TW201812010A - 最佳化之微小肌萎縮蛋白基因和表現卡匣及彼等之用途 - Google Patents

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Abstract

本發明關於編碼微小肌萎縮蛋白之多核苷酸、包含彼等之病毒載體、及使用彼等遞送微小肌萎縮蛋白至細胞或個體之方法。

Description

最佳化之微小肌萎縮蛋白基因和表現卡匣及彼等之用途 聯邦贊助研究或發展聲明
本發明獲得國家衛生研究院計畫編號AR050595、AR056394及AR056953之政府支持。美國政府對本發明享有特定權利。
本發明關於編碼微小肌萎縮蛋白之多核苷酸、包含彼等之病毒載體、及使用彼等遞送微小肌萎縮蛋白至細胞或個體之方法。
杜興(Duchenne)氏肌肉失養症(DMD)是一種嚴重、x性聯的、進行性神經肌肉疾病，每3,600至9200名活產男嬰中大約發生一例。此病症係因肌萎縮蛋白(dystrophin)基因讀框移位，阻止肌萎縮蛋白表現所造成。由於缺乏肌萎縮蛋白，骨骼肌及最終心臟及呼吸肌肉(例 如，肋間肌及橫膈)退化，導致早亡。進行性虛弱及肌肉萎縮始於兒童期，從下肢及骨盆腔開始，然後進展至上肢。其他症狀包括喪失某些反射、步伐搖晃、頻繁跌倒、從坐姿或臥姿起身困難、爬樓梯困難、整體姿勢改變、呼吸障礙及心肌病。許多病童無法快速奔跑或跳躍。萎縮的肌肉特別是腓肌(及較少見的臀部、肩部及手臂肌肉)可因脂肪及結締組織累積擴大，造成這些肌肉看起來比實際上更大、更健康(稱為假肥大)。骨骼變薄及脊柱側彎很常見。最後，大部分病例在12至15歲喪失獨立行動能力，必須使用輪椅。隨著疾病進展，輔助呼吸及咳嗽的橫膈肌變得更虛弱。罹病個體出現呼吸困難、呼吸道感染及吞嚥問題。幾乎所有DMD病患都將發展出心肌病。因心臟問題而加劇的肺炎是最常見的死因，死亡通常發生在三十歲以前。
貝克(Becker)氏肌肉失養症(BMD)的症狀不像DMD那麼嚴重，但仍導致早亡。相較於DMD，BMD的特徵在於較晚開始的骨骼肌虛弱。DMD病患在13歲以前就依賴輪椅，而BMD病患在16歲以後才喪失行動力及需要輪椅。BMD病患也展現頸屈肌強度的保留，不像對應的DMD病患。儘管骨骼肌的症狀較輕微，DMD相關擴張性心肌病(DCM)造成的心衰竭是常見的發病原因及BMD最常見的死亡原因，死亡平均發生在40歲中期。
肌萎縮蛋白是一種由dmd基因編碼的細胞質蛋白質，功能為連結細胞骨架肌動蛋白絲與膜蛋白。正常狀 況下，肌萎縮蛋白主要位於骨骼肌與心臟肌肉中，有少量表現於腦部，其在肌肉纖維收縮期間，藉由連結可收縮單元(contractile apparatus)的肌動蛋白與環繞各肌肉纖維之結締組織之層以作用為吸震器。在肌肉中，肌萎縮蛋白位於肌膜的細胞質面。
最初在1987年識別，dmd基因是最大型的已知人類基因，約2.5Mb。該基因位於X染色體的位置Xp21，含有79個外顯子。最常造成DMD或BMD之突變係一或多個外顯子(60至70%)的大型刪除突變，但重複突變(5至10%)及單核苷酸變體(包括小型刪除或插入、單鹼基改變及剪接位點改變大約佔DMD男性25%至35%及BMD男性約10%至20%的致病性變體)亦可造成致病性肌萎縮蛋白變體。
在DMD中，突變通常導致讀框移位造成過早終止密碼子及截短、非功能性或不穩定蛋白質。無意義點突變亦可導致過早終止密碼子造成相同結果。雖然造成DMD的突變可影響任何外顯子，但外顯子2至20及45至55係大型刪除及重複突變的常見熱點。符合讀框刪除導致較不嚴重的貝克氏肌肉失養症(BMD)，其中病患表現截短、部分功能性肌萎縮蛋白。
全長肌萎縮蛋白係大型(427kDa)蛋白質，其包含數個與其功能有關的子結構域。這些子結構域包括(依照自胺基端向羧基端之順序)N端肌動蛋白結合結構域、中央所謂的「棒狀(rod)」結構域、半胱胺酸富含結構 域及最後的羧基端結構域或區域。棒狀結構域包含4個脯胺酸富含絞鏈結構域(縮寫成H)及24個血影蛋白樣重複(縮寫成R)，順序如下：第一絞鏈結構域(H1)、3個血影蛋白樣重複(R1、R2、R3)、第二絞鏈結構域(H2)、再16個血影蛋白樣重複(R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19)、第三絞鏈結構域(H3)、再5個血影蛋白樣重複(R20、R21、R22、R23、R24)及最終第四絞鏈結構域(H4)。蛋白質之朝向羧基端的子結構域涉及與肌萎縮蛋白相關醣蛋白複合體(DGC)連接，這是一種在細胞骨架與細胞外基質之間形成關鍵連結的大型蛋白質複合體。
沒有治療能明確阻止或逆轉DMD的進展。皮質類固醇治療是目前的標準照護，但此僅延緩進展一或二年。一些用於DMD的新藥最近已經過藥物主管機關核准。這些包括造成通讀(read-through)過早終止密碼子之阿他盧侖(ataluren)及造成跳過外顯子51而產生內部刪除之部分功能性肌萎縮蛋白的依替利森(eteplirsen)。然而，這些藥物的作用機制不預期能幫助所有DMD病患，且需要進一步證據以明確證明彼等在DMD之臨床療效。
過去10至15年來使用腺病毒相關病毒(AAV)媒介性基因療法以潛在治療多種罕見疾病的的進展，使得重新燃起AAV可能用於治療DMD及較不嚴重抗肌萎縮蛋白病(即其他與dmd基因突變相關之肌肉疾病)的希望及關注。由於AAV載體有載荷物大小的限制，因此研究焦點集 中在產生微型或微小肌萎縮蛋白，這是消除非必需子結構域同時維持全長蛋白質的至少一些功能之較小型版本的肌萎縮蛋白。AAV媒介性微小肌萎縮蛋白基因療法已在mdx小鼠(DMD動物模型)顯示希望，其廣泛表現於肌肉中且顯示改善肌肉功能的證據(見例如Wang et al.,J.Orthop.Res.27：421(2009))。然而當相關實驗企圖使用微型肌萎縮蛋白載體於GRMD DMD犬模型中時，仍需要使用強效免疫抑制藥物才能達成顯著肌肉細胞轉導(Yuasa et al.,Gene Ther.14：1249(2007))。類似地，當人類DMD病患使用經設計以表現微小肌萎縮蛋白之AAV載體治療時，六名病患中僅有二位偵測到極少量的蛋白質，而有三位受到刺激出現對抗微小肌萎縮蛋白的T細胞反應(Bowles,et al.,Mol Ther.20(2)：443-455(2012))。
因此，所屬技術領域中仍需要可在DMD個體的轉導細胞中高水準表現，同時最小化對微小肌萎縮蛋白之免疫反應之編碼微小肌萎縮蛋白之AAV載體。
在本文中揭示及例示者係微小肌萎縮蛋白、用於表現該等微小肌萎縮蛋白之密碼子最佳化基因、用於以該等基因轉導細胞之AAV載體以及使用該等AAV載體預防及治療之方法，特別是用於預防及治療有其需要之個體的抗肌萎縮蛋白病。在這些實施例的一些中，本揭露之AAV載體能在轉導細胞中引導生產顯著水準之微小肌萎縮 蛋白，同時不造成對抗微小肌萎縮蛋白之免疫反應或僅造成緘默免疫反應。
以下闡述本揭露之發明的某些非限制性實施例(E)。這些及相關實施例係進一步詳細描述於實施方式，包括實例及圖式。
E1。一種微小肌萎縮蛋白，其包含、基本上由下列組成或由下列組成：野生型人肌萎縮蛋白(SEQ ID NO：25)之N端、肌動蛋白結合結構域(ABD)、絞鏈H1、棒狀結構域R1及R2、絞鏈H3、棒狀結構域R22、R23及R24、絞鏈H4、半胱胺酸富含(CR)結構域及部分羧基端(CT)結構域，其中該CT結構域不包含野生型肌萎縮蛋白之羧基端的最後三個胺基酸殘基。
E2。如E1之微小肌萎縮蛋白，其中該N端及肌動蛋白結合結構域(ABD)一起包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號1至240；絞鏈H1包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號253至327；棒狀結構域R1包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號337至447；棒狀結構域R2包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號448至556；絞鏈H3包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號2424至2470；棒狀結構域R22包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號2687至2802；棒狀結構域R23包含、基本上由下列組成或由下列組成： SEQ ID NO：25之胺基酸編號2803至2931；棒狀結構域R24包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號2932至3040；絞鏈H4包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號3041至3112；CR結構域包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號3113至3299；且部分CT結構域包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號3300至3408。
E3。如E1及E2中任一者之微小肌萎縮蛋白，其中微小肌萎縮蛋白包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：7之胺基酸序列。
E4。一種微小肌萎縮蛋白，其包含、基本上由下列組成或由下列組成：野生型人肌萎縮蛋白(SEQ ID NO：25)之N端、肌動蛋白結合結構域(ABD)、絞鏈H1、棒狀結構域R1、R2、R22、R23及R24、絞鏈H4、半胱胺酸富含(CR)結構域及部分羧基端(CT)結構域，其中該CT結構域不包含野生型肌萎縮蛋白之羧基端的最後三個胺基酸殘基。
E5。如E4之微小肌萎縮蛋白，其中該N端及肌動蛋白結合結構域(ABD)一起包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號1至240；絞鏈H1包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號253至327；棒狀結構域R1包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號337至447；棒狀結構域R2包含、基本上由下列組成或由下列組成： SEQ ID NO：25之胺基酸編號448至556；棒狀結構域R22包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號2687至2802；棒狀結構域R23包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號2803至2931；棒狀結構域R24包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號2932至3040；絞鏈H4包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號3041至3112；CR結構域包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號3113至3299；且部分CT結構域包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號3300至3408。
E6。如E4及E5中任一者之微小肌萎縮蛋白，其中微小肌萎縮蛋白包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：8之胺基酸序列。
E7。一種編碼如E1至E3之微小肌萎縮蛋白之多核苷酸。
E8。一種編碼如E4至E6之微小肌萎縮蛋白之多核苷酸。
E9。如E7及E8中任一者之多核苷酸，其中彼之核鹼基序列係自天然野生型基因編碼全長人肌萎縮蛋白之編碼序列組裝而成，全長人肌萎縮蛋白之一實例提供於NCBI參考序列NM_004006.2。
E10。如E9之多核苷酸，其中彼之核鹼基序列提供於SEQ ID NO：26。
E11。如E7至E10中任一者之多核苷酸，其中核鹼基序列係經密碼子最佳化。
E12。如E11之多核苷酸，其中密碼子最佳化降低或增加相較於野生型序列之GC含量。
E13。如E11之多核苷酸，其中密碼子最佳化降低或增加相較於野生型序列之CpG二核苷酸數量。
E14。如E11之多核苷酸，其中密碼子最佳化消除一或多個隱匿剪接位點。
E15。如E11之多核苷酸，其中密碼子最佳化消除一或多個核糖體進入位點，位於微小肌萎縮蛋白編碼序列起始處之一個核糖體進入位點除外。
E16。如E11之多核苷酸，其中密碼子最佳化將一或多個罕見密碼子取代為在意欲用於表現微小肌萎縮蛋白基因之細胞類型及/或種類中發生頻率較高之密碼子。
E17。如E12之多核苷酸，其中密碼子最佳化增加相較於野生型之GC含量且增加基因表現水準至少50%、100%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、550%、600%、650%、700%、750%、800%、900%、1000%或更多。
E18。如E12之多核苷酸，其中密碼子最佳化增加相較於野生型之GC含量至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更多。
E19。如E12之多核苷酸，其中GC含量係約或至少 45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%或更多。
E20。如E13之多核苷酸，其中密碼子最佳化降低或增加相較於野生型之CpG二核苷酸數量約或至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%或更多。
E21。如E20之多核苷酸，其中CpG二核苷酸數量若減少，則其減少之量足以完全或部分抑制因CpG模體甲基化導致之基因表現靜默。
E22。如E11之多核苷酸，其中密碼子最佳化參照高度表現人類基因，增加微小肌萎縮蛋白基因之密碼子適應指數(CAI)至一至少0.70、0.71、0.72、0.73、0.74、0.75、0.76、0.77、0.78、0.79、0.80、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98或0.99之值。
E23。如E11至E22中任一者之多核苷酸，其中核鹼基序列係經人密碼子最佳化。
E24。如E11至E22中任一者之多核苷酸，其中核鹼基序列係經犬密碼子最佳化。
E25。如E23之多核苷酸，其中人密碼子最佳化序列提供於SEQ ID NO：1或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%同一性 之核鹼基序列。
E26。如E23之多核苷酸，其中人密碼子最佳化序列提供於SEQ ID NO：2或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%同一性之核鹼基序列。
E27。如E24之多核苷酸，其中犬密碼子最佳化序列提供於SEQ ID NO：3或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%同一性之核鹼基序列。
E28。一種載體，其包含如E7至E27中任一者之多核苷酸。
E29。如E28之載體，其中多核苷酸可操作地連接基因控制區域。
E30。如E29之載體，其中基因控制區域係啟動子。
E31。如E30之載體，其中啟動子具肌肉特異性，其在肌肉細胞中相較於在其他種類細胞諸如肝臟細胞中更為活躍。
E32。如E30至E31中任一者之載體，其中基因控制區域進一步包括增強子。
E33。如E30至E32中任一者之載體，其中啟動子(及若存在之增強子)係來自肌肉肌胺酸激酶(CK)基因。
E34。如E33之載體，其中CK基因係來自小鼠或人類。
E35。如E33之載體，其中基因控制區域係小鼠CK7 增強子及啟動子。
E36。如E29至E36中任一者之載體，其中基因控制區域包含選自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：16之群組的核鹼基序列。
E37。如E28至E36中任一者之載體，其中多核苷酸可操作地連接轉錄終止區域。
E38。如E37之載體，其中轉錄終止區域包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：17之核鹼基序列。
E39。如E28至E38中任一者之載體，其中載體係AAV病毒載體基因體且包含側接之AAV反向末端重複(ITR)。
E40。如E39之載體，其中兩個ITR皆為AAV2 ITR。
E41。如E39及E40中任一者之載體，其中載體之核鹼基序列提供於選自SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：18之群組的核鹼基序列。
E42。一種重組AAV(rAAV)顆粒，其包含AAV殼體(capsid)及如E39至E41中任一者之載體。
E43。如E42之rAAV顆粒，其中AAV殼體係AAV9殼體。
E44。一種rAAV顆粒，其包含具有橫紋肌趨性之AAV殼體及用於表現人微小肌萎縮蛋白之載體基因體。
E45。如E44之rAAV顆粒，其中AAV殼體係來自AAV9血清型。
E46。如E44及E45中任一者之rAAV顆粒，其中載體基因體包含編碼人微小肌萎縮蛋白之人密碼子最佳化核酸序列。
E47。如E44至E46中任一者之rAAV顆粒，其中人微小肌萎縮蛋白依N端至C端之順序包含來自全長人肌萎縮蛋白之下列子結構域或其部分：N端結構域、肌動蛋白結合結構域(ABD)、絞鏈H1、棒狀結構域R1、棒狀結構域R2、絞鏈H3、棒狀結構域R22、棒狀結構域R23、棒狀結構域R24、絞鏈H4、半胱胺酸富含(CR)結構域及部分羧基端(CT)結構域，其中部分CT結構域不包括來自肌萎縮蛋白的最後3個胺基酸。
E48。如E44至E47中任一者之rAAV顆粒，其中人微小肌萎縮蛋白包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列。
E49。如E44至E46中任一者之rAAV顆粒，其中人微小肌萎縮蛋白依N端至C端之順序包含來自全長人肌萎縮蛋白之下列子結構域或其部分：N端結構域、肌動蛋白結合結構域(ABD)、絞鏈H1、棒狀結構域R1、棒狀結構域R2、棒狀結構域R22、棒狀結構域R23、棒狀結構域R24、絞鏈H4、半胱胺酸富含(CR)結構域及部分羧基端(CT)結構域，其中部分CT結構域不包括來自肌萎縮蛋白的最後3個胺基酸。
E50。如E44至E46及E49中任一者之rAAV顆粒，其中人微小肌萎縮蛋白包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列。
E51。如E44至E47中任一者之rAAV顆粒，其中編碼 人微小肌萎縮蛋白之人密碼子最佳化核酸序列包含SEQ ID NO：1之核酸序列。
E52。如E44至E46、E49及E50中任一者之rAAV顆粒，其中編碼人微小肌萎縮蛋白之人密碼子最佳化核酸序列包含SEQ ID NO：3之核酸序列。
E53。如E44至E52中任一者之rAAV顆粒，其中載體基因體進一步包含AAV反向末端重複(ITR)以側接密碼子最佳化核酸序列。
E54。如E53之rAAV顆粒，其中AAV ITR係AAV2 ITR。
E55。如E44至E54中任一者之rAAV顆粒，其中載體基因體進一步包含與人密碼子最佳化核酸序列可操作地連接之肌肉特異性轉錄調節元件。
E56。如E55之rAAV顆粒，其中肌肉特異性轉錄調節元件係位於5' AAV2 ITR與人密碼子最佳化核酸序列之間。
E57。如E55及E56中任一者之rAAV顆粒，其中肌肉特異性轉錄調節元件係源自人或小鼠肌胺酸激酶(CK)基因。
E58。如E55至E57中任一者之rAAV顆粒，其中肌肉特異性轉錄調節元件包含增強子及啟動子。
E59。如E55至E58中任一者之rAAV顆粒，其中肌肉特異性轉錄調節元件係小鼠CK7增強子及啟動子。
E60。如E55至E59中任一者之rAAV顆粒，其中肌肉 特異性轉錄調節元件包含SEQ ID NO：16之核酸序列。
E61。如E44至E60中任一者之rAAV顆粒，其中載體基因體進一步包含位於密碼子最佳化核酸序列與3' AAV2 ITR之間之轉錄終止序列。
E62。如E61之rAAV顆粒，其中轉錄終止序列包含聚腺苷酸化信號。
E63。如E44至E62中任一者之rAAV顆粒，其中載體基因體依5'至3'之順序包含：第一AAV2 ITR、可操作地連接編碼人微小肌萎縮蛋白之人密碼子最佳化核酸序列之肌肉特異性轉錄調節元件、轉錄終止序列及第二AAV2 ITR。
E64。如E63之rAAV顆粒，其中肌肉特異性轉錄調節元件包含SEQ ID NO：16之核酸序列。
E65。如實施例E63或E64之rAAV顆粒，其中人密碼子最佳化核酸序列包含SEQ ID NO：1之核酸序列。
E66。如實施例E63至E65之rAAV顆粒，其中轉錄終止序列包含SEQ ID NO：17之核酸序列。
E67。如E44至E48、E51及E53至E66中任一者之rAAV顆粒，其中載體基因體包含SEQ ID NO：18之核酸序列或其反向互補序列。
E68。如E44至E48、E51及E53至E66中任一者之rAAV顆粒，其中載體基因體實質上由SEQ ID NO：18之核酸序列或其反向互補序列組成。
E69。如E44至E48、E51及E53至E66中任一者之 rAAV顆粒，其中載體基因體由SEQ ID NO：18之核酸序列或其反向互補序列組成。
E70。一種重組AAV顆粒，其包含AAV9殼體及載體基因體，該載體基因體包含SEQ ID NO：18之核酸序列或其反向互補序列。
E71。一種重組AAV顆粒，其包含AAV9殼體及載體基因體，該載體基因體基本上由SEQ ID NO：18之核酸序列或其反向互補序列組成。
E72。一種重組AAV顆粒，其包含AAV9殼體及載體基因體，該載體基因體由SEQ ID NO：18之核酸序列或其反向互補序列組成。
E73。一種醫藥組成物，其包含如E42至E72中任一者之rAAV顆粒及醫藥上可接受之載劑。
E74。一種用於治療抗肌萎縮蛋白病之方法，其包含向有治療抗肌萎縮蛋白病需要之個體投予治療有效量之E73之組成物。
E75。一種如E42至E72中任一者之重組AAV(rAAV)顆粒或如E73之組成物於製備用於治療抗肌萎縮蛋白病個體的藥物之用途。
E76。如E42至E72中任一者之rAAV顆粒或如E73之組成物，其係用於治療抗肌萎縮蛋白病個體。
E77。如E74至E76中任一者之方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物，其中抗肌萎縮蛋白病係杜興氏肌肉失養症(DMD)、貝克氏肌肉失養症(BMD)或DMD相關擴張 性心肌病。
E78。如E74至E77中任一者之方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物，其中個體係男性或女性人類個體。
E79。如E74至E78中任一者之方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物，其中個體首次接受組成物治療或投予組成物時可以走動。
E80。如E74至E79中任一者之方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物，其中個體首次接受組成物治療或投予組成物時係約或至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16歲。
E81。如E74至E79中任一者之方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物，其中方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物相較於未治療對照組有效恢復在肌肉細胞之肌膜上的肌萎縮蛋白相關蛋白質複合體。
E82。如E74至E79中任一者之方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物，其中方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物相較於未治療對照組有效改善心臟中的肌肉失養組織病理學。
E83。如E74至E79中任一者之方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物，其中方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物相較於未治療對照組有效抑制四肢肌肉及橫膈中的纖維化。
E84。如E74至E79中任一者之方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物，其中方法、用途、rAAV顆粒或供 使用之組成物相較於未治療對照組有效減少肌肉病灶分數。
E85。如E74至E79中任一者之方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物，其中方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物相較於未治療對照組有效減少肌肉疲勞。
E86。如E74至E79中任一者之方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物，其中方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物相較於未治療對照組有效增加Dmd mdx 大鼠之最大絕對或相對前肢抓力強度。
E87。如E74至E79中任一者之方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物，其中方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物有效增加骨骼肌、心肌或橫膈中微小肌萎縮蛋白mRNA之可偵測水準。
E88。如E74至E79中任一者之方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物，其中方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物有效減少個體血液中之平均MMP-9水準至高於健康對照組的約15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2倍以內。
E89。如E74至E79中任一者之方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物，其中方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物有效減少個體血液中之平均ALT、AST、或LDH水準至高於健康對照組的約7、6、5、4、3或2倍以內。
E90。如E74至E79中任一者之方法、用途、rAAV顆 粒或供使用之組成物，其中方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物有效減少個體血液中之平均總CK水準至高於健康對照組的約50、48、46、44、42、40、38、36、34、32、30、28、26、24、22、20、18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、4、3或2倍以內。
E91。如E74至E79中任一者之方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物，其中方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物在投予載體之後3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、或36個月，相較於未治療對照組的平均6分鐘步行距離(6MWD)，有效增加個體之6MWD至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100公尺。
E92。如E74至E79中任一者之方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物，其中方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物在投予載體後3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、或36個月，相較於未治療對照組進行爬4階樓梯測試所需之平均時間，有效減少個體之平均時間至少0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8或4.0秒。
E93。如E74至E79中任一者之方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物，其中方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物在投予載體之後3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、或36個月，相較於未治療對照組失去行動力的平均比例，有效減少個體失去行動力的平均比 例至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%或65%。
E94。如E74至E79中任一者之方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物，其中方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物在投予載體之後3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、或36個月，相較於未治療對照組之下肢平均脂肪比例，有效減少個體之下肢平均脂肪比例至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。
E95。如E88至E94中任一者之方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物，其中對照組與個體之年齡及性別相符。
E96。如E91至E94中任一者之方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物，其中個體及未治療對照組係根據年齡、先前皮質類固醇治療及/或6MWT基線表現分層。
E97。如E74至E79中任一者之方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物，其中方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物在投予載體之後3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、或36個月，有效造成個體至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%的骨骼肌纖維表現微小肌萎縮蛋白。
E98。如E79中任一者之方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物，其中骨骼肌纖維係存在於取自個體之二 頭肌、三角肌或四頭肌的活體組織切片中。
E99。如E74至E98中任一者之方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物，其中方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物在投予載體之後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36個月，在少於或等於約0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%的個體中造成對抗微小肌萎縮蛋白之細胞性免疫反應或肌肉發炎。
E100。如E74至E99中任一者之方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物，其中方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物有效治療個體無需併用免疫抑制。
E101。如E74至E76中任一者之方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物，其中個體係Dmd mdx 大鼠且相較於僅投予媒劑之年齡相符對照組，該方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物有效導致注射後3個月或6個月血清AST、ALT、LDH或總肌胺酸激酶水準減少。
E102。如E74至E76中任一者之方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物，其中個體係Dmd mdx 大鼠且相較於僅投予媒劑之年齡相符對照組，該方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物有效導致注射後3個月或6個月股二頭肌、橫膈或心肌纖維化減少。
E103。如E74至E76中任一者之方法、用途、rAAV 顆粒或供使用之組成物，其中個體係Dmd mdx 大鼠且相較於僅投予媒劑之年齡相符對照組，該方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物有效導致注射後3個月或6個月前肢抓力增加。
E104。如E74至E76中任一者之方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物，其中個體係Dmd mdx 大鼠且相較於僅投予媒劑之年齡相符對照組，該方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物有效導致肌肉疲勞減少，如在注射後3個月或6個月以5次相隔短暫的測試前肢抓力試驗中所測量。
E105。如E74至E76中任一者之方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物，其中個體係Dmd mdx 大鼠且相較於僅投予媒劑之年齡相符對照組，該方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物有效導致左心室射出率增加，如在注射後6個月使用心臟超音波圖所測量。
E106。如E74至E76中任一者之方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物，其中個體係Dmd mdx 大鼠且相較於僅投予媒劑之年齡相符對照組，該方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物有效導致早期對晚期左心室填充速度比例(即E/A比例)增加，如在注射後3個月或6個月使用心臟超音波圖所測量。
E107。如E74至E76中任一者之方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物，其中個體係Dmd mdx 大鼠且相較於僅投予媒劑之年齡相符對照組，該方法、用途、rAAV顆 粒或供使用之組成物有效導致等容弛緩時間(IVRT)或E峰速度與其回復至基線之間的時間(毫秒)降低，其中E波減速時間(DT)係在注射後3個月或6個月使用心臟超音波圖測量。
E108。如E74至E76中任一者之方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物，其中個體係Dmd mdx 大鼠，且該方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物在注射後3個月或6個月有效轉導股二頭肌、橫膈、心肌、或其他橫紋肌及表現由opti-Dys3978基因所編碼之微小肌萎縮蛋白，而不誘導抗微小肌萎縮蛋白之細胞性免疫反應。
E109。如E74至E76中任一者之方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物，其中個體係Dmd mdx 大鼠且相較於僅投予媒劑之年齡相符對照組，該方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物在注射後6個月有效部分或完全逆轉左心室舒張末期直徑的增加。
E110。如E74至E100中任一者之方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物，其中個體亦經至少第二劑治療、或組成物亦包含至少第二劑，該第二劑可有效治療抗肌萎縮蛋白病，該第二劑之實例包括造成DMD基因外顯子跳過之反義寡核苷酸、抗肌肉生成抑制素抗體、促進核糖體通讀無意義突變之藥劑、抑制過早終止密碼子之藥劑、同化類固醇及皮質類固醇(諸如但不限於強體松(prednisone)、地氟可特(deflazacort)、或普賴蘇龍(prednisolone))。
E111。如E74至E110中任一者之方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物，其中組成物係經系統性(諸如靜脈注射)或局部性(諸如直接注射至肌肉)投予。
E112。如E74至E111中任一者之方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物，其中在該方法、用途、rAAV顆粒或供使用之組成物中使用的rAAV顆粒之劑量係選自由下列所組成之劑量群組：1×1012vg/kg、2×1012vg/kg、3×1012vg/kg、4×1012vg/kg、5×1012vg/kg、6×1012vg/kg、7×1012vg/kg、8×1012vg/kg、9×1012vg/kg、1×1013vg/kg、2×1013vg/kg、3×1013vg/kg、4×1013vg/kg、5×1013vg/kg、6×1013vg/kg、7×1013vg/kg、8×1013vg/kg、9×1013vg/kg、1×1014vg/kg、1.5×1014vg/kg、2×1014vg/kg、2.5×1014vg/kg、3×1014vg/kg、3.5×1014vg/kg、4×1014vg/kg、5×1014vg/kg、6×1014vg/kg、7×1014vg/kg、8×1014vg/kg及9×1014vg/kg，其中vg/kg代表每公斤個體體重載體基因體。
E113。如E73之組成物，其進一步包含與rAAV顆粒相同AAV血清型的空殼體，其中空殼體對rAAV顆粒之濃度比例係約或至少0.5：1、1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1或更高。
E114。一種在細胞中表現微小肌萎縮蛋白之方法，其包含使細胞與如E42至E72中任一者之rAAV顆粒接觸。
E115。如E114之方法，其中該細胞係肌肉細胞。
E116。如E115之方法，其中該肌肉細胞係來自骨骼 肌、橫膈或心臟。
E117。一種製造如E42至E72中任一者之rAAV顆粒之方法，其包含將如E39至E41中任一者之載體、AAV rep基因、AAV cap基因及具有幫手功能之基因導入生產細胞中；培養該細胞；以及純化由該細胞生產之rAAV顆粒。
E118。如E117之方法，其中生產細胞係黏著性。
E119。如E117之方法，其中生產細胞係非黏著性。
E120。如E117至E119中任一者之方法，其中載體係包含於一個質體中、AAV rep及cap基因係包含於第二質體中且幫手功能基因係包含於第三質體中，並將所有三個質體導入包裝細胞(packaging cell)中。
E121。如E117至E120中任一者之方法，其中導入步驟係由轉染進行。
E122。如E117至E121中任一者之方法，其中生產細胞係HEK293細胞。
E123。如E117至E122中任一者之方法，其中生產細胞生長於不含血清介質中。
E124。如E117至E123中任一者之方法，其中AAV cap基因編碼AAV9 VP1、VP2及VP3蛋白質。
E125。如E117至E124中任一者之方法，其中rAAV顆粒使用密度梯度超離心或管柱層析法純化。
E126。一種rAAV顆粒，其係由如E117至E125中任一者之方法生產。
圖1顯示建構大幅截短之微小肌萎縮蛋白基因。野生型肌萎縮蛋白具有四個主要結構域：N端結構域(N)；中央棒狀結構域，其含有24個棒狀重複(R)及四個絞鏈(H)；半胱胺酸富含(CR)結構域及羧基端(CT)結構域。微小肌萎縮蛋白基因係藉由刪除一大部分的中央棒狀結構域及絞鏈及絕大部分的CT結構域建構。微小肌萎縮蛋白基因係經密碼子最佳化、完全合成且後續選殖在介於基因5'端的CMV啟動子或肌肉特異性合成雜交啟動子與基因3'端的小型poly(A)序列之間。接著將此基因區段(含有啟動子、密碼子最佳化微小肌萎縮蛋白基因、及polyA信號)選殖至含有左及右AAV反向末端重複(ITRs)的質體之中，以使該基因區段側接ITRs。
圖2顯示密碼子最佳化有效增強微小肌萎縮蛋白基因表現。上圖顯示在(A)未轉染293細胞中、或在轉染原始未最佳化(B)、或最佳化(C)微小肌萎縮蛋白Dys3978載體質體後之微小肌萎縮蛋白的免疫螢光(IF)染色。下圖顯示在轉染293細胞中之微小肌萎縮蛋白的西方墨點轉漬。左側墨點使用等量的細胞溶解物且顯示最佳化cDNA的強烈表現。右側墨點使用經最佳化微小肌萎縮蛋白cDNA轉染之293細胞的100X稀釋細胞溶解物，非最佳化樣本未經稀釋。應注意最佳化者之信號經過100X稀釋後仍然較強。
圖3顯示人微小肌萎縮蛋白在經AAV9載體治 療之肌萎縮蛋白/抗肌萎縮蛋白相關蛋白雙基因剔除(dKO)小鼠中之表現的IF染色。來自野生型對照小鼠C57BL/10(C57)、未治療dKO小鼠及AAV9-CMV-Hopti-Dys3978治療dKO小鼠(T-dKO)的肌肉及心臟樣本經薄切，並用也辨識小鼠野生型肌萎縮蛋白及人微小肌萎縮蛋白兩者之抗體染色。在所有檢查樣本中皆達成高效表現。
圖4顯示dKO小鼠之體重因AAV9-CMV-Hopti-Dys3978治療而正常化。資料在野生型對照B10小鼠(C57BL/10)、未治療mdx小鼠、未治療dKO小鼠及載體治療dKO小鼠4月齡時獲得。
圖5顯示dKO小鼠之抓力及跑步機跑步因AAV9-CMV-Hopti-Dys3978治療改善。資料在野生型對照B10小鼠(C57BL/10)、未治療mdx小鼠、未治療dKO小鼠及載體治療dKO小鼠(T-dKO)3月齡時獲得。
圖6A至6B顯示dKO小鼠之肌肉失養病狀因AAV9-CMV-Hopti-Dys3978治療改善。(圖6A)將野生型對照C57BL/10小鼠、未治療dKO小鼠及載體治療dKO(T-dKO)小鼠的脛骨前肌冷凍切片(8μm)進行組織病理學蘇木精及伊紅(H&E)染色(10X放大)。(圖6B)肌肉質量、心臟質量、中央位置細胞核百分比及血清肌胺酸激酶活性之定量分析。
圖7顯示經人密碼子最佳化微小肌萎縮蛋白Dys3978載體(AAV9-CMV-Hopti-Dys3978)治療之dKO小鼠相較於未治療dKO小鼠及野生型小鼠之存活曲線。大於 50%之經治療dKO小鼠存活超過80週(實驗期間)。
圖8顯示dKO小鼠之心臟功能因AAV9-CMV-Hopti-Dys3978治療改善。血液動力學分析係於野生型對照C57BL/10小鼠、未治療mdx小鼠及AAV9載體治療之dKO小鼠進行。未治療dKO小鼠太過虛弱無法承受程序。資料係收集自三組接受或未接受多巴酚丁胺挑戰之小鼠。
圖9A至9B顯示dKO小鼠之心電圖(ECG)因AAV9-CMV-Hopti-Dys3978治療改善。(圖9A)ECG的PR間隔在載體治療dKO小鼠中獲得改善。(圖9B)分析的定量資料。進行仔細監測三組心跳速率的實驗，以使ECG不受心跳速率變異的影響。*p<0.05。
圖10顯示在尾靜脈注射含有CMV或hCK啟動子之AAV9-Hopti-Dys3978載體後，非組織特異性CMV啟動子與肌肉特異性hCK啟動子在mdx小鼠中驅動人密碼子最佳化微小肌萎縮蛋白Dys3978的比較。使用IF染色，顯示人微小肌萎縮蛋白Dys3978在肢體肌肉及心肌中的強健表現。hCK啟動子似乎比CMV啟動子更為有效。
圖11顯示GRMD犬「Jelly」的後肢在單離肢體靜脈灌流AAV9-CMV-Hopti-Dys3978載體後的磁振造影(MRI)影像。載體係在壓力下輸注於右後腿，即利用止血帶綁緊腹股溝區域。白色信號指示載體溶液滯留於灌流肢體中。
圖12顯示GRMD犬「Jelly」注射載體後2個月，人微小肌萎縮蛋白Dys3978表現之IF染色。檢查右後 腿及左後腿中5個不同肌肉群的活體組織切片樣本。非注射左腿也具有可偵測到之dys3978，暗示AAV9載體從注射部位移動至對側腿。
圖13顯示GRMD犬「Jelly」注射載體後7個月，人微小肌萎縮蛋白Dys3978表現之IF染色。檢查右後腿及左後腿中4個不同肌肉群的活體組織切片樣本。非注射左腿也具有可偵測到之Dys3978，暗示AAV9載體從注射部位移動至對側腿。在相同樣本進行Dys3978之西方墨點轉漬法分析。
圖14顯示GRMD犬「Jelly」注射載體後12個月，人微小肌萎縮蛋白Dys3978表現之IF染色。檢查右後腿及左後腿中4個不同肌肉群的活體組織切片樣本及1個前肢樣本。非注射左腿也具有可偵測到之Dys3978，暗示AAV9載體從注射部位移動至對側腿。
圖15顯示GRMD犬「Jelly」注射載體後2年，人微小肌萎縮蛋白Dys3978表現之IF染色。檢查右後腿及左後腿中2個不同肌肉群的活體組織切片樣本。注意非注射左腿似乎比注射腿具有更多可偵測到之Dys3978。
圖16顯示人微小肌萎縮蛋白Dys3978之IF染色。檢查來自GRMD犬「Jelly」右後腿及左後腿中二個額外(相較於圖15)肌肉群的活體組織切片樣本及一個前肢樣本。樣本也在注射載體後2年收集。
圖17顯示GRMD犬「Jelly」注射載體後4年，來自非注射左後腿的人微小肌萎縮蛋白Dys3978之IF染 色。
圖18顯示GRMD犬「Jelly」注射載體後超過8年，人微小肌萎縮蛋白Dys3978之IF染色。檢查5個不同肌肉群及心臟的屍體剖檢肌肉樣本。
圖19顯示GRMD犬「Jelly」注射載體後超過8年，人微小肌萎縮蛋白Dys3978及內源性回復突變肌萎縮蛋白之IF染色。將三個不同肌肉群的屍體剖檢肌肉樣本用辨識人類及犬肌萎縮蛋白的抗體(上圖)或僅辨識犬回復突變肌萎縮蛋白的抗體(下圖)染色。回復突變肌萎縮蛋白陽性肌纖維以箭頭強調。回復突變纖維是罕見的肌纖維，呈現肌萎縮蛋白染色陽性，且發生於人類DMD病患、以及mdx小鼠及GRMD犬中。回復突變纖維發生的確切機制並未完全理解，但可能涉及罕見肌細胞中的外顯子跳過(exon skipping)，因而生產具有經抗體探針辨識之表位的縮短的肌萎縮蛋白。見例如Lu,QL,et al.,J Cell Biol 148：985-96(2000)。
圖20顯示在GRMD犬「Jelly」注射AAV9載體後超過8年之屍體剖檢中，存在於肌肉樣本中之人微小肌萎縮蛋白Dys3978的西方墨點轉漬法分析。西方墨點轉漬法顯示人微小肌萎縮蛋白Dys3978存在於所有受檢的骨骼肌中。使用來自年齡及性別相符正常犬「茉莉(Molly)」的肌肉作為陽性對照，經連續2倍稀釋以指示肌萎縮蛋白之定量。野生型全長肌萎縮蛋白之分子量約為400kDa，而微小肌萎縮蛋白Dys3978蛋白質約為150kDa。
圖21顯示GRMD犬「Jelly」在注射AAV9-CMV-Hopti-Dys3978載體及身體廣泛的基因表現後肌肉收縮力改善。最上方的曲線代表正常犬的肌肉力，而最下方的曲線代表未治療GRMD犬的肌肉力。二條延伸至較多時間點的曲線代表犬「Jelly」的肌肉力。另外二隻經AAV9-CMV-犬-微小肌萎縮蛋白Dys3849載體治療的GRMD犬(Wang,et al.,PNAS 97(25)：13714-9(2000))亦接受肌肉力的檢查，且顯示改善(「Jasper」及「Peridot」)。
圖22顯示GRMD犬「Dunkin」注射AAV9-hCK-Copti-Dys3978載體後4個月，人微小肌萎縮蛋白表現之肌肉活體組織切片IF染色。載體藉由靜脈內注射遞送以達成身體廣泛基因表現。檢查後肢中4個不同肌肉群的活體組織切片樣本。注意到在所有肌肉群皆偵測到幾乎均勻的微小肌萎縮蛋白Dys3978。
圖23顯示GRMD犬「Dunkin」注射AAV9-hCK-Copti-Dys3978載體後14個月，人微小肌萎縮蛋白表現之IF染色。採集並檢查屍體剖檢樣本。注意到在心臟及所有肌肉群皆偵測到廣泛且強健水準的微小肌萎縮蛋白Dys3978。放大4倍。
圖24顯示GRMD犬「Dunkin」注射AAV9-hCK-Copti-Dys3978載體後14個月，在橫膈肌偵測到強健水準的人微小肌萎縮蛋白之IF染色。
圖25顯示GRMD犬「Dunkin」注射AAV9-hCK-Copti-Dys3978載體後14個月，在腓骨長肌偵測到強健水 準的人微小肌萎縮蛋白之IF染色。
圖26顯示GRMD犬「Dunkin」注射AAV9-hCK-Copti-Dys3978載體後14個月，在半膜肌偵測到強健水準的人微小肌萎縮蛋白之IF染色。
圖27顯示GRMD犬「Dunkin」注射AAV9-hCK-Copti-Dys3978載體後14個月，在心臟左心室(LV)肌肉偵測到強健水準的人微小肌萎縮蛋白之IF染色。
圖28顯示在GRMD犬「Dunkin」注射載體後4個月及14個月之肌肉樣本中，藉由西方墨點轉漬法偵測人微小肌萎縮蛋白Dys3978。使用來自年齡相符正常犬的肌肉作為陽性對照，經連續2倍稀釋以指示肌萎縮蛋白之定量。野生型全長肌萎縮蛋白之分子量約為400kDa，而微小肌萎縮蛋白Dys3978約為150kDa。應注意微小肌萎縮蛋白Dys3978在肝臟中偵測到。
圖29顯示在GRMD犬「Dunkin」注射載體後14個月之心臟(LV)樣本中，藉由西方墨點轉漬法偵測人微小肌萎縮蛋白Dys3978表現。使用來自年齡相符正常犬的心臟樣本作為陽性對照，經連續2倍稀釋以指示肌萎縮蛋白之定量。
圖30顯示恢復肌萎縮蛋白相關蛋白質複合體，如各種肌肉群之人微小肌萎縮蛋白Dys 3978以及γ-肌聚糖(sarcoglycan)(r-SG)之IF染色所示。
圖31顯示在各種肌肉及組織中AAV9-CMV-Copti-Dys3978載體DNA份數分析。進行定量PCR(qPCR) 以判定AAV載體DNA基因體複製數，其以每個二倍體細胞為基礎標準化。
圖32顯示AAV9-CMV-Copti-Dys3978載體GRMD犬「Dunkin」之心臟的肌肉失養組織病理學相較於年齡相符之正常及未治療GRMD犬改善。HE染色。
圖33顯示AAV9-CMV-Copti-Dys3978載體GRMD犬「Dunkin」之橫膈肌的肌肉失養組織病理學改善。相較於年齡相符之正常及未治療GRMD犬。HE染色。
圖34顯示AAV9-CMV-Copti-Dys3978載體GRMD犬「Dunkin」之肢體肌肉的肌肉失養組織病理學相較於年齡相符之未治療GRMD犬改善。HE染色。
圖35顯示GRMD犬「Dunkin」之肢體肌肉及橫膈的纖維化相較於年齡相符之未治療GRMD犬抑制。梅森(Mason)三色藍染色。
圖36A提供顯微照片，顯示獲自PBS空白對照處理WT大鼠(左圖)、空白對照處理DMD大鼠(中圖)及AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體治療Dmd mdx 大鼠(右圖)之以抗-肌萎縮蛋白DYSB抗體免疫標示的股二頭肌。在纖維周圍的深色輪廓顯示肌萎縮蛋白在WT大鼠中及微小肌萎縮蛋白在載體治療Dmd mdx 大鼠中的肌膜下定位。
圖36B提供顯微照片，顯示獲自空白對照處理WT大鼠(左圖)、空白對照處理Dmd mdx 大鼠(中圖)及AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體治療DMD大鼠(右圖)之經蘇木精及伊紅(HES)染色的股二頭肌。壞死纖維 叢集(*)及肌內膜輕微纖維化(黑色箭頭)係經顯示。
圖36C提供顯微照片，顯示獲自空白對照處理WT大鼠(左圖)、空白對照處理Dmd mdx 大鼠(中圖)及AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體治療Dmd mdx 大鼠(右圖)之以抗-肌萎縮蛋白DYSB抗體免疫標示的心肌。在纖維周圍的深色輪廓顯示肌萎縮蛋白在WT大鼠中及微小肌萎縮蛋白在載體治療Dmd mdx 大鼠中的肌膜下定位。
圖36D提供顯微照片，顯示獲自空白對照處理WT大鼠(左圖)、空白對照處理Dmd mdx 大鼠(中圖)及AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體治療Dmd mdx 大鼠(右圖)之經HES染色的心肌。纖維化病灶(空心箭頭)顯示於中圖，且單核細胞浸潤病灶顯示於右圖。
圖37顯示媒劑(緩衝劑)處理WT大鼠及媒劑處理及增加劑量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體處理Dmd mdx 大鼠的平均體重克數隨時間直到投藥後25週的變化。「WT」係指野生型大鼠；「DMD」係指Dmd mdx 大鼠；「n」係指樣本大小；「D」係指自投藥起之天數；「W」係指自投藥起之週數；「E」係一種表示法，將指定係數乘以十再乘以指定指數的次方(因此，「1E13」代表1×1013、「3E13」代表3×1013、「1E14」代表1×1014且「3E14」代表3×1014)；「vg/kg」代表每公斤體重載體基因體；且「w/o HAS」係指其中載體係以不含人類血清白蛋白之PBS投予的治療組。在該圖右側第25週時，由上至下的平均體重資料順序與圖例列出之治療組由上至下的順 序相同(除了以不含HSA之媒劑投予1×1014vg/kg載體治療的Dmd mdx 大鼠以外，該組的資料收集在試驗開始後13週結束)。這些相同縮寫用於本文中的其他圖式。
圖38A提供Dmd mdx 大鼠骨骼肌的經組織學檢查染色之例示性顯微照片，顯示用來估計缺乏肌萎縮蛋白所造成的肌肉病灶嚴重程度的半定量評分方案。在骨骼肌中，如圖所示，0的分數對應於無病灶；1對應於存在一些再生活性，證據為中央成核纖維及小型再生病灶；2對應於存在單離或呈小型叢集之變性纖維；及3對應於由纖維化或脂肪組織進行組織再造及纖維替換。心臟評分使用如文中解釋之不同標準。
圖38B顯示注射後3個月大鼠總DMD病灶分數(也就是股二頭肌、胸肌、橫膈及心肌病灶子分數的平均)，顯示為各治療組中所有大鼠個別分數以及平均分數，並進行比較以顯示載體劑量反應性減少病灶分數。「WT空白對照」係指經媒劑處理之WT大鼠，「KO空白對照」係指經媒劑處理之Dmd mdx 大鼠，「KO 1E13」、「3E13」及「1E14」係指經所示劑量(vg/kg)之AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體處理之Dmd mdx 大鼠。槓上的字母指示下方資料與槓上有相同字母出現的其他槓無統計差異。相反地，槓上出現不同字母之槓彼此具有統計差異。統計使用Kruskal-Wallis檢定及Dunn's檢定計算。
圖39A提供來自增加劑量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體治療之Dmd mdx 大鼠及陰性對照的股二頭 肌樣本代表性切片。樣本經特異性結合全長大鼠肌萎縮蛋白及人微小肌萎縮蛋白之抗體及染色結締組織之小麥胚芽凝集素接合物雙重標示。上圖係在注射後3個月犧牲動物的顯微照片。下圖係在注射後6個月犧牲動物的顯微照片。
圖39B提供來自增加劑量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體治療之Dmd mdx 大鼠及陰性對照的股二頭肌樣本隨機切片中存在肌萎縮蛋白而呈陽性染色之纖維百分比。包括注射後3及6個月的資料。槓上的字母指示下方資料與槓上有相同字母出現的其他槓無統計差異。相反地，槓上出現不同字母之槓彼此具有統計差異。統計使用ANOVA分析及Fisher's事後雙邊檢定計算。
圖39C提供來自增加劑量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體治療之Dmd mdx 大鼠及陰性對照的股二頭肌樣本隨機切片中存在結締組織而呈陽性染色之面積百分比。包括注射後3及6個月的資料。槓上的字母指示下方資料與槓上有相同字母出現的其他槓無統計差異。相反地，槓上出現不同字母之槓彼此具有統計差異。統計使用ANOVA分析及Fisher's事後雙邊檢定計算。
圖40A提供來自增加劑量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體治療之Dmd mdx 大鼠及陰性對照的橫膈肌肉樣本代表性切片，動物在注射後3個月犧牲。樣本經特異性結合全長大鼠肌萎縮蛋白及人微小肌萎縮蛋白之抗體及染色結締組織之小麥胚芽凝集素接合物雙重標示。
圖40B提供來自增加劑量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體治療之Dmd mdx 大鼠及陰性對照的橫膈肌肉樣本隨機切片中存在肌萎縮蛋白而呈陽性染色之纖維百分比。包括注射後3及6個月的資料。槓上的字母指示下方資料與槓上有相同字母出現的其他槓無統計差異。相反地，槓上出現不同字母之槓彼此具有統計差異。統計使用ANOVA分析及Fisher's事後雙邊檢定計算。
圖40C提供來自增加劑量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體治療之Dmd mdx 大鼠及陰性對照的橫膈肌肉樣本隨機切片中存在結締組織而呈陽性染色之面積百分比。包括注射後3及6個月的資料。槓上的字母指示下方資料與槓上有相同字母出現的其他槓無統計差異。相反地，槓上出現不同字母之槓彼此具有統計差異。統計使用ANOVA分析及Fisher's事後雙邊檢定計算。
圖41A顯示採集自增加劑量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體治療之Dmd mdx 大鼠(上圖)及陰性對照(下圖)的距心尖三分之一處之心臟代表性橫切面，動物在注射後3個月及6個月犧牲。組織切片以苦味酸天狼星紅染色，以允許視覺化結締組織。中間圖含有自載體及媒劑處理Dmd mdx 大鼠採集且以特異性結合全長大鼠肌萎縮蛋白及人微小肌萎縮蛋白之抗體與染色結締組織之小麥胚芽凝集素接合物雙重標示之心肌代表性切片。
圖41B提供來自增加劑量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體治療之Dmd mdx 大鼠及陰性對照的心肌樣 本隨機切片中存在肌萎縮蛋白而染色之纖維百分比。包括注射後3及6個月的資料。槓上的字母指示下方資料與槓上有相同字母出現的其他槓無統計差異。相反地，槓上出現不同字母之槓彼此具有統計差異。統計使用ANOVA分析及Fisher's事後雙邊檢定計算。
圖41C提供來自增加劑量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體治療之Dmd mdx 大鼠及陰性對照的心肌樣本隨機切片中存在結締組織而染色之面積百分比。包括注射後3及6個月的資料。槓上的字母指示下方資料與槓上有相同字母出現的其他槓無統計差異。相反地，槓上出現不同字母之槓彼此具有統計差異。統計使用ANOVA分析及Fisher's事後雙邊檢定計算。
圖42A提供關於經增加劑量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體治療之Dmd mdx 大鼠相較於媒劑處理Dmd mdx 及WT大鼠，藉由重複五次相隔短暫的抓力強度測試所測量的肌肉疲勞資料。測試係於7至9週齡注射的大鼠之注射後3個月(或當大鼠約4.5月齡時)進行。圖形顯示在試驗1與5之間所測量的前肢抓力降低(表示為試驗1抓力百分比)。結果以平均值±SEM表示。統計比較經載體治療之Dmd mdx 大鼠與接受媒劑之WT大鼠(*p<0.05；***p<0.001)及接受媒劑之Dmd mdx 大鼠(¤¤p<0.01；¤¤¤p<0.001)，兩者皆作為陰性對照組。
圖42B提供關於經增加劑量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體治療之Dmd mdx 大鼠相較於媒劑處理 Dmd mdx 及WT大鼠，藉由重複五次相隔短暫的抓力強度測試所測量的肌肉疲勞資料。測試係於7至9週齡注射的大鼠之注射後6個月(或當大鼠約7.5月齡時)進行。圖形顯示在試驗1與5之間所測量的前肢抓力降低(表示為試驗1抓力百分比)。結果以平均值±SEM表示。
圖43提供投予媒劑或AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體之WT及Dmd mdx 大鼠在注射後6個月，以藉由M模式心臟超音波圖獲得的長軸影像在舒張期間所測量的左心室(LV)舒張末期直徑。敘述統計學顯示為平均值±SEM。
圖44提供投予媒劑或AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體之WT及Dmd mdx 大鼠在注射後6個月，以藉由M模式心臟超音波圖獲得的長軸影像在舒張期間所測量的射出率。敘述統計學顯示為平均值±SEM，且「$」符號指示在該符號下方的資料與媒劑(緩衝劑)處理Dmd mdx 大鼠的資料之間有統計顯著差異(p<0.05)。
圖45A提供投予媒劑或AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體之WT及Dmd mdx 大鼠在注射後3個月，使用脈衝式Doppler以心尖四腔定向所測量的E/A比例。敘述統計學顯示為平均值±SEM，且「*」符號指示在該符號下方的資料與媒劑(緩衝劑)處理WT大鼠的資料之間有統計顯著差異(p<0.05)。
圖45B提供投予媒劑或AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體之WT及Dmd mdx 大鼠在注射後6個月，使 用脈衝式Doppler以心尖四腔定向所測量的E/A比例。敘述統計學顯示為平均值±SEM，且「**」符號指示在該符號下方的資料與媒劑(緩衝劑)處理WT大鼠的資料之間有統計顯著差異(p<0.01)。
圖46A提供投予媒劑或AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體之WT及Dmd mdx 大鼠在注射後3個月，使用脈衝式Doppler以心尖四腔定向所測量的等容弛緩時間。敘述統計學顯示為平均值±SEM。
圖46B提供投予媒劑或AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體之WT及Dmd mdx 大鼠在注射後6個月，使用脈衝式Doppler以心尖四腔定向所測量的等容弛緩時間。敘述統計學顯示為平均值±SEM，且「$」符號指示在該符號下方的資料與媒劑(緩衝劑)處理Dmd mdx 大鼠的資料之間有統計顯著差異(p<0.05)。
圖47提供投予媒劑或AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體之WT及Dmd mdx 大鼠在注射後6個月，使用脈衝式Doppler以心尖四腔定向所測量的減速時間。敘述統計學顯示為平均值±SEM，且「*」符號指示在該符號下方的資料與媒劑(緩衝劑)處理WT大鼠的資料之間有統計顯著差異(p<0.05)。
圖48A顯示增加劑量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體在注射後3個月對Dmd mdx 大鼠血液AST水準的效應。結果以平均值±SEM表示。統計分析使用非參數Kruskal Wallis檢定及事後Dunn's多重比較檢定進行。統 計比較經載體治療之Dmd mdx 大鼠與作為陰性對照組之接受緩衝劑(媒劑)之WT大鼠(**p<0.01,*p<0.05)。
圖48B顯示不同劑量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體在注射後6個月對Dmd mdx 大鼠血液AST水準的效應。結果以平均值±SEM表示。統計分析使用非參數Kruskal Wallis檢定及事後Dunn's多重比較檢定進行。統計比較經載體治療之Dmd mdx 大鼠與作為陰性對照組之接受緩衝劑(媒劑)之WT大鼠(***p<0.001,**p<0.01)。
圖49A顯示不同劑量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體在注射後3個月對Dmd mdx 大鼠血液ALT水準的效應。結果以平均值±SEM表示。統計分析使用非參數Kruskal Wallis檢定及事後Dunn's多重比較檢定進行。統計比較經載體治療之Dmd mdx 大鼠，與作為陰性對照組之接受緩衝劑(媒劑)之WT大鼠(***p<0.001,*p<0.05)或接受緩衝劑之Dmd mdx 大鼠(##p<0.01,#p<0.05)。
圖49B顯示不同劑量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體在注射後6個月對Dmd mdx 大鼠血液ALT水準的效應。結果以平均值±SEM表示。統計分析使用非參數Kruskal Wallis檢定及事後Dunn's多重比較檢定進行。統計比較經載體治療之Dmd mdx 大鼠與作為陰性對照組之接受緩衝劑(媒劑)之WT大鼠(**p<0.01)。
圖50A顯示不同劑量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體在注射後3個月對Dmd mdx 大鼠血液LDH水準的效應。結果以平均值±SEM表示。統計分析使用非參 數Kruskal Wallis檢定及事後Dunn's多重比較檢定進行。統計比較經載體治療之Dmd mdx 大鼠，與作為陰性對照組之接受緩衝劑(媒劑)之WT大鼠(***p<0.001,**p<0.01)或接受緩衝劑之Dmd mdx 大鼠(#p<0.05)。
圖50B顯示不同劑量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體在注射後6個月對Dmd mdx 大鼠血液LDH水準的效應。結果以平均值±SEM表示。統計分析使用非參數Kruskal Wallis檢定及事後Dunn's多重比較檢定進行。統計比較經載體治療之Dmd mdx 大鼠與作為陰性對照組之接受緩衝劑(媒劑)之WT大鼠(**p<0.01)。
圖51A顯示不同劑量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體在注射後3個月對Dmd mdx 大鼠血液總肌胺酸激酶(CK)水準的效應。結果以平均值±SEM表示。統計分析使用非參數Kruskal Wallis檢定及事後Dunn's多重比較檢定進行。統計比較經載體治療之Dmd mdx 大鼠與接受緩衝劑(媒劑)之WT大鼠(**p<0.01)，或比較經3×1014vg/kg載體投藥之Dmd mdx 大鼠與接受緩衝劑或1×1013vg/kg載體之Dmd mdx 大鼠(##p<0.01)。
圖51B顯示不同劑量的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體在注射後6個月對Dmd mdx 大鼠血液總肌胺酸激酶(CK)水準的效應。結果以平均值±SEM表示。統計分析使用非參數Kruskal Wallis檢定及事後Dunn's多重比較檢定進行。統計比較經載體治療之Dmd mdx 大鼠與作為陰性對照組之接受緩衝劑(媒劑)之WT大鼠(***p<0.001, **p<0.01,*p<0.05)，或比較經3×1014vg/kg載體投藥之Dmd mdx 大鼠與接受1×1013vg/kg載體之Dmd mdx 大鼠($p<0.05)。
圖52A提供總肌胺酸激酶(CK)在媒劑或載體注射當天(D0)與注射後3個月後犧牲之間的演變。實心長條指示D0之資料，而斜線長條指示3個月之資料。結果以平均值±SEM表示。
圖52B提供總肌胺酸激酶(CK)在媒劑或載體注射當天(D0)與注射後6個月後犧牲之間的演變。實心長條指示D0之資料，而斜線長條指示6個月之資料。結果以平均值±SEM表示。
圖53A提供經1×1014vg/kg AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體治療之較年長Dmd mdx 大鼠相較於媒劑處理之Dmd mdx 及WT大鼠的平均絕對最大前肢抓力強度。測試係於4月齡注射的大鼠之注射後3個月(或當大鼠約7月齡時)進行。結果以平均值±SEM表示。統計比較經載體治療之Dmd mdx 大鼠與經媒劑處理之Dmd mdx 大鼠(*p<0.01)。
圖53B提供經1×1014vg/kg AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體治療之較年長Dmd mdx 大鼠相較於媒劑處理之Dmd mdx 及WT大鼠的平均最大前肢抓力強度(相對於體重)。測試係於4月齡注射的大鼠之注射後3個月(或當大鼠約7月齡時)進行。結果以平均值±SEM表示。統計比較經載體治療之Dmd mdx 大鼠與經媒劑處理之Dmd mdx 大鼠(*p<0.01)。
圖53C顯示經1×1014vg/kg AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體治療之較年長Dmd mdx 大鼠相較於媒劑處理之Dmd mdx 及WT大鼠的前肢抓力演變(作為肌肉疲勞的量度)。測試藉由測量平均最大抓力5次進行，每次試驗之間間隔短暫。測試係於4月齡注射的大鼠之注射後3個月(或當大鼠約7月齡時)進行。結果相對於體重提供且提供為平均值±SEM。統計比較經載體治療之Dmd mdx 大鼠與接受媒劑之WT大鼠(*p<0.05)及接受媒劑之Dmd mdx 大鼠(¤¤p<0.01)，並在媒劑處理Dmd mdx 大鼠中比較後面的試驗與試驗1(§§p<0.01,§§§p<0.001)。
圖54A提供經1×1014vg/kg AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體治療之較年長Dmd mdx 大鼠相較於媒劑處理之Dmd mdx 及WT大鼠的平均絕對最大前肢抓力強度。測試係於6月齡注射的大鼠之注射後3個月(或當大鼠約9月齡時)進行。結果以平均值±SEM表示。統計比較經媒劑處理之Dmd mdx 大鼠與經媒劑處理之WT大鼠(**p<0.01)。
圖54B提供經1×1014vg/kg AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體治療之較年長Dmd mdx 大鼠相較於媒劑處理之Dmd mdx 及WT大鼠的平均最大前肢抓力強度(相對於體重)。測試係於6月齡注射的大鼠之注射後3個月(或當大鼠約9月齡時)進行。結果以平均值±SEM表示。統計比較經媒劑處理之Dmd mdx 大鼠與經媒劑處理之WT大鼠(*p<0.05)或經載體治療之Dmd mdx 大鼠與經媒劑處理之Dmd mdx 大鼠(¤p<0.05)。
圖54C顯示經1×1014vg/kg AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體治療之較年長Dmd mdx 大鼠相較於媒劑處理之Dmd mdx 及WT大鼠的前肢抓力演變(作為肌肉疲勞的量度)。測試藉由測量平均最大抓力5次進行，每次試驗之間間隔短暫。測試係於6月齡注射的大鼠之注射後3個月(或當大鼠約9月齡時)進行。結果相對於體重提供且提供為平均值±SEM。統計比較經載體治療之Dmd mdx 大鼠與接受媒劑之Dmd mdx 大鼠(¤p<0.05)，經媒劑處理之Dmd mdx 大鼠與接受媒劑之WT大鼠(**p<0.01,***p<0.001)，以及媒劑治療Dmd mdx 大鼠的試驗5與試驗1(§§p<0.01)。
圖55A至55C提供微小肌萎縮蛋白△3990的胺基酸序列(SEQ ID NO：27)與微小肌萎縮蛋白Dys3978的胺基酸序列(SEQ ID NO：7)之間的比對。
圖56A至56I提供編碼微小肌萎縮蛋白△3990之核酸序列(SEQ ID NO：28)(其係源自編碼人類肌萎縮蛋白之野生型核酸序列)與編碼微小肌萎縮蛋白Dys3978之人類密碼子最佳化核酸序列(稱為Hopti-Dys3978；SEQ ID NO：1)之間的比對。
本發明現將參照顯示本發明之較佳實施例之隨附圖式說明。然而，本發明可能以不同形式實施，且不應解讀為限制在本文中闡述之實施例。相反地，這些實施例是為了本揭露之詳盡及完整而提供，且將完整表達本發 明之範圍給所屬技術領域中具有通常知識者。
除非另行定義，此處所使用之所有技術及科學用語和本發明所屬領域之一般技藝人士所通常瞭解之意義相同。本文之發明說明中所使用之用語僅係為了說明具體實施例，而無意加以限制本發明。所有此處所提及之公開資料、專利申請案、專利及其他參考文獻係以參照方式被整體納入。
核苷酸序列在本文中僅以單股表示，自左至右為5'至3'的方向，除非另行具體指示。核苷酸及胺基酸在本文中依照IUPAC-IUB生化命名委員會建議之方式表示，或(就胺基酸而言)以單字母代碼或三字母代碼(二者皆根據37 CFR §1.822及已建立之用法)表示。見例如PatentIn User Manual,99-102(Nov.1990)(美國專利商標局)。
除非另有指示，可使用所屬技術領域中具有通常知識者已知之標準方法建構重組小病毒及AAV(rAAV)建構體、表現小病毒Rep及/或Cap序列之包裝載體及經暫時及穩定轉染之包裝細胞。該等技術為所屬技術領域中具有通常知識者已知。見例如SAMBROOK et al.,MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL 2nd Ed.(Cold Spring Harbor,NY,1989)；AUSUBEL et al.,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Green Publishing Associates,Inc.and John Wiley & Sons,Inc.,New York)。
另外，本發明亦考慮到在本發明之一些實施例中，任何在本文中闡述之特徵或特徵之組合可經排除或省略。
為了進一步說明，舉例來說，如果說明書指示一特定胺基酸可選自A、G、I、L及/或V，此文字亦指示胺基酸可選自這些胺基酸的任何子群，例如A、G、I或L；A、G、I或V；A或G；僅L；等，如同各種該等子組合經明白闡述在本文中。另外，該文字亦指示一或多個指定胺基酸可經排除(disclaimed)。例如，在具體實施例中，胺基酸不是A、G或I；不是A；不是G或V；等，如同各種該等可能的排除者經明白闡述在本文中。
定義
下列用語用於本文之說明及隨附申請專利範圍中。
單數形式「一(a及an)」意欲同時包括複數形式，除非上下文另行清楚指示。
另外，如本文中所使用之用語「約(about)」當指稱可測量數值諸如多核苷酸或多肽序列的長度、劑量、時間、溫度及類似的量時，意欲包含該指定量之20%、10%、5%、1%、0.5%或甚至0.1%的變異。
亦如本文中所使用，「及/或(and/or)」係指且包含一或多個相關列示項目之任何及所有可能的組合，以及當解讀為替代性(「或」)時不包含組合。
如本文中所使用，用語「腺病毒相關病毒(adeno-associated virus)」(AAV)包括但不限於AAV 1型(AAV1)、AAV 2型(AAV2)、AAV 3型(AAV3，包括3A型及3B型)、AAV 4型(AAV4)、AAV 5型(AAV5)、AAV 6型(AAV6)、AAV 7型(AAV7)、AAV 8型(AAV8)、AAV 9型(AAV9)、AAV 10型(AAV10)、AAV 11型(AAV11)、AAV 12型(AAV12)、AAV 13型(AAV13)、禽AAV ATCC VR-865、禽AAV病毒株DA-1、Bb1、Bb2、Ch5、Cy2、Cy3、Cy4、Cy5、Cy6、Hu1、Hu10、Hu11、Hu13、Hu15、Hu16、Hu17、Hu18、Hu19、Hu2、Hu20、Hu21、Hu22、Hu23、Hu24、Hu25、Hu26、Hu27、Hu28、Hu29、Hu3、Hu31、Hu32、Hu34、Hu35、Hu37、Hu39、Hu4、Hu40、Hu41、Hu42、Hu43、Hu44、Hu45、Hu46、Hu47、Hu48、Hu49、Hu51、Hu52、Hu53、Hu54、Hu55、Hu56、Hu57、Hu58、Hu6、Hu60、Hu61、Hu63、Hu64、Hu66、Hu67、Hu7、Hu9、HuLG15、HuS17、HuT17、HuT32、HuT40、HuT41、HuT70、HuT71、HuT88、Pi1、Pi2、Pi3、Rh1、Rh10、Rh13、Rh2、Rh25、Rh32、Rh33、Rh34、Rh35、Rh36、Rh37、Rh38、Rh40、Rh43、Rh48、Rh49、Rh50、Rh51、Rh52、Rh53、Rh54、Rh55、Rh57、Rh58、Rh61、Rh62、Rh64、Rh74、Rh8、蛇AAV、禽AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、綿羊AAV、山羊AAV、蝦AAV、AAV1.1、AAV2.5、AAV6.1、AAV6.3.1、AAV9.45、RHM4-1(WO 2015/013313之SEQ ID NO：5)、AAV2-TT、AAV2-TT-S312N、AAV3B-S312N、AAV-LK03及任何其他現在已知或稍後發現之AAV。見例如Fields et al.,VIROLOGY,volume 2,chapter 69(4th ed.,Lippincott-Raven Publishers)。殼體可源自一些揭示於下列之AAV血清型：美國專利第7,906,111號；Gao et al.,2004,J.Virol.78：6381；Moris et al.,2004,Virol.33：375；WO 2013/063379；WO 2014/194132；且包括揭示於WO 2015/121501之真實型(true type)AAV(AAV-TT)變體、及揭示於WO 2015/013313之RHM4-1、RHM15-1至RHM15-6及其變體，且所屬技術領域中具有通常知識者將了解可能有其他尚未識別之變體可進行相同或類似功能，或可包括源自二或更多個AAV殼體之組分。AAV cap蛋白質之全集包括VP1、VP2及VP3。包含編碼AAV殼體蛋白質之核苷酸序列的開放閱讀框可包含少於全集AAV cap蛋白質或可提供AAV cap蛋白質之全集。
及任何其他現在已知或稍後發現之AAV。見例如FIELDS et al.,VIROLOGY,volume 2,chapter 69(4th ed.,Lippincott-Raven Publishers)。一些相當新的AAV血清型及分支已被識別(見例如Gao et al.,(2004)J.Virol.78：6381；Moris et al.,(2004)Virol.33-：375)。
AAV是一種小型的無外膜病毒，具有直徑約20至30nm之二十面體殼體。AAV無法在沒有來自其他病毒(例如腺病毒、單純疱疹病毒、牛痘病毒及人類乳突病毒)的所謂幫手蛋白之幫忙下複製，所以被歸類為小病毒 科(parvoviridae)中的一個特別的屬，稱為依賴病毒(dependovirus)(因為它們依賴其他病毒來複製)。雖然已發現許多不同AAV血清型，且許多人產生對抗一或多個AAV血清型的抗體(暗示AAV感染的普遍歷史)，但無已知疾病係由AAV造成，暗示AAV在人類無致病性。
雖然已發現許多不同AAV血清型，但其中最廣為表徵之一係AAV2，下列AAV生物學的討論即著重於一些關於AAV2所習得者。其他AAV血清型的生命週期一般相信是類似的，雖然細節可能有所差異。AAV2或任何其他AAV血清型感染細胞及在細胞中複製的具體細節之提供，僅為了幫助了解在本文中揭示之本發明，絕非意欲以任何方式限制本發明之範圍。即使其中一些資訊在稍後被發現為不正確或不完全的，也不應被解讀為否定在本文中揭示及主張權利之本發明的利用或實行性。有關AAV生命週期的進一步資訊可見M.Goncalves,Virol J 2：43(2005)、MD Weitzman and RM Linden,Adeno-Associated Virus Biology,Ch.1,pp.1-23,Adeno-Associated Virus Methods and Protocols,Ed.RO Snyder and P Moullier,Humana Press(2011)、GE Berry and A Asokan,Curr Opin Virol 21：54-60(2016)及其中引用之參考文獻。
野生型AAV2之基因體係長度約4.7千鹼基之線性DNA。雖然大部分皆為單股，但基因體的5'端及3'端係由所謂的反向末端重複(ITR)組成，各為145個鹼基對長且含有經由典型Watson-Crick鹼基配對自我黏合以形成T型 髮夾結構之迴文序列。這些結構之一含有游離3'羥基，其依賴細胞性DNA聚合酶，經由自動起始鏈替代(self-priming strand-displacement)機制，允許病毒DNA複製之起始。見例如M.Goncalves,Adeno-associated virus：from defective virus to effective vector,Virology J 2：43(2005)。由於單股病毒基因體複製的機制及接著在經感染之細胞中被包裝至殼體中，正股(正義或編碼股)及負股(反義或非編碼股)以相等效率包裝至不同顆粒中。
除了側接的ITRs以外，野生型AAV2基因體含有二個基因rep及cap，經由有效使用選擇性啟動子及剪接，分別編碼四個複製蛋白質(Rep 78、Rep 68、Rep 52及Rep 40)及三個殼體蛋白質(VP1、VP2及VP3)。大型複製蛋白質Rep 78及68係多功能性且在AAV轉錄、病毒DNA複製及定點整合病毒基因體至人類染色體19上發揮作用。較小的Rep蛋白質與在感染細胞核中將病毒基因體包裝至病毒殼體有關。三個殼體蛋白質經由選擇性剪接與使用選擇性轉譯起始點之組合生產，以使所有三個蛋白質共用彼等之羧基端的序列，但VP2包括VP3所沒有的額外胺基端序列，且VP1包括VP2及VP3所沒有的額外胺基端序列。估計殼體含有總計60個大約1：1：10之VP1：VP2：VP3化學計量的殼體蛋白質，雖然這些比例可明顯變化。
儘管其大小及因而其攜帶異源性基因的能力相對較小，但AAV已被識別為基因療法的領導病毒載體。使用AAV相較於其他提議作為基因療法載體之病毒的優 點，包括AAV支持轉導細胞長期基因表現、轉導分裂及非分裂細胞、根據血清型轉導各式各樣的不同類型細胞、無幫手病毒即無法複製、及明顯缺乏野生型感染相關致病性的能力。
由於彼等的大小較小，AAV殼體實際上可容納最多約4.7至5.0千鹼基長度的單股DNA基因體。若沒有修飾基因體，將沒有足夠空間可包括異源性基因，諸如治療蛋白質的編碼序列及基因調節元件諸如啟動子及可選地增強子。為了產生更多空間，rep及cap基因可經移除並以所欲之異源性序列代替，只要仍保留側接ITR即可。Rep及cap基因的功能可反式(in trans)提供在不同的DNA上。對比之下，ITR是唯一必須與異源性序列順式(in cis)保留的AAV病毒元件。組合ITR與異源性基因並移除rep及cap基因至缺乏ITR的不同質體亦防止在生產用於基因療法之AAV載體的同時生產了具傳染性的野生型AAV。移除rep及cap也表示用於基因療法之AAV載體無法在其轉導之細胞中複製。
在一些實施例中，AAV載體之基因體係側接AAV ITR之線性單股DNA。在其可支持異源性基因的轉錄及轉譯之前，單股DNA基因體必須藉由細胞性DNA聚合酶轉換成雙股形式，該聚合酶利用自動起始ITR之一的游離3′-OH以起始第二股合成。在替代實施例中，相反極性之全長單股基因體可黏合以產生全長雙股基因體，且當複數個攜帶相反極性之基因體的AAV載體同時轉導相同細胞時 可導致。在雙股載體基因體藉由不論何種機制形成後，細胞性基因轉錄機制可作用在該雙股DNA上以表現異源性基因。
在其他實施例中，載體基因體可設計為自我互補性(scAAV)，其在各端具有野生型ITR且在中間具有突變ITR。見例如McCarty,DM,et al.,Adeno-associated virus terminal repeat(TR)mutant generates self-complementary vectors to overcome the rate-limiting step to transduction in vivo.Gene Ther.10：2112-18(2003)。已有建議指出，在進入細胞後，自我互補AAV基因體可從中間的ITR開始自我黏合以形成雙股基因體，無須重新進行DNA複製。此方式顯示導致更有效率的轉導及更快表現異源性基因，但減少可使用之異源性基因的大小大約一半。
已發展用於生產基因療法之AAV載體的不同策略，但最常見的一種係三重轉染技術，其中將三種不同的質體轉染至生產細胞。見例如N.Clement and J.Grieger,Mol Ther Methds Clin Dev,3：16002(2016),Grieger,JC,et al.,Mol Ther 24(2)：287-97(2016)及其中引用之參考文獻。在此技術中，產生包括載體基因體之序列(包括例如異源性啟動子及可選地增強子)及側接左ITR及右ITR之異源性基因以表現所欲RNA或蛋白質之質體。載體質體將與含有rep及cap基因之第二質體及含有複製及包裝載體基因體至AAV殼體所需之腺病毒(或其他病毒)幫手基因之第三質體共轉染至生產細胞諸如HEK293細 胞。在該技術之替代實施例中，rep、cap及腺病毒幫手基因皆位於相同質體上，並將二個質體共轉染至生產細胞。腺病毒幫手基因之實例包括E1a、E1b、E2a、E4orf6及VA RNA基因。對許多AAV血清型而言，AAV2 ITR可取代天然ITR而不顯著損害載體基因體複製及包裝至非AAV2殼體的能力。此方式稱為假型(pseudo-typing)，僅需要使用含有來自其他血清型之rep及cap基因的rep/cap質體。因此，舉例來說，AAV基因療法載體可使用AAV9殼體及含有AAV2 ITR側接異源性基因諸如微小肌萎縮蛋白之載體基因體(其可被指定為「AAV2/9」)。在AAV顆粒藉由細胞生產之後，可使用所屬技術領域中已知之標準技術將其收集及純化，諸如在CsCl梯度中超離心或使用各種類型的層析管柱。
本發明之小病毒顆粒及基因體可來自但不限於AAV。各種AAV血清型及自主性小病毒之基因體序列以及天然ITR、Rep蛋白質及殼體次單位之序列係所屬技術領域中已知。該等序列可見文獻或公眾資料庫諸如GenBank。見例如GenBank編號NC_002077、NC_001401、NC_001729、NC_001863、NC_001829、NC_001862、NC_000883、NC_001701、NC_001510、NC_006152、NC_006261、AF063497、U89790、AF043303、AF028705、AF028704、J02275、J01901、J02275、X01457、AF288061、AH009962、AY028226、AY028223、AY631966、AX753250、EU285562、 NC_001358、NC_001540、AF513851、AF513852及AY530579；其揭露以引用方式併入本文中以教示小病毒及AAV核酸及胺基酸序列。亦見例如Bantel-Schaal et al.,(1999)J.Virol.73：939；Chiorini et al.,(1997)J.Virol.71：6823；Chiorini et al.,(1999)J.Virol.73：1309；Gao et al.,(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 99：11854；Moris et al.,(2004)Virol.33-：375-383；Mori et al.,(2004)Virol.330：375；Muramatsu et al.,(1996)Virol.221：208；Ruffing et al.,(1994)J.Gen.Virol.75：3385；Rutledge et al.,(1998)J.Virol.72：309；Schmidt et al.,(2008)J.Virol.82：8911；Shade et al.,(1986)J.Virol.58：921；Srivastava et al.,(1983)J.Virol.45：555；Xiao et al.,(1999)J.Virol.73：3994；國際專利公開案WO 00/28061、WO 99/61601、WO 98/11244；及美國專利第6,156,303號；其揭露以引用方式併入本文中以教示小病毒及AAV核酸及胺基酸序列。來自AAV1、AAV2及AAV3之ITR序列係由Xiao,X.,(1996),“Characterization of Adeno-associated virus(AAV)DNA replication and integration,”Ph.D.Dissertation,University of Pittsburgh,Pittsburgh,PA提供(全文併入本文中)。
如本文中所使用，以AAV「轉導(transduction)」細胞係指AAV媒介轉移基因材料至細胞中。見例如FIELDS et al.,VIROLOGY,volume 2,chapter 69(3d ed.,Lippincott-Raven Publishers)。
用語「5′部分」及「3′部分」係定義二或更多個元件之間的空間關係的相對用語。因此，舉例來說，多核苷酸之「3′部分」指示在另一區段下游之多核苷酸區段。用語「3′部分」並非意欲指示區段必然位於多核苷酸之3′端，或甚至必定位於多核苷酸之3′半體(half)，雖然有可能。同樣地，多核苷酸之「5′部分」指示在另一區段上游之多核苷酸區段。用語「5′部分」並非意欲指示區段必然位於多核苷酸之5′端，或甚至必定位於多核苷酸之5′半體(half)，雖然有可能。
如本文中所使用，用語「多肽(polypeptide)」包含肽及蛋白質兩者，除非另有指示。
「多核苷酸(polynucleotide)」係核苷酸的線性序列，其中各單體單元的3′-位置與相鄰單體單元的5′-位置經由磷酸基團連結。多核苷酸可為RNA(僅含RNA核苷酸)、DNA(僅含DNA核苷酸)、RNA及DNA雜交物(含有RNA及DNA核苷酸)以及其他含有天然發生及/或非天然發生核苷酸之雜交物。多核苷酸中之核苷酸之鹼基的線性順序稱為「核苷酸序列(nucleotide sequence)」、「核酸序列(nucleic acid sequence)」、「核鹼基序列(nucleobase sequence)」或有時僅稱為多核苷酸的「序列(sequence)」。一般而言，鹼基順序係自多核苷酸之5′端開始提供，並終於多核苷酸之3′端。如所屬技術領域中已知，多核苷酸可採二級結構，諸如自我互補區域。多核苷酸亦可經由典型Watson-Crick鹼基配對或其他所屬技術領 域中具有通常知識者熟悉之機制與完全或部分互補之多核苷酸雜交。
如本文中所使用，「基因(gene)」係一段編碼多肽或蛋白質之多核苷酸，一般但不必然是DNA。在一些實施例中，基因可被內含子中斷。在一些實施例中，由於諸如選擇性剪接之機制、使用替代性起始密碼子、或其他所屬技術領域中具有通常知識者熟悉之生物機制，多核苷酸可編碼超過一種多肽或蛋白質。用語「開放閱讀框(open reading frame)」(縮寫成「ORF」)係指編碼多肽或蛋白質之多核苷酸部分。
如本文中所使用之用語「密碼子最佳化(codon-optimized)」係指藉由以相同(同義)胺基酸之密碼子取代一或多個正常存在於編碼序列(例如野生型序列，包括例如肌萎縮蛋白或微小肌萎縮蛋白之編碼序列)中之密碼子進行最佳化，以增加表現之基因編碼序列。在此方式中，由基因編碼之蛋白質完全相同，但基因或對應mRNA之實際核鹼基序列不同。在一些實施例中，最佳化用較常發生的同義密碼子取代一或多個罕見密碼子(也就是相對不常在來自特定物種之細胞中發生的tRNA之密碼子)以改善轉譯效率。例如，在人類密碼子最佳化中，一或多個在編碼序列中之密碼子被在人類細胞中較常發生之相同胺基酸之密碼子代替。密碼子最佳化亦可經由其他可改善轉錄及/或轉譯效率之機制增加基因表現。策略包括(但不限於)增加總GC含量(也就是鳥嘌呤及胞嘧啶在 整個編碼序列中之百分比)、降低CpG含量(也就是編碼序列中CG或GC二核苷酸之數量)、移除隱匿剪接供體或受體位點及/或添加或移除核糖體進入位點諸如Kozak序列。所欲的是，密碼子最佳化基因展現改善的蛋白質表現，例如相較於野生型基因在其他方面類似之細胞中所提供之蛋白質表現水準，藉此編碼之蛋白質以可偵測地較高水準在細胞中表現。
如本文中所使用之用語「序列同一性(sequence identity)」具有所屬技術領域中之標準意義。如所屬技術領域中已知，一些不同程式可用於識別多核苷酸或多肽是否與已知序列具有序列同一性或類似性。序列同一性或類似性可使用所屬技術領域中已知之標準技術判定，包括但不限於Smith & Waterman,Adv.Appl.Math.2：482(1981)之局部序列同一性演算法、Needleman & Wunsch,J.Mol.Biol.48：443(1970)之序列同一性排比演算法、Pearson & Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)之搜尋類似性方法、這些演算法的電腦化實施(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,WI中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)、Devereux et al.,Nucl.Acid Res.12：387(1984)所描述之Best Fit序列程式(較佳地使用內建設定)、或藉由目視檢查。
有用演算法之實例係PILEUP。PILEUP使用進行性成對排比，自一群相關序列產生多個序列排比。其亦 可作樹狀圖，顯示用於產生排比之叢集關係。PILEUP使用簡化的Feng & Doolittle,J.Mol.Evol.35 ：351(1987)進行性排比方法；該方法類似於Higgins & Sharp,CABIOS 5：151(1989)所述。
另一個有用演算法之實例係BLAST演算法，描述於Altschul et al.,J.Mol.Biol.215：403(1990)及Karlin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 ：5873(1993)。一個特別有用的BLAST程式係獲自Altschul et al.,Meth.Enzymol.,266 ：460(1996)；blast.wustl/edu/blast/README.html之WU-BLAST-2程式。WU-BLAST-2使用數個搜尋參數，該等參數較佳地設定為內建數值。參數係動態數值且由程式本身依據特定序列之組成及受到關注之序列所搜尋之特定資料庫之組成建立；然而，數值可經調整以增加敏感性。
另一個有用的演算法係如Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25 ：3389(1997)所報告之缺口BLAST。
胺基酸序列同一性百分比數值係藉由將匹配的同一性殘基數量除以排比區域中「較長」序列的殘基總數量判定。「較長」序列係指具有排比區域最真實殘基之序列(忽略由WU-Blast-2導入以最大化排比分數的缺口)。
以類似方式，核酸序列同一性百分比係定義為在候選序列中與本文中具體揭示之多核苷酸中的核苷酸同一之核苷酸殘基的百分比。
排比可包括在欲排比序列中導入缺口。此外，對於相較於在本文中具體揭示之多核苷酸含有較多或較少核苷酸之序列，應理解在一實施例中，序列同一性百分比將基於同一性核苷酸之數量相對於核苷酸總數判定。因此舉例來說，在一實施例中，比在本文中具體揭示之序列短的序列之序列同一性，將使用較短序列中之核苷酸的數量判定。在同一性百分比計算中，不指定相對權重給各種序列變異表現，諸如插入、刪除、取代等。
在一實施例中，只有同一性給正分(+1)且所有形式的序列變異包括缺口給「0」的數值，其排除如下所述之用於序列類似性計算之權重表或參數的需求。序列百分比同一性可藉由例如將匹配的同一性殘基數量除以排比區域中「較短」序列的殘基總數量並乘以100計算。「較長」序列係在排比區域具有最實際殘基之序列。
當指稱核酸或其片段時，「實質同源性(Substantial homology)」或「實質類似性(substantial similarity)」意指當經適當核苷酸插入或刪除與另一核酸(或其互補股)最佳排比時，指示該序列有至少約95至99%的核苷酸序列同一性。
如本文中所使用，「單離(isolated)」多核苷酸(例如「單離DNA」或「單離RNA」)意指多核苷酸與至少一些天然發生有機體或病毒的其他組分分離或實質上不含至少一些天然發生有機體或病毒的其他組分，例如，細胞或病毒結構組分或經常發現與多核苷酸相關之其他多 肽或核酸。
同樣地，「單離」多肽意指多肽與至少一些天然發生有機體或病毒的其他組分分離或實質上不含至少一些天然發生有機體或病毒的其他組分，例如，細胞或病毒結構組分或經常發現與多肽相關之其他多肽或核酸。
「治療多肽(therapeutic polypeptide)」係可減輕或減少在細胞或個體中因蛋白質缺乏或缺損所導致之症狀的多肽。替代地，「治療多肽」以其他方式授予益處給個體，例如抗癌效應或改善移植存活性。
如本文中所使用，用語「修飾(modified)」當應用於多核苷酸或多肽序列時，係指因一或多個刪除、添加、取代或其任何組合而與野生型序列不同的序列。
如本文中所使用，所謂「單離(isolate)」或「純化(purify)」(或文法等效物)病毒載體，意指病毒載體係至少部分地與起始材料中之至少一些其他組分分離。
用語「治療(treat、treating或treatment of)」(及其文法變異物)意指個體之病況的嚴重性係經減少、至少部分改善或穩定及/或至少一個臨床症狀達成一些減輕、減緩、降低或穩定及/或疾病或病症的進展延緩。
用語「預防(prevent、preventing及prevention)」(及其文法變異物)係指相對於沒有本發明之方法時將會發生的情況，預防及/或延緩個體中之疾病、病症及/或臨床症狀的開始及/或減少疾病、病症及/或臨床症狀的開始 的嚴重性。預防可為完全，例如完全沒有疾病、病症及/或臨床症狀。預防亦可為部分，以使個體中之疾病、病症及/或臨床症狀的發生及/或開始的嚴重性小於沒有本發明時將會發生的情況。
如本文中所使用之「治療有效(treatment effective)」量係足以提供一些改善或益處給個體的量。換句話說，「治療有效」量係將提供一些減輕、減緩、降低或穩定個體中之至少一個症狀的量。所屬技術領域中具有通常知識者將理解，治療效應不需為完全或治癒，只要有一些益處提供給個體。
如本文中所使用之「預防有效(prevention effective)」量係指相對於沒有本發明之方法時將會發生的情況，足以預防及/或延緩個體中之疾病、病症及/或臨床症狀的開始及/或減少及/或延緩個體中之疾病、病症及/或臨床症狀的開始的嚴重性的量。所屬技術領域中具有通常知識者將理解，預防程度不需為完全，只要有一些益處提供給個體。
用語「異源性(heterologous)」或「外源性(exogenous)」核苷酸或核酸序列在本文中可互換使用，且係指非天然發生於病毒或細胞中之核酸序列。在一些實施例中，異源性核酸包含編碼受到關注之多肽或非轉譯RNA(例如用於遞送至細胞或個體)之開放閱讀框。
如本文中所使用，用語「病毒載體(virus vector、viral vector)」、「基因遞送載體(gene delivery vector)」或有時僅「載體(vector)」係指具有核酸遞送媒劑之功能的病毒粒子或病毒顆粒且其包含包裝在該病毒粒子或病毒顆粒內之載體基因體。載體可具傳染性或不具傳染性。不具傳染性載體在無外源性添加因子下無法自行複製。載體可為AAV顆粒病毒粒子，包含其內包裝AAV載體基因體之AAV殼體。這些載體亦可在本文中稱為「重組AAV(recombinant AAV)」(縮寫成「rAAV」)載體、顆粒或病毒粒子。
載體基因體係用於包裝在載體顆粒或病毒粒子內以供遞送至細胞(該細胞可稱為「目標細胞(target cell)」)中之多核苷酸。一般而言，載體基因體經工程改造以含有用於遞送至目標細胞中之異源性核酸序列諸如基因。載體基因體亦可含有一或多個作用為調節元件以控制異源性基因在目標細胞中之表現的核酸序列。載體基因體亦可含有載體生產及/或功能諸如但不限於載體基因體在宿主中複製及包裝成載體顆粒所需的野生型或經修飾病毒核酸序列。在一些實施例中，載體基因體係「AAV載體基因體(AAV vector genome)」，其能夠被包裝至AAV殼體中。在一些實施例中，AAV載體基因體包括一或二個與異源性基因順式的反向末端重複(ITR)以支持複製及包裝。所有AAV載體生產所需的其他結構性及非結構性蛋白質編碼序列可以反式提供(例如來自質體或將序列穩定整合至宿主細胞中)。在某些實施例中，AAV載體基因體包含至少一個ITR(例如AAV ITR)、可選地二個ITR(例如二個 AAV ITR)，彼等一般將位於載體基因體的5′端及3′端且側接異源性核酸序列，但不需要與其緊鄰。ITR可彼此相同或不同，且來自相同或不同AAV血清型。
用語「宿主細胞(host cell)」、「宿主細胞系(host cell line)」及「宿主細胞培養(host cell culture)」可互換使用，且係指其中導入外源性核酸之細胞，包括該細胞之子代。宿主細胞包括「轉形物(transformant)」、「轉形細胞(transformed cell)」及「轉導細胞(transduced cell)」，其包括初代轉形細胞及源自該細胞之不論繼代次數的子代。為達生產AAV載體之目的，某些宿主細胞可被用來作為含有組裝功能性病毒顆粒所需的所有基因包括殼體及載體基因體的「生產(producer)」或「包裝(packaging)」細胞。如所屬技術領域中具有通常知識者理解的，不同宿主細胞可有用地作為生產細胞，諸如HEK293細胞或Pro10細胞系，但其他也可能。病毒粒子組裝之所需基因包括在本文中他處描述之載體基因體、AAV rep及cap基因及某些來自其他病毒包括但不限於腺病毒之幫手基因。如所屬技術領域中具有通常知識者理解的，AAV生產之必需基因可以各種方式導入生產細胞中，包括但不限於轉染一或多個質體，然而，某些基因可經整合至基因體中或攜帶在游離基因體上而已經存在生產細胞中。
用語「反向末端重複(inverted terminal repeat)」或「ITR」包括任何形成髮夾結構且具有反向末端重複之功能(即媒介某些病毒功能諸如複製、病毒包 裝、整合及/或原病毒救援、及類似者)的迴文病毒末端重複或合成序列。ITR可為AAV ITR或非AAV ITR。例如，非AAV ITR序列諸如該些其他小病毒者(例如犬小病毒、牛小病毒、小鼠小病毒、豬小病毒、人類小病毒B-19)或作為SV40複製來源之SV40髮夾可用來作為ITR，其可經進一步截短、取代、刪除、插入及/或添加之修飾。另外，ITR可為部分或完全合成，諸如美國專利第5,478,745號(Samulski et al)中所述之「雙D序列(double-D sequence)」。亦見FIELDS et al.,VIROLOGY,volume 2,chapters 69 & 70(4th ed.,Lippincott-Raven Publishers)。
「AAV反向末端重複(AAV inverted terminal repeat)」或「AAV ITR」可來自任何AAV，包括但不限於血清型1、2、3a、3b、4、5、6、7、8、9、10、11或13、蛇AAV、禽AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、綿羊AAV、山羊AAV、蝦AAV或任何其他現在已知或稍後發現之AAV。AAV ITR不需要具有天然末端重複序列(例如天然AAV ITR序列可藉由插入、刪除、截短及/或錯義突變改變)，只要末端重複媒介所欲功能，例如複製、病毒包裝、持續性及/或原病毒救援、及類似者。AAV2 ITR之序列係145個鹼基對長，且係本文提供之SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15。
「順式模體(Cis-motif)」包括保守序列，諸如在基因體序列末端或附近發現且識別為複製起點之序列；可能用於轉錄起始、剪接或終止的在內部位置之隱匿啟動 子或序列。
關於序列經其他元件側接，「側接(Flanked)」指示相對於該序列的上游及/或下游(即5'及/或3')存在一或多個側接元件。用語「側接」並非意欲指示序列必然為緊鄰。例如，編碼轉殖基因的核酸與側接元件之間可能有介入序列。經二個其他元件(例如TR)側接的序列(例如轉殖基因)指示一個元件位於該序列的5'且另一個元件位於該序列的3'；然而，在之間可能有介入序列。
「轉染(Transfection)」細胞意指將遺傳物質導入細胞中以達基因改造細胞之目的。轉染可藉由多種所屬技術領域中已知之手段達成，諸如磷酸鈣、聚乙亞胺、電穿孔及類似者。
「基因轉移(Gene transfer)」或「基因遞送(gene delivery)」係指用於可靠地將外來DNA插入宿主細胞中之方法或系統。該等方法可導致暫時表現非整合轉移DNA、染色體外複製及表現轉移複製子(例如游離基因體)、或整合轉移遺傳物質至宿主細胞的基因體DNA中。
「轉殖基因(Transgene)」係用於表示任何併入載體(包括病毒載體)中以供遞送至及表現於目標細胞(在本文中亦稱為「宿主細胞(host cell)」)之異源性核苷酸序列，且包括相關表現控制序列諸如啟動子。所屬技術領域中具有通常知識者理解表現控制序列將基於在目標細胞中促進轉殖基因之表現的能力選擇。轉殖基因之實例 係編碼治療多肽之核酸。
本發明之病毒載體可進一步為「靶向性(targeted)」病毒載體(例如具有指向趨性)及/或「雜交(hybrid)」小病毒(即其中病毒ITR及病毒殼體係來自不同小病毒)，如國際專利公開號WO 00/28004及Chao et al.,(2000)Mol.Therapy 2：619中所述。
另外，病毒殼體或基因體元件可含有其他修飾，包括插入、刪除及/或取代。
如本文中所使用，小病毒或AAV「Rep編碼序列」指示編碼媒介病毒複製及新病毒顆粒生產之小病毒或AAV非結構性蛋白質的核酸序列。小病毒及AAV複製基因及蛋白質已描述於例如FIELDS et al.,VIROLOGY,volume 2,chapters 69 & 70(4th ed.,Lippincott-Raven Publishers)。
「Rep編碼序列」不需要編碼所有小病毒或AAV Rep蛋白質。例如，關於AAV，Rep編碼序列不需要編碼所有四種AAV Rep蛋白質(Rep78、Rep 68、Rep52及Rep40)，事實上，據信AAV5僅表現剪切Rep68及Rep40蛋白質。在代表性實施例中，Rep編碼序列編碼至少該些病毒或載體基因體複製包裝至新病毒粒子所需之複製蛋白質。Rep編碼序列通常將編碼至少一個大型Rep蛋白質(即Rep78/68)及一個小型Rep蛋白質(即Rep52/40)。在具體實施例中，Rep編碼序列編碼AAV Rep78蛋白質及AAV Rep52及/或Rep40蛋白質。在其他實施例中，Rep編碼序列編碼Rep68及Rep52及/或Rep40蛋白質。在仍進一步實施例 中，Rep編碼序列編碼Rep68及Rep52蛋白質、Rep68及Rep40蛋白質、Rep78及Rep52蛋白質或Rep78及Rep40蛋白質。
如本文中所使用，用語「大型Rep蛋白質(large Rep protein)」係指Rep68及/或Rep78。本申請專利之發明的大型Rep蛋白質可為野生型或合成的。野生型大型Rep蛋白質可來自任何小病毒或AAV，包括但不限於血清型1、2、3a、3b、4、5、6、7、8、9、10、11或13、或任何其他現在已知或稍後發現之AAV。合成的大型Rep蛋白質可藉由插入、刪除、截短及/或錯義突變改變。
在天然AAV基因體中，不同的Rep蛋白質係藉由單一基因經由使用二個不同的啟動子及選擇性剪接編碼。然而為達AAV載體生產之目的，Rep蛋白質可在生產細胞中自單一基因表現、或自每個Rep蛋白質由一個序列表現之不同多核苷酸表現。因此，舉例來說，Rep編碼基因可經工程改造以使p5或p19啟動子不活化，使得僅小型或僅大型Rep蛋白質由各別經修飾的基因表現。自不同基因表現大型及小型Rep蛋白質可在下列情況具有優點：當一個病毒啟動子在宿主細胞中不活化時，這種情況下可使用組成性活性啟動子；或當希望在不同的轉錄及/或轉譯控制元件控制下以不同水準表現Rep蛋白質。例如，在一些實施例中，下調大型Rep蛋白質相對於小型Rep蛋白質(例如Rep78/68)之表現以避免對宿主細胞的毒性可能具有優點(見例如Urabe et al.,(2002)Human Gene Therapy 13：1935)。
如本文中所使用，小病毒或AAV「cap編碼序列」編碼形成功能性小病毒或AAV殼體之結構性蛋白質(即可包裝DNA及感染目標細胞)。一般而言，cap編碼序列將編碼所有小病毒或AAV殼體次單位，但可編碼少於所有殼體次單位，只要可生產功能性殼體。一般但不必然，cap編碼序列將存在單一核酸分子上。
自主性小病毒及AAV之殼體結構係更詳細描述於BERNARD N.FIELDS et al.,VIROLOGY,volume 2,chapters 69 & 70(4th ed.,Lippincott-Raven Publishers)。
「微型肌萎縮蛋白(micro-dystrophin)」或「微小肌萎縮蛋白(mini-dystrophin)」係經工程改造之蛋白質，其包含存在於全長肌萎縮蛋白或其異構體中之某些子結構域或子結構域部分，該等子結構域或子結構域部分當表現於肌肉細胞中時具有至少一些肌萎縮蛋白的功能性。微型肌萎縮蛋白及微小肌萎縮蛋白小於全長肌萎縮蛋白(Dp427m)。相對於全長肌萎縮蛋白，微型肌萎縮蛋白及微小肌萎縮蛋白可在N端、C端、內部或其任何組合中含有刪除。
如本文中所使用，「抗肌萎縮蛋白病(dystrophinopathy)」是一種由DMD(編碼肌萎縮蛋白之基因)中之致病性變體造成的肌肉疾病。抗肌萎縮蛋白病根據實際基因病灶的本質表現為表型譜系。該譜系的輕微端包括但不限於無症狀性肌胺酸磷酸激酶(CK)血清濃度增加 及肌肉痙攣伴隨肌球蛋白尿之表型。該譜系的嚴重端包括但不限於進行性肌肉疾病杜興氏肌肉失養症(DMD)及貝克氏肌肉失養症(BMD)，其中以骨骼肌的影響為主及心臟的影響較小，及以心臟的影響為主之DMD相關擴張性心肌病(DCM)。
微小肌萎縮蛋白多核苷酸、表現卡匣及載體
本揭露提供密碼子最佳化微小肌萎縮蛋白基因序列及含有相同物之表現卡匣。該等基因及表現卡匣可用於多種應用，包括基因療法以預防或治療有需要之個體之抗肌萎縮蛋白病諸如DMD。微小肌萎縮蛋白在轉導肌肉細胞中之表現，能夠複製及代替至少一些正常由全長肌萎縮蛋白所帶來的功能，諸如支持細胞外基質及細胞骨架之間的機械性強力連結。
密碼子最佳化序列係經設計以裝入小病毒載體例如AAV載體之大小限制中，並且提供相較於非最佳化序列增強的微小肌萎縮蛋白表現。在一些實施例中，最佳化微小肌萎縮蛋白序列提供微小肌萎縮蛋白在肌肉細胞或在動物肌肉中增加的表現，該增加至少約5%高於非密碼子最佳化肌萎縮蛋白序列的表現，例如至少約5、10、20、30、40、50、75、100、200、300、400或500%或更多，其中非密碼子最佳化序列係基於編碼野生型人類全長肌萎縮蛋白之mRNA，如NCBI參考序列NM_004006.2所例示，其以引用方式併入本文中。
因此，本發明之一態樣關於編碼微小肌萎縮蛋白之多核苷酸，該多核苷酸包含、基本上由下列組成或由下列組成：(a)SEQ ID NO：1之核苷酸序列或與其具有至少約90%同一性之序列；(b)SEQ ID NO：2之核苷酸序列或與其具有至少約90%同一性之序列；或(c)SEQ ID NO：3之核苷酸序列或與其具有至少約90%同一性之序列。在一些實施例中，多核苷酸係與SEQ ID NO：1至3中之一者的核苷酸序列具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。在某些實施例中，多核苷酸具有在病毒載體例如小病毒載體例如AAV載體之容量以內的長度。在一些實施例中，多核苷酸係約5000、4900、4800、4700、4600、4500、4400、4300、4200、4100或約4000個核苷酸或更少。
在一些實施例中，由多核苷酸編碼之微小肌萎縮蛋白包含、基本上由下列組成或由下列組成：野生型肌萎縮蛋白的N端、絞鏈H1、棒狀結構域R1及R2、絞鏈H3、棒狀結構域R22、R23及R24、絞鏈H4、半胱胺酸富含結構域(CR結構域)及在一些實施例中所有或部分羧基端結構域(CT結構域)。在其他實施例中，由多核苷酸編碼之微小肌萎縮蛋白包含、基本上由下列組成或由下列組成：野生型肌萎縮蛋白的N端、肌動蛋白結合結構域(ABD)、絞鏈H1、棒狀結構域R1及R2、棒狀結構域R22、R23及R24、絞鏈H4、CR結構域及在一些實施例中所有或部分CT結構域。在進一步實施例中，微小肌萎縮蛋白不 包含野生型肌萎縮蛋白(SEQ ID NO：25)之C端的最後三個胺基酸。在某些實施例中，多核苷酸編碼微小肌萎縮蛋白，該微小肌萎縮蛋白包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8之胺基酸序列或與SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8之胺基酸序列具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性之序列。
肌萎縮蛋白之核苷酸序列係所屬技術領域中廣為週知，且可見於諸如GenBank之序列資料庫。例如，人類肌萎縮蛋白mRNA序列可見GenBank寄存編號M18533或NCBI參考序列NM_004006.2，彼等全文以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，多核苷酸係用於生產肌萎縮蛋白之表現卡匣的一部分。表現卡匣可進一步包含用於增加肌萎縮蛋白表現之表現元件。
在一些實施例中，本發明之多核苷酸係可操作地連接啟動子。啟動子可為組成性啟動子或組織特異性或組織優先性啟動子諸如肌肉特異性或肌肉優先性啟動子。在一些實施例中，啟動子係肌酸酐激酶啟動子，例如包含、基本上由下列組成或由下列組成之啟動子：SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5之核苷酸序列。
在一些實施例中，本發明之多核苷酸係可操作地連接聚腺苷酸化元件。在一些實施態樣中，聚腺苷酸化元件包含SEQ ID NO：6之核苷酸序列。
在一些實施例中，多核苷酸係表現卡匣的一部分，該表現卡匣包含、基本上由下列組成或由下列組成：與啟動子及聚腺苷酸化元件可操作地連接之多核苷酸。在某些實施例中，基因表現卡匣包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：9至12中任一者之核苷酸序列或與其具有至少約90%同一性例如至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性之序列。
本發明之另一態樣關於包含本發明之多核苷酸的載體。合適載體包括但不限於質體、噬菌體、噬質體、病毒載體(例如AAV載體、腺病毒載體、疱疹病毒載體、α病毒或桿狀病毒載體)、細菌性人工染色體(BAC)或酵母菌人工染色體(YAC)。例如，核酸可包含、由下列組成或基本上由下列組成：包含5'及/或3'端重複(例如5'及/或3' AAV末端重複)之AAV載體。在一些實施例中，載體係病毒載體，例如小病毒載體，例如AAV載體，例如AAV9載體。病毒載體可進一步包含：包含重組病毒模板之核酸，其中該核酸藉由小病毒殼體包殼。本發明進一步提供包含本發明之多核苷酸之重組小病毒顆粒(例如重組AAV顆粒)。病毒載體及病毒顆粒於下進一步討論。
在某些實施例中，病毒載體相較於經修飾的載體所源自的載體展現經修飾的組織趨性。在一實施例中，小病毒載體展現對骨骼肌、心臟及/或橫膈肌的系統性趨性。在其他實施例中，小病毒載體相較於包含野生型 殼體蛋白質之病毒載體具有減少的肝臟趨性。組織趨性可根據所屬技術領域中具有通常知識者所知，藉由改變某些病毒殼體胺基酸例如存在於AAV殼體VP1、VP2及/或VP3蛋白質中之胺基酸來修飾。
在一些實施例中，載體基因體係自我互補或雙股，且含有該等載體基因體之AAV病毒粒子稱為scAAV載體。scAAV載體係描述於國際專利公開號WO 01/92551(其揭示內容係以引用方式整體併入本文中)。使用scAAV表現微小肌萎縮蛋白可提供增加的轉導細胞數、每轉導細胞複製數或二者。
本發明之額外態樣關於包含本發明之多核苷酸及/或載體之轉形細胞。細胞可為體外(in vitro)、離體(ex vivo)或體內(in vivo)細胞。
本發明之進一步態樣關於包含本發明之多核苷酸及/或載體及/或轉形細胞之非人類轉殖動物。在一些實施例中，轉殖動物係實驗動物，例如疾病之動物模型，例如肌肉失養症之動物模型。
本發明之另一態樣關於由本發明之多核苷酸編碼的微小肌萎縮蛋白。微小肌萎縮蛋白含有所有功能性肌萎縮蛋白所需之序列。肌萎縮蛋白之結構域係所屬技術領域中廣為週知，且序列可見於諸如GenBank之序列資料庫。例如，人類肌萎縮蛋白胺基酸序列可NCBI參考序列：NP_003997.1及GenBank寄存編號AAA53189，彼等全文以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，微小肌萎縮蛋白包含、基本上由下列組成或由下列組成：野生型肌萎縮蛋白(SEQ ID NO：25)之N端、絞鏈H1、棒狀結構域R1及R2、絞鏈H3、棒狀結構域R22、R23及R24、絞鏈H4、CR結構域、及在一些實施例中所有或部分CT結構域，其中該微小肌萎縮蛋白不包含C端的最後三個胺基酸。根據一些這些實施例，N端肌動蛋白結合結構域包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25(全長人肌萎縮蛋白之胺基酸序列)之胺基酸編號1至240；H1包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號253至327；R1包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號337至447；R2包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號448至556；H3包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號2424至2470；R22包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號2687至2802；R23包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號2803至2931；R24包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號2932至3040；H4包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號3041至3112；CR結構域包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號3113至3299；且CT結構域包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號3300至3408。在 某些實施例中，微小肌萎縮蛋白包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：7之胺基酸序列。此及相關建構體之進一步說明係包括在本文中的實例1。
在一些實施例中，微小肌萎縮蛋白包含、基本上由下列組成或由下列組成：N端、絞鏈H1、棒狀結構域R1及R2、棒狀結構域R22、R23及R24、絞鏈H4、CR結構域及在一些實施例中所有或部分CT結構域。在某些實施例中，微小肌萎縮蛋白不包含野生型肌萎縮蛋白之C端的最後三個胺基酸。根據一些這些實施例，N端肌動蛋白結合結構域包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25(全長人肌萎縮蛋白之胺基酸序列)之胺基酸編號1至240；H1包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號253至327；R1包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號337至447；R2包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號448至556；R22包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號2687至2802；R23包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號2803至2931；R24包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號2932至3040；H4包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號3041至3112；半胱胺酸富含區包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號3113至3299；且羧基端結構域包含、 基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號3300至3408。在某些實施例中，微小肌萎縮蛋白包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：8之胺基酸序列。
本發明之進一步態樣關於一種在細胞中生產微小肌萎縮蛋白之方法，其包含使該細胞與本發明之多核苷酸或載體接觸，藉以在該細胞中生產該微小肌萎縮蛋白。細胞可為體外、離體或體內細胞，例如細胞系或初代細胞。藉由導入編碼蛋白質之多核苷酸在細胞中生產蛋白質之方法係所屬技術領域中廣為週知。
本發明之另一態樣關於一種在個體中生產微小肌萎縮蛋白之方法，其包含遞送本發明之多核苷酸、載體及/或轉形細胞至該個體，藉以在該個體中生產該微小肌萎縮蛋白。
本發明之另一態樣關於一種治療有需要之個體的肌肉失養症之方法，其包含遞送治療有效量的本發明之多核苷酸、載體及/或轉形細胞至該個體，藉以在該個體中治療肌肉失養症。肌肉失養症可為任何形式的肌肉失養症，例如杜興氏肌肉失養症或貝克氏肌肉失養症。
重組病毒載體
本發明之病毒載體可用於遞送編碼微小肌萎縮蛋白之多核苷酸至體外、離體及體內細胞。具體而言，可有利地採用病毒載體以遞送或轉移編碼微小肌萎縮蛋白 之多核苷酸至動物(包括哺乳動物)細胞。
病毒載體亦可包含與宿主染色體上之基因座具有同源性且與之重組之異源性核酸。此方式可經利用以例如改正宿主細胞的遺傳缺陷。
作為進一步替代方案，編碼微小肌萎縮蛋白之多核苷酸可用於在體外、離體或體內細胞中生產微小肌萎縮蛋白。例如，病毒載體可經導入培養細胞中且自其中單離表現的微小肌萎縮蛋白。
所屬技術領域中具有通常知識者將理解，編碼微小肌萎縮蛋白之多核苷酸可與適當控制序列可操作地相關。例如，多核苷酸可與表現控制元件可操作地相關，諸如轉錄/轉譯控制信號、複製起點、聚腺苷酸化信號、內部核糖體進入位點(IRES)、啟動子及/或增強子及類似物。
所屬技術領域中具有通常知識者將理解，取決於所欲之水準及組織特異性表現，可使用多種啟動子及可選地增強子元件。啟動子/增強子可為組成性或誘導性，取決於所欲之表現模式。啟動子/增強子可為天然或外來，且可為天然或合成序列。若為外來，則轉錄起始區域意欲不見於該轉錄起始區域將導入的野生型宿主中。若採用增強子，可選自與啟動子相同的基因及物種中、選自與啟動子不同的物種中之同源基因、選自與啟動子相同的物種中之不同基因、或選自與啟動子不同的物種中之不同基因。
在具體實施例中，啟動子/增強子元件可為所欲治療之目標細胞或個體所固有。在代表性實施例中，啟動子/增強子元件可為異源性核酸序列所固有。啟動子/增強子元件通常經選擇以使其在受到關注之目標細胞中發揮作用。另外，在具體實施例中，啟動子/增強子元件係哺乳動物啟動子/增強子元件。啟動子/增強子元件可為組成性或誘導性。
誘導性表現控制元件一般在該些欲提供調節優先於表現異源性核酸序列的應用中係為有利。用於基因遞送之誘導性啟動子/增強子元件可為組織特異性或組織優先性啟動子/增強子元件，且包括肌肉特異性或優先性(包括心臟、骨骼肌及/或平滑肌特異性或優先性)啟動子/增強子元件。其他誘導性啟動子/增強子元件包括荷爾蒙誘導性及金屬誘導性元件。例示性誘導性啟動子/增強子元件包括但不限於Tet開/關元件、RU486誘導性啟動子、蛻皮激素誘導性啟動子、雷帕黴素誘導性啟動子及金屬硫蛋白啟動子。
在其中編碼微小肌萎縮蛋白之多核苷酸經轉錄且接著轉譯於目標細胞中之實施例中，通常包括用於有效轉譯插入的蛋白質編碼序列之特定起始信號。這些外源性轉譯控制序列(可包括ATG起始密碼子及相鄰序列)可具有多種天然及合成的來源。
根據本發明之病毒載體提供一種用於遞送編碼微小肌萎縮蛋白之多核苷酸至廣泛範圍之細胞包括分裂 及非分裂細胞之手段。病毒載體可經採用以遞送多核苷酸至體外細胞，以例如在體外生產微小肌萎縮蛋白或用於離體基因療法。病毒載體可另外用於遞送多核苷酸至有需要之個體之方法，以例如表現微小肌萎縮蛋白。在此方式中，蛋白質可在個體體內生產。個體可需要微小肌萎縮蛋白，因為個體具有功能性肌萎縮蛋白缺乏症。另外，可實施該方法，因為在個體中生產微小肌萎縮蛋白可能授予一些有益效應。
病毒載體亦可用於在培養細胞或個體中生產微小肌萎縮蛋白(例如，使用個體作為生物反應器以生產蛋白質或觀察蛋白質對個體之效應，例如，在篩選方法中)。
通常，本發明之病毒載體可經採用以遞送編碼微小肌萎縮蛋白之多核苷酸以治療及/或預防任何遞送微小肌萎縮蛋白係為有利之疾病狀態。示例性疾病狀態包括但不限於肌肉失養症包括杜興氏肌肉失養症及貝克氏肌肉失養症。
根據本發明之病毒載體可用於診斷及篩選方法，其中編碼微小肌萎縮蛋白之多核苷酸係暫時或穩定表現於細胞培養系統或替代地轉殖動物模型中。
本發明之病毒載體亦可用於各種非治療性目的，包括但不限於用於評估基因標靶、廓清、轉錄、轉譯等之方案中，如所屬技術領域中具有通常知識者將顯而易見。病毒載體亦可用於評估安全性之目的(擴散、毒性、 免疫原性等)。例如，該等資料被美國食品藥物管理局視為評估臨床療效之前的審查核准過程的一部分。
根據本揭露之用於治療抗肌萎縮蛋白病諸如DMD之AAV載體或顆粒的某些實施例，本揭露提供包括來自具有橫紋肌趨性之AAV血清型的AAV殼體之AAV載體或顆粒，該橫紋肌包括但不限於骨骼肌，包括橫膈及心肌。具有橫紋肌趨性之天然發生的AAV殼體之非限制性實例係AAV1、AAV6、AAV7、AAV8及AAV9。然而，其他實施例包括未知為天然發生，而是為了產生相較於其他組織優先轉導橫紋肌之新穎AAV殼體之明確目的進行工程改造之AAV殼體。該等工程改造殼體係所屬技術領域中已知，但本揭露包含尚未經發展之新穎肌肉特異性AAV殼體。肌肉特異性工程改造AAV殼體之非限制性實例報告於Yu,CY,et al.,Gene Ther 16(8)：953-62(2009)、Asokan,A,et al.,Nat Biotech 28(1)：79-82(2010(描述AAV2i8)、Bowles,DE,et al.,Mol Therapy 20(2)：443-455(2012)(描述AAV 2.5)及Asokan,A,et al.,Mol Ther 20(4)：699-708(2012)。許多天然及非天然發生之AAV血清型的殼體蛋白質包括VP1、VP2及VP3蛋白質之胺基酸序列係所屬技術領域中已知。在一非限制性實例中，AAV9血清型之胺基酸序列提供於SEQ ID NO：13之胺基酸序列。
本揭露之用於治療抗肌萎縮蛋白病諸如DMD之AAV顆粒包括用於表現微小肌萎縮蛋白之載體基因體，該微小肌萎縮蛋白具有經選擇之肌萎縮蛋白子結構域，以 在經轉導肌肉細胞中至少部分地恢復缺少的全長肌萎縮蛋白所提供的功能。根據一些實施例，微小肌萎縮蛋白係自全長野生型人肌萎縮蛋白的子結構域建構。在一些實施例中，微小肌萎縮蛋白依下列N端至C端之順序包括來自人肌萎縮蛋白的下列子結構域：N端肌動蛋白結合結構域(ABD)；H1絞鏈結構域；R1及R2血影蛋白樣重複結構域；H3絞鏈結構域；R22、R23及R24血影蛋白樣重複結構域；H4絞鏈結構域；半胱胺酸富含(CR)區；及羧基端(CT)結構域。根據一些這些實施例，N端肌動蛋白結合結構域包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25(全長人肌萎縮蛋白之胺基酸序列)之胺基酸編號1至240；H1包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號253至327；R1包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號337至447；R2包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號448至556；H3包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號2424至2470；R22包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號2687至2802；R23包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號2803至2931；R24包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號2932至3040；H4包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號3041至3112；CR結構域包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號3113至3299；且CT結構域包含、基本上由下列組成或由下列組成：SEQ ID NO：25之胺基酸編號3300至3408。根據某些實施例，微小肌萎縮蛋白具有SEQ ID NO：7之胺基酸序列。
本揭露之用於治療抗肌萎縮蛋白病諸如DMD之AAV顆粒的載體基因體包括用於表現微小肌萎縮蛋白之基因。一般而言，載體基因體將缺乏正常存在於野生型AAV中之rep及cap基因，以提供空間給表現微小肌萎縮蛋白之基因。在一些實施例中，基因編碼具有來自全長人肌萎縮蛋白之下列子結構域的微小肌萎縮蛋白：ABD-H1-R1-R2-H3-R22-R23-R24-H4-CRD-CTD。在一些實施例中，CTD僅是野生型肌萎縮蛋白的部分CTD，且在一些實施例中不包括存在野生型肌萎縮蛋白(SEQ ID NO：25)中的最後三個胺基酸。在某些實施例中，基因編碼具有SEQ ID NO：7之胺基酸序列的人微小肌萎縮蛋白。
根據一些實施例，編碼人微小肌萎縮蛋白之基因係根據將投予本揭露之AAV顆粒以接受基因療法之個體的物種進行密碼子最佳化。在不希望受到理論束縛下，據信密碼子最佳化改善轉導細胞能夠轉錄基因至mRNA及/或轉譯mRNA至蛋白質的效率，藉此相較於非密碼子最佳化之微小肌萎縮蛋白編碼基因的表現，增加微小肌萎縮蛋白的生產量。在一些非限制性實施例中，密碼子最佳化係人類密碼子最佳化，但密碼子最佳化可針對其他物種包括犬進行。
在一些實施例中，密碼子最佳化以同義密碼子取代一或多個與存在於物種(諸如人類)中之相對罕見tRNA配對的密碼子，該同義密碼子與相同胺基酸之較常見tRNA配對。此方式可增加轉譯效率。在其他實施例中，密碼子最佳化消除某些可影響轉錄或轉譯效率之順式作用模體。密碼子最佳化之非限制性實例包括在編碼序列的預計起點添加強效Kozak序列、或刪除在預計起始密碼子下游的內部核糖體進入位點。其他可經由密碼子最佳化消除之順式作用模體包括內部TATA盒；chi位點；ARE、INS及/或CRS序列元件；重複序列及/或RNA二級結構；隱匿剪接供體及/或受體位點、分支點；及SalI位點。
在某些實施例中，密碼子最佳化相對於微小肌萎縮蛋白基因自其組裝之野生型序列增加GC含量(即存在於核酸序列中之G及C核鹼基的數量，通常以百分比表示)。在一些實施例中，GC含量至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%高於對應野生型基因的GC含量。在相關實施例中，密碼子最佳化基因之GC含量係約或至少45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%或更高。
在一些實施例中，密碼子最佳化增加編碼微小肌萎縮蛋白之基因的密碼子適應指數(CAI)。CAI係在特 定物種中同義密碼子使用偏差的量度。特定物種中之CAI值(介於0至1)與基因表現水準呈現正相關。見例如Sharp,PM and W-H Lie,Nuc Acids Res 15(3)：1281-95(1987)。根據某些實施例，密碼子最佳化參照高度表現人類基因，增加微小肌萎縮蛋白基因之CAI至一至少0.70、0.71、0.72、0.73、0.74、0.75、0.76、0.77、0.78、0.79、0.80、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98或0.99之值。
在其他實施例中，密碼子最佳化減少CpG二核苷酸在微小肌萎縮蛋白編碼序列中之數量。在不希望受到任何特定操作理論之束縛下，據信CpG二核苷酸的甲基化可靜默基因轉錄，因此減少CpG二核苷酸在基因序列中之數量可減少甲基化水準，藉此導致增強的轉錄效率。因此，在密碼子最佳化微小肌萎縮蛋白基因之一些實施例中，CpG二核苷酸之數量相較於微小肌萎縮蛋白基因自其組裝之野生型序列減少約或至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%或更多。
人類密碼子最佳化人微小肌萎縮蛋白基因之非限制性實例提供於SEQ ID NO：1之DNA序列。此DNA序列有3978個核鹼基長(包括終止密碼子)，在本文中稱為Hopti-Dys3978，但該特定用語僅為了方便使用，並非意欲作為限制。由SEQ ID NO：1編碼之微小肌萎縮蛋白序列稱為Dys3978，提供於SEQ ID NO：7。犬密碼子最佳化人 微小肌萎縮蛋白基因之實例提供於SEQ ID NO：3，其亦編碼Dys3978。如在本文中額外詳細描述的，SEQ ID NO：7之微小肌萎縮蛋白的編碼序列係自野生型全長人肌萎縮蛋白基因(如NCBI參考序列NM_004006.2所例示，其以引用方式併入本文中)對應存在於肌萎縮蛋白(SEQ ID NO：25)中之某些子結構域的子序列組裝。所得基因序列在本文提供為SEQ ID NO：26，其接著經人類密碼子最佳化，導致SEQ ID NO：1之DNA序列。在不加以限制下，相較於基因序列經密碼子最佳化以前，密碼子最佳化增加GC含量、降低不尋常密碼子的使用(即增加密碼子適應指數(CAI))且包括強效轉譯起始位點(Kozak一致序列或類似者)。
本揭露之用於治療抗肌萎縮蛋白病諸如DMD之AAV顆粒的載體基因體進一步包括側接編碼微小肌萎縮蛋白之密碼子最佳化基因之AAV反向末端重複(ITR)。在一些實施例中，ITR係來自與殼體相同的AAV血清型(例如但不限於AAV9 ITR與AAV9殼體一起使用)，但在其他實施例中可使用來自不同血清型的AAV ITR。例如，來自AAV2血清型的ITR可用於與來自不同、非AAV2血清型的AAV殼體組合之載體基因體。非限制性實例包括使用AAV2 ITR與來自AAV1、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9血清型或不同的天然或非天然發生AAV血清型之殼體。在一具體非限制性實例中，AAV2 ITR可與來自AAV9血清型之殼體組合使用。從載體基因體之正股或正義DNA股來看， 左側、5'或上游AAV2 ITR之序列提供於SEQ ID NO：14之DNA序列，且右側、3'或下游AAV2 ITR之序列提供於SEQ ID NO：15之DNA序列。
本揭露之用於治療抗肌萎縮蛋白病諸如DMD之AAV載體的載體基因體進一步包括可操作地連接編碼微小肌萎縮蛋白之基因的轉錄調節元件，以使載體基因體一旦轉換成其雙股形式之後，即可在轉導細胞中表現微小肌萎縮蛋白基因。轉錄調節元件一般包括啟動子，但可選地包括一或多個可作用以放大自啟動子起始轉錄之速率的增強子元件。
相關於微小肌萎縮蛋白編碼序列可操作地連接轉錄調節元件意指轉錄調節元件可作用以控制基因的轉錄及表現，但不必然需要任何特定結構或空間關係。由於本揭露之載體基因體一般以單股DNA分子之形式包裝至AAV殼體中，應理解可操作地連接可能在載體基因體轉換成雙股形式之前不具作用。通常，啟動子將位於編碼微小肌萎縮蛋白之基因序列的5′或上游，但其他轉錄調節元件諸如增強子可位於基因的5′或他處諸如3′。
在一些實施例中，轉錄調節元件可為強效組成性活性啟動子，諸如該些見於感染真核細胞的某些病毒中者。所屬技術領域中廣為週知之實例包括來自巨細胞病毒(CMV)之啟動子，但其他亦廣為週知者如來自勞斯肉瘤病毒(RSV)之啟動子。強效病毒啟動子諸如CMV或RSV一般不具組織特異性，因此若使用，微小肌萎縮蛋白將不僅 在肌肉細胞中表現，但在任何其他經本揭露之AAV顆粒轉導之細胞類型諸如肝臟中皆可表現。因此，在其他實施例中，可使用肌肉特異性轉錄調節元件以減少在亦可能經本揭露之AAV顆粒轉導之非肌肉細胞諸如肝臟細胞中表現之微小肌萎縮蛋白的量。
肌肉特異性轉錄調節元件可源自任何物種的肌肉特異性基因，包括哺乳動物物種諸如但不限於人類或小鼠肌肉基因。肌肉特異性轉錄調節元件一般將包括最少來自肌肉特異性基因之啟動子以及一或多個來自相同或不同肌肉特異性基因之增強子。該等增強子可源自天然基因的許多部份，諸如位於基因之5′或3′或甚至位於內含子內之增強子。肌肉特異性轉錄調節元件可集體自肌肉特異性基因移除並插入質體中以生產本揭露之AAV載體基因體，或可經工程改造以定制彼等之活性且儘可能減少彼等之大小。
肌肉特異性轉錄調節元件所源自之肌肉特異性基因的非限制性實例包括肌肉肌胺酸激酶基因、肌蛋白重鏈基因或肌蛋白輕鏈基因、或來自骨骼肌之α1肌動蛋白基因，雖然其他者也有可能。這些基因可源自人類、小鼠或其他物種。
已產生之用於基因療法應用中之肌肉特異性轉錄調節元件係在所屬技術領域中描述，且可用於本揭露之用於治療肌肉失養症之AAV載體。在非限制性實例中，Hauser描述稱為CK4、CK5及CK6之源自小鼠肌胺酸激酶 (MCK)基因之肌肉特異性轉錄調節元件(Hauser,MA,et al.,Mol Therapy 2(1)：16-25(2000))；Salva描述稱為CK1及CK7(源自MCK基因)以及MHCK1及MHCK7(彼等額外包括來自小鼠α-MHC基因之增強子)之肌肉特異性轉錄調節元件(Salva,MZ,et al.,Mol Therapy 15(2)：320-9(2007))；且Wang描述稱為enh358MCK、dMCK及tMCK之肌肉特異性轉錄調節元件(Wang,B,et al.,Gene Therapy 15：1489-9(2008))。本揭露之用於治療肌肉失養症之AAV載體亦可能使用其他肌肉特異性轉錄調節元件。
可用於本揭露之用於治療肌肉失養症之AAV載體之肌肉特異性轉錄調節元件的非限制性實例包括CK4、CK5、CK6、CK1、CK7、MHCK1、MHCK7、enh358MCK、dMCK及tMCK(各如所屬技術領域中所述)或該些在本文中揭示之具有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：16之DNA序列者。亦可使用其他肌肉特異性轉錄調節元件。
本揭露之用於治療抗肌萎縮蛋白病諸如DMD之AAV載體的載體基因體進一步包括位於微小肌萎縮蛋白基因編碼序列之3'的轉錄終止序列。包括轉錄終止序列確保編碼微小肌萎縮蛋白之mRNA轉錄物將被轉導細胞適當聚腺苷酸化，藉此確保訊息有效轉譯成蛋白質。在無意受到任何特定操作理論之限制下，研究哺乳動物轉錄終止序列在基因之3' UTR發現一致序列，作用為終止轉錄及為生長轉錄物加上聚腺苷酸化信號。具體而言，這些序列一般 包括模體AATAAA，隨後是15至30個核苷酸，接著是CA。見例如N.Proudfoot,Genes Dev 25：1770-82(2011)。其他模體諸如上游元件(USE)及下游元件(DSE)可在一些基因中造成轉錄終止。許多轉錄終止序列係所屬技術領域中已知且可用於本揭露之AAV載體。非限制性實例包括來自SV40病毒早期或晚期基因之聚腺苷酸化信號(SV40早期或晚期polyA)或來自牛生長激素基因之聚腺苷酸化信號(bGH polyA)。來自任何物種之其他基因的轉錄終止序列可用於本揭露之AAV載體。替代地，合成的轉錄終止序列可經設計並用以提供轉錄終止及聚腺苷酸化之信號。可用於本揭露之AAV載體的轉錄終止序列之額外非限制性實例包括該些在本文中揭示之具有SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：17之DNA序列者。
根據某些非限制性實施例，本揭露提供一種用於治療抗肌萎縮蛋白病諸如DMD之AAV病毒顆粒或載體，其包含AAV殼體及編碼微小肌萎縮蛋白之載體基因體。在一些實施例中，微小肌萎縮蛋白包括來自全長人肌萎縮蛋白之下列子結構域：ABD-H1-R1-R2-H3-R22-R23-R24-H4-CRD-CTD。在一些實施例中，CTD僅是野生型肌萎縮蛋白的部分CTD，且在一些實施例中不包括存在野生型肌萎縮蛋白(SEQ ID NO：25)中的最後三個胺基酸。根據某些實施例，編碼SEQ ID NO：7之微小肌萎縮蛋白之基因係經人密碼子最佳化且具有SEQ ID NO：1之DNA序列。在一些實施例中，AAV殼體係來自AAV9血清型。
如本文中他處所說明，單股AAV載體基因體係以大約相等比例之正股或負股包裝至殼體中。因此，載體或顆粒之實施例包括其中載體基因體係呈正股極性(即具有正義或編碼DNA股之核鹼基序列)之AAV顆粒以及其中載體基因體係呈負股極性(即具有反義或模板DNA股之核鹼基序列)之AAV顆粒。考慮到正股之核鹼基序列呈其正規5′至3′順序，呈其5′至3′順序之負股之核鹼基序列可判定為正股之核鹼基序列的反向互補序列。
在載體的一些實施例中，載體基因體當呈正股極性時包含：源自肌胺酸激酶基因且具有SEQ ID NO：16之DNA序列的肌肉特異性轉錄調節元件，該肌肉特異性轉錄調節元件位於SEQ ID NO：1(編碼微小肌萎縮蛋白之人密碼子最佳化基因的DNA序列)之5′且與其可操作地連接。包含對應負股之顆粒亦為可能，其中自其5′端之核鹼基序列將為前述正股序列之反向互補序列。在其他實施例中，載體基因體當呈正股極性時包含：第一AAV2 ITR、隨後為位於SEQ ID NO：1之DNA序列之5′且與其可操作地連接的SEQ ID NO：16之DNA序列、及包含位於微小肌萎縮蛋白基因之3′的SEQ ID NO：17之DNA序列的轉錄終止序列、隨後為第二AAV2 ITR。包含對應負股之顆粒亦為可能，其中自其5′端之核鹼基序列將為前述正股序列之反向互補序列。
在載體的某些其他實施例中，載體基因體當呈正股極性時，依5′至3′順序包含：第一AAV2 ITR；由 SEQ ID NO：16之DNA序列定義之轉錄調節元件序列；用於表現微小肌萎縮蛋白之人密碼子最佳化基因序列，該基因序列由與轉錄調節元件可操作地連接之SEQ ID NO：1之DNA序列定義；由SEQ ID NO：17之DNA序列定義之轉錄終止序列；及第二AAV2 ITR。包含對應負股之顆粒亦為可能，其中自其5′端之核鹼基序列將為前述正股序列之反向互補序列。
根據具體非限制性實施例，用於治療抗肌萎縮蛋白病諸如DMD之AAV載體(其在本文中可稱為AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA)包含來自AAV9血清型之殼體及載體基因體，該載體基因體(在本文中可稱為hCK.Hopti-Dys3978.spA)包含、基本上由下列組成或由下列組成：當基因體呈正向極性時，SEQ ID NO：18之DNA序列，或當基因體呈負向極性時，SEQ ID NO：18之DNA序列的反向互補序列(即當載體基因體序列係自5′讀至3′時)。
生產病毒載體之方法
本揭露進一步提供生產AAV載體之方法。在一具體實施例中，本揭露提供一種生產重組小病毒顆粒之方法，其包含在足以複製及包裝重組AAV顆粒之條件下，提供重組AAV載體基因體及AAV複製及包裝功能給容許AAV複製及包裝的細胞，藉以由細胞生產rAAV顆粒，該重組AAV載體基因體包含微小肌萎縮蛋白基因、相關基因 控制元件及側接的AAV ITR，該AAV複製及包裝功能諸如該些由AAV rep及cap基因所提供者。足以複製及包裝rAAV顆粒之條件包括但不限於幫手功能，諸如該些來自腺病毒及/或疱疹病毒之功能。容許AAV複製及包裝之細胞在本文中稱為包裝細胞或生產細胞，該等用語被更廣泛的用語宿主細胞涵蓋。該rAAV顆粒載體基因體、複製及包裝功能及若需要之幫手功能可經由病毒或非病毒載體諸如質體提供，且可以整合至細胞的基因體或游離基因體中之方式穩定地或暫時地存在於包裝細胞中。
本揭露之重組AAV載體可藉由所屬技術領域中具有通常知識者已知之數種方法製造(見例如WO 2013/063379)。例示性方法係描述於Grieger,et al.2015,Molecular Therapy 24(2)：287-297，其內容以引用方式併入本文中。簡言之，有效轉染HEK293細胞係用來作為起始點，其中來自合格臨床種原細胞庫之黏著性HEK293細胞系係用來生長於不含動物組分之懸浮條件之振盪燒瓶及允許快速及可擴充rAAV顆粒生產之WAVE生物反應器中。使用三重轉染方法(例如WO 96/40240)，懸浮HEK293細胞系在轉染後48小時收集時，在一些實施例中能夠生產大於每細胞1×105個含載體基因體(vg)顆粒、或大於1×1014vg/L細胞培養。三重轉染係指包裝細胞經三種質體轉染：一種質體編碼AAV rep及cap基因、另一種質體編碼各種幫手功能(例如腺病毒或HSV蛋白質諸如E1a、E1b、E2a、E4及VA RNA)及另一種質體編碼載體基因體即微小肌萎縮蛋 白基因及其經AAV ITR側接之各種控制元件。為了達成所欲產率，一些變數可經最佳化，諸如選擇支持生長及轉染的相容不含血清懸浮液介質、選擇轉染試劑、轉染條件及細胞密度。載體可自介質及/或藉由溶解細胞收集，接著使用典型密度梯度超離心技術或使用管柱層析或其他技術純化。
包裝功能包括用於病毒載體複製及包裝之基因。因此，舉例來說，包裝功能可視需要包括病毒基因表現、病毒載體複製、自整合狀態救援病毒載體、病毒基因表現及包裝病毒載體至病毒顆粒所需之功能。包裝功能可使用基因建構體諸如質體或擴增子、桿狀病毒或HSV幫手建構體一起或分開供應給包裝細胞。包裝功能可存在於包裝細胞內之染色體外，但也可整合至細胞的染色體DNA中。實例包括編碼AAV Rep及Cap蛋白質之基因。Rep及cap基因可為相同病毒或非病毒載體的一部分一起提供給包裝細胞。例如，rep及cap序列可藉由雜交的腺病毒載體(例如插入經刪除腺病毒載體之E1a或E3區域)或疱疹病毒載體諸如EBV載體提供。替代地，AAV rep及cap基因可分開提供。Rep及cap基因亦可穩定整合至包裝細胞的基因體中，或存在游離基因體上。一般而言，rep及cap基因將不會側接ITR以避免將這些序列包裝至rAAV載體顆粒中。
幫手功能包括建立活性感染包裝細胞所需的幫手病毒元件，其為起始病毒載體包裝所需。實例包括源自腺病毒、桿狀病毒及/或疱疹病毒之足以導致病毒載體 包裝之功能。例如，腺病毒幫手功能一般將包括腺病毒組分E1a、E1b、E2a、E4及VA RNA。包裝功能可藉由以所需病毒感染包裝細胞供應。替代地，可避免使用具傳染性病毒，因此包裝功能可使用非病毒載體諸如質體或擴增子一起或分開供應給包裝細胞。見例如Rabinowitz et al.,2002,J.Virol.76：791所述之pXR幫手質體及Grimm et al.,1998,Human Gene Therapy 9：2745-2760所述之pDG質體。包裝功能可存在於包裝細胞內之染色體外，但也可整合至細胞的染色體DNA中(例如在HEK 293細胞中之E1或E3)。
任何將攜帶幫手功能之核苷酸序列導入細胞性宿主以進行複製及包裝之方法皆可採用，包括但不限於電穿孔、磷酸鈣沉澱、顯微注射、陽離子或陰離子脂質體及脂質體與核定位信號之組合。在其中幫手功能係藉由使用病毒載體轉染或使用幫手病毒感染而提供之實施例中，可使用生產病毒感染之標準方法。
任何所屬技術領域中已知之合適容許或包裝細胞可經採用以生產包裝病毒載體。哺乳動物細胞或昆蟲細胞係較佳。可用於生產包裝細胞以實施本發明之細胞實例包括例如人類細胞系諸如VERO、WI38、MRC5、A549、HEK 293細胞(其在組成性啟動子控制下表現功能性腺病毒E1)、B-50或任何其他HeLa細胞、HepG2、Saos-2、HuH7及HT1080細胞系。在一態樣中，包裝細胞能夠生長於懸浮液培養中，特別是不含血清之生長介質 中。在一實施例中，包裝細胞係懸浮生長於不含血清之介質中的HEK293。在另一實施例中，包裝細胞係美國專利第9,441,206號所述且寄存為ATCC編號PTA 13274之HEK293細胞。許多rAAV顆粒包裝細胞系係所屬技術領域中已知，包括但不限於該些揭示於WO 2002/46359中者。
用來作為包裝細胞之細胞系包括昆蟲細胞系，特別是當使用桿狀病毒載體以導入如本文中描述之rAAV顆粒生產所需之基因時。任何允許AAV複製且可培養維持之昆蟲細胞皆可根據本揭露使用。實例包括草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)諸如Sf9或Sf21細胞系、果蠅屬(Drosophila spp.)細胞系或蚊細胞系例如白線斑蚊(Aedes albopictus)衍生性細胞系。
在本揭露之AAV載體顆粒已生產及純化後，彼等可經滴定以製備用於投予至個體諸如人類肌肉失養症個體之組成物。AAV載體滴定可使用所屬技術領域中已知之方法完成。在某些實施例中，AAV載體顆粒可使用定量PCR(qPCR)滴定，該qPCR使用載體基因體中之序列(例如載體基因體中之AAV2 ITR序列(若有的話)或其他序列)的引子。藉由在已知濃度之標準物(諸如含有載體基因體序列之質體)的稀釋液上平行進行qPCR，可產製容許計算AAV載體濃度為每單位體積(諸如微升或毫升)之載體基因體(vg)數量的標準曲線。替代地，含有基因體之AAV載體顆粒的數量可使用點漬法使用載體基因體之合適探針判定。這些技術進一步描述於Gray,SJ,et al., Production of recombinant adeno-associated viral vectors and use in in vitro and in vivo administration,Curr Protoc Neurosci(2011)及Werling NJ,et al.,Gene Ther Meth 26：82-92(2015)。一旦判定AAV載體基因體於原液中之濃度，其可用合適緩衝劑稀釋或透析以用於製備供投予至個體之組成物。
治療方法
本揭露提供用於治療抗肌萎縮蛋白病之方法，其藉由向需要治療抗肌萎縮蛋白病之個體投予治療有效劑量或量的本揭露之AAV載體，諸如但不限於稱為AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA之載體。在一些實施例中，抗肌萎縮蛋白病係肌肉失養症，包括但不限於杜興氏肌肉失養症(DMD)、貝克氏肌肉失養症(BMD)、DMD相關擴張性心肌病(DCM)及女性有症狀的帶原者狀態。因此在一些實施例中，本揭露提供用於治療肌肉失養症之方法，其藉由向需要治療肌肉失養症之個體投予治療有效劑量或量的本揭露之AAV載體，諸如但不限於稱為AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA之載體。在相關實施例中，本揭露提供用於治療有需要治療之個體的杜興氏肌肉失養症(DMD)、貝克氏肌肉失養症(BMD)、DMD相關擴張性心肌病(DCM)及女性有症狀的帶原者狀態之方法。
亦提供本揭露之AAV載體或醫藥組成物於製造用於本文所揭示之治療方法中的藥物之用途。此外，提 供用於本文所揭示之治療方法之本揭露之AAV載體或醫藥組成物。
治療抗肌萎縮蛋白病諸如DMD個體不需要導致治癒(cure)才被視為有效，其中治癒被定義為阻止疾病進展、或部分或完全恢復個體的肌肉功能。相反地，治療有效劑量或量的本揭露之AAV載體可減少或改善抗肌萎縮蛋白病諸如DMD的症狀、延緩抗肌萎縮蛋白病諸如DMD的進展、或改善罹患抗肌萎縮蛋白病諸如DMD之個體的生活品質。根據某些非限制性實施例，治療抗肌萎縮蛋白病個體可改善他們的移動性(mobility)、延緩他們失去行動力(ambulation)或其他移動性的時間，且在一些嚴重抗肌萎縮蛋白病諸如DMD病例中延長罹患該病症之個體的壽命。
本揭露之治療方法可用於治療抗肌萎縮蛋白病諸如DMD之男性或女性個體。在女性病例中，治療可提供給有症狀的帶原者或有完全發展疾病的罕見女性個體。本揭露之方法亦可用於治療任何年齡的抗肌萎縮蛋白病個體，包括小於1歲、或約或至少1歲、或約或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30歲或更年長的個體。個體接受治療時可能可以走動或不能走動。
本揭露之治療方法可用於治療不論實際基因病灶(例如肌萎縮蛋白基因中之刪除、重複、剪接位點變 體或無意義突變)為何之抗肌萎縮蛋白病個體，只要該病灶導致減少或失去天然人肌萎縮蛋白基因之功能。
在本揭露之某些實施例中，以治療有效劑量或量的AAV微小肌萎縮蛋白載體治療個體，將減少一或多個與肌肉失養症之存在或進展相關之生物標記的組織濃度。
根據某些實施例，生物標記係某些自受損骨骼肌或心臟肌肉細胞釋放至血液(包括血清或血漿)中的酶。非限制性實例包括肌酸酐激酶(CK)、轉胺酶丙胺酸轉胺酶(ALT)及天冬胺酸轉胺酶(AST)及乳酸去氫酶(LDH)，已知彼等之平均水準在DMD個體中皆上升。
在一些實施例中，治療有效劑量或量的本揭露之AAV微小肌萎縮蛋白載體有效減少DMD病患之上升的血中ALT水準至大於在類似年齡及性別之健康個體中一般可見水準的約7、6、5、4、3或2倍以內。在其他實施例中，治療有效劑量或量的本揭露之AAV微小肌萎縮蛋白載體有效減少DMD病患之上升的血中AST水準至大於在類似年齡及性別之健康個體中一般可見水準的約7、6、5、4、3或2倍以內。在一些實施例中，治療有效劑量或量的本揭露之AAV微小肌萎縮蛋白載體有效減少DMD病患之上升的血中LDH水準至大於在類似年齡及性別之健康個體中一般可見水準的約7、6、5、4、3或2倍以內。且在一些其他實施例中，治療有效劑量或量的本揭露之AAV微小肌萎縮蛋白載體有效減少DMD病患之上升的血中總CK水準至大於 在類似年齡及性別之健康個體中一般可見之水準的約50、48、46、44、42、40、38、36、34、32、30、28、26、24、22、20、18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、4、3或2倍以內。亦已發現基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)(一種與細胞外基質降解或再造有關的酶)在DMD病患的血液中上升。見例如Nadaraja,VD,et al.,Neuromusc.Disorders 21：569-578(2011)。因此在一些實施例中，治療有效劑量或量的本揭露之AAV微小肌萎縮蛋白載體有效減少DMD病患之上升的血中MMP-9水準至大於在類似年齡及性別之健康個體中一般可見水準的約15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2倍以內。
在其他實施例中，治療有效劑量或量的本揭露之AAV微小肌萎縮蛋白載體單獨或以一或多個這些相同或其他生物標記之組合如上所示有效改變ALT、AST、LDH、CK及MMP-9之水準。因此，在例示性非限制性實施例中，治療有效劑量或量的本揭露之AAV微小肌萎縮蛋白載體有效減少ALT及AST、ALT及LDH、AST及CK或AST及MMP-9等。
在一些本揭露之治療方法中，有效劑量或量的AAV載體係改善6分鐘步行測試(6MWT)之平均個體表現的劑量或量。已建立6MWT作為人類肌肉失養症特別是DMD個體之肌肉功能及移動性的可重現且有效量度。見例如McDonald,CM,et al.,Muscle Nerve 41(4)：500-10(2010)；Henricson,E,et al.,PLOS Currents Musc Dys,8 July 2013；McDonald,CM,et al.,Muscle Nerve 48：343-56(2013)。在此測試中，記錄個體從休息開始，在6分鐘期間可持續且不受協助的行走的距離(公尺)。此距離亦稱為6分鐘行走距離(6MWD)。在測試的一些應用中，個別個體可在數天期間測試超過一次，並將結果平均。由於其優點，6MWT已被採用為涉及可以走動的DMD病患之藥物試驗的主要臨床終點。見例如Bushby,K,et al.,Muscle Nerve 50：477-87(2014)；Mendell,JR,et al.,Ann Neurol 79：257-71(2016)；Campbell,C,et al.,Muscle Nerve 55(4)：458-64(2017)。通常在這些試驗中，治療組中的每個個體在數月或數年期間使用6MWT測試其行動力，以判定治療效應是否存在。
根據本揭露之治療方法的一些實施例，治療療效係藉由比較本揭露之AAV載體對於治療個體(諸如DMD個體)之平均6MWT表現的治療效應，與未治療之相同類型抗肌萎縮蛋白病(諸如DMD)對照個體的平均6MWT表現進行統計判定。該等對照組可被包括於用於評估本揭露之AAV載體的治療療效之相同試驗中，或可為來自DMD或其他抗肌萎縮蛋白病進展之自然病史試驗中的類似個體。對照組可為年齡相符(或例如且不限於分層至該些年輕或年長於一些臨限年齡諸如6、7、8、9或10歲之個體)、先前皮質類固醇治療狀態相符(即是或否，或先前治療的時間長度)、任何治療(也許皮質類固醇除外)前的6MWT基線表現相符(或例如且不限於分層至該些基線 表現低於及高於一些臨限諸如200m、250m、300m、350m、400m、450m或500m之個體)或一些其他經判定為臨床相關之屬性相符者。
根據本揭露之治療方法的某些實施例，治療有效劑量或量的本揭露之AAV載體在投予載體之後3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、或36個月，相較於類似相符或分層對照組，有效增加抗肌萎縮蛋白病諸如DMD個體之平均6MWD約或至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100公尺或更多。在一些這些實施例中，AAV載體包含AAV9殼體及包括編碼微小肌萎縮蛋白之人密碼子最佳化基因之基因體，諸如但不限於命名為AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA之載體。
根據本揭露之治療方法的某些實施例，治療有效劑量或量的本揭露之AAV載體在投予載體之後30、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330、360、390、420、450、480、510、540、570、600、630、660、690或720天，相較於類似相符或分層對照組，有效增加抗肌萎縮蛋白病諸如DMD個體之平均6MWD約或至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100公尺或更多。在一些這些實施例中，AAV載體包含AAV9殼體及包括編碼微小肌萎縮蛋白之人密碼子最佳化基因之基因體，諸如但不限於命名為AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA之載體。
作為6MWT之替代物，治療療效可表示為個體爬上4階標準尺寸樓梯所需時間的減少，該測試稱為爬4階樓梯測試。此測試已被用於評估皮質類固醇治療於DMD病患的有效性。Griggs,RC,et al.,Arch Neurol 48(4)：383-8(1991).因此，根據本揭露之治療方法的某些實施例，治療有效劑量或量的本揭露之AAV載體在投予載體之後3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、或36個月，相較於類似相符或分層對照組，有效減少抗肌萎縮蛋白病諸如DMD個體進行爬4階樓梯測試所需之平均時間約或至少0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8或4.0秒或更多。在一些這些實施例中，AAV載體包含AAV9殼體及包括編碼微小肌萎縮蛋白之人密碼子最佳化基因之基因體，諸如但不限於命名為AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA之載體。
在本揭露之治療方法的相關實施例中，治療有效劑量或量的本揭露之AAV載體在投予載體之後30、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330、360、390、420、450、480、510、540、570、600、630、660、690或720天，相較於類似相符或分層對照組，有效減少抗肌萎縮蛋白病諸如DMD個體進行爬4階樓梯測試所需之平均時間約或至少0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8或4.0秒或更多。在一些這些實施例中， AAV載體包含AAV9殼體及包括編碼微小肌萎縮蛋白之人密碼子最佳化基因之基因體，諸如但不限於命名為AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA之載體。
治療療效亦可表示為在治療後一定時間經歷失去行動力之個體百分比相較於對照組隨時間減少。失去行動力定義為開始連續依賴使用輪椅。因此，根據本揭露之治療方法的仍其他實施例，治療有效劑量或量的本揭露之AAV載體在投予至抗肌萎縮蛋白病諸如DMD個體之後3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、或36個月，相較於類似相符或分層對照組，減少失去行動力的個體平均數目至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%或更多。在一些這些實施例中，AAV載體包含AAV9殼體及包括編碼微小肌萎縮蛋白之人密碼子最佳化基因之基因體，諸如但不限於命名為AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA之載體。
在本揭露之治療方法的一些實施例中，治療有效劑量或量的本揭露之AAV載體有效延緩抗肌萎縮蛋白病諸如DMD個體之一或多個症狀的開始。症狀開始之前的診斷可經由產前、產期或產後基因測試DMD基因突變完成。根據某些實施例，以本揭露之AAV載體治療相較於類似相符或分層對照組，有效延緩DMD之一或多個症狀的開始至少或約3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、15、16、18、20、22、24、25、26、28、30、32、34、35、36、38、40、42、44、45、46、48、50、52、54、55、 56、28、60、62、64、65、66、68、70、72、74、75、76、78或80個月或更多。如所屬技術領域中具有通常知識者理解的，DMD的早期症狀包括但不限於走路能力延緩(至平均約18個月齡，相較於無DMD嬰兒平均12至15個月)；跳躍、奔跑或爬樓梯困難；容易跌倒；近端肌肉虛弱，例如當從地上爬起時展現Gowers氏現象；腓肌因假肥大擴大；步伐搖晃，因個體用腳趾及/或前腳掌走路；傾向藉由突出腹部及後拉肩膀以維持平衡；及認知障礙，諸如接受性語言、表達性語言、視覺空間能力、精確運動技巧、注意力及記憶技巧減少。在一些這些實施例中，AAV載體包含AAV9殼體及包括編碼微小肌萎縮蛋白之人密碼子最佳化基因之基因體，諸如但不限於命名為AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA之載體。
治療療效亦可表示為經歷脂肪組織替換瘦肉組織的量增加之載體治療個體百分比相較於未治療對照組隨時間減少。在一些實施例中，此朝向脂肪組織增加之進展可使用MRI分析DMD病患的腿部肌肉判定，並表示為脂肪比例(FF)，如Willcocks,RJ,et al.,Multicenter prospective longitudinal study of magnetic resonance biomarkers in a large Duchenne muscular dystrophy cohort,Ann Neurol 79：535-47(2016)中進一步解釋。在相關實施例中，以本揭露之AAV載體治療DMD個體之後3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、或36個月，相較於相符對照組，有效減少DMD個體由MRI判定之下肢平均FF約 或至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或更多。在一些這些實施例中，AAV載體包含AAV9殼體及包括編碼微小肌萎縮蛋白之人密碼子最佳化基因之基因體，諸如但不限於命名為AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA之載體。
在一些實施例中，治療有效劑量或量的本揭露之AAV載體導致治療之後3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、或36個月，至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或更多的骨骼肌纖維表現微小肌萎縮蛋白。微小肌萎縮蛋白表現陽性的肌肉纖維百分比可藉由以能夠特異性結合微小肌萎縮蛋白之抗肌萎縮蛋白抗體免疫標示來自治療個體之肌肉活體組織切片判定。合適免疫標示技術描述於實例中，且為所屬技術領域中具有通常知識者所熟悉。可採集之治療個體的例示性肌肉活體組織切片包括二頭肌、三角肌及四頭肌，雖然也可採集其他肌肉活體組織切片。在一些這些實施例中，AAV載體包含AAV9殼體及包括編碼微小肌萎縮蛋白之人密碼子最佳化基因之基因體，諸如但不限於命名為AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA之載體。
在一些實施例中，判定本揭露之AAV載體用於治療抗肌萎縮蛋白病諸如肌肉失養症諸如DMD的劑量或量係治療有效且同時不在治療個體或僅在低百分比之該等個體造成具微小肌萎縮蛋白特異性之細胞性(T細胞)免 疫反應。對抗微小肌萎縮蛋白之T細胞反應的存在或程度可使用ELISPOT檢定判定，以偵測因應暴露至涵蓋微小肌萎縮蛋白胺基酸序列之重疊肽庫而生產γ干擾素(IFNγ)之自個體血液單離之周邊血液單核細胞(PBMC)。在某些實施例中，陽性IFNγ反應之臨限可設定為每百萬個測試的PBMC大於50個斑點形成細胞。也可能使用其他檢定以偵測對抗微小肌萎縮蛋白之T細胞反應，包括但不限於在獲自載體治療個體之肌肉或其他表現微小肌萎縮蛋白之組織的活體組織切片中偵測T細胞浸潤。個體可為人類個體或動物個體，諸如DMD動物模型，諸如mdx小鼠、mdx大鼠或GRMD犬模型。在其他實施例中，判定本揭露之AAV載體用於治療抗肌萎縮蛋白病諸如肌肉失養症諸如DMD的劑量或量係治療有效且同時不造成或僅在低百分比之該等個體造成對抗殼體、載體基因體(或其任何組分)或由轉導細胞表現之微小肌萎縮蛋白之發炎反應。在不希望受到任何特定操作理論之束縛下，因應AAV載體之發炎可由先天免疫反應造成。若有任何發炎存在於載體治療個體之肌肉中，可使用磁振造影偵測。見例如J Garcia,Skeletal Radiol 29：425-38(2000)及Schulze,M,et al.,Am J Radiol 192：1708-16(2009)。個體可為人類個體或動物個體，諸如DMD動物模型，諸如mdx小鼠、mdx大鼠或GRMD犬模型。在上述之一些實施例中，細胞性免疫反應或發炎之存在或不存在係於治療之後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36個月或治療之後一些其他時間測定。在相關實施例中，低百分比之個體展現對微小肌萎縮蛋白之細胞性免疫反應可為少於或等於約0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%的投予載體個體。在一些這些實施例中，AAV載體包含AAV9殼體及包括編碼微小肌萎縮蛋白之人密碼子最佳化基因之基因體，諸如但不限於命名為AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA之載體。
在相關實施例中，本揭露之AAV載體用於治療抗肌萎縮蛋白病諸如肌肉失養症諸如DMD的劑量或量在治療個體係治療有效，無需併用免疫抑制。因此，在某些實施例中，以AAV載體治療抗肌萎縮蛋白病諸如DMD個體係有效，無需在治療之前、期間或之後向個體投予一或多種免疫抑制藥物(類固醇治療除外，其為目前的標準照護)。例示性免疫抑制藥物包括但不限於鈣調磷酸酶抑制劑諸如他克莫司(tacrolimus)及環孢靈、抗增生劑諸如黴酚酸酯(mycophenolate)、來氟米特(leflunomide)及硫唑嘌呤(azathioprine)、或mTOR抑制劑諸如西羅莫司(sirolimus)及依維莫司(everolimus)。
如在實例中詳細探索的，本揭露之AAV載體(包括但不限於命名為AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA之載體)的療效可在杜興氏肌肉失養症動物模型中測試，且結果用於預測該等載體在人類DMD病患的有效劑量。各種動 物模型係所屬技術領域中已知，包括mdx小鼠模型、黃金獵犬肌肉失養症模型及較為最近的Dmd mdx 大鼠模型，其在實例中詳細描述。
基於Dmd mdx 大鼠模型，本揭露之AAV載體(包括命名為AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA之載體)的有效劑量可根據大鼠疾病病程的各種生物參數及態樣建立。
因此，根據本揭露之某些實施例，以一劑至少1×1014vg/kg或3×1014vg/kg之AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA治療Dmd mdx 大鼠，在注射後3個月或6個月相較於對照組有效減少血清AST、ALT、LDH或總肌胺酸激酶之水準。
在其他實施例中，以一劑至少1×1014vg/kg或3×1014vg/kg之AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA治療Dmd mdx 大鼠，在注射後3個月或6個月相較於對照組有效減少股二頭肌、橫膈或心臟肌肉中之纖維化。
在又其他實施例中，以一劑至少1×1014vg/kg或3×1014vg/kg之AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA治療Dmd mdx 大鼠，在注射後3個月或6個月相較於對照組有效增加前肢抓力。
根據其他實施例，以一劑至少1×1014vg/kg或3×1014vg/kg之AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA治療Dmd mdx 大鼠，在注射後3個月或6個月相較於對照組有效減少5次相隔短暫的前肢抓力測試試驗所測量的肌肉疲勞。
在一些其他實施例中，以一劑至少1×1014 vg/kg或3×1014vg/kg之AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA治療Dmd mdx 大鼠，在注射後6個月相較於對照組有效增加使用心臟超音波圖所測量的左心室射出率。
在其他實施例中，以一劑至少1×1014vg/kg或3×1014vg/kg之AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA治療Dmd mdx 大鼠，在注射後3個月或6個月相較於對照組有效增加使用心臟超音波圖所測量的早期對晚期左心室填充速度比例(即E/A比例)。
根據一些實施例，以一劑至少1×1014vg/kg或3×1014vg/kg之AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA治療Dmd mdx 大鼠，在注射後3個月或6個月相較於對照組有效降低使用心臟超音波圖所測量的等容弛緩時間(IVRT)或E峰速度與其回復至基線之間的時間(毫秒)(即E波減速時間(DT))。
在前述各實施例中，載體治療動物的生理測量相較於對照動物的增加或降低在一些實施例中可測試統計顯著性。採用何種統計檢定之選擇係所屬技術領域中具有通常知識者的知識範圍內。當採用p值作為評估統計顯著性之方式時，該等p值在計算出後可與預先定義之顯著水準比較，且若p值小於顯著水準，則治療效應應被判定為具有統計顯著性。在一些實施例中，顯著水準可預先定義為0.25、0.20、0.15、0.10、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.005或一些其他顯著水準。因此，在例示性非限制性實施例中，當顯著水準預先定義為0.05，則計算之p值< 0.05將被解讀為代表載體治療與對照組之間具有統計顯著差異。
在前述各實施例中，對照組可為未治療或僅用媒劑而非載體處理之相同性別及基因背景的年齡相符動物。然而其他對照組也有可能。
在一些其他實施例中，以一劑至少3×1014vg/kg之AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA治療Dmd mdx 大鼠，在注射後3個月或6個月有效轉導股二頭肌、橫膈、心肌、或其他橫紋肌及表現由opti-Dys3978基因所編碼之微小肌萎縮蛋白，而不誘導抗微小肌萎縮蛋白之細胞性免疫反應。對抗微小肌萎縮蛋白之細胞性免疫反應可藉由下列評估：自測試動物單離脾細胞或血液淋巴細胞諸如周邊血液單核細胞(PBMC)；培養細胞與來自涵蓋微小肌萎縮蛋白胺基酸序列之重疊肽庫的分群(例如5群)之肽(例如15個胺基酸長之肽，各有10個胺基酸重疊)；及判定細胞是否因應暴露至肽而生產γ干擾素(IFNγ)。IFNγ之生產可使用ELISPOT檢定根據所屬技術領域中具有通常知識者之知識判定。見例如Smith,JG,et al.,Clin Vaccine Immunol 8(5)：871-9(2001),Schmittel A,et al.,J Immunol Methods 247：17-24(2001),and Marino,AT,et al.,Measuring immune responses to recombinant AAV gene transfer,Ch.11,pp.259-72,Adeno-Associated Virus Methods and Protocols,Ed.RO Snyder and P Moullier,Humana Press(2011)。在某些實施例中，陽性IFNγ反應之臨限可設定為 每百萬個測試細胞大於50個斑點形成細胞，或在其他實施例中，設定為使用陰性對照組(例如僅介質而無添加肽)所偵測之斑點形成細胞數量的至少3倍，因此陰性反應將被視為低於這些臨限。
在本揭露之治療方法的一些實施例中，用於治療抗肌萎縮蛋白病諸如DMD之AAV載體係與至少第二劑聯合投予至需要治療抗肌萎縮蛋白病諸如DMD之個體，該第二劑已確立或據信可有效治療抗肌萎縮蛋白病諸如DMD。聯合投予AAV載體意指在第二劑治療之前、之同時或之後治療個體。根據某些實施例，AAV載體係與造成DMD基因外顯子跳過(例如肌萎縮蛋白基因之外顯子51或肌萎縮蛋白基因之一些其他外顯子)之反股寡核苷酸聯合投予。造成肌萎縮蛋白基因之外顯子51跳過之劑包括屈沙培森(drisapersen)及依替利森(eteplirsen)，但其他也有可能。在其他實施例中，AAV載體係與抑制個體肌肉生成抑制素功能之劑(諸如抗肌肉生成抑制素抗體，其實例提供於美國專利第7,888,486、8,992,913及8,415,459號)聯合投予。在其中個體之抗肌萎縮蛋白病可歸因於肌萎縮蛋白基因無意義突變之其他實施例中，AAV載體係與促進核糖體通讀無意義突變之藥劑(諸如阿他盧侖(ataluren))或與抑制過早終止密碼子之藥劑(諸如胺基糖苷諸如建它黴素)聯合投予。在其他實施例中，AAV載體係與同化類固醇(諸如氧雄龍(oxandrolone))聯合投予。且在仍其他實施例中，AAV載體係與皮質類固醇(諸如但不限於強體松 (prednisone)、地氟可特(deflazacort)、或普賴蘇龍(prednisolone))聯合投予。在這些方法的一些實施例中，AAV載體係包含包括編碼微小肌萎縮蛋白之人密碼子最佳化基因之基因體的AAV9載體，諸如但不限於命名為AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA之載體。
醫藥配方及投予模式
根據本發明之病毒載體及殼體可用於獸醫及人醫應用。合適個體包括禽類及哺乳動物。如本文中所使用之用語「禽類(avian)」包括但不限於雞、鴨、鵝、鵪鶉、土雞、雉雞、鸚鵡、長尾鸚鵡及類似者。如本文中所使用之用語「哺乳動物(mammal)」包括但不限於人類、非人類靈長動物、牛、綿羊、山羊、馬、貓、犬、兔類動物等。人類個體包括新生兒、幼兒、青少年及成年人。可選地，個體「需要(in need of)」本發明之方法，例如因為該個體具有病症(包括該些在本文中描述者)或據信有該病症之風險，或將可得益於遞送多核苷酸(包括該些在本文中描述者)。作為進一步選項，個體可為實驗動物及/或疾病的動物模型。
在具體實施例中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含本發明之病毒載體(諸如rAAV顆粒)及/或殼體於醫藥上可接受之載劑及可選地其他藥劑、醫藥劑、穩定劑、緩衝劑、載劑、佐劑、稀釋劑等。用於注射時，載劑一般將為液體。用於其他投予方法時，載劑可為固體或 液體。用於吸入投予時，載劑將為適於呼吸的，且可選地可為固體或液體顆粒形式。
「醫藥上可接受(pharmaceutically acceptable)」意指材料不具毒性或其他非所欲性質，也就是材料可投予至個體而不造成任何非所欲之生物效應。
本發明之一態樣係一種轉移編碼微小肌萎縮蛋白之多核苷酸至體外細胞之方法。病毒載體可根據適合特定目標細胞之標準轉導方法以適當感染複數導入細胞中。投予之病毒載體力價可取決於目標細胞種類及數量及特定病毒載體而異，且所屬技術領域中具有通常知識者不須過度實驗即可判定。在代表性實施例中，將至少約103個具傳染性單位、更佳至少約105個具傳染性單位導入細胞。
被病毒載體導入之細胞可為任何種類，包括但不限於肌肉細胞(例如骨骼肌細胞、心肌細胞、平滑肌細胞及/或橫膈肌細胞)、幹細胞、生殖細胞及類似者。在代表性實施例中，細胞可為任何祖細胞。有進一步可能的，細胞可為幹細胞(例如肌肉幹細胞)。另外，細胞可來自如上所示之任何來源物種。
病毒載體可經導入體外細胞中，以達投予經修飾的細胞至個體之目的。在具體實施例中，細胞係自個體移除、將病毒載體導入其中、接著將細胞投予回個體。自個體移除細胞以離體操作隨後導入回個體之方法係所屬技術領域中已知(見例如美國專利第5,399,346號)。替代 地，重組病毒載體可導入來自供體個體之細胞、導入培養細胞或導入來自任何其他合適來源之細胞中，且細胞被投予至有需要之個體(即「受體(recipient)」個體)。
適合用於離體基因遞送之細胞係如上所述。投予至個體之細胞劑量將隨個體年齡、病況及物種、細胞種類、由細胞表現之核酸、投予模式及類似者而異。一般而言，每劑量至少約102至約108個細胞或至少約103至約106個細胞於醫藥上可接受之載劑中將被投予。在具體實施例中，經病毒載體轉導之細胞以治療有效或預防有效量與醫藥載劑組合投予至個體。
本發明之進一步態樣係一種投予病毒載體至個體之方法。投予根據本發明之病毒載體及/或殼體至有需要之人類個體或動物可藉由所屬技術領域中已知之任何手段。可選地，病毒載體及/或殼體係以治療有效或預防有效劑量於醫藥上可接受之載劑中遞送。
將投予至個體的病毒載體及/或殼體之劑量取決於投予模式、所欲治療及/或預防之疾病或病況、個別個體之病況、特定病毒載體或殼體及所欲遞送之核酸及類似者，且可以例行方式判定。用於達到治療效應之例示性劑量係至少約105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015個轉導單位、可選地約108至1013個轉導單位之力價。
在具體實施例中，超過一次投予(例如二、三、四或更多次投予)可經採用以在各種間隔期間例如每 天、每週、每月、每年等達成所欲之基因表現水準。
在某些實施例中，本揭露之AAV載體或顆粒可以包含相同或不同血清型之空AAV殼體之組成物投予至個體。空殼體係包含典型安排及比例的VP1、VP2及VP3殼體蛋白質但不含載體基因體之AAV殼體。在不希望受到任何特定操作理論之束縛下，假設空殼體的存在可減少對抗AAV載體之殼體的免疫反應且藉此增加轉導效率。空殼體可天然發生於AAV載體之製劑中，或以已知量添加以達成已知比例的空殼體對AAV載體(即含有載體基因體之殼體)。空殼體之製備、純化及定量係所屬技術領域中具有通常知識者的知識範圍內。包含本揭露之AAV載體及空殼體之組成物可調製為空殼體相對於AAV載體過量、或含有基因體之AAV載體相對於空殼體過量。因此，在一些實施例中，本揭露之組成物包含本揭露之AAV載體及相同或不同血清型之空殼體，其中空殼體對AAV載體之比例係約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、 9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10比1、或一些其他比例。
在其他實施例中，本揭露提供用於治療抗肌萎縮蛋白病諸如肌肉失養症諸如DMD之AAV載體顆粒的例示性有效劑量，定量為每公斤個體體重(kg)之載體基因體(vg)，縮寫為vg/kg。根據某些實施例，本揭露之AAV載體(包括該些包含AAV9殼體及包括編碼微小肌萎縮蛋白之人密碼子最佳化基因的基因體者，諸如但不限於命名為AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA之載體)的有效劑量係約1×1012vg/kg、2×1012vg/kg、3×1012vg/kg、4×1012vg/kg、5×1012vg/kg、6×1012vg/kg、7×1012vg/kg、8×1012vg/kg、9×1012vg/kg、1×1013vg/kg、2×1013vg/kg、3×1013vg/kg、4×1013vg/kg、5×1013vg/kg、6×1013vg/kg、7×1013vg/kg、8×1013vg/kg、9×1013vg/kg、1×1014vg/kg、1.5×1014vg/kg、2×1014vg/kg、2.5×1014vg/kg、3×1014vg/kg、3.5×1014vg/kg、4×1014vg/kg、5×1014vg/kg、6×1014vg/kg、7×1014vg/kg、8×1014vg/kg、或9×1014vg/kg、或一些其他劑量。在這些實施例的任一者中，AAV載體可單獨以醫藥上可接受之組成物、或與相同殼體血清型之空殼體以空殼體對載體比例約0.5：1、1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、或一些其他比例投予至個體。
例示性投予模式包括口服、經直腸、經黏膜、鼻內、吸入(例如經由氣霧劑)、經頰(例如舌 下)、經陰道、鞘內、眼內、經皮、內皮內、子宮內(或卵中)、非經腸(例如靜脈內、皮下、皮內、顱內、肌肉內(包括投予至骨骼肌、橫膈肌及/或心肌)、胸膜內、大腦內及關節內)、局部(例如皮膚及黏膜表面，包括呼吸道表面及經皮投予)、淋巴內及類似者、以及直接組織或器官注射(例如注射至骨骼肌、心肌或橫膈肌)。
可投予至個體之任何部位，包括但不限於選自由骨骼肌、平滑肌、心臟及橫膈所組成之群組的部位。
根據本發明投予至骨骼肌包括但不限於投予至肢體(例如上臂、下臂、大腿及/或小腿)、背、頸、頭(例如舌)、胸部、腹部、骨盆/會陰及/或指(趾)。合適骨骼肌包括但不限於：外展小指肌(手)、外展小趾肌(腳)、外展足拇肌、外展第五蹠骨肌、外展拇短肌、外展拇長肌、內收短肌、內收足拇肌、內收長肌、內收大肌、內收拇肌、肘肌、前斜角肌、膝關節肌、肱二頭肌、股二頭肌、肱肌、肱橈肌、頰肌、喙肱肌、皺眉肌、三角肌、降口角肌、下脣掣肌、二腹肌、骨間背側肌(手)、骨間背側肌(腳)、橈側伸腕短肌、橈側伸腕長肌、尺側伸腕肌、伸小指肌、伸指肌、伸趾短肌、伸趾長肌、伸拇趾短肌、伸拇趾長肌、伸食指肌、伸拇短肌、伸拇長肌、橈側屈腕肌、尺側屈腕肌、短小指屈肌(手)、短小指屈肌(腳)、屈趾短肌、屈趾長肌、屈指深肌、屈指淺肌、屈拇趾短肌、屈拇趾長肌、屈拇短肌、屈拇長肌、額肌、腓腸肌、頦舌骨肌、臀大肌、臀中肌、臀小肌、薄肌、項 髂肋肌、腰髂肋肌、胸髂肋肌、髂肌、孖下肌、下斜肌、下直肌、棘下肌、棘間肌、橫突間肌、翼外肌、外直肌、背闊肌、提口角肌、提上唇肌、鼻脣舉肌、上瞼舉肌、提肩胛肌、長旋肌、頭最長肌、頸最長肌、胸最長肌、頭長肌、頸長肌、蚓狀肌(手)、蚓狀肌(腳)、嚼肌、翼內側肌、內直肌、中斜角肌、多裂肌、下頜舌骨肌、頭下斜肌、頭上斜肌、閉孔外肌、閉孔內肌、枕骨肌、肩舌肌、小指對掌肌、拇指對掌肌、眼輪匝肌、口輪匝肌、掌側骨間肌、掌短肌、掌長肌、恥骨肌、胸大肌、胸小肌、腓骨短肌、腓骨長肌、腓骨第三肌、梨狀肌、骨間蹠側肌、蹠肌、闊肌、膕肌、後斜角肌、旋前方肌、旋前圓肌、腰大肌、股方肌、蹠方肌、頭前直肌、頭側直肌、大頭後直肌、小頭後直肌、股直肌、大菱形肌、小菱形肌、笑肌、縫匠肌、小斜角肌、半膜肌、頭半棘肌、頸半棘肌、胸半棘肌、半腱肌、前鋸肌、短旋肌、比目魚肌、頭棘肌、頸棘肌、胸棘肌、頭夾肌、頸夾肌、胸鎖乳頭肌、胸舌肌、胸盾肌、莖突舌骨肌、鎖骨下肌、肩胛下肌、孖上肌、上斜肌、上直肌、旋後肌、棘上肌、顳肌、闊筋膜張肌、大圓肌、小圓肌、胸部肌肉、盾舌肌、脛骨前肌、脛骨後肌、斜方肌、肱三頭肌、股間肌、外股肌、內股肌、顴大肌及顴小肌及任何其他所屬技術領域中已知之合適骨骼肌。
病毒載體可藉由靜脈內投予、動脈內投予、腹膜內投予、肢體灌流(可選地腿及/或臂之單離肢體灌 流；見例如Arruda et al.,(2005)Blood 105：3458-3464)及/或直接肌肉內注射遞送至骨骼肌。在具體實施例中，病毒載體及/或殼體藉由肢體灌流可選地單離肢體灌流(例如藉由靜脈內或關節內投予)投予至個體(例如肌肉失養症諸如DMD個體)的肢體(臂及/或腿)。在本發明之實施例中，本發明之病毒載體及/或殼體可在不採用「流體動力學(hydrodynamic)」技術下有利地投予。先前技術的載體之組織遞送(例如至肌肉)通常藉由增加血管壓力並促進載體穿過內皮細胞障壁之能力的流體動力學技術(例如大體積的靜脈內/靜脈內投予)增強。在具體實施例中，本發明之病毒載體及/或殼體可在不使用流體動力學技術諸如高體積輸注及/或提高血管內壓力(例如大於正常收縮壓，例如血管內壓力相較於正常收縮壓增加小於或等於5%、10%、15%、20%、25%)下投予。該等方法可減少或避免與流體動力學技術相關之不良反應，諸如水腫、神經傷害及/或腔室症候群。
投予至心肌包括投予至左心房、右心房、左心室、右心室及/或中隔。病毒載體及/或殼體可藉由靜脈內投予、動脈內投予諸如主動脈內投予、直接心臟注射(例如直接注射至左心房、右心房、左心室、右心室)及/或冠狀動脈灌流遞送至心肌。
投予至橫膈肌可藉由任何合適方法包括靜脈內投予、動脈內投予及/或腹膜內投予進行。
投予至平滑肌可藉由任何合適方法包括靜脈 內投予、動脈內投予及/或腹膜內投予進行。在一實施例中，可投予至存在於平滑肌之中、之附近及/或之上的內皮細胞。
遞送至目標組織亦可藉由遞送包含病毒載體及/或殼體之貯劑達成。在代表性實施例中，包含病毒載體及/或殼體之貯劑係經植入骨骼肌、平滑肌、心肌及/或橫膈肌組織中，或組織可與包含病毒載體及/或殼體之膜或其他基質接觸。該植入式基質或基材係描述於美國專利第7,201,898號。
在具體實施例中，根據本發明之病毒載體係投予至骨骼肌、橫膈肌及/或心肌(例如以治療及/或預防肌肉失養症)。
在代表性實施例中，本發明係用於治療及/或預防骨骼肌、心肌及/或橫膈肌之病症。
在一代表性實施例中，本發明提供一種治療及/或預防有需要之個體的肌肉失養症之方法，該方法包含：投予治療或預防有效量的本發明之病毒載體至哺乳動物個體，其中病毒載體包含編碼肌萎縮蛋白、微小肌萎縮蛋白或微型肌萎縮蛋白之異源性核酸。在具體實施例中，病毒載體可如本文他處所述投予至骨骼肌、橫膈肌及/或心肌。
注射劑可經製備為習用形式，如液體溶液或懸浮液，或適合在注射前經溶解或懸浮於液體中之固體形式，或作為乳劑。替代地，可以局部而非系統性方式投予 本發明之病毒載體及/或病毒殼體，例如以貯劑或持續釋放配方。另外，病毒載體及/或病毒殼體可黏著至外科植入式基質遞送(例如於美國專利公開號2004-0013645中所述)。
現已描述本發明，並將在下列實例中更詳細解釋本發明，但下列實例僅為說明目的包括在本文中，並非意欲限制本發明。
實例1
合成密碼子最佳化人微小肌萎縮蛋白基因
先前我們藉由PCR選殖人肌萎縮蛋白cDNA產製一些微小版本的人肌萎縮蛋白基因，產製在中央棒狀結構域具有大量刪除且在肌萎縮蛋白編碼序列的C端區域幾乎完全刪除的微小肌萎縮蛋白基因(Wang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 97：13714(2000)；美國專利第7,001,761及7,510,867號)。這些微小肌萎縮蛋白基因經測試在DMD mdx小鼠模型中具有高度體內功能性(Watchko et al.,Human Gene Therapy 13：1451(2002))。這些微小肌萎縮蛋白的其中一種稱為△3990，在美國專利第7,510,867號中描述為SEQ ID NO：6。△3990之蛋白質序列及編碼其之DNA分別係本文提供之SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28。
對△3990微小肌萎縮蛋白之修飾亦經設計、密碼子最佳化及測試活性。此新的人微小肌萎縮蛋白稱為 Dys3978，長度為1325個胺基酸，且包括來自野生型全長人肌萎縮蛋白(SEQ ID NO：25)的下列部分或子結構域：N端及肌動蛋白結合結構域(ABD)、絞鏈H1、棒狀結構域R1及R2、絞鏈H3、棒狀結構域R22、R23及R24、絞鏈H4、半胱胺酸富含區(CR結構域)及部分羧基端結構域(CT結構域)。此蛋白質的胺基酸序列提供於SEQ ID NO：7，且以示意圖繪示於圖1。為了減少潛在免疫原性，刪除△3990蛋白質C端的最後四個胺基酸。在產生△3990時，此序列係藉由接合肌萎縮蛋白羧基端結構域的部分胺基端(終於P3409)與肌萎縮蛋白的最後三個胺基酸(3683至3685，或DTM)形成。此四個胺基酸片段不具有已知功能，且可作用為新的表位，因為該序列不出現在野生型肌萎縮蛋白中。此外，在△3990中胺基酸2號位的纈胺酸(不存在於野生型肌萎縮蛋白中，但來自產製△3990起始密碼子附近的一致Kozak起始序列時)被改變成原本存在於肌萎縮蛋白中之白胺酸。因此△3990與Dys3978之間有5個胺基酸差異。△3990與Dys3978之間的胺基酸序列比對提供於圖55A至55C。
編碼Dys3978之基因係藉由合併來自野生型肌萎縮蛋白編碼序列之對應上述蛋白子結構域的子序列建構。所得基因提供於SEQ ID NO：26。為了增加Dys3978的表現，基因序列使用人密碼子演算法進行密碼子最佳化。所得之人密碼子最佳化基因稱為Hopti-Dys3978，其提供於SEQ ID NO：1。亦產製犬密碼子最佳化基因編碼 Dys3978，稱為Copti-Dys3978，其序列提供於SEQ ID NO：3。比較Hopti-Dys3978與非密碼子最佳化基因編碼△3990之DNA序列比對提供於圖56A至56I。
除了其他改變之外，密碼子最佳化使基因編碼Dys3978的總GC含量自非密碼子最佳化基因的約46%，增加至人密碼子最佳化基因(即Hopti-Dys3978)的約61%。增加GC含量可導致哺乳動物細胞中的mRNA水準增加。見例如，Grzegorz,K,et al.,PLoS Biol,4(6)：e180(2006)；及Newman,ZR,et al.,PNAS,E1362-71(2016)。密碼子最佳化亦增加密碼子適應指數(CAI)且包括在編碼序列的起點添加Kozak一致轉錄起始辨識位點。
為了檢查人密碼子最佳化是否可以增強基因表現，將Hopti-Dys3978基因選殖至含有組成性活性CMV啟動子及小型合成聚腺苷酸化(polyA)信號序列(SEQ ID NO：6)的AAV載體表現卡匣。在轉染至人HEK 293細胞後，含有Hopti-Dys3978基因之載體質體相較於非最佳化基因編碼Dys3978顯示驚人較高的蛋白表現，其中使用免疫螢光染色及西方墨點轉漬法對於肌萎縮蛋白進行定量判定(圖2)。
亦產製及密碼子最佳化一編碼人微小肌萎縮蛋白且結構類似Dys3978惟絞鏈H3不存在之基因。此基因Hopti-Dys3837(SEQ ID NO：2)編碼具有1278個胺基酸之人微小肌萎縮蛋白Dys3837(SEQ ID NO：8)，其亦以示意圖繪示於圖1。
在本文中描述之其他實驗中，人及犬密碼子最佳化Dys3978基因係放置於如下所示之源自肌肉肌胺酸激酶基因之二個不同的合成肌肉特異性啟動子及增強子組合中之一者的控制下：1)合成雜交肌肉特異性啟動子(hCK)(SEQ ID NO：4)；以及2)合成雜交肌肉特異性啟動子+(hCKplus)(SEQ ID NO：5)；在實驗中使用時，下列載體使用標準分子選殖技術建構。將特異性啟動子、微小肌萎縮蛋白基因及polyA序列的基因表現卡匣選殖至含有AAV2反向末端重複(ITRs)之AAV載體質體骨架中以側接表現卡匣。
1)AAV-CMV-Hopti-Dys3978
2)AAV-hCK-Hopti-Dys3978(SEQ ID NO：9)
3)AAV-hCK-Hopti-Dys3837(SEQ ID NO：10)
4)AAV-hCKplus-Hopti-Dys3837(SEQ ID NO：11)
5)AAV-hCK-Copti-Dys3978(SEQ ID NO：12)
實例2
CMV-Hopti-Dys3978用於肌萎縮蛋白/抗肌萎縮蛋白相關蛋白雙基因剔除小鼠
在杜興氏肌肉失養症(DMD)病患中的肌萎縮蛋白喪失，導致毀滅性的骨骼肌退化及心肌病。僅缺乏肌 萎縮蛋白之Mdx小鼠具有遠較輕微的表型，然而同時缺乏肌萎縮蛋白及其同源物抗肌萎縮蛋白相關蛋白之雙基因剔除(dKO)小鼠展現和DMD病患同樣嚴重的肌肉失養症臨床症狀。先前已證實，對新生同型合子dKO小鼠腹膜內注射3×1011vg/小鼠的AAV1-CMV-△3990(非密碼子最佳化)，能部分恢復生長、功能且延長數月之壽命期(在22週有50%存活率)(見Wang et al.,J.Orthop.Res,27：421(2009)之圖6B)。在此，使用AAV9作為殼體評估系統性遞送人密碼子最佳化Hopti-Dys3978基因之治療效應。結果顯示單次系統性投予(IP)AAV9-CMV-Hopti-Dys3978約2×1013vg/kg至1週齡新生dKO小鼠，導致微小肌萎縮蛋白基因在骨骼肌及整個心肌中的廣泛表現(圖3)。AAV9治療dKO小鼠顯示幾乎正常的生長曲線及體重(圖4)且顯著改善以抓力及跑步機跑步測試評估的肌肉功能(圖5)。治療dKO小鼠亦顯示肌肉失養病狀改善(圖6A至6B)及整體健康大幅改善。當與經AAV1載體表現性非密碼子最佳化△3990治療之dKO小鼠比較時，經Hopti-Dys3978基因治療之dKO小鼠顯示延長許久的壽命期(50%存活率：22週相較於超過80週)(圖7)。未預期的，雄性及雌性dKO小鼠之生育力皆恢復(表1)，暗示整體功能改善且平滑肌功能也可能獲得改善。
未治療dKO小鼠完全不孕。然而，AAV-CMV-Hopti-Dys3978使經治療之dKO(T-dKO)雄性及雌性小鼠恢復生育力。
以上描述之結果證明，系統性遞送密碼子最佳化Hopti-Dys3978基因比非密碼子最佳化△3990基因更有效。
重要的是，亦觀察到心臟功能大幅改善。對心臟的治療效應在4月齡時藉由使用米勒(Millar)壓力-容積系統之血液動力學分析評估。未治療dKO小鼠很少存活超過4個月。dKO小鼠的體型非常小、脊柱隆凸且肌肉及心臟功能嚴重異常，使得這種小鼠太過虛弱而無法耐受血液動力學分析程序。因此，AAV9治療dKO小鼠係與未治療、年齡相符的mdx小鼠比較，mdx小鼠的表型輕微許多，因為牠們具有完整的已知可代償此模型所缺乏之肌萎縮蛋白的抗肌萎縮蛋白相關蛋白基因。雖然心臟超音波圖 測量顯示mdx小鼠在基線條件下與C57/B10野生型小鼠比較時不具有明顯心臟缺損，但牠們在基線(圖8，空心長條)藉由血液動力學測量確實顯示明顯缺損。在本文中之結果顯示AAV9治療dKO小鼠展示與mdx小鼠類似的基線心臟血液動力學，包括收縮末期壓力、舒張末期容積、等容收縮最大速率(dp/dtmax)及等容弛緩最大速率(dp/dtmin)。治療dKO小鼠雖然展示與mdx小鼠類似之基線心臟血液動力學，包括收縮末期壓力、舒張末期容積、等容收縮最大速率(dp/dtmax及dp/dtmin)，但在經多巴酚丁胺挑戰後，AAV9治療dKO小鼠的每項檢查參數表現皆顯著優於mdx小鼠(圖8，實心長條)。另外，大於50%的mdx小鼠在30-min多巴酚丁胺挑戰窗口內死亡，與我們先前報告一致(Wu et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105：14814(2008))。呈現意外對比的是，由於AAV9治療dKO小鼠心臟表現微小肌萎縮蛋白轉基因，因此大幅預防多巴酚丁胺誘導之心衰竭。大於90%的AAV9治療dKO小鼠存活通過多巴酚丁胺壓力測試30min窗口。最後，常見的心電圖(ECG)PR間隔短缺也獲得改善(圖9A至9B)。PR間隔是從P波開始到QRS複合波起點的時間。綜上所述，這些結果顯示AAV9-CMV-Hopti-Dys3978基因療法對於嚴重DMD小鼠模型中之心肌病的有效性。
實例3
hCK-Hopti-Dys3978用於mdx小鼠
為了檢測雜交合成的肌肉特異性啟動子hCK是否能有效驅動Dys3978基因表現，將其與由強力非特異性CMV啟動子驅動之相同建構體比較。在尾靜脈注射各別載體後，以免疫螢光染色mdx小鼠中之微小肌萎縮蛋白表現，顯示這二個啟動子(即hCK及CMV)在肌肉及心臟中提供等效表現水準(圖10)。
實例4
CMV-Hopti-Dys3978用於DMD犬模型黃金獵犬肌肉失養症(GRMD)犬
基於mdx小鼠及肌萎縮蛋白/抗肌萎縮蛋白相關蛋白雙KO(dKO)小鼠的試驗，在黃金獵犬肌肉失養症(GRMD)犬(一種大型動物DMD模型)中測試相同載體AAV9-CMV-Hopti-Dys3978。具體而言，將載體投予至一隻名為「Jelly」的2.5月齡GRMD犬，注射後接著追蹤超過8年。
實驗程序：GRMD犬「Jelly」(2.5月齡雌性；6.3kg；治療前血清CK：20262單位/L)經由右後肢注射AAV9-CMV-Hopti-Dys3978載體，劑量為1×1013vg/kg。在常規麻醉下，將橡皮止血帶放置在下肢近側(腹股溝區域)以涵蓋右後肢的大部分肌肉。使用Harvard泵組，經由大隱靜脈注射AAV9載體，注射速度1ml/sec。載體體積為20ml/kg體重(總共130ml)。在開始注射10分鐘後，將止血帶放開。觸診顯示注射肢的肌肉 變得較硬。注射後約1小時收集後肢MRI影像，並確認載體溶液存在注射肢體中(圖11)。在整個超過8年的觀察期間的任何時間點，皆未使用免疫抑制劑諸如類固醇。肌肉活體組織切片程序在載體注射後最長4年內在5個時間點進行。最終屍體剖檢在8歲4個月時進行，當時「Jelly」仍能行走，但是活動力已大不如前。
結果：免疫螢光(IF)染色顯示長期微小肌萎縮蛋白表現於大部分直到最終屍體剖檢檢查的肌肉樣本中。有趣的是，注射肢體最初(注射後2個月的活體組織切片)的表現低於非注射肢體，暗示程序相關性發炎及CMV啟動子的部分非活化(圖12)。然而，儘管注射肢體最初的發炎，人微小肌萎縮蛋白表現在「Jelly」持續8年。後續時間點(載體注射後7個月、1年、2年、及4年)的肌肉活體組織切片及人微小肌萎縮蛋白的免疫螢光染色及西方墨點轉漬法顯示持續基因表現(圖13至17)。雖然微小肌萎縮蛋白陽性肌纖維的百分比在不同肌肉中有所不同，某些肌肉在屍體剖檢時仍具有大於90%的陽性肌纖維(圖18)。共染色微小肌萎縮蛋白及回復突變肌纖維(抗C端抗體)顯示兩者共存在(圖19)。微小肌萎縮蛋白亦在大約20%的心肌細胞中觀察到(圖18)。整體基因表現相當穩定。例如，前縫匠肌中之陽性肌纖維在6個時間點維持類似(自2及7個月至1、4及8年)(比較圖12、13、14、17及18)。西方墨點轉漬法證實IF染色結果(圖20)。
收縮力測量顯示相較於未治療犬有部分改善 (圖21)。「Jelly」在整個大於8年的治療後觀察期仍能走動，最後一年因心肌病安樂死。屍體剖檢及病理學家檢查未在任何組織發現腫瘤DNA定序顯示「Jelly」並未帶有疾病修飾性Jagged 1突變，此突變見於最近報告的二隻表型輕微GRMD犬(Vieira et al.,Cell163：1204(2015))。
實例5
hCK-Copti-Dys3978用於GRMD犬
在此試驗中，將AAV9-hCK-Copti-Dys3978載體(經修飾的肌胺酸激酶啟動子驅動犬密碼子最佳化人微小肌萎縮蛋白3978)使用於名為「Dunkin」的GRMD犬。基因編碼在其他試驗使用的相同人微小肌萎縮蛋白Dys3978蛋白質，但經犬密碼子最佳化。DNA序列與人密碼子最佳化基因具有94%同一性。在人類HEK 293細胞中進行的比較CK-Copti-Dys3978(犬密碼子最佳化)與CK-Hopti-Dys3978(人類密碼子最佳化)的轉染實驗顯示實質上相同水準的表現。比較兩種建構體用於mdx小鼠的多重實驗亦顯示實質上相同的表現水準。
實驗程序：GRMD犬「Dunkin」(雌性，2.5月齡，6.5kg)經大隱靜脈靜脈內注射AAV9-hCK-Copti-Dys3978載體，劑量4×1013vg/kg。犬在注射期間未經鎮靜。並無可注意得到的不良反應或行為改變。肌肉活體組織切片在載體注射後4個月進行，屍體剖檢在注射後14個月進行。
結果：藉由免疫螢光染色骨骼肌樣本上的微小肌萎縮蛋白3978，觀察到從注射後4個月的活體組織切片(圖22)到注射後14個月的屍體剖檢(圖23至26為屍體剖檢)非常高水準且幾乎均勻的微小肌萎縮蛋白表現。
IF染色也觀察到心臟肌肉中顯著高水準的微小肌萎縮蛋白(圖27)。CK啟動子驅動的表現相較於CMV啟動子似乎更強且更均勻。
西方墨點轉漬法分析證實IF染色結果。在骨骼肌中，微小肌萎縮蛋白水準大多高於正常犬對照組之野生型肌萎縮蛋白的正常水準(圖28)。心臟中Dys3978水準大約是野生型肌萎縮蛋白水準的一半(圖29)。
自犬密碼子最佳化基因Copti-Dys3978表現Dys3978，有效恢復肌萎縮蛋白相關蛋白質複合體包括γ-肌聚糖(sarcoglycan)(圖30)。
載體DNA複製數的定量PCR顯示與微小肌萎縮蛋白表現水準一致的趨勢(圖31)。
所有檢查樣本皆未發現先天性或細胞性免疫反應。此與AAV9-CMV-opH-dys3978的結果非常不同，這暗示肌肉特異性hCK啟動子不僅具有強效作用，還比CMV啟動子來得更安全。
肌肉失養病狀大幅改善，如心臟(圖32)、橫膈(圖33)及肢體肌肉(圖34)組織學H&E染色所示。三色梅森藍染色亦顯示肢體肌肉及橫膈纖維化顯著減少(圖35)。
實施例6
製備用於體內實驗之AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體
在實例7、8及9進一步描述之Dmd mdx 大鼠試驗中所使用的AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體包括AAV9殼體及經設計以表現微小版本的人類肌萎縮蛋白之表現卡匣，該表現卡匣包括來自全長人類Dp427m肌萎縮蛋白(SEQ ID NO：25)之N端區域、絞鏈1(H1)、棒狀結構域1(R1)、棒狀結構域2(R2)、絞鏈3(H3)、棒狀結構域22(R22)、棒狀結構域23(R23)、棒狀結構域24(R24)、絞鏈4(H4)、半胱胺酸富含(CR)結構域及部分羧基端(CT)結構域，這些是發揮功能所需的最少結構域。微小肌萎縮蛋白之蛋白質序列係提供於SEQ ID NO：7之胺基酸序列，其係由提供於SEQ ID NO：1之核酸序列的人密碼子最佳化DNA序列所編碼。AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體之載體基因體係提供於SEQ ID NO：18之核酸序列或其反向互補序列(當單股基因體以其負向極性包裝時)。
載體基因體包含5′及3′側接AAV2反向末端重複(ITRs)(分別具有SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15之DNA序列)、源自肌胺酸激酶(CK)基因之合成雜交增強子及啟動子以作為肌肉特異性轉錄調節元件(hCK；具有SEQ ID NO：16之DNA序列)、編碼上述人微小肌萎縮蛋白之3978個鹼基對長的人密碼子最佳化基因(即Hopti-Dys3978基因)及包括聚腺苷酸化(polyA)信號之小型合成 轉錄終止序列(spA；具有SEQ ID NO：17之DNA序列)。
載體係使用三重轉染技術及不含血清之源自HEK 293細胞之非黏著性細胞系製造。所使用的質體包括幫手質體(以表現載體有效複製及包裝所需之腺病毒幫手蛋白)、包裝質體(表現AAV2 rep基因及AAV9殼體蛋白質)及第三質體(含有上述表現卡匣之序列)。
細胞係生長及擴增自工作細胞庫樣本，一旦達到足夠的體積及細胞密度，將細胞使用轉染試劑轉染。在培養以允許轉染細胞生產載體後，將細胞溶解以釋放載體，使溶解物澄清化，並將載體使用核酸酶處理步驟純化以移除汙染核酸，隨後進行碘克沙醇(iodixanol)不連續梯度離心、陰離子交換層析法、以配方緩衝劑透析、無菌過濾接著儲存在2至8℃下。
實施例7
單次劑量AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA於DMD大鼠模型中之效應
此實例描述在最近發展之Dmd mdx 大鼠模型中測試AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA，此模型相較於典型mdx小鼠及GRMD犬模型具有某些優點。Larcher,T.,et al.,Characterization of dystrophin deficient rats：a new model for Duchenne muscular dystrophy.PLoS One.2014；9(10)：e110371.具體而言，在Dmd mdx 大鼠模型中，骨骼及心臟疾病皆在早期階段出現，並且以類似於在人類所見之 疾病進展的連續方式發展。
在這些試驗中，5至6週齡的雄性Dmd mdx 大鼠藉由IV注射至尾靜脈系統性投予單次劑量(1×1014載體基因體/每公斤體重或vg/kg)懸浮於PBS中之Dys3978載體。作為對照組，相同基因背景(Sprague Dawley)的野生型(「WT」)大鼠亦經此方式處理。所有程序的進行經大鼠基因型或治療組加盲以避免偏差。三隻Dmd mdx 大鼠及4隻WT大鼠經載體治療，而3隻Dmd mdx 大鼠及2隻WT大鼠僅投予PBS作為陰性對照組(空白對照處理)。注射後三個月，將動物安樂死並經屍體剖檢，藉由組織學及免疫細胞化學進行組織的肌萎縮蛋白表現分析。
為了進行組織病理學評估，將組織樣本固定於10%中性緩衝福馬林中、以石蠟包埋並切片5-μm厚，接著以蘇木精伊紅番紅(HES)染色。為了進行肌萎縮蛋白免疫標示，將額外樣本(肝臟、心臟、股二頭肌、胸肌及橫膈肌肉)冷凍並切片8-μm厚。使用針對肌萎縮蛋白之小鼠單株抗體NCL-DYSB(Novocastra Laboratories,Newcastle on Tyne,Uk)進行肌萎縮蛋白及微小肌萎縮蛋白的偵測(1：50)，因為此抗體無法分辨全長野生型肌萎縮蛋白與經工程改造的微小肌萎縮蛋白。所有屍體剖檢及組織學觀察皆以加盲方式進行。
組織學檢查發現，經PBS及載體治療之WT大鼠的骨骼肌或心肌皆未觀察到病灶。在所有Dmd mdx 大鼠中，顯示個別壞死、再生小型纖維叢集、分散巨大透明纖 維、紅血球大小不均、中央成核、肌內膜纖維化及散發性脂肪浸潤之骨骼肌纖維病灶存在且為DMD骨骼肌之特徵。這些病灶的發生率及強度在經載體治療之Dmd mdx 大鼠相較於僅經PBS處理者整體降低。在心臟中，多處壞死、單核細胞局部浸潤及輕微局部廣泛纖維化之病灶存在於一隻PBS處理Dmd mdx 大鼠(大鼠49)，其為DMD心臟肌肉的特徵。在所有經載體治療的Dmd mdx 大鼠中，心臟肌肉表現皆類似且顯示如在接受PBS之Dmd mdx 大鼠中所見之輕微單核細胞局部浸潤，但相對地，載體治療Dmd mdx 大鼠的心臟並未觀察到纖維化病灶。
使用免疫細胞化學法，WT大鼠展示在骨骼肌、橫膈及心臟肌肉纖維中偵測到肌膜下肌萎縮蛋白，且偵測到之肌萎縮蛋白的定位在載體處理大鼠相較於僅PBS處理大鼠之間並無差異。然而，在載體處理WT大鼠中的微小肌萎縮蛋白偵測無法使用此檢定證實，因為所使用的抗-肌萎縮蛋白抗體無法分辨野生型肌萎縮蛋白與微小肌萎縮蛋白。對比之下，一隻Dmd mdx 大鼠(大鼠49)展示罕見的可偵測到肌膜下肌萎縮蛋白之骨骼肌纖維(約5%至10%)，此與先前說明散發性回復突變纖維以約5%之頻率存在於此模型的說明一致(Larcher et al.,PlosOne,2014)。然而此大鼠的橫膈或心臟肌肉纖維並未偵測到肌萎縮蛋白。在所有Dys3978載體治療Dmd mdx 大鼠中，肌膜下肌萎縮蛋白亦在約80%至95%的骨骼肌纖維、約30%至50%的橫膈肌纖維及約70%至80%的心肌纖維中偵測到，雖然並未 進行系統化計算。在這些大鼠中，非常罕見的骨骼肌纖維(每個肌肉切片中1或2個)展示一些細胞質纖維間肌萎縮蛋白。在經載體處理的WT及Dmd mdx 大鼠中，皆無發炎細胞浸潤或壞死增加的證據，這些證據可能指示有由載體轉導或生產微小肌萎縮蛋白所刺激的細胞性免疫反應。
總結來說，在系統性投予1×1014vg/kg的AAV9.hCK.opti-Dys3978.spA載體後3個月，經載體處理之WT大鼠相較於PBS組並未觀察到肌肉組織的組織學改變，這暗示微小肌萎縮蛋白的表現在健康動物的耐受良好。另外，Dmd mdx 大鼠的載體治療導致在所有研究的肌肉(股二頭肌、胸肌、橫膈及心臟)纖維中顯著且全面偵測到微小肌萎縮蛋白肌膜，且模式類似於WT大鼠肌肉中之肌膜下定位。來自載體的微小肌萎縮蛋白Dys3978表現與纖維化及壞死減少有關(圖36A至36D)。
實施例8
增加AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA劑量對Dmd mdx 大鼠之效應，在注射後3個月及6個月判定
此實例說明以增加劑量之AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA治療Dmd mdx 大鼠(杜興氏肌肉失養症之動物模型)的結果，且在投予後3個月及6個月測量效應。
大鼠在7至8週齡藉由IV注射至陰莖背靜脈投藥，導致系統性投予測試製品。將四種不同的載體劑量測試於10至12隻Dmd mdx 大鼠：1×1013vg/kg(5隻大鼠在3個 月時間點及6隻大鼠在6個月時間點)、3×1013vg/kg(6隻大鼠在3個月時間點及5隻大鼠在6個月時間點)、1×1014vg/kg(7隻大鼠在3個月時間點及6隻大鼠在6個月時間點)及3×1014vg/kg(5隻大鼠在3個月時間點及5隻大鼠在6個月時間點)。此外，Dmd mdx 大鼠及WT大鼠各自僅接受媒劑(1X PBS，215mM NaCl，1.25%人類血清白蛋白，5%(w/v)山梨醇)作為陰性對照(6隻Dmd mdx 大鼠在3個月時間點、4隻Dmd mdx 大鼠在6個月時間點、5隻WT大鼠在3個月時間點及7隻WT大鼠在6個月時間點)。也包括五隻未處理(也就是無載體也無媒劑)的Dmd mdx 大鼠作為進一步的陰性對照。在注射後3個月及6個月，將各測試組的大鼠安樂死並屍體剖檢以採集組織樣本進一步分析。在犧牲之前，在測試動物進行心臟功能及抓力強度測試以評估載體治療對DMD疾病進展的效應。
應注意在文本及圖式中的載體劑量可以兩種不同的數字等效方式表示。因此，「1×1013」等於「1E13」、「3×1013」等於「3E13」、「1×1014」等於「1E14」且「3×1014」等於「3E14」。
體重
在治療後及犧牲前，第一週每天秤重各治療組的大鼠，之後每週秤重直到犧牲。各治療組中所有大鼠的平均體重列於表2(從注射前直到注射後9週)及表3(注射後第10至25週)並在圖37中對時間作圖。在該圖 中，誤差槓表示平均值的標準誤(SEM)，其亦報告於表中。在所有時間，WT大鼠的平均體重超越Dmd mdx 大鼠，包括經載體治療者。由於年齡差異及Dmd mdx 大鼠身體質量的天然差異，劑量與體重之間並無一致相關性直到注射後4週，此時所有載體治療Dmd mdx 大鼠(除最高劑量組以外)的體重皆高於未治療Dmd mdx 大鼠，但低於WT大鼠。到了注射後12週，所有治療組的劑量效應變得明顯，所有劑量測試組的體重皆與載體劑量成正比直到試驗結束。
在AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體治療Dmd mdx 大鼠中定量載體轉導及RNA與蛋白質表現
材料及方法
使用標準分子生物學技術，藉由定量PCR(qPCR)定量轉殖基因複製數、藉由反轉錄酶qPCR(RT-qPCR)定量微小肌萎縮蛋白mRNA轉錄物之相對表現水準、且藉由西方墨點轉漬分析定量微小肌萎縮蛋白定量表現量。
為了進行qPCR，使用Qiagen之Gentra Puregene套組，將基因體DNA(gDNA)自組織純化。接著使用StepOne PlusTM即時PCR系統(Applied Biosystems®,Thermo Fisher Scientific)分析樣本，使用雙份的50ng gDNA。所有反應重複(in duplex)進行於20μL的最終體積，含有模板DNA、Premix Ex taq(Ozyme)、0.3μL之ROX參考染料(Ozyme)、0.2μmol/L之各引子及0.1μmol/L之Taqman®探針。
載體複製數係使用經設計以擴增微小肌萎縮蛋白轉殖基因區域之引子及探針測定：前置：5'-CCAACAAAGTGCCCTACTACATC-3' SEQ ID NO：19
反置：5'-GGTTGTGCTGGTCCAGGGCGT-3' SEQ ID NO：20
探針：5'-FAM-CCGAGCTGTATCAGAGCCTGGCC-TAMRA-3' SEQ ID NO：21
內源性gDNA複製數係使用經設計以擴增大鼠HPRT1基因之引子及探針測定：前置：5'-GCGAAAGTGGAAAAGCCAAGT-3' SEQ ID NO：22
反置：5'-GCCACATCAACAGGACTCTTGTAG-3' SEQ ID NO：23
探針：5'-JOE-CAAAGCCTAAAAGACAGCGGCAAGTTGAAT-TAMRA-3' SEQ ID NO：24
各樣本的臨限循環(Ct)值係與不同稀釋倍數的線性化標準質體(含有微小肌萎縮蛋白表現卡匣或大鼠HPRT1基因)所獲得的值比較。在gDNA存在下無qPCR抑制，係藉由分析自對照動物組織樣本萃取之50ng的gDNA並加入不同稀釋倍數的標準質體來檢查。使用雙套式qPCR(在相同反應中擴增2個序列)，結果表示為每二倍體基因體的載體基因體(vg/dg)。測試敏感度為0.003vg/dg。
為了進行RT-qPCR，使用TRIzol®試劑(Thermo Fisher Scientific)自組織樣本萃取總RNA，接著用TURBO不含DNA套組(Thermo Fischer Scientific)中的不含RNAse之DNAse I處理。將總RNA(500ng)使用隨機引子(Thermo Fischer Scientific)及M-MLV反轉錄酶(Thermo Fischer Scientific)於最終體積25μL中反轉錄。接著進行雙套式qPCR分析，將1/15稀釋的cDNA使用和藉由qPCR定量 轉殖基因複製數相同的微小肌萎縮蛋白及大鼠HPRT1特異性引子及探針進行。在cDNA存在下無qPCR抑制，係藉由分析自對照動物組織樣本獲得之cDNA並加入不同稀釋倍數的標準質體來檢查。各RNA樣本的Ct值係與不同稀釋倍數的標準質體(含有微小肌萎縮蛋白表現卡匣或大鼠HPRT1基因)所獲得的值比較。結果表示為相對數量(RQ)：RQ=2-△Ct=2-(Ct目標-Ct內源性對照)
在各RNA樣本中，無DNA之汙染亦藉由分析反應混合物中未添加反轉錄酶所獲得的「類cDNA樣本(cDNA-like samples)」證實。
為了進行蛋白質表現水準的西方墨點轉漬分析，使用含有蛋白酶抑制劑雞尾酒之RIPA緩衝劑(Sigma-Aldrich)自組織樣本萃取總蛋白質。將蛋白質萃取物(股二頭肌、心臟及橫膈50μg、或肝臟100μg)裝載至NuPAGE® Novex 3至8% Tris乙酸酯凝膠上，並使用NuPAGE®大型蛋白質轉漬套組(Thermo Fischer Scientific)分析。使用最終濃度200mM之DTT在裝載前還原蛋白質。接著將膜以5%脫脂牛乳、1% NP40(Sigma-Aldrich)於TBST(tris緩衝鹽水、0.1% Tween 20)中封閉，並以對肌萎縮蛋白之外顯子10及11具特異性之抗-肌萎縮蛋白抗體(1：100，MANEX 1011C單株抗體)及二級抗小鼠IgG HRP接合抗體(1：2000,Dako)雜交。為了進行蛋白質裝載對照，將相同膜亦以抗大鼠α-微管蛋白抗體(1：10000,Sigma) 及二級抗小鼠IgG HRP接合抗體(1：2000,Dako)雜交。免疫墨點藉由ECL化學發光分析系統(Thermo Fisher Scientific)視覺化。
注射後3及6個月之人微小肌萎縮蛋白的轉殖基因複製數
經載體及媒劑處理之Dmd mdx 大鼠及僅投予媒劑之WT大鼠的全血、脾臟、心臟、股二頭肌、胸肌、橫膈及肝臟中的轉殖基因複製數(表示為每二倍體基因體之載體基因體(vg/dg))測試結果描述於下表。注射後3個月的資料提供於表4，注射後6個月的資料提供於表5。資料為個別測試動物之結果的平均值。
僅注射媒劑之Dmd mdx 或WT大鼠中無偵測到qPCR信號，證實這些動物未接受任何載體，且注射後3及6個月的全血無偵測到qPCR信號。
微小肌萎縮蛋白DNA在注射載體之Dmd mdx 大鼠中在注射後3及6個月皆偵測到。測試組織中的轉殖基因複製數遵循肝臟>心臟>股二頭肌橫膈胸肌>脾臟的盛行率模式。在所分析的組織中，肝臟的轉導最為有效，在投予3×1014vg/kg載體之大鼠中載體複製數高達平均80至110vg/dg。肝臟中的載體複製數高於心臟7至45倍，且高於股二頭肌、橫膈或胸肌40至300倍。在心臟中，載體複製數在以1×1014vg/kg載體投藥之大鼠中平均約1.0vg/dg，在以3×1014vg/kg載體投藥之大鼠中約5.0vg/dg。在1×1014vg/kg的劑量下，轉殖基因複製數在股二頭肌及胸肌中類似且未曾超過約0.5vg/dg。當載體劑量增加至3×1014vg/kg，平均轉殖基因複製數增加至約1.2vg/dg。橫膈的資料變異特別大，因為在接受兩個最高劑量水準的載體組 中有4隻動物有某些異常高的結果，其轉殖基因複製數自約9至15vg/dg不等。若將這些異常資料點排除，則橫膈的轉導效率在3及6個月時間點皆相當低，1×1014vg/kg劑量組的轉殖基因複製數平均約0.2至0.4vg/dg，3×1014vg/kg劑量組約1.05至1.3vg/dg。
注射後3及6個月之人微小肌萎縮蛋白的mRNA表現
每個治療組隨機選擇二至四隻動物進行RT-qPCR分析，以定量在犧牲時獲得的股二頭肌、橫膈、心臟、脾臟及肝臟樣本中之人微小肌萎縮蛋白mRNA轉錄物的水準。自注射後3個月及6個月犧牲的測試動物獲得的結果分別提供於表6及表7。資料以微小肌萎縮蛋白mRNA相對於大鼠HPRT1基因之mRNA的相對數量(RQ)表示。
在陰性對照組動物(媒劑處理WT大鼠及Dmd mdx 大鼠)之任何組織中或經不論劑量之載體治療動物的脾臟中皆未偵測到轉錄物。在所有其他檢查的組織中，偵測到源自載體之轉錄物，其水準傾向於以劑量反應性方式增加，雖然資料中有一些變異。組織中的轉錄物水準遵循股二頭肌>心臟橫膈>肝臟之模式。如上所討論，肝臟是所有樣本中轉導最高的組織，載體複製數高於股二頭肌約60至130倍。儘管如此，微小肌萎縮蛋白mRNA在肝臟中的水準約低於股二頭肌5至15倍，證明載體中使用的啟動子具有高度肌肉特異性活性。
注射後3及6個月之人微小肌萎縮蛋白的蛋白質表現
隨機選擇以進行人微小肌萎縮蛋白mRNA水準分析的相同動物，亦使用西方墨點轉漬法測定微小肌萎縮蛋白水準。在陰性對照組動物(媒劑處理WT大鼠及 Dmd mdx 大鼠)之任何組織中皆未偵測到微小肌萎縮蛋白。在3及6個月時間點，以載體投藥的Dmd mdx 大鼠之股二頭肌、心臟及橫膈中皆偵測到微小肌萎縮蛋白。相較於以較高水準的載體投藥之大鼠，在最低測試劑量(1×1013vg/kg)下，組織樣本中較不常偵測到微小肌萎縮蛋白。這些結果定性摘列於表8。
藉由西方墨點轉漬法偵測的蛋白質之量與載體劑量以及相同組織樣本中微小肌萎縮蛋白mRNA的量之間有正相關。微小肌萎縮蛋白mRNA的RQ需要約1.5才能夠偵測到蛋白質。與肝臟中測量之低微小肌萎縮蛋白轉錄 物水準一致的是，此組織中未偵測到微小肌萎縮蛋白，即使使用最高載體劑量。
組織病理學評估
犧牲WT及Dmd mdx 大鼠後，立即獲得組織樣本以進行組織病理學及免疫細胞化學分析。
材料及方法
媒劑處理WT大鼠、媒劑及載體處理Dmd mdx 大鼠的組織樣本在注射後3及6個月的全屍體剖檢評估中獲得。亦自7至9週齡犧牲的未治療Dmd mdx 大鼠獲得樣本作為基線比較。將組織立即固定於福馬林中以進行組織病理學檢查或急速冷凍以進行免疫組織化學檢查(免疫標示)及儲存直到處理。為了進行組織病理學檢查，將組織樣本固定於10%中性緩衝福馬林中、以石蠟包埋並切片(5μm)，接著以蘇木精伊紅番紅(HES)染料染色。將額外的石蠟包埋心臟組織切片用苦味酸天狼星紅F3B(Sigma-Aldrich Chimie SARL,Lyon,FR)染色以看見膠原蛋白。為了藉由免疫標示識別肌萎縮蛋白及結締組織，將樣本冷凍並切片(8μm)。在免疫標示試驗中使用特異性結合大鼠肌萎縮蛋白以及人微小肌萎縮蛋白opti-Dys3978之小鼠單株抗體NCL-DYSB(1：50,Novocastra Laboratories,Newcastle on Tyne,UK)以視覺化肌萎縮蛋白。使用Alexa Fluor 555小麥胚芽凝集素(WGA)接合物(1：500,Molecular Probes, Eugene,OR)以視覺化結締組織。將細胞核用DRAQ5(1：1000,BioStatus Ltd,Shepshed,UK)染色。屍體剖檢及組織學檢查加盲進行。
心臟切片中的苦味酸天狼星陽性區域定量係使用Nikon成像軟體(Nikon,Champigny sur Marne,France)進行。DYSB陽性纖維及WGA陽性區域定量係使用ImageJ開放來源影像處理軟體(v 2.0.0-rc-49/1.51a)進行。
結果
注射後3及6個月肌肉中之DMD病灶的組織病理學分析
以顯微鏡檢查經組織學染色的組織樣本，並有系統地記錄與DMD表型有關之病灶。將骨骼肌及心臟肌肉中的病灶半定量評分，如圖38A所示。在骨骼肌(股二頭肌、胸肌及橫膈)中，0分對應於無顯著病灶；1分對應於存在一些再生活性，證據為中央成核纖維及再生病灶；2分對應於單離或呈小型叢集之變性纖維；及3分對應於由纖維化或脂肪組織進行組織再造及纖維替換。在心臟中，評分係基於纖維化的強度(較低為1分，較高為2分)及變性纖維的存在(3分)。各大鼠的總病灶分數係計算為動物的股二頭肌、胸肌、橫膈及心臟肌肉分數之平均值。亦將各治療組中個別大鼠的病灶分數平均。
注射後3個月個別大鼠的總病灶分數及治療組分組平均值顯示於圖38B，其中WT空白對照係指媒劑處理 WT大鼠，其病灶分數為0。KO空白對照係指經媒劑處理之Dmd mdx 大鼠，而KO 1E13、3E13及1E14係指經所示劑量(分別為1×1013、3×1013及1×1014)的載體(vg/kg)處理之Dmd mdx 大鼠。如圖可見，在Dmd mdx 大鼠中，與肌肉失養表型相關之肌肉病灶盛行率以劑量反應性方式隨載體治療減少。
病灶分數的統計分析(使用Dunn's檢定之多重成對比較)顯示治療組之間的下列差異。在注射後3個月的股二頭肌樣本中，經媒劑處理之WT大鼠與經二個最高劑量(1×1014及3×1014vg/kg)載體處理之Dmd mdx 大鼠之間的病灶分數無顯著差異，且在注射後6個月，經媒劑處理之WT與經四個測試劑量任一者的載體處理之Dmd mdx 大鼠之間無顯著差異。在注射後3個月的胸肌及橫膈樣本中，媒劑處理WT大鼠與經三個最高載體測試劑量(3×1013、1×1014及3×1014vg/kg)處理之Dmd mdx 大鼠之間的病灶分數無顯著差異，且在注射後6個月，經媒劑處理之WT大鼠與經所有四個載體劑量處理之Dmd mdx 大鼠之間的分數無顯著差異。最後，在二個時間點的心肌中，媒劑處理WT大鼠與經所有四個載體劑量處理之Dmd mdx 大鼠之間的病灶分數無顯著差異。
注射後3及6個月之組織形態測定法
在用DYSB抗體(其特異性結合自載體表現之大鼠肌萎縮蛋白及人微小肌萎縮蛋白兩者)標示組織樣本 後，計算在各大鼠的股二頭肌、橫膈及心臟肌肉中隨機選擇之三個顯微鏡視野中陽性染色肌肉纖維百分比。此外，計算三個隨機選擇顯微鏡視野中WGA接合物陽性染色之面積，以判定股二頭肌及橫膈冷凍組織樣本中結締組織纖維化程度。在相關分析中，心臟橫切面中之結締組織(膠原蛋白)的量，係藉由量化組織學製備樣本中苦味酸天狼星紅陽性染色之面積判定。這些試驗的結果提供於圖39A至39C、圖40A至40C及圖41A至41C。
圖39A顯示經媒劑處理WT大鼠(WT+緩衝劑)、經媒劑處理Dmd mdx 大鼠(DMD+緩衝劑)及經增加劑量1×1013、3×1013、1×1014及3×1014vg/kg(分別為DMD+1E13、3E13、1E14及3E14)之載體治療之Dmd mdx 大鼠的股二頭肌樣本染色組織切片之代表性顯微照片。上排照片為注射後3個月採集的樣本，下排為注射後6個月採集的樣本。圖39B顯示在3及6個月時間點，各自經媒劑處理之WT大鼠及Dmd mdx 大鼠及經增加劑量之載體治療的Dmd mdx 大鼠，股二頭肌樣本中肌萎縮蛋白陽性纖維百分比。亦包括7至9週齡未治療Dmd mdx 大鼠之結果(「DMD病理狀態」)。圖39C顯示經類似處理之WT及Dmd mdx 大鼠在3及6個月時間點，以及7至9週齡未治療Dmd mdx 大鼠，股二頭肌樣本中結締組織佔據之面積百分比(作為纖維化之量度)。在該圖中，誤差槓上之相同字母指示資料之間無統計顯著差異，然而無相同字母指示有顯著差異(例如，上方皆具有「a」的兩條槓彼此之間將無統計差異)。
圖40A顯示經媒劑處理WT大鼠(WT+緩衝劑)、經媒劑處理Dmd mdx 大鼠(DMD+緩衝劑)及經增加劑量1×1013、3×1013、1×1014及3×1014vg/kg(分別為DMD+1E13、3E13、1E14及3E14)之載體治療之Dmd mdx 大鼠的橫膈樣本染色組織切片之代表性顯微照片，所有照片皆在注射後3個月採集。圖40B顯示在3及6個月時間點，各自經媒劑處理之WT大鼠及Dmd mdx 大鼠及經增加劑量之載體治療的Dmd mdx 大鼠，橫膈樣本中肌萎縮蛋白陽性纖維百分比。亦包括7至9週齡未治療Dmd mdx 大鼠之結果(「DMD病理狀態」)。圖40C顯示經類似處理之WT及Dmd mdx 大鼠在3及6個月時間點，以及7至9週齡未治療Dmd mdx 大鼠，橫膈樣本中結締組織佔據之面積百分比(作為纖維化之量度)。在該圖中，誤差槓上之相同字母指示資料之間無統計顯著差異，然而無相同字母指示有顯著差異(例如，上方皆具有「a」的兩條槓彼此之間將無統計差異)。
圖41A顯示經媒劑處理WT大鼠(WT+緩衝劑)、經媒劑處理Dmd mdx 大鼠(DMD+緩衝劑)及經增加劑量1×1013、3×1013、1×1014及3×1014vg/kg(分別為DMD+1E13、3E13、1E14及3E14)之載體治療之Dmd mdx 大鼠的心肌樣本染色組織切片之代表性顯微照片。上圖及下圖顯示距心尖三分之一處以組織學製備並經苦味酸天狼星紅染色之心臟橫切面，分別採集自注射後3及6個月犧牲的測試動物。黑色槓指示2mm長度。中間圖顯示在3個月 時間點採集之心肌樣本經抗-肌萎縮蛋白抗體及WGA接合物免疫標示。圖41B顯示在3及6個月時間點，各自經媒劑處理之WT大鼠及Dmd mdx 大鼠及經增加劑量之載體治療的Dmd mdx 大鼠，心肌樣本中肌萎縮蛋白陽性纖維百分比。亦包括7至9週齡未治療Dmd mdx 大鼠之結果(「DMD病理狀態」)。圖41C顯示經類似處理之WT及Dmd mdx 大鼠在3及6個月時間點，以及7至9週齡未治療Dmd mdx 大鼠，心肌樣本中結締組織佔據之面積百分比(作為纖維化之量度)。在該圖中，誤差槓上之相同字母指示資料之間無統計顯著差異，然而無相同字母指示有顯著差異(例如，上方皆具有「a」的兩條槓彼此之間將無統計差異)。
資料的統計分析(ANOVA分析及Fisher's事後雙邊檢定)顯示在注射後3及6個月，經媒劑處理之Dmd mdx 大鼠與經所有載體劑量治療之Dmd mdx 大鼠之間，股二頭肌及心臟中的肌萎縮蛋白標示有顯著差異。在橫膈中，二個最高測試劑量在注射後3個月有顯著差異，然而在注射後6個月，三個最高測試劑量有顯著差異。媒劑處理WT大鼠與經3×1014vg/kg治療Dmd mdx 大鼠之間的比較，顯示在注射後3個月的股二頭肌或在注射後6個月的心臟肌肉無顯著差異。
在媒劑處理WT大鼠的肌肉中，所有肌肉纖維展示高度均勻的肌膜下DYSB抗體標示。在媒劑處理Dmd mdx 大鼠的肌肉中，小百分比的散發性回復突變纖維展示類似標示(在注射後3及6個月分別為：股二頭肌，3.7± 2.4%及7.3±2.3%；橫膈，0.7±1.5%及5.8±1.3%；心肌，0.0±0.0%及0.1±0.1%)。在投予載體之Dmd mdx 大鼠中，所有觀察肌肉中的肌萎縮蛋白陽性染色纖維百分比增加，其中纖維展示微弱至高度肌膜下標示。必須標示三分之二的纖維才被認定為陽性。在3及6個月時間點，肌萎縮蛋白陽性纖維百分比在股二頭肌與心臟肌肉之間類似，而橫膈則具有較高百分比。在經載體治療之Dmd mdx 大鼠中，藉由結締組織佔據面積測量之纖維化病灶的數量及大小在骨骼肌中減少，且心肌中的纖維化強度降低。
在7至9週齡犧牲之未治療Dmd mdx 大鼠中，股二頭肌或心肌無明顯纖維化，但橫膈中已有顯著結締組織擴增。相較於WT大鼠，媒劑處理Dmd mdx 大鼠展示骨骼肌之肌內膜及肌束膜空間局部或全面性增厚，此為纖維化之指標。在心臟中，這些大鼠的心室及中隔的心外膜下區域展示散發性及廣泛纖維化病灶。在嚴重案例中，觀察到改變心臟形狀的透壁性纖維化。相較於媒劑處理Dmd mdx 大鼠，經3×1013vg/kg載體及更高劑量治療之Dmd mdx 大鼠在注射後3個月的股二頭肌及經3×1014vg/kg載體治療之Dmd mdx 大鼠在注射後6個月的橫膈，纖維化病灶的數量及大小顯著減少。在心臟中，發現媒劑處理Dmd mdx 大鼠與所有載體劑量治療Dmd mdx 大鼠之間，兩個時間點均有纖維化的顯著差異。在注射後3個月，媒劑處理WT大鼠與經3×1013vg/kg之劑量及更高劑量的載體治療之Dmd mdx 大鼠之間未觀察到纖維化的顯著差異。所觀察到的纖維化之量 與載體劑量呈現負相關(股二頭肌p=0.019，橫膈p=0.004；且心肌p=0.003，所有皆經線性回歸)。
經載體治療之Dmd mdx 大鼠在所有分析肌肉(股二頭肌、橫膈及心臟)中誘導微小肌萎縮蛋白表現，且表現微小肌萎縮蛋白之纖維百分比與載體劑量呈現正相關(經線性回歸p<0.001)。微小肌萎縮蛋白陽性纖維數量在載體治療Dmd mdx 大鼠的股二頭肌及心臟中高於橫膈，這暗示生物分布或表現效率上的一些非均質性。微小肌萎縮蛋白表現就其肌膜下定位而言係類似的，與劑量無關，即使在最高分析劑量3×1014vg/kg下亦無偵測到定位異常。在一些纖維中，沿著肌膜偵測到不連續肌萎縮蛋白染色，儘管此觀察的頻率隨著載體劑量增加而降低。
比較注射後3與6個月之間微小肌萎縮蛋白陽性肌肉纖維的數量顯示不同治療組的股二頭肌無顯著差異。在橫膈中，1×1014vg/kg劑量組在注射後3與6個月之間有顯著增加，然而在心肌中，劑量1×1013、3×1013及1×1014vg/kg在兩個時間點之間有顯著增加。
某些典型DMD相關肌肉病灶的發生率及程度在治療組之間有所差異。例如，載體治療Dmd mdx 大鼠相較於僅接受媒劑者有較少壞死性或變性纖維，且在所有Dmd mdx 大鼠皆觀察到新的再生纖維，但彼等之數量傾向於隨載體劑量增加而降低。
抓力及肌肉疲勞測量
注射媒劑或增加劑量之載體的Dmd mdx 大鼠前肢抓力在注射後3及6個月測試。包括注射媒劑之WT大鼠作為陰性對照。大鼠在7至9週齡時注射，因此抓力測試係在大鼠約4.5及7.5月齡時進行。測量最大抓力及作為疲勞指標的重複試驗後抓力。
材料及方法
使用附接至力換能器之抓力計(Bio-GT3,BIOSEB,France)，將大鼠前爪放置在T型桿上並輕輕向後拉直到大鼠鬆開前爪的抓握，以測量所產生之尖峰力。連續進行五次測試，每次測試之間稍作短暫等待(20至40秒)，並採集第一次測試及最後一次測試之間減少的力量作為疲勞指標。結果以克(g)表示，並標準化至體重(g/g BW)。抓力測試測量由一位加盲基因型及治療組的實驗人員進行。資料以平均值±SEM表示，並使用非參數Kruskal-Wallis檢定進行統計評估，以分析不同組之間的差異。當偵測到顯著的整體效應時，組別之間的差異使用Dunn's事後檢定評估。抓力之演變使用Friedman檢定分析，隨後使用Dunn's事後檢定分析。所有資料分析使用GraphPad Prism 5(GraphPad Software Inc.,La Jolla,CA)進行。在圖式中，具有95%、99%及99.9%信賴水準之顯著差異分別以一、二及三個符號表示。
結果
在注射後3個月犧牲之大鼠的抓力測試結果提供於表9及表10。如表9所示，媒劑處理Dmd mdx 大鼠相較於媒劑處理WT大鼠展示絕對抓力強度(即未經身體質量差異校正)減少(降低24±2%)。對比之下，載體治療Dmd mdx 大鼠相較於媒劑處理Dmd mdx 大鼠對照組展示絕對抓力強度的劑量依賴性增加。在二個最低劑量組(1×1013及3×1013vg/kg)，抓力分別增加13±7%及24±8%，但未達到統計顯著性，然而在二個最高劑量組(1×1014及3×1014vg/kg)，抓力分別增加40±9%及55±6%，即達到統計顯著性(分別為p<0.01及p<0.001)。亦如表9所示，當前肢抓力經身體質量差異校正後，皆經媒劑處理的WT與Dmd mdx 大鼠抓力之間無統計顯著差異。然而，載體治療Dmd mdx 大鼠的相對抓力相較於媒劑處理Dmd mdx 大鼠呈現劑量反應性增加，此在二個最高測試劑量組(1×1014及3×1014vg/kg)達到統計顯著性(分別為27±8%增加，p<0.05及39±6%增加，p<0.001)。
前肢抓力亦在五次相隔短暫的重複試驗中測量以判定載體治療對於已知發生在Dmd mdx 大鼠模型的肌肉疲勞的可能影響程度。如圖42A所示，媒劑處理Dmd mdx 大鼠在第一次與第五次試驗之間展示明顯降低前肢強度(減少63±5%)，然而媒劑處理WT大鼠的強度在第五次試驗後仍與第一次之後一樣，這種效應過去在此模型中見過(Larcher,et al.,2014)。
相對地，相較於僅用媒劑處理之類似大鼠， 在載體治療Dmd mdx 大鼠中觀察到劑量依賴性改善。如表10所示，二個最低測試劑量組(1×1013及3×1013vg/kg)的抓力強度降低之前出現延遲，這暗示至少在試驗早期有減少疲勞的現象。然而，較低劑量組(載體治療Dmd mdx 大鼠)到了第五次試驗的抓力強度，仍與僅用媒劑處理之Dmd mdx 大鼠之間無統計顯著差異。但是，出現明顯的抓力強度減少趨緩的強勁趨勢，即使在這些較低劑量組。在二個最高劑量(1×1014及3×1014vg/kg)下，Dmd mdx 大鼠在疲勞程度上相較於媒劑處理WT大鼠顯示無統計顯著差異。換言之，在五次測試後，這些載體治療Dmd mdx 大鼠與野生型大鼠無法區別。事實上，在所有試驗中，經最高載體劑量治療之Dmd mdx 大鼠的平均抓力高於WT對照組，雖然差異不具統計顯著性。
在注射後6個月犧牲之大鼠的抓力測試結果提供於表11及表12。如表11所示，媒劑處理Dmd mdx 大鼠相較於媒劑處理WT大鼠展示抓力強度(即未經身體質量差異校正)減少(絕對抓力降低38±3%)。此差異當以絕對意義測量時具有統計顯著性，但當以相對意義測量時則否。對比之下，載體治療Dmd mdx 大鼠相較於媒劑處理Dmd mdx 大鼠對照組展示絕對抓力強度的劑量依賴性增加。在二個最低劑量組(1×1013及3×1013vg/kg)，抓力分別增加20±5%及21±6%，但未達到統計顯著性，然而在二個最高劑量組(1×1014及3×1014vg/kg)，抓力分別增加39±9%及41±5%，即達到統計顯著性(分別為p<0.05及p<0.01)。
類似於在注射後3個月犧牲的Dmd mdx 大鼠，在注射後6個月犧牲的媒劑處理Dmd mdx 大鼠在第一次與第五次試驗之間也展示實質上降低的前肢強度(減少57±3%)(圖42B)，然而相較於媒劑處理WT大鼠經過五次試驗所見之輕微抓力減少(最有可能因為這些試驗涉及的小樣本數所致)，此差異不具統計顯著性。
相對地，相較於僅用媒劑處理之類似大鼠，在載體治療Dmd mdx 大鼠中觀察到劑量依賴性改善。如表12所示，雖然二個最低劑量(1×1013及3×1013vg/kg)並未顯著影響抓力強度在多個試驗中的降低，但二個最高劑量(1×1014及3×1014vg/kg)使Dmd mdx 大鼠在疲勞程度上相較於媒劑處理WT大鼠顯示無統計顯著差異。另外，在最高劑量下，載體治療Dmd mdx 大鼠每次試驗的抓力皆統計顯著高於媒劑處理Dmd mdx 大鼠。換言之，在五次測試後，這些載體治療Dmd mdx 大鼠與野生型大鼠無法區別。事實上，在所有試驗中，經最高載體劑量治療之Dmd mdx 大鼠的平均抓力高於WT對照組，雖然差異不具統計顯著性。
基於這些試驗，很明顯地在注射後3及6個月，1×1014vg/kg的載體劑量足以反轉Dmd mdx 大鼠展示之抓力減少及因多次相隔短暫抓力測試造成的肌肉疲勞。另外，3×1014vg/kg的載體劑量實際改善Dmd mdx 大鼠的抓力及疲勞抗性至超越相同基因背景的WT大鼠的程度。
心臟功能
Dmd mdx 大鼠及WT對照組的心臟功能在注射後3及6個月(分別約5及8月齡)測試，以判定載體治療是否可改善大鼠DMD模型中肌肉失養症疾病病程對心臟的結構性或功能性效應。使用二維心臟超音波圖，在注射後3及6個月測量自由壁舒張厚度(free wall diastolic thickness)、LV舒張末期直徑、LV射出率及E/A比例。
材料及方法
心臟超音波圖測量由一位加盲基因型及治療組的實驗人員進行。二維(2D)心臟超音波圖使用Vivid 7 Dimension超音波(GE Healthcare)及14-MHz換能器在測試動物進行。為了觀察可能的結構再造，測量以M模式心臟超音波圖獲得的長軸及短軸影像之舒張期間，左心室舒張末期直徑及自由壁舒張末期厚度。收縮功能藉由射出率評估，且舒張功能藉由使用脈衝式Doppler以心尖四室定向測量心室填充速度之經二尖瓣流速以判定E/A比例、等容弛緩時間及E波減速時間，舒張功能異常指標在下面進一步解釋。
E/A比例係在心房排空及心室填充二階段期間，血液自左心房移動至左心室之尖峰流速的比例。血液自左心房轉移至左心室分二階段。在第一階段，當二尖瓣打開時，左心房中的血液因為心室弛緩所產生的負壓被動地移動進入下方心室。血液在此初始動作中的移動速度稱 為「E」代表早期(early)的心室填充流速。稍晚，左心房收縮以射出任何心房中的殘留血液，且血液在此階段移動的速度稱為「A」代表心房(atrium)的心室填充流速。E/A比例係早期(E)對晚期(A)心室填充流速比例。在健康心臟中，E/A比應大於1。然而在杜興氏肌病中，左心室壁變得僵硬，心室弛緩及對心房血液的拉力減少，因而延緩早期(E)填充流速並降低E/A比例。等容弛緩時間(IVRT)係從主動脈瓣關閉到藉由打開二尖瓣以開始心室填充之間的間隔，或直到弛緩開始後心室填充開始的時間。長於正常的IVRT指示心室弛緩不良，此已描述於人類DMD病患(RC Bahler et al.,J Am Soc Echocardiogr 18(6),666-73(2005)；LW Markham et al.,J Am Soc Echocardiogr 19(7),865-71(2006))及DMD犬模型(V Chetboul et al.,Eur Heart J 25(21),1934-39(2004)；V Chetboul et al.,Am J Vet Res 65(10),1335-41(2004))中，且在DMD相關擴張性心肌病之前。最後，E波減速時間(DT)對應E峰流速與其回復到基線之間的時間(毫秒)，該時間增加指示舒張功能異常。
結果
在注射後3及6個月，皆以媒劑處理之WT大鼠及Dmd mdx 大鼠的自由壁舒張厚度無顯著差異，指示此測量無法提供有關此檢查年齡下此模型之疾病進程的資訊。然而在注射後6個月，但非注射後3個月，經媒劑處理之Dmd mdx 大鼠相較於WT對照組有左心室舒張末期直徑增加 的趨勢，當Dmd mdx 大鼠經載體治療時此趨勢反轉，雖然並未達到統計顯著性(圖43)。
為了評估收縮功能，測量左心室(LV)射出率。注射後3個月在Dmd mdx 大鼠並未發現差異，但在注射後6個月，僅投予媒劑之Dmd mdx 大鼠展現減少的LV射出率，此藉由載體治療防止，雖然差異只有在一個較低劑量組(3×1013vg/kg)具有統計顯著性(圖44)。
為了評估舒張功能異常，使用Doppler心臟超音波圖以測量早期(E)及晚期舒張(A)流速、E/A比例、等容弛緩時間(IVRT)及減速時間(DT)。在注射後3個月，經媒劑處理之Dmd mdx 大鼠相較於WT對照組有統計顯著減少之E/A比例，且有趨勢暗示經最高載體劑量3×1014vg/kg治療之Dmd mdx 大鼠回復至正常E/A比例，雖然差異未達到統計顯著性(圖45A)。在注射後6個月，經媒劑處理之Dmd mdx 大鼠的E/A比例相較於WT對照組也顯著減少，且如同較早時間點，有趨勢暗示載體的一些治療效應，雖然資料的變化相當大且未達到統計顯著性(圖45B)。
在注射後3個月，IVRT在經媒劑處理之Dmd mdx 大鼠相較於WT對照組上升，且有輕微趨勢暗示IVRT在經載體治療之Dmd mdx 大鼠呈劑量反應性減少，雖然資料中的差異皆未達到統計顯著性(圖46A)。在注射後6個月，經媒劑處理之Dmd mdx 大鼠具有相較於WT對照組顯著較高的IVRT，然而載體治療導致暗示IVRT回復至正常水準的強烈趨勢，其在最低載體劑量1×1013vg/kg達到統計顯著性 (圖46B)。
最終，由於麻醉程序的技術困難，DT只能在較年長大鼠測量。然而，當在注射後6個月檢查時，DT在經媒劑處理之Dmd mdx 大鼠相較於WT對照組顯著上升，且有強烈趨勢指向在所有測試劑量的載體治療後回復至正常數值(圖47)。
儘管資料的變異性，這些試驗的結果強烈暗示5及8月齡Dmd mdx 大鼠的心臟存在舒張功能異常，其可藉由AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體治療至少部分地反轉。
血液化學
在治療前及在犧牲時，自大鼠採集血液樣本並儲存以進行最終分析。進行測試以判定尿素、肌酸酐、鹼性磷酸酶(ALK)、丙胺酸轉胺酶(ALT)、天冬胺酸轉胺酶(AST)、乳酸去氫酶(LDH)、肌胺酸激酶(CK)、肌鈣蛋白I及對抗微小肌萎縮蛋白及AAV9殼體之抗體的血清濃度。ALT、AST、CK及LDH所有皆為自受損肌肉細胞釋放至血液中的酶，且已知在人類DMD病患中升高。
在注射後3個月及6個月，尿素、肌酸酐、ALK、總血清蛋白質、總膽紅素及肌鈣蛋白I的水準在不同實驗組之間並無顯著不同。對比之下，AST、ALT、LDH及總CK水準在媒劑處理Dmd mdx 大鼠相較於WT大鼠皆為上升，並對載體治療有不同程度的反應。
在注射後3及6個月，AST水準在經媒劑處理之Dmd mdx 大鼠相較於WT大鼠上升，雖然由於資料的變異性，顯著性僅存在於6個月時間點。當Dmd mdx 大鼠經載體治療時，在注射後3個月之1×1014及3×1014vg/kg劑量組及注射後6個月之3×1014vg/kg劑量組觀察到降低AST水準的趨勢(雖然有大幅的個體間差異)。同樣地，由於資料的變異性，這些差異未達到統計顯著性。這些結果顯示於圖48A及圖48B，分別報告注射後3個月及6個月時間點的資料。
ALT、LDH及總CK水準的模式皆以類似方式對年齡及載體治療反應。在注射後3個月，經媒劑處理之Dmd mdx 大鼠相較於WT大鼠的ALT、LDH及總CK水準皆顯著上升。以微小肌萎縮蛋白載體治療Dmd mdx 大鼠導致暗示ALT、LDH及總CK水準相對於媒劑處理Dmd mdx 大鼠呈劑量反應性減少之趨勢，在一些情況中達成統計顯著性。這些結果分別顯示於圖49A、圖50A及圖51A。在注射後6個月，資料中的趨勢暗示媒劑處理Dmd mdx 大鼠相較於WT大鼠有上升水準的ALT及LDH，該上升在最高載體測試劑量下反轉，但這些差異皆無統計顯著性。這些結果分別顯示於圖49B及圖50B。相對地，類似於在注射後3個月見到的模式，總CK在經媒劑處理之Dmd mdx 大鼠在注射後6個月相較於WT大鼠顯著上升，且載體治療導致在最高載體測試劑量下達成統計顯著性之減少水準之趨勢(圖51B)。
亦比較各治療組在注射當天及之後3及6個月 的總CK水準。如圖52A及圖52B所示，血液總CK水準在投予媒劑之WT大鼠呈現一致性地低，然而CK水準在所有Dmd mdx 大鼠包括僅經媒劑及最低載體劑量處理者皆降低。相對地，在經三個最高載體劑量治療之Dmd mdx 大鼠中，3及6個月之後CK水準的減少大得多。這些觀察與DMD在人類的自然病程一致，其中CK水準雖然相較於對照組升高，但隨著疾病進展而降低，因為肌肉被脂肪及纖維化組織替換，但在較高載體測試劑量下也具有劑量反應性治療效應。
也觀察到CK同功異構酶的差異。在投藥前，CK-MM異構體在Dmd mdx 大鼠中為主要形式(平均>90%)，然而CK-MM及CK-BB異構體在WT大鼠中相若(平均40至60%)，且CK-MB水準在WT中高於Dmd mdx 大鼠(4至6%相較於約1%)。在注射後3及6個月，經高於1×1013vg/kg之載體劑量治療的Dmd mdx 大鼠顯示CK-BB異構體的比例稍微增加，且CK-MM異構體的比例稍微降低，趨勢傾向於劑量相關效應。在載體治療Dmd mdx 大鼠中未觀察到CK-MB異構體比例的清楚改變。
免疫學
經AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體治療之Dmd mdx 大鼠的體液性及細胞性免疫反應係於治療前及注射後3及6個月測量並與陰性及陽性對照組比較。血清樣本獲自注射媒劑或載體之前及注射後3個月安樂死時。在注射 後3及6個月安樂死時收集脾細胞進行T細胞反應分析。
藉由西方墨點轉漬分析獲自測試動物並經稀釋1：500之血清，定性評估表現微小肌萎縮蛋白的體液性反應。來自投予媒劑或在接受載體前的所有大鼠(不論是WT或Dmd mdx )的血清皆呈現抗微小肌萎縮蛋白之抗體陰性。對比之下，大部分經載體治療之Dmd mdx 大鼠(即使在最低劑量1×1013vg/kg下)皆生產在西方墨點轉漬法中與微小肌萎縮蛋白結合之IgG抗體。取決於劑量，80%至100%在注射後3個月犧牲的Dmd mdx 大鼠以及60%至100%在注射後6個月犧牲的Dmd mdx 大鼠生產對微小肌萎縮蛋白具特異性之IgG。
抗AAV9載體殼體之抗體的存在係藉由ELISA測試。來自媒劑處理WT及Dmd mdx 大鼠的血清不具有可偵測到之與AAV9反應之IgG。對比之下，所有經載體治療之大鼠(不論劑量或在注射後3或6個月犧牲)皆生產力價高於1：10240(所測試的最高稀釋倍數)之抗AAV9 IgG。抗AAV9之中和抗體也使用細胞轉導抑制檢定測試，使用表現LacZ報導子基因且使用亮度計偵測的重組AAV9載體。力價定義為抑制>50%之轉導的最低稀釋倍數。抗AAV9之中和抗體在所有接受載體的Dmd mdx 大鼠血清中偵測到，不論劑量或在注射後3或6個月犧牲，但在相同動物的注射前或僅接受媒劑的WT及Dmd mdx 大鼠中則未偵測到。力價範圍自1：5000至1：500000，且無明顯劑量效應。
對載體之細胞性免疫反應的存在，係在單離 自媒劑處理WT及Dmd mdx 大鼠及接受載體之Dmd mdx 大鼠的脾細胞上使用IFNγ ELISpot檢定評估。對於載體基因體所表現之人微小肌萎縮蛋白的T細胞反應，係使用涵蓋opti-dys3978蛋白質之完整序列的重疊肽庫(長度15個胺基酸，重疊10個胺基酸，總計263個肽)及大鼠特異性IFNγ-ELISpotBASIC套組(Mabtech)測試。陰性對照組由未受刺激的脾細胞組成，且陽性對照組由經致裂物質刀豆球蛋白A刺激的細胞組成。IFNγ分泌係定量為每106個細胞中斑點形成細胞(SFC)的數量，陽性反應係定義為>50SFC/106個細胞或為陰性對照組獲得數值的至少3倍。在獲自任何測試動物不論注射後3個月或6個月的脾細胞中，皆未發現對抗任何源自微小肌萎縮蛋白之肽序列的特異性T細胞反應，包括以最高載體劑量3×1014vg/kg治療之Dmd mdx 大鼠。
對抗AAV9殼體之T細胞反應亦使用針對源自AAV9之肽序列(有10個胺基酸重疊之15聚體分成3群)進行篩選的IFNγ ELISpot檢定測試。介於16%至60%在注射後3個月犧牲的載體治療Dmd mdx 大鼠及介於16%至66%在注射後6個月犧牲的載體治療Dmd mdx 大鼠有陽性IFNγ反應，其與載體劑量呈正相關。對比之下，所有媒劑處理WT及Dmd mdx 大鼠之對抗AAV9殼體的T細胞反應皆為陰性。
實施例9
經AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA治療之較年長 Dmd mdx 大鼠的抓力強度
上述實例8描述之試驗係在7至9週齡的年輕大鼠進行。本實例描述首次經AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體治療時分別為4月齡及6月齡之較年長Dmd mdx 大鼠的肌肉功能分析。Sprague Dawley大鼠的平均壽命期係24至36個月。這些實驗的目標是要判定在Dmd mdx 大鼠生命較後期以載體治療是否有效。陽性結果將暗示以載體治療較年長人類DMD病患諸如較年長兒童、青少年或甚至年輕成人也可能改善他們的肌肉功能。
本實例描述之實驗使用類似於實例8所述之材料及方法進行。更具體而言，4及6月齡之Dmd mdx 大鼠(各年齡組之n=6)分開經1×1014vg/kg之AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA載體治療。作為陰性對照之4月齡及6月齡之WT大鼠及Dmd mdx 大鼠(各年齡組之n=6)分開僅經媒劑處理。在注射後3個月，如前所述測試大鼠的抓力強度。如同較年輕的大鼠，測試最大前肢抓力強度及多次重複試驗且每次試驗之間休息短暫的抓力強度。後項測試意欲測量肌肉疲勞。
如圖53A所示，在注射後3個月，在4月齡經媒劑處理之Dmd mdx 大鼠的最大前肢抓力強度相較於4月齡經媒劑處理WT大鼠平均稍微降低，雖然差異未達到統計顯著性。對比之下，在4月齡經1×1014vg/kg載體注射的Dmd mdx 大鼠相較於同年齡、僅經媒劑處理之Dmd mdx 大鼠具有較高平均最大前肢抓力強度，且差異確實達到統計顯著 性。載體治療大鼠的強度甚至大於WT大鼠，雖然差異不具統計顯著性。當資料經體重標準化後結果類似，如圖53B所示。在圖53A及圖53B中，符號「¤¤」指示在載體與媒劑處理Dmd mdx 大鼠之間具有統計顯著差異(p<0.01)。
關於如圖53C所示之肌肉疲勞，在4個月經媒劑處理之Dmd mdx 大鼠在第2次抓力測試後展現疲勞，然而WT大鼠即使在4次測試後未展現疲勞。對比之下，在4月齡經載體治療之Dmd mdx 大鼠在第1及第5次抓力測試之間展現最小(若有的話)肌肉疲勞。載體治療Dmd mdx 大鼠整體看起來也比媒劑處理WT大鼠較為強壯。在圖53C中，符號「*」指示在載體治療Dmd mdx 大鼠與媒劑處理WT大鼠之間具有統計顯著差異(p<0.05)；「¤¤」指示在載體與媒劑處理Dmd mdx 大鼠之間具有統計顯著差異(p<0.01)；且「§§」及「§§§」分別指示媒劑處理Dmd mdx 大鼠的第4及第5次抓力測試相較於第1次抓力測試具有統計顯著差異(分別為p<0.01及p<0.001)。
如圖54A所示，在注射後3個月，在6月齡經媒劑處理之Dmd mdx 大鼠的最大前肢抓力強度相較於6月齡經媒劑處理WT大鼠顯著較低。即使當結果經體重標準化後仍維持此效應，如圖54B所示。在6月齡以1×1014vg/kg載體治療Dmd mdx 大鼠相較於僅用媒劑處理之Dmd mdx 大鼠增加平均最大前肢抓力強度，此差異經體重標準化後達到統計顯著性(圖54B)。在圖54A及圖54B中，符號「*」及「**」指示在媒劑處理Dmd mdx 大鼠與WT大鼠之間具有統 計顯著差異(分別為p<0.05及p<0.01)；且「¤」指示在載體與媒劑處理Dmd mdx 大鼠之間具有統計顯著差異(p<0.05)。
關於如圖54C所示之肌肉疲勞，在6個月經媒劑處理之Dmd mdx 大鼠在第2次抓力測試後展現疲勞，然而WT大鼠即使在4次測試後未展現疲勞。相對於在4月齡處理的大鼠，在6月齡經載體治療之Dmd mdx 大鼠在多次抓力測試中展現一些強度的減少，雖然程度不及媒劑處理對照Dmd mdx 大鼠所見。同樣相對於在4月齡治療之大鼠所進行的測試，WT大鼠的強度在實驗期間似乎大於在6月齡經載體治療之Dmd mdx 大鼠。在圖54C中，符號「**」及「***」指示在載體治療Dmd mdx 大鼠與媒劑處理WT大鼠之間具有統計顯著差異(分別為p<0.01及p<0.001)；「¤」指示在載體與媒劑處理Dmd mdx 大鼠之間具有統計顯著差異(p<0.05)；且「§§」指示媒劑處理Dmd mdx 大鼠的第5次抓力測試相較於第1次抓力測試具有統計顯著差異(p<0.01)。
前文係本發明之說明且不應被解讀為本發明之限制。本發明係由下列申請專利範圍定義，且申請專利範圍之等效範圍亦包含其中。
<110> 班布療法公司(Bamboo Therapeutics,Inc.) 美國北卡羅萊納州立大學教堂山分校(The University of North Carolina at Chapel Hill)
<120> 最佳化之微小肌萎縮蛋白基因和表現卡匣及彼等之用途
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<160> 28
<170> PatentIn 3.5版
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<223> Hopti-Dys3978基因
<400> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hopti-Dys3837基因
<400> 2
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<211> 3978
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
<223> hCK啟動子
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<223> hCKplus啟動子
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<223> 合成polyA
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<212> PRT
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<223> Dys3978蛋白質
<400> 7
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<213> 人工序列
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<223> Dys3837蛋白質
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<223> 具有Hopti-Dys3978基因之AAV載體基因體
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<223> 具有Hopti-Dys3837基因之AAV載體基因體
<400> 10
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<212> DNA
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<223> 具有Hopti-Dys3837基因之AAV載體基因體
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<223> 具有Copti-Dys3978基因之AAV載體基因體
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<213> 腺病毒相關病毒9
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<211> 145
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<213> 腺病毒相關病毒2
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<223> 具有Hopti-Dys3978基因之AAV載體基因體
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<212> DNA
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<223> 引子
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<223> 引子
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<212> DNA
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<223> 引子
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<212> DNA
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<223> 引子
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<212> DNA
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<223> 引子
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<212> DNA
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<220>
<223> 引子
<400> 24
<210> 25
<211> 3685
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 非密碼子最佳化Dys3978基因
<400> 26
<210> 27
<211> 1329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> △3990蛋白質
<400> 27
<210> 28
<211> 3990
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> △3990基因
<400> 28

Claims (93)

  1. 一種編碼微小肌萎縮蛋白之多核苷酸，該多核苷酸包含：(a)SEQ ID NO：1之核苷酸序列或與其具有至少約90%同一性之核苷酸序列；(b)SEQ ID NO：2之核苷酸序列或與其具有至少約90%同一性之核苷酸序列；或(c)SEQ ID NO：3之核苷酸序列或與其具有至少約90%同一性之核苷酸序列。
  2. 如申請專利範圍第1項之多核苷酸，其中由該多核苷酸編碼之該微小肌萎縮蛋白基本上由野生型人肌萎縮蛋白之N端、肌動蛋白結合結構域(ABD)、絞鏈H1、棒狀結構域R1及R2、絞鏈H3、棒狀結構域R22、R23及R24、絞鏈H4、CR結構域及部分CT結構域組成。
  3. 如申請專利範圍第1項之多核苷酸，其中由該多核苷酸編碼之該微小肌萎縮蛋白基本上由野生型人肌萎縮蛋白之N端、ABD、絞鏈H1、棒狀結構域R1及R2、棒狀結構域R22、R23及R24、絞鏈H4、CR結構域及部分CT結構域組成。
  4. 如申請專利範圍第1項之多核苷酸，其中該微小肌萎 縮蛋白不包含野生型人肌萎縮蛋白C端的最後三個胺基酸殘基。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之多核苷酸，其中該多核苷酸編碼包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列或與其具有至少約90%同一性之胺基酸序列之微小肌萎縮蛋白。
  6. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之多核苷酸，其中該多核苷酸編碼包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列或與其具有至少約90%同一性之胺基酸序列之微小肌萎縮蛋白。
  7. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之多核苷酸，其可操作地連接啟動子。
  8. 如申請專利範圍第7項之多核苷酸，其中該啟動子係肌肉特異性啟動子。
  9. 如申請專利範圍第7項之多核苷酸，其中該啟動子係肌酸酐激酶啟動子。
  10. 如申請專利範圍第9項之多核苷酸，其中該啟動子包含SEQ ID NO：4之核苷酸序列。
  11. 如申請專利範圍第9項之多核苷酸，其中該啟動子包 含SEQ ID NO：5之核苷酸序列。
  12. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之多核苷酸，其可操作地連接聚腺苷酸化元件。
  13. 如申請專利範圍第12項之多核苷酸，其中該聚腺苷酸化元件包含SEQ ID NO：6之核苷酸序列。
  14. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之多核苷酸，其中該多核苷酸係包含啟動子及聚腺苷酸化元件之基因表現卡匣之一部分。
  15. 如申請專利範圍第14項之多核苷酸，其中該基因表現卡匣包含SEQ ID NO：9至12中任一者之核苷酸序列或與其具有至少約90%同一性之核苷酸序列。
  16. 一種載體，其包含如申請專利範圍第1至15項中任一項之多核苷酸。
  17. 如申請專利範圍第16項之載體，其中該載體係病毒載體。
  18. 如申請專利範圍第17項之載體，其中該載體係腺病毒相關病毒(AAV)載體。
  19. 如申請專利範圍第18項之載體，其中該AAV載體係AAV9載體。
  20. 一種轉形細胞，其包含如申請專利範圍第1至15項中任一項之多核苷酸及/或如申請專利範圍第16至19項中任一項之載體。
  21. 一種基本上由野生型人肌萎縮蛋白之N端、ABD、絞鏈H1、棒狀結構域R1及R2、絞鏈H3、棒狀結構域R22、R23及R24、絞鏈H4、CR結構域及部分CT結構域組成之微小肌萎縮蛋白，其中該微小肌萎縮蛋白不包含野生型人肌萎縮蛋白C端的最後三個胺基酸殘基。
  22. 如申請專利範圍第21項之微小肌萎縮蛋白，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列或與其具有至少約90%同一性之胺基酸序列。
  23. 一種微小肌萎縮蛋白，其基本上由野生型人肌萎縮蛋白之N端、ABD、絞鏈H1、棒狀結構域R1、R2、R22、R23及R24、絞鏈H4、CR結構域及部分CT結構域組成。
  24. 如申請專利範圍第23項之微小肌萎縮蛋白，其中該微小肌萎縮蛋白不包含野生型人肌萎縮蛋白C端的最後三個 胺基酸殘基。
  25. 如申請專利範圍第23或24項之微小肌萎縮蛋白，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列或與其具有至少約90%同一性之胺基酸序列。
  26. 一種在細胞中生產微小肌萎縮蛋白之方法，其包含使該細胞與如申請專利範圍第1至15項中任一項之多核苷酸或如申請專利範圍第16至19項中任一項之載體接觸，藉以在該細胞中生產該微小肌萎縮蛋白。
  27. 一種在個體中生產微小肌萎縮蛋白之非治療方法，其包含遞送如申請專利範圍第1至15項中任一項之多核苷酸、如申請專利範圍第16至19項中任一項之載體及/或如申請專利範圍第20項之轉形細胞至該個體，藉以在該個體中生產該微小肌萎縮蛋白。
  28. 一種如申請專利範圍第1至15項中任一項之多核苷酸、如申請專利範圍第16至19項中任一項之載體及/或如申請專利範圍第20項之轉形細胞於製備用於治療個體之肌肉萎縮的藥物之用途。
  29. 如申請專利範圍第28項之用途，其中該肌肉萎縮係杜興(Duchenne)氏肌肉失養症或貝克(Becker)氏肌肉失養 症。
  30. 一種重組AAV顆粒，其包含AAV殼體及用於表現人微小肌萎縮蛋白之載體基因體。
  31. 如申請專利範圍第30項之重組AAV顆粒，其中該AAV殼體係來自AAV9。
  32. 如申請專利範圍第30項之重組AAV顆粒，其中該載體基因體包含編碼該人微小肌萎縮蛋白之人密碼子最佳化核酸序列。
  33. 如申請專利範圍第30至32項中任一項之重組AAV顆粒，其中該人微小肌萎縮蛋白依胺基端至羧基端之順序包含來自全長人肌萎縮蛋白之下列子結構域：N端肌動蛋白結合結構域、H1、R1、R2、H3、R22、R23、R24、H4、半胱胺酸富含區、及不包括野生型人肌萎縮蛋白的最後3個胺基酸之部分羧基端結構域。
  34. 如申請專利範圍第30至32項中任一項之重組AAV顆粒，其中該N端肌動蛋白結合結構域由SEQ ID NO：25之胺基酸編號1至240組成；H1由SEQ ID NO：25之胺基酸編號253至327組成；R1由SEQ ID NO：25之胺基酸編號337至447組成；R2由SEQ ID NO：25之胺基酸編號448至556組 成；H3由SEQ ID NO：25之胺基酸編號2424至2470組成；R22由SEQ ID NO：25之胺基酸編號2687至2802組成；R23由SEQ ID NO：25之胺基酸編號2803至2931組成；R24由SEQ ID NO：25之胺基酸編號2932至3040組成；H4由SEQ ID NO：25之胺基酸編號3041至3112組成；該CR結構域由SEQ ID NO：25之胺基酸編號3113至3299組成；且該部分CT結構域由SEQ ID NO：25之胺基酸編號3300至3408組成。
  35. 如申請專利範圍第30至32項中任一項之重組AAV顆粒，其中該人微小肌萎縮蛋白包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列。
  36. 如申請專利範圍第30至32項中任一項之重組AAV顆粒，其中編碼該人微小肌萎縮蛋白之該人密碼子最佳化核酸包含SEQ ID NO：1之核酸序列。
  37. 如申請專利範圍第30至32項中任一項之重組AAV顆粒，其中該載體基因體進一步包含5 ' AAV反向末端重複(ITR)及3 ' AAV ITR以側接編碼該人微小肌萎縮蛋白之該密碼子最佳化核酸。
  38. 如申請專利範圍第37項之重組AAV顆粒，其中該AAV ITR係AAV2 ITR。
  39. 如申請專利範圍第30至32項中任一項之重組AAV顆粒，其中該載體基因體進一步包含與該人密碼子最佳化核酸序列可操作地連接之肌肉特異性轉錄調節元件。
  40. 如申請專利範圍第39項之重組AAV顆粒，其中該肌肉特異性轉錄調節元件係位於該5 ' AAV2 ITR與編碼該人微小肌萎縮蛋白之該人密碼子最佳化核酸之間。
  41. 如申請專利範圍第39項之重組AAV顆粒，其中該肌肉特異性轉錄調節元件係源自該人或小鼠肌胺酸激酶基因。
  42. 如申請專利範圍第39項之重組AAV顆粒，其中該肌肉特異性轉錄調節元件包含增強子及啟動子。
  43. 如申請專利範圍第39項之重組AAV顆粒，其中該肌肉特異性轉錄調節元件包含SEQ ID NO：16之核苷酸序列。
  44. 如申請專利範圍第37項之重組AAV顆粒，其中該載體基因體進一步包含介於編碼該人微小肌萎縮蛋白之該密碼子最佳化核酸的5 '端與該3 ' ITR之間之轉錄終止序列。
  45. 如申請專利範圍第44項之重組AAV顆粒，其中該轉錄終止序列包含聚腺苷酸化信號序列。
  46. 如申請專利範圍第30至32項中任一項之重組AAV顆粒，其中該載體基因體依5 '至3 '之順序包含：第一AAV2 ITR、可操作地連接編碼人微小肌萎縮蛋白之人密碼子最佳化核酸之肌肉特異性轉錄調節元件、轉錄終止序列及第二AAV2 ITR。
  47. 如申請專利範圍第46項之重組AAV顆粒，其中該肌肉特異性轉錄調節元件包含SEQ ID NO：16之核苷酸序列。
  48. 如申請專利範圍第46項之重組AAV顆粒，其中該人密碼子最佳化核酸序列包含SEQ ID NO：1之核苷酸序列或與其具有至少95%同一性之序列。
  49. 如申請專利範圍第46項之重組AAV顆粒，其中該轉錄終止序列包含SEQ ID NO：17之核苷酸序列。
  50. 如申請專利範圍第30至32項中任一項之重組AAV顆粒，其中該載體基因體包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列或其反向互補序列。
  51. 如申請專利範圍第30至32項中任一項之重組AAV顆粒，其中該載體基因體基本上由SEQ ID NO：18之核苷酸序列或其反向互補序列組成。
  52. 如申請專利範圍第30至32項中任一項之重組AAV顆粒，其中該載體基因體由SEQ ID NO：18之核苷酸序列或其反向互補序列組成。
  53. 一種重組AAV顆粒，其包含AAV9殼體及載體基因體，該載體基因體包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列或其反向互補序列。
  54. 一種重組AAV顆粒，其包含AAV9殼體及載體基因體，該載體基因體基本上由SEQ ID NO：18之核苷酸序列或其反向互補序列組成。
  55. 一種重組AAV顆粒，其包含AAV9殼體及載體基因體，該載體基因體由SEQ ID NO：18之核苷酸序列或其反向互補序列組成。
  56. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第30至55項中任一項之重組AAV顆粒及醫藥上可接受之載劑。
  57. 一種如申請專利範圍第56項之醫藥組成物於製備用於治療個體之抗肌萎縮蛋白病的藥物之用途。
  58. 一種如申請專利範圍第30至55項中任一項之重組AAV 顆粒或如申請專利範圍第56項之醫藥組成物於製備用於治療抗肌萎縮蛋白病個體的藥物之用途。
  59. 如申請專利範圍第30至32及53至55項中任一項之重組AAV顆粒，其係用於治療抗肌萎縮蛋白病個體。
  60. 如申請專利範圍第56項之醫藥組成物，其係用於治療抗肌萎縮蛋白病個體。
  61. 如申請專利範圍第57至58項中任一項之用途，其中該抗肌萎縮蛋白病係杜興氏肌肉失養症(DMD)、貝克氏肌肉失養症(BMD)或 DMD相關擴張性心肌病。
  62. 如申請專利範圍第57至58項中任一項之用途，其中該個體係男性或女性人個體。
  63. 如申請專利範圍第57至58項中任一項之用途，其中該個體首次接受治療時可以走動。
  64. 如申請專利範圍第57至58項中任一項之用途，其中該個體首次接受治療時係約4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16歲。
  65. 如申請專利範圍第57至58項中任一項之用途，其中該 AAV顆粒之劑量係選自由下列所組成之群組：1×10 12vg/kg、2×10 12vg/kg、3×10 12vg/kg、4×10 12vg/kg、5×10 12vg/kg、6×10 12vg/kg、7×10 12vg/kg、8×10 12vg/kg、9×10 12vg/kg、1×10 13vg/kg、2×10 13vg/kg、3×10 13vg/kg、4×10 13vg/kg、5×10 13vg/kg、6×10 13vg/kg、7×10 13vg/kg、8×10 13vg/kg、9×10 13vg/kg、1×10 14vg/kg、1.5×10 14vg/kg、2×10 14vg/kg、2.5×10 14vg/kg、3×10 14vg/kg、3.5×10 14vg/kg、4×10 14vg/kg、4.5×10 14vg/kg、5×10 14vg/kg、5.5×10 14vg/kg、6×10 14vg/kg、6.5×10 14vg/kg、7×10 14vg/kg、7.5×10 14vg/kg、8×10 14vg/kg、8.5×10 14vg/kg及9×10 14vg/kg。
  66. 如申請專利範圍第57至58項中任一項之用途，其用於將該個體之血中平均ALT、AST或LDH水準減少至高於健康對照組之血中ALT、AST或LDH水準的約7、6、5、4、3或2倍以內。
  67. 如申請專利範圍第57至58項中任一項之用途，其用於將該個體之血中平均總CK水準減少至高於健康對照組之血中平均總CK水準的約50、48、46、44、42、40、38、36、34、32、30、28、26、24、22、20、18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、4、3或2倍以內。
  68. 如申請專利範圍第57至58項中任一項之用途，其用於 將該個體之平均6分鐘步行距離(6MWD)相較於未治療對照組之平均6MWD增加至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100公尺。
  69. 如申請專利範圍第68項之用途，其中該個體之6MWD係於投予該載體之後3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33或36個月測定。
  70. 如申請專利範圍第57至58項中任一項之用途，其用於將該個體進行爬4階樓梯測試所需之平均時間相較於未治療對照組之平均時間減少至少0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8或4.0秒。
  71. 如申請專利範圍第70項之用途，其中該個體之爬4階樓梯時間係於投予該載體之後3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33或36個月測定。
  72. 如申請專利範圍第57至58項中任一項之用途，其用於將個體失去行動力的平均比例相較於未治療對照組失去行動力的平均比例減少至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%或65%。
  73. 如申請專利範圍第72項之用途，其中個體之行動力係於投予該載體之後3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33或36個月測定。
  74. 如申請專利範圍第57至58項中任一項之用途，其用於將該個體之下肢脂肪比例相較於未治療對照組之下肢平均脂肪比例減少至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。
  75. 如申請專利範圍第74項之用途，其中該個體之下肢脂肪比例係於投予該載體之後3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33或36個月測定。
  76. 如申請專利範圍第57至58項中任一項之用途，其用於造成個體至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%的骨骼肌纖維表現該微小肌萎縮蛋白。
  77. 如申請專利範圍第76項之用途，其中該微小肌萎縮蛋白於該個體之該等肌肉纖維中之表現係於投予該載體之後3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33或36個月測定。
  78. 如申請專利範圍第76項之用途，其中該等骨骼肌纖維 係存在於取自該個體之二頭肌、三角肌或四頭肌的活體組織切片中。
  79. 如申請專利範圍第57至58項中任一項之用途，其用於在少於或等於約0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%的個體中造成對抗該微小肌萎縮蛋白之細胞性免疫反應或肌肉發炎。
  80. 如申請專利範圍第79項之用途，其中對抗該微小肌萎縮蛋白之細胞性免疫反應或肌肉發炎之存在係於投予該載體之後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36個月測定。
  81. 如申請專利範圍第57至58項中任一項之用途，其中該醫藥組成物係與至少一種可有效治療抗肌萎縮蛋白病之第二藥劑聯合投予。
  82. 如申請專利範圍第81項之用途，其中該第二藥劑係選自由下列所組成之群組：造成 DMD基因外顯子跳過之反義寡核苷酸、抗肌肉生成抑制素抗體、促進核糖體通讀(read-through)無意義突變之藥劑、抑制過早終止密碼子之 藥劑、同化類固醇及皮質類固醇。
  83. 一種如申請專利範圍第56項之醫藥組成物於製備用於增加個體之肌肉質量或強度的藥物之用途。
  84. 一種如申請專利範圍第56項之醫藥組成物於製備用於預防個體之肌肉質量或強度之喪失的藥物之用途。
  85. 一種如申請專利範圍第56項之醫藥組成物於製備用於預防個體之抗肌萎縮蛋白病的藥物之用途。
  86. 一種製造如申請專利範圍第30至55項之重組AAV顆粒之方法，該方法包含：將包含該AAV載體基因體之多核苷酸、包含AAV rep基因之多核苷酸、包含AAV cap基因之多核苷酸、及編碼一或多個病毒幫手基因之多核苷酸導入生產細胞中，培養該細胞；以及純化藉此生產之該等AAV顆粒。
  87. 如申請專利範圍第86項之方法，其中該載體基因體係包含於第一質體中，且該等rep、cap及病毒幫手基因係包含於一或二個額外質體中。
  88. 一種製造如申請專利範圍第30至55項之重組AAV顆粒 之方法，該方法包含：將包含該AAV載體基因體之多核苷酸、包含AAV rep基因之多核苷酸、及包含AAV cap基因之多核苷酸導入生產細胞中，培養該細胞；以及純化藉此生產之該等AAV顆粒，其中該生產細胞包含且表現內源性病毒幫手基因。
  89. 如申請專利範圍第88項之方法，其中該載體基因體係包含於第一質體中，且該等rep及cap基因係包含於一或二個額外質體中。
  90. 如申請專利範圍第86至89項中任一項之方法，其中該導入步驟係由轉染進行。
  91. 如申請專利範圍第86至89項中任一項之方法，其中該生產細胞係HEK293細胞。
  92. 如申請專利範圍第86至89項中任一項之方法，其中該cap基因係AAV9 cap基因。
  93. 一種AAV顆粒，其係由如申請專利範圍第86至92項中任一項之方法生產。
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