac atcaaccacg agacccagac cacctgctgg 3000
gaccacccta agatgaccga gctgtatcag agcctggccg acctgaacaa tgtgcggttc 3060
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cccatggaca tcctgcagat catcaactgc ctgaccacaa tctacgaccg gctggaacag 3240
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aacgtgtacg acaccggcag gaccggcaga atccgcgtgc tgagcttcaa gaccggcatc 3360
atcagcctgt gcaaggccca cctggaggat aagtaccgct acctgttcaa gcaggtggcc 3420
agcagcaccg gcttctgcga tcagaggaga ctgggcctgc tgctgcacga tagcatccag 3480
atccctaggc agctgggcga agtggccagc tttggcggca gcaacatcga gccctctgtg 3540
aggagctgct tccagttcgc caacaacaag cccgagatcg aggccgccct gttcctggac 3600
tggatgaggc tggagcctca gagcatggtg tggctgcctg tgctgcacag agtggccgcc 3660
gccgagaccg ccaagcacca ggccaagtgc aatatctgca aggagtgccc catcatcggc 3720
ttccggtaca ggagcctgaa gcacttcaac tacgacatct gccagagctg ctttttcagc 3780
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acctccggcg aggatgtgag agacttcgcc aaagtgctga agaataagtt ccggaccaag 3900
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<210> 2
<211> 3837
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hopti-Dys3837基因
<400> 2
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<210> 3
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<400> 3
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gagattgagg cccacaccga cgtgtaccac aacctggacg agaacagcca gaaaatcctg 2040
agaagcctgg aaggcagcga cgacgccgtg ctgctgcaga ggcggctgga caacatgaac 2100
ttcaagtgga gcgagctgag gaagaagagc ctgaacatca ggtcccatct ggaagccagc 2160
agcgaccagt ggaagaggct gcacctgagc ctgcaggaac tgctcgtctg gctgcagctg 2220
aaagacgacg agctgtccag gcaggccccc atcggcggcg acttccccgc cgtgcagaaa 2280
cagaacgacg tgcacagggc cttcaagcgg gagctgaaaa ccaaagagcc cgtgatcatg 2340
agcaccctgg aaaccgtgag gatcttcctg accgagcagc ccctggaagg actggaaaag 2400
ctgtaccagg aacccagaga gctgcccccc gaggaacggg cccagaacgt gaccaggctg 2460
ctgagaaagc aggccgagga agtgaacacc gagtgggaga agctgaacct gcactccgcc 2520
gactggcaga ggaagatcga cgagaccctg gaaaggctcc aggaactgca ggaagccacc 2580
gacgagctgg acctgaagct gagacaggcc gaggtgatca agggcagctg gcagcccgtg 2640
ggcgacctgc tgatcgactc cctgcaggat cacctggaaa aagtgaaggc cctgcggggc 2700
gagatcgccc ccctgaaaga gaacgtcagc cacgtcaacg acctggccag gcagctgacc 2760
accctgggca tccagctgtc cccctacaac ctgtccaccc tggaagatct gaacacaagg 2820
tggaagctgc tgcaggtggc cgtggaggac agagtgaggc agctgcacga ggcccacagg 2880
gacttcggcc ctgcctccca gcacttcctg agcaccagcg tgcagggccc ctgggagagg 2940
gccatctccc ccaacaaggt gccctactac atcaaccacg agacccagac cacctgctgg 3000
gaccacccta agatgaccga gctgtaccag tccctggccg acctgaacaa tgtgcggttc 3060
agcgcctacc ggaccgccat gaagctgagg cggctgcaga aagccctgtg cctggatctg 3120
ctgtccctga gcgccgcctg cgacgccctg gaccagcaca acctgaagca gaacgaccag 3180
cccatggata tcctgcagat catcaactgt ctgaccacca tctacgacag gctggaacag 3240
gaacacaaca acctggtcaa cgtgcccctg tgcgtggaca tgtgcctgaa ctggctgctg 3300
aacgtgtacg acaccggcag gaccggccgg atcagggtgc tgtccttcaa gaccggcatc 3360
atcagcctgt gcaaggccca cctggaagat aagtaccgct acctgttcaa gcaggtggcc 3420
agctctaccg gcttctgcga ccagcggagg ctgggcctgc tgctgcacga cagcatccag 3480
atcccccggc agctgggcga ggtggcctcc ttcggcggca gcaacatcga gcccagcgtg 3540
cggagctgct tccagttcgc caacaacaag cccgagatcg aggccgccct gttcctggac 3600
tggatgcggc tggaacccca gagcatggtc tggctgcccg tgctgcacag agtggctgcc 3660
gccgagaccg ccaagcacca ggccaagtgc aacatctgca aagagtgccc catcatcggc 3720
ttcaggtaca gaagcctgaa gcacttcaac tacgacatct gccagagctg tttcttcagc 3780
ggcagggtgg ccaagggcca caaaatgcac taccccatgg tggagtactg cacccccacc 3840
acctccggcg aggacgtgag ggacttcgcc aaggtgctga agaataagtt ccggaccaag 3900
cggtacttcg ccaaacaccc caggatgggc tacctgcccg tgcagaccgt gctggaaggc 3960
gacaacatgg aaacctga 3978
<210> 4
<211> 606
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCK启动子
<400> 4
gaattcggta ccccactacg ggtttaggct gcccatgtaa ggaggcaagg cctggggaca 60
cccgagatgc ctggttataa ttaacccaga catgtggctg cccccccccc ccccaacacc 120
tgctgcctct aaaaataacc ctgtccctgg tggatcccct gcatgcgaag atcttcgaac 180
aaggctgtgg gggactgagg gcaggctgta acaggcttgg gggccagggc ttatacgtgc 240
ctgggactcc caaagtatta ctgttccatg ttcccggcga agggccagct gtcccccgcc 300
agctagactc agcacttagt ttaggaacca gtgagcaagt cagcccttgg ggcagcccat 360
acaaggccat ggggctgggc aagctgcacg cctgggtccg gggtgggcac ggtgcccggg 420
caacgagctg aaagctcatc tgctctcagg ggcccctccc tggggacagc ccctcctggc 480
tagtcacacc ctgtaggctc ctctatataa cccaggggca caggggctgc cctcattcta 540
ccaccacctc cacagcacag acagacactc aggagccagc cagcgtcgag cggccgatcc 600
gccacc 606
<210> 5
<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCKplus启动子
<400> 5
gaattcggta ccccactacg ggtctaggct gcccatgtaa ggaggcaagg cctggggaca 60
cccgagatgc ctggttataa ttaaccccaa cacctgctgc cccccccccc ccaacacctg 120
ctgcctctaa aaataaccct gtccctggtg gatcccctgc atgccccact acgggtttag 180
gctgcccatg taaggaggca aggcctgggg acacccgaga tgcctggtta taattaaccc 240
agacatgtgg ctgccccccc cccccccaac acctgctgcc tctaaaaata accctgtccc 300
tggtggatcc cctgcatgcg aagatcttcg aacaaggctg tgggggactg agggcaggct 360
gtaacaggct tgggggccag ggcttatacg tgcctgggac tcccaaagta ttactgttcc 420
atgttcccgg cgaagggcca gctgtccccc gccagctaga ctcagcactt agtttaggaa 480
ccagtgagca agtcagccct tggggcagcc catacaaggc catggggctg ggcaagctgc 540
acgcctgggt ccggggtggg cacggtgccc gggcaacgag ctgaaagctc atctgctctc 600
aggggcccct ccctggggac agcccctcct ggctagtcac accctgtagg ctcctctata 660
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ctcaggagcc agccagcgtc gagcggccga tccgccacc 759
<210> 6
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的polyA
<400> 6
tgaggagctc gagaggccta ataaagagct cagatgcatc gatcagagtg tgttggtttt 60
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<210> 7
<211> 1325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Dys3978蛋白质
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Gly Lys Gln His Ile Glu Asn Leu Phe Ser Asp Leu Gln Asp Gly Arg
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Glu Lys Gly Ser Thr Arg Val His Ala Leu Asn Asn Val Asn Lys Ala
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Leu Arg Val Leu Gln Asn Asn Asn Val Asp Leu Val Asn Ile Gly Ser
85 90 95
Thr Asp Ile Val Asp Gly Asn His Lys Leu Thr Leu Gly Leu Ile Trp
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Asn Ile Ile Leu His Trp Gln Val Lys Asn Val Met Lys Asn Ile Met
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Arg Gln Ser Thr Arg Asn Tyr Pro Gln Val Asn Val Ile Asn Phe Thr
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Thr Ser Trp Ser Asp Gly Leu Ala Leu Asn Ala Leu Ile His Ser His
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180 185 190
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210 215 220
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370 375 380
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385 390 395 400
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450 455 460
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465 470 475 480
Pro Asp Leu Glu Asp Leu Lys Arg Gln Val Gln Gln His Lys Val Leu
485 490 495
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500 505 510
Met Val Val Val Val Asp Glu Ser Ser Gly Asp His Ala Thr Ala Ala
515 520 525
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530 535 540
Arg Trp Thr Glu Asp Arg Trp Val Leu Leu Gln Asp Gln Pro Asp Leu
545 550 555 560
Ala Pro Gly Leu Thr Thr Ile Gly Ala Ser Pro Thr Gln Thr Val Thr
565 570 575
Leu Val Thr Gln Pro Val Val Thr Lys Glu Thr Ala Ile Ser Lys Leu
580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
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705 710 715 720
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Gly Asp Phe Pro Ala Val Gln Lys Gln Asn Asp Val His Arg Ala Phe
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900 905 910
Asn Asp Leu Ala Arg Gln Leu Thr Thr Leu Gly Ile Gln Leu Ser Pro
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965 970 975
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980 985 990
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Asn Leu Lys Gln Asn Asp Gln Pro Met Asp Ile Leu Gln Ile Ile
1055 1060 1065
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1070 1075 1080
Asn Leu Val Asn Val Pro Leu Cys Val Asp Met Cys Leu Asn Trp
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Leu Ser Phe Lys Thr Gly Ile Ile Ser Leu Cys Lys Ala His Leu
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1130 1135 1140
Gly Phe Cys Asp Gln Arg Arg Leu Gly Leu Leu Leu His Asp Ser
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1160 1165 1170
Ser Asn Ile Glu Pro Ser Val Arg Ser Cys Phe Gln Phe Ala Asn
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Asn Lys Pro Glu Ile Glu Ala Ala Leu Phe Leu Asp Trp Met Arg
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1220 1225 1230
Lys Glu Cys Pro Ile Ile Gly Phe Arg Tyr Arg Ser Leu Lys His
1235 1240 1245
Phe Asn Tyr Asp Ile Cys Gln Ser Cys Phe Phe Ser Gly Arg Val
1250 1255 1260
Ala Lys Gly His Lys Met His Tyr Pro Met Val Glu Tyr Cys Thr
1265 1270 1275
Pro Thr Thr Ser Gly Glu Asp Val Arg Asp Phe Ala Lys Val Leu
1280 1285 1290
Lys Asn Lys Phe Arg Thr Lys Arg Tyr Phe Ala Lys His Pro Arg
1295 1300 1305
Met Gly Tyr Leu Pro Val Gln Thr Val Leu Glu Gly Asp Asn Met
1310 1315 1320
Glu Thr
1325
<210> 8
<211> 1278
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Dys3837蛋白质
<400> 8
Met Leu Trp Trp Glu Glu Val Glu Asp Cys Tyr Glu Arg Glu Asp Val
1 5 10 15
Gln Lys Lys Thr Phe Thr Lys Trp Val Asn Ala Gln Phe Ser Lys Phe
20 25 30
Gly Lys Gln His Ile Glu Asn Leu Phe Ser Asp Leu Gln Asp Gly Arg
35 40 45
Arg Leu Leu Asp Leu Leu Glu Gly Leu Thr Gly Gln Lys Leu Pro Lys
50 55 60
Glu Lys Gly Ser Thr Arg Val His Ala Leu Asn Asn Val Asn Lys Ala
65 70 75 80
Leu Arg Val Leu Gln Asn Asn Asn Val Asp Leu Val Asn Ile Gly Ser
85 90 95
Thr Asp Ile Val Asp Gly Asn His Lys Leu Thr Leu Gly Leu Ile Trp
100 105 110
Asn Ile Ile Leu His Trp Gln Val Lys Asn Val Met Lys Asn Ile Met
115 120 125
Ala Gly Leu Gln Gln Thr Asn Ser Glu Lys Ile Leu Leu Ser Trp Val
130 135 140
Arg Gln Ser Thr Arg Asn Tyr Pro Gln Val Asn Val Ile Asn Phe Thr
145 150 155 160
Thr Ser Trp Ser Asp Gly Leu Ala Leu Asn Ala Leu Ile His Ser His
165 170 175
Arg Pro Asp Leu Phe Asp Trp Asn Ser Val Val Cys Gln Gln Ser Ala
180 185 190
Thr Gln Arg Leu Glu His Ala Phe Asn Ile Ala Arg Tyr Gln Leu Gly
195 200 205
Ile Glu Lys Leu Leu Asp Pro Glu Asp Val Asp Thr Thr Tyr Pro Asp
210 215 220
Lys Lys Ser Ile Leu Met Tyr Ile Thr Ser Leu Phe Gln Val Leu Pro
225 230 235 240
Gln Gln Val Ser Ile Glu Ala Ile Gln Glu Val Glu Met Leu Pro Arg
245 250 255
Pro Pro Lys Val Thr Lys Glu Glu His Phe Gln Leu His His Gln Met
260 265 270
His Tyr Ser Gln Gln Ile Thr Val Ser Leu Ala Gln Gly Tyr Glu Arg
275 280 285
Thr Ser Ser Pro Lys Pro Arg Phe Lys Ser Tyr Ala Tyr Thr Gln Ala
290 295 300
Ala Tyr Val Thr Thr Ser Asp Pro Thr Arg Ser Pro Phe Pro Ser Gln
305 310 315 320
His Leu Glu Ala Pro Glu Asp Lys Ser Phe Gly Ser Ser Leu Met Glu
325 330 335
Ser Glu Val Asn Leu Asp Arg Tyr Gln Thr Ala Leu Glu Glu Val Leu
340 345 350
Ser Trp Leu Leu Ser Ala Glu Asp Thr Leu Gln Ala Gln Gly Glu Ile
355 360 365
Ser Asn Asp Val Glu Val Val Lys Asp Gln Phe His Thr His Glu Gly
370 375 380
Tyr Met Met Asp Leu Thr Ala His Gln Gly Arg Val Gly Asn Ile Leu
385 390 395 400
Gln Leu Gly Ser Lys Leu Ile Gly Thr Gly Lys Leu Ser Glu Asp Glu
405 410 415
Glu Thr Glu Val Gln Glu Gln Met Asn Leu Leu Asn Ser Arg Trp Glu
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Cys Leu Arg Val Ala Ser Met Glu Lys Gln Ser Asn Leu His Arg Val
435 440 445
Leu Met Asp Leu Gln Asn Gln Lys Leu Lys Glu Leu Asn Asp Trp Leu
450 455 460
Thr Lys Thr Glu Glu Arg Thr Arg Lys Met Glu Glu Glu Pro Leu Gly
465 470 475 480
Pro Asp Leu Glu Asp Leu Lys Arg Gln Val Gln Gln His Lys Val Leu
485 490 495
Gln Glu Asp Leu Glu Gln Glu Gln Val Arg Val Asn Ser Leu Thr His
500 505 510
Met Val Val Val Val Asp Glu Ser Ser Gly Asp His Ala Thr Ala Ala
515 520 525
Leu Glu Glu Gln Leu Lys Val Leu Gly Asp Arg Trp Ala Asn Ile Cys
530 535 540
Arg Trp Thr Glu Asp Arg Trp Val Leu Leu Gln Asp Thr His Arg Leu
545 550 555 560
Leu Gln Gln Phe Pro Leu Asp Leu Glu Lys Phe Leu Ala Trp Leu Thr
565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
Leu Asp Glu Asn Ser Gln Lys Ile Leu Arg Ser Leu Glu Gly Ser Asp
625 630 635 640
Asp Ala Val Leu Leu Gln Arg Arg Leu Asp Asn Met Asn Phe Lys Trp
645 650 655
Ser Glu Leu Arg Lys Lys Ser Leu Asn Ile Arg Ser His Leu Glu Ala
660 665 670
Ser Ser Asp Gln Trp Lys Arg Leu His Leu Ser Leu Gln Glu Leu Leu
675 680 685
Val Trp Leu Gln Leu Lys Asp Asp Glu Leu Ser Arg Gln Ala Pro Ile
690 695 700
Gly Gly Asp Phe Pro Ala Val Gln Lys Gln Asn Asp Val His Arg Ala
705 710 715 720
Phe Lys Arg Glu Leu Lys Thr Lys Glu Pro Val Ile Met Ser Thr Leu
725 730 735
Glu Thr Val Arg Ile Phe Leu Thr Glu Gln Pro Leu Glu Gly Leu Glu
740 745 750
Lys Leu Tyr Gln Glu Pro Arg Glu Leu Pro Pro Glu Glu Arg Ala Gln
755 760 765
Asn Val Thr Arg Leu Leu Arg Lys Gln Ala Glu Glu Val Asn Thr Glu
770 775 780
Trp Glu Lys Leu Asn Leu His Ser Ala Asp Trp Gln Arg Lys Ile Asp
785 790 795 800
Glu Thr Leu Glu Arg Leu Gln Glu Leu Gln Glu Ala Thr Asp Glu Leu
805 810 815
Asp Leu Lys Leu Arg Gln Ala Glu Val Ile Lys Gly Ser Trp Gln Pro
820 825 830
Val Gly Asp Leu Leu Ile Asp Ser Leu Gln Asp His Leu Glu Lys Val
835 840 845
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850 855 860
Val Asn Asp Leu Ala Arg Gln Leu Thr Thr Leu Gly Ile Gln Leu Ser
865 870 875 880
Pro Tyr Asn Leu Ser Thr Leu Glu Asp Leu Asn Thr Arg Trp Lys Leu
885 890 895
Leu Gln Val Ala Val Glu Asp Arg Val Arg Gln Leu His Glu Ala His
900 905 910
Arg Asp Phe Gly Pro Ala Ser Gln His Phe Leu Ser Thr Ser Val Gln
915 920 925
Gly Pro Trp Glu Arg Ala Ile Ser Pro Asn Lys Val Pro Tyr Tyr Ile
930 935 940
Asn His Glu Thr Gln Thr Thr Cys Trp Asp His Pro Lys Met Thr Glu
945 950 955 960
Leu Tyr Gln Ser Leu Ala Asp Leu Asn Asn Val Arg Phe Ser Ala Tyr
965 970 975
Arg Thr Ala Met Lys Leu Arg Arg Leu Gln Lys Ala Leu Cys Leu Asp
980 985 990
Leu Leu Ser Leu Ser Ala Ala Cys Asp Ala Leu Asp Gln His Asn Leu
995 1000 1005
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1085 1090 1095
Cys Asp Gln Arg Arg Leu Gly Leu Leu Leu His Asp Ser Ile Gln
1100 1105 1110
Ile Pro Arg Gln Leu Gly Glu Val Ala Ser Phe Gly Gly Ser Asn
1115 1120 1125
Ile Glu Pro Ser Val Arg Ser Cys Phe Gln Phe Ala Asn Asn Lys
1130 1135 1140
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1145 1150 1155
Pro Gln Ser Met Val Trp Leu Pro Val Leu His Arg Val Ala Ala
1160 1165 1170
Ala Glu Thr Ala Lys His Gln Ala Lys Cys Asn Ile Cys Lys Glu
1175 1180 1185
Cys Pro Ile Ile Gly Phe Arg Tyr Arg Ser Leu Lys His Phe Asn
1190 1195 1200
Tyr Asp Ile Cys Gln Ser Cys Phe Phe Ser Gly Arg Val Ala Lys
1205 1210 1215
Gly His Lys Met His Tyr Pro Met Val Glu Tyr Cys Thr Pro Thr
1220 1225 1230
Thr Ser Gly Glu Asp Val Arg Asp Phe Ala Lys Val Leu Lys Asn
1235 1240 1245
Lys Phe Arg Thr Lys Arg Tyr Phe Ala Lys His Pro Arg Met Gly
1250 1255 1260
Tyr Leu Pro Val Gln Thr Val Leu Glu Gly Asp Asn Met Glu Thr
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<210> 9
<211> 4953
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有Hopti-Dys3978基因的AAV载体基因组
<400> 9
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcctagatc tgaattcggt accccactac gggtttaggc 180
tgcccatgta aggaggcaag gcctggggac acccgagatg cctggttata attaacccag 240
acatgtggct gccccccccc cccccaacac ctgctgcctc taaaaataac cctgtccctg 300
gtggatcccc tgcatgcgaa gatcttcgaa caaggctgtg ggggactgag ggcaggctgt 360
aacaggcttg ggggccaggg cttatacgtg cctgggactc ccaaagtatt actgttccat 420
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agtgagcaag tcagcccttg gggcagccca tacaaggcca tggggctggg caagctgcac 540
gcctgggtcc ggggtgggca cggtgcccgg gcaacgagct gaaagctcat ctgctctcag 600
gggcccctcc ctggggacag cccctcctgg ctagtcacac cctgtaggct cctctatata 660
acccaggggc acaggggctg ccctcattct accaccacct ccacagcaca gacagacact 720
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<211> 4812
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有Hopti-Dys3837基因的AAV载体基因组
<400> 10
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<223> 具有Hopti-Dys3837基因的AAV载体基因组
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tggttttttg tgtgagatct aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg 4860
cgctcgctcg ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg 4920
cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaa 4965
<210> 12
<211> 4955
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有Copti-Dys3978基因的AAV载体基因组
<400> 12
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcctcagat ctgaattcgg taccccacta cgggtttagg 180
ctgcccatgt aaggaggcaa ggcctgggga cacccgagat gcctggttat aattaaccca 240
gacatgtggc tgcccccccc ccccccaaca cctgctgcct ctaaaaataa ccctgtccct 300
ggtggatccc ctgcatgcga agatcttcga acaaggctgt gggggactga gggcaggctg 360
taacaggctt gggggccagg gcttatacgt gcctgggact cccaaagtat tactgttcca 420
tgttcccggc gaagggccag ctgtcccccg ccagctagac tcagcactta gtttaggaac 480
cagtgagcaa gtcagccctt ggggcagccc atacaaggcc atggggctgg gcaagctgca 540
cgcctgggtc cggggtgggc acggtgcccg ggcaacgagc tgaaagctca tctgctctca 600
ggggcccctc cctggggaca gcccctcctg gctagtcaca ccctgtaggc tcctctatat 660
aacccagggg cacaggggct gccctcattc taccaccacc tccacagcac agacagacac 720
tcaggagcca gccagcgtcg agcggccgcc accatgcttt ggtgggagga agtggaggac 780
tgctacgagc gggaggacgt gcagaagaaa accttcacca agtgggtgaa cgcccagttc 840
agcaagttcg gcaagcagca catcgagaac ctgttcagcg acctgcagga cggcaggcgg 900
ctgctggacc tcctggaagg cctgaccggc cagaagctgc ccaaagagaa gggcagcacc 960
agggtgcacg ccctgaacaa cgtgaacaag gccctgaggg tgctgcagaa caacaacgtg 1020
gacctggtga acatcggcag caccgacatc gtggacggca accacaagct gaccctgggc 1080
ctgatctgga acatcatcct gcactggcag gtcaagaacg tgatgaagaa catcatggcc 1140
ggcctgcagc agaccaacag cgagaagatc ctgctgtcct gggtgcggca gagcaccagg 1200
aactaccccc aggtcaacgt gatcaacttc accacctctt ggagcgacgg cctggccctg 1260
aacgccctga tccacagcca caggcccgac ctgttcgact ggaacagcgt ggtgtgccag 1320
cagagcgcca cccagaggct ggaacacgcc ttcaacatcg ccagatacca gctgggcatc 1380
gagaagctgc tggatcccga ggacgtggac accacctacc ccgacaagaa aagcatcctc 1440
atgtacatca ccagcctgtt ccaggtgctg ccccagcagg tgtccatcga ggccatccag 1500
gaagtggaga tgctgcccag gccccccaag gtcaccaaag aggaacactt ccagctgcac 1560
caccagatgc actacagcca gcagatcacc gtgagcctgg cccagggcta cgagaggacc 1620
agcagcccca agcccaggtt caagagctac gcctacaccc aggccgccta cgtgaccacc 1680
tccgacccca ccaggtcccc cttccccagc cagcatctcg aagcccccga ggacaagagc 1740
ttcggcagca gcctgatgga aagcgaggtg aacctggaca gataccagac cgccctggaa 1800
gaagtgctgt cttggctgct gtccgccgag gacaccctgc aggcccaggg cgagatcagc 1860
aacgacgtgg aggtcgtgaa ggaccagttc cacacccacg agggctacat gatggacctg 1920
accgcccacc agggcagagt gggcaacatc ctgcagctgg gcagcaagct gatcggcacc 1980
ggcaagctgt ccgaggacga ggaaaccgag gtgcaggaac agatgaacct gctgaacagc 2040
agatgggagt gcctgagggt ggccagcatg gaaaagcaga gcaacctgca cagggtgctg 2100
atggatctgc agaaccagaa gctcaaagag ctgaacgact ggctgaccaa gaccgaggaa 2160
aggacccgga agatggaaga ggaacccctg ggccccgatc tcgaagatct gaagaggcag 2220
gtgcagcagc acaaggtgct gcaggaagat ctcgaacagg aacaggtccg ggtcaacagc 2280
ctgacccaca tggtcgtggt ggtggacgag agcagcggcg accacgccac cgctgccctg 2340
gaagagcagc tgaaggtgct gggcgacaga tgggccaaca tctgccggtg gaccgaggac 2400
agatgggtcc tcctgcagga ccagcccgac ctggcccctg gcctgacaac catcggcgcc 2460
agccccaccc agaccgtgac cctggtgacc cagcccgtgg tgaccaaaga gaccgccatc 2520
agcaagctgg aaatgcccag ctccctgatg ctggaagtgc ccacccacag gctcctccag 2580
cagttccccc tggacctgga aaagttcctg gcctggctga ccgaggccga gaccaccgcc 2640
aacgtgctgc aggacgccac caggaaagag aggctgctgg aagatagcaa gggcgtgaaa 2700
gagctgatga agcagtggca ggacctgcag ggggagattg aggcccacac cgacgtgtac 2760
cacaacctgg acgagaacag ccagaaaatc ctgagaagcc tggaaggcag cgacgacgcc 2820
gtgctgctgc agaggcggct ggacaacatg aacttcaagt ggagcgagct gaggaagaag 2880
agcctgaaca tcaggtccca tctggaagcc agcagcgacc agtggaagag gctgcacctg 2940
agcctgcagg aactgctcgt ctggctgcag ctgaaagacg acgagctgtc caggcaggcc 3000
cccatcggcg gcgacttccc cgccgtgcag aaacagaacg acgtgcacag ggccttcaag 3060
cgggagctga aaaccaaaga gcccgtgatc atgagcaccc tggaaaccgt gaggatcttc 3120
ctgaccgagc agcccctgga aggactggaa aagctgtacc aggaacccag agagctgccc 3180
cccgaggaac gggcccagaa cgtgaccagg ctgctgagaa agcaggccga ggaagtgaac 3240
accgagtggg agaagctgaa cctgcactcc gccgactggc agaggaagat cgacgagacc 3300
ctggaaaggc tccaggaact gcaggaagcc accgacgagc tggacctgaa gctgagacag 3360
gccgaggtga tcaagggcag ctggcagccc gtgggcgacc tgctgatcga ctccctgcag 3420
gatcacctgg aaaaagtgaa ggccctgcgg ggcgagatcg cccccctgaa agagaacgtc 3480
agccacgtca acgacctggc caggcagctg accaccctgg gcatccagct gtccccctac 3540
aacctgtcca ccctggaaga tctgaacaca aggtggaagc tgctgcaggt ggccgtggag 3600
gacagagtga ggcagctgca cgaggcccac agggacttcg gccctgcctc ccagcacttc 3660
ctgagcacca gcgtgcaggg cccctgggag agggccatct cccccaacaa ggtgccctac 3720
tacatcaacc acgagaccca gaccacctgc tgggaccacc ctaagatgac cgagctgtac 3780
cagtccctgg ccgacctgaa caatgtgcgg ttcagcgcct accggaccgc catgaagctg 3840
aggcggctgc agaaagccct gtgcctggat ctgctgtccc tgagcgccgc ctgcgacgcc 3900
ctggaccagc acaacctgaa gcagaacgac cagcccatgg atatcctgca gatcatcaac 3960
tgtctgacca ccatctacga caggctggaa caggaacaca acaacctggt caacgtgccc 4020
ctgtgcgtgg acatgtgcct gaactggctg ctgaacgtgt acgacaccgg caggaccggc 4080
cggatcaggg tgctgtcctt caagaccggc atcatcagcc tgtgcaaggc ccacctggaa 4140
gataagtacc gctacctgtt caagcaggtg gccagctcta ccggcttctg cgaccagcgg 4200
aggctgggcc tgctgctgca cgacagcatc cagatccccc ggcagctggg cgaggtggcc 4260
tccttcggcg gcagcaacat cgagcccagc gtgcggagct gcttccagtt cgccaacaac 4320
aagcccgaga tcgaggccgc cctgttcctg gactggatgc ggctggaacc ccagagcatg 4380
gtctggctgc ccgtgctgca cagagtggct gccgccgaga ccgccaagca ccaggccaag 4440
tgcaacatct gcaaagagtg ccccatcatc ggcttcaggt acagaagcct gaagcacttc 4500
aactacgaca tctgccagag ctgtttcttc agcggcaggg tggccaaggg ccacaaaatg 4560
cactacccca tggtggagta ctgcaccccc accacctccg gcgaggacgt gagggacttc 4620
gccaaggtgc tgaagaataa gttccggacc aagcggtact tcgccaaaca ccccaggatg 4680
ggctacctgc ccgtgcagac cgtgctggaa ggcgacaaca tggaaacctg ataacacgcg 4740
tcgactcgag aggcctaata aagagctcag atgcatcgat cagagtgtgt tggttttttg 4800
tgtgagatct aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg 4860
ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca 4920
gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaa 4955
<210> 13
<211> 736
<212> PRT
<213> 腺相关病毒9
<400> 13
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro
20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly
145 150 155 160
Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195 200 205
Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn
260 265 270
Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg
275 280 285
Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn
290 295 300
Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile
305 310 315 320
Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn
325 330 335
Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu
340 345 350
Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro
355 360 365
Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp
370 375 380
Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe
385 390 395 400
Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu
405 410 415
Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu
420 425 430
Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser
435 440 445
Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser
450 455 460
Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro
465 470 475 480
Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn
485 490 495
Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn
500 505 510
Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys
515 520 525
Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly
530 535 540
Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile
545 550 555 560
Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser
565 570 575
Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln
580 585 590
Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln
595 600 605
Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His
610 615 620
Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met
625 630 635 640
Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala
645 650 655
Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr
660 665 670
Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln
675 680 685
Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn
690 695 700
Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val
705 710 715 720
Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
725 730 735
<210> 14
<211> 145
<212> DNA
<213> 腺相关病毒2
<400> 14
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcct 145
<210> 15
<211> 145
<212> DNA
<213> 腺相关病毒2
<400> 15
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag agagggagtg gccaa 145
<210> 16
<211> 577
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的增强子和启动子
<400> 16
ccactacggg tctaggctgc ccatgtaagg aggcaaggcc tggggacacc cgagatgcct 60
ggttataatt aacccagaca tgtggctgcc cccccccccc ccaacacctg ctgcctctaa 120
aaataaccct gtccctggtg gatcccctgc atgcgaagat cttcgaacaa ggctgtgggg 180
gactgagggc aggctgtaac aggcttgggg gccagggctt atacgtgcct gggactccca 240
aagtattact gttccatgtt cccggcgaag ggccagctgt cccccgccag ctagactcag 300
cacttagttt aggaaccagt gagcaagtca gcccttgggg cagcccatac aaggccatgg 360
ggctgggcaa gctgcacgcc tgggtccggg gtgggcacgg tgcccgggca acgagctgaa 420
agctcatctg ctctcagggg cccctccctg gggacagccc ctcctggcta gtcacaccct 480
gtaggctcct ctatataacc caggggcaca ggggctgccc tcattctacc accacctcca 540
cagcacagac agacactcag gagccagcca gcgtcga 577
<210> 17
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的转录终止子
<400> 17
aggcctaata aagagctcag atgcatcgat cagagtgtgt tggttttttg tgtg 54
<210> 18
<211> 4955
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有Hopti-Dys3978基因的AAV载体基因组
<400> 18
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcctcagat ctgaattcgg taccccacta cgggtctagg 180
ctgcccatgt aaggaggcaa ggcctgggga cacccgagat gcctggttat aattaaccca 240
gacatgtggc tgcccccccc ccccccaaca cctgctgcct ctaaaaataa ccctgtccct 300
ggtggatccc ctgcatgcga agatcttcga acaaggctgt gggggactga gggcaggctg 360
taacaggctt gggggccagg gcttatacgt gcctgggact cccaaagtat tactgttcca 420
tgttcccggc gaagggccag ctgtcccccg ccagctagac tcagcactta gtttaggaac 480
cagtgagcaa gtcagccctt ggggcagccc atacaaggcc atggggctgg gcaagctgca 540
cgcctgggtc cggggtgggc acggtgcccg ggcaacgagc tgaaagctca tctgctctca 600
ggggcccctc cctggggaca gcccctcctg gctagtcaca ccctgtaggc tcctctatat 660
aacccagggg cacaggggct gccctcattc taccaccacc tccacagcac agacagacac 720
tcaggagcca gccagcgtcg agcggccgat ccgccaccat gctttggtgg gaggaagtgg 780
aggactgcta cgagagagag gacgtgcaga agaaaacctt caccaagtgg gtgaacgccc 840
agttcagcaa gttcggcaag cagcacatcg agaacctgtt cagcgacctg caggatggca 900
ggagactgct ggacctgctg gagggcctga ccggccagaa gctgcccaag gagaagggca 960
gcaccagagt gcacgccctg aacaacgtga acaaggccct gagagtgctg cagaacaaca 1020
acgtggacct ggtgaacatc ggcagcaccg acatcgtgga cggcaaccac aagctgaccc 1080
tgggcctgat ctggaacatc atcctgcact ggcaggtgaa gaacgtgatg aagaacatca 1140
tggccggcct gcagcagacc aacagcgaga agatcctgct gagctgggtg aggcagagca 1200
ccagaaacta cccccaggtg aacgtgatca acttcaccac ctcctggagc gacggcctgg 1260
ccctgaacgc cctgatccac agccacagac ccgacctgtt cgactggaac agcgtggtgt 1320
gtcagcagag cgccacccag agactggagc acgccttcaa catcgccaga taccagctgg 1380
gcatcgagaa gctgctggac cccgaggacg tggacaccac ctaccccgac aagaaaagca 1440
tcctcatgta cattaccagc ctgttccagg tgctgcccca gcaggtgtcc atcgaggcca 1500
tccaggaagt ggaaatgctg cccaggcccc ccaaagtgac caaggaggag cacttccagc 1560
tgcaccacca gatgcactac agccagcaga tcacagtgag cctggcccag ggctatgaga 1620
gaaccagcag ccccaagccc agattcaaga gctacgccta cacccaggcc gcctacgtga 1680
ccacctccga ccccaccaga agccccttcc ccagccagca cctggaggcc cccgaggaca 1740
agagcttcgg cagcagcctg atggagagcg aagtgaacct ggacagatac cagaccgccc 1800
tggaggaagt gctgtcctgg ctgctgagcg ccgaggacac cctgcaggcc cagggcgaga 1860
tcagcaacga cgtggaagtg gtgaaggacc agttccacac ccacgagggc tacatgatgg 1920
atctgaccgc ccaccagggc agagtgggca atatcctgca gctgggcagc aagctgatcg 1980
gcaccggcaa gctgagcgag gacgaggaga ccgaagtgca ggagcagatg aacctgctga 2040
acagcagatg ggagtgcctg agagtggcca gcatggagaa gcagagcaac ctgcacagag 2100
tgctgatgga cctgcagaac cagaagctga aggagctgaa cgactggctg accaagaccg 2160
aggagcggac cagaaagatg gaggaggagc ccctgggccc cgacctggag gacctgaaga 2220
gacaggtgca gcagcacaaa gtgctgcagg aggacctgga gcaggagcag gtgcgcgtga 2280
acagcctgac ccacatggtg gtggtcgtgg acgagagcag cggcgaccac gccacagccg 2340
ccctggaaga gcagctgaaa gtgctgggcg acagatgggc caatatttgt aggtggaccg 2400
aggacagatg ggtgctgctg caggaccagc ccgacctggc ccctggcctg accaccatcg 2460
gcgccagccc cacccagacc gtgaccctgg tgacccagcc cgtggtgaca aaggagaccg 2520
ccatcagcaa gctggagatg cccagctccc tgatgctgga agtgcccacc caccgcctgc 2580
tccagcagtt ccccctggac ctggagaagt tcctggcctg gctgaccgag gccgaaacca 2640
ccgccaatgt gctccaggac gccactagaa aggagaggct gctggaggac agcaagggcg 2700
tgaaagagct gatgaagcag tggcaggatc tgcagggcga aatcgaggcc cacaccgacg 2760
tgtaccacaa cctggacgag aacagccaga agattctgag gagcctggag ggcagcgacg 2820
acgccgtcct gctccagagg aggctggaca acatgaactt caagtggagc gagctgcgga 2880
agaagagcct gaacatccgg agccacctgg aagccagcag cgaccagtgg aagagactgc 2940
acctgagcct gcaggagctg ctggtgtggc tgcagctgaa ggacgacgag ctgagcagac 3000
aggcccccat cggcggcgac ttccccgccg tgcagaagca gaacgacgtg caccgggcct 3060
tcaagaggga gctgaaaacc aaggaacccg tgatcatgag caccctggag acagtgcgga 3120
tcttcctgac cgagcagccc ctggagggac tggagaagct gtaccaggag cccagagagc 3180
tgccccccga ggagagagcc cagaacgtga ccaggctgct gagaaagcag gccgaggaag 3240
tgaataccga gtgggagaag ctgaatctgc acagcgccga ctggcagaga aagatcgacg 3300
agaccctgga gagactccag gaactgcagg aagccaccga cgagctggac ctgaagctga 3360
gacaggccga agtgatcaag ggcagctggc agcctgtggg cgatctgctg atcgactccc 3420
tgcaggatca cctggagaaa gtgaaggccc tgcggggcga gatcgccccc ctgaaggaga 3480
atgtgagcca cgtgaacgac ctggccagac agctgaccac cctgggcatc cagctgagcc 3540
cctacaacct gagcacactg gaggatctga acacccggtg gaaactgctg caggtggccg 3600
tggaggatag agtgaggcag ctgcacgaag cccacagaga cttcggccct gcctcccagc 3660
acttcctgag caccagcgtg cagggcccct gggagagagc catctccccc aacaaagtgc 3720
cctactacat caaccacgag acccagacca cctgctggga ccaccctaag atgaccgagc 3780
tgtatcagag cctggccgac ctgaacaatg tgcggttcag cgcctacaga accgccatga 3840
agctgcggag actgcagaag gccctgtgcc tggatctgct gagcctgagc gccgcctgcg 3900
acgccctgga ccagcacaac ctgaagcaga atgaccagcc catggacatc ctgcagatca 3960
tcaactgcct gaccacaatc tacgaccggc tggaacagga gcacaacaac ctggtgaatg 4020
tgcccctgtg cgtggacatg tgcctgaatt ggctgctgaa cgtgtacgac accggcagga 4080
ccggcagaat ccgcgtgctg agcttcaaga ccggcatcat cagcctgtgc aaggcccacc 4140
tggaggataa gtaccgctac ctgttcaagc aggtggccag cagcaccggc ttctgcgatc 4200
agaggagact gggcctgctg ctgcacgata gcatccagat ccctaggcag ctgggcgaag 4260
tggccagctt tggcggcagc aacatcgagc cctctgtgag gagctgcttc cagttcgcca 4320
acaacaagcc cgagatcgag gccgccctgt tcctggactg gatgaggctg gagcctcaga 4380
gcatggtgtg gctgcctgtg ctgcacagag tggccgccgc cgagaccgcc aagcaccagg 4440
ccaagtgcaa tatctgcaag gagtgcccca tcatcggctt ccggtacagg agcctgaagc 4500
acttcaacta cgacatctgc cagagctgct ttttcagcgg cagagtggcc aagggccaca 4560
aaatgcacta ccccatggtg gagtactgca cccccaccac ctccggcgag gatgtgagag 4620
acttcgccaa agtgctgaag aataagttcc ggaccaagcg gtactttgcc aagcacccca 4680
ggatgggcta cctgcccgtg cagaccgtgc tggaaggcga caacatggag acctgatgag 4740
gagctcgaga ggcctaataa agagctcaga tgcatcgatc agagtgtgtt ggttttttgt 4800
gtgagatctg aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg 4860
ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca 4920
gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaa 4955
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 19
ccaacaaagt gccctactac atc 23
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 20
ggttgtgctg gtccagggcg t 21
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 21
ccgagctgta tcagagcctg gcc 23
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 22
gcgaaagtgg aaaagccaag t 21
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 23
gccacatcaa caggactctt gtag 24
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 24
caaagcctaa aagacagcgg caagttgaat 30
<210> 25
<211> 3685
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 25
Met Leu Trp Trp Glu Glu Val Glu Asp Cys Tyr Glu Arg Glu Asp Val
1 5 10 15
Gln Lys Lys Thr Phe Thr Lys Trp Val Asn Ala Gln Phe Ser Lys Phe
20 25 30
Gly Lys Gln His Ile Glu Asn Leu Phe Ser Asp Leu Gln Asp Gly Arg
35 40 45
Arg Leu Leu Asp Leu Leu Glu Gly Leu Thr Gly Gln Lys Leu Pro Lys
50 55 60
Glu Lys Gly Ser Thr Arg Val His Ala Leu Asn Asn Val Asn Lys Ala
65 70 75 80
Leu Arg Val Leu Gln Asn Asn Asn Val Asp Leu Val Asn Ile Gly Ser
85 90 95
Thr Asp Ile Val Asp Gly Asn His Lys Leu Thr Leu Gly Leu Ile Trp
100 105 110
Asn Ile Ile Leu His Trp Gln Val Lys Asn Val Met Lys Asn Ile Met
115 120 125
Ala Gly Leu Gln Gln Thr Asn Ser Glu Lys Ile Leu Leu Ser Trp Val
130 135 140
Arg Gln Ser Thr Arg Asn Tyr Pro Gln Val Asn Val Ile Asn Phe Thr
145 150 155 160
Thr Ser Trp Ser Asp Gly Leu Ala Leu Asn Ala Leu Ile His Ser His
165 170 175
Arg Pro Asp Leu Phe Asp Trp Asn Ser Val Val Cys Gln Gln Ser Ala
180 185 190
Thr Gln Arg Leu Glu His Ala Phe Asn Ile Ala Arg Tyr Gln Leu Gly
195 200 205
Ile Glu Lys Leu Leu Asp Pro Glu Asp Val Asp Thr Thr Tyr Pro Asp
210 215 220
Lys Lys Ser Ile Leu Met Tyr Ile Thr Ser Leu Phe Gln Val Leu Pro
225 230 235 240
Gln Gln Val Ser Ile Glu Ala Ile Gln Glu Val Glu Met Leu Pro Arg
245 250 255
Pro Pro Lys Val Thr Lys Glu Glu His Phe Gln Leu His His Gln Met
260 265 270
His Tyr Ser Gln Gln Ile Thr Val Ser Leu Ala Gln Gly Tyr Glu Arg
275 280 285
Thr Ser Ser Pro Lys Pro Arg Phe Lys Ser Tyr Ala Tyr Thr Gln Ala
290 295 300
Ala Tyr Val Thr Thr Ser Asp Pro Thr Arg Ser Pro Phe Pro Ser Gln
305 310 315 320
His Leu Glu Ala Pro Glu Asp Lys Ser Phe Gly Ser Ser Leu Met Glu
325 330 335
Ser Glu Val Asn Leu Asp Arg Tyr Gln Thr Ala Leu Glu Glu Val Leu
340 345 350
Ser Trp Leu Leu Ser Ala Glu Asp Thr Leu Gln Ala Gln Gly Glu Ile
355 360 365
Ser Asn Asp Val Glu Val Val Lys Asp Gln Phe His Thr His Glu Gly
370 375 380
Tyr Met Met Asp Leu Thr Ala His Gln Gly Arg Val Gly Asn Ile Leu
385 390 395 400
Gln Leu Gly Ser Lys Leu Ile Gly Thr Gly Lys Leu Ser Glu Asp Glu
405 410 415
Glu Thr Glu Val Gln Glu Gln Met Asn Leu Leu Asn Ser Arg Trp Glu
420 425 430
Cys Leu Arg Val Ala Ser Met Glu Lys Gln Ser Asn Leu His Arg Val
435 440 445
Leu Met Asp Leu Gln Asn Gln Lys Leu Lys Glu Leu Asn Asp Trp Leu
450 455 460
Thr Lys Thr Glu Glu Arg Thr Arg Lys Met Glu Glu Glu Pro Leu Gly
465 470 475 480
Pro Asp Leu Glu Asp Leu Lys Arg Gln Val Gln Gln His Lys Val Leu
485 490 495
Gln Glu Asp Leu Glu Gln Glu Gln Val Arg Val Asn Ser Leu Thr His
500 505 510
Met Val Val Val Val Asp Glu Ser Ser Gly Asp His Ala Thr Ala Ala
515 520 525
Leu Glu Glu Gln Leu Lys Val Leu Gly Asp Arg Trp Ala Asn Ile Cys
530 535 540
Arg Trp Thr Glu Asp Arg Trp Val Leu Leu Gln Asp Ile Leu Leu Lys
545 550 555 560
Trp Gln Arg Leu Thr Glu Glu Gln Cys Leu Phe Ser Ala Trp Leu Ser
565 570 575
Glu Lys Glu Asp Ala Val Asn Lys Ile His Thr Thr Gly Phe Lys Asp
580 585 590
Gln Asn Glu Met Leu Ser Ser Leu Gln Lys Leu Ala Val Leu Lys Ala
595 600 605
Asp Leu Glu Lys Lys Lys Gln Ser Met Gly Lys Leu Tyr Ser Leu Lys
610 615 620
Gln Asp Leu Leu Ser Thr Leu Lys Asn Lys Ser Val Thr Gln Lys Thr
625 630 635 640
Glu Ala Trp Leu Asp Asn Phe Ala Arg Cys Trp Asp Asn Leu Val Gln
645 650 655
Lys Leu Glu Lys Ser Thr Ala Gln Ile Ser Gln Ala Val Thr Thr Thr
660 665 670
Gln Pro Ser Leu Thr Gln Thr Thr Val Met Glu Thr Val Thr Thr Val
675 680 685
Thr Thr Arg Glu Gln Ile Leu Val Lys His Ala Gln Glu Glu Leu Pro
690 695 700
Pro Pro Pro Pro Gln Lys Lys Arg Gln Ile Thr Val Asp Ser Glu Ile
705 710 715 720
Arg Lys Arg Leu Asp Val Asp Ile Thr Glu Leu His Ser Trp Ile Thr
725 730 735
Arg Ser Glu Ala Val Leu Gln Ser Pro Glu Phe Ala Ile Phe Arg Lys
740 745 750
Glu Gly Asn Phe Ser Asp Leu Lys Glu Lys Val Asn Ala Ile Glu Arg
755 760 765
Glu Lys Ala Glu Lys Phe Arg Lys Leu Gln Asp Ala Ser Arg Ser Ala
770 775 780
Gln Ala Leu Val Glu Gln Met Val Asn Glu Gly Val Asn Ala Asp Ser
785 790 795 800
Ile Lys Gln Ala Ser Glu Gln Leu Asn Ser Arg Trp Ile Glu Phe Cys
805 810 815
Gln Leu Leu Ser Glu Arg Leu Asn Trp Leu Glu Tyr Gln Asn Asn Ile
820 825 830
Ile Ala Phe Tyr Asn Gln Leu Gln Gln Leu Glu Gln Met Thr Thr Thr
835 840 845
Ala Glu Asn Trp Leu Lys Ile Gln Pro Thr Thr Pro Ser Glu Pro Thr
850 855 860
Ala Ile Lys Ser Gln Leu Lys Ile Cys Lys Asp Glu Val Asn Arg Leu
865 870 875 880
Ser Gly Leu Gln Pro Gln Ile Glu Arg Leu Lys Ile Gln Ser Ile Ala
885 890 895
Leu Lys Glu Lys Gly Gln Gly Pro Met Phe Leu Asp Ala Asp Phe Val
900 905 910
Ala Phe Thr Asn His Phe Lys Gln Val Phe Ser Asp Val Gln Ala Arg
915 920 925
Glu Lys Glu Leu Gln Thr Ile Phe Asp Thr Leu Pro Pro Met Arg Tyr
930 935 940
Gln Glu Thr Met Ser Ala Ile Arg Thr Trp Val Gln Gln Ser Glu Thr
945 950 955 960
Lys Leu Ser Ile Pro Gln Leu Ser Val Thr Asp Tyr Glu Ile Met Glu
965 970 975
Gln Arg Leu Gly Glu Leu Gln Ala Leu Gln Ser Ser Leu Gln Glu Gln
980 985 990
Gln Ser Gly Leu Tyr Tyr Leu Ser Thr Thr Val Lys Glu Met Ser Lys
995 1000 1005
Lys Ala Pro Ser Glu Ile Ser Arg Lys Tyr Gln Ser Glu Phe Glu
1010 1015 1020
Glu Ile Glu Gly Arg Trp Lys Lys Leu Ser Ser Gln Leu Val Glu
1025 1030 1035
His Cys Gln Lys Leu Glu Glu Gln Met Asn Lys Leu Arg Lys Ile
1040 1045 1050
Gln Asn His Ile Gln Thr Leu Lys Lys Trp Met Ala Glu Val Asp
1055 1060 1065
Val Phe Leu Lys Glu Glu Trp Pro Ala Leu Gly Asp Ser Glu Ile
1070 1075 1080
Leu Lys Lys Gln Leu Lys Gln Cys Arg Leu Leu Val Ser Asp Ile
1085 1090 1095
Gln Thr Ile Gln Pro Ser Leu Asn Ser Val Asn Glu Gly Gly Gln
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Lys Ile Lys Asn Glu Ala Glu Pro Glu Phe Ala Ser Arg Leu Glu
1115 1120 1125
Thr Glu Leu Lys Glu Leu Asn Thr Gln Trp Asp His Met Cys Gln
1130 1135 1140
Gln Val Tyr Ala Arg Lys Glu Ala Leu Lys Gly Gly Leu Glu Lys
1145 1150 1155
Thr Val Ser Leu Gln Lys Asp Leu Ser Glu Met His Glu Trp Met
1160 1165 1170
Thr Gln Ala Glu Glu Glu Tyr Leu Glu Arg Asp Phe Glu Tyr Lys
1175 1180 1185
Thr Pro Asp Glu Leu Gln Lys Ala Val Glu Glu Met Lys Arg Ala
1190 1195 1200
Lys Glu Glu Ala Gln Gln Lys Glu Ala Lys Val Lys Leu Leu Thr
1205 1210 1215
Glu Ser Val Asn Ser Val Ile Ala Gln Ala Pro Pro Val Ala Gln
1220 1225 1230
Glu Ala Leu Lys Lys Glu Leu Glu Thr Leu Thr Thr Asn Tyr Gln
1235 1240 1245
Trp Leu Cys Thr Arg Leu Asn Gly Lys Cys Lys Thr Leu Glu Glu
1250 1255 1260
Val Trp Ala Cys Trp His Glu Leu Leu Ser Tyr Leu Glu Lys Ala
1265 1270 1275
Asn Lys Trp Leu Asn Glu Val Glu Phe Lys Leu Lys Thr Thr Glu
1280 1285 1290
Asn Ile Pro Gly Gly Ala Glu Glu Ile Ser Glu Val Leu Asp Ser
1295 1300 1305
Leu Glu Asn Leu Met Arg His Ser Glu Asp Asn Pro Asn Gln Ile
1310 1315 1320
Arg Ile Leu Ala Gln Thr Leu Thr Asp Gly Gly Val Met Asp Glu
1325 1330 1335
Leu Ile Asn Glu Glu Leu Glu Thr Phe Asn Ser Arg Trp Arg Glu
1340 1345 1350
Leu His Glu Glu Ala Val Arg Arg Gln Lys Leu Leu Glu Gln Ser
1355 1360 1365
Ile Gln Ser Ala Gln Glu Thr Glu Lys Ser Leu His Leu Ile Gln
1370 1375 1380
Glu Ser Leu Thr Phe Ile Asp Lys Gln Leu Ala Ala Tyr Ile Ala
1385 1390 1395
Asp Lys Val Asp Ala Ala Gln Met Pro Gln Glu Ala Gln Lys Ile
1400 1405 1410
Gln Ser Asp Leu Thr Ser His Glu Ile Ser Leu Glu Glu Met Lys
1415 1420 1425
Lys His Asn Gln Gly Lys Glu Ala Ala Gln Arg Val Leu Ser Gln
1430 1435 1440
Ile Asp Val Ala Gln Lys Lys Leu Gln Asp Val Ser Met Lys Phe
1445 1450 1455
Arg Leu Phe Gln Lys Pro Ala Asn Phe Glu Gln Arg Leu Gln Glu
1460 1465 1470
Ser Lys Met Ile Leu Asp Glu Val Lys Met His Leu Pro Ala Leu
1475 1480 1485
Glu Thr Lys Ser Val Glu Gln Glu Val Val Gln Ser Gln Leu Asn
1490 1495 1500
His Cys Val Asn Leu Tyr Lys Ser Leu Ser Glu Val Lys Ser Glu
1505 1510 1515
Val Glu Met Val Ile Lys Thr Gly Arg Gln Ile Val Gln Lys Lys
1520 1525 1530
Gln Thr Glu Asn Pro Lys Glu Leu Asp Glu Arg Val Thr Ala Leu
1535 1540 1545
Lys Leu His Tyr Asn Glu Leu Gly Ala Lys Val Thr Glu Arg Lys
1550 1555 1560
Gln Gln Leu Glu Lys Cys Leu Lys Leu Ser Arg Lys Met Arg Lys
1565 1570 1575
Glu Met Asn Val Leu Thr Glu Trp Leu Ala Ala Thr Asp Met Glu
1580 1585 1590
Leu Thr Lys Arg Ser Ala Val Glu Gly Met Pro Ser Asn Leu Asp
1595 1600 1605
Ser Glu Val Ala Trp Gly Lys Ala Thr Gln Lys Glu Ile Glu Lys
1610 1615 1620
Gln Lys Val His Leu Lys Ser Ile Thr Glu Val Gly Glu Ala Leu
1625 1630 1635
Lys Thr Val Leu Gly Lys Lys Glu Thr Leu Val Glu Asp Lys Leu
1640 1645 1650
Ser Leu Leu Asn Ser Asn Trp Ile Ala Val Thr Ser Arg Ala Glu
1655 1660 1665
Glu Trp Leu Asn Leu Leu Leu Glu Tyr Gln Lys His Met Glu Thr
1670 1675 1680
Phe Asp Gln Asn Val Asp His Ile Thr Lys Trp Ile Ile Gln Ala
1685 1690 1695
Asp Thr Leu Leu Asp Glu Ser Glu Lys Lys Lys Pro Gln Gln Lys
1700 1705 1710
Glu Asp Val Leu Lys Arg Leu Lys Ala Glu Leu Asn Asp Ile Arg
1715 1720 1725
Pro Lys Val Asp Ser Thr Arg Asp Gln Ala Ala Asn Leu Met Ala
1730 1735 1740
Asn Arg Gly Asp His Cys Arg Lys Leu Val Glu Pro Gln Ile Ser
1745 1750 1755
Glu Leu Asn His Arg Phe Ala Ala Ile Ser His Arg Ile Lys Thr
1760 1765 1770
Gly Lys Ala Ser Ile Pro Leu Lys Glu Leu Glu Gln Phe Asn Ser
1775 1780 1785
Asp Ile Gln Lys Leu Leu Glu Pro Leu Glu Ala Glu Ile Gln Gln
1790 1795 1800
Gly Val Asn Leu Lys Glu Glu Asp Phe Asn Lys Asp Met Asn Glu
1805 1810 1815
Asp Asn Glu Gly Thr Val Lys Glu Leu Leu Gln Arg Gly Asp Asn
1820 1825 1830
Leu Gln Gln Arg Ile Thr Asp Glu Arg Lys Arg Glu Glu Ile Lys
1835 1840 1845
Ile Lys Gln Gln Leu Leu Gln Thr Lys His Asn Ala Leu Lys Asp
1850 1855 1860
Leu Arg Ser Gln Arg Arg Lys Lys Ala Leu Glu Ile Ser His Gln
1865 1870 1875
Trp Tyr Gln Tyr Lys Arg Gln Ala Asp Asp Leu Leu Lys Cys Leu
1880 1885 1890
Asp Asp Ile Glu Lys Lys Leu Ala Ser Leu Pro Glu Pro Arg Asp
1895 1900 1905
Glu Arg Lys Ile Lys Glu Ile Asp Arg Glu Leu Gln Lys Lys Lys
1910 1915 1920
Glu Glu Leu Asn Ala Val Arg Arg Gln Ala Glu Gly Leu Ser Glu
1925 1930 1935
Asp Gly Ala Ala Met Ala Val Glu Pro Thr Gln Ile Gln Leu Ser
1940 1945 1950
Lys Arg Trp Arg Glu Ile Glu Ser Lys Phe Ala Gln Phe Arg Arg
1955 1960 1965
Leu Asn Phe Ala Gln Ile His Thr Val Arg Glu Glu Thr Met Met
1970 1975 1980
Val Met Thr Glu Asp Met Pro Leu Glu Ile Ser Tyr Val Pro Ser
1985 1990 1995
Thr Tyr Leu Thr Glu Ile Thr His Val Ser Gln Ala Leu Leu Glu
2000 2005 2010
Val Glu Gln Leu Leu Asn Ala Pro Asp Leu Cys Ala Lys Asp Phe
2015 2020 2025
Glu Asp Leu Phe Lys Gln Glu Glu Ser Leu Lys Asn Ile Lys Asp
2030 2035 2040
Ser Leu Gln Gln Ser Ser Gly Arg Ile Asp Ile Ile His Ser Lys
2045 2050 2055
Lys Thr Ala Ala Leu Gln Ser Ala Thr Pro Val Glu Arg Val Lys
2060 2065 2070
Leu Gln Glu Ala Leu Ser Gln Leu Asp Phe Gln Trp Glu Lys Val
2075 2080 2085
Asn Lys Met Tyr Lys Asp Arg Gln Gly Arg Phe Asp Arg Ser Val
2090 2095 2100
Glu Lys Trp Arg Arg Phe His Tyr Asp Ile Lys Ile Phe Asn Gln
2105 2110 2115
Trp Leu Thr Glu Ala Glu Gln Phe Leu Arg Lys Thr Gln Ile Pro
2120 2125 2130
Glu Asn Trp Glu His Ala Lys Tyr Lys Trp Tyr Leu Lys Glu Leu
2135 2140 2145
Gln Asp Gly Ile Gly Gln Arg Gln Thr Val Val Arg Thr Leu Asn
2150 2155 2160
Ala Thr Gly Glu Glu Ile Ile Gln Gln Ser Ser Lys Thr Asp Ala
2165 2170 2175
Ser Ile Leu Gln Glu Lys Leu Gly Ser Leu Asn Leu Arg Trp Gln
2180 2185 2190
Glu Val Cys Lys Gln Leu Ser Asp Arg Lys Lys Arg Leu Glu Glu
2195 2200 2205
Gln Lys Asn Ile Leu Ser Glu Phe Gln Arg Asp Leu Asn Glu Phe
2210 2215 2220
Val Leu Trp Leu Glu Glu Ala Asp Asn Ile Ala Ser Ile Pro Leu
2225 2230 2235
Glu Pro Gly Lys Glu Gln Gln Leu Lys Glu Lys Leu Glu Gln Val
2240 2245 2250
Lys Leu Leu Val Glu Glu Leu Pro Leu Arg Gln Gly Ile Leu Lys
2255 2260 2265
Gln Leu Asn Glu Thr Gly Gly Pro Val Leu Val Ser Ala Pro Ile
2270 2275 2280
Ser Pro Glu Glu Gln Asp Lys Leu Glu Asn Lys Leu Lys Gln Thr
2285 2290 2295
Asn Leu Gln Trp Ile Lys Val Ser Arg Ala Leu Pro Glu Lys Gln
2300 2305 2310
Gly Glu Ile Glu Ala Gln Ile Lys Asp Leu Gly Gln Leu Glu Lys
2315 2320 2325
Lys Leu Glu Asp Leu Glu Glu Gln Leu Asn His Leu Leu Leu Trp
2330 2335 2340
Leu Ser Pro Ile Arg Asn Gln Leu Glu Ile Tyr Asn Gln Pro Asn
2345 2350 2355
Gln Glu Gly Pro Phe Asp Val Gln Glu Thr Glu Ile Ala Val Gln
2360 2365 2370
Ala Lys Gln Pro Asp Val Glu Glu Ile Leu Ser Lys Gly Gln His
2375 2380 2385
Leu Tyr Lys Glu Lys Pro Ala Thr Gln Pro Val Lys Arg Lys Leu
2390 2395 2400
Glu Asp Leu Ser Ser Glu Trp Lys Ala Val Asn Arg Leu Leu Gln
2405 2410 2415
Glu Leu Arg Ala Lys Gln Pro Asp Leu Ala Pro Gly Leu Thr Thr
2420 2425 2430
Ile Gly Ala Ser Pro Thr Gln Thr Val Thr Leu Val Thr Gln Pro
2435 2440 2445
Val Val Thr Lys Glu Thr Ala Ile Ser Lys Leu Glu Met Pro Ser
2450 2455 2460
Ser Leu Met Leu Glu Val Pro Ala Leu Ala Asp Phe Asn Arg Ala
2465 2470 2475
Trp Thr Glu Leu Thr Asp Trp Leu Ser Leu Leu Asp Gln Val Ile
2480 2485 2490
Lys Ser Gln Arg Val Met Val Gly Asp Leu Glu Asp Ile Asn Glu
2495 2500 2505
Met Ile Ile Lys Gln Lys Ala Thr Met Gln Asp Leu Glu Gln Arg
2510 2515 2520
Arg Pro Gln Leu Glu Glu Leu Ile Thr Ala Ala Gln Asn Leu Lys
2525 2530 2535
Asn Lys Thr Ser Asn Gln Glu Ala Arg Thr Ile Ile Thr Asp Arg
2540 2545 2550
Ile Glu Arg Ile Gln Asn Gln Trp Asp Glu Val Gln Glu His Leu
2555 2560 2565
Gln Asn Arg Arg Gln Gln Leu Asn Glu Met Leu Lys Asp Ser Thr
2570 2575 2580
Gln Trp Leu Glu Ala Lys Glu Glu Ala Glu Gln Val Leu Gly Gln
2585 2590 2595
Ala Arg Ala Lys Leu Glu Ser Trp Lys Glu Gly Pro Tyr Thr Val
2600 2605 2610
Asp Ala Ile Gln Lys Lys Ile Thr Glu Thr Lys Gln Leu Ala Lys
2615 2620 2625
Asp Leu Arg Gln Trp Gln Thr Asn Val Asp Val Ala Asn Asp Leu
2630 2635 2640
Ala Leu Lys Leu Leu Arg Asp Tyr Ser Ala Asp Asp Thr Arg Lys
2645 2650 2655
Val His Met Ile Thr Glu Asn Ile Asn Ala Ser Trp Arg Ser Ile
2660 2665 2670
His Lys Arg Val Ser Glu Arg Glu Ala Ala Leu Glu Glu Thr His
2675 2680 2685
Arg Leu Leu Gln Gln Phe Pro Leu Asp Leu Glu Lys Phe Leu Ala
2690 2695 2700
Trp Leu Thr Glu Ala Glu Thr Thr Ala Asn Val Leu Gln Asp Ala
2705 2710 2715
Thr Arg Lys Glu Arg Leu Leu Glu Asp Ser Lys Gly Val Lys Glu
2720 2725 2730
Leu Met Lys Gln Trp Gln Asp Leu Gln Gly Glu Ile Glu Ala His
2735 2740 2745
Thr Asp Val Tyr His Asn Leu Asp Glu Asn Ser Gln Lys Ile Leu
2750 2755 2760
Arg Ser Leu Glu Gly Ser Asp Asp Ala Val Leu Leu Gln Arg Arg
2765 2770 2775
Leu Asp Asn Met Asn Phe Lys Trp Ser Glu Leu Arg Lys Lys Ser
2780 2785 2790
Leu Asn Ile Arg Ser His Leu Glu Ala Ser Ser Asp Gln Trp Lys
2795 2800 2805
Arg Leu His Leu Ser Leu Gln Glu Leu Leu Val Trp Leu Gln Leu
2810 2815 2820
Lys Asp Asp Glu Leu Ser Arg Gln Ala Pro Ile Gly Gly Asp Phe
2825 2830 2835
Pro Ala Val Gln Lys Gln Asn Asp Val His Arg Ala Phe Lys Arg
2840 2845 2850
Glu Leu Lys Thr Lys Glu Pro Val Ile Met Ser Thr Leu Glu Thr
2855 2860 2865
Val Arg Ile Phe Leu Thr Glu Gln Pro Leu Glu Gly Leu Glu Lys
2870 2875 2880
Leu Tyr Gln Glu Pro Arg Glu Leu Pro Pro Glu Glu Arg Ala Gln
2885 2890 2895
Asn Val Thr Arg Leu Leu Arg Lys Gln Ala Glu Glu Val Asn Thr
2900 2905 2910
Glu Trp Glu Lys Leu Asn Leu His Ser Ala Asp Trp Gln Arg Lys
2915 2920 2925
Ile Asp Glu Thr Leu Glu Arg Leu Gln Glu Leu Gln Glu Ala Thr
2930 2935 2940
Asp Glu Leu Asp Leu Lys Leu Arg Gln Ala Glu Val Ile Lys Gly
2945 2950 2955
Ser Trp Gln Pro Val Gly Asp Leu Leu Ile Asp Ser Leu Gln Asp
2960 2965 2970
His Leu Glu Lys Val Lys Ala Leu Arg Gly Glu Ile Ala Pro Leu
2975 2980 2985
Lys Glu Asn Val Ser His Val Asn Asp Leu Ala Arg Gln Leu Thr
2990 2995 3000
Thr Leu Gly Ile Gln Leu Ser Pro Tyr Asn Leu Ser Thr Leu Glu
3005 3010 3015
Asp Leu Asn Thr Arg Trp Lys Leu Leu Gln Val Ala Val Glu Asp
3020 3025 3030
Arg Val Arg Gln Leu His Glu Ala His Arg Asp Phe Gly Pro Ala
3035 3040 3045
Ser Gln His Phe Leu Ser Thr Ser Val Gln Gly Pro Trp Glu Arg
3050 3055 3060
Ala Ile Ser Pro Asn Lys Val Pro Tyr Tyr Ile Asn His Glu Thr
3065 3070 3075
Gln Thr Thr Cys Trp Asp His Pro Lys Met Thr Glu Leu Tyr Gln
3080 3085 3090
Ser Leu Ala Asp Leu Asn Asn Val Arg Phe Ser Ala Tyr Arg Thr
3095 3100 3105
Ala Met Lys Leu Arg Arg Leu Gln Lys Ala Leu Cys Leu Asp Leu
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Leu Ser Leu Ser Ala Ala Cys Asp Ala Leu Asp Gln His Asn Leu
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Lys Gln Asn Asp Gln Pro Met Asp Ile Leu Gln Ile Ile Asn Cys
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Leu Thr Thr Ile Tyr Asp Arg Leu Glu Gln Glu His Asn Asn Leu
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Val Asn Val Pro Leu Cys Val Asp Met Cys Leu Asn Trp Leu Leu
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Asn Val Tyr Asp Thr Gly Arg Thr Gly Arg Ile Arg Val Leu Ser
3185 3190 3195
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Lys Tyr Arg Tyr Leu Phe Lys Gln Val Ala Ser Ser Thr Gly Phe
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Cys Asp Gln Arg Arg Leu Gly Leu Leu Leu His Asp Ser Ile Gln
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Ile Pro Arg Gln Leu Gly Glu Val Ala Ser Phe Gly Gly Ser Asn
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Ile Glu Pro Ser Val Arg Ser Cys Phe Gln Phe Ala Asn Asn Lys
3260 3265 3270
Pro Glu Ile Glu Ala Ala Leu Phe Leu Asp Trp Met Arg Leu Glu
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Pro Gln Ser Met Val Trp Leu Pro Val Leu His Arg Val Ala Ala
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Ala Glu Thr Ala Lys His Gln Ala Lys Cys Asn Ile Cys Lys Glu
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Tyr Asp Ile Cys Gln Ser Cys Phe Phe Ser Gly Arg Val Ala Lys
3335 3340 3345
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3350 3355 3360
Thr Ser Gly Glu Asp Val Arg Asp Phe Ala Lys Val Leu Lys Asn
3365 3370 3375
Lys Phe Arg Thr Lys Arg Tyr Phe Ala Lys His Pro Arg Met Gly
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Tyr Leu Pro Val Gln Thr Val Leu Glu Gly Asp Asn Met Glu Thr
3395 3400 3405
Pro Val Thr Leu Ile Asn Phe Trp Pro Val Asp Ser Ala Pro Ala
3410 3415 3420
Ser Ser Pro Gln Leu Ser His Asp Asp Thr His Ser Arg Ile Glu
3425 3430 3435
His Tyr Ala Ser Arg Leu Ala Glu Met Glu Asn Ser Asn Gly Ser
3440 3445 3450
Tyr Leu Asn Asp Ser Ile Ser Pro Asn Glu Ser Ile Asp Asp Glu
3455 3460 3465
His Leu Leu Ile Gln His Tyr Cys Gln Ser Leu Asn Gln Asp Ser
3470 3475 3480
Pro Leu Ser Gln Pro Arg Ser Pro Ala Gln Ile Leu Ile Ser Leu
3485 3490 3495
Glu Ser Glu Glu Arg Gly Glu Leu Glu Arg Ile Leu Ala Asp Leu
3500 3505 3510
Glu Glu Glu Asn Arg Asn Leu Gln Ala Glu Tyr Asp Arg Leu Lys
3515 3520 3525
Gln Gln His Glu His Lys Gly Leu Ser Pro Leu Pro Ser Pro Pro
3530 3535 3540
Glu Met Met Pro Thr Ser Pro Gln Ser Pro Arg Asp Ala Glu Leu
3545 3550 3555
Ile Ala Glu Ala Lys Leu Leu Arg Gln His Lys Gly Arg Leu Glu
3560 3565 3570
Ala Arg Met Gln Ile Leu Glu Asp His Asn Lys Gln Leu Glu Ser
3575 3580 3585
Gln Leu His Arg Leu Arg Gln Leu Leu Glu Gln Pro Gln Ala Glu
3590 3595 3600
Ala Lys Val Asn Gly Thr Thr Val Ser Ser Pro Ser Thr Ser Leu
3605 3610 3615
Gln Arg Ser Asp Ser Ser Gln Pro Met Leu Leu Arg Val Val Gly
3620 3625 3630
Ser Gln Thr Ser Asp Ser Met Gly Glu Glu Asp Leu Leu Ser Pro
3635 3640 3645
Pro Gln Asp Thr Ser Thr Gly Leu Glu Glu Val Met Glu Gln Leu
3650 3655 3660
Asn Asn Ser Phe Pro Ser Ser Arg Gly Arg Asn Thr Pro Gly Lys
3665 3670 3675
Pro Met Arg Glu Asp Thr Met
3680 3685
<210> 26
<211> 3978
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 非密码子优化的Dys3978基因
<400> 26
atgctttggt gggaagaagt agaggactgt tatgaaagag aagatgttca aaagaaaaca 60
ttcacaaaat gggtaaatgc acaattttct aagtttggga agcagcatat tgagaacctc 120
ttcagtgacc tacaggatgg gaggcgcctc ctagacctcc tcgaaggcct gacagggcaa 180
aaactgccaa aagaaaaagg atccacaaga gttcatgccc tgaacaatgt caacaaggca 240
ctgcgggttt tgcagaacaa taatgttgat ttagtgaata ttggaagtac tgacatcgta 300
gatggaaatc ataaactgac tcttggtttg atttggaata taatcctcca ctggcaggtc 360
aaaaatgtaa tgaaaaatat catggctgga ttgcaacaaa ccaacagtga aaagattctc 420
ctgagctggg tccgacaatc aactcgtaat tatccacagg ttaatgtaat caacttcacc 480
accagctggt ctgatggcct ggctttgaat gctctcatcc atagtcatag gccagaccta 540
tttgactgga atagtgtggt ttgccagcag tcagccacac aacgactgga acatgcattc 600
aacatcgcca gatatcaatt aggcatagag aaactactcg atcctgaaga tgttgatacc 660
acctatccag ataagaagtc catcttaatg tacatcacat cactcttcca agttttgcct 720
caacaagtga gcattgaagc catccaggaa gtggaaatgt tgccaaggcc acctaaagtg 780
actaaagaag aacattttca gttacatcat caaatgcact attctcaaca gatcacggtc 840
agtctagcac agggatatga gagaacttct tcccctaagc ctcgattcaa gagctatgcc 900
tacacacagg ctgcttatgt caccacctct gaccctacac ggagcccatt tccttcacag 960
catttggaag ctcctgaaga caagtcattt ggcagttcat tgatggagag tgaagtaaac 1020
ctggaccgtt atcaaacagc tttagaagaa gtattatcgt ggcttctttc tgctgaggac 1080
acattgcaag cacaaggaga gatttctaat gatgtggaag tggtgaaaga ccagtttcat 1140
actcatgagg ggtacatgat ggatttgaca gcccatcagg gccgggttgg taatattcta 1200
caattgggaa gtaagctgat tggaacagga aaattatcag aagatgaaga aactgaagta 1260
caagagcaga tgaatctcct aaattcaaga tgggaatgcc tcagggtagc tagcatggaa 1320
aaacaaagca atttacatag agttttaatg gatctccaga atcagaaact gaaagagttg 1380
aatgactggc taacaaaaac agaagaaaga acaaggaaaa tggaggaaga gcctcttgga 1440
cctgatcttg aagacctaaa acgccaagta caacaacata aggtgcttca agaagatcta 1500
gaacaagaac aagtcagggt caattctctc actcacatgg tggtggtagt tgatgaatct 1560
agtggagatc acgcaactgc tgctttggaa gaacaactta aggtattggg agatcgatgg 1620
gcaaacatct gtagatggac agaagaccgc tgggttcttt tacaagacca gcctgaccta 1680
gctcctggac tgaccactat tggagcctct cctactcaga ctgttactct ggtgacacaa 1740
cctgtggtta ctaaggaaac tgccatctcc aaactagaaa tgccatcttc cttgatgttg 1800
gaggtaccta ctcatagatt actgcaacag ttccccctgg acctggaaaa gtttcttgcc 1860
tggcttacag aagctgaaac aactgccaat gtcctacagg atgctacccg taaggaaagg 1920
ctcctagaag actccaaggg agtaaaagag ctgatgaaac aatggcaaga cctccaaggt 1980
gaaattgaag ctcacacaga tgtttatcac aacctggatg aaaacagcca aaaaatcctg 2040
agatccctgg aaggttccga tgatgcagtc ctgttacaaa gacgtttgga taacatgaac 2100
ttcaagtgga gtgaacttcg gaaaaagtct ctcaacatta ggtcccattt ggaagccagt 2160
tctgaccagt ggaagcgtct gcacctttct ctgcaggaac ttctggtgtg gctacagctg 2220
aaagatgatg aattaagccg gcaggcacct attggaggcg actttccagc agttcagaag 2280
cagaacgatg tacatagggc cttcaagagg gaattgaaaa ctaaagaacc tgtaatcatg 2340
agtactcttg agactgtacg aatatttctg acagagcagc ctttggaagg actagagaaa 2400
ctctaccagg agcccagaga gctgcctcct gaggagagag cccagaatgt cactcggctt 2460
ctacgaaagc aggctgagga ggtcaatact gagtgggaaa aattgaacct gcactccgct 2520
gactggcaga gaaaaataga tgagaccctt gaaagactcc aggaacttca agaggccacg 2580
gatgagctgg acctcaagct gcgccaagct gaggtgatca agggatcctg gcagcccgtg 2640
ggcgatctcc tcattgactc tctccaagat cacctcgaga aagtcaaggc acttcgagga 2700
gaaattgcgc ctctgaaaga gaacgtgagc cacgtcaatg accttgctcg ccagcttacc 2760
actttgggca ttcagctctc accgtataac ctcagcactc tggaagacct gaacaccaga 2820
tggaagcttc tgcaggtggc cgtcgaggac cgagtcaggc agctgcatga agcccacagg 2880
gactttggtc cagcatctca gcactttctt tccacgtctg tccagggtcc ctgggagaga 2940
gccatctcgc caaacaaagt gccctactat atcaaccacg agactcaaac aacttgctgg 3000
gaccatccca aaatgacaga gctctaccag tctttagctg acctgaataa tgtcagattc 3060
tcagcttata ggactgccat gaaactccga agactgcaga aggccctttg cttggatctc 3120
ttgagcctgt cagctgcatg tgatgccttg gaccagcaca acctcaagca aaatgaccag 3180
cccatggata tcctgcagat tattaattgt ttgaccacta tttatgaccg cctggagcaa 3240
gagcacaaca atttggtcaa cgtccctctc tgcgtggata tgtgtctgaa ctggctgctg 3300
aatgtttatg atacgggacg aacagggagg atccgtgtcc tgtcttttaa aactggcatc 3360
atttccctgt gtaaagcaca tttggaagac aagtacagat accttttcaa gcaagtggca 3420
agttcaacag gattttgtga ccagcgcagg ctgggcctcc ttctgcatga ttctatccaa 3480
attccaagac agttgggtga agttgcatcc tttgggggca gtaacattga gccaagtgtc 3540
cggagctgct tccaatttgc taataataag ccagagatcg aagcggccct cttcctagac 3600
tggatgagac tggaacccca gtccatggtg tggctgcccg tcctgcacag agtggctgct 3660
gcagaaactg ccaagcatca ggccaaatgt aacatctgca aagagtgtcc aatcattgga 3720
ttcaggtaca ggagtctaaa gcactttaat tatgacatct gccaaagctg ctttttttct 3780
ggtcgagttg caaaaggcca taaaatgcac tatcccatgg tggaatattg cactccgact 3840
acatcaggag aagatgttcg agactttgcc aaggtactaa aaaacaaatt tcgaaccaaa 3900
aggtattttg cgaagcatcc ccgaatgggc tacctgccag tgcagactgt cttagagggg 3960
gacaacatgg aaacttag 3978
<210> 27
<211> 1329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Δ3990蛋白质
<400> 27
Met Val Trp Trp Glu Glu Val Glu Asp Cys Tyr Glu Arg Glu Asp Val
1 5 10 15
Gln Lys Lys Thr Phe Thr Lys Trp Val Asn Ala Gln Phe Ser Lys Phe
20 25 30
Gly Lys Gln His Ile Glu Asn Leu Phe Ser Asp Leu Gln Asp Gly Arg
35 40 45
Arg Leu Leu Asp Leu Leu Glu Gly Leu Thr Gly Gln Lys Leu Pro Lys
50 55 60
Glu Lys Gly Ser Thr Arg Val His Ala Leu Asn Asn Val Asn Lys Ala
65 70 75 80
Leu Arg Val Leu Gln Asn Asn Asn Val Asp Leu Val Asn Ile Gly Ser
85 90 95
Thr Asp Ile Val Asp Gly Asn His Lys Leu Thr Leu Gly Leu Ile Trp
100 105 110
Asn Ile Ile Leu His Trp Gln Val Lys Asn Val Met Lys Asn Ile Met
115 120 125
Ala Gly Leu Gln Gln Thr Asn Ser Glu Lys Ile Leu Leu Ser Trp Val
130 135 140
Arg Gln Ser Thr Arg Asn Tyr Pro Gln Val Asn Val Ile Asn Phe Thr
145 150 155 160
Thr Ser Trp Ser Asp Gly Leu Ala Leu Asn Ala Leu Ile His Ser His
165 170 175
Arg Pro Asp Leu Phe Asp Trp Asn Ser Val Val Cys Gln Gln Ser Ala
180 185 190
Thr Gln Arg Leu Glu His Ala Phe Asn Ile Ala Arg Tyr Gln Leu Gly
195 200 205
Ile Glu Lys Leu Leu Asp Pro Glu Asp Val Asp Thr Thr Tyr Pro Asp
210 215 220
Lys Lys Ser Ile Leu Met Tyr Ile Thr Ser Leu Phe Gln Val Leu Pro
225 230 235 240
Gln Gln Val Ser Ile Glu Ala Ile Gln Glu Val Glu Met Leu Pro Arg
245 250 255
Pro Pro Lys Val Thr Lys Glu Glu His Phe Gln Leu His His Gln Met
260 265 270
His Tyr Ser Gln Gln Ile Thr Val Ser Leu Ala Gln Gly Tyr Glu Arg
275 280 285
Thr Ser Ser Pro Lys Pro Arg Phe Lys Ser Tyr Ala Tyr Thr Gln Ala
290 295 300
Ala Tyr Val Thr Thr Ser Asp Pro Thr Arg Ser Pro Phe Pro Ser Gln
305 310 315 320
His Leu Glu Ala Pro Glu Asp Lys Ser Phe Gly Ser Ser Leu Met Glu
325 330 335
Ser Glu Val Asn Leu Asp Arg Tyr Gln Thr Ala Leu Glu Glu Val Leu
340 345 350
Ser Trp Leu Leu Ser Ala Glu Asp Thr Leu Gln Ala Gln Gly Glu Ile
355 360 365
Ser Asn Asp Val Glu Val Val Lys Asp Gln Phe His Thr His Glu Gly
370 375 380
Tyr Met Met Asp Leu Thr Ala His Gln Gly Arg Val Gly Asn Ile Leu
385 390 395 400
Gln Leu Gly Ser Lys Leu Ile Gly Thr Gly Lys Leu Ser Glu Asp Glu
405 410 415
Glu Thr Glu Val Gln Glu Gln Met Asn Leu Leu Asn Ser Arg Trp Glu
420 425 430
Cys Leu Arg Val Ala Ser Met Glu Lys Gln Ser Asn Leu His Arg Val
435 440 445
Leu Met Asp Leu Gln Asn Gln Lys Leu Lys Glu Leu Asn Asp Trp Leu
450 455 460
Thr Lys Thr Glu Glu Arg Thr Arg Lys Met Glu Glu Glu Pro Leu Gly
465 470 475 480
Pro Asp Leu Glu Asp Leu Lys Arg Gln Val Gln Gln His Lys Val Leu
485 490 495
Gln Glu Asp Leu Glu Gln Glu Gln Val Arg Val Asn Ser Leu Thr His
500 505 510
Met Val Val Val Val Asp Glu Ser Ser Gly Asp His Ala Thr Ala Ala
515 520 525
Leu Glu Glu Gln Leu Lys Val Leu Gly Asp Arg Trp Ala Asn Ile Cys
530 535 540
Arg Trp Thr Glu Asp Arg Trp Val Leu Leu Gln Asp Gln Pro Asp Leu
545 550 555 560
Ala Pro Gly Leu Thr Thr Ile Gly Ala Ser Pro Thr Gln Thr Val Thr
565 570 575
Leu Val Thr Gln Pro Val Val Thr Lys Glu Thr Ala Ile Ser Lys Leu
580 585 590
Glu Met Pro Ser Ser Leu Met Leu Glu Val Pro Thr His Arg Leu Leu
595 600 605
Gln Gln Phe Pro Leu Asp Leu Glu Lys Phe Leu Ala Trp Leu Thr Glu
610 615 620
Ala Glu Thr Thr Ala Asn Val Leu Gln Asp Ala Thr Arg Lys Glu Arg
625 630 635 640
Leu Leu Glu Asp Ser Lys Gly Val Lys Glu Leu Met Lys Gln Trp Gln
645 650 655
Asp Leu Gln Gly Glu Ile Glu Ala His Thr Asp Val Tyr His Asn Leu
660 665 670
Asp Glu Asn Ser Gln Lys Ile Leu Arg Ser Leu Glu Gly Ser Asp Asp
675 680 685
Ala Val Leu Leu Gln Arg Arg Leu Asp Asn Met Asn Phe Lys Trp Ser
690 695 700
Glu Leu Arg Lys Lys Ser Leu Asn Ile Arg Ser His Leu Glu Ala Ser
705 710 715 720
Ser Asp Gln Trp Lys Arg Leu His Leu Ser Leu Gln Glu Leu Leu Val
725 730 735
Trp Leu Gln Leu Lys Asp Asp Glu Leu Ser Arg Gln Ala Pro Ile Gly
740 745 750
Gly Asp Phe Pro Ala Val Gln Lys Gln Asn Asp Val His Arg Ala Phe
755 760 765
Lys Arg Glu Leu Lys Thr Lys Glu Pro Val Ile Met Ser Thr Leu Glu
770 775 780
Thr Val Arg Ile Phe Leu Thr Glu Gln Pro Leu Glu Gly Leu Glu Lys
785 790 795 800
Leu Tyr Gln Glu Pro Arg Glu Leu Pro Pro Glu Glu Arg Ala Gln Asn
805 810 815
Val Thr Arg Leu Leu Arg Lys Gln Ala Glu Glu Val Asn Thr Glu Trp
820 825 830
Glu Lys Leu Asn Leu His Ser Ala Asp Trp Gln Arg Lys Ile Asp Glu
835 840 845
Thr Leu Glu Arg Leu Gln Glu Leu Gln Glu Ala Thr Asp Glu Leu Asp
850 855 860
Leu Lys Leu Arg Gln Ala Glu Val Ile Lys Gly Ser Trp Gln Pro Val
865 870 875 880
Gly Asp Leu Leu Ile Asp Ser Leu Gln Asp His Leu Glu Lys Val Lys
885 890 895
Ala Leu Arg Gly Glu Ile Ala Pro Leu Lys Glu Asn Val Ser His Val
900 905 910
Asn Asp Leu Ala Arg Gln Leu Thr Thr Leu Gly Ile Gln Leu Ser Pro
915 920 925
Tyr Asn Leu Ser Thr Leu Glu Asp Leu Asn Thr Arg Trp Lys Leu Leu
930 935 940
Gln Val Ala Val Glu Asp Arg Val Arg Gln Leu His Glu Ala His Arg
945 950 955 960
Asp Phe Gly Pro Ala Ser Gln His Phe Leu Ser Thr Ser Val Gln Gly
965 970 975
Pro Trp Glu Arg Ala Ile Ser Pro Asn Lys Val Pro Tyr Tyr Ile Asn
980 985 990
His Glu Thr Gln Thr Thr Cys Trp Asp His Pro Lys Met Thr Glu Leu
995 1000 1005
Tyr Gln Ser Leu Ala Asp Leu Asn Asn Val Arg Phe Ser Ala Tyr
1010 1015 1020
Arg Thr Ala Met Lys Leu Arg Arg Leu Gln Lys Ala Leu Cys Leu
1025 1030 1035
Asp Leu Leu Ser Leu Ser Ala Ala Cys Asp Ala Leu Asp Gln His
1040 1045 1050
Asn Leu Lys Gln Asn Asp Gln Pro Met Asp Ile Leu Gln Ile Ile
1055 1060 1065
Asn Cys Leu Thr Thr Ile Tyr Asp Arg Leu Glu Gln Glu His Asn
1070 1075 1080
Asn Leu Val Asn Val Pro Leu Cys Val Asp Met Cys Leu Asn Trp
1085 1090 1095
Leu Leu Asn Val Tyr Asp Thr Gly Arg Thr Gly Arg Ile Arg Val
1100 1105 1110
Leu Ser Phe Lys Thr Gly Ile Ile Ser Leu Cys Lys Ala His Leu
1115 1120 1125
Glu Asp Lys Tyr Arg Tyr Leu Phe Lys Gln Val Ala Ser Ser Thr
1130 1135 1140
Gly Phe Cys Asp Gln Arg Arg Leu Gly Leu Leu Leu His Asp Ser
1145 1150 1155
Ile Gln Ile Pro Arg Gln Leu Gly Glu Val Ala Ser Phe Gly Gly
1160 1165 1170
Ser Asn Ile Glu Pro Ser Val Arg Ser Cys Phe Gln Phe Ala Asn
1175 1180 1185
Asn Lys Pro Glu Ile Glu Ala Ala Leu Phe Leu Asp Trp Met Arg
1190 1195 1200
Leu Glu Pro Gln Ser Met Val Trp Leu Pro Val Leu His Arg Val
1205 1210 1215
Ala Ala Ala Glu Thr Ala Lys His Gln Ala Lys Cys Asn Ile Cys
1220 1225 1230
Lys Glu Cys Pro Ile Ile Gly Phe Arg Tyr Arg Ser Leu Lys His
1235 1240 1245
Phe Asn Tyr Asp Ile Cys Gln Ser Cys Phe Phe Ser Gly Arg Val
1250 1255 1260
Ala Lys Gly His Lys Met His Tyr Pro Met Val Glu Tyr Cys Thr
1265 1270 1275
Pro Thr Thr Ser Gly Glu Asp Val Arg Asp Phe Ala Lys Val Leu
1280 1285 1290
Lys Asn Lys Phe Arg Thr Lys Arg Tyr Phe Ala Lys His Pro Arg
1295 1300 1305
Met Gly Tyr Leu Pro Val Gln Thr Val Leu Glu Gly Asp Asn Met
1310 1315 1320
Glu Thr Pro Asp Thr Met
1325
<210> 28
<211> 3990
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Δ3990基因
<400> 28
atggtttggt gggaagaagt agaggactgt tatgaaagag aagatgttca aaagaaaaca 60
ttcacaaaat gggtaaatgc acaattttct aagtttggga agcagcatat tgagaacctc 120
ttcagtgacc tacaggatgg gaggcgcctc ctagacctcc tcgaaggcct gacagggcaa 180
aaactgccaa aagaaaaagg atccacaaga gttcatgccc tgaacaatgt caacaaggca 240
ctgcgggttt tgcagaacaa taatgttgat ttagtgaata ttggaagtac tgacatcgta 300
gatggaaatc ataaactgac tcttggtttg atttggaata taatcctcca ctggcaggtc 360
aaaaatgtaa tgaaaaatat catggctgga ttgcaacaaa ccaacagtga aaagattctc 420
ctgagctggg tccgacaatc aactcgtaat tatccacagg ttaatgtaat caacttcacc 480
accagctggt ctgatggcct ggctttgaat gctctcatcc atagtcatag gccagaccta 540
tttgactgga atagtgtggt ttgccagcag tcagccacac aacgactgga acatgcattc 600
aacatcgcca gatatcaatt aggcatagag aaactactcg atcctgaaga tgttgatacc 660
acctatccag ataagaagtc catcttaatg tacatcacat cactcttcca agttttgcct 720
caacaagtga gcattgaagc catccaggaa gtggaaatgt tgccaaggcc acctaaagtg 780
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agtctagcac agggatatga gagaacttct tcccctaagc ctcgattcaa gagctatgcc 900
tacacacagg ctgcttatgt caccacctct gaccctacac ggagcccatt tccttcacag 960
catttggaag ctcctgaaga caagtcattt ggcagttcat tgatggagag tgaagtaaac 1020
ctggaccgtt atcaaacagc tttagaagaa gtattatcgt ggcttctttc tgctgaggac 1080
acattgcaag cacaaggaga gatttctaat gatgtggaag tggtgaaaga ccagtttcat 1140
actcatgagg ggtacatgat ggatttgaca gcccatcagg gccgggttgg taatattcta 1200
caattgggaa gtaagctgat tggaacagga aaattatcag aagatgaaga aactgaagta 1260
caagagcaga tgaatctcct aaattcaaga tgggaatgcc tcagggtagc tagcatggaa 1320
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cctgatcttg aagacctaaa acgccaagta caacaacata aggtgcttca agaagatcta 1500
gaacaagaac aagtcagggt caattctctc actcacatgg tggtggtagt tgatgaatct 1560
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gctcctggac tgaccactat tggagcctct cctactcaga ctgttactct ggtgacacaa 1740
cctgtggtta ctaaggaaac tgccatctcc aaactagaaa tgccatcttc cttgatgttg 1800
gaggtaccta ctcatagatt actgcaacag ttccccctgg acctggaaaa gtttcttgcc 1860
tggcttacag aagctgaaac aactgccaat gtcctacagg atgctacccg taaggaaagg 1920
ctcctagaag actccaaggg agtaaaagag ctgatgaaac aatggcaaga cctccaaggt 1980
gaaattgaag ctcacacaga tgtttatcac aacctggatg aaaacagcca aaaaatcctg 2040
agatccctgg aaggttccga tgatgcagtc ctgttacaaa gacgtttgga taacatgaac 2100
ttcaagtgga gtgaacttcg gaaaaagtct ctcaacatta ggtcccattt ggaagccagt 2160
tctgaccagt ggaagcgtct gcacctttct ctgcaggaac ttctggtgtg gctacagctg 2220
aaagatgatg aattaagccg gcaggcacct attggaggcg actttccagc agttcagaag 2280
cagaacgatg tacatagggc cttcaagagg gaattgaaaa ctaaagaacc tgtaatcatg 2340
agtactcttg agactgtacg aatatttctg acagagcagc ctttggaagg actagagaaa 2400
ctctaccagg agcccagaga gctgcctcct gaggagagag cccagaatgt cactcggctt 2460
ctacgaaagc aggctgagga ggtcaatact gagtgggaaa aattgaacct gcactccgct 2520
gactggcaga gaaaaataga tgagaccctt gaaagactcc aggaacttca agaggccacg 2580
gatgagctgg acctcaagct gcgccaagct gaggtgatca agggatcctg gcagcccgtg 2640
ggcgatctcc tcattgactc tctccaagat cacctcgaga aagtcaaggc acttcgagga 2700
gaaattgcgc ctctgaaaga gaacgtgagc cacgtcaatg accttgctcg ccagcttacc 2760
actttgggca ttcagctctc accgtataac ctcagcactc tggaagacct gaacaccaga 2820
tggaagcttc tgcaggtggc cgtcgaggac cgagtcaggc agctgcatga agcccacagg 2880
gactttggtc cagcatctca gcactttctt tccacgtctg tccagggtcc ctgggagaga 2940
gccatctcgc caaacaaagt gccctactat atcaaccacg agactcaaac aacttgctgg 3000
gaccatccca aaatgacaga gctctaccag tctttagctg acctgaataa tgtcagattc 3060
tcagcttata ggactgccat gaaactccga agactgcaga aggccctttg cttggatctc 3120
ttgagcctgt cagctgcatg tgatgccttg gaccagcaca acctcaagca aaatgaccag 3180
cccatggata tcctgcagat tattaattgt ttgaccacta tttatgaccg cctggagcaa 3240
gagcacaaca atttggtcaa cgtccctctc tgcgtggata tgtgtctgaa ctggctgctg 3300
aatgtttatg atacgggacg aacagggagg atccgtgtcc tgtcttttaa aactggcatc 3360
atttccctgt gtaaagcaca tttggaagac aagtacagat accttttcaa gcaagtggca 3420
agttcaacag gattttgtga ccagcgcagg ctgggcctcc ttctgcatga ttctatccaa 3480
attccaagac agttgggtga agttgcatcc tttgggggca gtaacattga gccaagtgtc 3540
cggagctgct tccaatttgc taataataag ccagagatcg aagcggccct cttcctagac 3600
tggatgagac tggaacccca gtccatggtg tggctgcccg tcctgcacag agtggctgct 3660
gcagaaactg ccaagcatca ggccaaatgt aacatctgca aagagtgtcc aatcattgga 3720
ttcaggtaca ggagtctaaa gcactttaat tatgacatct gccaaagctg ctttttttct 3780
ggtcgagttg caaaaggcca taaaatgcac tatcccatgg tggaatattg cactccgact 3840
acatcaggag aagatgttcg agactttgcc aaggtactaa aaaacaaatt tcgaaccaaa 3900
aggtattttg cgaagcatcc ccgaatgggc tacctgccag tgcagactgt cttagagggg 3960
gacaacatgg aaactcccga cacaatgtag 3990

Claims (93)

1.一种编码小型抗肌萎缩蛋白质的多核苷酸，所述多核苷酸包含：
(a)SEQ ID NO:1的核苷酸序列或与其至少约90％同一的核苷酸序列；
(b)SEQ ID NO:2的核苷酸序列或与其至少约90％同一的核苷酸序列；或者
(c)SEQ ID NO:3的核苷酸序列或与其至少约90％同一的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述小型抗肌萎缩蛋白质基本上由以下各项组成：N末端、肌动蛋白结合结构域(ABD)、铰链H1、棒R1和R2、铰链H3、棒R22、R23和R24、铰链H4、CR结构域以及野生型人肌肉抗肌萎缩蛋白质的CT结构域的一部分。
3.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述小型抗肌萎缩蛋白质基本上由以下各项组成：N末端、ABD、铰链H1、棒R1和R2、棒R22、R23和R24、铰链H4、CR结构域以及野生型人肌肉抗肌萎缩蛋白质的CT结构域的一部分。
4.根据权利要求1-3中的任一项所述的多核苷酸，其中所述小型抗肌萎缩蛋白质不包含野生型人肌肉抗肌萎缩蛋白质的C末端的最后三个氨基酸残基。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码包含SEQ IDNO:7的氨基酸序列或与其至少约90％同一的氨基酸序列的小型抗肌萎缩蛋白质。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码包含SEQ IDNO:8的氨基酸序列或与其至少约90％同一的氨基酸序列的小型抗肌萎缩蛋白质。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的多核苷酸，其与启动子可操作地连接。
8.根据权利要求7所述的多核苷酸，其中所述启动子是肌肉特异性启动子。
9.根据权利要求7或8所述的多核苷酸，其中所述启动子是肌酸激酶启动子。
10.根据权利要求9所述的多核苷酸，其中所述启动子包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
11.根据权利要求9所述的多核苷酸，其中所述启动子包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的多核苷酸，其与多腺苷酸化元件可操作地连接。
13.根据权利要求12所述的多核苷酸，其中所述多腺苷酸化元件包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是包含启动子和多腺苷酸化元件的基因表达盒的一部分。
15.根据权利要求14所述的多核苷酸，其中所述基因表达盒包含SEQ ID NO:9到SEQ IDNO:12中任一项的核苷酸序列，或与其至少约90％同一的核苷酸序列。
16.一种包含根据权利要求1-15中任一项所述的多核苷酸的载体。
17.根据权利要求16所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
18.根据权利要求17所述的载体，其中所述载体是腺相关病毒(AAV)载体。
19.根据权利要求18所述的载体，其中所述AAV载体是AAV9载体。
20.一种转化细胞，其包含根据权利要求1-15中任一项所述的多核苷酸和/或根据权利要求16-19中任一项所述的载体。
21.一种转基因动物，其包含根据权利要求1-15中任一项所述的多核苷酸、根据权利要求16-19中任一项所述的载体，和/或根据权利要求20所述的转化细胞。
22.一种小型抗肌萎缩蛋白质，其基本上由N末端、ABD、铰链H1、棒R1和R2、铰链H3、棒R22、R23和R24、铰链H4、CR结构域以及野生型人肌肉抗肌萎缩蛋白质的CT结构域的一部分组成，其中所述小型抗肌萎缩蛋白质不包含野生型人肌肉抗肌萎缩蛋白质的C末端的最后三个氨基酸残基。
23.根据权利要求22所述的小型抗肌萎缩蛋白质，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或与其至少约90％同一的氨基酸序列。
24.一种小型抗肌萎缩蛋白质，其基本上由N末端、ABD、铰链H1、棒R1、R2、R22、R23和R24、铰链H4、CR结构域以及野生型人肌肉抗肌萎缩蛋白质的CT结构域的一部分组成。
25.根据权利要求24所述的小型抗肌萎缩蛋白质，其中所述小型抗肌萎缩蛋白质不包含野生型人肌肉抗肌萎缩蛋白质的C-末端的最后三个氨基酸残基。
26.根据权利要求24或25所述的小型抗肌萎缩蛋白质，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或与其至少约90％同一的氨基酸序列。
27.一种在细胞中产生小型抗肌萎缩蛋白质的方法，其包括使所述细胞与根据权利要求1-15中任一项所述的多核苷酸或根据权利要求16-19中任一项所述的载体接触，从而在所述细胞中产生所述小型抗肌萎缩蛋白质。
28.一种在受试者中产生小型抗肌萎缩蛋白质的方法，其包括向所述受试者递送根据权利要求1-15中任一项所述的多核苷酸、根据权利要求16-19中任一项所述的载体和/或根据权利要求20所述的转化细胞，从而在所述受试者中产生所述小型抗肌萎缩蛋白质。
29.一种治疗有需要的受试者的肌肉萎缩症的方法，其包括向所述受试者递送治疗有效量的根据权利要求1-15中任一项所述的多核苷酸、根据权利要求16-19中任一项所述的载体和/或根据权利要求20所述的转化细胞，从而治疗所述受试者的肌肉萎缩症。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述肌肉萎缩症是杜氏肌营养不良症或贝克型肌肉萎缩症。
31.一种重组AAV粒子，其包含AAV衣壳和用于表达人小型抗肌萎缩蛋白质的载体基因组。
32.根据权利要求31所述的重组AAV粒子，其中所述AAV衣壳来自AAV9。
33.根据权利要求31-32中任一项所述的重组AAV粒子，其中所述载体基因组包含编码所述人小型抗肌萎缩蛋白质的人密码子优化的核酸序列。
34.根据权利要求31-33中任一项所述的重组AAV粒子，其中所述人小型抗肌萎缩蛋白质以从氨基末端到羧基末端的顺序包含来自全长人抗肌萎缩蛋白质的以下亚结构域：N末端肌动蛋白结合结构域、H1、R1、R2、H3、R22、R23、R24、H4、富含半胱氨酸的结构域和不包含野生型人肌肉抗肌萎缩蛋白中的最后3个氨基酸的羧基末端结构域的一部分。
35.根据权利要求31-34中任一项所述的重组AAV粒子，其中所述N末端肌动蛋白结合结构域由来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号1-240组成；H1由来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号253-327组成；R1由来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号337-447组成；R2由来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号448-556组成；H3由来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号2424-2470组成；R22由来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号2687-2802组成；R23由来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号2803-2931组成；R24由来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号2932-3040组成；H4由来自SEQ IDNO:25的氨基酸编号3041-3112组成；所述CR结构域由来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号3113-3299组成；并且所述CT结构域的所述部分由来自SEQ ID NO:25的氨基酸编号3300-3408组成。
36.根据权利要求31-35中任一项所述的重组AAV粒子，其中所述人小型抗肌萎缩蛋白质包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
37.根据权利要求33-36中任一项所述的重组AAV粒子，其中编码所述人小型抗肌萎缩蛋白质的所述人密码子优化的核酸包含SEQ ID NO:1的核酸序列。
38.根据权利要求31-37中任一项所述的重组AAV粒子，其中所述载体基因组进一步包含在编码所述人小型抗肌萎缩蛋白质的所述密码子优化的核酸的侧翼的5′AAV反向末端重复序列(ITR)和3′AAV ITR。
39.根据权利要求38所述的重组AAV粒子，其中所述AAV ITR是AAV2 ITR。
40.根据权利要求33-39中任一项所述的重组AAV粒子，其中所述载体基因组进一步包含与所述人密码子优化的核酸序列可操作地连接的肌肉特异性转录调控元件。
41.根据权利要求40所述的重组AAV粒子，其中所述肌肉特异性转录调控元件位于5′AAV2 ITR与编码所述人小型抗肌萎缩蛋白质的所述人密码子优化的核酸之间。
42.根据权利要求40-41中任一项所述的重组AAV粒子，其中所述肌肉特异性转录调控元件来源于人或小鼠的肌酸激酶基因。
43.根据权利要求40-42中任一项所述的重组AAV粒子，其中所述肌肉特异性转录调控元件包含增强子和启动子。
44.根据权利要求40-43中任一项所述的重组AAV粒子，其中所述肌肉特异性转录调控元件包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列。
45.根据权利要求38-44中任一项所述的重组AAV粒子，其中所述载体基因组进一步包含在编码所述人小型抗肌萎缩蛋白质的所述密码子优化的核酸的5′末端与所述3′ITR之间的转录终止序列。
46.根据权利要求45所述的重组AAV粒子，其中所述转录终止序列包含多腺苷酸化信号序列。
47.根据权利要求31-46中任一项所述的重组AAV粒子，其中所述载体基因组以5'到3'顺序包含：第一AAV2 ITR、与编码人小型抗肌萎缩蛋白质的人密码子优化的核酸可操作地连接的肌肉特异性转录调控元件、转录终止序列和第二AAV2 ITR。
48.根据权利要求47所述的重组AAV粒子，其中所述肌肉特异性转录调控元件包含SEQID NO:16的核苷酸序列。
49.根据权利要求47-48中任一项所述的重组AAV粒子，其中所述人密码子优化的核酸序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列或与其至少95％同一的序列。
50.根据权利要求47-49中任一项所述的重组AAV粒子，其中所述转录终止序列包含SEQID NO:17的核苷酸序列。
51.根据权利要求31-50中任一项所述的重组AAV粒子，其中所述载体基因组包含SEQID NO:18的核苷酸序列或其反向互补序列。
52.根据权利要求31-50中任一项所述的重组AAV粒子，其中所述载体基因组基本上由SEQ ID NO:18的核苷酸序列或其反向互补序列组成。
53.根据权利要求31-50中任一项所述的重组AAV粒子，其中所述载体基因组由SEQ IDNO:18的核苷酸序列或其反向互补序列组成。
54.一种重组AAV粒子，其包含AAV9衣壳和载体基因组，所述载体基因组包含SEQ IDNO:18的核苷酸序列或其反向互补序列。
55.一种重组AAV粒子，其包含AAV9衣壳和载体基因组，所述载体基因组基本上由SEQID NO:18的核苷酸序列或其反向互补序列组成。
56.一种重组AAV粒子，其包含AAV9衣壳和载体基因组，所述载体基因组由SEQ ID NO:18的核苷酸序列或其反向互补序列组成。
57.一种药物组合物，其包含根据权利要求31-56中任一项所述的重组AAV粒子和药学上可接受的载剂。
58.一种治疗抗肌萎缩蛋白病的方法，其包括向需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求57所述的组合物。
59.根据权利要求31-56中任一项所述的重组AAV(rAAV)粒子或根据权利要求57所述的组合物在制备用于治疗患有抗肌萎缩蛋白病的受试者的药物中的用途。
60.在患有抗肌萎缩蛋白病的受试者的治疗中用于使用的根据权利要求31-56中任一项所述的rAAV粒子或根据权利要求57所述的组合物。
61.根据权利要求58-60中任一项所述的方法、用途、用于使用的rAAV粒子或用于使用的组合物，其中所述抗肌萎缩蛋白病是杜氏肌营养不良症(DMD)、贝克型肌肉萎缩症(BMD)或DMD相关的扩张型心肌病。
62.根据权利要求58-61中任一项所述的方法、用途、用于使用的rAAV粒子或用于使用的组合物，其中所述受试者是男性或女性人受试者。
63.根据权利要求58-62中任一项所述的方法、用途、用于使用的rAAV粒子或用于使用的组合物，其中所述受试者当首次治疗时是能走动的。
64.根据权利要求58-63中任一项所述的方法、用途、用于使用的rAAV粒子或用于使用的组合物，其中所述受试者当首次治疗时为约4岁、约5岁、约6岁、约7岁、约8岁、约9岁、约10岁、约11岁、约12岁、约13岁、约14岁、约15岁或约16岁。
65.根据权利要求58-64中任一项所述的方法、用途、用于使用的rAAV粒子或用于使用的组合物，其中所述AAV粒子的剂量选自由以下各项组成的组：1×1012vg/kg、2×1012vg/kg、3×1012vg/kg、4×1012vg/kg、5×1012vg/kg、6×1012vg/kg、7×1012vg/kg、8×1012vg/kg、9×1012vg/kg、1×1013vg/kg、2×1013vg/kg、3×1013vg/kg、4×1013vg/kg、5×1013vg/kg、6×1013vg/kg、7×1013vg/kg、8×1013vg/kg、9×1013vg/kg、1×1014vg/kg、1.5×1014vg/kg、2×1014vg/kg、2.5×1014vg/kg、3×1014vg/kg、3.5×1014vg/kg、4×1014vg/kg、4.5×1014vg/kg、5×1014vg/kg、5.5×1014vg/kg、6×1014vg/kg、6.5×1014vg/kg、7×1014vg/kg、7.5×1014vg/kg、8×1014vg/kg、8.5×1014vg/kg和9×1014vg/kg。
66.根据权利要求58-65中任一项所述的方法、用途、用于使用的rAAV粒子或用于使用的组合物，其中所述方法、用途、用于使用的rAAV粒子或用于使用的组合物有效地使所述受试者的血液中的平均ALT、AST或LDH水平降低到为健康对照的血液中ALT、AST或LDH水平的约7倍、约6倍、约5倍、约4倍、约3倍或约2倍以内。
67.根据权利要求58-66中任一项所述的方法、用途、用于使用的rAAV粒子或用于使用的组合物，其中所述方法、用途、用于使用的rAAV粒子或用于使用的组合物有效地使所述受试者的血液中平均总CK水平降低到为健康对照的血液中平均总CK水平的约50倍、约48倍、约46倍、约44倍、约42倍、约40倍、约38倍、约36倍、约34倍、约32倍、约30倍、约28倍、约26倍、约24倍、约22倍、约20倍、约18倍、约16倍、约14倍、约12倍、约10倍、约9倍、约8倍、约7倍、约6倍、约5倍、约4倍、约3倍或约2倍以内。
68.根据权利要求58-65中任一项所述的方法、用途、用于使用的rAAV粒子或用于使用的组合物，其中所述方法、用途、用于使用的rAAV粒子或用于使用的组合物有效地使得所述受试者的平均6分钟步行距离(6MWD)与未治疗对照的平均6MWD相比增加至少5米、至少10米、至少15米、至少20米、至少25米、至少30米、至少35米、至少40米、至少45米、至少50米、至少55米、至少60米、至少65米、至少70米、至少75米、至少80米、至少85米、至少90米、至少95米、或至少100米。
69.根据权利要求68所述的方法，其中在施用所述载体后3个月、6个月、9个月、12个月、15个月、18个月、21个月、24个月、27个月、30个月、33个月或36个月时确定所述受试者的6MWD。
70.根据权利要求58-65中任一项所述的方法、用途、用于使用的rAAV粒子或用于使用的组合物，其中所述方法、用途、用于使用的rAAV粒子或用于使用的组合物有效地使得所述受试者进行4阶梯爬升测试所需的平均时间与未治疗对照的所述平均时间相比缩短至少0.2秒、至少0.4秒、至少0.6秒、至少0.8秒、至少1.0秒、至少1.2秒、至少1.4秒、至少1.6秒、至少1.8秒、至少2.0秒、至少2.2秒、至少2.4秒、至少2.6秒、至少2.8秒、至少3.0秒、至少3.2秒、至少3.4秒、至少3.6秒、至少3.8秒或至少4.0秒。
71.根据权利要求70所述的方法，其中在施用所述载体后3个月、6个月、9个月、12个月、15个月、18个月、21个月、24个月、27个月、30个月、33个月或36个月时确定所述受试者的4阶梯爬升时间。
72.根据权利要求58-65中任一项所述的方法、用途、用于使用的rAAV粒子或用于使用的组合物，其中所述方法、用途、用于使用的rAAV粒子或用于使用的组合物有效地使得已丧失行走能力的受试者的平均比例与已丧失行走能力的未治疗对照的平均比例相比降低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％或至少65％。
73.根据权利要求72所述的方法，其中在施用所述载体后3个月、6个月、9个月、12个月、15个月、18个月、21个月、24个月、27个月、30个月、33个月或36个月时确定受试者的行走能力。
74.根据权利要求58-65中任一项所述的方法、用途、用于使用的rAAV粒子或用于使用的组合物，其中所述方法、用途、用于使用的rAAV粒子或用于使用的组合物有效地使得所述受试者的下肢脂肪分数与未治疗对照的下肢平均脂肪分数相比降低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少75％。
75.根据权利要求74所述的方法，其中在施用所述载体后3个月、6个月、9个月、12个月、15个月、18个月、21个月、24个月、27个月、30个月、33个月或36个月时确定所述受试者的下肢脂肪分数。
76.根据权利要求58-65中任一项所述的方法、用途、用于使用的rAAV粒子或用于使用的组合物，其中所述方法、用途、用于使用的rAAV粒子或用于使用的组合物有效地使得所述受试者的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％的骨骼肌纤维表达所述小型抗肌萎缩蛋白质。
77.根据权利要求76所述的方法，其中在施用所述载体后3个月、6个月、9个月、12个月、15个月、18个月、21个月、24个月、27个月、30个月、33个月或36个月时确定所述受试者的肌纤维中的所述小型抗肌萎缩蛋白质的表达。
78.根据权利要求76-77中任一项所述的方法、用途、用于使用的rAAV粒子或用于使用的组合物，其中所述骨骼肌纤维存在于从所述受试者的二头肌、三角肌或四头肌获得的活组织检查物中。
79.根据权利要求58-78中任一项所述的方法、用途、用于使用的rAAV粒子或用于使用的组合物，其中所述方法、用途、用于使用的rAAV粒子或用于使用的组合物在小于或等于约0％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％或约20％的受试者中引起针对所述小型抗肌萎缩蛋白质的细胞免疫应答或肌肉炎症。
80.根据权利要求79所述的方法，其中在施用所述载体后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月、25个月、26个月、27个月、28个月、29个月、30个月、31个月、32个月、33个月、34个月、35个月或36个月时确定针对所述小型抗肌萎缩蛋白质的细胞免疫应答或肌肉炎症的存在。
81.根据权利要求58-80中任一项所述的方法、用途、用于使用的rAAV粒子或用于使用的组合物，其中所述组合物与有效治疗抗肌萎缩蛋白病的至少第二药剂组合施用。
82.根据权利要求81所述的方法、用途、用于使用的rAAV粒子或用于使用的组合物，其中所述第二药剂选自由以下各项组成的组：引起DMD基因的外显子跳读的反义寡核苷酸、抗肌生成抑制蛋白抗体、促进无义突变的核糖体通读的药剂、抑制提前终止密码子的药剂、合成代谢类固醇和皮质类固醇。
83.一种增加肌肉质量或强度的方法，其包括向需要的受试者施用足以增加所述受试者的肌肉质量或强度的量的根据权利要求57所述的组合物。
84.一种预防肌肉质量或强度损失的方法，其包括向需要的受试者施用足以预防所述受试者的肌肉质量或强度损失的量的根据权利要求57所述的组合物。
85.一种预防抗肌萎缩蛋白病的方法，其包括向需要的受试者施用预防有效量的根据权利要求57所述的组合物。
86.一种制备根据权利要求31-56所述的AAV粒子的方法，其包括：
向生产细胞中导入包含所述AAV载体基因组的多核苷酸、包含AAV rep基因的多核苷酸、包含AAV cap基因的多核苷酸和编码一种或多种病毒辅助基因的多核苷酸，
孵育所述细胞；以及
纯化由此产生的AAV粒子。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述载体基因组由第一质粒包含，并且所述rep基因、cap基因和病毒辅助基因由一种或两种另外的质粒包含。
88.一种制备根据权利要求31-56所述的AAV粒子的方法，其包括：
向生产细胞中导入包含所述AAV载体基因组的多核苷酸、包含AAV rep基因的多核苷酸和包含AAV cap基因的多核苷酸，
孵育所述细胞；以及
纯化由此产生的AAV粒子。
其中所述生产细胞包含并表达内源病毒辅助基因。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述载体基因组由第一质粒包含，并且所述rep基因和cap基因由一种或两种另外的质粒包含。
90.根据权利要求86-89中任一项所述的方法，其中所述导入步骤是通过转染实现的。
91.根据权利要求86-90中任一项所述的方法，其中所述生产细胞是HEK293细胞。
92.根据权利要求86-91中任一项所述的方法，其中所述cap基因是AAV9cap基因。
93.一种通过根据权利要求86-92中任一项所述的方法生产的AAV粒子。
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