CN116406297A - 治疗心脏疾患和充血性心力衰竭以及施用aav载体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在单次施用方法中施用rAAV载体的方法，所述方法包括一系列子剂量的rAAV载体的子施用。本发明还涉及包含心脏特异性启动子、心脏细胞特异性启动子、多细胞心脏特异性启动子及其元件的rAAV载体。本发明还涉及rAAV载体、药物组合物及其在治疗有需要的受试者的心血管疾病、心脏疾病和心力衰竭的方法中的用途。

Description

治疗心脏疾患和充血性心力衰竭以及施用AAV载体的方法
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本国际申请要求2020年8月5日提交的美国临时申请号63/061,342和2021年6月23日提交的美国临时申请号63/214,119的权益，将其内容通过引用整体并入本文。
序列表
本申请包含序列表，其已经以ASCII格式电子提交，并由此通过引用将其整体并入。所述ASCII副本创建于2021年8月4日，命名为046192-097980WOPT_SL.txt，并具有1,059,646字节的大小。
技术领域
本文的技术涉及用于治疗心脏疾患(cardiac disorders)、心力衰竭(包括慢性心力衰竭(CHF))的AAV载体和调节性核酸序列，特别是心脏特异性启动子、肌肉细胞特异性启动子、及其元件。本文的技术还涉及施用AAV载体以用于治疗心脏疾患的表达方法。本文的技术还涉及包含这种启动子的构建体、载体、病毒粒子、药物组合物和细胞，其用于降低磷酸酶活性以改善β-肾上腺素能响应性，以及它们的使用方法。
背景技术
提供以下讨论是为了帮助读者理解本公开，并不构成对现有技术的内容或相关性的任何承认。
心力衰竭(由ACC/AHA定义为由心室充盈或射血的任何结构或功能障碍导致的复杂临床综合征)仍然是美国最常见、费钱和使人衰弱的疾病之一。基于2011年至2014年的美国国家健康与营养调查(National Health and Nutrition Examination Survey)数据，估计有600万美国成年人患有它，预计到2030年将多于800万。认为每年会发生超过960,000新病例，发病的终生风险为约20％至45％。因此，心力衰竭(HF)(也称为充血性心力衰竭(CHF))在美国是流行疾病。
心力衰竭是在其中心肌收缩性下降，并且心脏失去其有效泵血的能力的疾患。心力衰竭几乎总是慢性、长期的病症，并且消耗了过度量的医疗干预和人力资源费用。特别是，从患者生产生活的整体减少、以及从治疗费用的角度来看，心力衰竭对其他身体器官造成的后果都可以是毁灭性的。该病症可影响右侧、左侧或两侧的心脏。由于心脏的泵送作用受损，血液开始倒流到身体的其他区域。许多器官和器官系统开始因缺乏氧气和营养物质而遭受累积性损害。
在略多于一半的受影响个体中，心脏功能下降，如通过射血分数降低(伴有下降的射血分数的心力衰竭；HFrEF)所证明的，并且左心室扩张。在过去的3个十年中，已经引入了靶向对HF进展很关键的通路的新药，以及植入式心脏除颤器和再同步装置。然而，与HFrEF相关的发病率和死亡率仍处于不可接受的水平，多达50％的受影响个体在诊断后5年内死亡。这引发了研究者评估基因治疗通过增加心脏中的特定蛋白质的量而减轻或治愈HFrEF中的作用。
蛋白激酶和它们的磷酸化蛋白底物在心脏的泵送作用中很重要，并已被很好地表征，然而，逆转增加的心脏收缩性的蛋白磷酸酶也很重要。主要的Ser/Thr磷酸酶(1型、2A型和2B型(钙调磷酸酶))源于共同的基因家族，是高度同源的蛋白质(40％-50％)(Cohen,P.，1990Phosphoprotein Res；24：230-5)，在控制心脏收缩性和肥大方面发挥关键作用。已经显示出，蛋白磷酸酶2A的催化亚单位的过度表达会降低心脏功能并导致病理性心脏肥大(Brewis,N.等，2000Am J Physiol Heart Circ Physiol；279：H1307-18；Gergs,U.等，2004J Biol Chem.)。此外，钙调磷酸酶(一种钙依赖性磷酸酶)通过其对NFAT转录因子活性的调节来诱导肥大。5有趣的是，在体内和在体外对这种磷酸酶的抑制阻止了心脏肥大(Brewis,N.等，2000；Molkentin,J.D.，1998Cell；93：215-28)。
在人和实验性心力衰竭中，与肌质网(SR)相关的1型磷酸酶(PP1)的活性显著增加，表明这可能是功能降低、扩张型心肌病和过早死亡的促成因素(Huang,B.等，1999CircRes；85：848-55；Sande,J.B.，等，2002Cardiovasc Res；53：382-91；Boknik,P.等，2000Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol；362：222-31；Gupta,R.C.等，1997Circulation；96(Suppl 1):I-361；Neumann,J.1997J Mol Cell Cardiol；29：265-72；Carr,A.N.等，2002，Mol Cell Biol；22：4124-35)。
先前已确立，蛋白激酶Cα(“PKC-α”)的活性在心力衰竭的病理状态下增加。抑制蛋白磷酸酶-1(“PP-1”)的活性导致心脏收缩性增强(Pathak,A.等2005Circ Res 15:756′-66)。
需要对受试者的心力衰竭进行有效的治疗和预防。基因治疗对治疗各种疾病和疾患是有用的。然而，重要的是，基因治疗的递送、以及基因或核酸对特定组织和/或细胞类型的表达是最佳的。
基因治疗不仅有潜力治愈遗传疾患，还有利于利用病毒对获得性和退行性疾病进行长期非侵入性治疗。一种基因治疗载体是腺相关病毒(AAV)。AAV自身是需要辅助病毒来有效复制的非致病性依赖性细小病毒。AAV因其安全性和简单性而被用作基因治疗的病毒载体。AAV具有广泛的宿主和细胞类型趋向性，能够转导正在分裂和不在分裂的细胞。
在对体内基因调节的内部机制进行了广泛的研究之后，研究重点最近转移到通过将外源核酸序列引入细胞来调节基因表达。这在研究和生物加工中常规地完成，其中，可操作地连接至启动子的期望表达产物的核酸序列通常以载体的形式被引入生产细胞系。
在基因治疗领域，这对于遗传疾患(例如单基因疾患(或孟德尔病)有特别的意义，所述遗传疾患由存在于患者细胞中的有缺陷的基因引起。在基因治疗中，控制已被引入细胞的外源核酸的表达对患者的健康和安全至关重要。不仅表达产物的水平需要在治疗窗口内，而且需要在所需的组织内、甚至在所需组织的特定区域内表达，以使治疗有效。此外，表达可能需要限制到特定的细胞类型或多种细胞类型，以避免副作用。在治疗窗口之外的表达(即更低或更高)或在治疗区域之外的表达、或甚至在特定细胞或细胞的组合之外的表达，可能没有治疗作用，或甚至是有害的。
因此，需要驱动在心脏中、特别是在心脏的平滑肌或心肌中、特别是在特定的细胞类型(例如心肌细胞等)中表达的启动子。在心脏中的表达包括在心脏细胞、例如心肌细胞以及心脏平滑肌细胞中的表达。
因此，需要对心力衰竭(包括充血性心力衰竭(CHF))和其他心脏疾病和疾患的有效治疗。还需要有效地施用病毒载体以治疗疾病。本发明的一个或多个方面旨在解决上述问题中的一个或多个。
发明内容
本文描述的技术大体上涉及基因治疗构建体、组合物和施用方法，用于治疗心血管病症、心脏疾病和心力衰竭。本文还公开了施用AAV载体的方法，以及包含AAV载体的组合物和方法，用于治疗心脏疾患和疾病(包括心力衰竭和充血性心力衰竭(CHF))。在某些方面，用于治疗心脏疾患和疾病的AAV载体包括例如编码磷酸酶抑制剂的AAV载体，例如用于在心脏细胞中表达磷酸酶抑制剂以治疗心脏疾患(例如心力衰竭)。降低磷酸酶活性可以改善β-肾上腺素能响应性。
特别是，本发明的各个方面针对的是用于治疗患有心力衰竭的受试者的新型施用方法和新型rAAV组合物，包括施用方法，所述施用方法包括向具有心力衰竭分类的受试者施用一剂rAAV，其中，在施用后至少12个月，所述心力衰竭分类改善了至少一个、或至少两个分期或分类水平。在一些实施方式中，本文公开的施用方法可与其他药剂组合使用，包括但不限于使用免疫调节剂和/或血管扩张剂、以及包含密码子优化的核酸序列以编码I-1c(抑制蛋白磷酸酶1活性的组成型活化的经截短的抑制剂-1)的rAAV载体，和/或包含新型心脏特异性肌肉启动子的rAAV载体。此外，发明人已经示出了治疗患有心力衰竭的受试者(包括患有非缺血性心肌病和缺血性心肌病的受试者)的不同方法，这些方法具有能够显著改善受试者在用于评价心力衰竭的分类系统中的归类的能力。可以使用一系列分类系统来对受试者的心力衰竭程度进行分类，并且这些分类系统在本领域是众所周知的，包括但不限于美国心脏协会(American Heart Association，AHA)、美国心脏病学会(AmericanCollege of Cardiology，ACC)、明尼苏达心力衰竭生活质量问卷(Minnesota LIVING WITHHEART
Figure BDA0004161819920000041
Questionnaire，MLHFQ)、堪萨斯城心肌病问卷(Kansas CityCardiomyopathy questionnaire，KCCQ)、或2016欧洲心脏病学会指南(European Societyof Cardiology guidelines，ESCG)、日本心力衰竭学会(Japanese heart failureSociety，JHFS)指南、日本循环学会(Japanese Circulation Society，JCS)指南、或纽约心脏协会(NYHA)，或其修改后的评价或组合或合并的评价。
仅出于示例性目的，并且不希望局限于理论，已经证实了如本文所公开的治疗患有心力衰竭受试者的方法、或如本文所公开的施用方法用于如下：在施用本文所公开的rAAV后的12个月内改善根据如本文所公开的心力衰竭分类系统的受试者的心力衰竭分类，从例如IV级到III级或小于III级，或例如从III级到II级或小于II级。在一些实施方式中，使用相当于NYHA或AHA或ACC分类的系统、或本领域普通技术人员已知的任何其他比较性的心力衰竭分类系统。
本文所述技术的其他方面涉及编码I-1c蛋白的新型rAAV载体，所述载体可操作地连接至本文所公开的心脏特异性启动子、或心肌特异性启动子、或特异性地在心肌中活化的骨骼肌启动子。在一些实施方式中，编码I-1c蛋白的rAAV载体包含编码I-1c的密码子优化的核酸序列，例如，选自SEQ ID NOs：385-412中的任何一个，或与其具有至少85％序列同一性的核酸序列。在一些实施方式中，编码I-1c蛋白的rAAV载体包含编码I-1c的密码子优化的核酸序列(例如，选自SEQ ID NOs：385-412中的任何一个，或者，与其具有至少85％序列同一性的核酸序列)，其可操作地与本文所公开的CMV启动子、或心脏特异性启动子、或心肌特异性启动子、或特异性地在心肌中活化的骨骼肌连接。在一些实施方式中，包含编码I-1c的密码子优化的核酸序列的rAAV载体(例如选自SEQ ID NOs：385-412中的任何一个，或与其具有85％序列同一性的核酸序列)进一步包含逆向poly A或ds RNA终止元件。在一些实施方式中，编码用于本文所公开的方法和组合物中的I-1c蛋白的rAAV载体包含选自SEQID NOs：413-440中任何一个的核酸序列、或与其具有至少85％序列同一性的核酸序列。
本文还提供了封闭末端的线性双链体DNA(或者，本文中也称为封闭的线性DNA)，其包含SEQ ID NO：357-384中任何一个的核酸序列。在一些实施方式中，使用SEQ ID NO：357-384的封闭末端的线性双链DNA制造缺乏细菌序列并编码用于本文所公开的方法和组合物中的I-Ic蛋白的rAAV载体。
本文所述技术的一个方面涉及施用rAAV载体的方法，其中，所述方法是向受试者的单次施用，其中，单次总剂量施用包括在单次施用内的至少2、或3、或4、或5个以上的子剂量。换句话说，在一些实施方式中，该方法包括在单次施用中向受试者施用rAAV载体，其中，单次总剂量施用包括从至少2、或3、或4、或5个以上小瓶中施用rAAV，其中，在1-5分钟之间或多于5分钟的时间段内从每个小瓶中施用总的rAAV剂量。在一些实施方式中，rAAV载体选自于由AAV2、AAV6、AAV8、AAV9、AAV2i8、rh10、AAV2.5和AAV2G9所组成的组。在某些实施方式中，rAAV载体是AAV2i8(也被称为BNP116)。在另一个实施方式中，rAAV载体包括VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，其来自选自表11中所列的AAV血清型组的血清型，该表还列出了本领域已知的衣壳蛋白序列。
在一些实施方式中，所述方法涉及将rAAV载体施用于受试者(例如，人类受试者)的心脏。在一些实施方式中，所述rAAV载体包含心脏特异性启动子，例如，选自本文表2A中公开的任何心脏特异性启动子的示例性心脏特异性启动子、或其功能变体或功能片段，或选自本文表2和表3的任何心脏特异性启动子(CSP)。在一些实施方式中，根据所公开的方法施用rAAV载体，以用于治疗心血管病症、心力衰竭或心脏疾病或疾患。在一些实施方式中，根据本文所公开的方法施用的rAAV载体是包含编码用于治疗心力衰竭的治疗剂的核酸的rAAV载体，其中所述核酸可操作地连接至本文表2A中公开的心脏特异性启动子、或其功能变体或功能片段、或选自本文表2和表3的任何CSP。
在一些实施方式中，本文描述的技术涉及将rAAV载体与免疫调节剂共同施用的方法，如本文所公开的那样。
本文所述技术的另一个方面涉及基因治疗构建体、方法和组合物，用于治疗心力衰竭。更特别的是，所述技术涉及腺相关(AAV)病毒粒子，其被配置为用于向受试者递送蛋白磷酸酶1(PP1)抑制剂，并且更特别地用于递送用来在受试者的心脏中表达的PP1抑制剂。
因此，在一个方面，本公开的特点是一种方法，其包括向心脏细胞(例如心肌细胞)内施用表达调节细胞中的磷酸酶活性(例如1型磷酸酶活性)的药剂的rAAV载体。心脏细胞可以是体外的或体内的。例如，心脏细胞可以在受试者的心脏中。该方法可用于治疗受试者，例如患有心脏疾患(例如心力衰竭)的受试者。通常，受试者是哺乳动物，例如人或非人哺乳动物。1型磷酸酶包括但不限于PP1cα、PP1cβ、PP1cδ和PP1cγ。
在一个实施方式中，所述药剂是包含编码抑制磷酸酶活性(例如1型磷酸酶活性)的蛋白质的序列的核酸。rAAV载体可以以有效降低磷酸酶活性和/或增加所处理的细胞中的β-肾上腺素能响应性的量施用。
在一些实施方式中，rAAV载体表达核酸，所述核酸增加编码抑制磷酸酶活性的蛋白质的内源性核酸的表达。例如，所述核酸可以包括编码转录因子(例如经工程化的转录因子，如嵌合锌指蛋白)的序列。在另一个实例中，所述核酸是调节序列，该调节序列整合在编码抑制磷酸酶活性的蛋白质的内源性核酸中或附近，例如，在编码磷酸酶抑制剂-1(“I-1”)的基因中或附近。
在又一个实施方式中，rAAV载体表达如下的核酸，该核酸可以提供基因表达的核酸调节剂。例如，所述核酸可以是能够表达这种核酸调节剂的核酸，例如dsRNA(例如siRNA)、反义RNA或核酶。
在一个实施方式中，本文公开的rAAV载体在其基因组中包括：5’和3’AAV反向末端重复(ITR)序列，以及位于5’和3’ITR之间的编码蛋白磷酸酶1(PP1)抑制剂的异源核酸序列，其中，所述异源核酸可操作地连接至心脏特异性启动子(CSP)。在一些实施方式中，所述PP1抑制剂是抑制剂-1(Inhibitor-1，I-1)或其功能变体。在一些实施方式中，所述心脏特异性启动子是合成的心脏特异性启动子，其选自本文表2A中列出的任何启动子、或其功能变体或功能片段、或选自本文表2和表3的任何CSP。
在一个实施方式中，所述rAAV通过注射施用，例如直接注射到心脏内，例如直接注射到左心室表面内。在一些实施方式中，rAAV被施用到循环系统的腔内，例如施用到受试者的心脏或心脏血管的室(chamber)或腔(lumen)内。例如，可以打开心包膜，并且(例如使用注射器和导管)可将rAAV注射入心脏中。rAAV可以施用到主动脉的腔(例如主动脉根)内，引入冠状动脉口或引入心脏的腔内。可以把rAAV施用到冠状动脉内。也可以限制血流以增加在血管中(例如在冠状动脉中)的停留时间，例如使用顺行或逆行阻断。在一些实施方式中，使用装配有注射泵或输液泵的注射器来施用rAAV。在一些实施方式中，使用手动控制的注射器施用rAAV。
在一个实施方式中，本文公开的rAAV载体通过经皮注射引入，例如，从股动脉逆行至冠状动脉。在又一个实施方式中，例如使用血管支架，引入本文公开的rAAV载体。例如，将本文公开的rAAV载体涂覆在血管支架上，并将血管支架插入血管(例如冠状动脉、外周血管或脑动脉)中。
在一个实施方式中，引入本文公开的rAAV载体包括限制通过冠状动脉血管的血流(例如，部分或完全限制)，将病毒递送系统引入冠状动脉的腔中，并允许心脏泵送，同时限制冠状静脉的血液流出。限制通过冠状动脉血管的血流可以例如通过对至少一个、两个或三个血管成形术球囊进行充气来进行。限制通过冠状动脉血管的血流可以持续例如至少1、2、3或4分钟。将病毒颗粒引入冠状动脉可以例如由顺行注射通过血管成形术球囊的腔来进行。受限的冠状动脉血管可以是：左前降支动脉(LAD)、远端旋动脉(distal circumflexartery，LCX)、冠状大静脉(great coronary vein，GCV)、心脏中静脉(MCV)或前室间静脉(AIV)。病毒颗粒的引入可以在冠状动脉血管的缺血性预处理后进行，例如，通过如对至少一个、两个或三个血管成形术球囊充气)限制血流。冠状动脉血管的缺血预处理可以持续至少1、2、3或4分钟。
在一个实施方式中，引入本文所公开的rAAV载体包括限制流出心脏的主动脉血流(例如，部分或完全限制)，将病毒递送系统引入循环系统的腔内，并允许心脏(例如，针对封闭系统(等体积地))泵送，同时限制主动脉血流的流出。限制流出心脏的主动脉血流可以通过重新引导血流到冠状动脉(例如到肺动脉)来进行。限制主动脉的血流可以通过夹住(例如夹住肺动脉)来完成。引入病毒颗粒可以通过例如使用导管或例如直接注射来进行。引入病毒颗粒可以通过递送到主动脉根内来进行。
心脏特异性启动子可以在其他细胞中表达。然而，它在心脏细胞(例如心脏中的心肌细胞，以及位于心脏中的非心肌细胞)中的表达程度更高。例如，心脏特异性启动子在位于心脏中的细胞(包括位于心脏中的心肌细胞和非心肌细胞)中表达的基因比在位于心脏外的细胞中表达的基因高至少25％、或至少35％、或至少45％、或至少55％、或至少65％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或25％-95％之间的任何整数。
在下文中定义了功能变体。合适地，合成的心脏特异性启动子可包含与SEQ IDNO：3-64中的任何一个至少60％、65％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。合适地，所述合成的心脏特异性启动子可包含与SEQ ID NO：3-64中的任何一个至少60％、65％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列，其可操作地连接至与SEQ ID NO：3-32中的任一项至少60％、65％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
在一个实施方式中，提供了合成的心脏特异性启动子，其包含本文所公开的以下的顺式调控元件(CRE)中的至少一种，或由本文所公开的以下的顺式调控元件(CRE)中的至少一种组成。
本文所公开的技术的一个方面涉及治疗患有心力衰竭的患者的方法，包括：向患者的心脏细胞中施用至少一个总剂量的rAAV载体，所述rAAV载体包含编码抑制磷酸酶活性的磷酸酶抑制剂蛋白的核酸序列，其中，至少一剂的rAAV选自约1013vg至约1015vg的总剂量范围，并且其中，在施用后6个月，患者血清中的NT-proBNP水平低于900pg/mL。
本文所述技术的另一个方面涉及治疗患有心力衰竭的患者的方法，包括：向患者的心脏细胞中施用至少一个总剂量的rAAV载体，所述载体包含：(i)编码抑制磷酸酶活性的磷酸酶抑制剂蛋白的核酸序列，(ii)合成启动子，所述合成启动子可操作地连接至磷酸酶抑制剂(I-1)蛋白。
本文所述技术的另一个方面涉及治疗患有心血管病症或心脏疾病的患者的方法，包括：向患者的心脏细胞中施用至少一个总剂量的rAAV载体，所述rAAV载体包含可操作地连接至选自表2A的心脏特异性启动子或其变体、或选自表5A的在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子或其变体的治疗性核酸，其中所述治疗性核酸是RNA或DNA，并且其中所述治疗性核酸表达选自表18A或表18B的治疗性蛋白。
本文所述技术的另一个方面涉及治疗患有充血性心力衰竭的患者的方法，包括：向患者施用至少一个剂量的rAAV载体，其中所述rAAV载体是AAV2i8，并且包含编码磷酸酶抑制剂(I-1)的核酸，所述核酸可操作地连接至选自以下的启动子：CMV启动子、选自表2A的心脏特异性启动子或其变体、或者选自表5A的在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子或其变体。
在本文所公开的方法和组合物的所有方面，在一些实施方式中，rAAV载体包含编码多肽的核酸序列，所述多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸1-65，其中在SEQ ID NO:1的第35位的苏氨酸被替换为天冬氨酸(T35D)。在一些实施方式中，所述核酸序列是选自SEQ IDNO：385-412中的任何一个的密码子优化的核酸序列。
还提供了包含SEQ ID NO：385-412中的任何一个的核酸序列的封闭的线性DNA构建体。所述封闭的线性DNA可在制造缺少细菌DNA序列的rAAV的方法中使用。因此，本文还提供了用于治疗心力衰竭的药物组合物，其包含编码组成型活化的I-1c的rAAV，其中rAAV组合物缺少细菌核酸序列。
在本文所公开的方法和组合物的所有方面，在一些实施方式中，rAAV载体进一步包含CMV启动子或合成启动子，其可操作地连接至磷酸酶抑制剂蛋白。在一些实施方式中，合成启动子是选自表2A的心脏特异性启动子或其变体，或选自表5A的在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子或其变体。在一些实施方式中，所述合成启动子引起治疗性核酸或磷酸酶抑制剂蛋白优先在平滑肌细胞中表达。在一些实施方式中，所述合成启动子引起治疗性核酸或磷酸酶抑制剂蛋白优先在心脏细胞中表达。在一些实施方式中，由心脏或肌肉特异性启动子引起的治疗性核酸或磷酸酶抑制剂蛋白的表达等于或高于由CMV启动子引起的表达。
在本文所公开的方法和组合物的所有方面，在一些实施方式中，所述总剂量在约20分钟至约30分钟的时间段内施用。在一些实施方式中，所述总剂量以子剂量进行，其中每个子剂量在1-5分钟的时间段内施用，例如，总剂量的施用以五个子剂量进行，每个子剂量在1-5分钟的时间段内施用，其中，例如，五个子剂量在约20分钟至约30分钟的时间段内施用。
在本文所公开的方法和组合物的所有方面，在一些实施方式中，所述rAAV选自于由AAV2、AAV6、AAV8、AAV9、AAV2i8、rh10、AAV2.5和AAV2G9所组成的组。在一些实施方式中，所述rAAV是AAV2i8或AAV9。在一些实施方式中，所述rAAV选自表11中公开的任何AAV血清型。
在本文所公开的方法和组合物的所有方面，在一些实施方式中，所述rAAV的至少一个总剂量为1013vg、3×1013vg、1014vg、3×1014vg或1015vg。在一些实施方式中，所述rAAV的至少一个总剂量选自约1013vg至约1015vg的剂量范围。
在本文所公开的方法和组合物的所有方面，在一些实施方式中，在施用所述rAAV剂量后至少约6个月，对患者血清中的NT-proBNP水平测量并且其低于900pg/mL。
在本文所公开的方法和组合物的所有方面，在一些实施方式中，所述方法进一步包括施用免疫调节剂。在一些实施方式中，所述施用进一步包括硝普盐(nitroprusside)或硝酸甘油。在本文所公开的方法和组合物的所有方面，所述施用是进入患者心脏的冠状动脉的腔内或全身施用。
本文还提供了SEQ ID NO：357-384中任何一个的封闭末端的线性双链体DNA(在本申请中也被称为封闭的线性DNA)，其用于产生本发明的rAAV。
在本文所公开的方法和组合物的所有方面，所述方法用于治疗心力衰竭，包括充血性心力衰竭(CHF)，其中HF或CHF选自以下的任何一项：左心室重构、外周动脉闭塞性疾病(PAOD)、扩张型心肌病(DCM)(包括特发性扩张型心肌病(IDCM))、冠状动脉疾病、缺血、心律不齐(arrhythmia)、心肌梗塞(MI)、心脏收缩力异常、急性(失代偿性)心力衰竭(AHF)、Ca2+代谢异常、心肌缺血、动脉粥样硬化、心肌病、特发性心肌病、心律失常(cardiacarrhythmia)、肌营养不良症、肌肉质量异常、肌肉退化、感染性心肌炎、药物或毒素诱发的肌肉异常、过敏性心肌炎、自身免疫性心内膜炎和先天性心脏疾病以及肺心病高血压(pulmonary heart hypertension)。
在本文所公开的方法和组合物的所有方面，所述方法用于治疗心肌病。
在本文所公开的方法和组合物的所有方面，所述方法用于治疗非缺血性心肌病、或非缺血性心力衰竭。
在本文所公开的方法和组合物的所有方面，所述方法用于治疗缺血性心肌病、或非缺血性心力衰竭。
本文所述技术的一个方面涉及治疗患有心力衰竭的患者的方法，包括：(i)向具有充血性心力衰竭(CHF)分类的患者的心脏细胞中施用至少一个总剂量的rAAV载体，该载体包含编码抑制磷酸酶活性的磷酸酶抑制剂(I-1)蛋白的核酸序列，其中所述rAAV的至少一个剂量选自约1013vg至约1015vg的总剂量范围，并且其中，施用后至少十二个月，充血性心力衰竭的分类有改善。
在本文所公开的方法的所有方面，心力衰竭的分类基于以下所使用的分类系统：美国心脏协会(AHA)、美国心脏病学会(ACC)、明尼苏达心力衰竭生活质量问卷(MLHFQ)、堪萨斯城心肌病问卷(KCCQ)、或2016欧洲心脏病学会指南(ESCG)、日本心力衰竭学会(JHFS)指南、日本循环学会(JCS)指南、或纽约心脏协会(NYHA)，或其同等的分类系统。在一些实施方式中，在施用rAAV后12个月，分类具有至少一个等级、或至少两个等级的改善。在一些实施方式中，在施用rAAV后6个月内，分类具有至少一个等级、或两个等级的改善。
在本文所公开的方法的所有方面，心力衰竭的分类是NYHA，并且分类的等级选自于由以下所组成的组：I级、II级、III级和IV级。在一些实施方式中，分类系统是美国心脏病学会/美国心脏协会(ACC/AHA)的补充分期系统，并且分类的等级选自于由以下所组成的组：A期、B期、C期、D期。在一些实施方式中，分类系统是KCCQ，并且分类的等级是KQQC总体汇总得分范围，其选自于由以下所组成的组：KCCQ一般到优秀的分数为50到100，非常差到一般的分数为0到49，良好到优秀的分数为75到100，并且非常差到良好的分数为0到74。
本文所述技术的另一个方面涉及治疗患有心肌病的患者的方法，包括向患者的心脏细胞中施用至少一个总剂量的rAAV载体，该载体包含编码抑制磷酸酶活性的磷酸酶抑制剂(I-1)蛋白的核酸序列，其中所述rAAV的至少一个剂量选自约1013vg至约1015vg的总剂量范围，并且其中，在施用后至少12个月，在患者中至少一个参数比基线水平有改善，其中所述至少一个参数选自基本上由以下组成的组：(i)射血分数(EF)，(ii)收缩末期容积(ESV)，(iii)心脏收缩力，选自射血分数(EF)和短轴缩短率(FS)；(iv)心脏容积，选自舒张末期容积(DV)和收缩末期容积(ESV)中的任一项，(v)功能性标准，选自6分钟步行测试(6MWT)、锻炼和VO2max中的任一项；(vi)BNP水平、Pro-BNP水平，(vii)生物标志物水平，其中所述生物标志物水平选自肌钙蛋白、血清肌酐、胱抑素C或肝脏转氨酶的组，(viii)患者报告的结果(PRO)，例如减少的症状、健康相关的生活质量(HRQOL)或患者感知的健康状况，以及(ix)因心力衰竭导致的死亡风险、减少的因心力衰竭症状导致的住院治疗、或用于治疗心力衰竭的治疗性干预中的任一项的减少。
在本文所公开的方法的所有方面，在施用后至少12个月，具有至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个参数的改善。在一些实施方式中，在施用后至少6个月，具有至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个参数的改善。在一些实施方式中，所述改善选自以下任何一项：(a)射血分数比基线增加至少5％以上，(b)收缩末期容积比基线减少至少10％、或减少至少20mL，(c)6分钟步行测试比基线增加至少50米，(d)血液中的BNP水平(pg/mL)比基线减少至少40％，(e)血液中的pro-BNP水平(pg/mL)比基线减少至少35％，(f)相比于同一生物标志物的基线水平，选自以下的生物标志物减少至少10％：肌钙蛋白、血清肌酐、胱抑素C或肝脏转氨酶，(g)心肌耗氧量(MVO2)比基线增加至少1.5mL/kg/min，或者，(h)由于HF症状改善而出院，或者由于受试者中的改善的HF症状而减少的干预，所述减少的干预选自以下任何一种的使用减少：正性肌力药(inotropes)、血管扩张剂、利尿剂。
在本文所公开的方法和组合物的所有方面，所述rAAV载体进一步包含CMV启动子或合成启动子，其可操作地连接至磷酸酶抑制剂蛋白。在本文所公开的方法和组合物的所有方面，按以下的施用方法中的任何一种施用总剂量的rAAV：(a)在约20分钟至约30分钟的时间段内，(b)以一系列子剂量施用，其中每个子剂量在约1分钟至约5分钟的时间段内施用，或(c)以一系列五个子剂量施用，每个子剂量在约1分钟至约5分钟的时间段内施用，并且其中所述五个子剂量在约20分钟至约30分钟的时间段内施用。
在本文所公开的方法和组合物的所有方面，所述rAAV载体包含非靶向肝脏的衣壳——即所述rAAV优先靶向肝脏以外的组织。在本文所述的所有方面的一些实施方式中，所述rAAV可以优先靶向肌肉细胞，包括但不限于心肌和心肌细胞。在本文所公开的方法和组合物的所有方面，所述rAAV选自于由以下所组成的组：AAV1、AAV2、AAV6、AAV8、AAV9、AAV2i8、rh10、AAV2.5和AAV2G9，或选自表11的任何rAAV。在一些实施方式中，所述rAAV载体是AAV2i8。
在本文所公开的方法和组合物的所有方面，以1013vg、3×1013vg、1014vg、3×1014vg、或1015vg的至少一个总剂量的rAAV施用所述rAAV载体。
在本文所公开的用于治疗心肌病的方法和组合物的所有方面中，所述rAAV载体编码选自表18A或表18B中所列的任何蛋白质中的蛋白质。在本文所公开的用于治疗心肌病的方法和组合物的所有方面，所述rAAV载体包含编码磷酸酶抑制剂(I-1)蛋白的核酸序列，例如组成型活化的蛋白(I-1c)。在本文所公开的方法和组合物的所有方面，I-1c选自以下的任何一种：(a)包含至少SEQ ID NO：1的氨基酸残基1-54的多肽，其中SEQ ID NO：1在C端第70、67、66、65或61或54位氨基酸处截短，并且其中在第35位有天冬氨酸(T35D)，(b)包含SEQID NO：1的氨基酸1-54或其功能片段的多肽，其中所述功能片段与SEQ ID NO：1的氨基酸残基1-54具有至少85％的序列同一性，或在C端第70、67、66、65或61或54位氨基酸处截短，并且其中在第35位有天冬氨酸(T35D)，或(c)选自以下任何一项的多肽：SEQ ID NO：507或527-532或其功能等同物，所述功能等同物与SEQ ID NO：507或527-532中任何一个的氨基酸残基具有至少85％的序列同一性。
在本文所公开的方法和组合物的所有方面，所述rAAV基因组包含选自于由SEQ IDNO：413-441所组成的组中的核酸序列。在一些实施方式中，所述编码I-1多肽的核酸序列选自：(a)编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65的多肽的核酸序列，其中在SEQ ID NO：1第35位处的苏氨酸(T)被替换成非T的氨基酸，(b)编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65的多肽的核酸序列，其中在SEQ ID NO：1第35位处的苏氨酸(T)被选自天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)中的任一氨基酸取代，或(c)编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65的多肽的核酸序列，其中在SEQ ID NO：1第35位处的苏氨酸(T)被天冬氨酸(D)或天冬氨酸的保守氨基酸取代。
在本文所公开的方法和组合物的所有方面，编码I-1蛋白的核酸序列是经密码子优化的核酸序列，例如但不限于，编码I-1蛋白的核酸序列选自SEQ ID NO：385-412中的任何一个、或与SEQ ID NO：385-412具有至少80％序列同一性的核酸序列。
在本文所述技术的所有方面，本文所公开的方法和组合物可用于治疗患有心肌病的受试者，其中所述患有心肌病的受试者患有非缺血性心力衰竭和/或非缺血性心肌病，包括但不限于获得性心肌病、因感染或毒素等而获得的心肌病，或先天性心肌病或具有心脏表现的遗传性疾患。在一些实施方式中，患有先天性心肌病或具有心脏表现的遗传性疾患的受试者具有选自于由以下所组成的组中的疾病或疾患：致心律失常性右心室心肌病、家族性心房粘液瘤、原发孔型房间隔缺损、静脉窦型房间隔缺损、巴氏综合征、肌营养不良症、Buerger病、心脑肌病(Cardioencephalomyopathy)、染色体1p36缺失综合征、先天性全身脂质营养不良4型、先天性心脏传导阻滞、扩张型心肌病、杜氏肌营养不良症(DMD)、Fabry病、家族性心房颤动、家族性扩张型心肌病、家族性肥厚型心肌病、家族性进行性心脏传导缺陷、家族性胸主动脉瘤和主动脉夹层、纤维肌发育不良、Friedreich共济失调、戈谢病(Gaucher disease)、糖原贮积病(2、3或4型)、His束性心动过速、Hurler综合征、左心发育不良综合征、婴儿组织细胞样心肌病、颅内动静脉畸形、异丁酰-辅酶A脱氢酶缺乏症、激肽释放酶高血压、川崎病、Kearns-Sayre综合征、左心室致密化不全、肢带型肌营养不良症(1B、2E、2F、2M、2C、2D型)、局限性系统性硬化症、长QT综合征1、淋巴水肿和脑动静脉异常(cerebral arteriovenous anomaly)、淋巴细胞性血管炎、小头症-心肌病(Microcephaly-cardiomyopathy)、线粒体脑肌病乳酸酸中毒和卒中样发作、线粒体三功能蛋白缺乏症、强直性肌营养不良症1型、新生儿卒中，Noonan综合征1-、2-、3-、4-、5-和6，围产期心肌病、Peters plus综合征、PGM1-CDG、PHACE综合征、受磷蛋白Arg 14缺失(Phospholamban Arg14Deletion)、体位性心动过速综合征、原发性肉碱缺乏症、进行性家族性心脏传导阻滞(1A、1B和2型)、假性醛固酮减少症2型、肺动脉高压、肺动脉闭锁伴完整室间隔、肺动脉闭锁伴室间隔缺损、肺动脉瓣狭窄、肺静脉狭窄、肺动脉狭窄、肾功能缺乏性高血压(Renoprivalhypertension)、视网膜动脉大动脉瘤伴肺动脉瓣上狭窄、右心室发育不全、结节病、Sengers综合征、内脏反位(Situs inversus)、突发性心律失常死亡综合征、主动脉瓣上狭窄、Swyer综合征、TANGO2相关代谢性脑病和心律不齐、TARP综合征、法洛四联症(Tetralogyof Fallot)、Timothy综合征、三尖瓣闭锁、Vici综合征、VLCAD缺乏症和Williams综合征。
在本文所述技术的所有方面，本文所公开的方法和组合物可用于治疗患有心肌病的受试者，其中，所述患有心肌病的受试者患有缺血性心肌病。
在本文所述技术的所有方面，本文所公开的方法和组合物可用于治疗患有心肌病的受试者，其中，所述患有心肌病的受试者患有心力衰竭。在这样的实施方式中，所述患有心力衰竭的受试者的分类相当于纽约心脏协会(NYHA)分类系统中的III级以上。在一些实施方式中，所述患有心力衰竭的受试者患有心血管疾病或心脏疾病，该疾病选自以下的任何一种：充血性心力衰竭(CHF)、左心室重构、外周动脉闭塞性疾病(PAOD)、扩张型心肌病(DCM)(包括特发性扩张型心肌病(IDCM))、冠状动脉疾病、缺血、心律不齐、心肌梗塞(MI)、心脏收缩力异常、急性(失代偿性)心力衰竭(AHF)、Ca2+代谢异常、心肌缺血、动脉粥样硬化、心肌病、特发性心肌病、遗传性疾患诱发的心肌病、心律失常、肌营养不良症、肌肉质量异常、肌肉退化、感染性心肌炎、药物或毒素诱发的肌肉异常、过敏性心肌炎、自身免疫性心内膜炎和先天性心脏疾病和肺心病高血压。
在本文所述技术的所有方面，本文所公开的方法和组合物可用于治疗患有心肌病的受试者，其中患有心肌病的受试者具有降低的射血分数(rEF或HFrEF)或者保留的射血分数(HFpEF)。
在一些实施方式中，在治疗患有心肌病的受试者并且其中受试者患有心力衰竭的方法中，在施用rAAV后至少12个月，心力衰竭的分类比基线水平改善至少一个等级，其中心力衰竭的分类通过以下的至少一个来评价：(a)美国心脏协会(AHA)、美国心脏病学会(ACC)、2016欧洲心脏病学会指南(ESCG)、日本心力衰竭学会(JHFS)指南、日本循环学会(JCS)指南或纽约心脏协会(NYHA)所使用的分类系统或其等同物；或(b)选自于由以下的任一者所组成的组中的健康相关生活质量(HRQL)问卷：明尼苏达心力衰竭生活质量问卷(MLHFQ)、或堪萨斯城心肌病问卷(KCCQ)、慢性心力衰竭问卷(Chronic Heart FailureQuestionnaire，CHFQ)、重度心力衰竭生活质量问卷(Quality of Life Questionnairefor Severe Heart Failure，QLQ-SHF)、左心室功能障碍(LVD-36)问卷、和左心室疾病问卷(LVDQ)。
在本文所公开的方法的所有方面，HF分类的改善是指在施用后至少12个月内至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个参数的改善。在一些实施方式中，在施用后至少6个月，有至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个参数的改善。在一些实施方式中，在施用rAAV后6个月内，有至少一个等级、或至少两个等级的分类改善。在一些实施方式中，比起基线水平，在生活质量MLWHFQ或KCCQ中具有减少至少10分的改善。
在本文所公开的方法和组合物的所有方面，在施用所述至少一个总剂量的rAAV载体的同时、和/或之前、和/或之后向受试者施用血管扩张剂。在本文所公开的方法和组合物的所有方面，在施用所述至少一个总剂量的rAAV载体的同时、或之前、或之后向受试者施用免疫调节剂。
本文所述技术的另一个方面涉及药物组合物，其包含AAV载体，所述载体包含选自SEQ ID NO：385-412中任何一个的经密码子优化的I-Ic核酸序列，或与SEQ ID NO：385-412具有至少80％序列同一性的核酸序列。在一些实施方式中，经密码子优化的核酸序列可操作地连接至CMV启动子或合成启动子，例如选自表2A中任何一个的心脏特异性启动子、或在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子(例如，选自表5A或表13A的启动子)、或其变体。在一些实施方式中，所述药物组合物包含选自于由以下所组成的组中的核酸序列：SEQ IDNO：41-42，或与SEQ ID NO：385-412具有至少80％序列同一性的核酸序列。在一些实施方式中，所述药物组合物可用于治疗患有心肌病(包括非缺血性心肌病或缺血性心肌病)的受试者的方法中，如本文所公开的那样。在一些实施方式中，所述药物组合物可用于治疗患有本文所公开的心力衰竭的受试者的方法中。
本文所述技术的另一个方面涉及腺相关病毒(AAV)载体，其包含编码磷酸酶抑制剂(I-1)多肽的核酸序列，该核酸序列可操作地连接至选自以下任何一种的启动子：(a)选自表2A的心脏特异性启动子或其变体，或(b)在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子、或其变体，或(c)当存在心脏组织特异性增强子时的任何启动子。在AAV载体的一些实施方式中，在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子选自表5A或表13A或其变体。
在本文所公开的用于治疗患有心肌病和/或心力衰竭的受试者的rAAV组合物和方法的所有方面，所述AAV选自于由以下所组成的组：腺相关病毒-1(AAV1)、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAV2i8。在一些实施方式中，所述AAV包含非靶向肝脏的衣壳——即该衣壳将所述rAAV靶向至体内的肝脏以外的组织。在一些实施方式中，所述rAAV载体是AAV2i8。
在本文所公开的rAAV组合物和方法的所有方面，所述磷酸酶抑制剂(I-1)多肽是组成型活化的蛋白(I-1c)，例如，其中，所述I-1c选自以下的任何一种：(a)包含至少SEQ IDNO：1的氨基酸残基1-65的多肽或其功能等同物；(b)包含至少SEQ ID NO：1的氨基酸1-54的多肽，其中所述多肽在C端选自残基70、67、66、65或61或54的氨基酸处截短，并且在第35位有天冬氨酸(T35D)，(c)包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65的多肽或其功能等同物，其与SEQID NO：1的氨基酸残基1-65具有至少85％的序列同一性，或者(d)选自以下任何一种的多肽：SEQ ID NO：507或527-532或其功能等同物，所述功能等同物与SEQ ID NO：507或527-532中任何一个的氨基酸残基具有至少85％的序列同一性。在本文所公开的所有方面的一些实施方式中，所述AAV载体包含编码I-1多肽的核酸序列，该核酸序列选自：(a)编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65的多肽的核酸序列，其中，在SEQ ID NO：1第35位的苏氨酸(T)被替换成非T的氨基酸，(b)编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65的多肽的核酸序列，其中，在SEQ ID NO：1第35位的苏氨酸(T)被选自天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)中的任一氨基酸替换，(c)编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65的多肽的核酸序列，其中，在SEQ ID NO：1第35位的苏氨酸(T)被替换为天冬氨酸(D)、或天冬氨酸的保守氨基酸。
在本文所公开的所有方面的一些实施方式中，rAAV编码选自以下的I-1c多肽：SEQID NO：1的氨基酸1-54、SEQ ID NO：1的氨基酸1-61、SEQ ID NO：1的氨基酸1-65、SEQ IDNO：1的氨基酸1-66、SEQ ID NO：1的氨基酸1-67或SEQ ID NO：2的氨基酸1-77、或其功能变体，其中在SEQ ID NO：1第35位的苏氨酸被天冬氨酸(T35D)或天冬氨酸的保守氨基酸替换。
在本文所公开的所有方面的一些实施方式中，编码I-1多肽的核酸序列是经密码子优化的核酸序列，例如，与SEQ ID NO：1的野生型参考序列或其片段相比，经密码子优化的核酸序列具有减少的CpG含量或减少的CpG岛。在本文所公开的所有方面的一些实施方式中，编码I-1多肽的核酸序列是选自以下的任何一种的经密码子优化的核酸序列：SEQ IDNO：385-412，或与SEQ ID NO：385-412具有至少80％、或至少85％、或至少90％或至少95％或至少98％序列同一性的核酸序列。
在本文所公开的所有方面的一些实施方式中，rAAV载体可以包含位于编码磷酸酶抑制剂(I-1)多肽的核酸序列的5’的至少一个ITR，该ITR可操作地连接至心脏特异性启动子或肌肉特异性启动子。在本文所公开的所有方面的一些实施方式中，rAAV载体可以包含侧接于编码磷酸酶抑制剂(I-1)多肽的核酸序列的至少两个ITR，该ITR可操作地连接至心脏特异性启动子或肌肉特异性启动子。可以使用本领域普通技术人员已知的任何ITR序列，并且包括但不限于选自以下的任何一个或多个的ITR序列：SEQ ID NO：70-78，或与SEQ IDNO：70-78具有至少85％、或至少90％或至少95％或至少98％序列同一性的核酸序列。
在本文所公开的组合物和方法的所有方面的一些实施方式中，AAV载体包含反向poly A序列或双链RNA终止元件，其中反向polyA序列或双链终止元件位于编码磷酸酶抑制剂(I-1)多肽的核酸序列的3’。在一些实施方式中，反向poly A序列或双链RNA终止元件位于编码磷酸酶抑制剂(I-1)多肽的核酸序列的3’和右侧ITR的5’之间。在本文所公开的组合物和方法的所有方面的一些实施方式中，AAV载体进一步包含选自以下任一种的polyA序列：SV40 polyA(SEQ ID NO：334)、HGH poly A(SEQ ID NO：66)、SEQ ID NO：284-287、SEQID NO：331-335，或与SEQ ID NO：334、66、284-287或331-335具有至少85％、或至少90％、或至少95％或至少98％序列同一性的核酸序列，其中，所述polyA序列位于编码磷酸酶抑制剂(I-1)多肽的核酸序列的3’。
在本文所公开的组合物和方法的所有方面的一些实施方式中，所述AAV载体可以进一步包含编码至少一种免疫调节剂和/或血管扩张剂的核酸序列，如本文所公开的那样。在本文所公开的组合物和方法的所有方面的一些实施方式中，rAAV载体可以存在于组合物或溶液中，其中该溶液进一步包含免疫调节剂。在本文所公开的组合物和方法的所有方面的一些实施方式中，rAAV载体可以存在于组合物或溶液中，其中该溶液进一步包含血管扩张剂。
本文所述技术的另一个方面涉及药物组合物，该组合物包含：(i)腺相关病毒(AAV)载体，该载体包含编码磷酸酶抑制剂(I-1)多肽的核酸序列，该核酸序列可操作地连接至以下任何一个：(a)选自表2A的心脏特异性启动子或其变体，(b)在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子，或(c)当存在心脏组织特异性增强子时的任何启动子、或其变体；以及药学上可接受的运载体(carrier)。在本文所公开的组合物和方法的所有方面的一些实施方式中，在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子选自表5A或表13A或其变体，例如，包含与表5A或表13A中所列启动子具有至少85％、或至少90％或至少95％或至少98％序列同一性的核酸序列的变体。
在本文所公开的组合物和方法的所有方面的一些实施方式中，所述AAV选自于由以下所组成的组：腺相关病毒-1(AAV1)、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAV2i8。在本文所公开的组合物和方法的所有方面的一些实施方式中，所述AAV包含如本文所公开的非靶向肝脏的衣壳。在本文所公开的组合物和方法的所有方面的一些实施方式中，所述AAV是AAV2i8。在一些实施方式中，所述药物组合物包含AAV，所述AAV包含选自于由以下所组成的组中的核酸：SEQ ID NO：413-440，或与选自SEQ ID NO：413-440的序列具有至少80％、或至少85％、或至少90％或至少95％或至少98％序列同一性的核酸序列，其中，以SEQ ID NO：413-440示出的核酸包含SEQ ID NO：330的CMV启动子，其中，所述SEQ ID NO：330的CMV启动子被以下的任一种取代：(a)选自表2A的心脏特异性启动子或其变体(例如，包含与表2A中所列启动子具有至少85％、或至少90％、或至少95％或至少98％序列同一性的核酸序列的变体)，(b)在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子，或(c)当存在心脏组织特异性增强子时的任何启动子、或其变体，其中，在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子选自表5A或表13A或其变体，例如包含与表5A或表13A中所列启动子具有至少85％、或至少90％、或至少95％或至少98％序列同一性的核酸序列的变体。
在一些实施方式中，所述药物组合物包含血管扩张剂。在一些实施方式中，所述药物组合物包含免疫调节剂。
在本文所公开的所有方面的一些实施方式中，所述药物组合物包含AAV载体，所述AAV载体包含编码I-1多肽的核酸序列，该核酸序列选自：(a)编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65的多肽的核酸序列，其中SEQ ID NO：1第35位的苏氨酸(T)被替换为非T的氨基酸，(b)编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65的多肽的核酸序列，其中SEQ ID NO：1第35位的苏氨酸(T)被选自天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)中的任一氨基酸替换，(c)编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65的多肽的核酸序列，其中SEQ ID NO：1第35位的苏氨酸(T)被天冬氨酸(D)或天冬氨酸的保守氨基酸替换。
在本文所公开的所有方面的一些实施方式中，所述药物组合物包含rAAV，其编码选自以下的I-1c多肽：SEQ ID NO：1的氨基酸1-54、SEQ ID NO：1的氨基酸1-61、SEQ ID NO：1的氨基酸1-65、SEQ ID NO：1的氨基酸1-66、SEQ ID NO：1的氨基酸1-67或SEQ ID NO：2的氨基酸1-77，或其功能变体，其中SEQ ID NO：1第35位的苏氨酸被天冬氨酸替换(T35D)、或被天冬氨酸的保守氨基酸替换。
在本文所公开的所有方面的一些实施方式中，所述药物组合物包含编码I-1多肽的核酸序列，所述核酸序列是密码子优化的核酸序列，例如，其中，所述密码子优化的核酸序列与SEQ ID NO：1的野生型参考序列或其片段相比，具有减少的CpG含量或减少的CpG岛。在本文所公开的所有方面的一些实施方式中，所述编码I-1多肽的核酸序列是选自以下任何一种的密码子优化的核酸序列：SEQ ID NO：385-412或与SEQ ID NO：385-412具有至少80％、或至少85％、或至少90％或至少95％或至少98％序列同一性的核酸序列。
本文所述技术的另一个方面涉及如本文所公开的AAV载体的用途，用于制造治疗患有心肌病的受试者的药物组合物。在本文所公开的组合物和方法的所有方面的一些实施方式中，待治疗的患有心肌病的受试者患有非缺血性心力衰竭和/或非缺血性心肌病。在如本文所公开的组合物和方法的所有方面的一些实施方式中，所述患有心肌病的受试者患有先天性心肌病或具有心脏表现的遗传性疾患，例如，如本文所公开的具有心脏表现的遗传性疾患，其包括但不限于选自于由以下所组成的组中的疾病或疾患：致心律失常性右心室心肌病、家族性心房粘液瘤、原发孔型房间隔缺损、静脉窦型房间隔缺损、巴氏综合征、肌营养不良症、Buerger病、心脑肌病、染色体1p36缺失综合征、先天性全身脂质营养不良4型、先天性心脏传导阻滞、扩张型心肌病、杜氏营养不良症(DMD)、Fabry病、家族性心房颤动、家族性扩张型心肌病、家族性肥厚型心肌病、家族性进行性心脏传导缺陷、家族性胸主动脉瘤和主动脉夹层、纤维肌发育不良、Friedreich共济失调、戈谢病、糖原贮积病(2、3或4型)、His束性心动过速、Hurler综合征、左心发育不良综合征、婴儿组织细胞样心肌病、颅内动静脉畸形、异丁酰-辅酶A脱氢酶缺乏症、激肽释放酶高血压、川崎病、Kearns-Sayre综合征、左心室致密化不全、肢带型肌营养不良症(1B、2E、2F、2M、2C、2D型)、局限性系统性硬化症、长QT综合征1、淋巴水肿和脑动静脉异常、淋巴细胞性血管炎、小头症-心肌病、线粒体脑肌病乳酸酸中毒和卒中样发作、线粒体三功能蛋白缺乏症、强直性肌营养不良症1型、新生儿卒中，Noonan综合征1-、2-、3-、4-、5-和6，围产期心肌病、Peters plus综合征、PGM1-CDG、PHACE综合征、受磷蛋白Arg 14缺失、体位性心动过速综合征、原发性肉碱缺乏症、进行性家族性心脏传导阻滞(1A、1B和2型)、假性醛固酮减少症2型、肺动脉高压、肺动脉闭锁伴完整室间隔、肺动脉闭锁伴室间隔缺损、肺动脉瓣狭窄、肺静脉狭窄、肺动脉狭窄、肾功能缺乏性高血压、视网膜动脉大动脉瘤伴肺动脉瓣上狭窄、右心室发育不全、结节病、Sengers综合征、内脏反位、突发性心律失常死亡综合征、主动脉瓣上狭窄、Swyer综合征、TANGO2相关代谢性脑病和心律不齐、TARP综合征、法洛四联症、Timothy综合征、三尖瓣闭锁、Vici综合征、VLCAD缺乏症和Williams综合征。
在本文所公开的组合物和方法的所有方面的一些实施方式中，本文所公开的rAAV可用于治疗患有缺血性心肌病的心肌病受试者。在本文所公开的组合物和方法的所有方面的一些实施方式中，本文所公开的rAAV可用于治疗患有心力衰竭的心肌病受试者，例如，其中，患有心力衰竭的受试者具有基于以下所使用的分类系统的心力衰竭分类：美国心脏协会(AHA)、美国心脏病学会(ACC)或纽约心脏协会(NYHA)，或其等同的分类。在本文所公开的组合物和方法的所有方面的一些实施方式中，本文所公开的rAAV可用于治疗患有心力衰竭的受试者，例如，其中，所述患有心力衰竭的受试者在纽约心脏协会(NYHA)分类系统中的分级为III级或高于III级。
本文所述技术的另一个方面涉及本文所公开的AAV载体的用途，用于制造药物组合物，以治疗患有与心力衰竭关联的病症或疾病的受试者。在一些实施方式中，所述受试者具有充血性心力衰竭(CHF)或心力衰竭(HF)的分类，例如但不限于基于以下所使用的分类系统的分类：美国心脏协会(AHA)、美国心脏病学会(ACC)或纽约心脏协会(NYHA)，或本文所公开的等同的分类系统。在一些实施方式中，受试者患有非缺血性心力衰竭或非缺血性心肌病。在一些实施方式中，受试者患有缺血性心力衰竭或缺血性心肌病。在本文所公开的组合物和方法的所有方面的一些实施方式中，根据本文所公开的方法和组合物受到治疗的受试者具有降低的射血分数(rEF或HFrEF)。
本文所述技术的另一个方面涉及包含如本文所公开的AAV载体的细胞。在一些实施方式中，该细胞是心脏细胞或肌肉细胞，并且在一些实施方式中，该细胞处于细胞培养物中(即在体外)，并且在一些实施方式中，该细胞存在于受试者中(例如，在体内)。
本文所述技术的另一个方面涉及如本文所公开的AAV载体的用途，或如本文所公开的药物制剂，或如本文所公开的细胞，用于治疗患有心肌病的受试者。
在如本文所公开的组合物和方法的所有方面的一些实施方式中，本文所公开的rAAV载体(例如，表达调节磷酸酶活性、例如1型磷酸酶活性的药剂)的递送物是非有丝分裂的细胞(例如，心肌细胞)。因此，在至少1个剂量之后，转基因的表达可以在细胞的生命中持续存在。
本文所述技术的另一个方面涉及如本文所公开的AAV载体、或如本文所公开的药物制剂、或如本文所公开的细胞用于治疗患有心力衰竭的患者的用途。在本文所公开的组合物和方法的所有方面的一些实施方式中，将根据本文所公开的方法使用的AAV载体施用至具有充血性心力衰竭(CHF)分类的受试者，例如，其中，该分类基于以下所使用的分类系统：美国心脏协会(AHA)、美国心脏病学会(ACC)或纽约心脏协会(NYHA)，或其等同的分类系统。
在本文所公开的组合物和方法的所有方面的一些实施方式中，受试者患有非缺血性心力衰竭或非缺血性心肌病。在本文所公开的组合物和方法的所有方面的一些实施方式中，受试者患有缺血性心力衰竭或缺血性心肌病。在本文所公开的组合物和方法的所有方面的一些实施方式中，受试者具有降低的射血分数(rEF或HFrEF)。在本文所公开的组合物和方法的所有方面的一些实施方式中，患有心力衰竭的受试者具有心血管疾病或心脏疾病，该疾病选自以下的任何一种：充血性心力衰竭(CHF)、左心室重构、外周动脉闭塞性疾病(PAOD)、扩张型心肌病(DCM)(包括特发性扩张型心肌病(IDCM))、冠状动脉疾病、缺血、心律不齐、心肌梗塞(MI)、心脏收缩力异常、急性(失代偿性)心力衰竭(AHF)、Ca2+代谢异常、心肌缺血、动脉粥样硬化、心肌病、特发性心肌病、遗传性疾患诱发的心肌病、心律失常、肌营养不良症、肌肉质量异常、肌肉退化、感染性心肌炎、药物或毒素诱发的肌肉异常、过敏性心肌炎、自身免疫性心内膜炎和先天性心脏疾病以及肺心病高血压。在本文所公开的组合物和方法的所有方面的一些实施方式中，患有心力衰竭的受试者具有以下的任何一项：缺血、心律不齐、心肌梗塞、心脏收缩力异常或Ca2+代谢异常。
在本文所公开的组合物和方法的所有方面的一些实施方式中，受试者具有以下的一项或多项：(a)非缺血性心力衰竭；(b)非缺血性心肌病，(c)充血性心力衰竭(CHF)的分类，所述分类基于以下所使用的分类系统：美国心脏协会(AH)、美国心脏病学会(ACC)或纽约心脏协会(NYHA)或使用等同的分类系统的分类；或(d)降低的射血分数(rEF或HFrEF)。
本文所公开的技术的另一个方面涉及在患有心肌病的受试者中表达磷酸酶抑制剂(I-1)多肽的方法，所述方法包括根据本文公开的方法将至少一个剂量的AAV载体引入患有心肌病的受试者中，其中，所述患有心肌病的受试者具有心力衰竭的分类，并且其中，所述rAAV的至少一个剂量选自约1013vg至约1015vg的总剂量范围，并且其中在施用后至少12个月，所述心力衰竭的分类有改善。在一些实施方式中，所述心力衰竭的分类基于以下所使用的分类系统：美国心脏协会(AH)、美国心脏病学会(ACC)或纽约心脏协会(NYHA)，或等同的分类系统。在本文所公开的方法的所有方面的一些实施方式中，在施用rAAV后至少12个月，分类有至少一个等级、或至少两个等级的改善，或者在一些实施方式中，在施用rAAV后至少6个月，分类有至少一个等级、或至少两个等级的改善。在一些实施方式中，施用后至少12个月，在以下的任何一个或多个分类中具有至少1个或至少2个等级的改善：美国心脏协会(AH)、美国心脏病学会(ACC)、或纽约心脏协会(NYHA)分类系统，或等同的HF分类系统。
在本文所公开的方法的所有方面的一些实施方式中，将所述rAVV与免疫调节剂一起施用，其在施用至少一个剂量的rAAV载体的同时、或之前、或之后。在本文所公开的方法的所有方面的一些实施方式中，将所述rAVV与血管扩张剂一起施用，其在施用至少一个剂量的rAAV载体的同时、和/或之前、和/或之后。
在本文所公开的方法的所有方面的一些实施方式中，rAAV的施用是进入患者心脏的冠状动脉的腔内。在其中rAAV的施用是为了治疗患有缺血性心肌病的受试者的一些实施方式中，施用直接进入心脏的肌肉内，例如进入缺血性心脏肌肉或MI内。
在本文所公开的方法的所有方面的一些实施方式中，施用至少一个剂量的rAAV为约1013vg至约1015vg的总剂量范围，并且可以以一个剂量或2至5个子剂量施用。在本文所公开的方法的所有方面的一些实施方式中，总剂量以如下任何一种施用方法施用：(a)在约20分钟至约30分钟的时间段内，(b)以一系列子剂量施用，其中，每个子剂量在约1分钟至约5分钟的时间段内施用，和(c)以一系列的五个子剂量施用，每个子剂量在约1分钟至约5分钟的时间段内施用，并且其中，所述五个子剂量在约20分钟至约30分钟的时间段内施用。
本文所述技术的另一个方面涉及治疗患有心力衰竭的患者的方法，该方法包括：向患者的心脏细胞中施用至少一个总剂量的rAAV载体，该载体包含编码抑制磷酸酶活性的磷酸酶抑制剂蛋白的核酸序列，其中，至少一个总剂量的rAAV选自约1013vg至约1015vg的剂量范围，其中，所述总剂量在约20分钟至约30分钟的时间段内施用，其中，所述总剂量的施用以子剂量进行，其中，每个子剂量在1-5分钟的时间段内施用。在一些实施方式中，心力衰竭选自以下的任何一种或多种：缺血、心律不齐、心肌梗塞、心脏收缩力异常、或Ca2+代谢异常。
在一些实施方式中，所述rAAV载体进一步包含CMV启动子或合成启动子，其可操作地连接至磷酸酶抑制剂蛋白。在一些实施方式中，合成启动子是选自表2A的心脏特异性启动子或其变体，或选自表5A的在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子或其变体。在一些实施方式中，合成启动子使得治疗性核酸或磷酸酶抑制剂蛋白优先在平滑肌细胞中表达。在一些实施方式中，合成启动子使得治疗性核酸或磷酸酶抑制剂蛋白优先在心脏细胞中表达。在一些实施方式中，由心脏特异性启动子或肌肉特异性启动子引起的治疗性核酸或磷酸酶抑制剂蛋白的表达等同于或高于由CMV启动子引起的表达。
在一些实施方式中，在用于治疗患有心力衰竭的患者的方法中，所述rAAV选自于由以下所组成的组：AAV2、AAV6、AAV8、AAV9、AAV2i8、rh10、AAV2.5和AAV2G9。在一些实施方式中，所述rAAV是AAV2i8或AAV9。在一些实施方式中，所述rAAV选自表11中公开的任何AAV血清型。
在一些实施方式中，在用于治疗患有心力衰竭的患者的方法中，所述总剂量的施用以五个子剂量进行，每个子剂量在1-5分钟的时间段内施用。在一些实施方式中，所述五个子剂量在约20分钟至约30分钟的时间段内施用。
在一些实施方式中，在用于治疗患有心力衰竭的患者的方法中，所述rAAV的至少一个总剂量是1013vg、3×1013vg、1014vg、3×1014vg、或1015vg。在一些实施方式中，所述rAAV的至少一个子剂量是1013vg、3×1013vg、1014vg、3×1014vg或1015vg。在一些实施方式中，至少一个剂量是约1013vg至约1015vg的总剂量范围，以2至5个子剂量施用。在一些实施方式中，在用于治疗患有心力衰竭的患者的方法中，所述施用是进入患者心脏的冠状动脉的腔内。
在本文所公开的方法和组合物的所有方面，在一些实施方式中，所述磷酸酶抑制剂I-1包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65或其功能片段，其中，SEQ ID NO：1第35位的苏氨酸被替换为天冬氨酸(T35D)。在本文所公开的方法和组合物的所有方面，在一些实施方式中，编码磷酸酶抑制剂的核酸编码I-1的组成型活化片段(I-1c)，其包含SEQ ID NO：1的片段，其中，所述片段选自SEQ ID NO：1的氨基酸1-54、SEQ ID NO：1的氨基酸1-61、SEQ ID NO：1的氨基酸1-65、SEQ ID NO：1的氨基酸1-66、SEQ ID NO：1的氨基酸1-67或SEQ ID NO：1的氨基酸1-77、或其功能变体，其中，SEQ ID NO：1第35位的苏氨酸被天冬氨酸(T35D)替换。
本文所述技术的另一个方面涉及腺相关病毒(AAV)载体，该载体包含编码多肽的核酸序列，所述多肽包含至少SEQ ID NO：1的氨基酸1-54，其中，在SEQ ID NO：1第35位氨基酸处的苏氨酸被天冬氨酸替换，并且其中，所述核酸序列可操作地连接至选自以下的任何一种的启动子：CMV启动子，选自表2A的心脏特异性启动子或其变体，或选自表5A的在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子或其变体。在一些实施方式中，所述多肽选自SEQ IDNO：1的氨基酸1-54、SEQ ID NO：1的氨基酸1-61、SEQ ID NO：1的氨基酸1-65、SEQ ID NO：1的氨基酸1-66、SEQ ID NO：1的氨基酸1-67或SEQ ID NO：2的氨基酸1-77、或其功能变体，其中，SEQ ID NO：1第35位的苏氨酸被天冬氨酸(T35D)替换。在一些实施方式中，所述rAAV选自于由以下所组成的组：AAV2、AAV6、AAV8、AAV9、AAV2i8、rh10、AAV2.5和AAV2G9。在一些实施方式中，所述rAAV是AAV2i8或AAV9。在一些实施方式中，所述rAAV选自表11中公开的任何AAV血清型。
本文所述技术的另一个方面涉及包含以下的药物组合物：(i)腺相关病毒(AAV)载体，所述载体包含编码含有至少SEQ ID NO：1的氨基酸1-54的多肽的核酸序列，其中，在SEQID NO：1第35位氨基酸处的苏氨酸被替换为天冬氨酸(T35D)，并且其中，所述核酸序列可操作地连接至选自表2A的心脏特异性启动子或其变体、或选自表5A的在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子或其变体，和(ii)药学上可接受的运载体。
在一些实施方式中，药物组合物的rAAV载体包含编码选自以下的多肽的核酸序列：SEQ ID NO：1的氨基酸1-54、SEQ ID NO：1的氨基酸1-61、SEQ ID NO：1的氨基酸1-65、SEQ ID NO：1的氨基酸1-66、SEQ ID NO：1的氨基酸1-67、或SEQ ID NO：2的氨基酸1-77、或其功能变体，其中，SEQ ID NO：1第35位的苏氨酸被天冬氨酸替换(T35D)。在一些实施方式中，药物组合物中的rAAV选自于由以下所组成的组：AAV2、AAV6、AAV8、AAV9、AAV2i8、rh10、AAV2.5和AAV2G9。在一些实施方式中，rAAV是AAV2i8或AAV9。在一些实施方式中，rAAV选自表11中公开的任何AAV血清型。
在本文所公开的方法和组合物的所有方面，所述方法可以被实施多于一次。例如，可以在第一时间点向患者施用rAAV载体，并且例如在约3个月后、或约6个月后、或约12个月后、或约2年后、或约3年后，可以根据本文所公开的方法第二次向患者施用rAAV载体。在一些实施方式中，可以根据本文所公开的方法向受试者或患者多次施用rAAV载体，例如，根据本文所公开的方法施用至少2次、或至少3次、或至少4次、或至少5次或至少6次或超过6次。
将在下面描述本技术的所有其他方面。
附图说明
下面的详细描述(以举例的方式给出，但并不旨在将本发明限制在所描述的具体实施方式中)可以结合附图来理解，附图通过引用并入本文。现在将通过非限制性实例并参考附图来描述本发明的各种优选特征和实施方式，其中：
图1示出了与其他对照启动子(CBA和CK8b内含子)或盐水对照相比，来自肌肉特异性启动子SP0067的荧光素酶基因在心脏组织(心肌)中的体内表达。
图2示出了与其他对照启动子(CBA和CK8b内含子)或盐水对照相比，来自肌肉特异性启动子SP0067的荧光素酶基因在胫骨前(TA)肌中的体内表达。
图3示出了来自合成的心脏特异性启动子SP0067的荧光素酶基因在膈(diaph)、四头肌(Quad)、胫骨前肌(TA)、心脏、肠和肝脏中的体内表达。SP0067在体内在心脏肌肉中活化，但在骨骼肌(膈(diaph)、四头肌(Quad)、胫骨前肌(TA))中未活化。SP0067在肝脏中也有一些体内活性。
图4A-图4B示出了合成的心脏特异性启动子在人类心肌和骨骼肌细胞(H9C2或H2K细胞)中的平均体外表达。图4A示出了在pAAV-SYNP载体中的可操作地连接至SP0067、SP0424或SP0425合成启动子的标记基因在H2K小鼠骨骼肌细胞中的表达，其中，H2K细胞已分化为骨骼肌肌管，其中，数据归一化至已知启动子CBA的活性。相对活性为1等同于CBA的活性。误差条是标准差。图4B示出了在pAAV-SYNP载体中可操作地连接至SP0067、SP0424、SP0425、SP0429、SP0430、SP0344、SP0433、SP0435、SP0436合成启动子的的标记基因在H9C2大鼠心肌细胞中的平均表达，其中，H9C2细胞已分化为心肌(心脏)肌管，并被归一化至已知启动子CBA的活性。相对活性为1等同于CBA的活性。误差条是标准差。误差为至少三次重复实验的标准差。
图5A-图5F示出了在骨骼肌和心肌中活化的合成的肌肉特异性启动子的体内活性。图5A示出了合成的肌肉特异性启动子、对照启动子CBA和CK8、以及盐水阴性对照在心脏中的体内活性。图5B示出了合成的肌肉特异性启动子、对照启动子CBA和CK8以及盐水阴性对照在膈中的体内活性。图5C示出了合成的肌肉特异性启动子、对照启动子CBA和CK8以及盐水阴性对照在四头肌中的体内活性。图5D示出了合成的肌肉特异性启动子、对照启动子CBA和CK8、以及盐水阴性对照在肠中的体内活性。图5E示出了合成的肌肉特异性启动子、对照启动子CBA和CK8、以及盐水阴性对照在胫骨前肌中的体内活性。图5F示出了合成的肌肉特异性启动子、对照启动子CBA和CK8、以及盐水阴性对照在肝脏中的体内活性。
图6A-图6K示出了在心肌和骨骼肌中活化的示例性的合成的肌肉特异性启动子SP0173、SP0270、SP0268、SP0320、SP0279、SP0134、SP0057、SP0229、SP0067、SP0310和SP0267的体内活性。图6A示出了合成的肌肉特异性启动子SP0173在膈、心脏、肠、肝脏、四头肌(quad)和胫骨前肌(TA)中的体内活性。图6B示出了合成的肌肉特异性启动子SP0270在膈、心脏、肠、肝脏、四头肌(quad)和胫骨前肌(TA)中的体内活性。图6C示出了合成的肌肉特异性启动子SP0268在膈、心脏、肠、肝脏、四头肌(quad)和胫骨前肌(TA)中的体内活性。图6D示出了合成的肌肉特异性启动子SP0320在膈、心脏、肠、肝脏、四头肌(quad)和胫骨前肌(TA)中的体内活性。图6E示出了合成的肌肉特异性启动子SP0279在膈、心脏、肠、肝脏、四头肌(quad)和胫骨前肌(TA)中的体内活性。图6F示出了合成的肌肉特异性启动子SP0134在膈、心脏、肠、肝脏、四头肌(quad)和胫骨前肌(TA)中的体内活性。图6G示出了合成的肌肉特异性启动子SP0057在膈、心脏、肠、肝脏、四头肌(quad)和胫骨前肌(TA)中的体内活性。图6H示出了合成的肌肉特异性启动子SP0229在膈、心脏、肠、肝脏、四头肌(quad)和胫骨前肌(TA)中的体内活性。图6I示出了合成的肌肉特异性启动子SP0067在膈、心脏、肠、肝脏、四头肌(quad)和胫骨前肌(TA)中的体内活性。图6J示出了合成的肌肉特异性启动子SP0310在膈、心脏、肠、肝脏、四头肌(quad)和胫骨前肌(TA)中的体内活性。图6K示出了合成的肌肉特异性启动子SP0267在膈、心脏、肠、肝脏、四头肌(quad)和胫骨前肌(TA)中的体内活性。
图7A-图7P示出了与肌肉特异性启动子CK8、或心脏特异性启动子对照1或对照2相比，在心肌中活化的示例性的合成的心肌特异性启动子SP0067、SP0451、SP0452、SP0430、SP0450、SP0429、SP0424、SP0435、SP0436、SP0433、SP0449、SP0344、SP0475在选定的组织(肝脏、心脏、胫骨前肌(TA)、四头肌(Quad)、比目鱼肌和膈(Diaph))中的体内活性。图7A示出了示例性比较肝脏启动子CK8在肝脏、心脏、胫骨前肌(TA)、四头肌(Quad)、比目鱼肌和膈(Diaph)中的体内活性，显示出肝脏表达为1×105RLU/mg，且心脏表达为1×106-7RLU/mg。图7B示出了心肌启动子SP0067在肝脏、心脏、胫骨前肌(TA)、四头肌(Quad)、比目鱼肌和膈(Diaph)中的体内活性，显示出心脏中的特异性表达为1×105RLU/mg，且在骨骼肌或平滑肌组织中的表达较低，并且在肝脏中的表达也较低，为1×104RLU/mg。图7C示出了心肌启动子SP0344在肝脏、心脏、胫骨前肌(TA)、四头肌(Quad)、比目鱼肌和膈(Diaph)中的体内活性，显示出在心脏中的特异性表达为约1×107RLU/mg，且在骨骼肌或平滑肌组织中表达较低。图7D示出了心肌启动子SP0424在肝脏、心脏、胫骨前肌(TA)、四头肌(Quad)、比目鱼肌和膈(Diaph)中的体内活性，显示出在心脏中非常特异性的表达，为1×107至1×108RLU/mg，并且在肝脏和骨骼肌或平滑肌组织中的表达较低，为约1×104RLU/mg。图7E示出了心肌启动子SP0429在肝脏、心脏、胫骨前肌(TA)、四头肌(Quad)、比目鱼肌和膈(Diaph)中的体内活性，显示出在心脏中非常特异性的表达，为1×108RLU/mg，并且在肝脏和骨骼肌或平滑肌组织中表达较低，为约1×104至约1×105RLU/mg。图7F示出了心肌启动子SP0430在肝脏、心脏、胫骨前肌(TA)、四头肌(Quad)、比目鱼肌和膈(Diaph)中的体内活性，显示出在心脏中非常特异性的表达，为约1×108RLU/mg，并且在肝脏和骨骼肌或平滑肌组织中表达较低，为约1×104至约1×105RLU/mg。图7G示出了心肌启动子SP0433在肝脏、心脏、胫骨前肌(TA)、四头肌(Quad)、比目鱼肌和膈(Diaph)中的体内活性，显示出在心脏中的特异性表达为1×107RLU/mg，并且在骨骼肌或平滑肌组织和肝脏中的表达较低。图7H示出了阳性对照心肌启动子对照1在肝脏、心脏、胫骨前肌(TA)、四头肌(Quad)、比目鱼肌和膈(Diaph)中的体内活性，显示出在心脏中的表达为1×107RLU/mg，并且在骨骼肌或平滑肌组织和肝脏组织中的表达较低。图7I示出了心肌启动子SP0435在肝脏、心脏、胫骨前肌(TA)、四头肌(Quad)、比目鱼肌和膈(Diaph)中的体内活性，显示出在心脏中非常特异性的表达，为1×107至1×108RLU/mg之间，并且在肝脏和骨骼肌或平滑肌组织中的表达较低，为约1×104RLU/mg。图7J示出了心肌启动子SP0436在肝脏、心脏、胫骨前肌(TA)、四头肌(Quad)、比目鱼肌和膈(Diaph)中的体内活性，显示出在心脏中的表达为1×107RLU/mg，并且在肝脏和骨骼肌或平滑肌组织中的表达水平低于约1×104和1×106RLU/mg。图7K示出了阳性对照心肌启动子对照2在肝脏、心脏、胫骨前肌(TA)、四头肌(Quad)、比目鱼肌和膈(Diaph)中的体内活性，显示出在心脏中非常特异性的表达，为1.5×106RLU/mg，并且在骨骼肌或平滑肌组织中表达水平低于约1×104。图7L示出了心肌启动子SP0449在肝脏、心脏、胫骨前肌(TA)、四头肌(Quad)、比目鱼肌和膈(Diaph)中的体内活性，显示出在心脏中的表达为1×107RLU/mg，并且在肝脏和骨骼肌或平滑肌组织中的表达水平低于约1.5×105RLU/mg。图7M示出了心肌启动子SP0450在肝脏、心脏、胫骨前肌(TA)、四头肌(Quad)、比目鱼肌和膈(Diaph)中的体内活性，显示出在心脏中非常特异性的表达，为1.0×108RLU/mg，并且在肝脏和骨骼肌或平滑肌组织中的表达水平低于约1×105。图7N示出了心肌启动子SP0451在肝脏、心脏、胫骨前肌(TA)、四头肌(Quad)、比目鱼肌和膈(Diaph)中的体内活性，显示了在心脏中的特异性表达，为高于1.0×108RLU/mg，并且在骨骼肌或平滑肌组织中的表达水平低于约1.5×105，并且在肝脏中的表达甚至低于约1×104RLU/mg。图7O示出了心肌启动子SP0452在肝脏、心脏、胫骨前肌(TA)、四头肌(Quad)、比目鱼肌和膈(Diaph)中的体内活性，显示出在心脏中的特异性表达为高于1.0×108RLU/mg，并且在骨骼肌或平滑肌组织中的表达水平低于约1.5×105，并且在肝脏中的表达为约1.5×104RLU/mg。图7P示出了心肌启动子SP0475在肝脏、心脏、胫骨前肌(TA)、四头肌(Quad)、比目鱼肌和膈(Diaph)中的体内活性，显示出在心脏中的表达为高于1×105RLU/mg，并且在肝脏和骨骼肌或平滑肌组织中的表达水平低于约1.5×104RLU/mg。
图8示出了与CBA和CK8对照启动子相比，合成的肌肉特异性启动子SP0521和SP4169在肌肉细胞系H9C2中的体外活性。该图示出了合成的短肌肉特异性启动子SP0521和SP4769在分化成心脏肌管的H9C2细胞系中的平均活性，归一化至CBA启动子。误差条是来自三重复实验的标准差。
具体实施方式
本文公开了施用AAV载体的方法，以及用于改善心血管疾病和疾患、心脏疾患和疾病(包括心肌病、心力衰竭和充血性心力衰竭(CHF))的治疗的包含AAV载体的组合物和方法。在一些实施方式中，心力衰竭为非缺血性心力衰竭，或受试者患有非缺血性心肌病。在一些实施方式中，心力衰竭为缺血性心力衰竭，或受试者患有缺血性心肌病。非缺血性心力衰竭包括基于遗传的和营养引起的衰竭。
特别是，本发明的各方面针对的是用于治疗患有心力衰竭的受试者的新型施用方法和新型rAAV组合物，包括施用方法，所述施用方法包括向具有心力衰竭分类的受试者施用一剂rAAV，其中，在施用后至少12个月，所述心力衰竭的分类改善至少一个、或至少两个分期或分类水平。在一些实施方式中，本文所公开的施用方法可与其他药剂组合使用，包括但不限于使用免疫调节剂和/或血管扩张剂，以及包含编码I-1c的密码子优化的核酸序列的rAAV载体，和/或包含新型心脏特异性肌肉启动子的rAAV载体。此外，发明人已经证实了治疗患有心力衰竭的受试者(包括患有非缺血性心肌病和缺血性心肌病的受试者)的不同方法，所述方法具有能够显著改善受试者在用于评价心力衰竭的分类系统中的归类的能力。可以使用一系列分类系统来对受试者的心力衰竭程度进行分类，并且这些分类系统是本领域内众所周知的，包括但不限于美国心脏协会(AHA)、美国心脏病学会(ACC)、明尼苏达心力衰竭生活质量问卷(MLHFQ或MLWHF)、堪萨斯城心肌病问卷(KCCQ)、或2016欧洲心脏病学会指南(ESCG)、日本心力衰竭学会(JHFS)指南、日本循环学会(JCS)指南、或纽约心脏协会(NYHA)，或等同的或修改过的评估、或其组合或其合并的评估。
仅出于示例性目的，并且不希望局限于理论，已经证明了如本文所公开的治疗患有心力衰竭的受试者的方法、或如本文所公开的施用方法用于在施用本文所公开的rAAV后12个月内改善受试者的心力衰竭分类，从例如根据如本文所公开的心力衰竭分类系统的IV级至III级或小于III级、或例如从III级到II级或小于II级。在一些实施方式中，使用NYHA或AHA或ACC分类，或本领域普通技术人员已知的任何其它比较性心力衰竭分类系统。
特别是，本文所述技术的一个方面大体上涉及施用重组AAV(rAAV)载体的方法，其中，该方法是向受试者的单次施用，其中，所述单次施用包含单次施用内的至少2个、或3个、或4个、或5个或更多剂量。换句话说，在一些实施方式中，该方法包括以形成多个剂量的单次施用向受试者施用rAAV载体，例如，使用推注(bolus)以在特定的时间段内以小的子剂量在那个时间段中施用离散的量。单次施用也可以包括从至少2个、或3个、或4个、或5个以上的小瓶或注射器中施用rAAV，其中，从每个小瓶或每个注射器递送rAAV的时间在1-5分钟之间、或超过5分钟。在不受任何理论限制的情况下，示例性的注射器可以是简单的往复式泵，其由柱塞(尽管在现代注射器中，它实际上是活塞)组成，该柱塞紧密地配合在被称为筒的圆柱形管内。沿管的内部线性地拉动和推动柱塞，使注射器能够通过管前(开口)端的排出孔吸入和排出液体或气体。注射器的开口端装配有皮下注射用针头、喷嘴或管状物，以引导流入和流出筒。在一些实施方式中，所述方法涉及向心脏施用rAAV载体。在一些实施方式中，rAAV载体包含心脏特异性启动子，例如本文表1-表3中公开的示例性的心脏特异性启动子。在一些实施方式中，根据所公开的用于用于治疗心血管病症、心力衰竭或心脏疾病或疾患的方法施用rAAV载体。在一些实施方式中，根据本文所公开的方法施用的rAAV载体是包含编码用于治疗心力衰竭的治疗剂的核酸的rAAV载体，其中，所述核酸可操作地连接至表1-表3中公开的心脏特异性启动子。在一些实施方式中，启动子可以是调节性启动子，例如，诱导性启动子或抑制性启动子，或如本领域已知的带有锌指、TALONS等的启动子。
在一些实施方式中，本文所述的技术涉及一种方法，其中，如本文所公开的那样，旨在以子剂量施用单剂量的病毒载体，并且如本文所公开的那样，共同施用所述病毒载体与免疫调节剂。
本文所述的公开内容的另一个方面涉及重组AAV(rAAV)载体和用于基因治疗以向受试者递送蛋白磷酸酶1(PP1)的抑制剂的rAAV基因组的构建体。特别是，本文所述的技术大体上涉及rAAV载体、或用于生产PP1抑制剂(例如I-1多肽，或其功能片段或变体)的rAAV基因组，其在心脏(例如人的心肌和骨骼肌细胞)中表达。例如，本技术涉及用于在心脏(例如心肌和平滑肌细胞)中表达转基因的rAAV载体。
特别是，在一些实施方式中，PP1的抑制剂在重组rAAV载体中在心脏特异性启动子(CSP)的控制下表达。
本文所述技术的一个方面涉及rAAV载体，所述rAAV载体包含含有反向末端重复(ITR)的核苷酸序列、启动子、异源基因、poly-A尾和可能的其他调节元件，该rAAV载体用于治疗心血管病症、心脏疾患或心脏疾病(例如心力衰竭)，并且进一步用于治疗心力衰竭，其中，所述异源基因是PP1的抑制剂，并且其中，可以以治疗有效剂量向患者施用所述rAAVPP1抑制剂，其被递送至适当的组织和/或器官以表达异源基因并治疗疾病。
本文所述技术的一个方面涉及rAAV载体，该载体在其基因组中以5’至3’方向包含以下：5’-和3’-AAV反向末端重复(ITR)序列，以及位于5’和3’ITR之间的编码蛋白磷酸酶1(PP1)的抑制剂的异源核酸序列，其中，所述异源核酸可操作地连接至心脏特异性启动子(CSP)，例如本文表2A中公开的心脏特异性启动子、或其功能变体)。
在一些实施方式中，本文所述的rAAV载体来自任何血清型。在一些实施方式中，所述rAAV载体是AAV3b血清型，包括但不限于AAV3b265D病毒粒子、AAV3b265D549A病毒粒子、AAV3b549A病毒粒子、AAV3bQ263Y病毒粒子或AAV3bSASTG病毒粒子(即包含AAV3b衣壳的病毒粒子，所述AAV3b衣壳包含Q263A/T265突变)。在一些实施方式中，病毒粒子可以是合理的单倍体、或嵌合体或任何突变体，例如，可以为在所期望的位置(例如心脏)处的增加的更新而定制衣壳。其他的衣壳可以包括来自任何已知的AAV血清型的衣壳，包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10等等。在一些实施方式中，rAAV载体包含肝脏特异性衣壳，例如WO2019/241324中公开的选自XL32和XL32.1的肝脏特异性衣壳，该文件通过引用以其整体并入本文。在一些实施方式中，rAAV载体是WO2019/241324中公开的AAVXL32或AAVXL32.1，该文件通过引用以其整体并入本文。
I.治疗患有心血管病症、心脏疾病和心力衰竭以及CHF的受试者的方法
A.治疗心脏疾患和心脏疾病的方法
可受控的受试者
心力衰竭(HF)是由心脏不能正常运作导致的复杂的综合征。按具体特征(包括症状和功能的限制)对不同类型的心力衰竭进行分类。心力衰竭可以有可辨别的或未知的原因。根据已确立的指南，心力衰竭的诊断基于如下的标准，所述标准包括症状和病征的存在、针对诊断测试的降低的心脏功能的证据和/或对治疗的有利应答。
存在心力衰竭的多种分类，但两个主要的分类是纽约心脏协会(NYHA)和美国心脏病学会/美国心脏协会(ACC/AHA)，它们具有互补的分类系统。心力衰竭的严重性取决于受试者的症状和心脏功能水平。
本文所公开的技术的一个方面是用rAAV治疗患有心力衰竭的受试者的方法，或在施用后12个月或更早时，在受试者的心力衰竭分类的至少一个等级中具有改善。出于示例性目的，受试者可以由医生评估为在如本文所公开的一个或多个心力衰竭分类系统中从例如IV级到III级或低于III级，或例如从III级到II级或低于II级。在一些实施方式中，使用NYHA或AHA或ACC分类，或本领域普通技术人员已知的任何其他比较性心力衰竭分类系统。
B.心力衰竭分类系统
心力衰竭分类系统在本领域中是众所周知的，并且包括但不限于美国心脏协会(AHA)、美国心脏病学会(ACC)、明尼苏达心力衰竭生活质量问卷(MLHFQ)、堪萨斯城心肌病问卷(KCCQ)、或2016欧洲心脏病学会指南(ESCG)、日本心力衰竭学会(JHFS)指南、日本循环学会(JCS)指南、或纽约心脏协会(NYHA)，或其经修改的评估或组合或合并的评估。
(i)纽约心脏协会(NYHA)
用于本文所公开的方法中的一个心力衰竭分类系统是NYHA分类系统。NYHA(纽约心脏协会)基于症状严重性将HF分类为I级、II级、III级和IV级。Yancy CW，等，Circulation2013；128:e240-e327；改编自Dolgin M,Association NYH,Fox AC,Gorlin R,Levin RI,纽约心脏协会.Criteria Committee.Nomenclature and criteria for diagnosis ofdiseases of the heart and great vessels.第9版，Boston,MA：Lippincott Williamsand Wilkins；1994年3月1日；原始来源：Criteria Committee，纽约心脏协会,Inc.Diseases of the Heart and Blood Vessels.Nomenclature and Criteria fordiagnosis，第六版，Boston,Little,Brown and Co.1964,p114。
医生可以根据受试者自我报告的症状的严重性对受试者的心力衰竭进行分类。最经常使用的分类系统是纽约心脏协会(NYHA)功能分级。根据症状和在体力活动时感受到的限制，使用四个等级的临床分类对人进行分类。将症状严重性与正常呼吸、呼吸短促和/或心绞痛(胸痛或不适)进行比较。基于体力活动(通常称为劳力)期间的功能的心力衰竭分类通常是预后的重要指标。在NYHA中，存在4个等级或分期，其如下所示：
-I级(轻度)：体力活动没有限制。普通体力活动不会引起过度的疲劳、心悸、呼吸困难(呼吸短促)。
-II级(轻度)：体力活动有轻微限制。休息时感到舒适。普通体力活动导致疲劳、心悸、呼吸困难。
-III级(中度)：体力活动受到明显的限制。休息时感到舒适。低于普通活动导致疲劳、心悸或呼吸困难。
-IV级(重度)：即使在休息时也出现心力衰竭的症状。无法在不感到不适的情况下进行任何体力活动。如果进行任何体力活动，不适感增加。
通常认为I级和II级是轻度心力衰竭，而认为III级和IV级是更严重的或晚期心力衰竭。一个人可以在这些类别之间来回移动，因为它们是基于症状的。当患者具有心力衰竭恶化时，他们将有更多的症状，并且很可能是较高的类别，但当他们的症状得到较好的控制时，他们将是较低的类别。
表1A：纽约心脏协会(NYHA)分类等级/分期：
Figure BDA0004161819920000371
在某些实施方式中，接受本文所公开的rAAV施用的NYHA III级患者在rAAV剂量施用后1个月、或2个月、或3个月、或4个月、或5个月、或6个月、或7个月、或8个月、或9个月或12个月或更多个月之后改善为NYHA II级患者。在其他实施方式中，接受本文所公开的rAAV施用的NYHA II级患者在rAAV剂量施用后1个月、或2个月、或3个月、或4个月、或5个月、或6个月、或7个月、或8个月、或9个月或12个月或更多个月之后改善为NYHA I级患者。在一些实施方式中，接受本文所公开的rAAV施用的NYHA III级患者在rAAV剂量施用后1个月、或2个月、或3个月、或4个月、或5个月、或6个月、或7个月、或8个月、或9个月或12个月或更多个月之后改善为NYHA I级患者。在一些实施方式中，接受本文所公开的rAAV施用的NYHA IV级患者在rAAV剂量施用后1个月、或2个月、或3个月、或4个月、或5个月、或6个月、或7个月、或8个月、或9个月、或12个月或更多个月之后改善为NYHA III级患者或NYHA II级患者。
(ii)ACC/AHA分类：
用于本文所公开的方法中的一个心力衰竭分类系统是ACC/AHA分类系统。美国心脏病学会(ACC)和美国心脏协会(AHA)一起工作创建了对NYHA方法进行补充的另一个分类系统。它考虑了尚未患有HF但处于发展出HF的高风险的人。
ACC/AHA针对疾病进展来对心力衰竭进行分类，并根据HF症状的存在和病征以及心脏结构变化将HF分类为A期、B期、C期、D期。参见例如Yancy CW，等，Circulation 2013；128:e240-e327，和Hunt SA，等，Circulation 2001；104:2996-3007。
美国心脏病学会/美国心脏协会(ACC/AHA)分期系统定义了四期：
-A期：心力衰竭的高风险，但没有结构性心脏疾病或心力衰竭症状(前心力衰竭)
-B期：结构性心脏疾病，但没有心力衰竭的症状(前心力衰竭)
-C期：结构性心脏疾病和心力衰竭的症状
-D期：难治的心力衰竭，需要专门的干预
表1B：AHA/ACC 2013--心脏的分期系统
Figure BDA0004161819920000381
Figure BDA0004161819920000391
这些期表示从发展心力衰竭到发展为晚期心力衰竭的风险水平。这些期是逐步的，并且与治疗计划相关。随着心力衰竭恶化，病症将前进到下一期。各期之间不存在倒回。随着治疗，各期的进展可能被迟滞。诊断性考量包括评估心力衰竭何时开始、它在何处发展、它如何损害功能以及它是否可以用治疗有效管理。
在某些实施方式中，接受本文所公开的rAAV施用的ACC/AHA D期患者在rAAV剂量施用后1个月、或2个月、或3个月、或4个月、或5个月、或6个月、或7个月、或8个月、或9个月或12个月或更多个月之后改善为ACC/AHA C期患者。在其他实施方式中，接受本文所公开的rAAV施用的ACC/AHA C期患者在rAAV剂量施用后1个月、或2个月、或3个月、或4个月、或5个月、或6个月、或7个月、或8个月、或9个月、或12个月或更多个月之后改善为ACC/AHA B期患者。在一些实施方式中，接受本文所公开的rAAV施用的ACC/AHA D期患者在rAAV剂量施用后1个月、或2个月、或3个月、或4个月、或5个月、或6个月、或7个月、或8个月、或9个月、或12个月或更多个月之后改善为ACC/AHA C期或B期患者，或ACC/AHA A期患者。在一些实施方式中，接受本文所公开的rAAV施用的ACC/AHA C期患者在rAAV剂量施用后1个月、或2个月、或3个月、或4个月、或5个月、或6个月、或7个月、或8个月、或9个月、或12个月或更多个月之后改善为ACC/AHA B期或A期患者。
表1C：NYHA分类和ACC/AHA指南的比较(获取自Haselhuhn等，Cleveland ClinicJournal of Medicine 2019年2月，86(2)123-139。)
Figure BDA0004161819920000392
Figure BDA0004161819920000401
在一些实施方式中，还可以使用ACCF/AHA指南来管理心力衰竭，该指南是与美国家庭医师学会(American Academy of Family Physicians)、美国胸科医师学会(AmericanCollege of Chest Physicians)和国际心肺移植学会(International Society forHeart and Lung Transplant)合作开发的，公开于Yancy，Clyde W.等，“2017ACC/AHA/HFSAfocused update of the 2013ACCF/AHA guideline for the management of heartfailure:a report of the American College of Cardiology/American HeartAssociation Task Force on Clinical Practice Guidelines and the Heart FailureSociety of America.”Journal of the American College of Cardiology，70.6(2017)：776-803，通过引用以其整体并入本文。2013ACC/AHA心力衰竭指南的2017年重点更新包含了关于预防、新型生物标志物使用、伴有保留射血分数的心力衰竭(HFpEF)以及合并症(例如高血压、铁缺乏和睡眠呼吸紊乱)的重要建议。还将探索对急性失代偿心力衰竭的管理的潜在影响(参见例如Haselhuhn等，Cleveland Clinic Journal of Medicine 2019年2月，86(2)123-139)。
(iii)2016欧洲心脏病学会指南(ESCG)
2016欧洲心脏病学会指南公开于Piepoli等，Eur Heart J.2016Aug 1；37(29):2315-2381，该指南通过引用并入本文，并且包含该指南以在本文所公开的治疗HF的方法中使用，作为NYHA或ACC/AHA指南的替代或补充。
(iv)日本心力衰竭学会(JHFS)指南
日本循环学会(JCS)指南公开于Yamamoto K，等，Japanese heart failureSociety 2018Scientific Statement on Nutritional Assessment and Management inHeart Failure Patients.Circ J.2020年7月22日；84(8):1408-1444，并且包含该指南以在本文所公开的治疗HF的方法中使用，作为NYHA或ACC/AHA指南的替代或补充。
(v)堪萨斯城心肌病问卷(KCCQ)得分
KCCQ分数范围从0到100，并且经常以25分的范围进行总结，其中，分数代表如下的健康状况：0到24：非常差到差；25到49：差到一般；50到74：一般到良好；以及75到100：良好到优秀，描述于Spertus JA等，JACC，第76卷，第20期，2020年11月17日，第2379-2390页。由于临床实践和试验中量化健康状况的最常见手段是NYHA功能分级，理解KCCQ分数与哪个NYHA功能分级相关很有价值。分数为0至24的患者中，约85％为NYHA功能III/IV级；分数为25至49的患者中，60％为NYHA功能III级；分数为50至75的患者中，一半为NYHA功能III级，并且一半为NYHA功能II级；并且分数超过75的患者中，超过80％为NYHA功能I级或II级。
(vi)其他心力衰竭分类系统
射血分数：基于左心室射血分数将HF分类为HFrEF、HFmrEF、HFpEF，Ponikowski P，等，Eur J Heart Fail 2016；18：891-975。
病因学：按HF的具体病因对HF进行分期，例如缺血/非缺血、瓣膜性、高血压、浸润性心肌病(例如心脏淀粉样变性)、围产期心肌病、病毒性心肌炎、化疗诱导的心肌病，公开于Yancy CW，等，Circulation 2013；128：e240-e327和Ponikowski P，等，Eur J HeartFail2016；18：891-975。
MOGES：在形态-功能表型(M)、器官参与(O)、基因遗传模式(G)、病因学注释(E)(包括基因缺陷或潜在疾病/基质)和功能状态(S)的水平上对HF进行分类。参见例如，Arbustini E等，The MOGE(S)classification of cardiomyopathy for clinicians.J AmColl Cardiol2014；64：304-318。
INTERMACS(晚期HF的概况)：对于被考虑晚期HF治疗的患者，根据症状、功能能力、血液动力学稳定性将HF分类为Profiles 1至7。参见例如Stevenson LW等，INTERMACSprofiles of advanced heart failure:the current picture.J Heart LungTransplant 2009；28:535-541。
(vii)生活质量(QOF)问卷：
对心力衰竭的评价可以使用各种自我评价的问卷进行分类或归类，例如，选自以下的任何一种：明尼苏达心力衰竭生活质量问卷(MLHFQ，也被称为MLWHF、LHFQ、MQOL))(Rector等)；慢性心力衰竭问卷(CHFQ，CHQ)(Guyatt等，1989)；重度心力衰竭生活质量问卷(QLQ-SHF或QQL-SHF)(Wiklund等，1987)，堪萨斯城心肌病问卷(KCCQ)(Spertus等，1999)和左心室功能障碍问卷-36(LVD-36)(O’Learly等，1998)，对于它们中的每个都在以下进行了回顾：Garin，Olatz，等“Disease-specific health-related quality of lifequestionnaires for heart failure:a systematic review with meta-analyses.”Quality of Life Research 18.1(2009)：71-85，和Garin,O.等Assessing health-related quality of life in patients with heart failure:a systematic,standardized comparison of available measures.Heart Fail Rev 19，359-367(2014)，其各自都通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方式中，在生活质量(QOL)问卷中的临床上有意义的变化是与向受试者施用rAAV前的QOF问卷得分相比，在根据本文所公开的方法施用rAAV后至少6个月或至少12个月测量的QOF问卷得分减少10分、或减少多于10分。在一些实施方式中，在生活质量(QOL)问卷得分中的临床上有意义的变化是与向受试者施用rAAV前的ESV相比，在根据本文所公开的方法施用rAAV后至少3个月、或至少6个月、或至少12个月测量的QOL问卷得分(例如KCCQ得分，或MLWHF得分)减少10分、或减少11分、或减少12分、或减少13分、或减少14分、或减少15分、或减少16分、或减少17分、或减少18分、或减少19分、或减少20分、或减少21分、或减少22分、或减少23分、或减少24分、或减少25分、或减少多于25分。
(vi)用于评价治疗的测量：
在一些实施方式中，本文所公开的治疗HF的方法在患者中从基线水平改善了至少一个参数，其中，所述至少一个参数选自基本上由以下组成的组：(i)射血分数(EF或者可与左心室射血分数或LVEF互换使用)，(ii)收缩末期容积(ESV)，(iii)心脏收缩力，选自射血分数(EF)和短轴缩短率(FS)，(iv)心脏容积，选自舒张末期容积(DV)和收缩末期容积(ESV)中的任一项，(iv)功能性标准，选自6分钟步行测试(6MWT)、锻炼和VO2max(也称为pVO2max或心肌耗氧量(MVO2)(以mL/kg/min测量)中的任一项；(v)BNP水平，(vi)Pro-BNP水平，(vii)生物标志物水平，其中所述生物标志物水平选自肌钙蛋白、血清肌酐、胱抑素C或肝脏转氨酶的组，(viii)患者报告的结果(PRO)，例如减少的症状、健康相关的生活质量(HRQOL)或患者感知的健康状况，以及(ix)因心力衰竭导致的死亡风险、减少的因心力衰竭症状导致的住院治疗、或用于治疗HF的治疗性干预中的任一项的减少。
在一些实施方式中，收缩末期容积(ESV)的临床上有意义的变化是与向受试者施用rAAV前的ESV相比，在根据本文所公开的方法施用rAAV后至少1个月、或至少3个月、或至少6个月、或至少12个月测量的ESV减少10％、或减少多于10％。在一些实施方式中，ESV的临床上有意义的变化是与向受试者施用rAAV前的ESV相比，在根据本文所公开的方法施用rAAV后至少3个月、或至少6个月、或至少12个月测量的ESV减少10％、或减少约11％、或减少约12％、或减少约13％、或减少约14％、或减少约15％、或减少多于15％。在一些实施方式中，收缩末期容积(ESV)的临床上有意义的变化是与向受试者施用rAAV前的ESV相比，在根据本文所公开的方法施用rAAV后至少1个月、或至少3个月、或至少6个月、或至少12个月测量的ESV减少20mL，或减少多于20mL。
(a)BNP水平和NT-Pro-BNP水平
在一些实施方式中，可以通过测量生物标志物(例如从预先确定的时间段后(例如，在施用后至少约1个、或2个、或3个、或4个、或5个、或6个、或9个、或12个、或更多个月后)的受试者获得的血清中的循环利尿钠肽(BNP或NT-proBNP)水平)来评估如本文所公开的治疗方法。在一些实施方式中，在施用前，以及在施用后约4-6个月的时间段、或在施用后6个月之后、或在施用后超过6个月之后，可通过测量血清中的BNP和/或NT-proBNP水平来评估本文所公开的治疗或施用方法。
测量NT-proBNP水平的方法是本领域内众所周知的。如果来自受试者的血清中的BNP水平等于或少于100pg/mL，或来自受试者的血清中的NT-proBNP等于或少于300pg/mL，则急性心力衰竭(AHF)是不太可能的。如果来自受试者的血清中的BNP水平>400pg/mL，或者如果来自受试者的血清中的NT-proBNP对于年龄小于50岁的受试者来说>450pg/mL、或者对于年龄在50-75岁之间的受试者来说>900pg/mL、或者对于年龄>75岁的受试者来说>1800pg/mL，则诊断为HF是可能的。
因此，在一些实施方式中，在施用后至少6个月，经治疗的患者的血清中的BNP水平等于或小于400pg/mL表明治疗有效。
在一些实施方式中，在施用后至少6个月，年龄小于50岁的经治疗的患者的血清中的NT-proBNP水平等于或小于450pg/mL表明治疗有效。在一些实施方式中，在施用后至少6个月，年龄在50-75岁的经治疗的患者的血清中的NT-proBNP水平等于或小于900pg/mL表明治疗有效。在一些实施方式中，在施用后至少6个月，年龄≥75岁的经治疗的患者的血清中的NT-proBNP水平等于或小于1700pg/mL表明治疗有效。
在一些实施方式中，NT-pro-BNP(pg/mL)的临床上有意义的变化是与向受试者施用rAAV前测量的NT-pro-BNP(pg/mL)的水平相比，在根据本文所公开的方法施用rAAV后至少1个月、至少3个月、或至少6个月、或至少12个月测量的NT-pro-BNP(pg/mL)的水平减少35％、或减少多于35％。在一些实施方式中，NT-pro-BNP(pg/mL)的临床上有意义的变化是与向受试者施用rAAV前测量的NT-pro-BNP(pg/mL)的水平相比，在根据本文所公开的方法施用rAAV后至少1个月、或至少3个月、或至少6个月、或至少12个月测量的NT-pro-BNP(pg/mL)水平减少35％、或减少约36％、或减少约37％、或减少约38％、或减少约39％、或减少约40％、或减少约40％-45％或减少约46％-50％或减少多于50％。
在一些实施方式中，与施用前的BNP或NT-proBNP水平相比，在施用rAAV后至少3个月或至少约6个月，受试者血清中的BNP水平或NT-proBNP水平减少约10％、或约15％、或约20％、或约25％或约30％或>30％表明治疗有效。在一些实施方式中，与施用前的BNP或NT-proBNP水平相比，在施用rAAV后至少3个月或至少约6个月，受试者中的BNP或NT-proBNP血清水平减少约0.1倍、0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、1.0倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍或2.0倍、或减少多于2.0倍表明治疗有效。
在一些实施方式中，如果与施用前的BNP水平相比，施用rAAV后至少3个月或至少约6个月，受试者(任何年龄)中的BNP血清水平低于400pg/mL、或约350pg/mL、或约300pg/mL、或约250pg/mL、或约200pg/mL、或约150pg/mL、或约100pg/mL、或低于100pg/mL，则认为是有效治疗。
在一些实施方式中，如果与施用前的NT-proBNP水平相比，在施用rAAV后至少3个月、或至少约6个月，年龄小于50岁的受试者中的NT-proBNP的血清水平小于450pg/mL、或约400pg/mL、或约350pg/mL、或约300pg/mL、或约250pg/mL、或约200pg/mL、或约150pg/mL、或约100pg/mL、或小于100pg/mL，则认为是有效治疗。在一些实施方式中，经治疗的患者的年龄小于50岁、或者在50-75岁之间、或者≥75岁。
在一些实施方式中，如果与施用前的NT-proBNP水平相比，在施用rAAV后至少3个月、或至少约6个月，年龄在50-75岁之间的受试者中的NT-proBNP的血清水平低于900pg/mL、或约850pg/mL、或约800pg/mL、或约750pg/mL、或约700pg/mL、或约650pg/mL、或约600pg/mL、或约550pg/mL、或约500pg/mL、或约450pg/mL、或低于450pg/mL，则认为是有效治疗。在一些实施方式中，经治疗的患者的年龄小于50岁、或者在50-75岁之间、或者≥75岁。
在一些实施方式中，如果与施用前的NT-proBNP水平相比，在施用rAAV后至少3个月、或至少约6个月，年龄≥75岁的受试者中的NT-proBNP的血清水平低于约1800pg/mL、或约1700pg/mL、或约1600pg/mL、或约1500pg/mL、或约1400pg/mL、或约1300pg/mL、或约1200pg/mL、或约1100pg/mL、或约1000pg/mL、或约900pg/mL、或约800pg/mL、或约700pg/mL、或约600pg/mL、或约500pg/mL、或约450pg/mL、或低于450pg/mL，则认为是有效治疗。在一些实施方式中，经治疗的患者的年龄小于50岁、或者在50-75岁之间、或者≥75岁。
在一些实施方式中，BNP(pg/mL)的临床上有意义的变化是与向受试者施用rAAV前测量的BNP(pg/mL)水平相比，在根据本文所公开的方法施用rAAV后至少6个月、或至少12个月测量的BNP(pg/mL)水平减少40％、或减少多于40％。在一些实施方式中，BNP(pg/mL)的临床上有意义的变化是与向受试者施用rAAV前测量的BMP(pg/mL)水平相比，在根据本文所公开的方法施用rAAV后至少1个月、或至少3个月、或至少6个月、或至少12个月测量的BNP(pg/mL)水平减少40％、或减少约41％、或减少约42％、或减少约43％、或减少约44％、或减少约45％、或减少约45％-50％、或减少约51％-55％、或减少约56％-60％、或减少多于60％。
(b)射血分数(EF)(也可与左心室射血分数(LVEF)互换使用)
在一些实施方式中，可以根据本领域已知的方法使用经修改的Bruce方案对心肺运动测试进行评估。左心室射血分数(LVEF)的超声心动图评估的观察结果和从基线的变化也可用于评估治疗，其中，可在以下时间点评估LVEF：施用前，施用后18-24小时、4周后，施用后约6个月时和约12个月时。
在一些实施方式中，射血分数(EF)的临床上有意义的变化是与向受试者施用rAAV前的射血分数(EF)相比，在根据本文所公开的方法施用rAAV后至少1个月、或至少3个月、至少6个月或至少12个月测量的射血分数增加5％、或增加多于5％。在一些实施方式中，射血分数(EF)的临床上有意义的变化是与向受试者施用rAAV前的射血分数(EF)相比，在根据本文所公开的方法施用rAAV后至少1个月、或至少3个月、至少6个月、或至少12个月测量的射血分数增加5％、或增加约6％、或增加约7％、或增加约8％、或增加约9％、或增加约10％、或增加多于10％。
在一些实施方式中，改善的功能可以是与仅接受赋形剂的匹配的对照受试者的心脏功能相比的任何量的改善。例如，与施用rAAV时或施用rAAV之前测量的LVEF相比，根据本文所公开的方法施用rAAV载体后至少3个月或至少6个月，LVEF的改善(即增加)为约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或多于约200％。
在另一个实例中，与施用rAAV时或施用rAAV之前测量的E/A比相比，治疗后的E/A比的改善可以是约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或多于约200％。在又一实例中，与施用rAAV时或施用rAAV之前测量的LAV水平相比，左心房容积(LAV)的改善可以是约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或多于约200％。
在一些实施方式中，如果与根据本文所公开的方法施用rAAV时和/或施用rAAV前测量的LVEF水平相比，将LVEF保留了≥50％、或至少55％、或至少60％或多于60％，则认为所述rAAV载体和所述施用方法是有效的治疗(例如参见Dokainish，Glob Cardiol SciPract.2015；2015：3)。通常，正常LVEF的范围在50％至75％，并且认为女性的LVEF低于53％以及男性的LVEF低于52％是低的，并且具有49％或更低、或约45％、或约40％、或约36％、或在36％-49％之间的LVEF的受试者表示患有心力衰竭。在一些实施方式中，与根据本文所公开的方法施用rAAV时或施用rAAV前测量的LVEF相比，在受试者中测量的LVEF增加至少1％、或约2％、或约3％、或约4％、或约5％、或约6％、或约7％、或约8％、或约9％、或约10％、或约15％、或约20％、或约35％、或约40％、或约45％、或约50％、或多于50％表示有效治疗。例如，在说明性的实施方式中，如果受试者在根据本文所公开的方法施用rAAV载体时或施用rAAV载体之前测量的LVEF为36％，则如在施用rAAV后至少3个月、或至少约6个月测量的，LVEF增加至少1％达到37％LVEF、或增加约2％达到38％LVEF、或增加约3％达到39％LVEF、或增加约4％达到40％LVEF、或增加约5％达到41％LVEF、或增加约6％达到42％LVEF、或增加约7％达到43％LVEF、或增加约8％达到44％LVEF、或增加约9％达到45％LVEF、或增加约10％达到46％LVEF、或增加约15％达到51％LVEF、或增加约20％达到56％LVEF、或增加约25％达到61％LVEF，表明是有效治疗。
(c)收缩末期容积(ESV)/左心室收缩末期尺寸(LVESD)和舒张末期容积(DV)/左心室舒张末期尺寸(LVEDD)
在一个实施方式中，所述方法还包括根据如本文公开的方法施用如本文所公开的rAAV载体，以减弱心脏重构。心脏重构可以通过本领域已知的任何方法进行测量，包括例如超声心动描记术的方法。作为实例，左心室腔大小可用作对心脏重构的测量。在评价心脏重构的减弱时，根据本文所公开的方法，左心室大小增加的减弱可以是与施用本文所公开的rAAV载体之前的左心室大小相比的任何量的减弱。
在一些实施方式中，收缩末期容积(ESV)的临床上有意义的变化是与向受试者施用rAAV前的ESV相比，在根据本文所公开的方法施用rAAV后至少1个月、或至少3个月、至少6个月、或至少12个月测量的ESV减少10％、或减少多于10％。在一些实施方式中，ESV的临床上有意义的变化是与向受试者施用rAAV前的ESV相比，在根据本文所公开的方法施用rAAV后至少1个月、或至少3个月、至少6个月、或至少12个月测量的ESV减少10％、或减少约11％、或减少约12％、或减少约13％、或减少约14％、或减少约15％、或减少多于15％。
在一些实施方式中，收缩末期容积(ESV)的临床上有意义的变化是与向受试者施用rAAV前的ESV相比，在根据本文所公开的方法施用rAAV后至少1个月、或至少3个月、至少6个月、或至少12个月测量的ESV减少20mL或减少多于20mL。在一些实施方式中，ESV的临床上有意义的变化是与向受试者施用rAAV前的ESV相比，在根据本文所公开的方法施用rAAV后至少1个月、或至少3个月、至少6个月、或至少12个月测量的ESV减少20mL、或减少约22mL、或减少约23mL、或减少约24ml、或减少约25mL、或减少约26mL、或减少约27mL、或减少约28mL、或减少约29mL、或减少约30ml、或减少多于30mL。
在一些实施方式中，左心室大小增加的减弱可以是与仅接受赋形剂的匹配的对照受试者的左心室大小相比的任何量的减弱。左心室腔大小可以通过例如测定左心室舒张末期尺寸(LVEDD)或左心室收缩末期尺寸(LVESD)来测量。在实例中，与施用rAAV时或施用rAAV前测量的水平相比，在根据本文所公开的方法施用本文所公开的rAAV载体后至少3个月或至少6个月，LVEDD的变化可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或多于约200％。在另一实例中，与施用rAAV时或施用rAAV前测量的LVESD水平相比，在根据本文所公开的方法施用本文所公开的rAAV载体后至少3个月或至少6个月，LVESD的变化可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或多于约200％。
(d)VO2max(也称为pVO2max或心肌耗氧量(MVO2))
在一个实施方式中，所述方法还包括根据本文所公开的方法施用如本文所公开的rAAV载体，以改善患有充血性心力衰竭的受试者的运动能力。运动能力的改善可以通过本领域已知的任何方法来测量。例如，运动能力的改善可以通过测定峰值VO2摄取或运动能力与峰值乳酸之比来测量。运动期间的峰值摄氧量可以通过例如间接量热法测量。在实例中，与施用rAAV时或施用rAAV前测量的峰值乳酸之比相比，在根据本文所公开的方法施用本文所公开的rAAV载体后至少3个月或至少6个月测量的运动能力与峰值乳酸之比的变化可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或多于约200％。
在一些实施方式中，心肌耗氧量(MVO2)的临床上有意义的变化是与向受试者施用rAAV前测量的MVO2相比，在根据如本文所公开的方法施用rAAV后至少1个月、或至少3个月、至少6个月、或至少12个月测量的MVO2增加1.5mL/kg/min、或增加多于1.5mL/kg/min。在一些实施方式中，MVO2的临床上有意义的变化是与向受试者施用rAAV前测量的MVO2相比，在根据本文所公开的方法施用rAAV后至少1个月、或至少3个月、至少6个月、或至少12个月测量的MVO2增加1.5mL/kg/min、增加1.6mL/kg/min、或增加约1.7mL/kg/min、或增加约1.8mL/kg/min、或增加约1.9mL/kg/min、或增加约2.0mL/kg/min、或增加约2.1mL/kg/min或增加多于2.1mL/kg/min。
在一些实施方式中，如本文所公开的治疗方法可以通过测量峰值氧摄取(VO2)来评估，在施用rAAV载体后至少约3个、或4个、或5个、或6个月或6-10个月之间、或12个月测量所述峰值氧摄取。在一些实施方式中，适度的pVO2表示有效的治疗——即3个月内峰值VO2的适度增加与更有利的结果有关。因此，监测经治疗的受试者的峰值VO2的变化可用于评估rAAV载体和施用方法的预后和治疗效果。(Swank等，Circulation:Heart Failure，第5卷，第5期，2012年9月，第579-585页)。峰值VO2每增加6％(针对其他重要预测因素进行调整)与以下关联：全因死亡率和全因住院的主要终点风险降低5％(风险比＝0.95；CI＝0.93-0.98；P<0.001)；到心血管死亡或心血管住院的时间的次要终点风险降低4％(风险＝0.96；CI＝0.94-0.99；P<0.001)；心血管死亡或心力衰竭住院的风险降低8％(风险比＝0.92；CI＝0.88-0.96；P<0.001)；以及全因死亡率降低7％(风险比＝0.93；CI＝0.90-0.97；P<0.001)。在一些实施方式中，施用后峰值VO2比基线峰值VO2增加约2％、或约3％、或约4％、或约5％、或约6％、或约7％、或约8％、或约9％、或约10％、或约11％、或约12％、或约13％、或约14％、或约15％、或约16％、或约17％、或约18％、或约19％、或约20％、或约21％、或约22％、或约23％、或约24％、或约25％、或约26％、或约27％、或约28％、或约29％、或约30％。在一些实施方式中，施用后峰值VO2比基线峰值VO2增加至少2％。在一些实施方式中，施用后峰值VO2比基线峰值VO2增加至少5％。在其他实施方式中，施用后峰值VO2比基线峰值VO2增加至少10％。在又一实施方式中，施用后峰值VO2比基线峰值VO2增加至少20％。在某些实施方式中，施用后峰值VO2比基线峰值VO2增加至少30％。在一些实施方式中，施用后峰值VO2比基线峰值VO2增加约1.1倍、或约1.15倍、或约1.2倍、或约1.25倍、或约1.3倍、或约1.35倍、或约1.4倍、或约1.45倍、或约1.5倍、或约1.55倍、或约1.6倍、或约1.65倍、或约1.7倍、或约1.75倍、或约1.8倍、或约1.85倍、或约1.9倍、或约1.95倍、或约2倍、或约2.5倍、或约3倍、或约3.5倍、或约4倍、或约4.5倍、或约5倍、或约5.5倍、或约6倍、或约6.5倍、或约7倍、或约7.5倍、或约8倍、或约8.5倍、或约9倍、或约9.5倍、或约10倍。在某些实施方式中，施用后峰值VO2比基线峰值VO2增加至少1.1倍、或至少1.2倍、或至少1.5倍、或至少2倍、或至少2.5倍、或至少3倍、或至少3.5倍、或至少4倍、或至少4.5倍、或至少5倍、或至少6倍、或至少6.5倍、或至少7倍、或至少8倍、或至少9倍、或至少10倍、或至少11倍、或至少12倍、或至少13倍、或至少14倍、或至少15倍、或至少16倍、或至少17倍、或至少18倍、或至少19倍、或至少20倍、或至少22倍、或至少25倍、或至少30倍、或至少35倍、或至少40倍、或至少45倍、或至少50倍。
在评估与充血性心力衰竭相关的改善的心脏功能时，根据本文所公开的方法，改善的功能可以是与施用本文所公开的rAAV载体之前的心脏功能相比的任何量的改善。
(e)6分钟步行测试(6MWT)
在一些实施方式中，可以通过测量次要的结果度量来评估本文所公开的治疗方法，例如，在以下时间点在6分钟步行距离测试(称为6分钟步行测试(6MWT))中评估受试者：施用前、施用后18-24小时、4周后、施用后约6个月时和约12个月时。在某些实施方式中，可以在上述任何一个时间点进行的6分钟步行测试(6MWT)比基线改善了至少15m、或至少20m、或至少25m、或至少30m、或至少40m、或至少50m、或至少55m、或至少60m、或至少65m、或至少70m、或至少75m、或至少80m、或至少85m、或至少90m、或至少100m、或至少120m、或至少150m、或至少170m、或至少180m、或至少200m、或更多。
在一些实施方式中，6MWT的临床上有意义的变化是与向受试者施用rAAV前的6MWT中步行的距离相比，在根据本文所公开的方法施用rAAV后至少1个月、或至少3个月、至少6个月、或至少12个月测量的6MWT中步行距离增加50米或多于50米。在一些实施方式中，6MWT的临床上有意义的变化是与向受试者施用rAAV前的6MWT步行距离相比，在根据本文所公开的方法施用rAAV后至少1个月、或至少3个月、至少6个月、或至少12个月测量的6MWT中步行距离增加50米、或增加约60m、或增加约70m、或增加约80m、或增加约90m、或增加约100m、或增加约110m、或增加约120m、或增加约130m、或增加约140m、或增加约150m、或增加多于150米。
这样的6MWT可以根据在Giannitsi等，Ther Adv Cardiovas Disorders，2019，2019；13：1753944719870084中公开的方法进行，其通过引用以其整体并入本文。
(f)心脏收缩力，包括短轴缩短率(FS)和射血分数(EF)
在一个实施方式中，所述方法还包括根据本文所公开的方法施用本文所公开的rAAV载体，以改善心脏收缩力。改善心脏收缩力可包括可用于收缩的心肌细胞数量、心肌细胞收缩的能力、或两者的任何增加。为了评估心脏收缩力的改善，可以使用任何评估模式。例如，临床观察(例如心脏输出的增加或心率的减少或两者)可产生对增加的心脏收缩力的确定。另外，在体内，可以通过确定左心室的增加的短轴缩短率来评价增加的心脏收缩力。左心室的短轴缩短率可以通过任何可用手段(例如超声心动图)来观察。
在评估增加的心脏收缩力时，左心室的短轴缩短率的增加可以是与在根据本文所公开的方法施用本文所公开的rAAV载体前的短轴缩短率相比的任何量的增加。例如，与在施用rAAV时或施用rAAV前测量的缩短水平相比，根据本文所公开的方法施用rAAV载体后至少3个月或至少6个月测量的缩短的增加可以是约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或多于约200％。在进一步的方面，提供了预防性和治疗性的方法。考虑针对急性或慢性基础的治疗。此外，如果如此指出的话，针对急性基础的治疗可扩展为慢性治疗。在一个方面，提供了在有需要的受试者中治疗或预防与充血性心力衰竭有关的病症的方法。该方法大体上包括根据本文所公开的方法向受试者施用一定量的如本文所公开的rAAV载体，以有效地预防或改善充血性心力衰竭，其中，由此改善了与充血性心力衰竭相关的病症。
在一些实施方式中，rAAV载体以如下的量在受试者的心脏中表达本文所公开的I-1蛋白或其功能变体，所述量在具有现存的心力衰竭的受试者中有效地增加心脏收缩力并减少与心脏重构相关的形态退化(morphological deterioration)。在一些实施方式中，收缩力的增加通过如下确定：肌细胞缩短(肌细胞长度变化)增加、肌细胞缩短率(dL/dt)和再强化(relengthening)率(-dL/dt)、较短的弛豫时间常数(tau(.tau.))和加速的钙信号衰减。
在又一个实施方式中，所述方法进一步包括识别需要治疗的受试者。根据本文所公开的方法，任何有效的标准可用于确定可从施用本文所公开的rAAV载体中获益的受试者。例如，用于诊断心脏疾病和糖尿病的方法、以及识别处于发展出这些病症的风险的个体的程序是本领域的技术人员所熟知的。这些程序可以包括临床测试、身体检查、个人访谈和家族史的评估。
(g)生物标志物
来自血液的生物标志物可以帮助检测HF的存在，确定其严重性，评估未来事件的风险，并指导根据本文所公开的方法进行rAAV治疗的疗效。虽然BNP和Pro-BNP是HF分类中常受到评价的生物标志物，但其他生物标志物可用于进一步评价HF治疗的预后和有效性。
在一些实施方式中，一系列生物标志物可用于评价治疗疗效(如在美国专利8,450,069中所公开的那样，该专利通过引用以其整体并入本文)，包括测量与一个或多个血管炎症标志物(例如IL-6、TNFα、IL-17a)组合的cTnI和/或BNP的水平。
与HF相关的一些生物标志物是公认的，并且测量它们在循环中的浓度可以是方便和非侵入性的方法，所述方法用来提供关于疾病严重程度的重要信息，并有助于HF的检测、诊断、预后和管理。这些包括利尿钠肽、可溶性肿瘤抑制因子2、高敏肌钙蛋白、半乳糖凝集素-3、肾上腺髓质素前体中段肽(midregional proadrenomedullin)、胱抑素C、白细胞介素-6、降钙素原和其他。因此，在一些实施方式中，生物标志物选自以下的组：肌钙蛋白、血清肌酐、胱抑素C或肝脏转氨酶。在Chow等“Role of biomarkers for the prevention,assessment,and management of heart failure:a scientific statement from theAmerican Heart Association.”Circulation 135.22(2017)：e1054-e1091中公开了这些生物标志物的测量，以其整体并入本文。
在一些实施方式中，生物标志物是miRNA。已经使用了一些MicroRNA生物标志物，并且由于它们在循环中稳定，所选择的miRNA可以用作冠状动脉疾病、心肌梗塞、高血压、糖尿病、病毒性心肌炎和HF中的潜在生物标志物。例如，证实了7个miRNA在HF患者的血浆中富集(miR-423-5p、miR-18b*、miR-129-5p、HS_202.1、miR-622、miR-654-3p和miR-1254)，其中，miR-423-5p与HF的临床诊断最密切相关。miR-423-5p的循环水平与疾病的严重程度有关，该程度通过以下示出：与射血分数的负相关，并且具有更高的纽约心脏协会(NYHA)分级的患者中的更高水平的miR-423-5p。MiR-423-5p还与目前临床上使用的生物标志物N-末端脑钠素前体(N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP)的水平相关。(参见例如Goren Y，Kushnir M，Zafrir B，Tabak S，Lewis BS，Amir O.Serum levels ofmicroRNAs in patients with heart failure.Eur J Heart Fail 14：147-154，2012和Tijsen AJ等，Circulating microRNAs as diagnostic biomarkers for cardiovasculardiseases.Am J Physiol Heart Circ Physiol.2012；303：H1085-H1095)。
其他三种循环miRNA与HF的诊断有关。在10名患者和17名无症状对照中发现内皮特异性miR-126与年龄、BNP和NYHA分级负相关(Fukushima Y等，Assessment of plasmamiRNAs in congestive heart failure.Circ J 75：336-340，2011.8)。Corsten等(Corsten MF等，Circulating MicroRNA-208b and MicroRNA-499reflect myocardialdamage in cardiovascular disease.Circ Cardiovasc Genet 3：499-506，2010.10)发现与健康对照相比，在患有急性HF的患者的血浆中miR-499和miR-122两者富集，其中miR-499可能来源于心肌。
理想的生物标志物的特征之一是随着响应于治疗的疾病严重程度的变化而改变水平。已经证明miR-499-5p和miR-423-5p在HF的大鼠模型中显示出治疗的效果(Montgomery RL等，Therapeutic inhibition of miR-208a improves cardiac functionand survival during heart failure.Circulation 124：1537-1547，2011)。
此外，在患有MI的患者中，miR-1、miR-133a、miR-133b和miR-499-5p升高，而miR-122和miR-375降低(参见例如Tijsen AJ等，Circulating microRNAs as diagnosticbiomarkers for cardiovascular diseases.Am J Physiol Heart Circ Physiol.2012；303：H1085-H1095)。
在一些实施方式中，针对与心脏重构相关的形态退化的保护通过测量心脏与身体的重量比、梗塞面积和心脏纤维化的存在来确定，其中，如果与对照相比，所述人磷酸酶抑制剂-1(I-1)或其变体的表达产生降低的心脏与身体的重量比、减小的梗塞面积或减少的心脏纤维化，则存在保护。
在一些实施方式中，可以通过评估治疗对与心脏功能或心脏细胞功能相关的参数(例如收缩力)的影响来评价用rAAV载体并根据本文所公开的施用方法治疗的受试者。例如，可以使用上述方法测量SR Ca2+ATP酶活性或细胞内Ca2+浓度。此外，由心脏或心脏组织产生的力可以使用在Strauss等，Am.J.Physiol.，262：1437-45,1992中描述的方法进行测量。
在一些实施方式中，也可以通过其对受试者的影响(例如，根据治疗领域的技术人员将会认识到与特定治疗相关的参数)对用rAAV载体并根据本文所公开的施用方法治疗的受试者进行评估。例如，在治疗心力衰竭时，示例性的参数可能与心脏和/或肺功能有关。心脏参数包括：脉搏、EKG信号、管腔损失、心率、心脏收缩力、心室功能(例如，左心室舒张末期压力(LVEDP)、左心室收缩压力(LVSP))、Ca2+代谢(例如，细胞内Ca2+浓度或峰值或静息Ca2 +)，心脏的力产生、心脏的放松和压力，力频率关系、心脏细胞存活或凋亡或离子通道活性(例如，钠钙交换、钠通道活性、钙通道活性、钠钾ATP酶泵活性、肌球蛋白重链活性、肌钙蛋白I、肌钙蛋白C、肌钙蛋白T、原肌球蛋白、肌动蛋白、肌球蛋白轻链激酶(myosin lightchain kinase)、肌球蛋白轻链1、肌球蛋白轻链2或肌球蛋白轻链3、IGF-1受体、PI3激酶、AKT激酶、钠钙交换蛋白、钙通道(L和T)、CK-MB、肌集钙蛋白或钙网蛋白。评估可以包括进行血管造影术(例如定量血管造影术)和/或血管内超声(IVUS)，例如在治疗之前、之后或治疗期间。在某些实施方式中，对LVEF、LVEVD、LVEDVI、VLESV、LVEVI、SpI、GLS、或二尖瓣反流程度、或这些的任何组合、或所有这些的超声心动图评估在施用本文所述的rAAV载体4周之后、或6周之后、或8周之后、或12周之后、或3个月之后、或6个月之后、或9个月之后、或12个月或更多个月之后进行。在一些实施方式中，对全因死亡和/或心力衰竭相关的住院治疗的评估示出了如本文所述的rAAV治疗的安全性和/或疗效。在一些实施方式中，在监测施用rAAV的患者时，评估存活、心脏移植、或左心室辅助装置(LAVD)植入、或这些的任何组合。
在根据本发明的方法的一些实施方式中，以有效量引入rAAV载体，以产生选自于由以下所组成的组中的状况：心肌细胞缩短、弛豫时间常数降低，以及加速钙信号衰减及其组合。在又一实施方式中，以有效改善收缩末期压力尺寸关系(end-systolic pressuredimension relationship)或其组合的量引入rAAV载体。
在一些实施方式中，本文所公开的施用和治疗方法包括在所述受试者的心脏组织中表达治疗量的PP1抑制剂(I-1、或I-1c、或其变体)。适当地，在心脏组织中表达治疗量的PP1抑制剂减少了受试者的心力衰竭或心脏疾患的症状。适当地，在心脏组织中表达治疗量的PP1抑制剂可以减弱心脏重构、提高运动能力、或改善心脏收缩力。适当地，在心脏组织中表达治疗量的PP1抑制剂可引发心肌细胞缩短、弛豫时间常数降低、以及加速钙信号衰减、改善收缩末期压力尺寸关系及其组合。
在又一实施方式中，在施用本文所公开的rAAV载体之前或之后、或其两者，所述方法进一步包括评价受试者的心脏功能参数。该心脏功能参数可以是但不限于以下的一项或多项：心率、心脏代谢、心脏收缩力、心室功能、Ca2+代谢和肌质网Ca2+ATP酶活性。
C.待用本文所公开的rAAV载体治疗的示例性受试者
如本文所公开的，本文所公开的施用方法和rAAV载体可用于治疗心血管病症或心脏疾病，其中，如本文所公开的rAAV载体被靶向到患者的心脏，由此，核酸序列(例如PP1的抑制剂或其他治疗剂，例如血管生成蛋白或来自表18A-表18B的蛋白)在心肌中表达，从而通过改善血流和/或改善心脏收缩功能来改善心脏功能障碍。改善的心脏功能最终使得心脏疾病或心力衰竭的一个或多个症状减少或消失，并在超出预期死亡率后延长生命。
相似地，在一些实施方式中，本文所公开的施用方法和rAAV载体可用于治疗外周血管疾病，其中，将本文所公开的rAAV载体靶向至患者的心脏，由此，将核酸序列(例如PP1抑制剂、或其他治疗剂(例如血管生成蛋白)靶向至受影响的组织(例如缺血的骨骼肌)，由此，治疗蛋白(例如PP1抑制剂或血管生成蛋白)的表达改善和/或治愈外周血管疾病的症状(例如通过增加组织受影响(例如缺血)区域的血流，和/或在肌肉中通过改善受影响肌肉的收缩功能)。
因此，在一些方面，本文所述的技术涉及在治疗患有心肌缺血的患者的心血管病症或心脏疾病的方法中的施用方法和本文所公开的rAAV载体，包括通过冠状动脉内注射、优选通过将rAAV载体直接注射到一个或两个冠状动脉(或移植物)中，根据本文所公开的施用方法将rAAV载体施用至患者的心肌，由此表达了转基因(例如PP1的抑制剂和/或血管生成蛋白)，并且血流和/或收缩功能得到改善。举例说明，将rAAV载体递送至心脏，其中，在持续时间段中，在心肌中连续产生蛋白质或肽到治疗学上显著的程度，血管生成可以在心肌的受影响区域中得到促进。
心力衰竭
可适于使用本文所公开的rAAV载体和本文所公开的施用方法进行治疗的受试者包括但不限于患有心力衰竭(包括充血性心力衰竭(CHF))的受试者，其除了心力衰竭之外还患有选自于由以下所组成的组中的病症：缺血、心律不齐、心肌梗塞(MI)、心脏收缩力异常和Ca2+代谢异常及其组合。在又一个实施方式中，受试者是人类。在这些患有充血性心力衰竭的患者中，有表现出扩张型心肌病的患者和表现出严重心肌梗塞的患者，通常与严重或闭塞性冠状动脉疾病有关。在某些实施方式中，待治疗的受试者患有非缺血性心肌病。
来自美国心脏病学会/美国心脏协会(ACC/AHA)、HFA/ESC和JHFS指南的心力衰竭的定义将心力衰竭归类为临床综合征，并且各自的定义如下：
(i)急性心力衰竭(AHF)
急性心力衰竭(AHF)是指HF的症状和/或病征的迅速发生或恶化。它是威胁生命的医学病症，需要紧急评估和治疗，通常导致紧急入院。AHF可以表现为首次出现(从头开始(de novo))，或更经常地作为慢性HF急性失代偿的结果，并可以由原发性心脏功能障碍引起或由外在因素促发，通常是在患有慢性HF的患者中。急性心肌功能障碍(缺血性、炎症性或毒性)、急性瓣膜功能不全或心包填塞是AHF的最常见的急性原发性心脏诱因。慢性HF的失代偿可以在没有已知的促发因素的情况下发生，但更常见的是有一个或多个因素，例如感染、不受控的高血压、心律紊乱(rhythm disturbances)或不坚持用药/饮食。
患有急性心力衰竭(AHF)的人没有先前的心力衰竭的病征和症状。AHF可表现为快速肿胀和液体潴留(fluid retention)，其特征是体重突然增加。咳嗽、喘息和呼吸急促、以及不规则的心跳可以是急性心力衰竭的症状。在一些情况下，它与预先存在的心肌病有关。AHF常常需要意外入院。它也可以与预后不良、以及出院后的再入院和死亡的高风险有关。治疗选项包括药物、手术和植入式医疗设备，以及建议的生活方式调整。
在大多数情况下，患有AHF的患者表现出保留(90-140mmHg)或升高(140mmHg；高血压AHF)的收缩压。所有患者中的只有5-8％表现为低SBP(即90mmHg；低血压AHF)，其与不良的预后有关，特别是当低灌注(hypoperfusion)也存在时。
(ii)慢性心力衰竭(也可与充血性心力衰竭互换使用)
心力衰竭(HF)是有许多可能起因的复杂的综合征，其由左心室在心脏周期的舒张期期间充血或在心脏周期的收缩期期间射血的受损的能力造成。因此，受影响的心脏越来越不能泵送足够的血液体积以满足身体的氧气需求。
心力衰竭是常见的慢性病症，其主要影响老年人。在普通人群中的患病率为0.8％-2％，但在年龄>70岁的人群中为10％-20％。随着人口不断老化，患病率正在增加。在美国，HF目前影响了580万；一个估计预测，到2030年这一数字将上升至多于800万。
慢性心力衰竭(CHF)描述了心脏无法通过身体泵送足够的血液并提供足够的氧气供应——也就是说，CHF是心脏无法泵送所需量的血液以满足身体的需求。这是由于比正常心脏弱而引起的。当身体从心脏接收不足的血液流入时，一些组织和器官开始以低于它们的潜力起作用，使个体不可能拥有所需的能量来满足常规活动。当心脏不能正常充盈或向前泵血时，就会引起液体积聚到身体的组织中，造成充血或肿胀。CHF的典型症状是呼吸短促和疲劳，然而，有些患有CHF的人只经历疲劳和活动耐受力下降。那些经历充血的人可能在脚踝和腿部、腹部或肺部具有肿胀。如果不及时治疗，呼吸短促和肺水肿可导致呼吸窘迫。心力衰竭也能够影响肾脏处理以及消除钠和水的能力。这可能导致更多的液体潴留和随后的肿胀。在许多情况下，心脏功能不正常导致死亡，因为心脏无法接收氧气和血液至心脏肌肉。
心力衰竭可以发生在左侧或右侧。
左侧心力衰竭：当由于左心室工作不正常而发生衰竭时，发生左侧心力衰竭。在这种情况下，左心室不能以必要的力量从心脏泵出身体所需的血液。由于这个原因，积聚了血液的左室最终导致了肺水肿和肺动脉高压。其原因包括高血压、缺血性心脏疾病、主动脉瓣疾病和原发性心肌疾病。
右侧心力衰竭：右侧心室衰竭的主要原因是由于左侧心力衰竭。但是，如果右侧衰竭的发生是由于肺部的病变，那么它是冠状动脉肺心病(coronary pulmonale)。CHF在男性中最常见，并且风险因素包括年龄、高血压、超重和代谢紊乱(如糖尿病)的存在。CHF正如其名称所描述的那样——它是可随时间变得恶化的长期病症。在本发明之前，它通常不能被治愈，但可以进行药物管理。
射血分数：射血分数描述的是心脏(随着每一次跳动收缩和放松的肌肉)的泵送能力。EF度量每次心脏收缩时泵出心脏的血液的百分比。随着每一次跳动，心脏将血液泵送遍及全身。当心脏的泵送能力受到损害时，射血分数的测量值下降。EF的正常范围是55％至70％。在一些实施方式中，将本文所公开的方法用于含有具有减少的EF的心力衰竭(HFrEF)的受试者。
舒张性心力衰竭：
舒张性HF也被称为具有保留的射血分数的心力衰竭(HFpEF)，并当左心室变得僵化(rigid)或僵硬(stiff)且在舒张期(两次跳动之间的时间)不能放松时出现。这使心脏无法正常地重新充血。代表了所有HF病例的约一半，舒张性心力衰竭在老年人和女性中最常见。当存在能够导致HF的发展的其他潜在的医学病症(合并症)时经常出现这种情况。HFpEF表示保留的射血分数，因为尽管肌肉不能像它应该的那样放松，但左心室仍然正常泵送。
收缩性心力衰竭：
收缩性HF也被称为伴有降低的射血分数的心力衰竭(HFrEF)，并且当左心室不能正常收缩时而发展出。这意味着心脏不再以足够的力量进行泵送，以挤压足够的血液进入循环。病症(例如高血压、心律不齐、冠状动脉疾病、以及滥用酒精和药物)能够导致心力衰竭的发展。随着左心室(心脏的左下腔)变大、并且更努力地工作以挤压泵出正确量的富含氧气的血液来为身体提供能量，HFrEF得以进展。
失代偿性心力衰竭：
当患有已知的HF的患者发展出恶化的病征和充血症状时，发生失代偿性心力衰竭(DHF)。这也被称为流体过载，因为身体具有的流体多于它能排出的流体。患者可能有体重增加、呼吸困难加重、腿部或腹部肿胀或水肿、恶心、以及躺下时呼吸短促。失代偿性心力衰竭还能够引起疲劳，使人在进行剧烈活动或日常活动时感到更累。这可影响到进行家务活动或在工作时的任何费力任务。这些患者可能需要入院以进行治疗。
存在心力衰竭的一系列原因。它们大致包括非缺血性心力衰竭和缺血性心力衰竭。非缺血性心力衰竭可以是以基因为基础，由疾病(川崎病)、心肌病引起，以营养为基础(例如酒精诱导的心力衰竭)，或由病毒感染(并且可能由Covid-19)引起。它也可以由缺血引起。
存在多种疾病和病症可以导致受试者出现心力衰竭，包括例如高血压、肾功能不全、受损的心脏组织(心肌梗塞，包括既往心肌梗塞(MI)(antecedent myocardialinfarction)、冠状动脉疾病/缺血、异常的心脏瓣膜或心室(先天或后天的)、肺栓塞(PE)和高血压、心律失常、心肌病、糖尿病、与年龄相关的退化(age-related deterioration)、药物滥用、毒素、阻塞性睡眠呼吸暂停、和感染(心肌炎、心内膜炎)。
心脏成像(超声心动描记术)使得能够测量左心室射血分数(LVEF)。这是在收缩期射出的左心室中的总血液体积的％，且通常为约50％-70％。由受损的心室射血导致的HF与降低的射血分数(rEF)(即低于50％)有关，并且被称为HFrEF或收缩性心力衰竭。由受损的心室充盈导致的HF与保留的EF(即>55％)有关，并且被称为HFpEF或舒张性心力衰竭。心脏成像使得能够在心力衰竭的症状发生之前检测到左心室功能障碍(收缩性的或舒张性的)。在一些实施方式中，施用本文所公开的rAAV的患者具有40％LVEF、或35％LVEF、或30％LVEF、或25％LVEF、或20％LVEF、或15％LVEF、或10％LVEF、或5％LVEF或更少的LVEF。在一些实施方式中，通过经胸超声心动图(TTE)测量LVEF。
既往心肌梗塞(MI)和慢性高血压(CH)是HF的两个最常见的原因。糖尿病与HF的增加的风险有关，与既往MI或慢性高血压无关。
HF的主要症状包括：仅轻微用力后的呼吸急促(呼吸困难)；运动不耐受，疲劳；以及最终由于局部液体(水肿)积聚导致的踝关节肿胀/疼痛。HF是逐渐衰弱的病症。纽约心脏病协会(NYHA)功能分级被广泛用于基于身体活动受限的程度将HF的严重程度分类为四个等级之一。NYHA I级是基本上无症状的HF，而NYHA IV级被应用于患有最严重的HF的患者，他们“不能够在没有不适的情况下进行任何身体活动”。这些IV级HF患者“在休息时经受症状(呼吸急促、疲劳等)”。在一些实施方式中，施用本文所公开的rAAV的患者具有NYHA III级、或NYHA IV级心力衰竭。
通常，患者具有慢性稳定的HF时期，不时被急性加重打断，当症状和血液动力学病症明显恶化、需要紧急入院时，称为急性(失代偿性)心力衰竭(AHF)。AHF可能发生在那些还没有被诊断为患有HF的人中，与高死亡率有关。约12％-15％的因AHF住院的患者在12周内死亡，并且30％的患者在入院后12个月内死亡。
在一些实施方式中，在用于治疗慢性非缺血性心肌病或缺血性心肌病的方法中使用本文所公开的rAAV载体和施用方法。在一些实施方式中，受试者患有慢性非缺血性心肌病。在一些实施方式中，患有慢性缺血性心肌病的受试者不适于治疗。在一些实施方式中，如果受试者在入组前6个月内通过经胸超声心动图(TTE)具有≤30％的LVEF(左心室舒张末期容积)，则该受试者适于根据本文所公开的方法施用本文所公开的rAAV载体的治疗。在一些实施方式中，受试者具有如下的LVEF：>120的心室容积/EDVI(mL)(严重的LV扩大)，或100-120之间的心室容积/EDVI(mL)(中度LV扩大)，或84-99之间的心室容积/EDVI(mL)(轻度LV扩大)。在一些实施方式中，如果受试者的心室容积/EDVI(mL)等于或小于84(正常LV)，则受试者不适于根据所公开的方法施用本文所公开的rAAV载体的治疗。
(iii)心肌病
心肌病和充血性心力衰竭(CHF)是极其常见的病症，在全球造成了数百万的死亡。心肌病属于疾病的异质性的组，其导致机械或电功能障碍，表现出不适当的扩张。这种疾病的发生由多种因素(包括基因因素)导致。它们是多系统紊乱的一部分，或局限于仅心脏，其导致心血管死亡。充血性心力衰竭是心脏无法泵送所需量的血液以满足身体的需求。心肌病和心力衰竭或充血性心力衰竭彼此密切整合；心肌病是心脏肌肉的病变，而心力衰竭是存在心肌病时发生的综合症。
存在三种类型的心肌病：(1)扩张型心肌病，其由于具有伴随性肥厚的进行性心脏扩张而发生。原因包括基因突变、分娩、铁超载、心肌炎和酒精滥用。(2)肥厚型心肌病，其由于基因、心肌肥厚和左心室心肌功能不正常而发生。它们导致异常的舒张性充盈，并阻碍间歇性心室流出。(3)限制性心肌病，其最不常见，并且由于降低的心室顺应性而出现，其导致受损的心室充盈。其原因包括放射性纤维化、淀粉样变性、转移性肿瘤和结节病。
在本文所公开的所有方面，所述方法包括治疗患有心力衰竭的受试者。在一些实施方式中，该受试者患有非缺血性心肌病。在其他实施方式中，该受试者患有缺血性心肌病。
术语“心肌病”是指“心(cardio)(心脏，heart)”“肌(myo)(肌肉，muscle)”、“病(pathy)(的疾病，disease of)”。扩张型心肌病导致左心室腔扩大、收缩功能障碍和充血性心力衰竭的临床表现。
在一些实施方式中，患有非缺血性心肌病的受试者具有扩张型心肌病，其中，存在一个或两个心室的扩张和受损的收缩。
在一些实施方式中，受试者由于毒素(例如酒精)、药物(例如蒽环类)而患有非缺血性心肌病。在一些实施方式中，受试者由于浸润剂(infiltrative agent)(例如肉状瘤病)、铁超载(血色病或过量输血)而患有非缺血性心肌病。在一些实施方式中，受试者由于饮食问题(例如脚气病(硫胺素缺乏症))而患有非缺血性心肌病。
在一些实施方式中，受试者由于当前或先前的感染而患有非缺血性心肌病，所述感染例如但不限于病毒感染，例如：恰加斯病、HI、柯萨奇或莱姆病、冠状病毒(MERS-CoV(导致MERS)、SARS-CoV(导致SARS)、SARS-CoV2(导致COVID-19)和人冠状病毒229E、NL63、OC43和HKU1)。在一些实施方式中，患有非缺血性心肌病的受试者由于covid感染而具有长Covid或长期并发症或症状。
在一些实施方式中，受试者由于遗传性病症而具有非缺血性心肌病，例如，家族性DCM、肌营养不良症(杜兴氏症、肌强直、线粒体)。在本文所公开的治疗受试者心力衰竭的方法的一些实施方式中，受试者由于具有心脏表现的基因疾患而患有非缺血性心肌病，所述基因疾患选自包括以下的组：22q11.2缺失综合征、腹主动脉瘤、迷走锁骨下动脉、成人葡聚糖小体病、α-甘露糖苷贮积症、
Figure BDA0004161819920000641
综合征、Andersen-Tawil综合征、Valsalva窦动脉瘤、致心律失常性右心室心肌病、动脉迂曲综合征(Arterial tortuosity syndrome)、Ehlers-Danlos综合征、家族性心房粘液瘤、原发孔型房间隔缺损、静脉窦型房间隔缺损、压力反射衰竭(Baroreflex failure)、巴氏综合征、Becker肌营养不良症、双向心动过速、蓝色橡皮泡痣综合征、短指症长拇指型(Brachydactyly long thumb type)、心碎综合征、Brugada综合征、Brugada综合征3、Brugada综合征4、Budd-Chiari综合征、Buerger病、伴腔内扩张的心脏棘球蚴(Cardiac hydatid cysts with intracavitary expansion)、心脏破裂、心脏-瓣膜Ehlers-Danlos综合征、心脑肌病、心-面-皮肤综合征、心肌病白内障髋关节脊椎疾病(Cardiomyopathy cataract hip spine disease)、扩张型心肌病伴羊毛状毛发和皮肤角化病(Cardiomyopathy dilated with woolly hair and keratoderma)、Carney复合征、肉碱-酰基肉碱移位酶缺乏症、儿茶酚胺敏感性多形性室性心动过速(Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia)、混乱性房性心动过速、CHARGE综合征、染色体1p36缺失综合征、COG1-CDG(CDG-IIg)、COG7-CDG(CDG-IIe)、联合氧化磷酸化缺乏症16、先天性全身脂肪营养不良4型、先天性心脏传导阻滞、先天性矫正型大动脉转位、右侧三房心(Cor triatriatum dexter)、左侧三房心(Cor triatriatumsinister)、Costello综合征、主动脉囊性中层坏死、Danon病、DCMA综合征、弥漫性皮肤系统性硬化症、扩张型心肌病、伴高促性腺素性功能减退的扩张型心肌病、DOLK-CDG(CDG-Im)、DPM3-CDG(CDG-Io)、杜氏营养不良症(DMD)、Ebstein畸形、Ellis Yale Winter综合征、埃利伟氏综合征、伴多血管炎的嗜酸粒细胞肉芽肿、Fabry病、家族性心房颤动、家族性扩张型心肌病,家族性肥厚型心肌病、家族性进行性心脏传导缺陷、家族性胸主动脉瘤和主动脉夹层、纤维软骨栓塞、纤维肌发育不良、Friedreich共济失调、岩藻糖苷贮积症、戈谢病、戈谢病1型、戊二酸血症II型、糖原贮积症2型、糖原贮积症3型、糖原贮积症4型、心-手综合征(Heart-hand syndrome)Slovenian型、心手综合征Spanish型、HEC综合征、His束性心动过速、Holt-Oram综合征、人HOXA1综合征、Hurler综合征、Hurler-Scheie综合征、嗜酸性粒细胞增多综合征、左心发育不良综合征、婴儿组织细胞样心肌病、颅内动静脉畸形、异丁酰-辅酶A脱氢酶缺乏症、Ivemark综合征、Jervell Lange-Nielsen综合征、激肽释放酶(Kallikrein)高血压、川崎病、Kearns-Sayre综合征、LCHAD缺乏症、Leber遗传性视神经病变、左心室致密化不全、LEOPARD综合征、肢带型肌营养不良症1B型、肢带型肌营养不良症2E型、肢带型肌营养不良症2F型、肢带型肌营养不良症2M型-参见肢带型肌营养不良症、肢带型肌营养不良症2C型、肢带型肌营养不良症2D型、局限性皮肤系统性硬化症、局限性系统性硬化症、Loeys-Dietz综合征2型、Loeys-Dietz综合征4型、长QT综合征1、淋巴水肿和脑动静脉异常、淋巴细胞性血管炎、溶酶体的βA甘露糖苷贮积症(Mannosidosis,beta A,lysosomal)、McLeod神经棘红细胞增多综合征、髓母细胞瘤、MGAT2-CDG(CDG-IIa)、小头症-心肌病、线粒体脑肌病乳酸酸中毒和卒中样发作、线粒体三功能蛋白缺乏症、二尖瓣闭锁、常染色体显性家族性二尖瓣脱垂(Mitral valve prolapse,familial,autosomaldominant)、肌肉挛缩型Ehlers-Danlos综合征、肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维、强直性肌营养不良症1型、Nathalie综合征、Naxos病、新生儿卒中、神经纤维瘤病-Noonan综合征、Noonan综合征，Noonan综合征1-、2-、3-、4-、5-和6，伴生长期毛发松动的Noonan样综合征、继发孔型房间隔缺损、阵发性心室颤动、动脉导管未闭、静脉导管未闭、围产期心肌病、Petersplus综合征、PGM1-CDG、PHACE综合征、受磷蛋白Arg 14缺失、体位性心动过速综合征、原发性肉碱缺乏症、进行性家族性心脏传导阻滞1A型、进行性家族性心脏传导阻滞1B型、进行性家族性心脏传导阻滞2型、假性醛固酮减少症2型、弹性假黄瘤、肺动脉高压、肺动脉闭锁伴完整室间隔、肺动脉闭锁伴室间隔缺损、肺动脉瓣狭窄、肺静脉狭窄、肺动脉狭窄、肾功能缺乏性高血压、视网膜动脉大动脉瘤伴肺动脉瓣上狭窄、右心室发育不全、结节病、Sengers综合征、内脏反位、突发性心律失常死亡综合征、主动脉瓣上狭窄、Swyer综合征、TANGO2相关代谢性脑病和心律不齐、TARP综合征、法洛四联症、Timothy综合征、三尖瓣闭锁、Vici综合征、VLCAD缺乏症、白色额发伴畸形和Williams综合征。
(iv)总体的心血管病症和心血管疾病：
在一些实施方式中，还提供本文所公开的rAAV载体和施用方法以用于外周血管疾病，例如外周动脉闭塞性疾病(PAOD)。如本文所描述和说明的，这些方法由此用于治疗心血管病症、心脏疾病、外周血管疾病和相似的疾患。
在一些实施方式中，本文所公开的rAAV载体和施用方法用于治疗扩张型心肌病(DCM)的方法，扩张型心肌病是一种通常通过发现扩张的、收缩力低的左和/或右心室来诊断的心力衰竭。DCM可以在不存在其他特征形式的心脏疾病(例如冠状动脉闭塞或心肌梗塞史)的情况下发生。DCM与不良的心室功能和心力衰竭的症状有关。在这些患者中，心室扩张和室壁变薄一般会导致高的左心室壁张力。许多患者甚至在轻度劳累或休息时也表现出症状，并因此被表征为表现出严重(即分别为“III型”或“IV型”)的心力衰竭(参见例如，心力衰竭的NYHA分级)。如上所述，许多患有冠状动脉疾病的患者可能进展为表现出扩张型心肌病，这通常是一次或多次心脏病发作(心肌梗塞)的结果。
在一些实施方式中，本文所公开的rAAV载体和施用方法用于预防、抑制、减缓进展或至少减轻有害的左心室重构(又简称有害重构)的方法，有害的左心室重构是指心肌梗塞后的心腔扩张，其可进展为严重的心力衰竭。即使心室重构已经开始，仍然期望促进血流的增加，因为这仍然可以有效地弥补心室功能障碍。相似地，促进血管生成可以是有用的，因为微血管床的发展也能有效地弥补心室功能障碍。进一步，本文所公开的这种rAAV载体和施用方法还可以具有其他增强作用。在遭受心肌梗塞的患者中，如果患者缺少心室扩张，并且如果没有发展出心力衰竭的症状，则阻止了有害的心室重构。如果在心力衰竭的现有症状中存在任何可观察或可测量的减少，有害的心室重构得到缓解。例如，患者可能表现出较少的呼吸急促和改善的运动耐受。评估心脏功能改善和症状减轻的方法与上述用于DCM的方法基本上相似。作为改善的侧支血(collateral blood)和心室功能和/或其他机制的结果的对有害心室重构的预防或缓解被预期将在使用本文所述的方法在患者中进行体内血管生成基因的转移后数周内实现。
在另一个实例中，本文所公开的rAAV载体和施用方法使编码PP1的抑制剂、血管生成蛋白或选自表18A-表18B的治疗蛋白的转基因、转移，用于治疗与充血性心力衰竭(CHF)有关的病症。
在一个实施方式中，该疾病可以是心血管病症或心脏疾病和疾患。在一个实施方式中，该疾病可以是心力衰竭，例如充血性心力衰竭。在一个实施方式中，受试者可以具有非缺血性心肌病。
在一些实施方式中，疾病可以选自：充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、动脉粥样硬化、心肌病、特发性心肌病、心律失常、肌营养不良症、肌肉质量异常、肌肉退化、感染性心肌炎、药物或毒素诱导的肌肉异常、过敏性心肌炎、自身免疫性心内膜炎和先天性心脏疾病。
在一个实施方式中，疾病可选自：心律不齐、心脏收缩力异常、非缺血性心肌病、外周动脉闭塞性疾病和Ca2+代谢异常，及其组合。在一些实施方式中，该疾病可选自以下的组：充血性心力衰竭、心肌病、血管疾病、后天性心脏病、先天性心脏病、动脉粥样硬化、功能障碍的传导系统、功能障碍的冠状动脉、肺心病高血压。
在一些实施方式中，肌肉疾病是血管疾病。血管疾病可以是冠状动脉疾病、外周动脉疾病、脑血管疾病、肾动脉狭窄或主动脉瘤。在一些实施方式中，肌肉疾病可以是心肌病。心肌病可以是高血压心脏疾病、心力衰竭(例如充血性心力衰竭)、肺心病、心脏节律障碍、炎症心脏疾病(例如心内膜炎、炎性心脏肥大、心肌炎)、瓣膜性心脏疾病、先天性心脏疾病和风湿性心脏疾病。
在一些实施方式中，心肌病是肥厚型心肌病、致心律失常性右心室发育不良、扩张型心肌病、限制性心肌病、左心室致密化不全、Takotsubo心肌病、心肌炎和嗜酸粒细胞性心肌炎。优选地，肥厚型心肌病是CMH1(基因：MYH7)、CMH2(基因：TNNT2)、CMH3(基因：TPM1)、CMH4(基因：MYBPC3)、CMH5、CMH6(基因：PRKAG2)、CMH7(基因：TNNI3)、CMH8(基因：MYL3)、CMH9(基因：TTN)、CMH10(基因：MYL2)、CMH11(基因：ACTC1)、或CMH12(基因：CSRP3)。优选地，致心律失常性右心室发育不良是ARVD1(基因：TGFB3)、ARVD2(基因：RYR2)、ARVD3、ARVD4、ARVD5(基因：TMEM43)、ARVD6、ARVD7(基因：DES)、ARVD8(基因：DSP)、ARVD9(基因：PKP2)、ARVD10(基因：DSG2)、ARVD11(基因：DSC2)和/或ARVD12(基因：JUP)。
在另一个实例中，本文所公开的rAAV载体和施用方法可用于治疗以下的任何一种：充血性心力衰竭、非缺血性心肌病、血管疾病、后天性心脏疾病、先天性心脏疾病、动脉粥样硬化、功能障碍的传导系统、功能障碍的冠状动脉、肺心病高血压。在一些实施方式中，所述疾病选自于由以下所组成的组：充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、心肌梗塞、心肌缺血、动脉粥样硬化、心肌病、特发性心肌病、心律失常、肌营养不良症、肌肉质量异常、肌肉退化、感染性心肌炎、药物或毒素诱导的肌肉异常、过敏性心肌炎、自身免疫性心内膜炎和先天性心脏疾病。
心力衰竭，也称为充血性心力衰竭(CHF)，是在其中心脏肌肉的收缩力下降、并且心脏失去其有效地泵血的能力的疾患。据估计，仅它就影响了超过1000万美国人。心力衰竭几乎总是慢性、长期的病症，并且消耗了过度量的医疗干预和人力资源成本。特别是，心力衰竭对其它身体器官造成的后果从患者生产生活的整体减少和治疗费用的方面而言，都可以是毁灭性的。病症可能影响右侧、左侧或两侧的心脏。由于心脏的泵送作用受到损害，血液开始倒流到身体的其他区域。许多器官和器官系统开始因缺乏氧气和营养物质而遭受累积性损害。
可能存在许多潜在的原因，并且随着年龄的增长，心力衰竭变得更加常见。有问题的是，一些患有心力衰竭的患者没有明显可注意到的症状，使得严重的外周病症显现，而无用于避免或减少严重器官损伤的比例的早期干预益处。
(iv)缺血性心肌病
在一些实施方式中，在用于实质上减少心肌缺血的方法中使用本文所公开的rAAV载体和施用方法。
在一个实例中，在用于实质上减少心肌缺血的方法中使用本文所公开的rAAV载体和施用方法。
在一个实施方式中，该疾病可选自缺血、心肌梗塞(MI)、缺血性心肌病及其组合。在一些实施方式中，该疾病可选自以下的组：梗塞、组织缺血、心脏缺血、动脉粥样硬化或CAD。
心肌缺血是心脏功能障碍的一个方面，当心脏肌肉(心肌)未接收到足够的血液供应并因此被剥夺了必要水平的氧气和营养物质时，发生心肌缺血。心肌缺血可能导致各种心脏疾病，包括例如心绞痛、心脏病发作和/或充血性心力衰竭。心肌缺血最常见的原因是动脉粥样硬化(也被称为冠状动脉疾病或“CAD”)，其导致冠状动脉(向心脏肌肉提供血流的血管)堵塞。目前对心肌缺血的治疗包括药学治疗、冠状动脉搭桥手术和使用例如球囊血管成形术的技术的经皮血运重建。标准的药学治疗基于涉及增加向心脏肌肉的血液供应或减少心脏肌肉对氧气和营养物质的需求的策略。例如，增加的向心肌的血液供应可以通过药剂(例如钙通道阻断剂或硝酸甘油)来实现。这些药剂被认为是通过引起动脉壁平滑肌的松弛来增加病变动脉的直径。心脏肌肉对氧气和营养物质的需求减少可以通过如下的药剂来实现，该药剂减少心脏的血液动力学负荷(例如动脉血管扩张剂)、或减少心脏对给定的血液动力学负荷的收缩响应(例如β-肾上腺素能受体拮抗剂)。缺血性心脏疾病的手术治疗通常基于使用策略性放置的旁路移植物(通常是隐静脉或乳内动脉移植物)的病变动脉段的旁路(bypass)。经皮血运重建通常基于导管的使用来减少病变冠状动脉的变窄。在一些实施方式中，对将用本文所公开的rAAV治疗的患者联合施用硝酸甘油或硝普盐。
许多患有心脏疾病的患者(包括许多的其严重心肌缺血导致心脏病发作的患者)被诊断为患有充血性心力衰竭。充血性心力衰竭被定义为心脏功能异常导致心输出量不足以满足代谢需要(Braunwald,E.(编)，In:Heart Disease，W.B.Saunders，Philadelphia，第426页，1988)。在美国估计有5百万人患有充血性心力衰竭。一旦CHF的症状为中重度(moderately severe)，其预后比大多数癌症更糟糕，因为预期只有一半的这类患者会存活多于2年(Braunwald,E.(编)，In:Heart Disease，W.B.Saunders，Philadelphia，第471-485页，1988)。药物治疗初始可以减轻CHF的症状(例如水肿、运动不耐受和呼吸急促)，并在一些情况下延长生命。然而，即使采用药物治疗，这种疾病的预后仍然令人沮丧，并且CHF的发生率一直在增加(参见例如Baughman,K.，Cardiology Clinics 13：27-34，1995)。CHF的症状包括呼吸急促、疲劳、虚弱、腿部肿胀和运动不耐受。在身体检查中，患有心力衰竭的患者往往具有心率和呼吸速率的升高(肺中液体的标示)、水肿、颈静脉扩张、以及一般来说增大的心脏。CHF最常见的原因是动脉粥样硬化，其如上所述的导致向心脏肌肉供血的冠状动脉中的堵塞。因此，充血性心力衰竭最常见与冠状动脉疾病有关，所述冠状动脉疾病的范围或突发性非常严重，以至于其导致慢性或急性心力衰竭的发展。在这类患者中，一条或多条冠状动脉的广泛和/或突然阻塞，阻止了足够的血流到心肌，导致严重的缺血，以及在一些情况下的心肌梗塞或心脏肌肉死亡。随之而来的心肌坏死往往跟随着进行性慢性心力衰竭或急性低输出状态——这两者都与高死亡率有关。
可适于通过本文所公开的方法进行治疗的受试者可以通过诊断心肌梗塞(通常称为心脏病发作)的任何方法来鉴别。诊断这些病症的方法是本领域普通技术人员所熟知的。作为非限制性的实例，心肌梗塞可以通过以下方法进行诊断：(i)血液测试以检测肌酸磷酸激酶(CPK)、天冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)和心肌梗塞期间释放的其他酶的水平；(ii)心电图(ECG或EKG)，其是在纸上或电脑显示器上的心脏活动的图形记录。ECG在检测疾病和/或损伤中可以是有益的；(iii)超声心动图(心脏超声)用于调查先天性心脏疾病以及评估心脏壁的异常(包括心脏壁、瓣膜和血管的功能异常)；(iv)多普勒超声可用于测量穿过心脏瓣膜的血流；(v)核医学成像(在本领域也被称为放射性核素扫描)使得器官的解剖和功能可视化，并可用于检测冠状动脉疾病、心肌梗塞、瓣膜疾病、心脏移植排斥，检查搭桥手术的有效性，或选择进行血管形成术或冠状动脉旁路移植的患者。
患有充血性心力衰竭的大多数患者往往形成扩大的、收缩不良的心脏(被称为“扩张型心肌病”(或DCM，如本文所使用的)的病症)。DCM是通常通过发现扩张的、低收缩性的左和/或右心室来诊断的心脏病症。另一方面，在大多数情况下，与扩张的心脏相关的充血性心力衰竭是冠状动脉疾病的结果，往往严重到其造成一个或多个心肌梗塞。然而，在显著少数的情况中，DCM可以在不存在冠状动脉疾病(例如动脉粥样硬化)特征的情况下发生。在一些扩张型心肌病与CAD无关的情况中，DCM的原因是已知的或可疑的。实例包括家族性心肌病(例如与进行性肌营养不良症、强直性肌营养不良症、Freidrich共济失调和遗传性扩张型心肌病有关)、导致心肌炎症的感染(例如由各种病毒、细菌和其他寄生虫引起的感染)、非感染性炎症(例如由自身免疫性疾病导致的非感染性炎症、围产期心肌病、超敏反应或移植排斥)、引发心肌炎的代谢紊乱(包括营养、内分泌和电解质异常)，以及暴露于毒剂而导致的心肌炎(包括酒精以及某些化疗药物和儿茶酚胺)。然而，在大多数非CAD的DCM病例中，疾病的原因仍然未知，并因此这种病症被称为“特发性扩张型心肌病”(或“IDCM”)。尽管潜在的诱因可能不同，患有严重的CHF的大多数患者具有扩大的、薄壁的心脏(即DCM)，并且这些患者的大多数表现出心肌缺血(即使其中一些可能没有表面上的动脉粥样硬化)。此外，患有DCM的患者可以经受心绞痛，即使他们可能没有严重的冠状动脉疾病。
使与CHF相关的生理状态进一步复杂化的是各种自然适应，所述自然适应往往发生在具有功能障碍的心脏的患者中。虽然这些自然反应最初可以改善心脏功能，但它们通常导致其他问题，其能够使疾病恶化、挫败治疗、并对生存产生不利影响。在CHF患者中通常观察到三种这样的适应性应答：(i)钠重吸收的变化引起的容积保留，其扩大了血浆容积，并初始改善了心输出量；(ii)心脏扩大(来自扩张和肥厚)，其能够增加每搏输出量(strokevolume)，同时保持相对正常的壁张力；以及(iii)从肾上腺素能神经末梢释放的增加的去甲肾上腺素冲击心脏，其通过与心脏β-肾上腺素能受体相互作用，往往增加心率和收缩力，从而增加心脏输出。然而，由于各种原因，这三种自然适应的每一种都往往最终失败。特别是，液体潴留往往导致水肿和损害呼吸的肺部滞留液体。心脏扩大可导致有害的左心室重构，伴随之后的严重扩张和室壁张力增加，从而使CHF恶化。最后，心脏长期暴露于去甲肾上腺素往往使心脏对肾上腺素能刺激没有反应，并且与预后不良相关联。
外周血管系统的疾病(例如心脏疾病)通常是由流向组织(例如骨骼肌)的受限血流导致的，其(像心脏疾病一样)变得缺血，特别是当代谢需求增加时(例如伴随运动)。因此，存在于外周血管中的动脉粥样硬化可能导致由受影响的血管供应的组织缺血。这个问题被称为外周动脉闭塞性疾病(PAOD)，最经常影响患者的下肢。与其他形式的心血管疾病一样，这个病症或至少其部分症状可以通过使用药物(例如阿司匹林或降低血液粘度的其他药剂)、或通过手术干预(例如动脉移植、脂肪斑块沉积的外科手术去除)或通过血管内治疗(例如血管成形术)来治疗。虽然症状可得到改善，这种治疗的有效性通常不充分，原因与上面提到的相似。
II.施用方法
本文所述技术的一个方面涉及施用rAAV载体的方法，其中，该方法是向受试者单次施用总剂量的rAAV，其中，单次施用包括在单次施用内被分成至少2个、或3个、或4个、或5个以上的子剂量的总剂量rAAV递送。也就是说——换句话说，在一些实施方式中，该方法包括以单次施用向受试者施用rAAV载体的推注，其中，推注的单次施用包括施用来自至少2剂、或3剂、或4、剂或5剂的rAAV，并且在一些实施方式中，所述剂可以来自2个、3个、4个、5个、或6个或更多的小瓶或注射器，其中，从每个小瓶或注射器递送rAAV花费1-5分钟、或多于5分钟。在本文所述技术的其他方面，涉及施用rAAV载体的方法，其中，该方法包括向受试者施用至少一次、或施用多于一次的rAAV。在该实施方式的一些方面，施用rAAV载体的方法包括向受试者施用两次、施用三次、施用四次、或施用五次rAAV，其中，每次施用包括递送被分为至少2个、或3个、或4个、或5个、或更多子剂量的总剂量的rAAV。
在一些实施方式中，施用AAV载体的方法是单次注射，其在单次注射中包括AAV载体的递送的离散脉冲。也就是说，在单次注射施用中，rAAV的递送被分为多个时间上间隔开的子施用。例如，单次施用可以是分为至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个或更多子剂量(“SD”)的rAAV的总量(或总剂量，也称为“TD”)，其中每个子剂量在子施用中进行施用，其中每个子施用在时间上间隔开预先确定的一段时间，例如，在每个子剂量的每个子施用之间至少1分钟、或至少2分钟、或至少3分钟、或至少4分钟、或至少5分钟、或至少6分钟、或至少7分钟、或至少8分钟、或至少9分钟、或至少10分钟或多于10分钟。例如，总剂量的rAAV的单次施用可以包括一系列脉冲式的子剂量，并且在子施用(即单次施用的脉冲)中注射每个子剂量。
不受理论的限制，示例性的施用方法包括单次施用约1013vg至约1015vg之间的总剂量(TD)的rAAV载体的施用，其可分为至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个以上的子剂量(SD)，其中，所述子剂量以至少5秒、或至少10秒、或至少20秒、或至少30秒、或至少40秒、或至少50秒、或至少1分钟、或至少2分钟、或至少3分钟、或至少4分钟、或至少5分钟、或至少6分钟、或至少7分钟、或至少8分钟、或至少9分钟、或至少10或超过10分钟的间隔施用至受试者，其中，总的rAAV剂量的所有子剂量的施用花费约10分钟至约30分钟之间、或约10分钟至约20分钟之间、或约15分钟至约25分钟之间、或约15分钟至约30分钟之间、或约25分钟至约30分钟之间、或约20分钟至约40分钟之间、或约40分钟至约60分钟之间、或多于60分钟，并且其中，每个子剂量在1分钟、或约2分钟、或约3分钟、或约4分钟、或约5分钟、或约6分钟、或约7分钟、或约8分钟、或约9分钟、或约10分钟或更长的一段时间内施用。在一些实施方式中，其中，总的rAAV剂量的施用进行了约10分钟、或约15分钟、或约20分钟、或约25分钟、或约30分钟、或约35分钟、或约40分钟、或约45分钟、或约50分钟、或约60分钟或更长。在某些实施方式中，总的rAAV剂量的施用进行了约20分钟至约30分钟。在实施方式的某些方面，rAAV选自于由以下所组成的组：AAV2、AAV6、AAV8、AAV9、AAV2i8、rh10、AAV2.5和AAV2G9。在实施方式的一些方面，在总共五个子剂量(例如，五个注射器)的每一个中，rAAV施用进行了1至5分钟，其中，每个子剂量具有8mL、或9mL、或10mL、或12mL、或15mL、或20mL、或25mL或更多体积的稀释液。在实施方式的某些方面，rAAV施用的总体积为20mL、或25mL、或30mL、或35mL、或40mL、或45mL、或50mL、或60mL、或70mL、或80mL、或90mL、或100mL或更多。不受任何理论的限制，稀释剂可以是盐水、或不同比率的盐水-血液混合物。在实施方式的一些方面，施用的rAAV包含编码磷酸酶抑制剂蛋白(例如I-1或其变体，例如I-1c)的核酸、以及选自CMV启动子或选自表18A或表18B的合成启动子或其变体的启动子。在实施方式的所有方面，rAAV包含自互补(sc)基因组。
在一些实施方式中，在单次施用的rAAV载体的总剂量(TD)被分为至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个或更多的子剂量(SD)的情况下，每个子剂量可以在预先确定的时间段内施用或注射到受试者中，所述预先确定的时间段例如至少1分钟、或至少2分钟、或至少3分钟、或至少4分钟、或至少5分钟、或至少6分钟、或至少7分钟、或至少8分钟、或至少9分钟、或至少10分钟或多于10分钟，并且其中在每个子剂量的施用之间存在至少1分钟、或至少2分钟、或至少3分钟、或至少4分钟、或至少5分钟、或至少6分钟、或至少7分钟、或至少8分钟、或至少9分钟、或至少10分钟或多于10分钟的间隔。在一些实施方式中，每个子剂量在1-5分钟的时间段内施用。在一些实施方式中，子剂量之间的时间间隔可以是一致的(例如，各子剂量之间的时间相同)、或可以不同。例如，在示例性的施用方法中，其中rAAV载体的总剂量(TD)被分为5个子剂量(sd1、sd2、sd3、sd4、sd5)，sd1和sd2的施用之间的间隔可以是例如至少2分钟，并且在sd2和sd3的施用之间的间隔可以是例如5分钟。
在一些实施方式中，rAAV的子剂量是以推注计或在分别的小瓶或分别的注射器中。
在一些实施方式中，rAAV载体的单次施用与额外的药剂或治疗剂共同施用。在一些实施方式中，该额外的药剂是本文所公开的免疫调节剂。在一些实施方式中，额外的药剂在单次注射完全的rAAV剂量之前、或之后、或这两者(之前和之后)施用。在一些实施方式中，在rAAV的子剂量之间的间隔中向受试者施用额外的药剂(例如，免疫调节剂)，即——例如，在示例性的施用方法中，其中rAAV载体的总剂量(TD)被分为5个子剂量(sd1、sd2、sd3、sd4、sd5)，所述额外的药剂(例如免疫调节剂)可以在以下任何一个或多个之间施用：sd1和sd2之间、sd2和sd3之间、sd3和sd4之间、sd4和sd5之间。在一些实施方式中，所述额外的药剂(例如免疫调节剂)存在于rAAV的子剂量中。
在一些实施方式中，rAAV的总剂量选自以下任何一种：约1011vg、约3×1011vg、约5×1011vg、约1012vg、约3×1012vg、约5×1012vg、约1013vg、约3×1013vg、约1014vg、3×1014vg、或约1015vg、或多于约1015vg。在一些实施方式中，rAAV的总剂量在约1013vg至约1015vg之间。在一些实施方式中，施用至少一个、或至少两个或至少三个或更多的rAAV总剂量。在一些实施方式中，每个子剂量的rAAV在约1011vg至约1015vg之间。在某些实施方式中，每个子剂量的rAAV在约1013vg至约1015vg之间。在一个实施方式中，rAAV的每个子剂量选自以下任何一种：约1011vg、约3×1011vg、约5×1011vg、约1012vg、约3×1012vg、约5×1012vg、约1013vg、约3×1013vg、约1014vg、3×1014vg、或约1015vg、或多于约1015vg。
在一些实施方式中，在总共5个子剂量(例如，在总共5个注射器的每一个中，其中，每个子剂量具有10mL体积(例如盐水))的每一个中，所述rAAV施用进行1至5分钟。在某些实施方式中，在总共五个注射器的每一个中，所述rAAV施用进行1至5分钟，其中，每个注射器具有8mL、或9mL、或10mL、或12mL、或15mL、或20mL、或25mL或更多体积的稀释剂。稀释剂是盐水或不同比率的盐水-血液混合物。在某些实施方式中，rAAV施用的总体积为20mL、或25mL、或30mL、或35mL、或40mL、或45mL、或50mL、或60mL、或70mL、或80mL、或90mL、或100mL或更多。在一些实施方式中，所述rAAV施用以1个注射器、或2个注射器、或3个注射器、或4个注射器、或5个注射器、或6个注射器、或7个注射器、或8个注射器或更多注射器进行。每个注射器中的rAAV子剂量在1分钟、或2分钟、或3分钟、或4分钟、或5分钟、或6分钟、或7分钟、或8分钟、或9分钟、或10分钟、或更长的时间段内施用。在一些实施方式中，所述方法包括全身性地施用rAAV载体。全身性的施用可以是肠内的(例如口服、舌下含服和直肠)或胃肠外的(例如注射)。优选的注射途径包括静脉内、肌内、皮下、动脉内、关节内、鞘内和皮内注射。在一个实施方式中，可以通过注射到心脏组织中来递送基因治疗载体。
在一些实施方式中，包含根据本发明的合成的心脏特异性启动子或表达盒的AAV载体或病毒粒子的施用是血管内的。合适地，可在手背静脉或前臂前部静脉中施用包含根据本发明的合成的心脏特异性启动子或表达盒的AAV载体或病毒粒子。前臂前部中的合适静脉是头静脉、正中静脉或贵要静脉。这是因为这种施用途径对患者来说通常是安全的。
在一些实施方式中，将rAAV载体直接注射到心脏组织中。美国Ser.No.10/914,829描述了用于直接注射的方案。将病毒载体直接注射或应用到心肌中可以将经转移的基因的表达限制到心脏(Gutzman等，1993，Cric.Res.73：1202-7；French等，1994，Circulation.90：2414-24)。
在一些实施方式中，将rAAV载体引入到一个或多个冠状动脉的腔中。可以限制血液从冠状动脉流出。包含rAAV载体的制剂可以顺行递送，并允许其在动脉中停留1至5分钟之间(例如1至3分钟之间)。可通过相似的方法递送非病毒赋形剂。
在一些实施方式中，可以通过标准方法向受试者施用rAAV载体。例如，可以通过多种不同途径的任何一种施用药剂，所述多种不同途径包括静脉内(全身性的)、皮内、皮下、口服(例如吸入或摄入)、经皮(局部)、经粘膜、或通过导管、或通过注射器、或通过导管和注射器的组合。在一个实施方式中，通过注射(例如动脉内、肌内或静脉内)施用药剂。
在一些实施方式中，通过受试者心脏的冠状血管的血流受到限制，并且将本文所公开的rAAV载体引入到受试者的冠状动脉腔内。在又一个实施方式中，在冠状静脉流出受到限制的同时，心脏正在泵送。在又一个实施方式中，通过冠状血管的血流被完全限制。受限的冠状血管可以包括但不限于：左前降支动脉(LAD)、远端旋动脉(LCX)、冠状大静脉(GCV)、心脏中静脉(MCV)、或前室间静脉(AIV)。在又一个实施方式中，本文所公开的rAAV载体的引入发生在冠状血管的缺血预处理之后。在又一个实施方式中，在限制主动脉血液流出心脏的同时，将本文所公开的rAAV载体注射入受试者的心脏，从而使核酸分子流入心脏中。
在根据本发明的方法的一些实施方式中，施用本文所公开的rAAV载体包括以下步骤：限制主动脉血液流出心脏，使得血流重新导向至冠状动脉；将核酸分子注射到心脏、主动脉或冠状动脉口的腔内，以向冠状动脉提供核酸分子；在限制流出心脏的主动脉血流的同时使心脏泵送；以及重新建立主动脉血流。在又一个实施方式中，用导管将本文所公开的rAAV载体注射到心脏中。在又一个实施方式中，将本文所公开的rAAV载体直接注射到心脏的肌肉中。
在一些实施方式中，可以将如本文所公开的rAAV载体注射到受影响的血管(例如动脉)或器官(例如心脏)。在一个治疗方法的实施方式中，通过心脏冠状血管的血液流动受到限制，并且将如本文所公开的rAAV载体引入到冠状动脉的腔中。在具体的实施方式中，在限制冠状静脉流出的同时允许心脏泵送。在另一个具体的实施方式中，在限制主动脉血液流出心脏的同时，将本文所公开的rAAV载体注射入心脏，从而使得病毒递送系统能够流入并被递送至心脏。在其他实施方式中，通过冠状血管的血流被完全限制，并且在具体的这种实施方式中，受到限制的冠状血管包括：左前降支动脉(LAD)、远端旋动脉(LCX)、冠状大静脉(GCV)、心脏中静脉(MCV)或前室间静脉(AIV)。在某些实施方式中，本文所公开的rAAV载体的引入发生在冠状血管的缺血预处理之后。
在一些实施方式中，通过包括以下步骤的方法将本文所公开的rAAV载体注射到心脏中：限制主动脉血液流出心脏，使得血流重新导向至冠状动脉；将载体注射到心脏、主动脉或冠状动脉口的腔中，使得载体流入冠状动脉；在限制主动脉血流流出心脏的同时允许心脏泵送；以及重新建立主动脉血流。在更具体的实施方式中，用导管将本文所公开的rAAV载体注射入心脏，并且在甚至更具体的实施方式中，将本文所公开的rAAV载体直接注射入心脏肌肉中。
在一些实施方式中，递送方法包括限制血液流至冠状大静脉(GCV)、心脏中静脉(MCV)或前室间静脉(AIV)中的一个或多个。在一些实施方式中，在对左前降支动脉(LAD)和/或远端旋动脉(LCX)进行缺血预处理之后，将本文所公开的rAAV载体引入冠状动脉的腔内。在一些实施方式中，用导管将本文所公开的rAAV载体引入冠状动脉的腔内，例如远端旋动脉(LCX)或冠状血管(例如左前降支动脉(LAD))。在一些实施方式中，冠状动脉是左前降支动脉(LAD)或远端旋动脉(LCX)。
在一些实施方式中，本文所公开的AAV载体或病毒粒子可与一种或多种额外的治疗剂或者与被设计为防止载体被网状内皮系统清除的一种或多种饱和剂(saturatingagent)同时或依次施用，例如，可与本文所公开的一种或多种免疫调节剂一起施用。
在一些实施方式中，当载体是AAV载体时，载体的剂量可以是1×1010gc/kg至1×1015gc/kg或更多，适当地从1×1012gc/kg至1×1014gc/kg，适当地从5×1012gc/kg至5×1013gc/kg。在一些实施方式中，病毒载体的量在1×1011和1×1016斑块形成单位(pfu)之间。
一般来说，有需要的受试者将是哺乳动物，并且优选灵长类动物，更优选人类。通常，有需要的受试者将显示出心血管病症的症状特征，例如心脏疾病或心力衰竭。该方法通常包括通过表达治疗量的治疗产品来改善有需要的受试者所表现的症状。
本发明还提供了对有需要的受试者(优选人类)进行基因治疗的方法，该方法包括：向受试者施用(适当地引入受试者的心脏中)本发明的合成的心脏特异性表达盒、载体、病毒粒子或药物组合物，其包含编码PP1抑制剂的基因、或血管生成蛋白或肽、或本文表4A-表4B中公开的任何蛋白质。
该方法适当地包括在所述受试者的心脏组织中表达治疗量的PP1抑制剂。在本文中讨论了可以治疗的各种病症和疾病。在本文中讨论了编码合适的治疗产品的基因，并且包括但不限于表4A-表4B中公开的那些。
用于在体外和在体内于靶细胞中表达治疗性基因的基因治疗方案在本领域中是众所周知的，并在此将不作详细讨论。简而言之，它们包括质粒DNA载体(裸的或处于脂质体中)或病毒载体的静脉内或动脉内施用(例如颈动脉内、肝动脉内、肝静脉内)、脑室内、颅内施用、肌内注射、间质注射、气道内灌注、应用于内皮和肝实质内。已经开发了各种装置来增强DNA对靶细胞而言的可用性。简单的方法是用含有相关载体的导管或可植入材料与靶细胞进行物理接触，而更复杂的方法可以使用喷射式注射装置等。可以使用离体和体内程序实施向哺乳动物心脏细胞中的基因转移。离体方法通常需要收获心脏细胞(例如心肌细胞)，用合适的表达载体进行体外转导，然后将经转导的心肌细胞重新引入心脏。由于收获和重新将心肌细胞引入心脏的难度和危险，这种方法通常是不太优选的。体内基因转移已经通过将DNA或病毒载体直接注射入心脏(例如通过颅内注射，或通过病毒载体的静脉内或动脉内注射)来实现。
在一个实施方式中，可将基因治疗载体以治疗有效量向受试者(例如，向受试者的心脏)施用，以减少受试者的心力衰竭或心脏疾患的症状(例如，使用已知评价方法来确定)。
重复施用
在本发明的一些方面，使用心脏特异性合成启动子、或表2A、表5A或表13A中列出的在心脏细胞中活化的骨骼肌特异性合成启动子在心脏细胞中提供活性以及肝脏去靶向(detargetingE)的作用。
在一些实施方式中，本发明提供了包括两次施用的重复给药方法，其中，重复给药包括在心脏细胞中具有活性的肝脏去靶向AAV病毒粒子的一次施用，以及未在先前施用中使用的任何其他AAV病毒粒子的另一次施用，其中，在一次施用中，AAV病毒粒子包含编码磷酸酶抑制剂(I-1)的核酸，其中该核酸可操作地连接至选自CMV、CK7、肌球蛋白、CBA、CK8内含子、JET启动子等的组中的启动子，其中，在另一次施用中，所述AAV病毒粒子包含编码磷酸酶抑制剂的核酸，其中该核酸可操作地连接至选自表2A的心脏特异性启动子或其变体、或选自表5A的在心脏和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子或其变体、或选自表13A的在心脏和骨骼肌中活化的缩短的肌肉特异性启动子或其变体，并且其中，在一次施用中，AAV病毒粒子包含与先前施用不同的AAV衣壳。在一些实施方式中，I-1包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65或其功能片段，其中SEQ ID NO：1第35位的苏氨酸被天冬氨酸(T35D)替换。在一些实施方式中，编码磷酸酶抑制剂的核酸编码l-1(I-1c)的组成型活化的片段，包含SEQ ID NO：1的片段，其中，该片段选自：SEQ ID NO：1的氨基酸1-54、SEQ ID NO：1的氨基酸1-61、SEQ IDNO：1的氨基酸1-65、SEQ ID NO：1的氨基酸1-66、SEQ ID NO：1的氨基酸l-67或SEQ ID NO：1的氨基酸1-77，或其功能变体，其中，在SEQ ID NO：1第35位的苏氨酸被天冬氨酸替换(T35D)。在一些实施方式中，编码多肽的核酸序列包含至少SEQ ID NO：1的氨基酸1-54，其中，SEQ ID NO：1第35位的苏氨酸被天冬氨酸替换。
在不被解释为任何限制的情况下，重复给药(施用)方法的实例包括第一次和第二次施用，其中，在第一次施用中，包含编码本文所述的磷酸酶抑制剂(I-1)多肽的核酸的AAV2i8(或BNP116)载体被用于施用给具有充血性心力衰竭的受试者，并且其中该核酸可操作地与CMV启动子连接，在第二次施用中，包含编码本文所述的磷酸酶抑制剂多肽(I-1)的核酸的重组AAV2/9载体被用于施用给所述受试者，并且其中核酸可操作地与选自以下的组中的合成启动子连接：SP0173、SP0320、SP0279、SP0134、SP0057、SP0229、SP0067、SP0310、SP0311、SP0267或其变体。
在一些实施方式中，包含选自表2A的心脏特异性启动子或其变体、或选自表5A的在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子或其变体、或选自表13A的在心肌和骨骼肌中活化的缩短的肌肉特异性启动子或其变体的rAAV载体允许有效地重复施用rAAV载体以治疗心脏疾病(例如充血性心力衰竭)，其使用具有不同于先前施用的任何AAV衣壳的rAAV病毒粒子，并且其中，该rAAV包含编码磷酸酶抑制剂(I-1)的核酸，该核酸可操作地连接至所述启动子。在一些实施方式中，包含选自表2A的心脏特异性启动子或其变体、或选自表5A的在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子或其变体、或选自表13A的在心肌和骨骼肌中活化的缩短的肌肉特异性启动子或其变体的rAAV允许有效地重复施用rAAV载体以治疗心脏疾病(例如，充血性心力衰竭)，其使用具有不同于先前施用的任何AAV衣壳的rAAV病毒粒子，其中，rAAV包含编码磷酸酶抑制剂(I-1)的核酸，所述核酸可操作地连接至所述启动子，并且其中，所述rAAV为约1×1011vg/mL至约1×1013vg/mL。在一些实施方式中，包含选自表2A的心脏特异性启动子或其变体、或选自表5A的在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子或其变体、或选自表13A的在心肌和骨骼肌中活化的缩短的肌肉特异性启动子或其变体的rAAV允许有效地重复施用rAAV载体来治疗心脏疾病(例如充血性心力衰竭)，其使用具有不同于先前施用的任何AAV衣壳的rAAV病毒粒子，其中，所述rAAV包含编码磷酸酶抑制剂(I-1)的核酸，其可操作地连接至所述启动子，并且其中，至少一个总剂量的rAAV为约1011vg至约1015vg。在一些实施方式中，至少一个总剂量的rAAV为约1011vg至约1014vg。在一些实施方式中，至少一个总剂量的rAAV为1012vg、或1013vg、或3×1013vg、或1014vg、或3×1014vg。例如，SP0173、SP0320、SP0279、SP0134、SP0057、SP0229、SP0067、SP0310、SP0311或SP0267允许使用具有不同于先前施用的任何AAV衣壳的rAAV病毒粒子(即具有不同免疫谱(immuneprofile)的AAV衣壳)来有效地重复施用rAAV载体以治疗心脏疾病(例如充血性心力衰竭)。
(i)免疫调节剂：
在一些实施方式中，如本文所述的治疗心力衰竭的方法和组合物进一步包括施用免疫调节剂。在一些实施方式中，免疫调节剂可以在rAAV载体施用时、rAAV载体施用前、或rAAV载体施用后施用。
在一些实施方式中，免疫调节剂是免疫球蛋白降解酶，例如IdeS、IdeZ、IdeS/Z、Endo S、或它们的功能变体。这种免疫球蛋白降解酶及其用途的参考的非限制性实例在US7,666,582、US8,133,483、US20180037962、US20180023070、US20170209550、US8,889,128、WO2010057626、US9,707,279、US8,323,908、US20190345533、US20190262434、以及WO2020016318中描述，其各自通过引用以其整体并入。
在一些实施方式中，免疫调节剂是蛋白酶体抑制剂。在某些方面，蛋白酶体抑制剂是硼替佐米。在实施方式的一些方面，免疫调节剂包括硼替佐米和抗CD20抗体(利妥昔单抗)。在实施方式的其他方面，免疫调节剂包括硼替佐米、利妥昔单抗、甲氨蝶呤和进入静脉的丙种球蛋白(intravenous gamma globulin)。公开了蛋白酶体抑制剂和它们与利妥昔单抗、甲氨蝶呤和进入静脉的丙种球蛋白的组合的此类参考文献的非限制性实例如在US10,028,993、US9,592,247和US8,809,282中所述，各自通过引用以其整体并入。
在替代性的实施方式中，免疫调节剂是NF-kB通路的抑制剂。在实施方式的某些方面，免疫调节剂是雷帕霉素或功能变体。公开雷帕霉素及其用途的参考文献的非限制性实例在US10,071,114、US20160067228、US20160074531、US20160074532、US20190076458、US10,046,064中描述，以其整体并入。在实施方式的其他方面，免疫调节剂是包含免疫抑制剂的合成纳米运载体。免疫抑制剂、与合成纳米运载体偶联的免疫抑制剂、包含雷帕霉素的合成纳米运载体和/或致耐受性的合成纳米运载体，它们的剂量、施用和使用的参考文献的非限制性的实例在US20150320728、US20180193482、US20190142974、US20150328333、US20160243253、US10,039,822、US20190076522、US20160022650、US10,441,651、US10,420,835、US20150320870、US2014035636、US10,434,088、US10,335,395、US20200069659、US10,357,483、US20140335186、US10,668,053、US10,357,482、US20160128986、US20160128987、US20200038462、US20200038463中描述，各自通过引用以其整体并入。
在一些实施方式中，免疫调节剂是包含雷帕霉素的合成纳米运载体(ImmTORTM纳米颗粒)(Kishimoto等，2016，Nat Nanotechnol，11(10)：890-899；Maldonado等，2015，PNAS，112(2)：E156-165)，如US20200038463、美国专利9,006,254中所公开的，各自以其整体并入本文。在一些实施方式中，免疫调节剂是经工程化的细胞，例如，使用WO2017192786中公开的SQZ技术修饰的免疫细胞，其通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方式中，免疫调节剂选自于由以下所组成的组：聚ICLC、1018ISS、铝盐、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、Juvlmmune、LipoVac、MF59、单磷酰脂质A、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、PEPTEL、载体系统、PLGA微颗粒、resiquimod、SRL172、病毒小体(Virosomes)和其他病毒样颗粒、YF-17D、VEGF trap、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys和Aquila’s QS21 stimulon。在另一个进一步的实施方式中，免疫调节剂或佐剂是聚ICLC。
在一些实施方式中，免疫调节剂是抑制细胞中的先天性免疫应答的小分子，例如氯喹(TLR信号传导抑制剂)和2-氨基嘌呤(PKR抑制剂)，其也可以与包含本文所公开的至少一种rAAV的组合物联合施用。可商购得到的TLR信号传导抑制剂的一些非限制性实例包括BX795、氯喹、CLI-095、OxPAPC、多粘菌素B和雷帕霉素(均可从INVIVOGENTM购买获得)。此外，模式识别受体(PRR)(其参与先天性免疫信号传导)的抑制剂(例如2-氨基嘌呤、BX795、氯喹和H-89)也可在包含本文所公开的至少一个rAAV载体的组合物和方法中使用，用于本文所公开的体内蛋白表达。
在一些实施方式中，rAAV载体还可以编码先天免疫的负调控因子(例如NLRX1)。因此，在一些实施方式中，rAAV载体还可以任选地编码NLRX1、NS1、NS3/4A或A46R中的一个或多个或任何组合。此外，在一些实施方式中，包含本文所公开的至少一个rAAV载体的组合物还可以包含编码先天性免疫系统抑制剂的合成的、经修饰的RNA，以避免由组织或受试者产生的先天性免疫应答。
在一些实施方式中，在本文所公开的施用方法中使用的免疫调节剂是免疫抑制剂。如本文所使用的，术语“免疫抑制药物或药剂”旨在包括抑制或干扰正常免疫功能的药物制剂。适用于本文所公开的方法的免疫抑制剂的实例包括抑制T细胞/B细胞共刺激通路的药剂，例如干扰T细胞和B细胞经由CTLA4和B7通路耦合的药剂，如在美国专利公开号2002/0182211中所公开的药剂。在一个实施方式中，免疫抑制剂是环孢霉素A。其它实例包括霉酚酸吗啉乙酯(myophenylate mofetil)、雷帕霉素(rapamicin)和抗胸腺细胞球蛋白。在一个实施方式中，免疫抑制药物在包含本文所公开的至少一个rAAV载体的组合物中被施用；或者可以以单独的组合物被施用，但与根据本文所公开的施用方法的包含至少一个rAAV载体的组合物同时、或者在其施用之前或之后施用。在制剂中施用免疫抑制药物，所述制剂与施用途径相容，并以足以达到期望治疗效果的剂量施用给受试者。在一些实施方式中，免疫抑制药物被瞬时施用至足够的时间以诱导对本文所公开的rAAV载体的耐受。
在本文所公开的方法和组合物的任何实施方式中，被施用本文所公开的rAAV载体或rAAV基因组的受试者也被施用免疫抑制剂。已知有多种方法引起被施用AAV的患者的免疫应答的免疫抑制。本领域已知的方法包括向患者施用免疫抑制剂，例如蛋白酶体抑制剂。本领域已知的一种此类蛋白酶体抑制剂(例如在美国专利号9,169,492和美国专利申请号15/796,137中所公开的，两者通过引用并入本文)是硼替佐米。在一些实施方式中，免疫抑制剂可以是抗体，包括多克隆、单克隆、scfv或能够抑制免疫应答(例如，通过消除或抑制抗体产生细胞)的其他抗体衍生分子。在进一步的实施方式中，免疫抑制元件可以是短发夹RNA(shRNA)。在这样的实施方式中，shRNA的编码区被包括在rAAV盒中，并且一般位于下游(poly-A尾的3’)。该shRNA可以被靶向以减少或消除免疫刺激剂(例如细胞因子、生长因子(包括转化生长因子β1和β2、TNF和公众已知的其他免疫刺激剂))的表达。
这种免疫调节剂的使用促进了人在数月和/或数年内使用多次给药(例如，多次施用)的能力。这允许使用下面讨论的多种药剂(例如编码多种基因的rAAV载体)，或对受试者多次施用。
(ii)血管扩张剂
在一些实施方式中，如本文所述的治疗心力衰竭的方法和组合物进一步包括施用血管扩张剂。在一些实施方式中，血管扩张剂可以在rAAV载体施用时(即，与rAAV施用同时或基本同时)、rAAV载体施用前、或rAAV载体施用后施用。血管扩张剂可以通过扩大(扩张)血管来帮助rAAV载体的递送。在一些实施方式中，血管扩张剂在rAAV载体施用前至少约1分钟、至少约5分钟、至少约10分钟、至少约15分钟、至少约20分钟、至少约25分钟、至少约30分钟、至少约35分钟、至少约40分钟、或多于40分钟前施用。
在一些实施方式中，rAAV载体可以与选自以下任何的至少一种血管扩张剂一起施用：二硝酸异山梨酯
Figure BDA0004161819920000851
奈西立肽
Figure BDA0004161819920000853
肼苯哒嗪
Figure BDA0004161819920000852
硝酸盐药物、米诺地尔、4CAPTOPRILTM、硝基血管扩张剂(硝酸甘油、单硝酸异山梨酯、二硝酸异山梨酯和硝普钠、serelaxin、内皮素拮抗剂(例如，内皮素-1(ET-1)拮抗剂(例如tezosentan))；其它利尿钠肽(例如Ularitide、CD-NP)、松弛素、Cenderitide、氯维地平(Clevidipine)、TRV120027、Cinaciguat、BAY 1021189、BAY 28-2667(N)和血红素非依赖性可溶性G蛋白激活剂)、1021189CXL-1020、腺苷阻断剂、吸入性肺血管扩张剂(iPVD)(例如iNO或吸入性依前列醇)；血管扩张性正性肌力药(milrinone、多巴酚丁胺(dobutamine))、[Pyr1]apelin-13(参见例如El Mathari,B等“Apelin improves cardiac functionmainly through peripheral vasodilation in a mouse model of dilatedcardiomyopathy.”Peptides 142(2021)：170568)。血管扩张剂是本领域技术人员所熟知的，并且被包含用于本文所公开的方法和组合物中。用于本文所公开的方法中的一些血管扩张剂在以下参考文献中公开：Holt等，Vasodilator Therapies in the Treatment ofAcute Heart Failure.Curr Heart Fail Rep.2019年2月；16(1)：32-37，Travessa AM，Menezes
Figure BDA0004161819920000854
L.Vasodilators in acute heart failure-evidence based on newstudies.Eur J Intern Med.2018年5月；51：1-10，等，Levy等，“Vasodilators in acuteheart failure:review of the latest studies.”Current emergency and hospitalmedicine reports 2.2(2014)：126-132；Levy等，2014；Vasodilators in acute heartfailure:review of the latest studies.Current emergency and hospital medicinereports，2(2)，126-132；Kumar等，“New drugs you are going to read about:serelaxin,ularitide,TRV027”.Current emergency and hospital medicine reports3.2(2015)：66-73；Ibrahim N.E.，等(2021)Diagnosis and Management of Acute HeartFailure.In:Gaggin H.K.，Januzzi Jr.J.L.(编)MGH Cardiology BoardReview.Springer，Cham.，各自通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方式中，rAAV可与血管活性剂、或血管渗透剂(vasculaturepermeability agent)一起随着血管扩张剂施用。在一些实施方式中，rAAV可以仅与血管活性剂或血管渗透剂一起施用。在一些实施方式中，在不同时间共同施用血管活性剂和血管扩张剂。示例性的血管活性剂或血管渗透剂可以是但不限于：组胺、组胺激动剂、血管内皮生长因子蛋白(VEGF蛋白)、血清素、缓激肽、血小板活化因子(PAF)、前列腺素E1(PGE1)、封闭带毒素(zona occludens toxin，ZOT)、白细胞介素2、缓激肽，在国际公开号WO1999040945A3、美国专利号6,855,701中描述的其它血浆激肽，所有这些都通过引用以其整体并入本文。
III.示例性的用于施用的rAAV和rAAV基因组元件
a.调控蛋白磷酸酶性的药剂
蛋白磷酸化的增加和心脏功能的增强被蛋白磷酸酶以高效和高度调控的过程逆转。主要的两类丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(被称为1型和2型磷酸酶)调控心肌收缩性能(Neumann,J.等，1997J Mol Cell Cardiol；29(1)：265-72)。蛋白磷酸酶1(“PP1”)占了显著量的心脏酶活性，并被认为是调控性磷酸酶的关键种类。PP1在很大程度上与膜分数(membrane fraction)以及糖原颗粒相关，并且在糖原分解和糖原合成中重要。它通过大的非催化性的靶向亚基而锚定至这些场所，其用来增强底物的可得性和特异性。此外，这种酶由两种热和酸稳定的蛋白(磷酸酶抑制剂-1和-2)调控。磷酸酶抑制剂-1(“I-1”)是主要的生理调节剂，并且当被PKA在苏氨酸-35上磷酸化时是有效的抑制剂(Endo,S.等，1996Biochemistry；35(16)：5220-8)。PP1的抑制消除了其对PKA蛋白磷酸化作用的对抗，引起心脏中β-激动剂应答的放大(Ahmad,Z.J.1989Biol Chem；264：3859-63；Gupta,R.C.等，1996Circulation；(Suppl 1)：I-361)。
蛋白激酶和磷酸酶对心脏调控蛋白磷酸化的这种微调调控在心力衰竭中变得甚至更加重要，因为由β受体的脱敏造成的cAMP水平的下降(Koch,Lefkowitz等，2000)被预期将导致PKA的失活，而蛋白磷酸酶1的水平和活性增加。
也就是说，磷酸酶的活性在心力衰竭中增加。降低心肌细胞中的磷酸酶活性(例如，磷酸酶1的活性)可以缓解与心力衰竭相关的一个或多个症状。降低的磷酸酶活性与β-肾上腺素能反应性的减弱相关。因此，心脏细胞中的磷酸酶抑制剂的表达可用于治疗心脏疾患(例如心力衰竭)。降低磷酸酶活性可以改善β-肾上腺素能反应性。
因此，本公开的一个方面是治疗患有心力衰竭的受试者的方法，包括施用表达PKC-α磷酸化活性抑制剂的rAAV载体。
在一个实施方式中，可以通过抑制1型磷酸酶(PP1)来降低磷酸酶活性。1型磷酸酶包括但不限于PP1cα、PP1cβ、PP1cδ和PP1cγ。参见Sasaki等(1990)Jpn J Cancer Res.81：1272-1280，其内容通过引用并入本文。磷酸酶抑制剂-1(或“I-1”)蛋白是1型磷酸酶的内源性抑制剂。增加I-1的水平或活性可以恢复衰竭的人类心肌细胞的β-肾上腺素能反应性。
在具体的实施方式中，rAAV载体包含编码组成型活化的I-1蛋白的核酸。一个这样的rAAV载体包含编码I-1T35D的核酸，其包含I-1cDNA的截短以编码前65个氨基酸，并引入核苷酸变化以用天冬氨酸(GTC：Asp35)代替PKA磷酸化位点(GGT：Thr35)，产生组成型活化的抑制剂。在一些实施方式中，rAAV载体包含编码组成型活化的I-1蛋白的核酸构建体，其中，苏氨酸35被替换为谷氨酸而不是天冬氨酸。这些替换也可以在全长抑制剂分子中完成。表达I-1T35D的衰竭的人心肌细胞在基础条件下表现出正常的收缩功能，并且它们的β肾上腺素能功能恢复至正常。因此，在预先存在心力衰竭的情况下，抑制剂-1的递送完全恢复了功能并逆转了重构。
本文所公开的rAAV载体可以包含编码其它磷酸酶抑制剂和I-1的其它变体的核酸序列。例如，在一些实施方式中，如本文所公开的rAAV载体可以包含编码选自以下的任何一种或多种抑制剂的核酸：磷酸酶抑制剂2(PP2)；冈田酸(okadaic acid)或花萼海绵诱癌素(caliculin)；和nippl，其是蛋白磷酸酶1的内源性核抑制剂。在一个实施方式中，本文所公开的rAAV载体包含编码对蛋白磷酸酶1(PP1)而言特异性的磷酸酶抑制剂的核酸。调节心脏活性的蛋白质的实例包括但不限于：调节磷酸酶活性的蛋白质(例如，1型磷酸酶抑制剂，例如I-1)或肌质网Ca2+ATP酶(SERCA)(例如，SERCA1(例如1a或1b)、SERCA2(例如2a或2b)或SERCA3)。
在一些实施方式中，根据本文所述技术的实施方式的治疗方法包括向受试者的心脏细胞中引入包含编码磷酸酶抑制剂-1蛋白的突变形式的核酸序列的rAAV载体，其中，该突变形式包含在野生型中为PKC-α磷酸化位点的位置的至少一个氨基酸，其中，所述至少一个氨基酸为组成型未磷酸化的、或模拟突变形式中的未磷酸化状态。
(i)磷酸酶抑制剂蛋白-1(I-1)和组成型活化的I-1(I-1c)作为蛋白磷酸酶1(PP1)的抑制剂
磷酸酶抑制剂蛋白-I(I-1)是心脏收缩力的关键调节因子。I-1也被称为1型磷酸酶(PP1或PP-1)，已知其通过抑制蛋白磷酸酶-1(“PP-1”)的活性来调节心脏收缩力。进一步已知I-1抑制PP-1的能力由磷酸化调节。当I-1的苏氨酸35被蛋白激酶A(PKA)磷酸化时，PP-1活性受到抑制，心脏收缩力增强(Pathak,A.等2005Circ Res 15：756′-66)。
在一个实施方式中，可以通过抑制1型磷酸酶(PP1)来降低磷酸酶活性。1型磷酸酶包括但不限于PP1cα、PP1cβ、PP1cδ和PP1cγ。参见Sasaki等(1990)Jpn J Cancer Res.81：1272-1280，其内容通过引用并入本文。磷酸酶抑制剂-1(或“I-1”)蛋白是1型磷酸酶的内源性抑制剂。提高I-1的水平或活性可以恢复衰竭的人心肌细胞中的β-肾上腺素能反应性。
在具体的实施方式中，可以施用组成型活化的I-1蛋白。本文例示的一个这样的构建体(I-1T35D)涉及I-1cDNA的截短以编码前65个氨基酸，并引入核苷酸变化以用天冬氨酸(GTC：Asp35)取代PKA磷酸化位点(GGT：Thr35)，产生组成型活化的抑制剂。制造组成型活化的抑制剂的另一种方法是用谷氨酸而不是天冬氨酸替换苏氨酸35。这些替换也可以在全长抑制剂分子中完成。表达I-1T35D的衰竭的人心肌细胞在基础条件下表现出正常收缩功能，并且它们的β肾上腺素能功能恢复到正常。因此，在预先存在心力衰竭的情况下，抑制剂-1的递送完全恢复了功能并逆转了重构。
编码I-1的核酸以如下示出：
Figure BDA0004161819920000891
在本文所公开的方法和组合物的一些实施方式中，rAAV载体包含编码具有氨基酸SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1的经修饰的变体的I-1或I-1c蛋白的核酸序列。在一些实施方式中，rAAV载体包含SEQ ID NO：2的核酸序列或其片段，其中，SEQ ID NO：2的片段编码SEQID NO：1的氨基酸1-65，或从SEQ ID NO：1的氨基酸1至C端氨基酸70、67、66、65、或61、或54的片段，其中，SEQ ID NO：1第35位的苏氨酸被天冬氨酸(T35D)替换。在本文所公开的方法和组合物的一些实施方式中，rAAV载体包含编码I-1或I-1c蛋白的核酸序列，所述核酸序列是密码子优化的核酸序列，用于增强体内表达和/或减少CpG岛，和/或减少先天性免疫应答。可以使用本文所公开的方法和rAAV组合物中使用的示例性密码子优化的I-1或I-1c核酸序列，或与SEQ ID NO：2或其部分具有至少60％、或70％、或80％、85％或90％或95％、或98％、或99％序列同一性的核酸序列，或SEQ ID NO：385-412的核酸序列(其根据本领域已知的方法进行了密码子优化)，或与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：385-412中的任何一个具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的核酸序列。
此外，在一些实施方式中，用至少一个或多个下列修饰进一步对本文所公开的方法和rAAV组合物中使用的I-1或I-1c核酸序列进行修饰：(i)去除至少一个或两个或在一些实施方式中去除所有的替代性的阅读框，(ii)去除一个或多个CpG岛，(iii)Kozak序列的修饰，(iv)翻译终止子序列的修饰，以及(v)去除启动子和Kozak序列之间的间隔区。
在本文所公开的方法和组合物的一些实施方式中，通过AAV表达的人I-1蛋白由密码子优化的核酸序列编码，例如，选自SEQ ID NO：385-412中的任一个的序列。在本文所公开的方法和组合物的一些实施方式中，通过rAAV载体表达的I-1蛋白由与SEQ ID NO：385-412具有至少60％、或70％、或80％、85％或90％或95％、或98％、或99％的序列同一性的核酸序列编码。在一些实施方式中，这种与SEQ ID NO：385-412具有至少60％、或70％、或80％、85％或90％或95％、或98％、或99％序列同一性的核酸序列可以使用本文实施例中所公开的体外测定、或使用来自衰竭的心脏的心肌细胞(例如，来自衰竭的左心室(LV)的组织)来评估，其中，可以用32P标记的兔糖原磷酸化酶作为底物检测PP1活性。为了保持I-1的磷酸化状态，可以在组织提取物的制备和酶反应中包括PP2A(冈田酸，4nM)和钙调磷酸酶(EDTA，0.5mM)抑制剂，如在Carr等“Type 1phosphatase,a negative regulator ofcardiac function.”Molecular and cellular biology 22.12(2002)：4124-4135中所公开的；其通过引用全部并入本文。
在一些实施方式中，此类与SEQ ID NO：385-412具有至少60％、或70％、或80％、85％或90％或95％、或98％、或99％的序列同一性的核酸序列也可以使用本文实施例中公开的和Patkak等中公开的体内和体外测定(例如，通过非侵入性超声心动图和超声心动图评价来评估体内心脏功能，并使用Langendorff灌流系统检查体外收缩力)进行评估。也可以在鼠类心脏中进行心导管插入和压力-容积环测量，如在Patjak等“Enhancement ofcardiac function and suppression of heart failure progression by inhibitionof protein phosphatase 1.”Circulation research 96.7(2005)：756-766中所公开的，以其整体将其通过引用并入本文。
I-1的氨基酸序列如下：
Figure BDA0004161819920000911
为了确定蛋白磷酸酶1活性降低的长期体内影响，我们以心肌细胞受限的方式表达了组成型活化的截短的抑制剂-1(I1c)。选择这种形式的抑制剂-1是因为它特异性地抑制蛋白磷酸酶1，尽管其浓度比天然的磷酸化的抑制剂更高。
因此，在一些实施方式中，本文所公开的rAAV载体包含编码多肽的核酸序列，所述多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65，其中，SEQ ID NO：1第35位的苏氨酸被替换为天冬氨酸(T35D)；并且其中所述核酸序列可操作地连接至本文表2A、表3或表4中公开的心脏特异性启动子。在一些实施方式中，所述I-1蛋白或其功能变体在受试者的心脏中以对如下而言有效的量表达：增加心脏收缩力并减少与患有现有的心力衰竭的受试者的心脏重构相关的形态退化。
在一些实施方式中，本文所公开的rAAV载体包含编码I-1的组成型活化的片段(I-1c)的核酸序列，其中，I-1c是包含SEQ ID NO：1的氨基酸的多肽，其中，SEQ ID NO：1在C端氨基酸70、67、66、65或61或54处截短，并且其中，在第35位处存在天冬氨酸(T35D)。
在美国专利9,114,148中描述了I-1多肽，其通过引用以其整体并入本文。在一些实施方式中，I-1多肽可以包含分泌信号(SS)。在一些实施方式中，本领域普通技术人员能够理解I-1或I-1c的特定位置，所述I-1或I-1c可以融合分泌信号肽(SS)。因此，在一个方面，本发明涉及I-1蛋白，其从氨基酸1开始，并终止于SEQ ID NO：1的人I-1或经修饰的SEQID NO：1的I-1蛋白的氨基酸70、67、66、65、或61、或54，其中，在SEQ ID NO：1的第35位(T35D)处存在天冬氨酸。
在本文所公开的方法和组合物的一些实施方式中，由AAV表达的人I-1蛋白包含SEQ ID NO：1的氨基酸、或其片段或变体(例如从SEQ ID NO：1的残基70、67、66、65、或61、或54开始的I-1蛋白)。在本文所公开的方法和组合物的一些实施方式中，由rAAV载体表达的I-1蛋白包含从SEQ ID NO：1的70、67、66、65、或61、或54的任一个开始的氨基酸，或与SEQID NO：1至少60％、或70％、或80％、85％或90％或95％、或98％、或99％相同的蛋白质，从氨基酸70、67、66、65、或61、或54开始。在本文所公开的方法和组合物的一些实施方式中，由rAAV表达的I-1蛋白包含从SEQ ID NO：1的残基70、67、66、65、或61、或54开始的氨基酸，或与之至少60％、或70％、或80％、85％或90％或95％、或98％、或99％相同的蛋白。在一些实施方式中，由rAAV载体表达的I-1蛋白包含从以下任一个的第70、67、66、65、或61、或54位残基开始的氨基酸：SEQ ID NO：1，其中，在SEQ ID NO：1的第35位(T35D)处存在天冬氨酸，或与之至少60％、或70％、或80％、85％或90％或95％、或98％、或99％相同的蛋白质。
(ii)不同的rAAV载体构建体和I-1c的评价
在一些实施方式中，可以在体外评估本文所公开的rAAV载体对磷酸酶酶活性的影响。例如，可以按照所述(Endo,S.等(1996)Biochemistry 35，5220-5228)在含有50mMTris·HCl(pH 7.4)、1mM DTT、0.5mM MnCl2、10μM[32P]磷酸化酶a和0.5μg/mL PP1的30-μL反应混合物中对蛋白磷酸酶1活性进行测定。通过将1μL的PP1添加到20μL含有其余测定成分的测定混合物中来引发反应。在30℃下20min之后，向测定混合物中添加10μL的50％三氯乙酸来终止反应。然后将测定混合物在冰上冷却并离心。将来自上清液的20μL等分试样点在滤纸上，并置于闪烁计数器中以确定所释放的[32P]Pi的量。如所述的在30℃下以30min制备用于PP1测定的[32P]磷酸化酶a。在50mM Tris·HCl、pH 7.4、1mM EDTA、1mM DTT中透析[32P]磷酸化酶a，并在-80℃冷冻存储直到使用(另参见Huang等，Proc Natl Acad SciUSA.2000年5月23日；97(11)：5824-9)。
本文所公开的表达PP1抑制剂(例如I-1、I-1c或其变体)的rAAV载体的功效可以通过从使用各种浓度的测试化合物获得的数据生成剂量响应曲线来评估。此外，还可以进行对照测定以提供用于比较的基线。在对照测定中，在没有测试化合物的情况下孵育心脏细胞。
在不被解释为任何限制的前提下，表17示出了编码I1c基因的示例性核酸序列(SEQ ID NO：385-412)，其中，rAAV载体可以包含：选自SEQ ID NO：413-440中的任一个的核酸序列，其包含I-1c核酸和其它成分，并侧接于左侧和右侧ITR序列内；或与SEQ ID NO：413-440具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的核酸序列。在本文中有用的示例性的封闭末端的线性双链体可以包含选自以下的核酸序列：SEQ ID NO：357-384的任何一个，或与之具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的核酸。
Figure BDA0004161819920000941
动物模型
心血管基因治疗的成功研究的重要前提是：(1)构建可应用于临床心血管疾病的动物模型，该模型可以提供增加的血流和/或收缩功能的相关机理的有用数据，以及(2)准确评估基因转移的效果。因此，在一些实施方式中，可以使用猪的模型。猪是特别适合于研究心血管病症(包括人的心脏疾病)的模型，因为它与人体生理学有关。猪心脏在以下方面与人心脏非常相似。猪具有与人类非常相似的原生冠状动脉循环，包括原生冠状动脉侧支血管的相对缺乏。其次，猪心脏的尺寸，相对于总体重的百分比，与人心脏相似。此外，猪是大型动物模型，因此能够更准确地推断各种参数，例如有效载体剂量、毒性等。相比之下，例如狗和鼠科成员的动物的心脏具有很多内源性侧枝血管。此外，相对于总体重，狗心脏的尺寸是人心脏的两倍。
示例性的猪模型是模拟临床冠状动脉疾病的心肌缺血猪模型，该模型在美国申请号2003/0148968中描述，其通过引用以其整体并入本文。基于已发表的研究，本领域技术人员将理解，猪模型中的结果有望预测人类中的结果。
还可以使用美国申请号2003/0148968的实施例1中描述的另一个动物模型，其诱导扩张型心肌病，例如在临床充血性心力衰竭中观察到的。
因此，这些模型可用于确定本文所公开的rAAV载体的施用方法、和/或编码PP1的抑制剂(例如I-1、I-1c或其变体)和/或另一种治疗性蛋白(例如血管生成蛋白或肽)的rAAV载体是否有效地缓解与这些病症相关的至少一种心脏功能障碍。这些模型在提供一些参数方面特别有用，通过所述参数评估用于治疗充血性心力衰竭和心室重构的体内基因疗法的有效性。
(iii)由rAAV载体表达的用于治疗心力衰竭的其它药剂
在一些实施方式中，本文所公开的rAAV载体可以表达其它磷酸酶抑制剂和I-1的其它变体。这样的其它抑制剂的实例包括：磷酸酶抑制剂2；冈田酸或花萼海绵诱癌素(caliculin)；以及nippl，其是蛋白磷酸酶1的内源性核抑制剂。在一个实施方式中，该磷酸酶抑制剂对蛋白磷酸酶1而言是特异性的。
在一些实施方式中，本文所公开的rAAV载体可以表达其它治疗剂来治疗心力衰竭，例如腺苷酸环化酶6(AC6，也称为腺苷酸环化酶VI)、S100A1、β-肾上腺素能受体激酶-ct(βARKct)、肌质/内质网(SR)Ca-ATP酶(SERCA2a)、IL-18、VEGF、VEGF激活剂、尿皮质素和B细胞淋巴瘤2(Bcl2)-相关的anthanogene-3(BAG3)。
表18A：待由包含本文所公开的合成的心脏特异性启动子的rAAV载体编码的示例性基因
Figure BDA0004161819920000961
Figure BDA0004161819920000971
Figure BDA0004161819920000981
表18B：待由rAAV载体表达的用于治疗心律不齐或肌病的示例性治疗剂
Figure BDA0004161819920000982
Figure BDA0004161819920000991
在一些实施方式中，rAAV载体编码在美国专利10/086,043的表1、表2、表3、表4、表5、表6或表7中公开的核酸序列，其通过引用以其整体并入。
在一些实施方式中，用于本文所公开的方法和组合物中的rAAV载体包含编码表18A中公开的蛋白质或其变体的核酸序列，其中该核酸序列选自以下任何一个：SEQ ID NO：1、450-507、或527-532，或与SEQ ID NO：1、450-507、或527-532的任何一个具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％或至少98％的序列同一性的它们的变体。在一些实施方式中，用于本文所公开的方法和组合物中的rAAV载体包含编码选自表18A中的任何蛋白或选自表18A中的任何蛋白的变体的密码子优化的核酸序列，其中，密码子优化的核酸序列是选自以下任何一项的密码子优化的核酸序列：SEQ ID NO：1、450-507、或527-532，并且与SEQ ID NO：1、450-507、或527-532具有至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少98％的序列同一性。在一些实施方式中，rAAV载体包含编码以下任何一个的核酸序列：SEQ ID NO：1、450-507或527-532，并且经密码子优化以相对于SEQ ID NO：1、450-507或527-532的核酸序列的CpG位点含量减少了至少50％、或60％或70％或75％、80％、85％、90％、95％的CpG位点含量。
在一些实施方式中，用于本文所公开的方法和组合物中的rAAV载体包含编码表18B中所公开的蛋白质或其变体的核酸序列，其中，所述核酸序列选自以下的任何一个：SEQID NO：508-526，或与SEQ ID NO：508-526中的任何一个具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％或至少98％的序列同一性的它们的变体。在一些实施方式中，用于本文所公开的方法和组合物中的rAAV载体包含编码选自表18B中的任何蛋白质或选自表18B中的任何蛋白质的变体的密码子优化的核酸序列，其中，密码子优化的核酸序列是选自以下任何一个的密码子优化的核酸序列：SEQ ID NO：508-526，以及与SEQ ID NO：508-526具有至少60％、或至少70％或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％或至少98％的序列同一性的核酸序列。在一些实施方式中，rAAV载体包含编码SEQ ID NO：508-526的任何一个的核酸序列，并且经密码子优化以相对于SEQ ID NO：508-526的核酸序列的CpG位点含量减少至少50％、或60％或70％或75％、80％、85％、90％、95％的CpG位点含量。
在一些实施方式中，所述rAAV载体编码用于增加血管生成的核酸(例如本文所定义的血管生成蛋白)。血管生成一般是指血管的发育和分化。已知通常被称为“血管生成蛋白”的许多蛋白质促进血管生成。这种血管生成蛋白包括以下的成员：成纤维细胞生长因子(FGF)家族、血管内皮生长因子(VEGF)家族、血小板衍生生长因子(PDGF)家族、胰岛素样生长因子(IGF)等。例如，FGF和VEGF家族成员已被认为是生长和发育期间血管生成的调节因子。已经研究了FGF和VEGF家族的血管生成活性。例如，已经表明当放置在成年大鼠的腹膜腔中时，处于胶原蛋白包覆的基质中的酸性FGF(“aFGF”)蛋白产生良好血管化并且正常灌流的结构(Thompson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：7928-7932，1989)。据报道，在冠状动脉闭塞期间向成年犬的冠状动脉注射碱性FGF(“bFGF”)蛋白造成降低的心肌功能障碍、更小的心肌梗塞，并且有风险的床中的增加的血管形成(Yanagisawa-Miwa等，Science，257：1401-1403，1992)。在使用bFGF蛋白的心肌缺血动物模型中也报道了相似的结果(Harada等，J.Clin.Invest.，94：623-630，1994；Unger等，Am.J.Physiol.，266：H1588-H-1595，1994)。在用VEGF蛋白处理的狗中显示了侧支血流的增加(Banai等，Circulation 89：2183-2189，1994)。
在一些实施方式中，包含心脏特异性启动子的本文所公开的rAVV载体编码一种或多种血管生成蛋白或肽，例如FGF-5、FGF-4、aFGF、bFGF和/或VEGF、或其变体。合适的血管生成蛋白或肽由以下家族的成员例示：成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)等。FGF家族的成员包括但不限于：aFGF(FGF-1)、bFGF(FGF-2)、FGF-4(也称为“hst/KS3”)、FGF-5、FGF-6。在一些实施方式中，本文所公开的rAAV载体编码分泌的血管生成蛋白(例如FGF-4、FGF-5、或FGF-6)，因为这些蛋白含有功能性分泌信号序列，并且容易从细胞中分泌。许多(如果不是大多数)人VEGF蛋白(包括但不限于VEGF-121和VEGF-165)也容易分泌，并在分泌后可扩散。已显示VEGF在体外和体内响应于缺血由心肌细胞表达；它是在生理病症下以及对病理状态的适应性响应期间的血管生成的调节因子(Banai等，Circulation 89：2183-2189，1994)。VEGF家族包括但不限于VEGF-A亚家族的成员(例如VEGF-121、VEGF-145、VEGF-165、VEGF-189和VEGF-206)、以及VEGF-B亚家族(例如VEGF-167和VEGF-186)和VEGF-C亚家族的成员。PDGF包括例如PDGF A和PDGF B，并且IGF包括例如IGF-1。其它血管生成蛋白或肽是本领域已知的，并且经常发现新的血管生成蛋白或肽。编码这些和其它蛋白质的基因的核苷酸序列、以及相应的氨基酸序列同样是本领域已知的(参见例如GENBANK序列数据库)。
血管生成蛋白和肽包含经过翻译后加工成为活性肽的肽前体、以及血管生成蛋白或肽的“衍生物”和“功能等价物”。血管生成蛋白或肽的衍生物是具有相似的氨基酸序列、并在某种程度上保留了相关的血管生成蛋白或肽的一种或多种活性的肽。如本领域技术人员所熟知的，有用的衍生物通常在与血管生成活性相关的蛋白质的区域或结构域中具有实质的序列相似性(在氨基酸水平上)。类似地，本领域的技术人员很容易理解，“功能等价物”是指具有可替代特定血管生成蛋白或肽的一种或多种活性的活性的蛋白或肽。优选的功能等价物保留了特定血管生成蛋白或肽的所有活性；然而，功能等价物可能具有在定量测量时比野生型肽或蛋白更强或更弱的活性。
对于FGF家族的详情参见例如Burgess，Ann.N.Y.Acad.Sci.638：89-97，1991；Burgess等，Annu.Rev.Biochem.58：575-606，1989；Muhlhauser等，Hum.Gene Ther.6：1457-1465，1995；Zhan等，Mol.Cell.Biol.，8：3487，1988；Seddon等，Ann.N.Y.Acad.Sci.638：98-108，1991。对于人hst/KS3(即FGF-4)，参见Taira等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：2980-2984，1987。对于人VEGF-A蛋白，参见例如Tischer等，J.Biol.Chem.206：11947-11954，1991以及其中的参考文献；Muhlhauser等，Circ.Res.77：1077-1086，1995；以及Neufeld等，WO98/10071(1998年3月12日)。同样也描述了已知的血管生成蛋白的其它变体；例如VEGF蛋白和VEGF相关蛋白的变体，参见例如Baird等，WO 99/40197，(1999年8月12日)；和Bohlen等，WO 98/49300，(1998年11月5日)。血管生成蛋白的组合和编码这种组合的基因递送载体在Gao等于2000年6月30日提交的名称为“Dual Recombinant Gene Therapy Compositionsand Methods of Use”的U.S.Ser.No.09/607,766中描述，藉此通过引用以其整体并入。如本领域技术人员所理解的，血管生成蛋白可以通过增强其它血管生成蛋白的表达、稳定性或功能性来促进血管生成。这种血管生成蛋白或肽的实例包括例如响应于缺氧而被诱导的调节因子(例如缺氧诱导因子，如Hif-1、Hif-2等；参见例如Wang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(9)：4304-8，1993；Forsythe等，Mol.Cell.Biol.16(9)：4604-13，1996；Semenza等，Kidney Int.，51(2)：553-5，1997；和O′Rourke等，Oncol.Res.，9(6-7)：327-32，1997)；以及其它调节因子，例如由与心血管疾病相关的生理病症诱导的调节因子，所述心血管疾病例如炎症(例如诱导型一氧化氮合酶(iNOS)，以及组成型的对应物CNOS；参见例如Yoshizumi等，Circ.Res.，73(1)：205-9，1993；Chartrain等，J.Biol.Chem.，269(9)：6765-72，1994；Papapetropoulos等，Am.J.Pathol.，150(5)：1835-44，1997；和Palmer等，Am.J.Physiol.，274(2Pt 1)：L212-9，1998)。此类血管生成蛋白的其它实例包括某些胰岛素样生长因子(例如IGF-1)和血管生成素(Angs)，据报道，它们促进和/或刺激其它血管生成蛋白(例如VEGF)的表达和/或活性(参见例如Goad等，Endocrinology，137(6)：2262-68(1996)；Warren等，J.Bio.Chem.，271(46)：29483-88(1996)；Punglia等，Diabetes，46(10)：1619-26(1997)；和Asahara等，Circ.Res.，83(3)：233-40(1998)和Bermont等，Int.J.Cancer 85：117-123，2000)。相似地，据报道诱导体内血管形成(参见例如Grant等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1937-1941，1993)的肝细胞生长因子(也称为扩散因子(Scatter factor))，也被报道增加了VEGF的表达(参见例如Wojta等，Lab Invest.79：427-438，1999)。血管生成多肽的另外的实例包括天然和合成的调节肽(血管生成多肽调节因子)，所述调节肽充当内源性血管生成基因的促进剂。天然的血管生成多肽调节因子可以来源于内源性血管生成基因的诱导剂。如上所述，Hif是此类血管生成基因的一个说明性实例，据报道，它通过诱导其它血管生成基因的表达来促进血管生成。可以例如通过制备多指锌结合蛋白来设计合成的血管生成多肽调节因子，所述多指锌结合蛋白特异性地结合至内源性血管生成基因的编码区上游的序列，并且其可用于诱导此类内源性基因的表达。对许多基因的研究引起用于设计这种锌指DNA结合蛋白的“规则”的发展(参见例如Rhodes和Klug，Scientific American，1993年2月，pp 56-65；Choo和Klug，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91(23)：11163-7，1994；Rebar和Pabo，Science，263(5147)：671-3，1994；Choo等，J.Mol.Biol.，273(3)：525-32，1997；Pomerantz等，Science 267：93-96，1995；和Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：5525-5530，1997)。如本领域的技术人员将理解的那样，经常鉴别出编码具有直接或间接促进血管生成的能力的蛋白质或肽的许多另外的基因，并且将基于与已知的血管生成蛋白或肽编码基因的相似性或与已经发现的此类基因编码促进血管生成的蛋白或肽的能力的相似性来鉴别出新基因。可容易从序列数据库(例如GenBank或EMBL)获得此类基因和编码的多肽的序列信息。也可以从基因文库中获得(例如，通过使用PCR或本领域常规的杂交技术)编码这些蛋白质的多核苷酸。
在一些实施方式中，所述蛋白质可以是细胞因子的抑制剂(例如IL-18抑制剂)，例如，GSK抗体SGK-1070806抗体、针对IL-18的null Cas9、siRNA、miRNA或IL-18结合蛋白(IL-18BP)。IL-18BP是对IL-18具有高亲和力的可溶性蛋白(Novick等，1999；如在WO99/09063中所公开的)。
IL-18BP不是已知的IL18受体之一的细胞外结构域，而是分泌的天然循环蛋白。它属于分泌蛋白的新家族，进一步包括数个痘病毒编码的蛋白(Novick等，1999)。Urinary以及重组IL-18BP以高亲和力特异性结合IL-18，并调节IL-18的生物亲和力。IL-18以高亲和力结合并通过IL-18受体(IL-18R)进行信号传导，所述IL-18受体是由IL18R1和IL18RAP基因分别编码的α和β链的异聚复合体(Torigoe K等(1997)J Biol Chem；272(41)：25737-42)。IL-18的生物活性由IL18BP(天然形成并且特异性高的抑制剂)负向调节。这种可溶性蛋白与游离的IL-18形成复合体，阻止其与IL-18受体的相互作用，从而中和并抑制其生物活性(Dinarello C A(2000)Ann Rheum Dis；59Suppl 1：i17-20)。IL-18BP是组成型分泌蛋白，具有对IL-18的高亲和力。IL-18BP的交替mRNA剪接变体产生四种亚型。与IL-18相比，主要的‘a’亚型以超过20倍的摩尔量存在于健康人的血清中(Dinarello和Kaplanski(2005)Expert Rev Clin Immunol，1(4)，619-632)。
IL-18BP基因定位至人染色体11q13，并且在8.3kb的基因组序列中没有发现编码跨膜结构域的外显子。迄今为止，在人中已经发现了由替代性mRNA剪接产生的IL-18BP的四种剪接变体或异构体。它们被命名为IL-18BP a、b、c和d，共享相同的N端，而C端不同(Novick等，1999)。这些异构体在它们结合IL-18的能力方面有不同。在这四种中，已知hIL-18BP异构体a和c具有对IL-18的中和能力。人IL-18BP异构体结合至鼠类IL-18。rAAV编码如WO2015032932或US20140112915所公开的IL-18抑制剂，或如WO1999009063所公开的IL-18BP，它们以其整体并入本文。
在一些实施方式中，rAAV载体可以编码β-肾上腺素能信号传导蛋白(β-ASP)(包括β-肾上腺素能受体(β-AR)、G-蛋白受体激酶抑制剂(GRK抑制剂)和腺苷酸环化酶(AC))以增强心脏功能，如在1997年9月提交的美国专利申请序列号08/924,757(基于1997年6月16日提交的美国No.60/048,933和1996年9月提交的美国专利号08/708,661)、以及1997年9月提交的PCT/US97/15610、和1998年1月16日提交的美国延续案序列号09/008,097、和1999年12月27日提交的美国延续案序列号09/472,667中详细描述和说明的，其各自通过引用并入本文。
在一些实施方式中，可以使用Angeli等，Comparative Medicine，2009，59(3)，272-279中公开的心肌梗塞(MI)模型评估包含本文所公开的心脏特异性启动子的rAAV载体。
b.心脏特异性启动子(CSP)
在一些实施方式中，rAAV载体包含编码可操作地连接至心脏特异性启动子的治疗剂(例如PP1的抑制剂或其它药剂)的核酸。在本文的表2A、表2B、表3和表4中公开了示例性的心脏特异性启动子。在一些实施方式中，心脏特异性启动子是合成的心脏特异性启动子。
在一些实施方式中，为了实现转基因(例如PP1的抑制剂(例如I-1或I-1c))的适当表达水平，rAAV基因型包含心脏特异性启动子(CSP)。CSP能使可操作地连接的基因在心脏组织中表达，并且在一些实施方式中可以是可诱导的CSP。在一个实施方式中，CSP位于上游5’，并可操作地连接至编码转基因(例如PP1的抑制剂(例如I-1或I-1c))的异源核酸序列。本文公开了示例性的心脏特异性启动子，例如选自本文表1的任何启动子或其功能变体。在本文所公开的组合物和方法的一些实施方式中，心脏特异性启动子包含表1-表3中公开的合成的心脏特异性启动子、心脏特异性顺式调控元件(CRE)、或合成的心脏特异性顺式调控模块(CRM)。
在一些实施方式中，为了实现PP1抑制剂(例如I-1或I-1c表达)的适当表达水平，rAAV基因型包含心脏特异性启动子(CSP)。CSP能使可操作地连接的基因在心脏中表达，并且在一些实施方式中可以是可诱导的CSP。在一个实施方式中，CSP位于上游5’并可操作地连接至编码PP1抑制剂蛋白的异源核酸序列。示例性的CSP于本文中公开，包括例如本文表2A中所列的CSP或其功能变体。在本文所公开的组合物和方法的一些实施方式中，心脏特异性启动子包括心脏特异性顺式调控元件(CRE)、合成的心脏特异性顺式调控模块(CRM)或者包含最小的心脏特异性启动子或心脏特异性近端启动子的元件的合成的心脏特异性启动子。
i.心脏特异性启动子
表2A示出了用于本文所公开的方法和组合物中的示例性心脏特异性启动子的核酸序列。
Figure BDA0004161819920001061
本技术的各方面涉及包含表2A中公开的合成的心脏特异性启动子的rAAV载体。在一些实施方式中，rAAV载体包含表2A中公开的合成的心脏特异性启动子，其可操作地连接至编码本文所公开的PP1抑制剂的核酸、或本文所公开的表18A或表18B中公开的基因。
在一些实施方式中，本文所公开的合成的心脏特异性启动子可以包含一个或多个顺式调控元件(CRE)和/或最小启动子或近端启动子、和/或调控元件(RE)(例如5’UTR或内含子)，或同时起到5’UTR和内含子作用的RE(例如CMV-IE)，其在本文中公开。
表2B：表2A的心脏特异性启动子的实施方式的CRE和最小/近端启动子。
Figure BDA0004161819920001071
Figure BDA0004161819920001081
本文所公开的CRE、CRM、内含子、UTR、最小/近端启动子和启动子可以在各种肌肉组织(特别是但不限于骨骼肌和/或心肌)中活化。在至少一种肌肉组织类型或至少一种肌肉细胞类型中活化的CRE、CRM、启动子元件或启动子可被称为“肌肉特异性的”。为方便起见，可根据所述CRE、CRM、启动子元件或启动子是否主要在骨骼肌或心肌中活化而将肌肉特异性CRE、CRM、启动子元件或启动子进一步细分为亚型。
在一些实施方式中，本发明的顺式调控元件和启动子是骨骼肌特异的。在一些实施方式中，本发明的顺式调控元件、CRM、启动子元件和启动子主要在骨骼肌中活化，而在心肌中较少活化或不活化。这些CRE、CRM、启动子元件和启动子被称为“骨骼肌特异性的”。
在一些实施方式中，本发明的顺式调控元件和启动子是心肌特异性的。在一些实施方式中，本发明的顺式调控元件、CRM、启动子元件和启动子主要在心肌中活化，而在骨骼肌中较少活化或不活化。这些CRE、CRM、启动子元件和启动子被称为“心肌特异性的”。
在一些实施方式中，肌肉特异性CRE、CRM、启动子元件和启动子在骨骼肌和心肌两者中活化。当在骨骼肌和心脏(在心肌中)两者中需要启动子活性时，这些CRE、CRM、启动子元件和启动子可能是优选的。在一些实施方式中，可优选心肌特异性CRE、CRM、启动子元件和启动子。当在心脏中(心肌中)需要启动子活性而在骨骼肌中很少或没有活性时，这些CRE、CRM、启动子元件和启动子可能是优选的。合成的心肌特异性启动子的例子包括SP0067、SP0075、SP0424、SP0425、SP0429、SP0430、SP0433、SP0436、SP0452、SP0344、SP0483、SP0496、SP0435、SP0449、SP0450、SP0451、SP0475、SP0476、SP0477、SP0478、SP0479、SP0480、SP0481、SP0482、SP0484、SP0485、SP0486、SP0487、SP0488、SP0489、SP0490、SP0491、SP0492、SP0493、SP0494和SP0495。优选的合成的心肌特异性启动子的实例是SP0067、SP0433、SP0436、SP0452、SP0344和SP0483。
本发明的心肌特异性CRE、CRM、启动子元件和启动子可在心脏的各种细胞中活化。心脏中的主要细胞类型是心室心肌细胞、心房心肌细胞、心脏成纤维细胞、或心脏中的内皮细胞(EC)、以及血管周围细胞和起搏细胞。此外，本发明的心肌特异性CRE、CRM、启动子元件和启动子可以在心脏的各个区域中活化，例如在任何或所有的以下心脏区域中活化：主动脉弓动脉(AA)；主动脉；心肌细胞(CM)；内皮细胞或心内膜细胞(EC)；下腔静脉(ICV)；室间隔(IVS)；左心房(LA)；左上腔静脉(LSCV)；左心室(LV)；流出道(OT)；肺动脉(PO)；前心外膜器官(proepicardial organ，PEO)；肺静脉(PV)；右心房(RA)；右上腔静脉(RSCV)；右心室(RV)；上腔静脉(SCV)；心脏平滑肌细胞(SM)。
在一些实施方式中，在本文所公开的施用和治疗方法中使用的AAV还包括在骨骼肌和心肌中均活化的肌肉特异性CRE、CRM、启动子元件和启动子。当在骨骼肌和心脏(在心肌中)中都需要启动子活性时，这些CRE、CRM、启动子元件和启动子可能是优选的。在骨骼肌和心肌中均活化的肌肉特异性启动子的实例包括SP0010、SP0020、SP0033、SP0038、SP0040、SP0042、SP0051、SP0057、SP0058、SP0061、SP0062、SP0064、SP0065、SP0066、SP0068、SP0070、SP0071、SP0076、SP0132、SP0133、SP0134、SP0136、SP0146、SP0147、SP0148、SP0150、SP0153、SP0155、SP0156、SP0157、SP0158、SP0159、SP0160、SP0161、SP0162、SP0163、SP0164、SP0165、SP0166、SP0169、SP0170、SP0171、SP0173、SP0228、SP0229、SP0230、SP0231、SP0232、SP0257、SP0262、SP0264、SP0265、SP0266、SP0267、SP0268、SP0270、SP0271、SP0279、SP0286、SP0305、SP0306、SP0307、SP0309、SP0310、SP0311、SP0312、SP0313、SP0314、SP0315、SP0316、SP0320、SP0322、SP0323、SP0324、SP0325、SP0326、SP0327、SP0328、SP0329、SP0330、SP0331、SP0332、SP0333、SP0334、SP0335、SP0336、SP0337、SP0338、SP0339、SP0340、SP0341、SP0343、SP0345、SP0346、SP0347、SP0348、SP0349、SP0350、SP0351、SP0352、SP0353、SP0354、SP0355、SP0356、SP0358、SP0359、SP0361、SP0362、SP0363、SP0364、SP0365、SP0366、SP0367、SP0368、SP0369、SP0370、SP0371、SP0372、SP0373、SP0374、SP0375、SP0376、SP0377、SP0378、SP0379、SP0380、SP0381、SP0382、SKM_14、SKM_18、SKM_20、SP0357、SP0437-SP0445、SP0447和SP0453-SP0471、473-474。在骨骼肌和心肌中均活化的优选的合成肌肉特异性启动子的实例是SP0057、SP0134、SP0173、SP0279、SP0286、SP0310、SP0316、SP0320和SP0326。
ii.心脏特异性启动子的功能变体
在一些实施方式中，启动子是包含顺式调控元件(CRE)(例如CRE0051和CRE0042、或其功能变体)的组合的合成的心脏特异性启动子。通常，CRE可操作地连接至启动子元件。在一些优选的实施方式中，心脏特异性启动子按所列举的顺序包含所述CRE或其功能变体(例如CRE0051、CRE0042)，然后是启动子元件(按照本领域常规，顺序以上游到下游的方向给出)。在一些优选的实施方式中，心脏特异性启动子按与所列举的顺序不同的顺序包含所述CRE或其功能变体(例如CRE0042、CRE0051)，然后是启动子元件。
在一些实施方式中，心脏特异性启动子按所列举的顺序包含所述CRE或其功能变体(例如CRE0033)，然后是任何其它CRE元件、或本文所公开的启动子元件。例如，如本文所公开的，启动子可以包含CRE0033和至少一个CRE、或至少2个CRE、或至少3个CRE、或至少4个CRE、或多于4个的CRE，所述CRE选自表2B、表3、表5B或表6中公开的任何CRE。
启动子元件可以是任何合适的近端启动子或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选所述近端启动子是心脏特异性的。
SP0067及其变体
在一些实施方式中，启动子是包含可操作地连接至启动子元件的CRE0033的合成的心肌特异性启动子。在一些优选的实施方式中，合成的心肌特异性启动子包含紧接在启动子元件上游的CRE0033。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选近端启动子是肌肉特异性的或心肌特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是SKM_18或其功能变体。SKM_18是肌肉特异性近端启动子。在一些实施方式中，所述心肌特异性启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0033，然后是SKM_18。
CRE0033具有如下的核酸序列：SEQ ID NO：41；SEQ ID NO：41的功能变体，可具有与SEQ ID NO：41至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。
CRE0033的功能变体是具有与CRE0033不同的序列的调控元件，但其基本上保留了作为肌肉特异性CRE的活性。技术人员将理解，能够在保留CRE与必需转录因子(TF)结合并增强表达的能力的同时改变CRE的序列。功能变体可以包含与参考CRE相比的替换、缺失和/或插入，只要它们不会使CRE基本上无功能的。
在一些实施方式中，CRE0033的功能变体可被视为CRE，当在启动子中取代CRE0033时基本保持其活性。例如，包含取代了CRE0033的CRE0033的功能变体的心肌特异性启动子优选保留其活性的80％、更优选其活性的90％、更优选其活性的95％、并且甚至更优选其活性的100％。例如，以启动子SP0067为例，SP0067中的CRE0033可以用CRE0033的功能变体进行替换，并且启动子基本上保留其活性。活性的保留可以通过比较在等同的条件下、在参考启动子或者包含被置换的CRE的相同启动子的控制下合适的报告子的表达来评估。
将注意到，可以在双链多核苷酸的任何一条链上提供CRE0033或其功能变体，并且可以以任一方向提供。就其而言，SEQ ID NO：41或其功能变体的互补和反向互补序列落入本发明的范围内。包含根据SEQ ID NO：41的序列或其功能变体的单链核酸也落入本发明的范围内。
在一些实施方式中，CRE033或其功能变体具有200个以下的核苷酸、150个以下的核苷酸、125个以下的核苷酸、或100个以下的核苷酸的长度。
SKM_18具有SEQ ID NO：55的核酸序列。SEQ ID NO：51的功能变体可具有与SEQ IDNO：51至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。
如上所讨论的，SKM_18的功能变体基本上保留了SKM_18充当肌肉特异性启动子元件的能力。例如，当SKM_18的功能变体被替换到心肌特异性启动子SP0067中时，经修饰的启动子保留了它的活性的至少80％、更优选它的活性的至少90％、更优选它的活性的至少95％、并且还更优选SP0067的活性的100％。合适地，SKM_18的功能变体包含与SEQ ID NO：55具有至少70％、80％、90％、95％或99％同一性的序列。
在一些优选的实施方式中，包含SKM_18或其功能变体或由SKM_18或其功能变体组成的启动子元件具有300个以下的核苷酸、250个以下的核苷酸、200个以下的核苷酸、150个以下的核苷酸、125个以下的核苷酸、110个以下的核苷酸、或95个以下的核苷酸的长度。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：3、或其功能变体。在一些实施方式中，功能变体可具有与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：3的序列的启动子被称为SP0067。在一些实施方式中，SP0067启动子是特别优选的。已经发现这种启动子对心肌是非常特异性的，并且也很短，这在一些情况下是有利的。
SP0075及其变体
在一些实施方式中，该启动子是包含可操作地连接至启动子元件的CRE0033的合成的心肌特异性启动子。在一些优选的实施方式中，合成的心肌特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0033。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选近端启动子是肌肉特异性的或心肌特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是SKM_20或其功能变体。SKM_20是肌肉特异性近端启动子。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0033，然后是SKM_20。
CRE0033及其变体的序列在上文中列出。
SKM_20具有SEQ ID NO：56的核酸序列。SEQ ID NO：56的功能变体可具有与SEQ IDNO：56至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。
如上所述，SKM_20的功能变体基本上保留了SKM_20作为肌肉特异性启动子元件的能力。例如，当SKM_20的功能变体被替换到心肌特异性启动子SP0075中时，经修饰的启动子保留了它的活性的至少80％、更优选它的活性的至少90％、更优选它的活性的至少95％、并且还更优选SP0075的活性的100％。合适地，SKM_20的功能变体包含与SEQ ID NO：56具有至少70％、80％、90％、95％或99％同一性的序列。
在一些优选的实施方式中，包含SKM_20或其功能变体或者由SKM_20或其功能变体组成的启动子元件具有300个以下的核苷酸、250个以下的核苷酸、200个以下的核苷酸、150个以下的核苷酸、125个以下的核苷酸、110个以下的核苷酸、或95个以下的核苷酸的长度。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：4、或其功能变体。在一些实施方式中，功能变体可具有与SEQ ID NO：4至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：4的序列的启动子被称为SP0075。在一些实施方式中，SP0075启动子是特别优选的。已经发现这种启动子对心肌是非常特异性的，并且也很短，这在一些情况下是有利的。
SP0424及其变体
在一些实施方式中，启动子是包含可操作地连接至启动子元件的CRE0004的合成的心肌特异性启动子。在一些优选的实施方式中，合成的心肌特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0004。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选所述近端启动子是肌肉特异性的或心肌特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是CRE0082或其功能变体。CRE0082是心肌特异性的近端启动子。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0004，然后是CRE0082。
CRE0004具有SEQ ID NO：39的核酸序列。SEQ ID NO：39的功能变体可具有与SEQID NO：39至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。
CRE0004的功能变体是具有与CRE0004不同的序列的调控元件，但其基本上保留了作为心肌特异性CRE的活性。技术人员将理解，能够在保留其与必需转录因子(TF)结合并增强表达的能力的同时改变CRE的序列。功能变体可以包含与参考CRE相比的替换、缺失和/或插入，只要它们不会使得CRE基本上无功能的。
在一些实施方式中，CRE0004的功能变体可被视为当在启动子中取代CRE0004时基本上保留其活性的CRE。例如，包含取代了CRE0004的CRE0004的功能变体的心肌特异性启动子，所述CRE0004的功能变体优选保留它的活性的80％、更优选它的活性的90％、更优选它的活性的95％、并且还更优选它的活性的100％。例如，以启动子SP0424为例，可以用CRE0004的功能变体替换SP00424中的CRE0004，并且启动子基本上保留了它的活性。活性的保留可以通过比较在等同的条件下、在参考启动子或者包含被置换的CRE的相同启动子的控制下合适的报告子的表达来评估。
将注意到，可以在双链多核苷酸的任一条链上提供CRE0004或其功能变体，并且可以以任一方向提供。就其而言，SEQ ID NO：39或其功能变体的互补和反向互补序列落入本发明的范围内。包含根据SEQ ID NO：39的序列或其功能变体的单链核酸也落入本发明的范围内。
在一些实施方式中，CRE004或其功能变体具有300个以下的核苷酸、200个以下的核苷酸、150个以下的核苷酸、125个以下的核苷酸、或100个以下的核苷酸的长度。
CRE0082具有SEQ ID NO：57的核酸序列。SEQ ID NO：57的功能变体可具有与SEQID NO：57至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。
如上所讨论的，CRE0082的功能变体基本上保留了CRE0082充当心肌特异性启动子元件的能力。例如，当CRE0082的功能变体被替换到心肌特异性启动子SP0424中时，经修饰的启动子保留了它的活性的至少80％、更优选它的活性的至少90％、更优选它的活性的至少95％、并且还更优选SP0424的活性的100％。合适地，CRE0082的功能变体包含与SEQ IDNO：57具有至少70％、80％、90％、95％或99％同一性的序列。
在一些优选的实施方式中，包含CRE0082或其功能变体或者由CRE0082或其功能变体组成的启动子元件具有500个以下、400个以下、300个以下的核苷酸、250个以下的核苷酸、200个以下的核苷酸、150个以下的核苷酸、125个以下的核苷酸、110个以下的核苷酸、或95个以下的核苷酸的长度。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：5、或其功能变体。在一些实施方式中，功能变体可具有与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：5的序列的启动子被称为SP0424。在一些实施方式中，SP0424启动子是特别优选的。已经发现这种启动子对心肌而言是特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0425及其变体
在一些实施方式中，所述启动子是包含可操作地连接至启动子元件的CRE0028的合成的心肌特异性启动子。在一些优选的实施方式中，合成的心肌特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0028。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选近端启动子是肌肉特异性的或心肌特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是CRE0082或其功能变体。CRE0082是心肌特异性的近端启动子。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0028，然后是CRE0082。
CRE0028具有SEQ ID NO：40的核酸序列。SEQ ID NO：40的功能变体可具有与SEQID NO：40至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。
CRE0028的功能变体是具有与CRE0028不同的序列的调控元件，但其基本上保留了作为心肌特异性CRE的活性。技术人员将理解，能够在保留其与必需转录因子(TF)结合并增强表达的能力的同时改变CRE的序列。功能变体可以包含与参考CRE相比的替换、缺失和/或插入，只要它们不会使得CRE基本上无功能的。
在一些实施方式中，CRE0028的功能变体可被视为当其取代启动子中的CRE0028时基本上保持其活性的CRE。例如，包含取代了CRE0028的CRE0028的功能变体的心肌特异性启动子，所述CRE0028的功能变体优选保留它的活性的80％、更优选它的活性的90％、更优选它的活性的95％、并且还更优选它的活性的100％。例如，以启动子SP0425为例，可以用CRE0028的功能变体取代SP00425中的CRE0028，并且所述启动子基本上保留了它的活性。活性的保留可以通过比较在等同的条件下、在参考启动子或者包含被置换的CRE的相同启动子的控制下合适的报告子的表达来评估。
将注意到，可以在双链多核苷酸的任一条链上提供CRE0028或其功能变体，并且可以以任一方向提供。就其而言，SEQ ID NO：40或其功能变体的互补和反向互补序列落入本发明的范围内。包含根据SEQ ID NO：40的序列或其功能变体的单链核酸也落入本发明的范围内。
在一些实施方式中，CRE0028或其功能变体具有300个以下的核苷酸、200个以下的核苷酸、150个以下的核苷酸、125个以下的核苷酸、或100个以下的核苷酸的长度。CRE0082及其变体的序列在上文列出。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：6、或其功能变体的核酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO：6的功能变体可具有与SEQ ID NO：6至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ IDNO：6的序列的启动子被称为SP0425。在一些实施方式中，SP0425启动子是特别优选的。已经发现这种启动子对心肌而言是特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0429及其变体
在一些实施方式中，启动子是包含可操作地连接至启动子元件的CRE0095的合成的心肌特异性启动子。在一些优选的实施方式中，所述合成的心肌特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0095。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选近端启动子是肌肉特异性的或心肌特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是CRE0082或其功能变体。CRE0082是心肌特异性的近端启动子。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0095，然后是CRE0082。
CRE0095具有SEQ ID NO：44的核酸序列。SEQ ID NO：44的功能变体可具有与SEQID NO：44至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。
CRE0095的功能变体是具有与CRE0095不同的序列的调控元件，但其基本上保留了作为心肌特异性CRE的活性。技术人员将理解，能够在保留其与必需转录因子(TF)结合并增强表达的能力的同时改变CRE的序列。功能变体可以包含与参考CRE相比的替换、缺失和/或插入，只要它们不会使得CRE基本上无功能的。
在一些实施方式中，CRE0095的功能变体可被视为当在启动子中取代CRE0095时基本上保留其活性的CRE。例如，包含取代CRE0095的CRE0095的功能变体的心肌特异性启动子优选保留它的活性的80％、更优选它的活性的90％、更优选它的活性的95％、并且还更优选它的活性的100％。例如，以启动子SP0429为例，可以用CRE0095的功能变体代替SP0429中的CRE0095，并且启动子基本上保留其活性。活性的保留可以通过比较在等同的条件下、在参考启动子或者包含被置换的CRE的相同启动子的控制下合适的报告子的表达来评估。
将注意到，可以在双链多核苷酸的任一条链上提供CRE0095或其功能变体，并且可以以任一方向提供。就其而言，SEQ ID NO：44或其功能变体的互补和反向互补序列落入本发明的范围内。包含根据SEQ ID NO：44的序列或其功能变体的单链核酸也落入本发明的范围内。
在一些实施方式中，CRE0095或其功能变体具有400个以下、300个以下、200个以下的核苷酸、150个以下的核苷酸、125个以下的核苷酸、或100个以下的核苷酸的长度。
CRE0082及其变体的序列在上文列出。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：7、或其功能变体的核酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO：7的功能变体可具有与SEQ ID NO：7至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ IDNO：7的序列的启动子被称为SP0429。在一些实施方式中，SP0429启动子是特别优选的。已经发现这种启动子对心肌而言是特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0430及其变体
在一些实施方式中，启动子是包含可操作地连接至启动子元件的CRE0096的合成的心肌特异性启动子。在一些优选的实施方式中，所述合成的心肌特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0096。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选近端启动子是肌肉特异性的或心肌特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是CRE0082或其功能变体。CRE0082是心肌特异性近端启动子。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0096，然后是CRE0082。
CRE0096具有SEQ ID NO：45的核酸序列。其功能变体可具有与SEQ ID NO：45至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
CRE0096的功能变体是具有与CRE0096不同的序列的调控元件，但其基本上保留了作为心肌特异性CRE的活性。技术人员将理解，能够在保留其与必需转录因子(TF)结合并增强表达的能力的同时改变CRE的序列。功能变体可以包含与参考CRE相比的替换、缺失和/或插入，只要它们不会使得CRE基本上无功能的。
在一些实施方式中，CRE0096的功能变体可被视为当在启动子中取代CRE0096时基本上保留其活性的CRE。例如，包含取代CRE0096的CRE0096的功能变体的心肌特异性启动子优选保留它的活性的80％、更优选它的活性的90％、更优选它的活性的95％、并且还更优选它的活性的100％。例如，以启动子SP0430为例，可以用CRE0096的功能变体取代SP0430中的CRE0096，并且启动子基本上保留其活性。活性的保留可以通过比较在等同的条件下、在参考启动子或者包含被置换的CRE的相同启动子的控制下合适的报告子的表达来评估。
将注意到，可以在双链多核苷酸的任一条链上提供CRE0096或其功能变体，并且可以以任一方向提供。就其而言，SEQ ID NO：45或其功能变体的互补和反向互补序列落入本发明的范围内。包含根据SEQ ID NO：45的序列或其功能变体的单链核酸也落入本发明的范围内。
在一些实施方式中，CRE0096或其功能变体具有500个以下的核苷酸、400个以下的核苷酸、300个以下的核苷酸、200个以下的核苷酸、150个以下的核苷酸、125个以下的核苷酸、或100个以下的核苷酸的长度。CRE0082和其变体的序列在上文列出。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：8、或其功能变体的核酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO：8的功能变体可具有与SEQ ID NO：8至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ IDNO：8的序列的启动子被称为SP0430。在一些实施方式中，SP0430启动子是特别优选的。已经发现这种启动子对心肌而言是特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0344及其变体
在一些实施方式中，启动子是包含可操作地连接至启动子元件的CRE0033的合成的心肌特异性启动子。在一些优选的实施方式中，合成的心肌特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0033。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选近端启动子是肌肉特异性的或心肌特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是CRE0038或其功能变体。CRE0038是心肌特异性近端启动子。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0033，然后是CRE0038。
CRE0033及其变体的序列在上文列出。
CRE0038具有SEQ ID NO：64的核酸序列。SEQ ID NO：64的功能变体可具有与SEQID NO：64至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。
如上所讨论的，CRE0038的功能变体基本上保留了CRE0038充当心肌特异性启动子元件的能力。例如，当CRE0038的功能变体被替换到心肌特异性启动子SP0344中时，经修饰的启动子保留它的活性的至少80％、更优选它的活性的至少90％、更优选它的活性的至少95％、并且还更优选SP0344的活性的100％。合适地，CRE0038的功能变体包含与SEQ ID NO：64具有至少70％、80％、90％、95％或99％同一性的序列。
在一些优选的实施方式中，包含CRE0038或其功能变体或者由CRE0038或其功能变体组成的启动子元件具有300个以下的核苷酸、250个以下的核苷酸、200个以下的核苷酸、150个以下的核苷酸、125个以下的核苷酸、110个以下的核苷酸、或95个以下的核苷酸的长度。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：9、或其功能变体的核酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO：9的功能变体可具有与SEQ ID NO：9至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ IDNO：9的序列的启动子被称为SP0344。在一些实施方式中，SP0344启动子是特别优选的。已经发现这种启动子对心肌而言是特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0433及其变体
在一些实施方式中，启动子是包含顺式调控元件CRE0033和CRE0071.3、或其功能变体的组合的合成的心肌特异性启动子。通常，CRE可操作地连接至启动子元件。在一些优选的实施方式中，心肌特异性启动子包含所述CRE或其功能变体，处于CRE0033、CRE0071.3、然后是启动子元件的顺序(如本领域常规的，顺序按上游到下游的方向给出)。在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含所述CRE或其功能变体，处于CRE0071.3、CRE0033、然后是启动子元件的顺序(如本领域常规的，顺序按上游到下游的方向给出)。
启动子元件可以是任何合适的近端启动子或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选近端启动子是心肌特异性的或心肌特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是CRE0070、或其功能变体。CRE0070是肌肉特异性的近端启动子。
因此，在一个实施方式中，启动子包含以下调控元件：CRE0033、CRE0071.3和CRE0070，或其功能变体。CRE0033和其变体的序列在上文列出。CRE0071.3具有SEQ ID NO：43的核酸序列。SEQ ID NO：43的功能变体可具有与SEQ ID NO：43至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。
CRE0071.3的功能变体是具有与CRE0071.3不同的序列的调控元件，但其基本上保留了作为心肌特异性CRE的活性。技术人员将理解，可以在保留其与必需转录因子(TF)结合并增强表达的能力的同时改变CRE的序列。功能变体可以包含与参考CRE相比的替换、缺失和/或插入，只要它们不会使得CRE基本上无功能的。
在一些实施方式中，CRE0071.3的功能变体可被视为当在启动子中取代CRE0071.3时基本上保留其活性的CRE。例如，包含取代CRE0071.3的CRE0071.3的功能变体的心肌特异性启动子优选保留它的活性的80％、更优选它的活性的90％、更优选它的活性的95％、并且还更优选它的活性的100％。例如，以启动子SP0433为例，可以用CRE0071.3的功能变体取代SP00433中的CRE0071.3，并且所述启动子基本上保留了它的活性。活性的保留可以通过比较在等同的条件下、在参考启动子或者包含被置换的CRE的相同启动子的控制下合适的报告子的表达来评估。
将注意到，可以在双链多核苷酸的任一条链上提供CRE0071.3或其功能变体，并且可以以任一方向提供。就其而言，SEQ ID NO：43或其功能变体的互补和反向互补序列落入本发明的范围内。包含根据SEQ ID NO：43的序列或其功能变体的单链核酸也落入本发明的范围内。
在一些实施方式中，CRE0071.3或其功能变体具有300个以下、200个以下的核苷酸、150个以下的核苷酸、125个以下的核苷酸、或100个以下的核苷酸的长度。
CRE0070具有SEQ ID NO：42的核酸序列。SEQ ID NO：42的功能变体可具有与SEQID NO：42至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。
如上所讨论的，CRE0070的功能变体基本上保留了CRE0070充当肌肉特异性启动子元件的能力。例如，当CRE0070的功能变体被替换到心肌特异性启动子SP0433中时，经修饰的启动子保留它的活性的至少80％、更优选它的活性的至少90％、更优选它的活性的至少95％、并且还更优选SP0433的活性的100％。合适地，CRE0070的功能变体包含与SEQ ID NO：42具有至少70％、80％、90％、95％或99％同一性的序列。
在一些优选的实施方式中，包含CRE0070或其功能变体或者由CRE0070或其功能变体组成的启动子元件具有300个以下的核苷酸、250个以下的核苷酸、200个以下的核苷酸、150个以下的核苷酸、125个以下的核苷酸、110个以下的核苷酸、或95以下的核苷酸、85个以下的核苷酸、75个以下的核苷酸、50个以下的核苷酸的长度。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：10、或其功能变体的核酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO：10的功能变体可具有与SEQ ID NO：10至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：10的序列的启动子被称为SP0433。在一些实施方式中，SP0433启动子是特别优选的。已经发现这种启动子对心肌而言是特异性的，这在一些情况下是有利的。
在一些实施方式中，启动子是包含可操作地连接至启动子元件的CRE0033的合成的心肌特异性启动子。在一些优选的实施方式中，合成的心肌特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0033。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选近端启动子是肌肉特异性的或心肌特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是CRE0082或其功能变体。CRE0082是心肌特异性的近端启动子。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0033，然后是CRE0082。CRE0033及其变体的序列在上文列出。CRE0082及其变体的序列在上文列出。
SP0435及其变体
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：11、或其功能变体的核酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO：11的功能变体可具有与SEQ ID NO：11至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：11的序列的启动子被称为SP0435。在一些实施方式中，SP0435启动子是特别优选的。已经发现这种启动子对心肌而言是特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0436及其变体
在一些实施方式中，启动子是包含两个顺式调控元件CRE0033或其功能变体的组合的合成的心肌特异性启动子。通常，CRE可操作地连接至启动子元件。在一些优选的实施方式中，心肌特异性启动子包含所述CRE或其功能变体，处于首先是CRE0033、其次是CRE0033、然后是启动子元件的顺序(如本领域常规的，顺序按上游到下游的方向给出)。
启动子元件可以是任何合适的近端启动子或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选所述近端启动子是肌肉特异性的或心肌特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是SKM_18、或其功能变体。SKM_18是肌肉特异性的近端启动子。
因此，在一个实施方式中，启动子包含以下调控元件：第一CRE0033、第二CRE0033和SKM_18，或其功能变体。
预测包含两个相同的CRE的合成启动子比仅包含所述相同的CRE中的一个的等同的启动子在它的靶组织或细胞中具有更高的表达。例如，与仅包含CRE0033和SKM_18的启动子SP0067相比，包含第一CRE0033、第二CRE0033和SKM_18的启动子SP0436在心肌细胞中具有更高的表达。
CRE0033及其变体的序列在上文列出。
SKM_18及其变体的序列在上文列出。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：12、或其功能变体的核酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO：12的功能变体可具有与SEQ ID NO：12至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：12的序列的启动子被称为SP0436。在一些实施方式中，SP0436启动子是特别优选的。已经发现这种启动子对心肌而言是特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0449及其变体
在一些实施方式中，启动子是包含顺式调控元件CRE0004和CRE0033或其功能变体的组合的合成的心肌特异性启动子。通常，CRE可操作地连接至启动子元件。在一些优选的实施方式中，心肌特异性启动子包含所述CRE或其功能变体，处于CRE0004、CRE0033、然后是启动子元件的顺序(如本领域常规的，顺序按上游到下游的方向给出)。在一些优选的实施方式中，心肌特异性启动子包含所述CRE或其功能变体，处于CRE0033、CRE0004、然后是启动子元件的顺序(如本领域常规的，顺序按上游到下游的方向给出)。
启动子元件可以是任何合适的近端启动子或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选近端启动子是肌肉特异性的或心肌特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是SKM_18、或其功能变体。SKM_18是肌肉特异性的近端启动子。
因此，在一个实施方式中，启动子包含以下调控元件：CRE0004、CRE0033和SKM_18，或其功能变体。
CRE0004及其变体的序列在上文列出。
CRE0033及其变体的序列在上文列出。
SKM_18及其变体的序列在上文列出。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：13、或其功能变体的核酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO：13的功能变体可具有与SEQ ID NO：13至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：13的序列的启动子被称为SP0449。在一些实施方式中，SP0449启动子是特别优选的。预测这种启动子对心肌而言是特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0450及其变体
在一些实施方式中，启动子是包含顺式调控元件CRE0095和CRE0033或其功能变体的组合的合成的心肌特异性启动子。通常，CRE可操作地连接至启动子元件。在一些优选的实施方式中，心肌特异性启动子包含所述CRE或其功能变体，处于CRE0095、CRE0033、然后是启动子元件的顺序(如本领域常规的，顺序按上游到下游的方向给出)。在一些优选的实施方式中，心肌特异性启动子包含所述CRE或其功能变体，处于CRE0033、CRE0095、然后是启动子元件的顺序(如本领域常规的，顺序按上游到下游的方向给出)。
启动子元件可以是任何合适的近端启动子或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选近端启动子是肌肉特异性的或心肌特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是SKM_18、或其功能变体。SKM_18是肌肉特异性的近端启动子。
因此，在一个实施方式中，启动子包含以下调控元件：CRE0095、CRE0033和SKM_18，或其功能变体。
CRE0095及其变体的序列在上文列出。
CRE0033及其变体的序列在上文列出。
SKM_18及其变体的序列在上文列出。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：14、或其功能变体的核酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO：14的功能变体可具有与SEQ ID NO：14至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：14的序列的启动子被称为SP0450。在一些实施方式中，SP0450启动子是特别优选的。预测这种启动子对心肌而言是特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0451及其变体
在一些实施方式中，启动子是包含顺式调控元件CRE0096和CRE0033或其功能变体的组合的合成的心肌特异性启动子。通常，CRE可操作地连接至启动子元件。在一些优选的实施方式中，心肌特异性启动子包含所述CRE或其功能变体，处于CRE0096、CRE0033、然后是启动子元件的顺序(如本领域常规的，顺序按上游到下游的方向给出)。在一些优选的实施方式中，心肌特异性启动子包含所述CRE或其功能变体，处于CRE0033、CRE0096、然后是启动子元件的顺序(如本领域常规的，顺序按上游到下游的方向给出)。
启动子元件可以是任何合适的近端启动子或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选近端启动子是肌肉特异性的或心肌特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是SKM_18、或其功能变体。SKM_18是肌肉特异性的近端启动子。
因此，在一个实施方式中，启动子包含以下调控元件：CRE0096、CRE0033和SKM_18，或其功能变体。
CRE0096及其变体的序列在上文列出。CRE0033及其变体的序列在上文列出。SKM_18及其变体的序列在上文列出。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：15、或其功能变体的核酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO：15的功能变体可具有与SEQ ID NO：15至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：15的序列的启动子被称为SP0451。在一些实施方式中，SP0451启动子是特别优选的。预测这种启动子对心肌而言是特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0452及其变体
在一些实施方式中，启动子是包含心肌特异性近端启动子CRE0082和顺式调控元件CRE0033或其功能变体的组合的合成的心肌特异性启动子。通常，心肌特异性近端启动子CRE0082和顺式调控元件CRE0033可操作地连接至进一步的启动子元件。在一些优选的实施方式中，心肌特异性启动子包含所述近端启动子和CRE、或其功能变体，处于CRE0082、CRE0033、然后是所述进一步的启动子元件的顺序(如本领域常规的，顺序按上游到下游的方向给出)。
所述进一步的启动子元件可以是任何合适的近端启动子或最小启动子。在一些实施方式中，所述进一步的启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选所述近端启动子是肌肉特异性的或心肌特异性的。
在一些优选的实施方式中，所述进一步的启动子元件是SKM_18、或其功能变体。SKM_18是肌肉特异性的近端启动子。
因此，在一个实施方式中，所述启动子包含以下调控元件：CRE0082、CRE0033和SKM_18，或其功能变体。这种启动子包含串联使用的两个近端启动子。
CRE0082及其变体的序列在上文列出。CRE0033及其变体的序列在上文列出。SKM_18及其变体的序列在上文列出。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：16、或其功能变体的核酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO：16的功能变体可具有与SEQ ID NO：16至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：16的序列的启动子被称为SP0452。在一些实施方式中，SP0452启动子是特别优选的。预测这种启动子对心肌而言是特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0475及其变体
在一些实施方式中，启动子是包含可操作地连接至启动子元件和调控元件(例如5’UTR和/或内含子)的CRE0033的合成的心肌特异性启动子。在一些优选的实施方式中，合成的心肌特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0033、然后是调控元件(例如5’UTR和/或内含子)。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选所述近端启动子是肌肉特异性的或心肌特异性的。
在一些优选的实施方式中，所述启动子元件是SKM_18或其功能变体。SKM 18是肌肉特异性的近端启动子。
所述内含子可以是任何合适的内含子。所述5’UTR可以是任何合适的5’UTR。调控元件可包含内含子和5’UTR。在一些优选的实施方式中，所述调控元件是CMV-IE 5’UTR和内含子。
在一些实施方式中，所述心肌特异性启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0033随后是SKM_18，然后是CMV-IE 5’UTR和内含子。
CRE0033及其变体的序列在上文列出。SKM_18及其变体的序列在上文列出。
CMV-IE 5’UTR和内含子具有SEQ ID NO：65的核酸序列。SEQ ID NO：65的功能变体可具有与SEQ ID NO：65至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。
在一些实施方式中，CMV-IE 5’UTR和内含子的功能变体可被视为当在启动子中取代CMV-IE 5’UTR和内含子时基本上保留其活性的内含子。例如，包含取代CMV-IE 5’UTR和内含子的CMV-IE 5’UTR和内含子的功能变体的心肌特异性启动子优选保留它的活性的80％、更优选它的活性的90％、更优选它的活性的95％、并且还更优选它的活性的100％。例如，以启动子SP0475为例，可以用CMV-IE 5’UTR和内含子的功能变体替换SP0475中的CMV-IE 5’UTR和内含子，并且所述启动子基本上保留其活性。活性的保留可以通过比较在等同的条件下、在参考启动子或者包含被置换的内含子的相同启动子的控制下合适的报告子的表达来评估。
预期与不包含内含子的等同的启动子相比，包含内含子(例如CMV-IE 5’UTR和内含子)的合成启动子在其靶组织或细胞中具有更高的表达量。例如，预期与只包含CRE0033和SKM_18的启动子SP0067相比，包含CRE0033、SKM_18和CMV-IE 5’UTR和内含子的启动子SP0475在心肌组织或细胞具有更高的表达。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：17、或其功能变体的核酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO：17的功能变体可具有与SEQ ID NO：17至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：17的序列的启动子被称为SP0475。在一些实施方式中，SP0475启动子是特别优选的。预期这种启动子对心肌具有特异性，这在一些情况下是有利的。
SP0476及其变体
在一些实施方式中，启动子是包含可操作地连接至启动子元件的CRE0105的合成的心肌特异性启动子。在一些优选的实施方式中，合成的心肌特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0105。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选所述近端启动子是肌肉特异性的或心肌特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是SKM_18或其功能变体。SKM_18是肌肉特异性的近端启动子。在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0105，然后是SKM_18。
CRE0105具有SEQ ID NO：46的核酸序列。SEQ ID NO：46的功能变体可具有与SEQID NO：46至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。
CRE0105的功能变体是具有与CRE0105不同的序列的调控元件，但其基本上保留了作为心肌特异性CRE的活性。技术人员将理解，能够在保留其与必需转录因子(TF)结合并增强表达的能力的同时改变CRE的序列。功能变体可以包含与参考CRE相比的替换、缺失和/或插入，只要它们不会使得CRE基本上无功能的。
在一些实施方式中，CRE0105的功能变体可被视为当在启动子中取代CRE0105时基本上保留其活性的CRE。例如，包含取代了CRE0105的CRE0105的功能变体的心肌特异性启动子优选保留它的活性的80％、更优选它的活性的90％、更优选它的活性的95％、并且还更优选它的活性的100％。例如，以启动子SP0476为例，可以用CRE0105的功能变体取代SP0476中的CRE0105，并且启动子基本上保留其活性。活性的保留可以通过比较在等同的条件下、在参考启动子或者包含被置换的CRE的相同启动子的控制下合适的报告子的表达来评估。
将注意到，可以在双链多核苷酸的任一条链上提供CRE0105或其功能变体，并且可以以任一方向提供。就其而言，SEQ ID NO：46或其功能变体的互补和反向互补序列落入本发明的范围内。包含根据SEQ ID NO：46的序列或其功能变体的单链核酸也落入本发明的范围内。
在一些实施方式中，CRE0105或其功能变体具有300个以下的核苷酸、200个以下的核苷酸、150个以下的核苷酸、125个以下的核苷酸、或100个以下的核苷酸的长度。
SKM_18及其变体的序列在上文列出。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：18、或其功能变体的核酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO：18的功能变体可具有与SEQ ID NO：18至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：18的序列的启动子被称为SP0476。在一些实施方式中，SP0476启动子是特别优选的。预计这种启动子对心肌而言是特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0477及其变体
在一些实施方式中，启动子是包含可操作地连接至启动子元件的CRE0106的合成的心肌特异性启动子。在一些优选的实施方式中，合成的心肌特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0106。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选所述近端启动子是肌肉特异性的或心肌特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是SKM_18或其功能变体。SKM_18是肌肉特异性的近端启动子。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0106，然后是SKM_18。
CRE0106具有SEQ ID NO：47的核酸序列。SEQ ID NO：47的功能变体可具有与SEQID NO：47至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。
CRE0106的功能变体是具有与CRE0106不同的序列的调控元件，但其基本上保留了作为心肌特异性CRE的活性。技术人员将理解，能够在保留其与必需转录因子(TF)结合并增强表达的能力的同时改变CRE的序列。功能变体可以包含与参考CRE相比的替换、缺失和/或插入，只要它们不会使得CRE基本上无功能的。
在一些实施方式中，CRE0106的功能变体可被视为当在启动子中取代CRE0106时基本上保留其活性的CRE。例如，包含取代CRE0106的CRE0106的功能变体的心肌特异性启动子优选保留它的活性的80％、更优选它的活性的90％、更优选它的活性的95％、并且还更优选它的活性的100％。例如，以启动子SP0477为例，可以用CRE0106的功能变体取代SP0477中的CRE0106，并且所述启动子基本上保留其活性。活性的保留可以通过比较在等同的条件下、在参考启动子或者包含被置换的CRE的相同启动子的控制下合适的报告子的表达来评估。
将注意到，可以在双链多核苷酸的任一条链上提供CRE0106或其功能变体，并且可以以任一方向提供。就其而言，SEQ ID NO：47或其功能变体的互补和反向互补序列落入本发明的范围内。包含根据SEQ ID NO：47的序列或其功能变体的单链核酸也落入本发明的范围内。
在一些实施方式中，CRE0106或其功能变体具有300个以下的核苷酸、200个以下的核苷酸、150个以下的核苷酸、125个以下的核苷酸、或100个以下的核苷酸的长度。SKM_18及其变体的序列在上文列出。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：19、或其功能变体的核酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO：19的功能变体可具有与SEQ ID NO：19至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：19的序列的启动子被称为SP0477。在一些实施方式中，SP0477启动子是特别优选的。预计这种启动子对心肌而言是特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0478及其变体
在一些实施方式中，启动子是包含可操作地连接至启动子元件的CRE0107的合成的心肌特异性启动子。在一些优选的实施方式中，合成的心肌特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0107。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选所述近端启动子是肌肉特异性的或心肌特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是SKM_18或其功能变体。SKM_18是肌肉特异性的近端启动子。在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0107，然后是SKM_18。
CRE0107具有SEQ ID NO：48的核酸序列。SEQ ID NO：48的功能变体可具有与SEQID NO：48至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。
CRE0107的功能变体是具有与CRE0107不同的序列的调控元件，但其基本上保留了作为心肌特异性CRE的活性。技术人员将理解，能够在保留其与必需转录因子(TF)结合并增强表达的能力的同时改变CRE的序列。功能变体可以包含与参考CRE相比的替换、缺失和/或插入，只要它们不会使得CRE基本上无功能的。
在一些实施方式中，CRE0107的功能变体可被视为当在启动子中取代CRE0107时基本保留其活性的CRE。例如，包含取代CRE0107的CRE0107的功能变体的心肌特异性启动子优选保留它的活性的80％、更优选它的活性的90％、更优选它的活性的95％、并且还更优选它的活性的100％。例如，以启动子SP0478为例，可以用CRE0107的功能变体取代SP0478中的CRE0107，并且启动子基本上保留其活性。活性的保留可以通过比较在等同的条件下、在参考启动子或者包含被置换的CRE的相同启动子的控制下合适的报告子的表达来评估。
将注意到，可以在双链多核苷酸的任一条链上提供CRE0107或其功能变体，并且可以以任一方向提供。就其而言，SEQ ID NO：48或其功能变体的互补和反向互补序列落入本发明的范围内。包含根据SEQ ID NO：48的序列或其功能变体的单链核酸也落入本发明的范围内。
在一些实施方式中，CRE0107或其功能变体具有300个以下的核苷酸、200个以下的核苷酸、150个以下的核苷酸、125个以下的核苷酸、或100个以下的核苷酸的长度。SKM_18及其变体的序列在上文列出。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：20、或其功能变体的核酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO：20的功能变体可具有与SEQ ID NO：20至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：20的序列的启动子被称为SP0478。在一些实施方式中，SP0478启动子是特别优选的。预计这种启动子对心肌而言是特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0479及其变体
在一些实施方式中，启动子是包含可操作地连接至启动子元件的CRE0108的合成的心肌特异性启动子。在一些优选的实施方式中，合成的心肌特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0108。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选近端启动子是肌肉特异性的或心肌特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是SKM_18或其功能变体。SKM_18是肌肉特异性的近端启动子。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0108，然后是SKM_18。
CRE0108具有SEQ ID NO：49的核酸序列。SEQ ID NO：49的功能变体可具有与SEQID NO：49至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。
CRE0108的功能变体是具有与CRE0108不同的序列的调控元件，但其基本上保留了作为心肌特异性CRE的活性。技术人员将理解，能够在保留其与必需转录因子(TF)结合并增强表达的能力的同时改变CRE的序列。功能变体可以包含与参考CRE相比的替换、缺失和/或插入，只要它们不会使得CRE基本上无功能的。
在一些实施方式中，CRE0108的功能变体可被视为当在启动子中取代CRE0108时基本上保持其活性的CRE。例如，包含取代CRE0108的CRE0108的功能变体的心肌特异性启动子优选保留它的活性的80％、更优选它的活性的90％、更优选它的活性的95％、并且还更优选它的活性的100％。例如，以启动子SP0479为例，可以用CRE0108的功能变体取代SP0479中的CRE0108，并且启动子基本上保留其活性。活性的保留可以通过比较在等同的条件下、在参考启动子或者包含被置换的CRE的相同启动子的控制下合适的报告子的表达来评估。
将注意到，可以在双链多核苷酸的任一条链上提供CRE0108或其功能变体，并且可以以任一方向提供。就其而言，SEQ ID NO：49或其功能变体的互补和反向互补序列落入本发明的范围内。包含根据SEQ ID NO：49的序列或其功能变体的单链核酸也落入本发明的范围内。
在一些实施方式中，CRE0108或其功能变体具有250个以下的核苷酸、200个以下的核苷酸、150个以下的核苷酸、125个以下的核苷酸、或100个以下的核苷酸的长度。SKM_18及其变体的序列在上文列出。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：21、或其功能变体的核酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO：21的功能变体可具有与SEQ ID NO：21至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：21的序列的启动子被称为SP0479。在一些实施方式中，SP0479启动子是特别优选的。预计这种启动子对心肌而言是特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0480及其变体
在一些实施方式中，启动子是包含可操作地连接至启动子元件的CRE0109的合成的心肌特异性启动子。在一些优选的实施方式中，合成的心肌特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0109。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选所述近端启动子是肌肉特异性的或心肌特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是SKM_18或其功能变体。SKM_18是肌肉特异性的近端启动子。在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0109，然后是SKM_18。
CRE0109具有SEQ ID NO：50的核酸序列。SEQ ID NO：50的功能变体可具有与SEQID NO：50至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。
CRE0109的功能变体是具有与CRE0109不同的序列的调控元件，但其基本上保留了作为心肌特异性CRE的活性。技术人员将理解，能够在保留其与必需转录因子(TF)结合并增强表达的能力的同时改变CRE的序列。功能变体可以包含与参考CRE相比的替换、缺失和/或插入，只要它们不会使得CRE基本上无功能的。
在一些实施方式中，CRE0109的功能变体可以被视为当在启动子中取代CRE0109时基本保持其活性的CRE。例如，包含取代CRE0109的CRE0109的功能变体的心肌特异性启动子优选保留它的活性的80％、更优选它的活性的90％、更优选它的活性的95％、并且还更优选它的活性的100％。例如，以启动子SP0480为例，可以用CRE0109的功能变体取代SP0480中的CRE0109，并且启动子基本上保留其活性。活性的保留可以通过比较在等同的条件下、在参考启动子或者包含被置换的CRE的相同启动子的控制下合适的报告子的表达来评估。
将注意到，可以在双链多核苷酸的任一条链上提供CRE0109或其功能变体，并且可以以任一方向提供。就其而言，SEQ ID NO：50或其功能变体的互补和反向互补序列落入本发明的范围内。包含根据SEQ ID NO：50的序列或其功能变体的单链核酸也落入本发明的范围内。
在一些实施方式中，CRE0109或其功能变体具有300个以下的核苷酸、250个以下的核苷酸、200个以下的核苷酸、150个以下的核苷酸、125个以下的核苷酸、或100个以下的核苷酸的长度。SKM_18及其变体的序列在上文列出。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：22、或其功能变体的核酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO：22的功能变体可具有与SEQ ID NO：22至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：22的序列的启动子被称为SP0480。在一些实施方式中，SP0480启动子是特别优选的。预计这种启动子对心肌而言是特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0481及其变体
在一些实施方式中，启动子是包含可操作地连接至启动子元件的CRE0033的合成的心肌特异性启动子。在一些优选的实施方式中，合成的心肌特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0033。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选所述近端启动子是肌肉特异性的或心肌特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是CRE0110或其功能变体。CRE0110是心肌特异性的近端启动子。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0033，然后是CRE0110。CRE0033及其变体的序列在上文列出。
CRE0110具有SEQ ID NO：59的核酸序列。SEQ ID NO：59的功能变体可具有与SEQID NO：59至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。
如上所讨论的，CRE0110的功能变体基本上保留了CRE0110充当心肌特异性启动子元件的能力。例如，当CRE0110的功能变体被替换到心肌特异性启动子SP0481中时，经修饰的启动子保留了它的活性的至少80％、更优选它的活性的至少90％、更优选它的活性的至少95％、并且还更优选SP0481的活性的100％。合适地，CRE0110的功能变体包含与SEQ IDNO：59具有至少70％、80％、90％、95％或99％同一性的序列。
在一些优选的实施方式中，包含CRE0110或其功能变体或者由CRE0110或其功能变体组成的启动子元件具有300个以下的核苷酸、250个以下的核苷酸、200个以下的核苷酸、150个以下的核苷酸、125个以下的核苷酸、110个以下的核苷酸、或95个以下的核苷酸的长度。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：23、或其功能变体的核酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO：23的功能变体可具有与SEQ ID NO：23至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：23的序列的启动子被称为SP0481。在一些实施方式中，SP0481启动子是特别优选的。预计这种启动子对心肌而言是特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0482及其变体
在一些实施方式中，启动子是包含可操作地连接至启动子元件的CRE0111的合成的心肌特异性启动子。在一些优选的实施方式中，合成的心肌特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0111。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选所述近端启动子是肌肉特异性的或心肌特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是SKM_18或其功能变体。SKM_18是肌肉特异性的近端启动子。在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0111，然后是SKM_18。
CRE0111具有SEQ ID NO：51的核酸序列。SEQ ID NO：51的功能变体可具有与SEQID NO：51至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。
CRE0111的功能变体是具有与CRE0111不同的序列的调控元件，但其基本上保留了作为心肌特异性CRE的活性。技术人员将理解，能够在保留其与必需转录因子(TF)结合并增强表达的能力的同时改变CRE的序列。功能变体可以包含与参考CRE相比的替换、缺失和/或插入，只要它们不会使得CRE基本上无功能的。
在一些实施方式中，CRE0111的功能变体可被视为当在启动子中取代CRE0111时基本上保留其活性的CRE。例如，包含取代CRE0111的CRE0111的功能变体的心肌特异性启动子优选保留它的活性的80％、更优选它的活性的90％、更优选它的活性的95％、并且还更优选它的活性的100％。例如，以启动子SP0482为例，可以用CRE0111的功能变体取代SP0482中的CRE0111，并且启动子基本上保留其活性。活性的保留可以通过比较在等同的条件下、在参考启动子或者包含被置换的CRE的相同启动子的控制下合适的报告子的表达来评估。
将注意到，可以在双链多核苷酸的任一条链上提供CRE0111或其功能变体，并且可以以任一方向提供。就其而言，SEQ ID NO：51或其功能变体的互补和反向互补序列落入本发明的范围内。包含根据SEQ ID NO：51的序列或其功能变体的单链核酸也落入本发明的范围内。
在一些实施方式中，CRE0111或其功能变体具有300个以下的核苷酸、200个以下的核苷酸、150个以下的核苷酸、125个以下的核苷酸、或100个以下的核苷酸的长度。SKM_18及其变体的序列在上文列出。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：24、或其功能变体的核酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO：24的功能变体可具有与SEQ ID NO：24至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：24的序列的启动子被称为SP0482。在一些实施方式中，SP0482启动子是特别优选的。预计这种启动子对心肌而言是特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0483及其变体
在一些实施方式中，启动子是包含可操作地连接至启动子元件的CRE0033的合成的心肌特异性启动子。在一些优选的实施方式中，合成的心肌特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0033。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选所述近端启动子是肌肉特异性的或心肌特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是CRE0112或其功能变体。CRE0112是心肌特异性的近端启动子。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0033，然后是CRE0112。CRE0033及其变体的序列在上文列出。
CRE0112具有SEQ ID NO：60的核酸序列。SEQ ID NO：60的功能变体可具有与SEQID NO：60至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。
如上所讨论的，CRE0112的功能变体基本上保留了CRE0112充当心肌特异性启动子元件的能力。例如，当CRE0112的功能变体被替换到心肌特异性启动子SP0483中时，经修饰的启动子保留了它的活性的至少80％、更优选它的活性的至少90％、更优选它的活性的至少95％、并且还更优选SP0483的活性的100％。合适地，CRE0112的功能变体包含与SEQ IDNO：60具有至少70％、80％、90％、95％或99％同一性的序列。
在一些优选的实施方式中，包含CRE0112或其功能变体或者由CRE0112或其功能变体组成的启动子元件具有300个以下的核苷酸、250个以下的核苷酸、200个以下的核苷酸、150个以下的核苷酸、125个以下的核苷酸、110个以下的核苷酸、或95个以下的核苷酸的长度。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：25、或其功能变体的核酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO：25的功能变体可具有与SEQ ID NO：25至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：25的序列的启动子被称为SP0483。在一些实施方式中，SP0483启动子是特别优选的。预计这种启动子对心肌而言是特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0484及其变体
在一些实施方式中，启动子是包含可操作地连接至启动子元件的CRE0033的合成的心肌特异性启动子。在一些优选的实施方式中，合成的心肌特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0033。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选所述近端启动子是肌肉特异性的或心肌特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是CRE0113或其功能变体。CRE0113是心肌特异性的近端启动子。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0033，然后是CRE0113。CRE0033及其变体的序列在上文列出。
CRE0113具有SEQ ID NO：61的核酸序列。SEQ ID NO：61的功能变体可具有与SEQID NO：61至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。
如上所讨论的，CRE0113的功能变体基本上保留了CRE0113充当心肌特异性启动子元件的能力。例如，当CRE0113的功能变体被替换到心肌特异性启动子SP0484中时，经修饰的启动子保留了它的活性的至少80％、更优选它的活性的至少90％、更优选它的活性的至少95％、并且还更优选SP0484的活性的100％。合适地，CRE0113的功能变体包含与SEQ IDNO：61具有至少70％、80％、90％、95％或99％同一性的序列。
在一些优选的实施方式中，包含CRE0113或其功能变体或由CRE0113或其功能变体组成的启动子元件具有300个以下的核苷酸、250个以下的核苷酸、200个以下的核苷酸、150个以下的核苷酸、125个以下的核苷酸、110个以下的核苷酸、或95个以下的核苷酸的长度。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：26或其功能变体的核酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO：26的功能变体可具有与SEQ ID NO：26至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ IDNO：26的序列的启动子被称为SP0484。在一些实施方式中，SP0484启动子是特别优选的。预计这种启动子对心肌而言是特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0485及其变体
在一些实施方式中，启动子是包含可操作地连接至启动子元件的CRE0114的合成的心肌特异性启动子。在一些优选的实施方式中，合成的心肌特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0114。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选所述近端启动子是肌肉特异性的或心肌特异性的。在一些优选的实施方式中，启动子元件是SKM_18或其功能变体。SKM_18是肌肉特异性的近端启动子。在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0114，然后是SKM_18。
CRE0114具有SEQ ID NO：52的核酸序列。SEQ ID NO：52的功能变体可具有与SEQID NO：52至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。
CRE0114的功能变体是具有与CRE0114不同的序列的调控元件，但其基本上保留了作为心肌特异性CRE的活性。技术人员将理解，能够在保留其与必需转录因子(TF)结合并增强表达的能力的同时改变CRE的序列。功能变体可以包含与参考CRE相比的替换、缺失和/或插入，只要它们不会使得CRE基本上无功能的。
在一些实施方式中，CRE0114的功能变体可被视为当在启动子中取代CRE0114时基本上保留其活性的CRE。例如，包含取代CRE0114的CRE0114的功能变体的心肌特异性启动子优选保留它的活性的80％、更优选它的活性的90％、更优选它的活性的95％、并且还更优选它的活性的100％。例如，以启动子SP0485为例，可以用CRE0114的功能变体取代SP0485中的CRE0114，并且启动子基本上保留其活性。活性的保留可以通过比较在等同的条件下、在参考启动子或者包含被置换代的CRE的相同启动子的控制下合适的报告子的表达来评估。
将注意到，可以在双链多核苷酸的任一条链上提供CRE0114或其功能变体，并且可以以任一方向提供。就其而言，SEQ ID NO：52或其功能变体的互补和反向互补序列落入本发明的范围内。包含根据SEQ ID NO：52的序列或其功能变体的单链核酸也落入本发明的范围内。
在一些实施方式中，CRE0114或其功能变体具有200个以下的核苷酸、150个以下的核苷酸、125个以下的核苷酸、或100个以下的核苷酸的长度。
SKM_18及其变体的序列在上文列出。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：27或其功能变体的核酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO：27的功能变体可具有与SEQ ID NO：27至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ IDNO：27的序列的启动子被称为SP0485。在一些实施方式中，SP0485启动子是特别优选的。预计这种启动子对心肌而言是特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0486及其变体
在一些实施方式中，启动子是包含可操作地连接至启动子元件的CRE0033的合成的心肌特异性启动子。在一些优选的实施方式中，合成的心肌特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0033。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选所述近端启动子是肌肉特异性的或心肌特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是CRE0115或其功能变体。CRE0115是心肌特异性的近端启动子。在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0033，然后是CRE0115。
CRE0033及其变体的序列在上文列出。
CRE0115具有SEQ ID NO：62的核酸序列。SEQ ID NO：62的功能变体可具有与SEQID NO：62至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。
如上所讨论的，CRE0115的功能变体基本上保留了CRE0115充当心肌特异性启动子元件的能力。例如，当CRE0115的功能变体被替换到心肌特异性启动子SP0486中时，经修饰的启动子保留了它的活性的至少80％、更优选它的活性的至少90％、更优选它的活性的至少95％、并且还更优选SP0486的活性的100％。合适地，CRE0115的功能变体包含与SEQ IDNO：62具有至少70％、80％、90％、95％或99％同一性的序列。
在一些优选的实施方式中，包含CRE0115或其功能变体或者由CRE0115或其功能变体组成的启动子元件具有300个以下的核苷酸、250个以下的核苷酸、200个以下的核苷酸、150个以下的核苷酸、125个以下的核苷酸、110个以下的核苷酸、或95个以下的核苷酸的长度。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：28或其功能变体的核酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO：28的功能变体可具有与SEQ ID NO：28至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ IDNO：28的序列的启动子被称为SP0486。在一些实施方式中，SP0486启动子是特别优选的。预计这种启动子对心肌而言是特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0487及其变体
在一些实施方式中，启动子是包含可操作地连接至启动子元件的CRE0033的合成的心肌特异性启动子。在一些优选的实施方式中，合成的心肌特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0033。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选所述近端启动子是肌肉特异性的或心肌特异性的。在一些优选的实施方式中，启动子元件是CRE0116或其功能变体。CRE0116是心肌特异性的近端启动子。在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0033，然后是CRE0116。CRE0033及其变体的序列在上文列出。
CRE0116具有SEQ ID NO：63的核酸序列。SEQ ID NO：63的功能变体可具有与SEQID NO：63至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。
如上所讨论的，CRE0116的功能变体基本上保留了CRE0116充当心肌特异性启动子元件的能力。例如，当CRE0116的功能变体被替换到心肌特异性启动子SP0487中时，经修饰的启动子保留了它的活性的至少80％、更优选它的活性的至少90％、更优选它的活性的至少95％、并且还更优选SP0487的活性的100％。合适地，CRE0116的功能变体包含与SEQ IDNO：63具有至少70％、80％、90％、95％或99％同一性的序列。
在一些优选的实施方式中，包含CRE0116或其功能变体或者由CRE0116或其功能变体组成的启动子元件具有300个以下的核苷酸、250个以下的核苷酸、200个以下的核苷酸、150个以下的核苷酸、125个以下的核苷酸、110个以下的核苷酸、或95个以下的核苷酸的长度。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：29或其功能变体的核酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO：29的功能变体可具有与SEQ ID NO：29至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ IDNO：29的序列的启动子被称为SP0487。在一些实施方式中，SP0487启动子是特别优选的。预计这种启动子对心肌而言是特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0488及其变体
在一些实施方式中，启动子是包含可操作地连接至启动子元件的CRE0117合成的心肌特异性启动子。在一些优选的实施方式中，合成的心肌特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0117。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选所述近端启动子是肌肉特异性的或心肌特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是SKM_18或其功能变体。SKM_18是肌肉特异性的近端启动子。在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0117，然后是SKM_18。
CRE0117具有SEQ ID NO：53的核酸序列。SEQ ID NO：53的功能变体可具有与SEQID NO：53至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。
CRE0117的功能变体是具有与CRE0117不同的序列的调控元件，但其基本上保留了作为心肌特异性CRE的活性。技术人员将理解，能够在保留其与必需转录因子(TF)结合并增强表达的能力的同时改变CRE的序列。功能变体可以包含与参考CRE相比的替换、缺失和/或插入，只要它们不会使得CRE基本上无功能的。
在一些实施方式中，CRE0117的功能变体可被视为当在启动子中取代CRE0117时基本上保留其活性的CRE。例如，包含取代CRE0117的CRE0117的功能变体的心肌特异性启动子优选保留它的活性的80％、更优选它的活性的90％、更优选它的活性的95％、并且还更优选它的活性的100％。例如，以启动子SP0488为例，可以用CRE0117的功能变体取代SP0488中的CRE0117，并且启动子基本上保留其活性。活性的保留可以通过比较在等同的条件下、在参考启动子或者包含被置换的CRE的相同启动子的控制下合适的报告子的表达来评估。
将注意到，可以在双链多核苷酸的任一条链上提供CRE0117或其功能变体，并且可以以任一方向提供。就其而言，SEQ ID NO：53或其功能变体的互补和反向互补序列落入本发明的范围内。包含根据SEQ ID NO：53的序列或其功能变体的单链核酸也落入本发明的范围内。
在一些实施方式中，CRE0117或其功能变体具有300个以下的核苷酸、200个以下的核苷酸、150个以下的核苷酸、125个以下的核苷酸、或100个以下的核苷酸的长度。
SKM_18及其变体的序列在上文列出。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：30、或其功能变体的核酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO：30的功能变体可具有与SEQ ID NO：30至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：30的序列的启动子被称为SP0488。在一些实施方式中，SP0488启动子是特别优选的。预计这种启动子对心肌而言是特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0489及其变体
在一些实施方式中，包含可操作地连接至启动子元件的CRE0033的启动子是合成的心肌特异性启动子。在一些优选的实施方式中，合成的心肌特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0033。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选近端启动子是肌肉特异性的或心肌特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是CRE0104或其功能变体。CRE0104是心肌特异性的近端启动子。在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0033，然后是CRE0104。
CRE0033及其变体的序列在上文列出。
CRE0104具有SEQ ID NO：58的核酸序列。SEQ ID NO：58的功能变体可具有与SEQID NO：58至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。
如上所讨论的，CRE0104的功能变体基本上保留了CRE0104充当心肌特异性启动子元件的能力。例如，当CRE0104的功能变体被替换到心肌特异性启动子SP0489中时，经修饰的启动子保留了它的活性的至少80％、更优选它的活性的至少90％、更优选它的活性的至少95％、并且还更优选SP0489的活性的100％。适合地，CRE0104的功能变体包含与SEQ IDNO：58具有至少70％、80％、90％、95％或99％同一性的序列。
在一些优选的实施方式中，包含CRE0104或其功能变体或由CRE0104或其功能变体组成的启动子元件具有400个以下的核苷酸、300个以下的核苷酸、250个以下的核苷酸、200个以下的核苷酸、150个以下的核苷酸、125个以下的核苷酸、110个以下的核苷酸、或95个以下的核苷酸的长度。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：31、或其功能变体的核酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO：31的功能变体可具有与SEQ ID NO：31至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：31的序列的启动子被称为SP0489。在一些实施方式中，SP0489启动子是特别优选的。预计这种启动子对心肌而言是特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0490及其变体
在一些实施方式中，启动子是包含可操作地连接至启动子元件的CRE0106的合成的心肌特异性启动子。在一些优选的实施方式中，所述合成的心肌特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0106。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选所述近端启动子是肌肉特异性的或心肌特异性的。在一些优选的实施方式中，启动子元件是CRE0110或其功能变体。CRE0110是心肌特异性的近端启动子。在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0106，然后是CRE0110。CRE0106及其变体的序列在上文列出。CRE0110及其变体的序列在上文列出。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：32、或其功能变体的核酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO：32的功能变体可具有与SEQ ID NO：32至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：32的序列的启动子被称为SP0490。在一些实施方式中，SP0490启动子是特别优选的。预计这种启动子对心肌而言是特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0491及其变体
在一些实施方式中，启动子是包含可操作地连接至启动子元件的CRE0107的合成的心肌特异性启动子。在一些优选的实施方式中，合成的心肌特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0107。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选所述近端启动子是肌肉特异性的或心肌特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是CRE0110或其功能变体。CRE0110是心肌特异性的近端启动子。在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0107，然后是CRE0110。CRE0107及其变体的序列在上文列出。CRE0110及其变体的序列在上文列出。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：33、或其功能变体的核酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO：33的功能变体可具有与SEQ ID NO：33至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：33的序列的启动子被称为SP0491。在一些实施方式中，SP0491启动子是特别优选的。预计这种启动子对心肌而言是特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0492及其变体
在一些实施方式中，启动子是包含可操作地连接至启动子元件的CRE0106的合成的心肌特异性启动子。在一些优选的实施方式中，合成的心肌特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0106。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选所述近端启动子是肌肉特异性的或心肌特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是CRE0116或其功能变体。CRE0116是心肌特异性的近端启动子。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0106，然后是CRE0116。CRE0106及其变体的序列在上文列出。CRE0116及其变体的序列在上文列出。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：34、或其功能变体的核酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO：34的功能变体可具有与SEQ ID NO：34至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：34的序列的启动子被称为SP0492。在一些实施方式中，SP0492启动子是特别优选的。预计这种启动子对心肌而言是特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0493及其变体
在一些实施方式中，启动子是包含可操作地连接至启动子元件的CRE0107的合成的心肌特异性启动子。在一些优选的实施方式中，合成的心肌特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0107。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选所述近端启动子是肌肉特异性的或心肌特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是CRE0116或其功能变体。CRE0116是心肌特异性的近端启动子。在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0107，然后是CRE0116。CRE0107及其变体的序列在上文列出。CRE0116及其变体的序列在上文列出。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：35、或其功能变体的核酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO：35的功能变体可具有与SEQ ID NO：35至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：35的序列的启动子被称为SP0493。在一些实施方式中，SP0493启动子是特别优选的。已经发现这种启动子对心肌而言是特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0494及其变体
在一些实施方式中，启动子是包含可操作地连接至启动子元件的CRE0118的合成的心肌特异性启动子。在一些优选的实施方式中，合成的心肌特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0118。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选所述近端启动子是肌肉特异性的或心肌特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是SKM_18或其功能变体。SKM_18是肌肉特异性的近端启动子。在一些实施方式中，心肌特异性的启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0118，然后是SKM_18。
CRE0118具有SEQ ID NO：54的核酸序列。SEQ ID NO：54的功能变体可具有与SEQID NO：54至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。
CRE0118的功能变体是具有与CRE0118不同的序列的调控元件，但其基本上保留了作为心肌特异性CRE的活性。技术人员将理解，能够在保留其与必需转录因子(TF)结合并增强表达的能力的同时改变CRE的序列。功能变体可以包含与参考CRE相比的替换、缺失和/或插入，只要它们不会使得CRE基本上无功能的。
在一些实施方式中，CRE0118的功能变体可被视为当在启动子中取代CRE0118时基本上保留其活性的CRE。例如，包含取代CRE0118的CRE0118的功能变体的心肌特异性启动子优选保留它的活性的80％、更优选它的活性的90％、更优选它的活性的95％、并且还更优选它的活性的100％。例如，以启动子SP0494为例，可以用CRE0118的功能变体取代SP0494中的CRE0118，并且启动子基本上保留其活性。活性的保留可以通过比较在等同的条件下、在参考启动子或者包含被置换的CRE的相同启动子的控制下合适的报告子的表达来评估。
将注意到，可以在双链多核苷酸的任一条链上提供CRE0118或其功能变体，并且可以以任一方向提供。就其而言，SEQ ID NO：54或其功能变体的互补和反向互补序列落入本发明的范围内。包含根据SEQ ID NO：54的序列或其功能变体的单链核酸也落入本发明的范围内。
在一些实施方式中，CRE0118或其功能变体具有300个以下的核苷酸、200个以下的核苷酸、150个以下的核苷酸、125个以下的核苷酸、或100个以下的核苷酸的长度。
SKM_18及其变体的序列在上文列出。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：36、或其功能变体的核酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO：36的功能变体可具有与SEQ ID NO：36至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：36的序列的启动子被称为SP0494。在一些实施方式中，SP0494启动子是特别优选的。已经发现这种启动子对心肌而言是特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0495及其变体
在一些实施方式中，启动子是包含顺式调控元件CRE0106和CRE0033、或其功能变体的组合的合成的心肌特异性启动子。通常，CRE可操作地连接至启动子元件。在一些优选的实施方式中，心肌特异性启动子包含所述CRE或其功能变体，处于CRE0106、CRE0033、然后是启动子元件的顺序(如本领域常规的，顺序按上游到下游的方向给出)。在一些优选的实施方式中，心肌特异性启动子包含所述CRE或其功能变体，处于CRE0033、CRE0106、然后是启动子元件的顺序(如本领域常规的，顺序按上游到下游的方向给出)。
启动子元件可以是任何合适的近端启动子或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选所述近端启动子是肌肉特异性的或心肌特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是CRE0116或其功能变体。CRE0116是心肌特异性的近端启动子。因此，在一个实施方式中，所述启动子包含以下调控元件：CRE0106、CRE0033和CRE0116，或其功能变体。CRE0106及其变体的序列在上文列出。CRE0033及其变体的序列在上文列出。CRE0116及其变体的序列在上文列出。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：37、或其功能变体的核酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO：37的功能变体可具有与SEQ ID NO：37至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：37的序列的启动子被称为SP0495。在一些实施方式中，SP0495启动子是特别优选的。已经发现这种启动子对心肌而言是特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0496及其变体
在一些实施方式中，启动子是包含顺式调控元件CRE0107和CRE0033、或其功能变体的组合的合成的心肌特异性启动子。通常，CRE可操作地连接至启动子元件。在一些优选的实施方式中，心肌特异性启动子包含所述CRE或其功能变体，处于CRE0107、CRE0033、然后是启动子元件的顺序(如本领域常规的，顺序按上游到下游的方向给出)。在一些优选的实施方式中，心肌特异性启动子包含所述CRE或其功能变体，处于CRE0033、CRE0107、然后是启动子元件的顺序(如本领域常规的，顺序按上游到下游的方向给出)。
启动子元件可以是任何合适的近端启动子或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当启动子是近端启动子时，一般优选近端启动子是肌肉特异性的或心肌特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是CRE0116或其功能变体。CRE0116是心肌特异性的近端启动子。
因此，在一个实施方式中，启动子包含以下调控元件：CRE0107、CRE0033和CRE0116，或其功能变体。CRE0106的序列及其变体在上文列出。CRE0033及其变体的序列在上文列出。CRE0116及其变体的序列在上文列出。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含SEQ ID NO：38、或其功能变体的核酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO：38的功能变体可具有与SEQ ID NO：38至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：38的序列的启动子被称为SP0496。在一些实施方式中，SP0496启动子是特别优选的。已经发现这种启动子对心肌而言是特异性的，这在一些情况下是有利的。
串联启动子
在一些实施方式中，合成的心肌特异性启动子包含两个以上的启动子元件。包含两个以上的启动子元件的合成启动子在本文中被称为“串联启动子”。例如，因为SP0452包含启动子元件CRE0082和SKM_18，SP0452是串联启动子。在一些实施方式中，串联启动子可包含直接在另一个启动子元件上游的启动子元件。在一些实施方式中，串联启动子可在一个或每个启动子元件的上游包含一个或多个CRE。在一些实施方式中，串联启动子可在启动子元件之间包含一个或多个CRE。在一些实施方式中，本文所公开的任何一个合成的心肌特异性启动子可以可操作地连接至进一步的启动子元件。例如，SP0452是可操作地连接至启动子元件CRE0082的合成启动子SP0067。将会理解，合成启动子SP0067可以可操作地连接至本文所公开的任何其它启动子元件。类似地，本文所公开的任何其它合成启动子可以可操作地连接至本文所公开的任何启动子元件。
复合启动子
在一些实施方式中，如上文列出的肌肉特异性、心肌特异性或骨骼肌特异性的启动子可操作地连接至一个或多个另外的调控序列。例如，与没有可操作地连接另外的调控序列的肌肉特异性、心肌特异性或骨骼肌特异性的启动子相比，另外的调控序列能够增强表达。一般来说，优选的是，另外的调控序列不会实质性地降低肌肉特异性、心肌特异性或骨骼肌特异性的启动子的特异性。
例如，根据本发明的合成的肌肉特异性、心肌特异性或骨骼肌特异性的启动子能够可操作地连接至编码UTR(例如5’和/或3’UTR)的序列和/或内含子，或诸如此类。在一些实施方式中，心肌特异性启动子可操作地连接至编码UTR(例如5’UTR)的序列。5’UTR可以含有可以调控基因表达的各种元件。天然基因中的5’UTR从转录起始位点开始，并且在编码区的起始密码子的前一个核苷酸结束。应该注意的是，本文所指的5’UTR可以是整个天然形成的5’UTR，或者它可以是天然形成的5’UTR的一部分。5’UTR也可以是部分或完全合成的。在真核生物中，5’UTR的中位长度为约150个核苷酸，但在一些情况下它们可以更长得多。可见于5’UTR中的调控序列包括但不限于：(i)蛋白质的结合位点，其可影响mRNA的稳定性或翻译；(ii)核糖开关；(iii)促进或抑制翻译启动的序列；以及(iv)5’UTR内的内含子，与基因表达和mRNA输出的调控有关。
当调控序列包含5’UTR和内含子两者时，可称它为5’UTR和内含子。在一些实施方式中，如上文列出的心肌特异性启动子可操作地连接至编码来源于CMV主要立即基因(CMVmajor immediate gene，CMV-IE基因)的5’UTR和内含子的序列。例如，来自CMV-IE基因的5’UTR和内含子适当地包含CMV-IE基因外显子1和CMV-IE基因外显子1、或其部分。在一些情况下，考虑到与5’UTR的连接，可对启动子元件进行修饰，例如启动子元件中的转录起始位点(TSS)的下游序列可以被移除(例如用5’UTR替换)。
在Simari等，Molecular Medicine 4:700-706，1998“Requirements forEnhanced Transgene Expression by Untranslated Sequencesfrom the HumanCytomegalovirus Immediate-Early Gene”中描述了所述CMV-IE 5’UTR和内含子，其通过引用并入本文。在Simari等中讨论的CMV-IE5’UTR和内含子序列的变体也记载在WO2002/031137中，通过引用并入，并且也可以使用其中公开的调控序列。
能够与启动子组合使用的其它UTR在本领域是己知的，例如在Leppek，K.，Das，R.&Barna，M.“Functional5’UTR mRNA structures in eukaryotic translation regulationand how to find them”.Nat Rev Mol Cell Biol19，158-174(2018)中，通过引用并入。
在一些实施方式中，编码5’UTR和内含子的序列包含SEQ ID NO：65的核酸序列、或其功能变体。在一些实施方式中，SEQ ID NO：65的功能变体可具有与SEQ ID NO：65至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。SEQIDNO：65编码CMV-IE 5’UTR和内含子。
表8公开了用于本文所公开的启动子序列或rAAV构建体中的其它示例性元件(例如内含子/UTR、polyA序列)的序列标识号。
表8：
名称 SEQUENCE ID NO：
HBB SEQ ID NO：283
CMV-IE 5’UTR和内含子 SEQ ID NO：65
最小polyA序列 SEQ ID NO：284
最小polyA序列 SEQ ID NO：285
SV40早期polyA SEQ ID NO：286
RBG polyA SEQ ID NO：287
全合成poly A序列 SEQ ID NO：288
polyA SEQ ID NO：445
在一些实施方式中，5’UTR适当地包含作为蛋白质翻译起始位点的核酸基序，例如，在所产生的mRNA中定义Kozak序列的序列。例如，在一些实施方式中，编码5’UTR的序列在其3’端或其3’端附近包含序列基序GCCACC。可以使用其它Kozak序列或其它蛋白质翻译起始位点，如本领域己知的那些(例如Marilyn Kozak，“Point Mutations Define aSequence Flanking the AUG Initiator Codon That Modulates Translation byEukaryotic Ribosomes”Cell，Vol.44，283-292，1986年1月31日；Marilyn Kozak“At leastSix Nucleotides Preceding the AUG Initiator Codon Enhance Translation inMammalian Cells”J.Mol.Rid.(1987)196，947-950；Marilyn Kozak“An analysis of 5’-noncoding sequences from 699vertebrate messenger RNAs”Nucleic AcidsResearch.Vol.15(20)1987，所有这些通过引用并入本文)。所述蛋白质翻译起始位点(例如Kozak序列)优选定位于紧邻起始密码子的位置。
在一些实施方式中，将任何一个上述启动子或其变体连接至编码5’UTR和/或5’UTR和内含子的序列以提供复合启动子。在本文中，这种复合启动子可以被简单地称为“复合启动子”，或者在一些情况下为简洁起见简称为“启动子”。
在一些实施方式中，将如以上所讨论的SP0067启动子或其变体连接至编码5’UTR和内含子的序列以提供复合启动子。在一些实施方式中，所述复合启动子包含SEQ ID NO：17或其功能变体。这种复合启动子构建体包含可操作地与来自CMV-IE基因的5’UTR和内含子连接的SP0067。这种复合启动子被称为SP0475，如本文以上所述。
iii.CRE及其功能变体
本文公开了可用于构建心脏特异性启动子的各种CRE。合适地，所述CRE是心脏特异性的。这些CRE通常来源于基因组启动子和增强子序列，但它们在本文中在与它们的原生基因组环境非常不同的背景下被使用。一般来说，CRE构成更大得多的基因组调控结构域的较小的部分，所述调控结构域控制与它们通常相关的基因的表达。令人惊讶地发现这些CRE(其中许多非常小)可以从它们的正常环境中分离，并保留心脏特异性调控活性。这是令人惊讶的，因为从基因组中复杂和“三维”的自然环境移除调控序列通常导致活性的显著丧失，所以没有理由期望一旦从它们的自然环境中移除，给定的CRE会保留观察到的活性水平。当CRE在AAV载体中保留心脏特异性活性时更令人惊讶。这种情况尤其如此，因为AAV载体包含反向末端重复序列(ITR)并且与基因组相比具有不同的DNA结构，并且已知ITR和DNA结构两者会影响CRE的活性。
应该注意的是，可以在不造成活性的实质丧失的情况下改变本发明的CRE的序列。只要避免对CRE的活性显著有害的修饰，可以通过修饰CRE的序列来制备CRE的功能变体。考虑到本公开所提供的信息，修饰CRE以提供功能变体是易懂的。此外，本公开提供了用于简单地评估任何给定的CRE变体的功能性的方法学。
根据本发明的某些CRE的相对小的尺寸是有利的，因为它允许在占用最小量的载体有效载荷的同时在载体中提供CRE(更具体来说，含有它们的启动子)。当在有限容量的载体(例如基于AAV的载体)中使用CRE时，这特别重要。
表3：用于心脏特异性启动子的示例性CRE(顺式调控元件)的核酸序列的序列标识号
Figure BDA0004161819920001591
本发明的CRE包含某些心脏特异性转录因子结合位点(TFBS)。通常期望这些心脏特异性TFBS在CRE的功能变体中保留功能。技术人员非常清楚TFBS序列可以变化，但保留功能性。考虑到这点，TFBS的序列通常由共有序列来说明，从所述共有序列中通常显示一定程度的变化。可以使用位置权重矩阵(PWM)说明关于TFBS中发生的变化的进一步信息，所述位置权重矩阵表示在共有序列的给定位置处通常发现给定核苷酸的频率。TF共有序列和相关位置权重矩阵的细节可见于例如Jaspar或Transfac数据库http://jaspar.genereg.net/和http://gene-regulation.com/pub/databases.html中。这些信息允许技术人员以保留(并且在某些情况下甚至增加)CRE功能性的方式修饰CRE的任何给定TFBS中的序列。考虑到这些，技术人员对于如何能够在保持与期望的TF结合的能力的同时修饰任何给定的TF的TFBS有充分的指导；例如，Jaspar系统将基于其与给定的PWM的相似性对假定的TFBS进行评分。进一步地，可以针对来自JASPAR数据库的所有PWM扫描CRE，以识别/分析所有TFBS。当然，技术人员可以在文献中找到另外的指导，并且此外，可以使用常规实验以确认TF与任何变体CRE中假定的TFBS的结合。将是显然的，可以在保留功能的同时完成在CRE中、甚至在CRE中的TFBS内的显著的序列修饰。
本发明的CRE可以与广泛的合适的最小启动子或心脏特异性的近端启动子组合使用。
CRE的功能变体包含与参考CRE元件不同的序列，但其基本上保留了作为心脏特异性CRE的活性。技术人员将理解，能够在保留其募集合适的心脏特异性转录因子(TF)的能力并从而增强表达的同时改变CRE的序列。CRE的功能变体可以包含与参考CRE相比的替换、缺失和/或插入，只要它们不会使得CRE基本上无功能的。
在一些实施方式中，CRE的功能变体可被视为当在启动子中取代参考CRE时基本上保留其活性的CRE。例如，包含给定的CRE的功能变体的心脏特异性启动子优选保留它的活性的至少80％、更优选它的活性的至少90％、更优选它的活性的至少95％、并且还更优选它的活性的100％(与包含未修饰的CRE的参考启动子相比)。
合适地，与参考CRE相比，CRE的功能变体保留了显著水平的序列同一性。合适地，功能变体包含与参考CRE至少70％相同的序列，更优选与参考CRE至少80％、90％、95％或99％相同的序列。
活性的保留可以通过比较在等同的条件下、在参考启动子或者包含被置换的CRE的相同启动子的控制下合适的报告子的表达来评估。在本文中(例如，在实施例中)公开了用于评估心脏特异性启动子活性的合适的测定。
在一些实施方式中，CRE可以与一个或多个另外的CRE组合以创建顺式调控模块(CRM)。可以在根据本发明的CRE的上游、或者在根据本发明的CRE的下游提供另外的CRE。所述另外的CRE可以是本文所公开的CRE，或者它们可以是其它CRE。合适地，所述另外的CRE是心脏特异性的。
根据本发明的CRE或包含根据本发明的CRE的CRM可包含一个或多个另外的调控元件。例如，它们可包含可诱导或可抑制的元件、边界控制元件、绝缘子、基因座调控区域、应答元件、结合位点、末端重复序列的区段、响应位点(responsive site)、稳定元件、去稳定元件和剪接元件等，只要它们不会使得CRE或CRM基本上无功能的。
包含根据本发明的CRE的启动子可包含在CRM和最小或近端启动子之间和/或在CRE之间的间隔区。另外地或替代性地，间隔区可存在于CRM的5’端。
显然，根据本发明的CRE或包含根据本发明的CRE的CRM或其功能变体可以与任何合适的启动子元件组合，以提供根据本发明的合成的心脏特异性启动子。合适地，所述启动子元件是心脏特异性的近端启动子。
在许多情况中，更短的启动子序列是优选的，特别是用于载体(例如病毒载体，例如AAV)具有有限的容量的情况。因此，在一些实施方式中，根据本发明的CRE或其功能变体的长度为600个以下的核苷酸，例如600个、500个、450个、400个、350个、300个、250个、200个、150个、100个、75个、60个、50个或更少的核苷酸。合适地，包含根据SEQ ID NO：19-24、27、28的至少一个CRE或其功能变体的合成的心脏特异性CRM的长度为1000个以下的核苷酸，例如950个、900个、850个、800个、750个、700个、650个、600个、550个、500个、450个、400个、350个、300个、250个、200个、150个、100个、75个、60个、50个或更少的核苷酸。
iv.CRM及其功能变体
本发明公开了各种合成的心脏特异性CRM，其可用于构建合成的心脏特异性启动子。本发明的CRM可与广泛的合适的最小启动子或心脏特异性近端启动子组合使用。
CRM的功能变体包含与参考CRM元件不同的序列，但其基本上保留了作为心脏特异性CRM的活性。技术人员将理解，能够在保留其募集合适的心脏特异性转录因子(TF)的能力并从而增强表达的同时改变CRM的序列。CRM的功能变体可以包含与参考CRM相比的替换、缺失和/或插入，只要它们不会使得CRM基本上无功能的。
在一些实施方式中，CRM的功能变体可被视为当在启动子中取代参考CRM时基本上保留其活性的CRM。例如，包含给定的CRM的功能变体的心脏特异性启动子优选保留它的活性的至少80％、更优选它的活性的至少90％、更优选它的活性的至少95％、并且还更优选它的活性的100％(与包含未修饰的CRM的参考启动子相比)。
合适地，与参考CRM相比，CRM的功能变体保留了显著水平的序列同一性。合适地，功能变体包含与参考CRM至少70％相同的序列，更优选与参考CRM至少80％、90％、95％或99％相同的序列。
活性的保留可以通过比较在等同的条件下、在参考启动子或者包含被置换的CRM的相同启动子的控制下合适的报告子的表达来评估。在本文中(例如，在实施例中)公开了用于评估心脏特异性启动子活性的合适的测定。
在一些实施方式中，给定的CRM的功能变体可以包含存在于参考CRM中的一个或多个CRE的功能变体。例如，给定的CRM的功能变体可以包含存在于参考CRM中的1个或2个CRE的功能变体。
在一些实施方式中，给定的CRM的功能变体可以包含与参考CRM相同的组合CRE，但所述CRE可以以与参考CRM不同的顺序存在。通常优选的是CRE以与参考CRM相同的顺序存在(从而，CRM的所述功能变体适当地包含与参考CRM中列出的相同的CRE排列方式)。
在一些实施方式中，给定的CRM的功能变体可以包含在参考CRM中存在的一个或多个另外的CRE。可以在参考CRM中存在的CRE的上游、在参考CRM中存在的CRE的下游和/或在参考CRM中存在的CRE之间提供另外的CRE。所述另外的CRE可以是本文所公开的CRE，或者它们可以是其它CRE。一般来说，优选的是，给定的CRM的功能变体包含相同的CRE(或其功能变体)，并且不包含另外的CRE。
与参考CRM相比，给定的CRM的功能变体可以包含一个或多个另外的调控元件。例如，它们可包含可诱导或可抑制的元件、边界控制元件、绝缘子、基因座调控区域、应答元件、结合位点、末端重复序列的区段、响应位点、稳定元件、去稳定元件和剪接元件等，只要它们不会使得CRM基本上无功能的。
给定的CRM的功能变体可包含在相邻CRE之间的另外的间隔区，或者，如果在参考CRM中存在一个或多个间隔区，所述一个或多个间隔区可以比在参考CRM中的更长或更短。在功能变体中，可以移除存在于参考CRM中的间隔区。
显然，本文所公开的CRM或其功能变体可以与任何合适的启动子元件组合以提供根据本发明的合成的心脏特异性启动子。合适地，所述启动子元件是心脏特异性的近端启动子。
在许多情况中，更短的启动子序列是优选的，特别是用于载体(例如病毒载体，例如AAV)具有有限的容量的情况。因此，在一些实施方式中，所述合成的心脏特异性CRM的长度为500个以下的核苷酸，例如450个、400个、350个、300个、250个、200个、150个、100个、75个、60个、50个或更少的核苷酸。
v.合成的心脏特异性启动子及其功能变体
本文公开了各种合成的心脏特异性启动子。参考的合成的心脏特异性启动子的功能变体是包含与参考的合成的心脏特异性启动子不同的序列、但其基本上保持了心脏特异性启动子的活性的启动子。技术人员将理解，能够在保留其募集合适的心脏特异性转录因子(TF)并募集RNA聚合酶II的能力的同时改变合成的心脏特异性启动子的序列，以提供可操作地连接的序列(例如开放阅读框)的心脏特异性表达。合成的心脏特异性启动子的功能变体可以包含与参考启动子相比的替换、缺失和/或插入，只要这种替换、缺失和/或插入不会使得所述合成心的脏特异性启动子与参考启动子相比基本上无功能的。
表4：用于表2A的合成的心脏特异性启动子的一些实施方式中的示例性的最小或近端启动子
Figure BDA0004161819920001641
因此，在一些实施方式中，合成的心脏特异性启动子的功能变体可被视为基本上保留了参考启动子的心脏特异性启动子活性的变体。例如，合成的心脏特异性启动子的功能变体优选保留参考启动子的活性的至少70％、更优选它的活性的至少80％、更优选它的活性的至少90％、更优选它的活性的至少95％、并且还更优选它的活性的100％。
合成的心脏特异性启动子的功能变体通常与参考的合成的心脏特异性启动子保持显著水平的序列相似性。在一些实施方式中，功能变体包含与参考的合成的心脏特异性启动子至少70％相同的序列，更优选与参考的合成的心脏特异性启动子至少80％、90％、95％或99％相同的序列。
功能变体在本文下文中定义。合适地，合成的心脏特异性启动子可包含与SEQ IDNO：3-64的任一个至少60％、65％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
功能变体中的活性可以通过比较在等同的条件下、在参考的合成的心肌特异性启动子和假定的功能变体的控制下合适的报告子的表达来评估。在本文中(例如，在实施例中)公开了用于评估心脏特异性启动子活性的合适的测定。
给定的合成的心脏特异性启动子的功能变体可以包含存在于参考的合成的心脏特异性启动子中的CRE的功能变体。给定的合成的心脏特异性启动子的功能变体可以包含存在于参考的合成的心脏特异性启动子中的CRM的功能变体。给定的合成的心脏特异性启动子的功能变体可以包含启动子元件的功能变体，或者与参考的合成的心脏特异性启动子相比时不同的启动子元件。
给定的合成的心脏特异性启动子的功能变体可以包含在参考的合成的心脏特异性启动子中存在的一个或多个另外的CRE。例如，可以在参考的合成的心脏特异性启动子中存在的CRE的上游或在参考的合成的心脏特异性启动子中存在的CRE的下游提供另外的CRE。所述另外的CRE可以是本文所公开的CRE，或者它们可以是其它CRE。
给定的合成的心脏特异性启动子的功能变体可以在相邻的元件(CRE、CRM或启动子元件)之间包含另外的间隔区，或者，如果在参考的合成的心脏特异性启动子中存在一个或多个间隔区，所述一个或多个间隔区可以比在参考的合成的心脏特异性启动子中的更长或更短。或者，如果在参考的合成的心脏特异性启动子中存在一个或多个间隔区，这些间隔区可在功能变体中被移除。
显然，本发明的合成的心脏特异性启动子可以包含本发明的CRE或包含本发明的CRE和另外的调控序列的CRM。例如，它们可包含一个或多个另外的CRE、可诱导或可抑制的元件、边界控制元件、绝缘子、基因座调控区域、应答元件、结合位点、末端重复序列的区段、响应位点、稳定元件、去稳定元件和剪接元件等，只要它们不会使得启动子基本上无功能的。
本发明优选的合成的心脏特异性启动子表现出心脏特异性启动子活性，其为通过心脏细胞中的CMV或肌球蛋白启动子表现出的活性的至少15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％或400％。在一些实施方式中，由合成的心脏特异性启动子驱动的磷酸酶抑制剂基因或其它示例性基因的表达水平与由CMV启动子驱动的那些基因在心脏细胞中的表达水平等同。在许多情况下，更高水平的启动子活性是优选的，但这并不总是如此；因此，在一些情况下，更适中水平的表达可能是优选的。在一些情况下，期望能有一系列活性水平不同的启动子，以使得表达水平按需求定制；本公开提供了具有这种活性范围的启动子。与已知的启动子相比，本发明的给定的合成的心脏特异性启动子的活性可以通过如下来评估：当在其它方面等同的表达构建体并在等同条件下提供合成的心脏特异性启动子和已知启动子时，对在所述合成的心脏特异性启动子控制下的报告基因的心脏特异性表达与在所述已知启动子控制下的相同报告子的表达进行比较。
除了不同的活性水平，在一些情况下，期望能有一系列在不同区域具有活性的启动子，所述不同区域例如心脏的不同区域，例如心室与心房、或不同的心脏细胞(例如心室心肌细胞与心房心肌细胞或心脏成纤维细胞、或心脏中的内皮细胞(EC)、以及血管周围细胞和起搏细胞)。此外，可期望有一系列具有不同活性水平跨不同区域的启动子，以使得表达水平按需求定制。在一些情况下，期望在特定区域中的表达。在一些实施方式中，期望在心肌细胞中的表达，并且在心脏的其余部位或身体的其余部分很少或不表达。合适地，可能需要在心脏内的多个区域进行表达。在一些优选的实施方式中，根据本发明的心脏特异性启动子在以下的任何或所有心脏区域显示出活性：主动脉弓动脉(AA)；主动脉；心肌细胞(CM)；内皮细胞或心内膜细胞(EC)；下腔静脉(ICV)；室间隔(IVS)；左心房(LA)；左上腔静脉(LSCV)；左心室(LV)；流出道(OT)；肺动脉(PO)；前心外膜器官(PEO)；肺静脉(PV)；右心房(RA)；右上腔静脉(RSCV)；右心室(RV)；上腔静脉(SCV)；心脏平滑肌细胞(SM)。在一些实施方式中，根据本发明的心脏特异性启动子在上述心脏区域显示出活性，而在心脏的其它区域、身体的其它区域很少或没有活性。
除了不同的活性水平和不同的活性区域以外，在一些情况中，期望能有一系列在不同细胞或细胞组合(例如不同的心肌细胞群)中具有活性的启动子。在一些优选的实施方式中，根据本发明的心脏特异性启动子在心肌细胞中显示出活性。在一些优选的实施方式中，根据本发明的心脏特异性启动子在心室心肌细胞或在传导性心肌细胞(conductivecardiomyocyte)中显示出活性。在一些优选的实施方式中，根据本发明的心脏特异性启动子在心肌细胞和平滑肌细胞中显示出活性。在一些优选的实施方式中，根据本发明的心脏特异性启动子在心室心肌细胞中、在传导性心肌细胞和心脏中的平滑肌细胞中显示出活性。在一些实施方式中，根据本发明的心脏特异性启动子在心肌细胞中显示出活性，而在其它心脏细胞类型中很少或没有表达。在一些实施方式中，根据本发明的心脏特异性启动子在心肌细胞和心脏中的平滑肌细胞中显示出活性，而在其它心脏细胞类型中很少或没有表达。在一些实施方式中，根据本发明的心脏特异性启动子在心肌细胞和起搏细胞中显示出活性，而在其它心脏细胞类型中很少或没有表达。
另外，可能优选在心脏的所有或几乎所有区域、合适地在所有收缩区域(例如在构成心室和心房的细胞中)中具有广泛的表达。
本发明优选的合成的心脏特异性启动子表现出心脏特异性启动子活性，其为由MLC-2v心脏特异性启动子表现出的活性的至少15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％或400％。与MLC-2v启动子相比的本发明的给定的合成的心脏特异性启动子的活性可以通过如下来评估：当在其它等同的表达构建体中提供合成的心脏特异性启动子和MLC-2v启动子并在等同的条件下时，对在所述合成的心脏特异性启动子控制下的报告基因的心脏特异性表达与在MLC-2v启动子控制下的相同报告子在心脏组织或心脏细胞(例如心肌细胞)中的表达进行比较。在一些实施方式中，本发明的合成的心脏特异性启动子能够相对于已知的心脏特异性启动子(合适地，MLC-2v启动子)将基因(例如治疗基因或感兴趣的基因)在受试者神经元中的表达增加至少20％、至少40％、至少60％、至少80％、至少100％、至少200％、至少300％、至少500％、至少1000％或更多。本文所公开的合成的心脏特异性启动子的心脏特异性表达可以与其它已知的心脏特异性启动子进行比较，所述已知的心脏特异性启动子例如但不限于来自以下基因的启动子：α肌球蛋白重链基因(例如心室α肌球蛋白重链基因)，β肌球蛋白重链基因(例如心室β肌球蛋白重链基因)，心室肌球蛋白轻链2ν基因(例如轻链2基因)，肌球蛋白轻链2a基因(例如心室肌球蛋白轻链2基因)，心肌细胞限制性心肌锚蛋白重复蛋白(CARP)基因，心肌α-肌动蛋白基因，心脏m2毒蕈碱/乙酰胆碱基因，存在ANP基因、BNP基因、心脏肌钙蛋白C基因、心脏肌钙蛋白I基因、心脏肌钙蛋白T基因、心脏肌质网Ca-AT ase基因、骨骼α-肌动蛋白基因和人工心脏细胞特异性启动子。
此外，如本文公开的合成的心脏特异性启动子可与其它室特异性启动子或增强子进行比较，例如，鹌鹑慢肌球蛋白链3型(MyHC3)或ANP启动子、或cGATA-6增强子可用于心房特异性表达。Iroquois同源盒基因可用于心室特异性表达。心室肌细胞特异性启动子的实例包括心室肌球蛋白轻链2启动子和心室肌球蛋白重链启动子。在一些实施方式中，本文所公开的合成的心脏特异性启动子可与其它启动子和/或增强子进行比较，所述启动子和/或增强子包括Csx/NKX2.5基因、肌联蛋白基因、α-辅肌动蛋白基因、肌间蛋白基因、M蛋白基因、心脏肌钙蛋白T基因、RyR2基因、Cx40基因、Cx43基因、以及甚至Mef2，存在结合dHAND、GATA、CarG、E-box、Csx/NKX2.5、或TGF-β的基因，或其组合。
在许多情况中，更短的启动子序列是优选的，特别是用于载体(例如病毒载体，例如AAV)具有有限的容量的情况下。因此，在一些实施方式中，所述合成的心脏特异性启动子的长度为1000个以下的核苷酸，例如900个、800个、700个、600个、500个、450个、400个、350个、300个、250个、200个、150个、100个或更少的核苷酸。特别优选的合成的心脏特异性启动子是那些既短又表现出高水平的活性的启动子。
当心脏特异性启动子在AAV载体中保留心脏特异性活性时是令人惊讶的，因为已知与基因组相比不同的DNA结构和AAV载体的ITR会影响启动子的活性，通常，ITR和不同的DNA结构对启动子的活性有负面影响。
通常优选的是，包含表2A、表5A或表3或表6的任何一个的变体CRE的根据本发明的心脏特异性启动子保留参考CRE的活性的至少25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。活性的保留可以通过比较在等同的条件下、在参考启动子或者包含被置换的CRE的相同启动子的控制下合适的报告子的表达来评估。合适地，所述活性是使用本文所述的实例来评估的，但也可以使用其它方法。合适地，所述或每个CRE是心脏特异性的顺式调控元件。
合适地，所述启动子元件是最小或近端启动子。优选地，当存在时，所述近端启动子是心脏特异性的近端启动子。
在一些实施方式中，合成的心脏特异性启动子包含根据SEQ ID NO：3-64的任何一个或其功能变体的序列，或由根据SEQ ID NO：3-64的任何一个或其功能变体的序列组成。在一些实施方式中，合成的心脏特异性启动子包含如下的序列或由如下的序列组成，所述序列与SEQ ID NO：3-64的任何一个至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
因此，本发明提供了各种合成的心脏特异性启动子及其功能变体。通常优选的是，作为SEQ ID NO：3-38或55、56、80-200、290-329的任何一个的变体的根据本发明的启动子保留了参考启动子的活性的至少25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。合适地，使用本文所述的实例评估所述活性，但也可以使用其它方法。合适地，所述最小或近端启动子可以与CRE或CRM可操作地连接。所述CRE可以是根据本发明的CRE或任何其它CRE。所述CRM可以是根据本发明的CRM，或者可以包含根据本发明的CRE。合适地，所述CRE或所述CRM是心脏特异性的。
合适地，根据本发明的近端启动子可与一个或多个近端启动子可操作地连接。根据本发明的合成的心脏特异性启动子可包含两个近端启动子或由两个近端启动子组成。合适地，根据本发明的合成的心脏特异性启动子可包含两个以上的近端启动子或者由两个以上的近端启动子组成。合适地，所述近端启动子是心脏特异性的近端启动子。合适地，所述至少两个近端启动子可以可操作地连接至根据本发明的CRE或CRM。
本发明的CRE、最小/近端启动子或启动子可以在心脏的特定区域中(优选在心肌细胞中、或在特定的心脏细胞类型中、或在心脏细胞类型的组合中、或在两者的组合中)活化。合适地，本发明的CRE、最小/近端启动子或启动子因此是心脏特异性的。
本发明的CRE、最小/近端启动子或启动子可以在心脏的一个或多个不同部分中活化。合适地，本发明的CRE、最小/近端启动子或启动子可在心脏中活化。合适地，本发明的CRE、最小/近端启动子或启动子可在心肌细胞中活化，但在心脏的任何其它部分中不活化。合适地，本发明的CRE、最小/近端启动子或启动子可在心脏内的一个或多个不同区域中活化。
在一些实施方式中，可期望本发明的CRE、CRM、最小/近端启动子或启动子在心脏中显示出广泛的活性。在一些实施方式中，本发明的CRE、CRM、最小/近端启动子或启动子在心脏的所有部分(泛心脏)中活化。在一些实施方式中，本发明的CRE、CRM、最小/近端启动子或启动子在1、2、3、4、5、6、7、8或9个上述心脏的区域中活化。
在一些实施方式中，可期望本发明的CRE、最小/近端启动子或启动子在心脏的一个区域中显示出主要活性。合适地，可期望本发明的CRE、最小/近端启动子或启动子在心脏的一个区域显示出活性，但在心脏的其它部分没有或只有极少的活性。在一些实施方式中，本发明的CRE、最小/近端启动子或启动子仅在上述心脏区域的一个区域中是活化的。
本发明的CRE、最小/近端启动子或启动子可以在心脏的各种细胞中活化。心脏中的主要细胞类型是心室心肌细胞、心房心肌细胞、心脏成纤维细胞、或心脏中的内皮细胞(EC)、以及血管周围细胞和起搏细胞。此外，本发明的CRE、最小/近端启动子或启动子可以在心脏的各个区域中活化，例如，在任何或所有的以下心脏区域中的活性：主动脉弓动脉(AA)；主动脉；心肌细胞(CM)；内皮细胞或心内膜细胞(EC)；下腔静脉(ICV)；室间隔(IVS)；左心房(LA)；左上腔静脉(LSCV)；左心室(LV)；流出道(OT)；肺动脉(PO)；前心外膜器官(PEO)；肺静脉(PV)；右心房(RA)；右上腔静脉(RSCV)；右心室(RV)；上腔静脉(SCV)；心脏平滑肌细胞(SM)。在一些实施方式中，根据本发明的心脏特异性启动子在上述心脏区域显示出活性，而在心脏的其它区域、身体的其它区域很少或没有活性。可能存在其它细胞类型，特别是在炎性状态下。在一些实施方式中，本发明的CRE、CRM、最小/近端启动子或启动子在至少四种、或至少三种、或至少两种、或至少一种以上列出的心脏细胞类型(例如心室心肌细胞、心房心肌细胞、心脏成纤维细胞、或心脏中的内皮细胞(EC)，以及血管周围细胞和起搏细胞)中活化。
在一些实施方式中，可期望启动子在有限数量的心脏细胞类型中活化，或在不多于一种心脏细胞类型中活化。
在一些实施方式中，本发明的CRE、CRM、最小/近端启动子或启动子在特定的心脏细胞亚型(例如心室心肌细胞、心房心肌细胞、心脏成纤维细胞、或心脏中的内皮细胞(EC)，以及血管周围细胞和起搏细胞)中活化。
在所期望的心脏组织或心脏细胞中的由本发明的心脏特异性启动子驱动的表达可以进行如下的时间段：至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、3周、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、15年、20年、30年、40年、50年、60年、70年、80年、90年、100年。在所期望的组织或细胞中的由本发明的启动子驱动的表达可进行如下的时间段：超过1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、20年、30年、40年、50年、60年、70年、80年、90年、100年。表达可进行1-5个小时、1-12个小时、1-2天、1-5天、1-2周、1-3周、1-4周、1-2个月、1-4个月、1-6个月、2-6个月、3-6个月、3-9个月、4-8个月、6-12个月、1-2年、1-5年、2-5年、3-6年、3-8年、4-8年、5-10年、10-15年、15-20年、20-30年、30-40年、40-50年、50-60年、60-70年、80-90年或90-100年。
在进一步的方面，提供了包含rAAV载体的药物组合物，所述rAAV载体包含合成的心脏特异性启动子，其可操作地连接至根据本发明的用于治疗心脏疾病的转基因(例如但不限于PP1的抑制剂和/或血管生成蛋白或肽)。例如，rAAV载体颗粒可被制备为用于本文的施用方法中的药物组合物。将理解的是，这种组合物必需包含一种或多种活性成分，并且常常包含药学上可接受的赋形剂。
vi.在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子
在一些实施方式中，所述rAAV载体包含编码治疗剂(例如PP1抑制剂或其他药剂)的核酸，所述治疗剂可操作地连接至肌肉特异性启动子，其中所述肌肉特异性启动子在骨骼肌和心肌两者中活化。示例性的肌肉特异性启动子公开于本文的表5A、表5B、表6和表7中。在一些实施方式中，所述心脏特异性启动子是合成的心脏特异性启动子。
在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子。
在一些实施方式中，所述启动子是在骨骼肌和心肌两者中活化的合成的肌肉特异性启动子。在骨骼肌和心肌两者中活化的肌肉特异性启动子的实例包括SP0010、SP0020、SP0033、SP0038、SP0040、SP0042、SP0051、SP0057、SP0058、SP0061、SP0062、SP0064、SP0065、SP0066、SP0068、SP0070、SP0071、SP0076、SP0132、SP0133、SP0134、SP0136、SP0146、SP0147、SP0148、SP0150、SP0153、SP0155、SP0156、SP0157、SP0158、SP0159、SP0160、SP0161、SP0162、SP0163、SP0164、SP0165、SP0166、SP0169、SP0170、SP0171、SP0173、SP0228、SP0229、SP0230、SP0231、SP0232、SP0257、SP0262、SP0264、SP0265、SP0266、SP0267、SP0268、SP0270、SP0271、SP0279、SP0286、SP0305、SP0306、SP0307、SP0309、SP0310、SP0311、SP0312、SP0313、SP0314、SP0315、SP0316、SP0320、SP0322、SP0323、SP0324、SP0325、SP0326、SP0327、SP0328、SP0329、SP0330、SP0331、SP0332、SP0333、SP0334、SP0335、SP0336、SP0337、SP0338、SP0339、SP0340、SP0341、SP0343、SP0345、SP0346、SP0347、SP0348、SP0349、SP0350、SP0351、SP0352、SP0353、SP0354、SP0355、SP0356、SP0358、SP0359、SP0361、SP0362、SP0363、SP0364、SP0365、SP0366、SP0367、SP0368、SP0369、SP0370、SP0371、SP0372、SP0373、SP0374、SP0375、SP0376、SP0377、SP0378、SP0379、SP0380、SP0381、SP0382、SKM_14、SKM_18、SKM_20、SP0357、SP0437-SP0445、SP0447和SP0453-SP0471、SP0473-SP0474。在骨骼肌和心肌两者中活化的优选的合成的肌肉特异性启动子的实例是SP0057、SP0134、SP0173、SP0279、SP0286、SP0310、SP0316、SP0320和SP0326。
在一些实施方式中，在骨骼肌和心肌中活化的合成的肌肉特异性启动子包含根据SEQ ID Nos：55、56、80-200、290-329中任一项的序列或其功能变体、或者由上述组成。在一些实施方式中，在骨骼肌和心肌中活化的合成的肌肉特异性启动子包含与SEQ ID Nos：55、56、80-200、290-329中的任何一个至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列、或由上述组成。
表5A显示了用于本文公开的方法和组合物中的在心肌和骨骼肌中活化的示例性的肌肉特异性启动子的核酸序列的序列标识号。
Figure BDA0004161819920001741
Figure BDA0004161819920001751
Figure BDA0004161819920001761
表5B：表1C中所示的在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子的实施方式的CRE和最小/近端启动子
Figure BDA0004161819920001771
Figure BDA0004161819920001781
Figure BDA0004161819920001791
Figure BDA0004161819920001801
Figure BDA0004161819920001811
Figure BDA0004161819920001821
表13A显示了用于本文公开的方法和组合物中的在心肌和骨骼肌中活化的示例性的肌肉特异性启动子的缩短的核酸序列的序列标识号。
名称和SEQ ID NO: 长度
SP0502(SEQ ID NO:336) 251
SP0515(SEQ ID NO:337) 235
SP0521(SEQ ID NO:338) 263
SP4169(SEQ ID NO:339) 287
SP0522(SEQ ID NO:340) 237
SP0523(SEQ ID NO:341) 221
SP0524(SEQ ID NO:342) 249
表13B：表13A中所示的在心肌和骨骼肌中活化的缩短的肌肉特异性启动子的实施方式的CRE和最小/近端启动子。
Figure BDA0004161819920001831
vii.在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子的功能变体：
SP0057及其变体
在一些实施方式中，启动子是合成的肌肉特异性启动子，该启动子包含顺式调控元件CRE0029和CRE0071的组合、或其功能变体。通常，CRE可操作地连接至启动子元件。在一些优选的实施方式中，肌肉特异性启动子包含所述CRE或其功能变体，处于CRE0029、CRE0071、然后是启动子元件的顺序(如本领域常规的，顺序以上游至下游的方向给出)。在一些优选的实施方式中，肌肉特异性启动子包含所述CRE或其功能变体，处于CRE0071、CRE0029、然后是启动子元件的顺序。
启动子元件可以是任何合适的近端启动子或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当所述启动子是近端启动子时，通常优选近端启动子是肌肉特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是CRE0070或其功能变体。CRE0070是肌肉特异性近端启动子。
因此，在一个实施方式中，启动子包含以下调控元件：CRE0029、CRE0071和CRE0070，或其功能变体。
CRE0029具有根据SEQ ID NO：206的序列。其功能变体可具有与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
CRE0029的功能变体是具有不同于CRE0029的序列的调控元件，但其基本上保留了作为肌肉特异性CRE的活性。技术人员将理解的是，能够在保留其结合至必需转录因子(TF)以及增强表达的能力同时，改变CRE的序列。功能变体可以包含与参考CRE相比的替换、缺失和/或插入，只要它们不会使得CRE基本上无功能的。
在一些实施方式中，CRE0029的功能变体可以被视为当取代启动子中的CRE0029而进行置换时基本上保留其活性的CRE。例如，包含取代CRE0029而进行置换的CRE0029功能变体的肌肉特异性启动子优选地保留其活性的80％，更优选地保留其活性的90％，更优选地保留其活性的95％，还更优选地保留其活性的100％。例如，以启动子SP0057为例，可以用CRE0029的功能变体替换SP0057中的CRE0029，并且所述启动子基本上保留其活性。，活性的保留可以通过比较在等同的条件下、在参考启动子或者包含被置换的CRE的相同启动子的控制下合适的报告子的表达来评估。
将注意的是，可以在双链多核苷酸的任一条链上提供CRE0029或其功能变体，并且可以以任一方向提供。就其而言，SEQ ID NO：206或其功能变体的互补和反向互补序列落入本发明的范围内。包含根据SEQ ID NO：206的序列或其功能变体的单链核酸也落入本发明的范围内。
CRE0071具有根据SEQ ID NO：216的序列。其功能变体可具有与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
CRE0071的功能变体是具有不同于CRE0071的序列的调控元件，但其基本上保留了作为肌肉特异性CRE的活性。技术人员将理解的是，能够在保留其结合至必需转录因子(TF)并增强表达的能力同时，改变CRE的序列。功能变体可以包含与参考CRE相比的替换、缺失和/或插入，只要它们不会使得CRE基本上无功能的。
在一些实施方式中，CRE0071的功能变体可以被视为当取代启动子中的CRE0071而进行置换时基本上保留其活性的CRE。例如，包含取代CRE0071而进行置换的CRE0029功能变体的肌肉特异性启动子优选地保留其活性的80％，更优选地保留其活性的90％，更优选地保留其活性的95％，还更优选地保留其活性的100％。例如，以启动子SP0057为例，可以用CRE0071的功能变体替换SP0057中的CRE0071，并且所述启动子基本上保留其活性。活性的保留可以通过比较在等同的条件下、在参考启动子或包含被置换的CRE的相同启动子的控制下合适的报告子的表达来评估。
将注意的是，可以在双链多核苷酸的任一条链上提供CRE0071或其功能变体，并且可以以任一方向提供。就其而言，SEQ ID NO：216或其功能变体的互补和反向互补序列落入本发明的范围内。包含根据SEQ ID NO：216的序列或其功能变体的单链核酸也落入本发明的范围内。
CRE0070的序列及其变体在本文其他地方列出。
在一些实施方式中，肌肉特异性启动子包含根据SEQ ID NO：X的序列或其功能变体。在一些实施方式中，功能变体可具有与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：X的序列的启动子被称为SP0057。在一些实施方式中，特别优选SP0057启动子。已发现该启动子对肌肉是非常特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0134及其变体
在一些实施方式中，启动子是合成的肌肉特异性启动子，该启动子包含顺式调控元件CRE0020和CRE0071的组合、或其功能变体。通常，CRE可操作地连接至启动子元件。在一些优选的实施方式中，肌肉特异性启动子包含所述CRE或其功能变体，处于CRE0020、CRE0071、然后是启动子元件的顺序(如本领域常规的，顺序以上游至下游的方向给出)。在一些实施方式中，肌肉特异性启动子包含所述CRE或其功能变体，处于CRE0071、CRE0020、然后是启动子元件的顺序。
启动子元件可以是任何合适的近端启动子或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当所述启动子是近端启动子时，通常优选近端启动子是肌肉特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是CRE0070或其功能变体。CRE0070是肌肉特异性近端启动子。
因此，在一个实施方式中，启动子包含以下调控元件：CRE0020、CRE0071和CRE0070，或其功能变体。
CRE0020具有根据SEQ ID NO：203的序列。其功能变体可具有与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
CRE0020的功能变体是具有不同于CRE0020的序列的调控元件，但其基本上保留了作为肌肉特异性CRE的活性。技术人员将理解的是，能够在保留其结合至必需转录因子(TF)并增强表达的能力同时，改变CRE的序列。功能变体可以包含与参考CRE相比的替换、缺失和/或插入，只要它们不会使得CRE基本上无功能的。
在一些实施方式中，CRE0020的功能变体可以被视为当取代启动子中的CRE0020而进行置换时基本上保留其活性的CRE。例如，包含取代CRE0020而进行置换的CRE0020功能变体的骨骼肌特异性启动子优选地保留其活性的80％，更优选地保留其活性的90％，更优选地保留其活性的95％，还更优选地保留其活性的100％。例如，以启动子SP0227为例，可以用CRE0020的功能变体替换SP0227中的CRE0020，并且所述启动子基本上保持其活性。活性的保留可以通过比较在等同的条件下、在参考启动子或者包含被置换的CRE的相同启动子的控制下合适的报告子的表达来评估。
将注意的是，可以在双链多核苷酸的任一条链上提供CRE0020或其功能变体，并且可以以任一方向提供。就其而言，SEQ ID NO：203或其功能变体的互补和反向互补序列落入本发明的范围内。包含根据SEQ ID NO：203的序列或其功能变体的单链核酸也落入本发明的范围内。
在一些实施方式中，CRE0020或其功能变体具有300个以下核苷酸的长度、250个以下核苷酸的长度、200个以下核苷酸的长度、150个以下核苷酸的长度、125个以下核苷酸的长度、或100个以下核苷酸的长度。
CRE0071的序列及其变体在上文列出。
CRE0070的序列及其变体在本文其它地方列出。
在一些实施方式中，肌肉特异性启动子包含根据SEQ ID NO：100的序列或其功能变体。在一些实施方式中，功能变体可具有与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：100的序列的启动子被称为SP0134。在一些实施方式中，特别优选SP0134启动子。已发现该启动子对肌肉是非常特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0173及其变体
在一些实施方式中，启动子是合成的肌肉特异性启动子，该启动子包含肌肉特异性近端启动子CRE0010和顺式调控元件CRE0035的组合、或其功能变体。通常，肌肉特异性近端启动子CRE0010和顺式调控元件CRE0035可操作地连接至进一步的启动子元件。在一些优选的实施方式中，合成的肌肉特异性启动子包含所述近端启动子和CRE、或其功能变体，处于CRE0010、CRE0035、然后是进一步的启动子元件的顺序(如本领域常规的，顺序以上游至下游的方向给出)。在一些实施方式中，合成的肌肉特异性启动子包含所述近端启动子和CRE或其功能变体，处于CRE0035、CRE0010、然后是进一步的启动子元件的顺序。
启动子元件可以是任何合适的近端启动子或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当所述启动子是近端启动子时，通常优选近端启动子是肌肉特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是SKM_18或其功能变体。SKM_18是肌肉特异性近端启动子。
因此，在一个实施方式中，启动子包含以下调控元件：CRE0010、CRE0035和SKM_18，或其功能变体。
CRE0010具有根据SEQ ID NO：264的序列。其功能变体可具有与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
如上所讨论的，CRE0010的功能变体基本上保留了CRE0010充当肌肉特异性启动子元件的能力。例如，当将CRE0010的功能变体替换入肌肉特异性启动子SP0320中时，经修饰的启动子保留其活性的至少80％，更优选地保留其活性的至少90％，更优选地保留其活性的至少95％，并且还更优选地保留SP0320的活性的100％。适当地，CRE0010的功能变体包含与SEQ ID NO：264具有至少70％、80％、90％、95％或99％同一性的序列。
在一些优选的实施方式中，包含CRE0010或其功能变体或由CRE0010或其功能变体组成的启动子元件具有400个以下核苷酸的长度、300个以下核苷酸的长度、250个以下核苷酸的长度、200个以下核苷酸的长度、150个以下核苷酸的长度、125个以下核苷酸的长度、110个以下核苷酸的长度、或95个以下核苷酸的长度。
CRE0035具有根据SEQ ID NO：208的序列。其功能变体可具有与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
CRE0035的功能变体是具有不同于CRE0035的序列的调控元件，但其基本上保留了作为肌肉特异性CRE的活性。技术人员将理解的是，能够在保留其结合至必需转录因子(TF)并增强表达的能力同时，改变CRE的序列。功能变体可以包含与参考CRE相比的替换、缺失和/或插入，只要它们不会使得CRE基本上无功能的。
在一些实施方式中，CRE0035的功能变体可以被视为当取代启动子中的CRE0035而进行置换时基本上保留其活性的CRE。例如，包含取代CRE0035而进行置换的CRE0035功能变体的肌肉特异性启动子优选地保留其活性的80％，更优选地保留其活性的90％，更优选地保留其活性的95％，还更优选地保留其活性的100％。例如，以启动子SP0173为例，可以用CRE0035的功能变体替换SP0173中的CRE0035，并且所述启动子基本上保留其活性。活性的保留可以通过比较在等同的条件下、在参考启动子或者包含被置换的CRE的相同启动子的控制下合适的报告子的表达来评估。
将注意的是，可以在双链多核苷酸的任一条链上提供CRE0035或其功能变体，并且可以以任一方向提供。就其而言，SEQ ID NO：208或其功能变体的互补和反向互补序列落入本发明的范围内。包含根据SEQ ID NO：208的序列或其功能变体的单链核酸也落入本发明的范围内。
SKM_18(SEQ ID NO：55)的序列及其变体在本文其他地方列出。
在一些实施方式中，肌肉特异性启动子包含根据SEQ ID NO：122的序列或其功能变体。在一些实施方式中，功能变体可具有与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：122的序列的启动子被称为SP0173。在一些实施方式中，特别优选SP0173启动子。已发现该启动子对肌肉是非常特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0279及其变体
在一些实施方式中，启动子是合成的肌肉特异性启动子，该启动子包含顺式调控元件CRE0020和CRE0071的组合、或其功能变体。通常，CRE可操作地连接至启动子元件。在一些优选的实施方式中，肌肉特异性启动子包含所述CRE或其功能变体，处于CRE0020、CRE0071、然后是启动子元件的顺序(如本领域常规的，顺序以上游至下游的方向给出)。在一些优选的实施方式中，肌肉特异性启动子包含所述CRE或其功能变体，处于CRE0071、CRE0020、然后是启动子元件的顺序。在一些优选的实施方式中，肌肉特异性启动子包含所述CRE或其功能变体，处于CRE0020、CRE0071、启动子元件以及CMV-IE 5′UTR和内含子的顺序(如本领域常规的，顺序以上游至下游的方向给出)。
启动子元件可以是任何合适的近端启动子或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当所述启动子是近端启动子时，通常优选近端启动子是肌肉特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是CRE0070或其功能变体。CRE0070是肌肉特异性近端启动子。
因此，在一个实施方式中，启动子包含以下调控元件：CRE0020、CRE0071、CRE0070和CMV-IE 5′UTR和内含子，或其功能变体。
CRE0020的序列及其变体在上文列出。
CRE0071的序列及其变体在上文列出。
CRE0070的序列及其变体在本文其他地方列出。
CMV-IE 5′UTR和内含子的序列及其变体在本文其他地方列出。
在一些实施方式中，肌肉特异性启动子包含根据SEQ ID NO：137的序列或其功能变体。在一些实施方式中，功能变体可具有与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：137的序列的启动子被称为SP0279。在一些实施方式中，特别优选SP0279启动子。已发现该启动子对肌肉是非常特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0286及其变体
在一些实施方式中，启动子是合成的肌肉特异性启动子，该启动子包含可操作地连接至启动子元件的CRE0071。在一些优选的实施方式中，合成的肌肉特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0071。在一些优选的实施方式中，合成的肌肉特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0071以及CMV-IE 5′UTR和内含子。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当所述启动子是近端启动子时，通常优选近端启动子是肌肉特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是CRE0070或其功能变体。CRE0070是肌肉特异性近端启动子。
在一些实施方式中，合成的肌肉特异性启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0071、CRE0070，然后是CMV-IE 5′UTR和内含子。
CRE0071的序列及其变体在上文列出。
CRE0070的序列及其变体在本文其他地方列出。
CMV-IE 5′UTR和内含子的序列及其变体在本文其他地方列出。
在一些实施方式中，肌肉特异性启动子包含根据SEQ ID NO：138的序列或其功能变体。在一些实施方式中，功能变体可具有与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：138的序列的启动子被称为SP0286。在一些实施方式中，特别优选SP0286启动子。已发现该启动子对肌肉是非常特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0310及其变体
在一些实施方式中，启动子是合成的肌肉特异性启动子，该启动子包含可操作地连接至启动子元件的CRE0035。在一些优选的实施方式中，合成的肌肉特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0035。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当所述启动子是近端启动子时，通常优选近端启动子是肌肉特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是SKM_18或其功能变体。SKM_18是肌肉特异性近端启动子。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0035，然后是SKM_18。
CRE0035的序列及其变体在上文列出。
SKM_18的序列及其变体在本文其他地方列出。
在一些实施方式中，肌肉特异性启动子包含根据SEQ ID NO：143的序列或其功能变体。在一些实施方式中，功能变体可具有与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：143的序列的启动子被称为SP0310。在一些实施方式中，特别优选SP0310启动子。已发现该启动子对肌肉是非常特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0316及其变体
在一些实施方式中，启动子是合成的肌肉特异性启动子，该启动子包含可操作地连接至启动子元件的CRE0050。在一些优选的实施方式中，合成的肌肉特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0050。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当所述启动子是近端启动子时，通常优选近端启动子是肌肉特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是SKM_18或其功能变体。SKM_18是肌肉特异性近端启动子。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0050，然后是SKM_18。
CRE0050具有根据SEQ ID NO：211的序列。其功能变体可具有与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
CRE0050的功能变体是具有不同于CRE0050的序列的调控元件，但其基本上保留了作为肌肉特异性CRE的活性。技术人员将理解的是，能够在保留其结合至必需转录因子(TF)并增强表达的能力同时，改变CRE的序列。功能变体可以包含与参考CRE相比的替换、缺失和/或插入，只要它们不会使得CRE基本上无功能的。
在一些实施方式中，CRE0050的功能变体可以被视为当取代启动子中的CRE0050而进行置换时基本上保留其活性的CRE。例如，包含取代CRE0050而进行置换的CRE0035功能变体的肌肉特异性启动子优选地保留其活性的80％，更优选地保留其活性的90％，更优选地保留其活性的95％，还更优选地保留其活性的100％。例如，以启动子SP0316为例，可以用CRE0050的功能变体替换SP0316中的CRE0050，并且所述启动子基本上保留其活性。活性的保留可以通过比较在等同的条件下、在参考启动子或者包含被置换的CRE的相同启动子的控制下合适的报告子的表达来评估。
将注意的是，可以在双链多核苷酸的任一条链上提供CRE0050或其功能变体，并且可以以任一方向提供。就其而言，SEQ ID NO：211或其功能变体的互补和反向互补序列落入本发明的范围内。包含根据SEQ ID NO：211的序列或其功能变体的单链核酸也落入本发明的范围内。
SKM_18的序列及其变体在本文其他地方列出。
在一些实施方式中，肌肉特异性启动子包含根据SEQ ID NO：149的序列或其功能变体。在一些实施方式中，功能变体可具有与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：149的序列的启动子被称为SP0316。在一些实施方式中，特别优选SP0316启动子。已发现该启动子对肌肉是非常特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0320及其变体
在一些实施方式中，启动子是合成的肌肉特异性启动子，该启动子包含肌肉特异性近端启动子CRE0010和顺式调控元件CRE0035的组合、或其功能变体。通常，肌肉特异性近端启动子CRE0010和顺式调控元件CRE0035可操作地连接至进一步的启动子元件。在一些优选的实施方式中，合成的肌肉特异性启动子包含所述近端启动子和CRE、或其功能变体，处于CRE0010、CRE0035、然后是进一步的启动子元件的顺序(如本领域常规的，顺序以上游至下游的方向给出)。在一些实施方式中，合成的肌肉特异性启动子包含所述近端启动子和CRE、或其功能变体，处于CRE0035、CRE0010、然后是进一步的启动子元件的顺序。在一些优选的实施方式中，合成的肌肉特异性启动子包含所述近端启动子和CRE、或其功能变体，处于CRE0010、CRE0035、后随着CMV-IE 5′UTR和内含子的进一步的启动子元件的顺序。
进一步的启动子元件可以是任何合适的近端启动子或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当所述启动子是近端启动子时，通常优选近端启动子是肌肉特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是SKM_18或其功能变体。SKM_18是肌肉特异性近端启动子。
因此，在一个实施方式中，启动子包含以下调控元件：CRE0010、CRE0035、SKM_18以及CMV-IE 5′UTR和内含子，或其功能变体。
CRE0010的序列及其变体在上文列出。
CRE0035的序列及其变体在上文列出。
SKM_18的序列及其变体在本文其他地方列出。
CMV-IE 5′UTR和内含子的序列及其变体在本文其他地方列出。
在一些实施方式中，肌肉特异性启动子包含根据SEQ ID NO：150的序列或其功能变体。在一些实施方式中，功能变体可具有与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：150的序列的启动子被称为SP0320。在一些实施方式中，特别优选SP0320启动子。已发现该启动子对肌肉是非常特异性的，这在一些情况下是有利的。
SP0326及其变体
在一些实施方式中，启动子是合成的肌肉特异性启动子，该启动子包含可操作地连接至启动子元件的CRE0071。在一些优选的实施方式中，合成的肌肉特异性启动子包含紧邻启动子元件上游的CRE0071。
启动子元件可以是任何合适的近端或最小启动子。在一些实施方式中，启动子元件是最小启动子。当所述启动子是近端启动子时，通常优选近端启动子是肌肉特异性的。
在一些优选的实施方式中，启动子元件是SKM_18或其功能变体。SKM_18是肌肉特异性近端启动子。
在一些实施方式中，心肌特异性启动子包含以下元件(或其功能变体)：CRE0071，然后是SKM_18。
CRE0071的序列及其变体在上文列出。
SKM_18的序列及其变体在本文其他地方列出。
在一些实施方式中，肌肉特异性启动子包含根据SEQ ID NO：155的序列或其功能变体。在一些实施方式中，功能变体可具有与其至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。具有根据SEQ ID NO：155的序列的启动子被称为SP0326。在一些实施方式中，特别优选SP0326启动子。已发现该启动子对肌肉是非常特异性的，这在一些情况下是有利的。
表6：在心肌和骨骼肌两者中活化的肌肉特异性启动子的示例性CRE(顺式调控元件)的核酸序列的序列标识号，其在表5A中公开。
Figure BDA0004161819920001961
表7：表5A的在心肌和骨骼肌两者中活化的合成的肌肉特异性启动子的一些实施方式中使用的示例性最小启动子或近端启动子。
Figure BDA0004161819920001971
表14：在心肌和骨骼肌两者中活化的缩短的肌肉特异性启动子的示例性顺式调控模块(CRM)的核酸序列的序列标识号，其在表13A中公开。
Figure BDA0004161819920001972
表15：在心肌和骨骼肌两者中活化的缩短的肌肉特异性启动子的示例性CRE(顺式调控元件)的核酸序列的序列标识号，其在表13A中公开。
Figure BDA0004161819920001973
表16：来自在心肌和骨骼肌两者中活化的缩短的肌肉特异性启动子的合成的启动子的示例性启动子元件的核酸序列的序列标识号，其在表13A中公开。
Figure BDA0004161819920001974
viii.合成的心脏特异性表达盒
本发明还提供了合成的心脏特异性表达盒，该表达盒包含本发明的合成的心脏特异性启动子，所述启动子可操作地连接至编码表达产物的序列，合适地是基因(例如转基因)，例如，本文公开的PP1抑制剂、和/或本文公开的血管生成蛋白或肽。
在本发明的一些优选的实施方式中，基因编码治疗性表达产物，优选适用于治疗与异常基因表达(可选地在心脏组织中)相关的疾病或病症的治疗性多肽。
在一些实施方式中，治疗性表达产物包括那些本文公开的用于治疗心血管病症或心脏疾病和疾患的治疗性表达产物。在一些实施方式中，心脏疾患是心力衰竭或CHF。
c.分泌信号肽和内含子序列
在一些实施方式中，编码PP1抑制剂的核酸可以包含编码PP1抑制剂的核酸的分泌肽5′(例如I-1、I-1c或其变体)。合适的信号肽公开于WO2020/102645中，通过引用的方式将其整体并入本文。例如，可将含有合适的分泌序列的多核苷酸5′融合至所选PP1抑制剂或血管生成蛋白基因的第一个密码子。在一些实施方式中，合适的分泌信号序列包括FGF-4、FGF-5、FGF-6基因的信号序列或不同分泌蛋白(例如IL-1β)的信号序列。在一些实施方式中，合适的分泌序列是源自通常从心肌细胞分泌的蛋白质的分泌信号序列。在一些实施方式中，编码PP1抑制剂或血管生成蛋白或肽的核酸包含靶向肽，例如合适的心脏靶向肽公开于WO2018/170310或US20170166926A1中，通过引用的方式将其整体并入本文。其他合适的靶向肽包括由Muller等，Nature Biotechnology 21:1040-1046(2003)中鉴定的靶向冠状动脉内皮细胞的肽，并如WO2019/216932A1中公开的SEQ ID NO：2-126，通过引用的方式将其整体并入本文。
在一些实施方式中，rAAV基因型包含位于启动子序列的3′和分泌信号肽的5′(如果存在)、或编码PP1抑制剂的核酸序列的5′的内含子序列。内含子序列起到增强如下的一项或多项的作用：mRNA稳定性、mRNA转运出细胞核和/或表达和/或所表达的多肽的调控。
在一些实施方式中，内含子序列是MVM内含子序列，例如但不限于WO2020/102645中公开的SEQ ID NO：13的内含子序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％核苷酸序列同一性的核酸序列。
在一些实施方式中，内含子序列是HBB2内含子序列，例如但不限于WO2020/102645中公开的SEQ ID NO：14的内含子序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％核苷酸序列同一性的核酸序列。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方式中，重组AAV载体包含异源核酸序列，所述异源核酸序列进一步包含位于编码分泌信号肽的序列的5′和启动子的3′的内含子序列。在一些实施方式中，内含子序列包含MVM序列或HBB2序列，其中MVN序列包含WO2020/102645中公开的SEQ ID NO：13的核酸序列，或与WO2020/102645中公开的SEQ ID NO：13具有至少约75％、或80％、或85％、或90％、或95％、或98％、或99％序列同一性的核酸序列，并且HBB2序列包含WO2020/102645中公开的SEQ ID NO：14的核酸序列，或与WO2020/102645中公开的SEQ ID NO：14具有至少约75％、或80％、或85％、或90％、或95％、或98％、或99％序列同一性的核酸序列。
在一些实施方式中，rAAV基因型包含选自于由如下所组成的组中的内含子序列：人β珠蛋白b2(或HBB2)内含子、FIX内含子、鸡β-珠蛋白内含子和SV40内含子。在一些实施方式中，内含子任选地是经修饰的内含子，例如经修饰的HBB2内含子(参见例如，WO2018046774A1中的SEQ ID NO：17)、经修饰的FIX内含子(参见例如，WO2018046774A1中的SEQ ID NO：19)、或经修饰的鸡β-珠蛋白内含子(例如参见WO2018046774A1中的SEQ ID NO：21)或WO2015/162302中公开的经修饰的HBB2或FIX内含子，以引用的方式将它们的整体并入本文。
d.Poly A
在一些实施方式中，rAAV载体基因组包括至少一个poly-A尾，所述poly-A尾位于3′并位于编码PP1抑制剂(例如，I-1或I-1c)的异源核酸基因的下游。在一些实施方式中，poly A信号是本文所定义的稳定性序列或CS序列的3′。可以使用任何poly A序列，包括但不限于hGH polyA、synpA polyA等。在一些实施方式中，poly A是合成的poly A序列。在一些实施方式中，rAAV载体基因组包含两个poly A尾，例如，hGH poly A序列和另一poly A序列，其中间隔区核酸序列位于两个polyA序列之间。在一些实施方式中，rAAV基因组在编码PP1抑制剂(例如，I-1或I-1c)的核酸的3′包含以下元件：第一poly A序列、间隔区核酸序列(100-400bp之间，或约250bp)、第二poly A序列、间隔区核酸序列和3′ITR。在一些实施方式中，第一poly A序列和第二poly A序列是hGH poly A序列，而在一些实施方式中，第一polyA序列和第二poly A序列是合成的poly A序列。在一些实施方式中，第一poly A序列是hGHpoly A序列，且第二poly A序列是合成的序列，反之亦然——也就是说，在替代的实施方式中，第一poly A序列是合成的poly A序列，且第二poly A序列是hGH poly A序列。示例性的poly A序列为例如hGH poly A序列(SEQ ID NO：66)，或与SEQ ID NO：66具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸序列同一性的poly A核酸序列。在一些实施方式中，被涵盖以使用的hGHpoly序列描述于Anderson等，J.Biol.Chem 264(14)；8222-8229,1989(参见例如，第8223页，第二栏，第一段)，以引用的方式将其整体并入本文。
在一些实施方式中，可以对poly A尾进行工程化以稳定从rAAV载体基因组转录的RNA转录物，包括异源基因的转录物，在一个实施方式中该转录物是PP1抑制剂(例如，I-1或I-1c)，并且在替代的实施方式中，可以将poly-A尾工程化以包含去稳定的元件。
在本文公开的方法和组合物的一些实施方式中，重组AAV载体包含位于编码PP1抑制剂(例如，I-1或I-1c)肽的核酸的3′和3′ITR序列的5′的至少一个poly A序列。
在一个实施方式中，可以通过改变poly-A尾的长度将poly-A尾进行工程化以变成去稳定的元件。在一个实施方式中，poly-A尾可以延长或缩短。在一些实施方式中，3′非翻译区包含3′UTR。
在一些实施方式中，去稳定的元件是微小RNA(miRNA)，其具有沉默(阻抑翻译和促进降解)RNA转录物的能力，miRNA结合至编码异源基因的RNA转录物。在一个实施方式中，poly-A尾内的种子区域的添加或缺失可以增加或减少蛋白质的表达，例如本文公开的PP1抑制剂(例如，I-1或I-1c)。
在一些实施方式中，种子区域也可以被工程化到位于异源基因poly-A尾之间的3′端非翻译区中。在进一步的实施方式中，去稳定剂可以是siRNA。siRNA的编码区可以被包含在rAAV载体基因组中，并通常位于下游，poly-A尾的3′。
在本文公开的方法和组合物的所有方面，rAAV基因组也可以包含填充区DNA核酸序列。示例性的填充区DNA序列是任何非编码DNA序列。示例性的填充区DNA序列显示在表9中，或与表9中示出的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％核苷酸序列同一性的核酸序列。在一些实施方式中，填充区序列例如位于poly A尾的3′，并位于3′ITR序列的5′。在一些实施方式中，填充区DNA序列以反向取向包含合成的多聚腺苷酸化信号。
在一些实施方式中，填充区核酸序列可以位于poly A序列和3′ITR之间(即填充区核酸序列位于poly A序列的3′和3′ITR的5′)。此类填充区核酸序列可为约30bp、50pb、75bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp或长于300bp。在本文公开的方法和组合物的一些实施方式中，填充区核酸片段在20-50bp、50-100bp、100-200bp、200-300bp、300-500bp之间，或为20-500bp之间的任何整数。示例性的填充区(或间隔区)核酸序列包括表9中所示的序列，或与表9中所示的序列至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。
表9.示例性的间隔区或填充区序列：
示例性的填充区序列 SEQ ID NO:
填充区序列1 SEQ ID NO:67
填充区序列2 SEQ ID NO:68
填充序区列3 SEQ ID NO:69
适当地，本文公开的包含合成的心脏特异性启动子的rAAV载体可进一步包含提供或编码核糖体结合位点、起始密码子、终止密码子和转录终止序列中的一个或多个(优选全部)的序列。适当地，rAAV载体包含表达盒，所述表达盒包含编码转录后调控元件的核酸。适当地，所述表达盒包含编码poly A元件的核酸。
PolyA、双链RNA终止元件和反向poly A
如本文所述的，rAAV包含编码磷酸酶抑制剂基因的核酸序列，例如本文公开的I1c基因，该核酸序列进一步包含本文公开的聚腺苷酸化信号、或I1c基因的编码序列之后的poly A信号、或密码子优化的I1c基因。在一些实施方式中，poly A是同源的。在一些实施方式中，poly A信号是异源的。在一些实施方式中，poly A信号可以包含双链RNA终止元件和/或反向poly A。在一些实施方式中，poly A信号是双链RNA终止元件和/或反向poly A。在一些实施方式中，反向poly A或双链RNA终止子位于同源或异源poly A信号序列之后。
“双链RNA终止元件”是抑制例如从3′ITR起的双链RNA转录的元件。在一些实施方式中，双链RNA终止元件以3′至5′的方向位于I1c基因的下游和3′ITR的上游。以3′至5′的方向，终止元件不允许从3′ITR转录，并因此双链RNA不会从3′ITR转录。可以使用任何终止元件，包括例如来自任何物种的反向天然poly A序列或合成的poly A信号、或其片段；或本领域已知的其他核酸结构终止子。示例性的poly A信号和/或转录终止子包括但不限于BGH、SV40、HGH、β珠蛋白的poly A信号、来自α2珠蛋白基因的RNA聚合酶II转录暂停信号、polIII的转录终止信号、其片段和它们的任何组合。
‘反向poly A’是polyA信号序列，该序列以3′-5′方向位于I1c转基因的下游和3′ITR的上游。处于3′-5′方向的任何天然或合成的poly A均可用作反向poly A。在一些实施方式中，所述反向poly A是国际公开号WO2019143950和美国申请公开号US20200340013中描述的poly A(pA)，以引用的方式将其整体并入本文。在数个实施方式中，“反向poly A”和“双链RNA终止元件”可互换使用。以3′至5′的方向，反向poly A或终止元件不允许从3′ITR转录，并因此双链RNA不会从3′ITR转录。反向poly A或双链RNA终止元件可以是异源的，例如来自与感兴趣的基因不同的基因，或者是同源的，例如与感兴趣的基因相同的基因。在本申请中，感兴趣的基因为I1c。
在各种实施方式中，poly A信号包含双链RNA转录元件或反向poly A。在一些实施方式中，双链RNA终止元件或反向poly A序列的5′端和poly A信号的3′端彼此相邻，或者相隔1个核苷酸，或者相隔2个核苷酸，或者相隔3个核苷酸，或者相隔4个核苷酸，或者相隔5个核苷酸，或者相隔6个核苷酸，或者相隔7个核苷酸，或者相隔8个核苷酸，或者相隔9个核苷酸，或者相隔10个核苷酸，或者相隔多于10个核苷酸。在一些实施方式中，poly A信号不包含双链RNA转录元件或反向poly A。在一些实施方式中，poly A信号包含AATAAA或AAUAAA。在一些实施方式中，poly A信号包含AATAAA、或AAUAAA的1个、或2个、或3个、或4个、或5个、或6个、或7个、或8个、或9个、或10个、或更多的重复序列。在一些实施方式中，poly A信号包含“Delineation of the Exact Transcription Termination Signal for Type3Polymerase III.Mol Ther Nucleic Acids.2018Mar 2；10:36-44”中描述的Pol III的转录终止信号，以引用的方式将其整体并入本文。在一些实施方式中，一个或多个Pol III的转录终止信号处于3′至5′的方向。在一些实施方式中，poly A信号包含TTTT。在一些实施方式中，poly A信号包含AAAAAAA。
示例性的双链RNA终止元件序列(RNA聚合酶II转录暂停信号)为SEQ ID NO：332或与SEQ ID NO：332具有至少80％序列同一性的序列。
用于本文公开的rAAV和线性DNA中的示例性的poly A序列包括但不限于：(i)具有SEQ ID NO：331的核酸序列的hGH poly(A)信号和终止子序列，或者与SEQ ID NO：331具有至少80％序列同一性的核酸序列；(ii)具有包含SEQ ID NO：334的核酸的SV40 poly A序列，或与SEQ ID NO：331具有至少80％序列同一性的核酸序列；(iii)包含SEQ ID NO：335的核酸的完全的合成的poly A序列，或与SEQ ID NO：335具有至少80％序列同一性的核酸序列；(iv)包含SEQ ID NO：284的核酸的最小的合成的poly A序列，或与SEQ ID NO：284具有至少80％序列同一性的核酸序列，(v)包含SEQ ID NO：285的核酸的最小的合成的poly A序列，或与SEQ ID NO：285具有至少80％序列同一性的核酸序列；(vi)包含SEQ ID NO：286的核酸的最短的天然存在的SV40早期poly A信号(SV40早期polyA)，或与SEQ ID NO：286具有至少80％序列同一性的核酸序列；(vii)包含SEQ ID NO：287的核酸的RBG poly A，或与SEQID NO：287具有至少80％序列同一性的核酸序列。所述poly A序列描述于“Definition ofan efficient synthetic poly(A)site”,Genes Dev.1989Jul；3(7):1019-25.doi:10.1101/gad.3.7.1019.，以引用的方式将其整体并入本文。上文描述的所有poly A序列和/或终止子序列可以作为反向序列(例如，处于3′至5′的方向)使用。
e.AAV ITRS
本文公开的rAAV基因组包含具有期望特征的AAV ITR，并且可以被设计成调节并入有ITR的载体的活性和对该载体的细胞应答。在一些实施方式中，AAV ITR是具有期望特征的合成的AAV ITR，并且可以被设计成操纵包含一个或两个合成的ITR的载体的活性和对该载体的细胞应答，包括如在美国专利号9,447433中阐明的，以引用的方式将其并入本文。
在一些实施方式中，相对于天然存在的ITR(例如来自AAV2的ITR2)，ITR表现出经修饰的转录活性。已知ITR2序列固有地具有启动子活性。它也固有地具有与poly(A)序列相似的终止活性。尽管相对于ITR2处于降低的水平，本发明的最小功能性ITR表现出如实施例中所示的转录活性。因此，在一些实施方式中，ITR具有转录功能。在其它实施方式中，ITR对于转录而言是缺陷的。在某些实施方式中，ITR可以充当转录绝缘子，例如，当将载体整合到宿主染色体中时，阻止了载体中存在的转基因盒的转录。
本发明的一个方面涉及包含至少一个合成的AAV ITR的rAAV载体基因组，其中，相对于天然存在的AAV ITR(例如ITR2)的序列，ITR中的一个或多个转录因子结合位点的核苷酸序列被删除和/或置换。在一些实施方式中，它是其中一个或多个转录因子结合位点被删除和/或置换的最小功能性ITR。在一些实施方式中，至少一个转录因子结合位点被删除和/或置换，例如，至少5个或更多或者10个或更多的转录因子结合位点，例如，至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个转录因子结合位点。
另一实施方式，包含本文所述的rAAV载体基因组的rAAV载体包含含有至少一个合成的AAV ITR的多核苷酸，其中，通常出现在ITR中的转录起始位点处或其附近的一个或多个CpG岛(胞嘧啶碱基紧随着鸟嘌呤碱基(CpG)，其中这样排列的胞嘧啶倾向于被甲基化)被删除和/或置换。在实施方式中，CpG岛数量的缺失或减少可降低rAAV载体的免疫原性。这归因于TLR-9结合至rAAV载体DNA序列(发生在CpG岛处)的减少或完全抑制。CpG基序的甲基化引起转录沉默也是众所周知的。预期ITR中的CpG基序的去除将引起TLR-9识别的降低和/或甲基化的降低，并因此引起转基因沉默的降低。在一些实施方式中，它是最小功能性ITR，其中一个或多个CpG岛被删除和/或置换。在实施方式中，已知AAV ITR2包含16个CpG岛，其中一个或多个或全部16个可以被删除。
在一些实施方式中，至少1个CpG基序被删除和/或置换，例如至少4个或更多或者8个或更多的CpG基序，例如至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个CpG基序。
在一些实施方式中，合成的ITR包含下面所列核苷酸序列之一，基本上由下面所列核苷酸序列之一组成或由下面所列核苷酸序列之一组成。在其它实施方式中，合成的ITR包含如下核苷酸序列，基本上由如下核苷酸序列组成或由如下核苷酸序列组成：所述核苷酸序列与表10中所列核苷酸序列的一种至少80％相同(例如至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同)。
表10：示例性的合成的ITR序列：
Figure BDA0004161819920002061
IV.载体和病毒粒子
本发明还提供了包含合成的心脏特异性启动子或根据本发明的表达盒的载体。
在一些实施方式中，载体是基因治疗载体。本领域已知各种基因治疗载体，并且可以提及的有AAV载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体。当载体为基因治疗载体时，所述载体优选地包含可操作地连接至本发明的合成的心脏特异性启动子的核酸序列，该核酸序列编码治疗产物，适当地编码治疗蛋白质，例如本文公开的PP1抑制剂。在一些实施方式中，PP1抑制剂(例如I-1或I-1c)、或者其变体是可分泌蛋白，或融合至用于分泌的信号肽。
在一些实施方式中，载体是AAV载体。在一些实施方式中，AAV具有适合心脏转导或针对心脏转导特别地进行了优化的血清型。在一些实施方式中，AAV选自于由如下所组成的组：AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAV2i8、AAVDJ8和AAV2g9，或其衍生物。
AAV载体优选地用作自身互补的双链AAV载体(scAAV)，以克服AAV转导中的限制步骤之一(即单链到双链AAV的转换)，尽管本文中也涵盖单链AAV载体(ssAAV)的使用。在本发明的一些实施方式中，AAV载体是嵌合的，这意味着它包含来自至少两种AAV血清型的成分，例如AAV2的ITR和AAV5的衣壳蛋白。已知AAV9有效地转导心脏细胞，例如转导心肌细胞和心脏组织特别有效，并因此AAV9及其衍生物对于靶向心脏细胞和组织特别有意义。已知AAV2g9特别有效地有效转导心脏细胞和组织，并因此AAV2g9及其衍生物对于靶向心脏细胞和心脏组织特别有意义。已知AAVrh10特别有效地有效转导心脏细胞和组织，并因此AAVrh10及其衍生物对于靶向细胞和心脏组织特别有意义。
在一个实施方式中，本文公开的rAAV载体(也被称为rAAV病毒粒子)包含衣壳蛋白和衣壳蛋白中的rAAV基因组。
在一个实施方式中，本文公开的AAV载体包含来自WO2019/241324(通过引用的方式以其整体明确地并入本文)中公开的那些中的任一种的衣壳蛋白。在一些实施方式中，rAAV载体包含心脏特异性衣壳，例如选自WO2019/241324中公开的XL32和XL32.1的心脏特异性衣壳，过引用的方式以其整体并入本文。在一些实施方式中，rAAV载体是如WO2019/241324(通过引用的方式以其整体并入本文)中公开的AAVXL32或AAVXL32.1。
可以在本文所述的rAAV载体中用作AAV衣壳的示例性的嵌合或变体衣壳蛋白可选自于2019年11月19日提交的美国临时申请62,937,556(通过其引用的方式明确地并入本文)的表2，或可以与目前已知或今后识别出的野生型衣壳蛋白和/或其它嵌合或变体衣壳蛋白的任意组合一起使用，并且每种均被并入本文。在一些实施方式中，被涵盖以使用的rAAV载体是嵌合载体，例如在9,012,224和US 7,892,809中公开的，以引用的方式以其整体并入本文。
在一些实施方式中，rAAV载体是如WO2018/170310A1中公开的单倍体rAAV载体，或例如WO2019/216932A1和美国申请16/151,110中公开的多倍体rAAV载体，通过引用的方式以其整体各自并入本文。在一些实施方式中，rAAV载体是rAAV3载体，如9,012,224和WO2017/106236中所公开的，通过引用的方式以其整体并入本文。
在具体的实施方式中，rAAV是如WO2019/241324(通过引用的方式以其整体并入本文)中公开的AAVXL32或AAVXL32.1 AAV载体。
在一个实施方式中，本文公开的rAAV载体包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白与USPTO授权的专利和公开的申请的文档集中列出的以下生物序列文件中的任意一项相关，所述文件描述了可以以与野生型衣壳蛋白和/或目前已知或今后识别出的其它嵌合或变体衣壳蛋白的任何组合并入本发明的AAV衣壳中的嵌合衣壳蛋白或变体衣壳蛋白(出于说明性目的，11486254对应于美国专利申请No.11/486,254并且其它生物序列文件将以类似的方式解读)：11486254、11932017、12172121、12302206、12308959、12679144、13036343、13121532、13172915、13583920、13668120、13673351、13679684、14006954、14149953、14192101、14194538、14225821、14468108、14516544、14603469、14680836、14695644、14878703、14956934、15191357、15284164、15368570、15371188、15493744、15503120、15660906和15675677。
在一个实施方式中，本文公开的rAAV载体(也被称为rAAV病毒粒子)包含衣壳蛋白和衣壳蛋白中的rAAV基因组。用于治疗心血管疾病或心脏疾病或心力衰竭的rAAV病毒粒子的rAAV衣壳是表11中所列的衣壳中的任一种或它们的任意组合。
表11：AAV血清型和示例性的已公布的相应的衣壳序列。
Figure BDA0004161819920002081
Figure BDA0004161819920002091
Figure BDA0004161819920002101
Figure BDA0004161819920002111
Figure BDA0004161819920002121
Figure BDA0004161819920002131
Figure BDA0004161819920002141
Figure BDA0004161819920002151
Figure BDA0004161819920002161
Figure BDA0004161819920002171
Figure BDA0004161819920002181
Figure BDA0004161819920002191
Figure BDA0004161819920002201
Figure BDA0004161819920002211
Figure BDA0004161819920002221
Figure BDA0004161819920002231
在一个实施方式中，本文公开的rAAV载体包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白与USPTO授权的专利和公开的申请的文档集中列出的以下的生物序列文件中的任意一项相关，所述文件描述了可以以与野生型衣壳蛋白和/或目前已知或今后识别出的其它嵌合或变体衣壳蛋白的任意组合并入本发明的AAV衣壳中的嵌合衣壳蛋白或变体衣壳蛋白(出于说明性目的，11486254对应于美国专利申请No.11/486,254，并且其它的生物序列文件将以类似的方式解读)：11486254.raw、11932017.raw、12172121.raw、12302206.raw、12308959.raw、12679144.raw、13036343.raw、13121532.raw、13172915.raw、13583920.raw、13668120.raw、13673351.raw、13679684.raw、14006954.raw、14149953.raw、14192101.raw、14194538.raw、14225821.raw、14468108.raw、14516544.raw、14603469.raw、14680836.raw、14695644.raw、14878703.raw、14956934.raw、15191357.raw、15284164.raw、15368570.raw、15371188.raw、15493744.raw、15503120.raw、15660906.raw和15675677.raw。
在实施方式中，本发明的AAV衣壳蛋白和病毒衣壳可以是嵌合的，其中，它们可以包含来自另一种病毒的衣壳亚基的全部或部分，所述另一种病毒可选地为另一种细小病毒或AAV，例如，如国际专利公开WO 00/28004中所述的，以引用的方式将其并入。
在一些实施方式中，rAAV载体基因组是单链的或单体的双链体，如美国专利号8,784,799所述的，将其并入本文。
在一些实施方式中，rAAV载体包含如下的核酸：缺乏细菌序列、和/或缺少可替代的开放阅读框、和/或缺少来自编码序列的CpG、和/或具有双链RNA阻断剂或双链RNA终止元件的核酸。在一些实施方式中，本发明的重组AAV由封闭末端的线性双链DNA模板产生。在一些实施方式中，本发明的重组AAV由质粒DNA模板产生。
在一些实施方式中，重组AAV由质粒DNA产生。在一些实施方式中，重组AAV由封闭末端的线性双链DNA产生。封闭的线性DNA分子通常包含共价封闭的末端，也称为发夹环，其中互补的DNA链之间不存在碱基配对。发夹环连接互补DNA链的末端。这种类型的结构通常形成于染色体的端粒末端，以便通过将末端核苷酸隔离在封闭的结构中来保护染色体DNA免于丢失或损坏。在本文所述的封闭的线性DNA分子的实施例中，发夹环侧接于互补碱基对DNA链，形成封闭的线性(cl)DNA形状的结构。封闭的线性DNA分子包括杠铃形DNA。
封闭末端的线性双链核酸可以通过多种已知方法产生，包括体外无细胞合成和体内方法。产生共价封闭末端的线性双链核酸的一种方法是通过将原端粒酶(protelomerase)结合位点并入前体分子中，使得原端粒酶结合位点侧接于感兴趣的核酸。将感兴趣的核酸分子暴露于原端粒酶，从而在该位点处切割和连接核酸。制备封闭末端的线性双链DNA的实施例是本领域众所周知的，例如，如Nucleic Acids Res.2015年10月15日,43(18):e120；Antisense&nucleic acid drug development 11:149-153(2001)；美国专利US9109250、US9499847、US10501782、US10286399；和/或美国公开号US20190185924、US20190203282中所述的；以引用的方式将其全部内容以其整体并入本文。
产生缺少原核序列或细菌序列的共价封闭末端的线性DNA的替代方法在本领域中是已知的，例如通过从质粒形成微环DNA(mini-circle DNA)(例如，如美国专利8,828,726和美国专利7,897,380中所述的，以引用的方式将它们的内容各自整体并入)。例如，一种无细胞合成方法将Phi29 DNA聚合酶和原端粒酶这两种酶联合使用，并生成高保真度的共价封闭的线性DNA构建体。该构建体不含抗生素抗性标记，并因此消除了这些序列的包装。该方法可在两周的过程内以商业规模扩增AAV基因组DNA，并维持病毒产生所需的ITR序列。
在某些实施方式中，将体内细胞系统用于生产非病毒DNA载体构建体，所述构建体用于将预定的核酸序列递送至靶细胞中来进行持续表达。所述非病毒DNA载体包含：两个DD-ITR，所述DD-ITR各自包含反向末端重复序列，所述反向末端重复序列具有A、A’、B、B’、C、C’和D区域；D’区域；并且其中，所述D和D’区域是长度为约5nt-20nt的互补回文序列，且邻近所述A和A’区域定位；预定的核酸序列(例如用于表达的异源基因)；其中，在共价封闭的非病毒DNA的情况下，两个DD-ITR侧接于所述核酸，并且其中封闭的线性载体在每个末端包含1/2的原端粒酶结合位点，例如国际公开号WO2019246544中所述的，以引用的方式将其整体并入本文。
在替代的实施方式中，例如，用于本文公开的方法和组合物的本文公开的rAAV载体的产生可以使用封闭末端的线性双链DNA进行，包括但不限于如美国申请2018/0037943和Karbowniczek等，Bioinsights，2017(通过引用的方式将其整体并入本文)中公开的Doggybone技术(dbDNATM)。简而言之，使用封闭末端线性双链DNA技术的用于AAV生产的质粒可包含ITR、启动子和感兴趣的基因(其侧接有56bp的回文原端粒酶识别序列)。在该实施方式的一些方面，ITR为145bp或更小。在该实施例的某些方面，ITR是130bp。对质粒进行变性，并且在Phi29 DNA聚合酶和恰当的引物存在下，Phi29启动滚环扩增(RCA)，创建了原始构建体的双链多联重复序列。当加入原端粒酶时，回文原端粒酶识别序列发生结合，并发生切割-接合反应，从而产生了单体双链(ds)线性共价封闭的DNA构建体。添加常见的限制性酶去除不期望的DNA质粒骨架序列以及用外切核酸酶活性进行的消化，使得产生杠铃形DNA，可对其进行大小分级以分离编码ITR、启动子和感兴趣基因的杠铃形DNA序列。使用包括杠铃形DNA的封闭末端的线性双链DNA的用于产生rAAV载体的示例性质粒以如下的5′至3′的方向包含：5′-原端粒酶RS、5′ITR、LSP启动子、hGAA、3′UTR、hGH poly(A)、3′ITR、3′-原端粒酶RS(有义链)，其中有义链连接至链状(ds)线性共价封闭的DNA构建体的互补的反义链。使用封闭末端的线性双链DNA(例如杠铃形DNA)作为用于制造用于本文公开的方法和组合物中的AAV载体的起始材料，消除了用于扩增包含AAV载体的质粒的细菌骨架，产物无法触发Toll样受体9(TLR9)的应答。在一些实施方式中，制备本文公开的rAAV载体的方法公开于US9109250、US9499847、US10501782、US10286399；和/或美国公开号US2019/0185924、US2019/0203282，通过引用的方式将其各自以其整体并入本文。
在实施方式中，用于如本文公开的心血管疾病或心脏疾病或心力衰竭的治疗中的rAAV载体是AAV3b衣壳。被涵盖以使用的AAV3b衣壳描述于2017/106236、9,012,224和7,892,809中，通过引用的方式将其整体并入本文。
在实施方式中，本发明的AAV衣壳蛋白和病毒衣壳可以是嵌合的，其中，它们可以包含来自另一种病毒的衣壳亚基的全部或部分，所述另一种病毒可选地为另一种细小病毒或AAV，例如，如国际专利公开WO 00/28004中所述的，以引用的方式将其并入。在一些实施方式中，rAAV载体基因组是单链的或单体的双链体，如美国专利号8,784,799中所述的，将其并入本文。
作为进一步的实施方式，本发明的AAV衣壳蛋白和病毒衣壳可以是多倍体(也称为单倍体)，其中，它们可以在单个AAV衣壳中包含VP1、VP2和VP3 AAV血清型的不同组合，如PCT/US18/22725、PCT/US2018/044632或US10,550,405中所述的，以引用的方式将其并入。
在实施方式中，用于如本文公开的心脏疾病或疾患(例如，心力衰竭或CHF)的治疗中的rAAV载体是AAV3b衣壳。被涵盖以使用的AAV3b衣壳描述于2017/106236、9,012,224和7,892,809以及国际申请PCT/US2019/061653(WO2020/102645)中，通过引用的方式将其整体并入本文。在一些实施方式中，AAV3b衣壳选自以下的任一种：AAV3b265D衣壳、AAV3b265D549A衣壳、AAV3bSASTG衣壳、AAV3b265D549A衣壳、AAV3b549A衣壳、AAV3bQ263Y衣壳、包含AAV3b Q263A/T265衣壳的AAV3bSASTG衣壳，如WO2020/102645中所述的，通过引用的方式将其整体并入本文。在一些实施方式中，AAV3b衣壳选自以下任何一个：如WO2020/102645中公开的SEQ ID NO：44、46、50、52或54，以引用的方式将其整体并入本文。
为了促进将其引入细胞中，用于本发明中的rAAV载体基因组是重组核酸构建体，该构建体包括：(1)待表达的异源序列(在一个实施方式中为编码如本文公开的PP1抑制剂(例如，I-1或I-1c、或其变体)的多核苷酸)，以及(2)促进异源基因的整合和表达的病毒序列元件。病毒序列元件可包括DNA复制和将DNA包装(例如，功能性ITR)入AAV衣壳中所需的顺式的AAV载体基因组的那些序列。在实施方式中，异源基因编码如本文公开的PP1抑制剂(例如，I-1或I-1c、或其变体)，其用于在患有心脏病或疾患(例如，如本文公开的心力衰竭或CHF)的患者中表达PP1抑制剂。在实施方式中，此类rAAV载体基因组还可包含标志物或报告基因。在实施方式中，rAAV载体基因组可以具有一个或多个AAV3b野生型(WT)顺式基因，所述基因的全部或部分被置换或删除，但是保留了功能性侧接的ITR序列。
在一个实施方式中，用于心脏病或疾患(如本文公开的心力衰竭或CHF)的治疗中的如本文公开的rAAV载体包含被AAV3b衣壳或AAV2i8衣壳包裹的如本文公开的rAAV基因组。在一些实施方式中，用于心脏病或疾患(例如本文公开的心力衰竭或CHF)的治疗中的如本文公开的rAAV载体包含被任意AAV3b衣壳包裹的如本文公开的rAAV基因组，所述衣壳选自：AAV3b衣壳(如WO2020/102645中公开的SEQ ID NO：44)、AAV3b265D衣壳(如WO2020/102645中公开的SEQ ID NO：46)、AAV3b ST(如WO2020/102645中公开的S663V+T492V)、衣壳(如WO2020/102645中公开的SEQ ID NO：48)、AAV3b265D549A衣壳(如WO2020/102645中公开的SEQ ID NO：50)、AAV3b549A衣壳(如WO2020/102645中公开的SEQ ID NO：52)、AAV3bQ263Y衣壳(如WO2020/102645中公开的SEQ ID NO：54)、或AAV3bSASTG(即，如WO2020/102645中公开的Q263A/T265)衣壳。
AAV载体在本领域中已被广泛讨论。AAV载体特别令人感兴趣，因为AAV载体通常不会整合到基因组中，也不会引发免疫应答。已注意到AAV血清型1、2、4、5、8、9、rh10、DJ8和2g9(AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAVDJ8和AAV2g9)在心脏中实现有效转导。因此，AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAVVDJ8、AAV2g9、AAV2i8及其衍生物是特别优选的AAV血清型。在一些实施方式中，AAV9是优选的AAV载体。在其它实施方式中，AAV2g9是特别优选的AAV载体(WO2014/144229)。在另外其它的实施方式中，特别优选的AAV载体是AAVDJ8。在一些实施方式中，AAVrh10是特别优选的AAV载体。在另外其它的实施方式中，AAV2i8是特别优选的载体。AAV2i8公开于专利8,889,641中，以引用的方式将其整体并入本文。在一些实施方式中，AAV是杂合的AAV2ITR/AAV，如美国专利7,172,893中所公开的，以引用的方式将其整体并入本文。适当地，AAV载体包含病毒基因组，该病毒基因组包含位于两个反向末端重复序列(ITR)之间的本发明的核酸序列。例如，WO2019/028306公开了可用于心脏中的各种野生型和经修饰的AAV载体。在一个实施方式中，本发明的AAV载体是复制缺陷的重组AAV病毒载体，该载体在其病毒基因组内缺少编码功能性Rep和Cap蛋白的序列。这些有缺陷的AAV载体可能缺少大部分或全部的亲本编码序列，并且基本上仅携带一个或两个AAV ITR序列和感兴趣的核酸以递送到细胞、组织、器官或生物体。适当地，本文使用的AAV载体包含用于转导感兴趣的核酸有效载荷(payload)或负载物(cargo)所必需的已被减少至最小组分的病毒。以这种方式，AAV载体被工程化为特定递送的运载工具，同时缺乏在野生型病毒中发现的有害的复制和/或整合特征。在一个实施方式中，本发明的AAV颗粒是scAAV。在一些实施方式中，本发明的AAV颗粒是ssAAV。用于产生和/或修饰AAV颗粒的方法在本领域中被广泛公开(参见例如WO2000/28004、WO2001/23001、WO2004/112727、WO2005/005610和WO2005/072364，通过引用的方式将其并入本文)。在一个实施方式中，AAV载体包含允许在血管内(例如静脉内或动脉内)施用后穿透血脑屏障的衣壳(参见例如WO2014/144229，其讨论了例如为有效穿过血脑屏障而工程化的衣壳，例如衣壳或肽插入物，包括VOY101、VOY201、AAVPHP.N、AAVPHP.A、AAVPHP.B、PHP.B2、PHP.B3、G2A3、G2B4、G2B5、PHP.S及其变体)。
制作AAV载体的方法在本领域中是众所周知的，例如，在美国专利号US6204059、US5756283、US6258595、US6261551、US6270996、US6281010、US6365394、US6475769、US6482634、US6485966、US6943019、US6953690、US7022519、US7238526、US7291498和US7491508、US5064764、US6194191、US6566118、US8137948；或国际公开号WO1996039530、WO1998010088、WO1999014354、WO1999/015685、WO1999/047691、WO2000/055342、WO2000/075353和WO2001/023597；Methods In Molecular Biology,ed.Richard,Humana Press,NJ(1995)；O′Reilly et al,Baculovirus Expression Vectors,A Laboratory Manual,Oxford Univ.Press(1994)；Samulski et al.,J Fir.63:3822-8(1989)；Kajigaya et al,Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 88:4646-50(1991)；Ruffing et al.,J.Vir.66:6922-30(1992)；Kimbauer et al,Vir.,219:37-44(1996)；Zhao et al,Vir.272:382-93(2000)中所述的，通过引用的方式将其各自内容并入本文。通常用于生产重组AAV病毒颗粒的病毒复制细胞包括但不限于HEK293细胞、COS细胞、HeLa细胞、KB细胞和其他哺乳动物细胞系。
将理解的是，病毒表达系统将被进一步修饰以包含在使用本文描述的方法生产给定病毒载体期间补充给定病毒载体所需的任何必要元件。例如，在某些实施方式中，核酸盒侧接有末端重复序列。在一个实施方式中，为了rAAV载体的生产，AAV表达系统将进一步包含重组AAV质粒、表达Rep的质粒、表达Cap的质粒和腺病毒辅助质粒中的至少一种。用于给定病毒载体的补充(complementary)元件是本领域众所周知的，并且熟练的从业者将能够相应地修改本文所述的病毒表达系统。
用于制造AAV载体的病毒表达系统(例如AAV表达系统)可以进一步包含例如处于诱导型启动子控制下的反式的复制(Rep)基因和/或衣壳(Cap)基因。Rep和Cap的表达可以处于一种诱导型启动子的控制下，使得这些基因的表达一起“开启”，或处于两个单独的诱导型启动子的控制下，这些启动子由不同的诱导物“开启”。在AAV基因组的左侧存在称为p5和p19的两个启动子，从其可以产生不同长度的两个重叠的信使核糖核酸(mRNA)。这些中的每一个都包含可剪接出或不可剪接出的内含子，使得产生四个潜在的Rep基因：Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。Rep基因(特别是Rep78和Rep68)与由ITR在自启动行为中形成的发夹结合，并在发夹内的指定末端解析位点切割。它们对于AAV基因组的AAVS1特异性整合而言是必需的。所有四种Rep蛋白均示出了结合ATP并具有解旋酶活性。正义AAV基因组的右侧编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的重叠序列，它们从一个启动子(指定p40)开始。cap基因产生额外的非结构蛋白，称为组装激活蛋白(AAP)。这种蛋白质由ORF2产生，并且对衣壳组装过程至关重要。用于制造AAV载体的必要元件在本领域中是已知的，并且可进一步综述于例如美国专利号US5478745A；US5622856A；US5658776A；US6440742B1；US6632670B1；US6156303A；US8007780B2；US6521225B1；US7629322B2；US6943019B2；US5872005A；和美国专利申请号US2017/0130245；US20050266567A1；US20050287122A1；通过引用的方式将其各自的内容以其整体并入本文。
在一个实施方式中，将用于产生AAV载体的细胞悬浮培养。在一些实施方式中，将细胞在无动物成分的条件下培养。无动物成分培养基可为与给定的细胞系(例如HEK293细胞)相容的任何无动物成分培养基(例如无血清培养基)。本领域已知的能够增殖AAV载体的任何细胞系都可以用于使用本文所述的方法的AAV生产。可用于生成AAV载体的示例性细胞系包括但不限于HEK293、CHO、Cos-7和NSO。
在一个实施方式中，用于产生AAV载体的细胞系稳定地表达AAV载体产生所需的任何组分，例如Rep、Cap、VP1等。在一个实施方式中，用于产生AAV载体的细胞系瞬时表达AAV载体产生所需的任何组分，例如Rep、Cap、VP1等。
在用于产生AAV载体的细胞系未稳定地或瞬时地表达rep或cap的事件中，这些序列将被提供给AAV表达系统。AAV rep和cap序列可以通过本领域已知的任何方法提供。目前的方案通常在单个质粒上表达AAV rep/cap基因。AAV复制和包装序列不需要一起提供，尽管这样做可能是方便的。AAV rep和/或cap序列可以由任何病毒载体或非病毒载体提供。例如，rep/cap序列可以由杂交腺病毒或疱疹病毒载体提供(例如，插入缺失型腺病毒载体的Ela或E3区)。EBV载体也可用于表达AAV cap和rep基因。这种方法的一个优点在于EBV载体是游离的，且在连续的细胞分裂的整个过程中将保持高拷贝数(即作为染色体外元件稳定整合到细胞中，称为“基于EBV的核游离体”，参见Margolski,Curr.Top.Microbial.Immun.158:67(1992))。
通常，AAV rep/cap序列将不会侧接有TR，以防止这些序列的拯救和/或包装维持。
用于使用本文所述的方法制造慢病毒的病毒表达系统将进一步包含侧接于核酸盒的长末端重复序列(LTR)。LTR是相同的DNA序列，该序列在由逆转录病毒RNA逆转录形成的前病毒DNA或逆转录转座子的任一端处重复数百或数千次。LTR通过LTR特异性整合酶介导逆转录病毒DNA整合到宿主染色体。用于制造慢病毒载体的LTR和方法进一步描述于例如美国专利号US7083981B2；US6207455B1；US6555107B2；US8349606B2；US7262049B2；和美国专利申请号US20070025970A1；US20170067079A1；US20110028694A1；以引用的方式将它们各自的内容以其整体并入本文。
用于使用本文所述的方法制造腺病毒的病毒表达系统将进一步包含侧接于核酸盒的约90-140个碱基对(确切长度取决于血清型)的相同的反向末端重复序列(ITR)。病毒复制起点位于恰好在基因组末端的ITR内。腺病毒基因组为约36000个碱基对的线性双链DNA分子。通常，用于基因疗法中的腺病毒载体在E1区具有缺失，在该处可以引入新的遗传信息；E1缺失使重组病毒复制有缺陷的。用于制造腺病毒载体的ITR和方法进一步描述于例如美国专利号US7510875B2；US7820440B2；US7749493B2；US7820440B2；US10041049B2；国际专利申请号WO2000070071A1；以及美国专利申请号WO2000070071A1；US20030022356A1；US20080050770A1，以引用的方式将它们各自的内容以其整体并入本文。
在一个实施方式中，病毒表达系统可为宿主细胞，例如病毒、哺乳动物细胞或昆虫细胞。示例性的昆虫细胞包括但不限于Sf9、Sf21、Hi-5和S2昆虫细胞系。例如，用于制造AAV载体的病毒表达系统可以进一步包括杆状病毒表达系统，例如，如果病毒表达系统为昆虫细胞。杆状病毒表达系统被设计用于从杆状病毒感染的昆虫细胞中进行高效的大规模病毒生产和重组蛋白表达。杆状病毒表达系统进一步描述于例如美国专利号US6919085B2；US6225060B1；US5194376A；以引用的方式将它们各自的内容以其整体并入本文。
在一些实施方式中，病毒表达系统是无细胞系统。用于病毒载体生产的无细胞系统进一步描述于例如Cerqueira A.等，Journal of Virology,2016；Sheng J.等，TheRoyal Society of Chemistry,2017；以及Svitkin Y.V.和Sonenberg N.Journal ofVirology,2003；通过引用的方式将其各自的内容以其整体并入本文。
可以使用任何标准技术来释放细胞中产生的病毒载体(即，使其从产生该载体的细胞中释出)。例如，可以通过机械方法(例如微射流、离心或超声)或化学方法(例如裂解缓冲液和去污剂)来释放病毒载体。然后，使用本领域的标准方法回收(即收集)和纯化所释放的病毒载体以获得纯的群体。例如，可以通过纯化方法将病毒载体从所述病毒载体被释放入其中的缓冲液中回收，包括使用深度过滤或切向流过滤(TFF)的澄清步骤。如本文实施例中所述，可以通过超声将病毒载体从细胞中释放，并通过使用柱层析对澄清的裂解物进行纯化来回收。
本文提供了病毒载体，该病毒载体表达具有选自SEQ ID NOs：385-412的序列的核酸。在一个实施方式中，核酸序列具有与SEQ ID NOs：385-412的序列至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的序列。在一个实施方式中，病毒载体是AAV。
本文的一个方面是表达具有选自SEQ ID NOs：385-412的序列的核酸的rAAV。本文的一个方面是包含具有选自SEQ ID NOs：413-440的序列的核酸的rAAV。
本文进一步提供了包含病毒载体(例如rAAV，其表达具有选自SEQ ID Nos：385-412的序列的核酸)的组合物。本文进一步提供了编码I1c转基因的核酸序列，其中，核酸序列选自SEQ ID NOs：385-412。在一个实施方式中，核酸序列具有与选自SEQ ID Nos：385-412的序列至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的序列。
在一个实施方式中，核酸序列是经密码子优化的序列。在一个实施方式中，将如SEQ ID NOs：385-412所示的或编码其他经优化的I-1c转基因的核酸序列可操作地与选自如下的启动子连接：CMV启动子、选自表2A的心脏特异性启动子或其变体、或选自表5A的在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子或其变体、或选自表13A的在心肌和骨骼肌中活化的缩短的肌肉特异性启动子或其变体。
还提供了包含357-384中任一项的核酸序列的封闭的线性DNA构建体。封闭的线性DNA可用于制造缺少细菌DNA序列的rAAV的方法中。因此，本文还提供了用于心力衰竭的治疗的药物组合物，该药物组合物包含编码组成型活化的I-1c的rAAV，其中，rAAV组合物缺乏细菌核酸序列。
V.心脏细胞和肌肉细胞
作为非限制性示例，合适的心脏细胞包括但不限于胚胎干细胞、心脏成纤维细胞、骨骼肌成肌细胞、心肌细胞(包括心室心肌细胞)等。在其它实施方式中，心脏细胞是非心肌细胞体细胞。在一些实施方式中，心脏细胞是iPS细胞或其他干细胞衍生的心脏细胞，将该心脏细胞用本文公开的rAAV载体进行离体转染并移植到受试者中。在一些实施方式中，iPSC或其他干细胞衍生的心脏细胞是人类细胞。在一些实施方式中，心脏细胞来源于成体干细胞。将iPSC分化为成熟心脏细胞(包括心肌细胞)的方法是本领域已知的，并且包括但不限于Uosaki等(PLOS One,2011,6(8):e23657)描述的将人类iPS细胞体外分化为心肌细胞的方法。
在一些实施方式中，本文公开的心肌细胞可源自Isl1+多潜能祖细胞，例如在美国临时申请60/856,490和60/860,354以及国际申请PCT/US07/23155中公开的那些细胞，以引用的方式将其整体并入本文。
用本文公开的rAAV载体转染的心肌细胞可以通过使用对心肌细胞谱系典型标志物具有反应性的试剂来鉴定和分离，包括但不限于如下的阳性表达：Mef2c、Nxk2.5、Tbx20、Isl1、GATA4、GATA6；肌钙蛋白T(TnT)、肌钙蛋白C(TnI)、BMP7、BMP4、BMP2、miR-208、miR-143、miR-133a、miR-133b、miR-1、miR-143、miR-689和平滑肌肌动蛋白(smActin)或其同源物或变体。或者，心肌细胞对Mef2c和Nxk2.5的表达呈阳性。更准确地说，可以根据Mef2c和Nxk2.5的阳性表达以及以下标志物中的至少一种的缺失或低水平表达来选择或鉴定心肌细胞：Tbx5；Snai2；miR-200a；miR-200b；miR-199a；miR-199b；miR-126-3p；miR-322和CD31或其同源物或变体。
在一些实施方式中，细胞标志物SIRPA(信号调节蛋白α)可用于鉴定从干细胞分化的心肌细胞群，并允许例如98％为心肌肌钙蛋白T阳性的细胞群的分离(Dubois等，Nat.Biotech，(2011)29；1011-1018)。在Dubois等描述的方法中，PECAM、THY1、PDGFRB和ITGA1干细胞的阴性选择可用于去除非肌细胞群。
在本发明的一些实施方式中，细胞是离体的，例如在细胞培养物中。在本发明的其它实施方式中，细胞可以是组织或多细胞生物体的一部分。
在优选的实施方式中，细胞是肌肉细胞(肌细胞)，该肌肉细胞可以是离体的或体内的。在优选的实施方式中，细胞是心肌细胞，该心肌细胞可以是离体的或体内的。在替代的优选的实施方式中，细胞是骨骼肌细胞，该骨骼肌细胞可以是离体的或体内的。肌肉细胞可以是原代肌肉细胞或肌肉衍生的细胞系的细胞，例如永生化细胞系。细胞可存在于肌肉组织环境中(例如在动物的肌肉中)或可从肌肉组织中分离，例如它可能在细胞培养物中。适当地，细胞是人类细胞。
骨骼肌细胞可以来自快肌或慢肌。
心肌细胞可以选自心室心肌细胞、心房心肌细胞、心脏成纤维细胞或心脏中的内皮细胞(EC)、以及血管周围细胞和起搏细胞。在一个实施方式中，肌肉细胞是心肌细胞。在一个实施方式中，肌肉细胞是骨骼肌细胞。
VI.药物组合物
用于本文公开的施用方法中的本文公开的rAAV载体可以与药学上可接受的赋形剂(即，一种或多种药学上可接受的运载体物质和/或添加，例如缓冲液、运载体、赋形剂、稳定剂等)配制在药物组合物中。药物组合物可以以试剂盒的形式来提供。包含用于本文公开的施用方法中的本文公开的rAAV载体的药物组合物及其用途是本领域已知的。
因此，本发明的进一步方面提供了药物组合物，所述药物组合物包含用于本文公开的施用方法中的本文公开的rAAV载体。根据本公开的药物组合物中的活性成分(例如本文公开的rAAV载体)、药学上可接受的赋形剂和/或任何额外的成分的相对量可以依据特性、大小和/或被治疗的受试者的状况以及进一步依据组合物被施用的途径而有所不同。例如，该组合物可包含0.1％至99％(w/w)的活性成分。例如，组合物可包含0.1％至100％(例如.5％至50％、1％至30％、5％至80％、至少80％)(w/w)的活性成分。
可以使用一种或多种赋形剂或稀释剂来配制药物组合物以：(1)增加稳定性；(2)增强细胞的转染或转导；(3)允许有效载荷缓释或迟释；(4)改变生物分布(例如，将病毒颗粒靶向至特定组织或细胞类型)；(5)增强经编码的蛋白质的翻译；(6)改变经编码的蛋白质的释放曲线和/或(7)允许本发明的有效负载的可调节表达。在一些实施方式中，药学上可接受的赋形剂可以是至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯的。在一些实施方式中，赋形剂被批准用于人和兽医用途。在一些实施方式中，赋形剂可由美国食品和药物管理局批准。在一些实施方式中，赋形剂可以是药物级的。在一些实施方式中，赋形剂可满足美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准。如本文所使用的赋形剂包括但不限于适用于期望的特定剂型的任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体溶媒、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂等。用于配制药物组合物的多种赋形剂和用于制备该组合物的技术是本领域已知的(参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,A.R.Gennaro,Lippincott,Williams and Wilkins,Baltimore,MD,2006；通过引用的方式将其整体并入本文)。在本公开的范围内可以考虑使用常规赋形剂介质，除非任何常规赋形剂介质可能与物质或其衍生物(例如通过以有害的方式与药物组合物的任何其它成分产生任何不期望的生物效果或别的相互作用)不相容。
用于本文公开的施用方法中的本文公开的rAAV载体可以与一种或多种其它的治疗剂、预防剂、研究剂或诊断剂联合使用。“联合”并不意味着试剂必须同时施用和/或必须配制以一同递送，尽管这些递送方法在本发明的范围内。组合物可以与一种或多种其它期望的治疗剂或医学程序同时施用、在治疗剂或医学程序之前施用或在治疗剂或医学程序之后施用。在一些实施方式中，当第二种(例如，一种或多种治疗剂)的递送开始时，一种治疗(例如，基因治疗载体)的递送仍在发生，使得在施用方面存在着重叠。这在本文中有时被称为“同步”或“同时递送”。在其它实施方式中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在二者中的任一情况的一些实施方式中，由于联合施用，治疗更加有效。例如，第二治疗更加有效(例如用更少的第二治疗而看到等效的效果，或者与在第一治疗不存在的情况下施用第二治疗所能看到的相比或与第一治疗所看到的相似情况相比，第二治疗更大程度上减轻了症状)。在一些实施方式中，递送使得与紊乱相关的症状或其它参数减少，该减少超过在不存在另外的治疗的情况下递送一种治疗所观察到的。两种治疗的效果可以是部分叠加的、完全叠加的或大于叠加的。递送可以使得所递送的第一治疗的效果在递送第二治疗时仍然是可检测的。本文所述的组合物和至少一种额外的疗法可以在同一组合物或分开的组合物中同时施用、或序贯施用。对于序贯施用，可以首先施用本文所述的基因治疗载体，其次可以施用一种或多种治疗剂，或者可以颠倒施用顺序。基因治疗载体和一种或多种治疗剂可以在疾患活跃期间或在缓解期或疾病较不活跃期间施用。基因治疗载体可以在另一治疗之前施用、与所述治疗同时施用、所述治疗后或在疾患缓解期间施用。
当联合施用时，用于本文公开的施用方法中的本文公开的rAAV载体和一种或多种治疗剂(例如，第二或第三治疗剂)或全部可以以高于各自单独使用(例如，作为单一疗法)的量或剂量、低于各自单独使用的量或剂量或与各自单独使用的量或剂量相同的量或剂量施用。在某些实施方式中，用于本文公开的施用方法中的本文公开的rAAV载体和一种或多种治疗剂(例如，第二药剂或第三药剂)或全部的施用量或剂量低于(例如，低至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)各自单独使用的量或剂量。在其它实施方式中，用于本文公开的施用方法中的本文公开的rAAV载体和一种或多种治疗剂(例如，第二药剂或第三药剂)或全部的产生期望的效果(例如，心血管疾病或心脏病的治疗)的量或剂量低于(例如，低至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)各自单独实现相同的治疗效果所需的量或剂量。
在一些实施方式中，本文公开的rAAV载体的施用方法可以单独递送本文公开的rAVV载体，或与另外的药剂(例如本文公开的免疫调节剂)联合递送本文公开的rAVV载体。在一些实施方式中额外的药剂是肌肉增强蛋白或肽，例如，在经治疗的肌肉中用于改善血流和增强肌肉功能。此外，如果期望的话，在一些实施方式中，额外的药剂是血管活性剂，该血管活性剂可以与本文所述的这些方法和组合物结合使用，以进一步增强靶位点处的基因递送。示例性血管活性剂包括但不限于组胺、组胺激动剂、一氧化氮供体或VEGF蛋白，并且可用于增加基因载体剂量下的基因转移效率。在一些实施方式中，血管活性剂用于限制为达到给定的治疗效果而需要施用的载体的量。
可与本文所述的AAV颗粒联合使用的化合物包括但不限于目前用于充血性心力衰竭的治疗的药剂，包括血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂、β-受体阻滞剂、诱导正性肌力作用的化合物(例如，增加心脏收缩力)和增加尿流量的化合物或利尿剂。在一些实施方式中，根据本文公开的方法，将rAAV载体与另一种活性剂(例如食物摄入减少剂、或降血糖剂或降血脂剂(例如胰淀素、胰淀素激动剂、CCK或瘦素)、或心脏治疗剂(例如血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂))联合施用。在一个实施方式中，根据本文公开的方法施用的本文公开的rAAV载体与卡托普利
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联合施用。在其它实施方式中，根据本文公开的方法施用的本文公开的rAAV载体与一种或多种另外的ACE抑制剂联合施用，例如苯那普利
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依那普利
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赖诺普利
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福辛普利
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雷米普利
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培哚普利
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喹那普利
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莫昔普利
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和群多普利
Figure BDA00041618199200023810
在一些实施方式中，根据本文公开的方法施用的本文公开的rAAV载体可以与一种或多种β-受体阻滞剂联合用于充血性心力衰竭的治疗，例如索他洛尔
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噻吗洛尔
Figure BDA00041618199200023812
艾司洛尔
Figure BDA00041618199200023813
卡替洛尔
Figure BDA00041618199200023814
卡维地洛
Figure BDA00041618199200023815
纳多洛尔
Figure BDA00041618199200023816
普萘洛尔
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普萘洛尔
Figure BDA00041618199200023818
倍他洛尔
Figure BDA00041618199200023819
喷布洛尔
Figure BDA0004161819920002391
美托洛尔
Figure BDA0004161819920002392
拉贝洛尔
Figure BDA0004161819920002393
醋丁洛尔
Figure BDA0004161819920002394
阿替洛尔
Figure BDA0004161819920002395
美托洛尔
Figure BDA0004161819920002396
拉贝洛尔
Figure BDA0004161819920002397
吲哚洛尔
Figure BDA0004161819920002398
和比索洛尔
Figure BDA0004161819920002399
在一些实施方式中，根据本文公开的方法施用的本文公开的rAAV载体可以与一种或多种血管紧张素π受体阻滞剂(ARB)联合用于充血性心力衰竭的治疗，例如坎地沙坦酯
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厄贝沙坦
Figure BDA00041618199200023911
氯沙坦
Figure BDA00041618199200023912
缬沙坦
Figure BDA00041618199200023913
替米沙坦
Figure BDA00041618199200023914
和甲磺酸依普罗沙坦
Figure BDA00041618199200023915
在一些实施方式中，根据本文公开的方法施用的本文公开的rAAV载体可以与一种或多种醛固酮拮抗剂(例如螺内酯
Figure BDA00041618199200023916
和依普利酮
Figure BDA00041618199200023917
)联合用于充血性心力衰竭的治疗。在一些实施方式中，根据本文公开的方法施用的本文公开的rAAV载体可以与IL-18抑制剂(例如IL-18BP或其变体)联合使用，如美国专利7,799,541中所公开的，以引用的方式将其整体并入本文。
在一些实施方式中，根据本文公开的方法施用的本文公开的rAAV载体可以与一种或多种血管肽酶抑制剂联合用于充血性心力衰竭的治疗。血管肽酶抑制剂包括具有天然内肽酶(NEP)和ACE抑制活性的NEP/ACE抑制剂。NEP/ACE抑制剂的实例包括但不限于三环苯并氮杂
Figure BDA00041618199200023918
酮硫醇(tricyclic benzazepinone thiols)、奥马曲拉、格莫曲拉(gemopatrilat)、mixanpril、消旋卡多曲、法西多曲、山帕曲拉、MDL 100.240Z13752A、BMS1 89921、BMS182657和CGS 30008。适用于本文中的NEP/ACE抑制剂的实例包括在美国专利号5,362,727、5,366,973、5,225,401、4,722,810、5,223,516、4,749,688和5,552,397中所公开的那些，通过引用的方式将它们以其整体并入本文。此类额外的药剂或化合物可以与根据本文公开的方法施用的rAAV载体同时(即，在施用期间)施用，或者受试者可以在施用rAAV载体之前、期间或之后用额外的药剂进行治疗。
在一些实施方式中，根据本文公开的方法施用的本文公开的rAAV载体可以与本领域已知的充血性心力衰竭的任何疗法联合用于充血性心力衰竭的治疗。例如，在一个实施方式中，根据本文公开的方法的rAAV载体的施用可与治疗设备(例如心脏再同步)联合用于充血性心力衰竭的治疗。
根据本公开的药物组合物可以以单一单位剂量和/或以多个单一单位剂量批量制备、包装和/或销售。如本文所使用的，“单位剂量”是指包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将施用至受试者的活性成分的剂量和/或这种剂量的方便的分数，例如这种剂量的二分之一或三分之一。
在另一方面，制备本文公开的rAAV载体以用作本文公开的施用方法中使用的药物。
在另一方面，制备本文公开的rAAV载体以用作本文公开的施用方法中使用的药物来用于治疗(即，医学病症或疾病的预防或治疗)，例如本文公开的心血管疾病或心脏病或疾患。下面讨论与本方面相关的示例性的医学病症或疾病。
在另一方面，提供了包含本文公开的rAAV载体的细胞，所述rAAV载体包含选自表1-表3的合成的心脏特异性启动子或其变体。在一些实施方式中，细胞是哺乳动物细胞，任选地是人类细胞。适当地，细胞是心脏细胞。适当地，细胞可以是心肌细胞，例如心室心肌细胞。适当地，细胞可以是人类心肌细胞，例如人类心室心肌细胞。
在一些实施方式中，药物组合物包含在约pH 7.0至约pH8.0的缓冲液(例如，赋形剂)中的重组AAV载体。在一些实施方式中，缓冲液的pH为约7.0至约7.5。在优选的实施方式中，缓冲液的pH小于7.5。在数个实施方式中，缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)或磷酸盐缓冲液(例如，10mM磷酸盐pH 7.4、350mM NaCl、2.7mM KCl、5％山梨糖醇、0.001％(w/v)泊洛沙姆188)。在某些实施方式中，缓冲液或赋形剂包含选自于由钠、钾、磷酸盐、氯化物、钙、镁、硫酸盐、柠檬酸盐及其任意组合所组成的组中的离子。药物组合物还包含多元醇、糖或类似物。在一些实施方式中，药物组合物包含甘油或丙二醇或聚乙二醇或山梨糖醇或甘露醇。在数个实施方式中，山梨糖醇的浓度范围为约1％(w/v)至约10％(w/v)。在一些实施方式中，山梨糖醇的浓度范围为约2％(w/v)至约8％(w/v)。在优选的实施方式中，山梨糖醇的浓度范围为约3％(w/v)至约6％(w/v)。在某些实施方式中，山梨糖醇的浓度为1％(w/v)、2％(w/v)、3％(w/v)、4％(w/v)、5％(w/v)、6％(w/v)、7％(w/v)、8％(w/v)、9％(w/v)或10％(w/v)。药物组合物还包含非离子表面活性剂。在一些实施方式中，非离子表面活性剂选自于由聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、烷基葡糖苷、烷基酚乙氧基化物、聚山梨醇酯、聚氧乙烯烷基苯基醚及其任意组合所组成的组。在一些实施方式中，非离子表面活性剂是泊洛沙姆188或Ecosurf SA-15。在某些实施方式中，泊洛沙姆188或Ecosurf SA-15的浓度为0.0005％(w/v)、0.0008％(w/v)、0.0009％(w/v)、0.001％(w/v)、0.002％(w/v)、0.0025％(w/v)、0.003％(w/v)、0.0035％(w/v)、0.004％(w/v)、0.0045％(w/v)、0.005％(w/v)、0.006％(w/v)、0.007％(w/v)、0.008％(w/v)、0.009％(w/v)或0.01％(w/v)。
药物组合物包含至少1×109vg/ml的如本发明公开的重组AAV载体。在一些实施方式中，药物组合物包含约1×109vg/ml至约1×1013vg/ml重组AAV载体。在一些实施方式中，药物组合物包含约1×1011vg/ml至约1×1013vg/ml重组AAV载体。在数个实施方式中，药物组合物包含约1×1011vg/ml至约1×1013vg/ml重组AAV2i8载体，所述AAV2i8载体包含编码磷酸酶抑制剂多肽的核酸，其中，所述核酸与选自如下的启动子可操作地连接：CMV启动子、选自表2A的心脏特异性启动子或其变体、或选自表5A的在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子或其变体、或选自表13A的在心肌和骨骼肌中活化的缩短的肌肉特异性启动子或其变体。
VII.其他方法和用途
在一个实施方式中，所述技术还提供了用于如本文公开的施用方法中的如本文公开的rAAV载体，以用于心血管疾病或心脏疾病或心力衰竭的治疗，优选CHF。上文讨论了相关病症、疾病和治疗性表达产物。在一个实施方式中，所述技术还提供了用于心血管疾病或心脏疾病或心力衰竭(优选CHF)的治疗的如本文公开的rAAV载体。
在一个实施方式中，所述技术还提供了用作药物的用于如本文公开的施用方法中的如本文公开的rAAV载体。在一个实施方式中，所述技术还提供了用作药物的如本文所公开的rAAV载体。
在一个实施方式中，所述技术还提供了用于本文公开的施用方法中的如本文公开的rAAV载体，其用于制造药物组合物以用来治疗本文提及的任何病症或疾病。在一个实施方式中，所述技术还提供了用于本文提及的任何病症或疾病的治疗中的如本文所公开的rAAV载体。
在一个实施方式中，所述技术还提供了包含用于如本文公开的施用方法中的如本文公开的rAAV载体的细胞。适当地，细胞是真核细胞。所述真核细胞可以适当地是动物(后生动物)细胞(例如哺乳动物细胞)。适当地，细胞是人类细胞。在本发明的一些实施方式中，细胞是离体的，例如在细胞培养物中。在本发明的其它实施方式中，细胞可以是心脏组织的一部分或心脏组织。在一个实施方式中，所述技术还提供了用作药物的包含如本文公开的rAAV载体的细胞。
在优选的实施方式中，细胞是心脏细胞，所述心脏细胞可以是离体的或体内的。心脏细胞可以是心肌细胞，例如心室心肌细胞、心房心肌细胞、平滑肌细胞、起搏细胞或其他心脏细胞。或者，心脏细胞可以是心脏衍生的细胞系，例如永生化细胞系。在一个实施方式中，细胞是肌肉细胞，例如心脏中的心肌细胞或平滑肌细胞。细胞可以存在于心脏组织环境中(例如在动物的心脏中)或者可以从心脏组织中分离，例如它可能在细胞培养物中。适当地，原代细胞或细胞系是人类细胞。
在另一方面，本发明提供了用于在细胞中产生如本文公开的rAAV载体的方法，优选心脏细胞。所述方法适当地包括将所述心脏细胞维持在适合的基因表达的条件下。在培养物中，这可以包括在合适的培养条件下孵育心脏细胞或包含心脏细胞的组织。表达当然可以是体内的，例如在受试者的心脏的一个或多个细胞中。
适当地，所述方法包括将如本文公开的rAAV载体引入心脏细胞中的步骤。多种转染心脏细胞的方法是本领域众所周知的。转染心脏细胞的优选方法是用如本文公开的rAAV载体转导细胞。
对于技术人员显而易见的是，如本文公开的rAAV载体可用在用于基因治疗的如本文公开的施用方法中。
本发明还提供了施用如本文公开的rAAV载体以在心脏细胞中表达治疗性转基因的方法，所述方法包括根据如本文公开的施用方法向心脏细胞引入如本文公开的rAAV载体。心脏细胞可以在体内或离体。
本文公开的技术的组合物和方法的所有方面可以以如下的编号段落中的任何一个或多个定义：
A.一种治疗患有心力衰竭的患者的方法，包括：向患者的心脏细胞中施用至少一个总剂量的rAAV载体，所述载体包含编码抑制磷酸酶活性的磷酸酶抑制剂蛋白的核酸序列，其中，所述rAAV的至少一个剂量选自约1013vg至约1015vg的总剂量范围，并且其中，施用后六个月，患者血清中的NT-proBNP水平低于900pg/mL。
B.如段落A所述的方法，其中，所述rAAV载体进一步包含CMV启动子或合成启动子，所述启动子可操作地连接至磷酸酶抑制剂蛋白。
C.如段落A-B中任一段所述的方法，其中，所述总剂量在约20分钟至约30分钟的时间段内施用。
D.如段落A-C中任一段所述的方法，其中，所述总剂量的施用以子剂量进行，其中，每个子剂量在1-5分钟的时间段内施用。
E.如段落A-D中任一段所述的方法，其中，所述总剂量的施用以五个子剂量进行，每个子剂量在1-5分钟的时间段内施用。
F.如段落5所述的方法，其中，在约20分钟至约30分钟的时间段内施用所述五个子剂量。
G.如段落A-E中任一段所述的方法，其中，所述rAAV选自于由以下所组成的组：AAV2、AAV6、AAV8、AAV9、AAV2i8、rh10、AAV2.5和AAV2G9。
H.如段落1-7中任一段所述的方法，其中，所述rAAV的至少一个总剂量是1013vg、3×1013vg、1014vg、3×1014vg或1015vg。
I.一种治疗患有心力衰竭的患者的方法，所述方法包括：向患者的心脏细胞中施用至少一个总剂量的rAAV载体，所述载体包含：(i)编码抑制磷酸酶活性的磷酸酶抑制剂蛋白的核酸序列，(ii)合成启动子，所述合成启动子可操作地连接至磷酸酶抑制剂(I-1)蛋白。
J.如段落I所述的方法，其中，所述总剂量在约20分钟至约30分钟的时间段内施用。
K.如段落I-J所述的方法，其中，所述总剂量的施用以子剂量进行，其中，每个子剂量在1-5分钟的时间段内施用。
L.如段落I-K所述的方法，其中，所述总剂量的施用以五个子剂量进行，其中，每个子剂量在1-5分钟的时间段内施用。
M.如段落I-L所述的方法，其中，在约20分钟至约30分钟的时间段内施用所述五个子剂量。
N.如段落A-M中任一段所述的方法，其中，所述rAAV选自于由以下所组成的组：AAV2、AAV6、AAV8、AAV9、AAV2i8、rh10、AAV2.5和AAV2G9。
O.如段落A-N中任一段所述的方法，其中，所述rAAV的至少一个总剂量选自约1013vg至约1015vg的剂量范围。
P.如段落A-O中任一段所述的方法，其中，所述rAAV的至少一个剂量是1013vg、3×1013vg、1014vg、3×1014vg或1015vg。
Q.如段落A-P中任一段所述的方法，其中，所述rAAV剂量施用后六个月，患者血清中的NT-proBNP水平低于900pg/mL。
R.如段落A-Q中任一段所述的方法，其中，所述方法进一步包含施用免疫调节剂。
S.如前述段落A-R中任一段所述的方法，其中，所述rAAV载体包含编码多肽的核酸序列，所述多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸1-65，其中在SEQ ID NO:1的第35位的苏氨酸被替换为天冬氨酸(T35D)。
T.如前述段落A-S中任一段所述的方法，其中，所述rAAV选自表11。
U.如前述段落A-T中任一段所述的方法，所述施用进一步包括硝普盐或硝酸甘油。
V.如段落A-U中任一段所述的方法，其中，合成启动子导致磷酸酶抑制蛋白优先在平滑肌细胞中表达。
W.如段落A-V中任一段所述的方法，其中，合成启动子引起磷酸酶抑制剂蛋白优先在心脏细胞中表达。
X.如段落A-W中任一段所述的方法，其中，所述表达等同于由CMV启动子引起的表达。
Y.如段落A-X中任一段所述的方法，其中，所述施用是进入患者心脏的冠状动脉的腔内或全身施用。
Z.如段落A-Y中任一段所述的方法，其中，合成启动子是选自表2A的心脏特异性启动子或其变体、或选自表5A或表13A的在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子或其变体。
AA.一种治疗患有心血管病症或心脏疾病的患者的方法，包括：向患者的心脏细胞中施用至少一个总剂量的rAAV载体，所述rAAV载体包含可操作地连接至选自表2A的心脏特异性启动子或其变体、或选自表5A或表13A的在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子或其变体的治疗性核酸，其中所述治疗性核酸是RNA或DNA，其中所述治疗性核酸表达选自表18A或表18B的治疗性蛋白。
BB.如段落AA所述的方法，其中，所述心血管疾病或心脏疾病选自以下的任何一种：充血性心力衰竭(CHF)、左心室重构、外周动脉闭塞性疾病(PAOD)、扩张型心肌病(DCM)(包括特发性扩张型心肌病(IDCM))、冠状动脉疾病、缺血、心律不齐、心肌梗塞(MI)、心脏收缩力异常、急性(失代偿性)心力衰竭(AHF)、Ca2+代谢异常、心肌缺血、动脉粥样硬化、心肌病、特发性心肌病、心律失常、肌营养不良症、肌肉质量异常、肌肉退化、感染性心肌炎、药物或毒素诱发的肌肉异常、过敏性心肌炎、自身免疫性心内膜炎和先天性心脏疾病以及肺心病高血压。
CC.如段落AA-BB中任一段所述的方法，其中，所述总剂量在约20分钟至约30分钟的时间段内施用。
DD.如段落AA-CC中任一段所述的方法，其中，所述总剂量的施用以子剂量进行，其中每个子剂量在1-5分钟的时间段内施用。
EE.一种治疗患有心力衰竭的患者的方法，包括：向患者的心脏细胞中施用至少一个总剂量的rAAV载体，该载体包含编码抑制磷酸酶活性的磷酸酶抑制剂蛋白的核酸序列，其中，至少一个总剂量的rAAV选自约1013vg至约1015vg的剂量范围，其中，所述总剂量在约20分钟至约30分钟的时间段内施用，其中，所述总剂量的施用以子剂量进行，其中，每个子剂量在1-5分钟的时间段内施用。
FF.如段落AA-EE中任一段所述的方法，其中，所述rAAV载体进一步包含CMV启动子或合成启动子，所述启动子可操作地连接至磷酸酶抑制剂蛋白。
GG.如段落AA-FF中任一段所述的方法，其中，所述rAAV选自于由AAV2、AAV6、AAV8、AAV9、AAV2i8、rh10、AAV2.5和AAV2G9所组成的组。
HH.如段落AA-GG中任一段所述的方法，其中，所述总剂量的施用以五个子剂量进行，每个子剂量在1-5分钟的时间段内施用。
II.如段落AA-HH中任一段所述的方法，所述五个子剂量在约20分钟至约30分钟的时间段内施用。
JJ.如段落AA-II中任一段所述的方法，其中，所述rAAV的至少一个总剂量是1013vg、3×1013vg、1014vg、3×1014vg或1015vg。
KK.如前述段落中任一段所述的方法，其中，所述rAAV的至少一个子剂量是1013vg、3×1013vg、1014vg、3×1014vg或1015vg。
LL.一种治疗患有充血性心力衰竭的患者的方法，包括：向患者施用至少一个剂量的rAAV载体，其中所述rAAV载体是AAV2i8，并且包含编码磷酸酶抑制剂1(I-1)的核酸，所述核酸可操作地连接至选自以下的启动子：CMV启动子、选自表2A的心脏特异性启动子或其变体、或者选自表5A或表13A的在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子或其变体。
MM.如段落LL所述的方法，其中，所述I-1包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65或其功能片段，其中SEQ ID NO：1第35位的苏氨酸被天冬氨酸(T35D)替换。
NN.如段落LL-MM中任一段所述的方法，其中，编码磷酸酶抑制剂的核酸编码I-1的组成型活化片段(I-1c)，其包含SEQ ID NO：1的片段，其中，所述片段选自SEQ ID NO：1的氨基酸1-54、SEQ ID NO：1的氨基酸1-61、SEQ ID NO：1的氨基酸1-65、SEQ ID NO：1的氨基酸1-66、SEQ ID NO：1的氨基酸1-67或SEQ ID NO：1的氨基酸1-77、或其功能变体，其中，SEQID NO：1第35位的苏氨酸被天冬氨酸(T35D)替换。
OO.如段落LL-NN中任一段所述的方法，其中，所述心力衰竭包括缺血、心律不齐、心肌梗塞、心脏收缩力异常或Ca2+代谢异常。
PP.如段落LL-OO中任一段所述的方法，其中，所述施用是进入患者心脏的冠状动脉的腔内。
QQ.如段落LL-PP中任一段所述的方法，其中，所述至少一个剂量是约1013vg至约1015vg的总剂量范围，以2个至5个子剂量施用。
RR.一种腺相关病毒(AAV)载体，所述载体包含编码多肽的核酸序列，所述多肽包含至少SEQ ID NO：1的氨基酸1-54，其中，在SEQ ID NO：1第35位氨基酸处的苏氨酸被天冬氨酸替换，并且其中，所述核酸序列可操作地连接至选自以下的任何一种的启动子：CMV启动子，选自表2A的心脏特异性启动子或其变体，或选自表5A或表13A的在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子或其变体。
SS.如段落RR所述的AAV载体，其中，所述多肽选自SEQ ID NO：1的氨基酸1-54、SEQID NO：1的氨基酸1-61、SEQ ID NO：1的氨基酸1-65、SEQ ID NO：1的氨基酸1-66、SEQ IDNO：1的氨基酸1-67或SEQ ID NO：2的氨基酸1-77、或其功能变体，其中，SEQ ID NO：1第35位的苏氨酸被天冬氨酸(T35D)替换。
TT.如段落RR所述的AAV载体，其中，所述AAV选自于由以下组成的组：腺相关病毒-1(AAV1)、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAV2i8。
UU.一种药物组合物，所述药物组合物包含：(i)腺相关病毒(AAV)载体，所述载体包含编码含有至少SEQ ID NO：1的氨基酸1-54的多肽的核酸序列，其中，在SEQ ID NO：1第35位氨基酸处的苏氨酸被替换为天冬氨酸(T35D)，并且其中，所述核酸序列可操作地连接至选自表2A的心脏特异性启动子或其变体、或选自表5A或表13A的在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子或其变体，和(ii)药学上可接受的运载体。
VV.如段落UU所述的药物组合物，其中，所述AAV载体包含编码选自以下的多肽的核酸序列：SEQ ID NO：1的氨基酸1-54、SEQ ID NO：1的氨基酸1-61、SEQ ID NO：1的氨基酸1-65、SEQ ID NO：1的氨基酸1-66、SEQ ID NO：1的氨基酸1-67、或SEQ ID NO：2的氨基酸1-77、或其功能变体，其中，SEQ ID NO：1第35位的苏氨酸被天冬氨酸替换(T35D)。
WW.如段落UU或VV所述的AAV载体，其中，AAV选自于由以下所组成的组：腺相关病毒-1(AAV1)、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAV2i8。
XX.如段落49所述的AAV载体，其中，所述AAV是AAV9或AAV2i8。
本文公开的技术的组合物和方法的所有方面可以以如下编号段落中的任何一个或多个定义：
1.一种治疗患有心力衰竭的患者的方法，包括：
向具有充血性心力衰竭(CHF)分类的患者的心脏细胞中施用至少一个总剂量的rAAV载体，所述载体包含编码抑制磷酸酶活性的磷酸酶抑制剂(I-1)蛋白的核酸序列，其中，所述rAAV的至少一个剂量选自约1013vg至约1015vg的总剂量范围，并且其中，施用后至少十二个月，充血性心力衰竭的分类有改善。
2.如段落1所述的方法，其中，所述分类基于以下所使用的分类系统：美国心脏协会(AHA)、美国心脏病学会(ACC)、明尼苏达心力衰竭生活质量问卷(MLHFQ)、堪萨斯城心肌病问卷(KCCQ)、或2016欧洲心脏病学会指南(ESCG)、日本心力衰竭学会(JHFS)指南、日本循环学会(JCS)指南、或纽约心脏协会(NYHA)。
3.如段落1或2所述的方法，其中，在施用所述rAAV后12个月，所述分类具有至少一个等级的改善。
4.如段落1或2所述的方法，其中，在施用所述rAAV后6个月内，所述分类具有至少一个等级的改善。
5.如段落1所述的方法，其中，在施用后12个月，所述分类具有至少两个等级的改善。
6.如段落1-5中任一项所述的方法，其中，所述分类系统是NYHA，并且分类的等级选自于由以下所组成的组：I级、II级、III级和IV级。
7.如段落1-5中任一项所述的方法，其中，所述分类系统是美国心脏病学会/美国心脏协会(ACC/AHA)的补充分期系统，并且分类的等级选自于由以下所组成的组：A期、B期、C期、D期。
8.如段落1-5中任一项所述的方法，其中，所述分类系统是KCCQ，并且分类的等级是KQQC总体汇总得分范围，其选自于由以下所组成的组：KCCQ一般到优秀的分数为50到100，非常差到一般的分数为0到49，良好到优秀的分数为75到100，并且非常差到良好的分数为0到74。
9.一种治疗患有心肌病的患者的方法，包括：
向患者的心脏细胞中施用至少一个总剂量的rAAV载体，该载体包含编码抑制磷酸酶活性的磷酸酶抑制剂(I-1)蛋白的核酸序列，其中，所述rAAV的至少一个剂量选自约1013vg至约1015vg的总剂量范围，并且其中，在施用后至少12个月，在所述患者中至少一个参数比基线水平有改善，其中所述至少一个参数选自基本上由以下所组成的组：射血分数(EF)，收缩末期容积(ESV)；心脏收缩力，选自射血分数(EF)和短轴缩短率(FS)；心脏容积，选自舒张末期容积(DV)和收缩末期容积(ESV)中的任一项；功能性标准，选自6分钟步行测试(6MWT)、锻炼和VO2max中的任一项；BNP水平，Pro-BNP水平；生物标志物水平，其中所述生物标志物水平选自肌钙蛋白、血清肌酐、胱抑素C或肝脏转氨酶的组；患者报告的结果(PRO)，例如减少的症状、健康相关的生活质量(HRQOL)或患者感知的健康状况；以及因心力衰竭导致的死亡风险、减少的因心力衰竭症状导致的住院治疗、或用于治疗心力衰竭的治疗性干预中的任一项的减少。
10.如段落9所述的方法，其中，在施用后至少12个月，具有至少2个参数的改善。
11.如段落10所述的方法，其中，在施用后至少12个月，具有至少3个参数的改善。
12.如段落11所述的方法，其中，在施用后至少12个月，具有至少4个参数的改善。
13.如段落12所述的方法，其中，在施用后至少12个月，具有至少5个参数的改善。
14.如段落9所述的方法，其中，所述改善选自以下的任何一项：射血分数比基线增加至少5％以上，收缩末期容积比基线减少至少10％、或减少至少20mL，6分钟步行测试比基线增加至少50米，血液中的BNP水平(pg/mL)比基线减少至少40％，血液中的pro-BNP水平(pg/mL)比基线减少至少35％；相比于同一生物标志物的基线水平，选自肌钙蛋白、血清肌酐、胱抑素C或肝脏转氨酶的生物标志物减少至少10％；心肌耗氧量(MVO2)比基线增加至少1.5mL/kg/min；或者由于HF症状改善而出院，或者由于受试者中的改善的HF症状而减少的干预，所述减少的干预选自正性肌力药、血管扩张剂、利尿剂中的任何一种的使用减少。
15.如段落1或14所述的方法，其中，所述rAAV载体进一步包含CMV启动子或合成启动子，所述启动子可操作地连接至磷酸酶抑制剂蛋白。
16.如段落1-15中任一项所述的方法，其中，按以下的施用方法中的任何一种施用所述总剂量：在约20分钟至约30分钟的时间段内；以一系列子剂量施用，其中每个子剂量在约1分钟至约5分钟的时间段内施用；以一系列五个子剂量施用，每个子剂量在约1分钟至约5分钟的时间段内施用，并且其中所述五个子剂量在约20分钟至约30分钟的时间段内施用。
17.如段落1-16中任一项所述的方法，其中，所述rAAV载体包含非靶向肝脏的衣壳。
18.如段落1-17中任一项所述的方法，其中，所述rAAV选自于由以下所组成的组：AAV1、AAV2、AAV6、AAV8、AAV9、AAV2i8、rh10、AAV2.5和AAV2G9。
19.如段落1-18中任一项所述的方法，其中，所述rAAV载体是AAV2i8。
20.如段落1-19中任一项所述的方法，其中，所述rAAV的至少一个总剂量是1013vg、3×1013vg、1014vg、3×1014vg或1015vg。
21.如段落1-20中任一项所述的方法，其中，所述磷酸酶抑制剂(I-1)蛋白是组成型活化的蛋白(I-1c)。
22.如段落21所述的方法，其中，所述I-1c选自以下的任何一种：(a)包含至少SEQID NO：1的氨基酸残基1-54的多肽，其中SEQ ID NO：1在C端第70、67、66、65或61或54位氨基酸处截短，并且其中在第35位有天冬氨酸(T35D)；(b)包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-54或其功能片段的多肽，其中所述功能片段与SEQ ID NO：1的氨基酸残基1-54具有至少85％的序列同一性，或在C端第70、67、66、65或61或54位氨基酸处截短，并且其中在第35位有天冬氨酸(T35D)。
23.如段落1-21中任一项所述的方法，其中，所述rAAV基因组包含选自于由SEQ IDNO：413-441所组成的组中的核酸序列。
24.如段落21所述的方法，其中，所述编码I-1多肽的核酸序列选自：(a)编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65的多肽的核酸序列，其中在SEQ ID NO：1第35位处的苏氨酸(T)被替换成非T的氨基酸；(b)编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65的多肽的核酸序列，其中在SEQ ID NO：1第35位处的苏氨酸(T)被选自天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)中的任一氨基酸取代；(c)编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65的多肽的核酸序列，其中在SEQ ID NO：1第35位处的苏氨酸(T)被天冬氨酸(D)或天冬氨酸的保守氨基酸取代。
25.如段落1-24中任一项所述的方法，其中，所述编码I-1蛋白的核酸序列是经密码子优化的核酸序列。
26.如段落1-25中任一项所述的方法，其中，所述编码I-1蛋白的核酸序列选自SEQID NO：385-412中的任何一个、或与SEQ ID NO：385-412具有至少80％序列同一性的核酸序列。
27.如段落1-26中任一项所述的方法，其中，所述患有心肌病的受试者患有非缺血性心力衰竭和/或非缺血性心肌病。
28.如段落1-27中任一项所述的方法，其中，所述患有心肌病的受试者患有先天性心肌病或具有心脏表现的遗传性疾患。
29.如段落29所述的方法，其中，所述患有先天性心肌病或具有心脏表现的遗传性疾患的受试者具有选自于由以下所组成的组中的疾病或疾患：致心律失常性右心室心肌病、家族性心房粘液瘤、原发孔型房间隔缺损、静脉窦型房间隔缺损、巴氏综合征、肌营养不良症、Buerger病、心脑肌病、染色体1p36缺失综合征、先天性全身脂质营养不良4型、先天性心脏传导阻滞、扩张型心肌病、杜氏肌营养不良症(DMD)、Fabry病、家族性心房颤动、家族性扩张型心肌病、家族性肥厚型心肌病、家族性进行性心脏传导缺陷、家族性胸主动脉瘤和主动脉夹层、纤维肌发育不良、Friedreich共济失调、戈谢病、糖原贮积病(2、3或4型)、His束性心动过速、Hurler综合征、左心发育不良综合征、婴儿组织细胞样心肌病、颅内动静脉畸形、异丁酰-辅酶A脱氢酶缺乏症、激肽释放酶高血压、川崎病、Kearns-Sayre综合征、左心室致密化不全、肢带型肌营养不良症(1B、2E、2F、2M、2C、2D型)、局限性系统性硬化症、长QT综合征1、淋巴水肿和脑动静脉异常、淋巴细胞性血管炎、小头症-心肌病、线粒体脑肌病乳酸酸中毒和卒中样发作、线粒体三功能蛋白缺乏症、强直性肌营养不良症1型、新生儿卒中，Noonan综合征1-、2-、3-、4-、5-和6，围产期心肌病、Peters plus综合征、PGM1-CDG、PHACE综合征、受磷蛋白Arg 14缺失、体位性心动过速综合征、原发性肉碱缺乏症、进行性家族性心脏传导阻滞(1A、1B和2型)、假性醛固酮减少症2型、肺动脉高压、肺动脉闭锁伴完整室间隔、肺动脉闭锁伴室间隔缺损、肺动脉瓣狭窄、肺静脉狭窄、肺动脉狭窄、肾功能缺乏性高血压、视网膜动脉大动脉瘤伴肺动脉瓣上狭窄、右心室发育不全、结节病、Sengers综合征、内脏反位、突发性心律失常死亡综合征、主动脉瓣上狭窄、Swyer综合征、TANGO2相关代谢性脑病和心律不齐、TARP综合征、法洛四联症、Timothy综合征、三尖瓣闭锁、Vici综合征、VLCAD缺乏症和Williams综合征。
30.如段落1-29中任一项所述的方法，其中，所述患有心肌病的受试者患有缺血性心肌病。
31.如段落1-30中任一项所述的方法，其中，所述患有心肌病的受试者患有心力衰竭。
32.如段落31所述的方法，其中，所述患有心力衰竭的受试者的分类相当于纽约心脏协会(NYHA)分类系统中的III级以上。
33.如段落30-32中任一项所述的方法，其中，所述患有心力衰竭的受试者患有心血管疾病或心脏疾病，所述疾病选自以下的任何一种：充血性心力衰竭(CHF)、左心室重构、外周动脉闭塞性疾病(PAOD)、扩张型心肌病(DCM)(包括特发性扩张型心肌病(IDCM))、冠状动脉疾病、缺血、心律不齐、心肌梗塞(MI)、心脏收缩力异常、急性(失代偿性)心力衰竭(AHF)、Ca2+代谢异常、心肌缺血、动脉粥样硬化、心肌病、特发性心肌病、遗传性疾患诱发的心肌病、心律失常、肌营养不良症、肌肉质量异常、肌肉退化、感染性心肌炎、药物或毒素诱发的肌肉异常、过敏性心肌炎、自身免疫性心内膜炎和先天性心脏疾病和肺心病高血压。
34.如段落1-33中任一项所述的方法，其中，患有心肌病的受试者具有降低的射血分数(rEF或HFrEF)或者保留的射血分数(HFpEF)。
35.如段落1-34中任一项所述的方法，其中，在施用rAAV后至少12个月，心力衰竭的分类比基线水平改善至少一个等级，其中心力衰竭的分类通过以下的至少一个来评价：(a)美国心脏协会(AHA)、美国心脏病学会(ACC)、2016欧洲心脏病学会指南(ESCG)、日本心力衰竭学会(JHFS)指南、日本循环学会(JCS)指南或纽约心脏协会(NYHA)所使用的分类系统，或其等同物；或(b)选自于由以下的任一者所组成的组中的健康相关生活质量(HRQL)问卷：明尼苏达心力衰竭生活质量问卷(MLHFQ)、或堪萨斯城心肌病问卷(KCCQ)、慢性心力衰竭问卷(CHFQ)、重度心力衰竭生活质量问卷(QLQ-SHF)、左心室功能障碍(LVD-36)问卷、和左心室疾病问卷(LVDQ)。
36.如段落35所述的方法，其中，在施用rAAV后6个月内，分类具有至少一个等级的改善。
37.如段落35所述的方法，其中，在施用rAAV后12个月内，分类具有至少两个等级的改善。
38.如段落35所述的方法，其中，比起基线水平，在生活质量MLWHFQ或KCCQ中具有减少至少10分的改善。
39.如段落1-38中任一项所述的方法，其中，在施用所述至少一个总剂量的rAAV载体的同时、和/或之前、和/或之后向所述受试者施用血管扩张剂。
40.如段落1-39中任一项所述的方法，其中，在施用所述至少一个总剂量的rAAV载体的同时、或之前、或之后向所述受试者施用免疫调节剂。
41.一种药物组合物，所述药物组合物包含AAV载体，所述载体包含选自SEQ IDNO：385-412中任何一个的经密码子优化的I-Ic核酸序列，或与SEQ ID NO：385-412具有至少80％序列同一性的核酸序列。
42.如段落41所述的药物组合物，其中，所述经密码子优化的核酸序列可操作地连接至CMV启动子或合成启动子。
43.如段落41所述的药物组合物，所述药物组合物包含选自于由以下所组成的组中的核酸序列：SEQ ID NO：41-42，或与SEQ ID NO：385-412具有至少80％序列同一性的核酸序列。
44.如段落41-43中任一项所述的药物组合物，用于如段落1-40中任一项所述的方法。
45.一种腺相关病毒(AAV)载体，所述载体包含编码磷酸酶抑制剂(I-1)多肽的核酸序列，所述核酸序列可操作地连接至选自以下任何一种的启动子：选自表2A的心脏特异性启动子或其变体，在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子或其变体，或当存在心脏组织特异性增强子时的任何启动子。
46.如段落45所述的AAV载体，其中，在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子选自表5A或表13A或其变体。
47.如段落45-46中任一项所述的AAV载体，其中，所述AAV选自于由以下所组成的组：腺相关病毒-1(AAV1)、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAV2i8。
48.如段落45-47中任一项所述的AAV载体，其中，所述AAV包含非靶向肝脏的衣壳。
49.如段落45-48中任一项所述的AAV载体，其中，所述AAV载体是AAV2i8。
50.如段落45-49中任一项所述的AAV载体，其中，所述磷酸酶抑制剂(I-1)多肽是组成型活化的蛋白(I-1c)。
51.如段落45-50中任一项所述的AAV载体，其中，所述I-1c选自以下的任何一种：(a)包含至少SEQ ID NO：1的氨基酸残基1-65的多肽或其功能等同物；(b)包含至少SEQ IDNO：1的氨基酸1-54的多肽，其中所述多肽在C端选自残基70、67、66、65或61或54的氨基酸处截短，并且在第35位有天冬氨酸(T35D)；(c)包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65的多肽或其功能等同物，所述功能等同物与SEQ ID NO：1的氨基酸残基1-65具有至少85％的序列同一性；或者(d)选自以下任何一种的多肽：SEQ ID NO：507或527-532或其功能等同物，所述功能等同物与SEQ ID NO：507或527-532中任何一个的氨基酸残基具有至少85％的序列同一性。
52.如段落45-51中任一项所述的AAV载体，其中，所述编码I-1多肽的核酸序列选自：(a)编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65的多肽的核酸序列，其中，在SEQ ID NO：1第35位的苏氨酸(T)被替换成非T的氨基酸；(b)编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65的多肽的核酸序列，其中，在SEQ ID NO：1第35位的苏氨酸(T)被选自天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)中的任一氨基酸替换；(c)编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65的多肽的核酸序列，其中，在SEQ ID NO：1第35位的苏氨酸(T)被替换为天冬氨酸(D)、或天冬氨酸的保守氨基酸。
53.如段落45-52中任一项所述的AAV载体，其中，所述多肽选自：SEQ ID NO：1的氨基酸1-54、SEQ ID NO：1的氨基酸1-61、SEQ ID NO：1的氨基酸1-65、SEQ ID NO：1的氨基酸1-66、SEQ ID NO：1的氨基酸1-67或SEQ ID NO：2的氨基酸1-77、或其功能变体，其中在SEQID NO：1第35位的苏氨酸被天冬氨酸(T35D)或天冬氨酸的保守氨基酸替换。
54.如段落45-50中任一项所述的AAV载体，其中，所述编码I-1多肽的核酸序列是经密码子优化的核酸序列。
55.如段落45-54中任一项所述的AAV载体，其中，与SEQ ID NO：1的野生型参考序列或其片段相比，所述经密码子优化的核酸序列具有减少的CpG含量或减少的CpG岛。
56.如段落45-54中任一项所述的AAV载体，其中，所述编码I-1多肽的核酸序列是选自以下的任何一种的经密码子优化的核酸序列：SEQ ID NO：385-412，或与SEQ ID NO：385-412具有至少80％序列同一性的核酸序列。
57.如段落45-56中任一项所述的AAV载体，所述载体进一步包含位于编码磷酸酶抑制剂(I-1)多肽的核酸序列的5’的至少一个ITR，所述ITR可操作地连接至心脏特异性启动子或肌肉特异性启动子。
58.如段落45-57中任一项所述的AAV载体，所述载体进一步包含侧接于编码磷酸酶抑制剂(I-1)多肽的核酸序列的至少两个ITR，所述ITR可操作地连接至心脏特异性启动子或肌肉特异性启动子。
59.如段落45-58中任一项所述的AAV载体，其中，所述ITR序列选自以下的任何一个或多个：SEQ ID NO：70-78，或与SEQ ID NO：70-78具有至少85％序列同一性的核酸。
60.如段落45-59中任一项所述的AAV载体，所述载体进一步包含反向poly A序列或双链RNA终止元件，其中所述反向polyA序列或双链终止元件位于编码磷酸酶抑制剂(I-1)多肽的核酸序列的3’。
61.如段落60所述的AAV载体，其中，所述反向poly A序列或双链RNA终止元件位于编码磷酸酶抑制剂(I-1)多肽的核酸序列的3’和右侧ITR的5’之间。
62.如段落45-61中任一项所述的AAV载体，其中，所述核酸序列可进一步包含编码至少一种免疫调节剂的核酸序列。
63.如段落45-61中任一项所述的AAV载体，所述载体存在于组合物或溶液中，进一步包括免疫调节剂。
64.如段落45-63中任一项所述的AAV载体，所述载体进一步包含选自以下任一种的poly A序列：SV40 polyA(SEQ ID NO：334)、HGH poly A(SEQ ID NO：66)、SEQ ID NO：284-287、SEQ ID NO：331-335，其中，所述polyA序列位于编码磷酸酶抑制剂(I-1)多肽的核酸序列的3’。
65.一种药物组合物，所述药物组合物包含：(i)腺相关病毒(AAV)载体，所述载体包含(i)编码磷酸酶抑制剂(I-1)多肽的核酸序列，所述核酸序列可操作地连接至以下任何一个：(a)选自表2A的心脏特异性启动子或其变体、(b)在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子、或(c)当存在心脏组织特异性增强子时的任何启动子或其变体；以及(ii)药学上可接受的运载体。
66.如段落65所述的药物组合物，其中，在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子选自表5A或表13A、或与其具有至少85％序列同一性的变体。
67.如段落65-66中任一项所述的药物组合物，其中，所述AAV选自于由以下所组成的组：腺相关病毒-1(AAV1)、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAV2i8。
68.如段落65-67中任一项所述的药物组合物，其中，所述AAV包含非靶向肝脏的衣壳。
69.如段落65-68中任一项所述的药物组合物，其中，所述AAV是AAV2i8。
70.如段落65-69中任一项所述的药物组合物，其中，所述AAV包含选自于由以下所组成的组中的核酸：SEQ ID NO：413-440，或与选自SEQ ID NO：413-440的序列具有至少80％序列同一性的核酸序列；其中，以SEQ ID NO：413-440示出的核酸包含SEQ ID NO：330的CMV启动子，其中，所述SEQ ID NO：330的CMV启动子被以下的任一种取代：(a)选自表2A的心脏特异性启动子或与其具有至少85％序列同一性的变体，(b)在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子(例如，选自表5A或表13的在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子、或与其具有至少85％序列同一性的变体)，或(c)当存在心脏组织特异性增强子时的任何启动子、或其变体。
71.如段落64-69中任一项所述的药物组合物，所述组合物进一步包含血管扩张剂。
72.如段落64-69中任一项所述的药物组合物，所述组合物进一步包含免疫调节剂。
73.如段落65所述的药物组合物，其中，所述磷酸酶抑制剂(I-1)多肽是组成型活化的蛋白(I-1c)。
74.如段落73所述的药物组合物，其中，所述I-1c选自以下的任何一种：(a)包含至少SEQ ID NO：1的氨基酸残基1-65的多肽或其功能等同物；(b)包含至少SEQ ID NO：1的氨基酸1-54的多肽，其中所述多肽在C端的第70、67、66、65或61或54位氨基酸处截短，并且在第35位有天冬氨酸(T35D)；(c)包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65的多肽或其功能等同物，所述功能等同物与SEQ ID NO：1的氨基酸残基1-65具有至少85％的序列同一性，或者(d)选自以下任何一种的多肽：SEQ ID NO：507或527-532或其功能等同物，所述功能等同物与SEQID NO：507或527-532中任何一个的氨基酸残基具有至少85％的序列同一性。
75.如段落65-74中任一项所述的药物组合物，其中，所述编码I-1多肽的核酸序列选自：(a)编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65的多肽的核酸序列，其中SEQ ID NO：1第35位的苏氨酸(T)被替换为非T的氨基酸；(b)编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65的多肽的核酸序列，其中SEQ ID NO：1第35位的苏氨酸(T)被选自天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)中的任一氨基酸替换；(c)编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65的多肽的核酸序列，其中SEQ ID NO：1第35位的苏氨酸(T)被天冬氨酸(D)或天冬氨酸的保守氨基酸替换。
76.如段落65-745中任一项所述的药物组合物，其中，所述编码I-1蛋白的核酸序列是经密码子优化的核酸序列。
77.如段落76所述的药物组合物，其中，与参考野生型序列相比，所述经密码子优化的核酸序列具有减少的CpG含量。
78.如段落65-77中任一项所述的药物组合物，其中，所述编码I-1多肽的经密码子优化的核酸序列选自SEQ ID NO：385-412中的任何一个，或是与选自SEQ ID NO：385-412中的任何一个序列具有至少80％序列同一性的核酸序列。
79.如段落45-64中任一项所述的AAV载体用于制造治疗患有心肌病的受试者的药物组合物的用途。
80.如段落79所述的AAV载体的用途，其中，所述患有心肌病的受试者患有非缺血性心力衰竭和/或非缺血性心肌病。
81.如段落79-80中任一项所述的AAV载体的用途，其中，所述患有心肌病的受试者患有先天性心肌病或具有心脏表现的遗传性疾患。
82.如段落81所述的AAV载体的用途，其中，所述患有先天性心肌病或具有心脏表现的遗传性疾患的受试者具有选自于由以下所组成的组中的疾病或疾患：致心律失常性右心室心肌病、家族性心房粘液瘤、原发孔型房间隔缺损、静脉窦型房间隔缺损、巴氏综合征、肌营养不良症、Buerger病、心脑肌病、染色体1p36缺失综合征、先天性全身脂质营养不良4型、先天性心脏传导阻滞、扩张型心肌病、杜氏营养不良症(DMD)、Fabry病、家族性心房颤动、家族性扩张型心肌病、家族性肥厚型心肌病、家族性进行性心脏传导缺陷、家族性胸主动脉瘤和主动脉夹层、纤维肌发育不良、Friedreich共济失调、戈谢病、糖原贮积病(2、3或4型)、His束性心动过速、Hurler综合征、左心发育不良综合征、婴儿组织细胞样心肌病、颅内动静脉畸形、异丁酰-辅酶A脱氢酶缺乏症、激肽释放酶高血压、川崎病、Kearns-Sayre综合征、左心室致密化不全、肢带型肌营养不良症(1B、2E、2F、2M、2C、2D型)、局限性系统性硬化症、长QT综合征1、淋巴水肿和脑动静脉异常、淋巴细胞性血管炎、小头症-心肌病、线粒体脑肌病乳酸酸中毒和卒中样发作、线粒体三功能蛋白缺乏症、强直性肌营养不良症1型、新生儿卒中，Noonan综合征1-、2-、3-、4-、5-和6，围产期心肌病、Peters plus综合征、PGM1-CDG、PHACE综合征、受磷蛋白Arg 14缺失、体位性心动过速综合征、原发性肉碱缺乏症、进行性家族性心脏传导阻滞(1A、1B和2型)、假性醛固酮减少症2型、肺动脉高压、肺动脉闭锁伴完整室间隔、肺动脉闭锁伴室间隔缺损、肺动脉瓣狭窄、肺静脉狭窄、肺动脉狭窄、肾功能缺乏性高血压、视网膜动脉大动脉瘤伴肺动脉瓣上狭窄、右心室发育不全、结节病、Sengers综合征、内脏反位、突发性心律失常死亡综合征、主动脉瓣上狭窄、Swyer综合征、TANGO2相关代谢性脑病和心律不齐、TARP综合征、法洛四联症、Timothy综合征、三尖瓣闭锁、Vici综合征、VLCAD缺乏症和Williams综合征。
83.如段落79所述的AAV载体的用途，其中，所述患有心肌病的受试者患有缺血性心肌病。
84.如段落79所述的AAV载体的用途，其中，所述患有心肌病的受试者患有心力衰竭。
85.如段落84所述的AAV载体的用途，其中，所述患有心力衰竭的受试者具有基于以下所使用的分类系统的心力衰竭分类：美国心脏协会(AHA)、美国心脏病学会(ACC)或纽约心脏协会(NYHA)。
86.如段落85所述的AAV载体的用途，其中，所述患有心力衰竭的受试者在纽约心脏协会(NYHA)分类系统中的分级为III级或高于III级。
87.如段落45-64中任一项所述的AAV载体用于制造用来治疗患有与心力衰竭关联的病症或疾病的受试者的药物组合物的用途。
88.如段落87所述的用途，其中，所述受试者具有充血性心力衰竭(CHF)的分类。
89.如段落87所述的用途，其中，所述分类是基于以下所使用的分类系统：美国心脏协会(AHA)、美国心脏病学会(ACC)或纽约心脏协会(NYHA)。
90.如段落87所述的用途，其中，所述受试者患有非缺血性心力衰竭或非缺血性心肌病。
91.如段落87所述的用途，其中，所述受试者患有缺血性心力衰竭或缺血性心肌病。
92.如段落79或87所述的用途，其中，所述受试者具有降低的射血分数(rEF或HFrEF)。
93.一种细胞，所述细胞包含如段落45-64中任一项所述的AAV载体。
94.如段落93所述的细胞，其中，所述细胞是心脏细胞或肌肉细胞。
95.如段落93-94中任一项所述的细胞，其中，所述细胞处于细胞培养物中或者为存在于受试者中的细胞。
96.用于治疗患有心肌病的受试者的如段落45-64所述的AAV载体、如段落65-78中任一项所述的药物制剂、或者如段落93-95中任一项所述的细胞。
97.如段落96所述的AAV载体，其中，所述患有心肌病的受试者患有非缺血性心力衰竭和/或非缺血性心肌病。
98.如段落96所述的AAV载体，其中，所述患有心肌病的受试者患有先天性心肌病或具有心脏表现的遗传性疾患。
99.如段落98所述的AAV载体，其中，所述患有先天性心肌病或具有心脏表现的遗传性疾患的受试者具有选自于由以下所组成的组中的疾病或疾患：致心律失常性右心室心肌病、家族性心房粘液瘤、原发孔型房间隔缺损、静脉窦型房间隔缺损、巴氏综合征、肌营养不良症、Buerger病、心脑肌病、染色体1p36缺失综合征、先天性全身脂质营养不良4型、先天性心脏传导阻滞、扩张型心肌病、杜氏营养不良症(DMD)、Fabry病、家族性心房颤动、家族性扩张型心肌病、家族性肥厚型心肌病、家族性进行性心脏传导缺陷、家族性胸主动脉瘤和主动脉夹层、纤维肌发育不良、Friedreich共济失调、戈谢病、糖原贮积病(2、3或4型)、His束性心动过速、Hurler综合征、左心发育不良综合征、婴儿组织细胞样心肌病、颅内动静脉畸形、异丁酰-辅酶A脱氢酶缺乏症、激肽释放酶高血压、川崎病、Kearns-Sayre综合征、左心室致密化不全、肢带型肌营养不良症(1B、2E、2F、2M、2C、2D型)、局限性系统性硬化症、长QT综合征1、淋巴水肿和脑动静脉异常、淋巴细胞性血管炎、小头症-心肌病、线粒体脑肌病乳酸酸中毒和卒中样发作、线粒体三功能蛋白缺乏症、强直性肌营养不良症1型、新生儿卒中，Noonan综合征1-、2-、3-、4-、5-和6，围产期心肌病、Peters plus综合征、PGM1-CDG、PHACE综合征、受磷蛋白Arg 14缺失、体位性心动过速综合征、原发性肉碱缺乏症、进行性家族性心脏传导阻滞(1A、1B和2型)、假性醛固酮减少症2型、肺动脉高压、肺动脉闭锁伴完整室间隔、肺动脉闭锁伴室间隔缺损、肺动脉瓣狭窄、肺静脉狭窄、肺动脉狭窄、肾功能缺乏性高血压、视网膜动脉大动脉瘤伴肺动脉瓣上狭窄、右心室发育不全、结节病、Sengers综合征、内脏反位、突发性心律失常死亡综合征、主动脉瓣上狭窄、Swyer综合征、TANGO2相关代谢性脑病和心律不齐、TARP综合征、法洛四联症、Timothy综合征、三尖瓣闭锁、Vici综合征、VLCAD缺乏症和Williams综合征。
100.如段落96所述的AAV载体，其中，所述患有心肌病的受试者患有缺血性心肌病。
101.如段落96所述的AAV载体，其中，所述患有心肌病的受试者患有心力衰竭。
102.如段落101所述的AAV载体，其中，所述患有心力衰竭的受试者具有基于以下所使用的分类系统的心力衰竭分类：美国心脏协会(AHA)、美国心脏病学会(ACC)或纽约心脏协会(NYHA)。
103.如段落102所述的AAV载体，其中，所述患有心力衰竭的受试者在纽约心脏协会(NYHA)分类系统中的分级为III级或高于III级。
104.用于治疗患有心力衰竭的患者的如段落45-64所述的AAV载体、如段落65-78中任一项所述的药物制剂、或者如段落93-95中任一项所述的细胞。
105.如段落104所述的AAV载体，其中，所述受试者具有充血性心力衰竭(CHF)的分类。
106.如段落105所述的AAV载体，其中，所述分类是基于以下所使用的分类系统：美国心脏协会(AHA)、美国心脏病学会(ACC)或纽约心脏协会(NYHA)。
107.如段落104所述的AAV载体，其中，所述受试者患有非缺血性心力衰竭或非缺血性心肌病。
108.如段落104所述的AAV载体，其中，所述受试者患有缺血性心力衰竭或缺血性心肌病。
109.如段落96或104所述的AAV载体，其中，所述受试者具有降低的射血分数(rEF或HFrEF)。
110.如段落104所述的AAV载体，其中，所述患有心力衰竭的受试者患有心血管疾病或心脏疾病，所述疾病选自以下的任何一种：充血性心力衰竭(CHF)、左心室重构、外周动脉闭塞性疾病(PAOD)、扩张型心肌病(DCM)(包括特发性扩张型心肌病(IDCM))、冠状动脉疾病、缺血、心律不齐、心肌梗塞(MI)、心脏收缩力异常、急性(失代偿性)心力衰竭(AHF)、Ca2+代谢异常、心肌缺血、动脉粥样硬化、心肌病、特发性心肌病、遗传性疾患诱发的心肌病、心律失常、肌营养不良症、肌肉质量异常、肌肉退化、感染性心肌炎、药物或毒素诱发的肌肉异常、过敏性心肌炎、自身免疫性心内膜炎和先天性心脏疾病以及肺心病高血压。
111.如段落104所述的AAV载体，其中，所述受试者具有以下的一项或多项：(a)非缺血性心力衰竭；(b)非缺血性心肌病；(c)充血性心力衰竭(CHF)的分类，所述分类基于以下所使用的分类系统：美国心脏协会(AH)、美国心脏病学会(ACC)或纽约心脏协会(NYHA)或其等同的分类系统；或(d)降低的射血分数(rEF或HFrEF)。
112.一种在患有心肌病的受试者中表达磷酸酶抑制剂(I-1)多肽的方法，所述方法包括将至少一个剂量的如段落45-63中任一项所述的AAV载体引入患有心肌病的受试者中，其中，所述患有心肌病的受试者具有心力衰竭的分类，其中，所述rAAV的至少一个剂量选自约1013vg至约1015vg的总剂量范围，并且其中，在施用后至少12个月，所述心力衰竭的分类有改善。
113.如段落112所述的方法，其中，所述心力衰竭的分类基于以下所使用的分类系统：美国心脏协会(AH)、美国心脏病学会(ACC)或纽约心脏协会(NYHA)、或其等同的分类系统。
114.如段落112所述的方法，其中，在施用rAAV后12个月，分类具有至少一个等级的改善。
115.如段落112所述的方法，其中，在施用rAAV后6个月内，分类具有至少一个等级的改善。
116.如段落112所述的方法，其中，施用后12个月，在以下的任何一个或多个中的分类具有至少2个等级的改善：美国心脏协会(AH)、美国心脏病学会(ACC)、或纽约心脏协会(NYHA)、或其等同的分类系统。
117.如段落112-116中任一项所述的方法，所述方法进一步包含在施用所述至少一个总剂量的rAAV载体的同时、或之前、或之后，施用免疫调节剂。
118.如段落112-116中任一项所述的方法，所述方法进一步包含在施用所述至少一个总剂量的rAAV载体的同时、和/或之前、和/或之后，施用血管扩张剂。
119.如段落112-118中任一项所述的方法，其中，所述受试者患有非缺血性心力衰竭或非缺血性心肌病。
120.如段落112-119中任一项所述的方法，其中，所述患有非缺血性心力衰竭或非缺血性心肌病的受试者患有先天性心肌病或具有心脏表现的遗传性疾患。
121.如段落120所述的方法，其中，所述患有先天性心肌病或具有心脏表现的遗传性疾患的受试者具有选自于由以下所组成的组中的疾病或疾患：致心律失常性右心室心肌病、家族性心房粘液瘤、原发孔型房间隔缺损、静脉窦型房间隔缺损、巴氏综合征、肌营养不良症、Buerger病、心脑肌病、染色体1p36缺失综合征、先天性全身脂质营养不良4型、先天性心脏传导阻滞、扩张型心肌病、杜氏营养不良症(DMD)、Fabry病、家族性心房颤动、家族性扩张型心肌病、家族性肥厚型心肌病、家族性进行性心脏传导缺陷、家族性胸主动脉瘤和主动脉夹层、纤维肌发育不良、Friedreich共济失调、戈谢病、糖原贮积病(2、3或4型)、His束性心动过速、Hurler综合征、左心发育不良综合征、婴儿组织细胞样心肌病、颅内动静脉畸形、异丁酰-辅酶A脱氢酶缺乏症、激肽释放酶高血压、川崎病、Kearns-Sayre综合征、左心室致密化不全、肢带型肌营养不良症(1B、2E、2F、2M、2C、2D型)、局限性系统性硬化症、长QT综合征1、淋巴水肿和脑动静脉异常、淋巴细胞性血管炎、小头症-心肌病、线粒体脑肌病乳酸酸中毒和卒中样发作、线粒体三功能蛋白缺乏症、强直性肌营养不良症1型、新生儿卒中，Noonan综合征1-、2-、3-、4-、5-和6，围产期心肌病、Peters plus综合征、PGM1-CDG、PHACE综合征、受磷蛋白Arg 14缺失、体位性心动过速综合征、原发性肉碱缺乏症、进行性家族性心脏传导阻滞(1A、1B和2型)、假性醛固酮减少症2型、肺动脉高压、肺动脉闭锁伴完整室间隔、肺动脉闭锁伴室间隔缺损、肺动脉瓣狭窄、肺静脉狭窄、肺动脉狭窄、肾功能缺乏性高血压、视网膜动脉大动脉瘤伴肺动脉瓣上狭窄、右心室发育不全、结节病、Sengers综合征、内脏反位、突发性心律失常死亡综合征、主动脉瓣上狭窄、Swyer综合征、TANGO2相关代谢性脑病和心律不齐、TARP综合征、法洛四联症、Timothy综合征、三尖瓣闭锁、Vici综合征、VLCAD缺乏症和Williams综合征。
122.如段落111-117中任一项所述的方法，其中，所述患有心力衰竭的受试者患有缺血性心肌病。
123.如段落111-120中任一项所述的方法，其中，所述患有心力衰竭的受试者具有心血管疾病或心脏疾病，所述疾病选自以下的任何一种：充血性心力衰竭(CHF)、左心室重构、外周动脉闭塞性疾病(PAOD)、扩张型心肌病(DCM)(包括特发性扩张型心肌病(IDCM))、冠状动脉疾病、缺血、心律不齐、心肌梗塞(MI)、心脏收缩力异常、急性(失代偿性)心力衰竭(AHF)、Ca2+代谢异常、心肌缺血、动脉粥样硬化、心肌病、特发性心肌病、遗传性疾患诱发的心肌病、心律失常、肌营养不良症、肌肉质量异常、肌肉退化、感染性心肌炎、药物或毒素诱发的肌肉异常、过敏性心肌炎、自身免疫性心内膜炎和先天性心脏疾病以及肺心病高血压。
124.如段落111-122中任一项所述的方法，其中，所述受试者具有降低的射血分数(rEF或HFrEF)。
125.如段落111-123中任一项所述的方法，其中，所述心力衰竭包括缺血、心律不齐、心肌梗塞、心脏收缩力异常或Ca2+代谢异常。
126.如段落111-124中任一项所述的方法，其中，所述施用是进入患者心脏的冠状动脉的腔内。
127.如段落111-125中任一项所述的方法，其中，所述至少一个剂量为约1013vg至约1015vg的总剂量范围，以一个剂量或2至5个子剂量施用。
128.如段落111-126中任一项所述的方法，其中，所述总剂量以如下的施用方法中的任何一种施用：(a)在约20分钟至约30分钟的时间段内；(b)以一系列子剂量施用，其中，每个子剂量在约1分钟至约5分钟的时间段内施用；(c)以一系列的五个子剂量施用，每个子剂量在约1分钟至约5分钟的时间段内施用，并且其中，所述五个子剂量在约20分钟至约30分钟的时间段内施用。
定义和一般要点
虽然下面详细讨论了本发明的各种实施方式的完成和使用，但应该理解的是，本发明提供了许多可应用的发明构思，这些构思可以在各种各样的特定上下文中体现。本文所讨论的具体实施方式仅说明完成和使用本发明的具体方法，并不限定本发明的范围。
为了便于理解本发明，下面定义了一些术语。本文定义的术语具有与本发明相关的领域的普通技术人员通常理解的含义。诸如“一、一个、一种、该(“a”、“an”和“the”)之类的术语并不旨在仅仅指代单一实体，而是包括可以使用用于说明的特定实例的一般类别。本文的术语用于描述本发明的具体实施方式，但它们的用法并不限定本发明，除非在权利要求中概述。
本文包括对本发明背景的讨论，以便解释本发明的上下文。这不应被视为承认所提及的任何材料在任何权利要求的优先权日时已在任何国家出版、为人所知或作为公知常识的一部分。
在整个本公开内容中，通过识别引用提及了各种出版物、专利和公开的专利申请文件。在本申请文件中引用的所有文件均通过引用的方式将它们以其整体并入本文。特别地，本文特别提及的这些文件的教导或章节通过引用的方式并入。
除非另有说明，本发明的实践将采用本领域的技术范围内的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术。这些技术在文献中有充分的解释。参见例如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel，2000，Wiley and son Inc，Library of Congress，美国)；Molecular Cloning:A LaboratoryManual，第三版，(Sambrook等，2001，冷泉港，纽约：冷泉港实验室出版社)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑，1984)；美国专利号4,683,195；Nucleic AcidHybridization(Harries和Higgins编辑，1984)；Transcription and Translation(Hames和Higgins编辑，1984年)；Culture of Animal Cells(Freshney，Alan R.Liss,Inc.，1987)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL出版社，1986)；Perbal，A Practical Guideto Molecular Cloning(1984)；the series,Methods in Enzymology(Abelson和Simon主编，Academic Press,Inc.，纽约)，特别是，第154和155卷(Wu等编辑)和第185卷，“GeneExpression Technology”(Goeddel编辑)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(Miller和Calos编辑，1987，冷泉港实验室)；Immunochemical Methods in Cell andMolecular Biology(Mayer和Walker编辑，Academic Press，伦敦，1987)；Handbook ofExperimental Immunology，第I-IV卷(Weir和Blackwell编辑，1986)；和Manipulating theMouse Embryo，(冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1986)。
术语“肌肉”为技术人员所熟知。优选地，肌肉是骨骼肌(包括膈)或心肌。本发明的启动子可以在骨骼肌和/或心肌中活化。优选地，肌肉是脊椎动物的肌肉，更优选哺乳动物的肌肉，甚至更优选人类受试者的肌肉。优选地，肌肉是横纹肌。
在一些情况下，启动子是心脏特异性的。如本文所使用的，心脏特异性意指启动子对心脏组织具有偏好。只要对心脏细胞或心肌细胞有总体偏好，这种启动子也可以在其他组织中表达，包括其他肌肉。
目前，术语“肌肉细胞”或“肌细胞”是指在肌肉(肌肉组织)中发现的或源自肌肉组织的细胞。肌肉细胞可以是原代细胞或细胞系(例如C2C12或H2K细胞(骨骼肌细胞系)或H9C2细胞(心脏细胞系))。肌肉细胞可以在体内(例如在肌肉组织中)或在体外(例如在细胞培养物中)。在肌肉组织中发现的肌细胞通常是长的管状细胞，所述长的管状细胞在被称为肌生成的过程中从成肌细胞发育以形成肌肉。本文所使用的术语肌肉细胞或肌细胞包括来自骨骼肌和来自心肌的肌细胞(心肌细胞)。本文公开的启动子可以在骨骼肌细胞和/或心肌细胞中活化。
术语“顺式调控元件”或“CRE”是为技术人员熟知的术语，并且意指能够调节或调控相邻基因(即处于顺式)的转录的核酸序列(例如增强子、启动子、绝缘子或沉默子)。CRE见于它们调节的基因附近。CRE通常通过与TF结合来调节基因转录，即，它们包含TFBS。单个TF可与许多CRE结合，并从而控制许多基因的表达(多效性)。CRE通常但不总是位于它们调节的基因的转录起始位点(TSS)的上游。在该上下文中，“增强子”是增强(即上调)与它们可操作地连接的基因的转录的CRE，并且可见于它们调节的基因的上游、下游以及甚至内含子中。多个增强子可以以协调的方式起作用来调节一个基因的转录。在这种情况下，“沉默子”是指与被称为阻遏物的TF结合的CRE，阻遏物发挥作用来阻止或下调基因的转录。术语“沉默子”也可以指信使RNA的3′非翻译区中的区域，其结合阻遏该mRNA分子翻译的蛋白质，但这种用法不同于其在描述CRE中的用途。通常，本发明的CRE是肌肉特异性、心肌特异性或骨骼肌特异性增强元件(通常被称为肌肉特异性、心肌特异性或骨骼肌特异性CRE，或肌肉特异性、心肌特异性或骨骼肌特异性CRE增强子等)。在该上下文中，优选CRE位于距离转录起始位点(TSS)2500个核苷酸或更少，更优选地距离TSS 2000个核苷酸或更少，更优选地距离TSS 1500个核苷酸或更少，并且合适地距离TSS 1000个、750个、500个、250个、200个、150个或100个核苷酸或更少。本发明的CRE优选地长度相对较短，优选长度为500个核苷酸以下，例如它们长度可为400个、300个、200个、175个、150个、90个、80个、70个、60个或50个核苷酸以下。本发明的CRE通常与可操作地连接的启动子元件联合提供，所述启动子元件可以是最小启动子或近端启动子；本发明的CRE增强启动子元件的肌肉特异性、心肌特异性或骨骼肌特异性活性。在本文公开的CRE或其功能变体的任意组合中，所列举的CRE和启动子元件的部分或全部可以适当地位于启动子中彼此相邻的位置(即没有任何间插的CRE或其他调控元件)。CRE可以是连续的或不连续的(即它们可以位于彼此紧邻的位置或者它们可以被间隔区或其它序列隔开)。CRE可以处于任意顺序。在一些优选的实施方式中，CRE或其功能变体按所列举的顺序提供并彼此相邻。例如，合成的肌肉特异性调节核酸可以包含紧邻CRE0033上游的CRE0107等等。在一些实施方式中，优选部分或全部CRE是连续的。
术语“顺式调控元件”或“CRM”意指通常包含两个以上的CRE的功能性调节核酸模块；在本发明中，CRE通常是心脏特异性增强子，例如心肌特异性或骨骼肌特异性增强子，并因此，CRM是合成的心脏特异性调节核酸。CRM可以包含多个心脏特异性CRE。适当地，CRM中包含的CRE中的至少一个是根据SEQ ID NO：19-24、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28或其功能变体的CRE。通常，CRM内的多个CRE共同地(例如相加地或协同地)起作用以增强与包含CRM的启动子可操作地关联的基因的转录。CRM内的CRE的改组(shuffle)(即重新排序)、倒位(即反向取向)和改变间距存在相当大的范围。因此，本发明的CRM的功能变体除其他外，包括参考的CRM的变体，其中它们内的CRE已经被打改组和/或倒位，和/或CRE之间的间距已经改变。在串联启动子的情况下，CRM可用于描述启动子元件和一个或多个的可操作地连接至进一步的启动子元件的CRE的联合。例如，在串联启动子SP0268中，CRE CRE0035和启动子元件CRE0010的联合可被视为CRM。
如本文所使用的，短语“启动子”是指通常位于发生转录所需的待转录核酸序列上游的DNA区域，即所述DNA区域起始转录。启动子允许在其控制下的恰当激活或抑制编码序列的转录。启动子通常包含被多个TF识别和结合的特定序列。TF结合至启动子序列并引起RNA聚合酶的募集，所述RNA聚合酶是从基因的编码区合成RNA的酶。本领域已知许多不同的启动子。在一些情况下，术语“启动子”或“复合启动子”在本文中用于指启动子和额外调控元件(例如紧邻于转录起始位点(TSS)的下游的调节序列，例如5′UTR和/或5′UTR和内含子)的联合。TSS下游的此类序列可有助于在转录和/或翻译阶段调节表达。在一些情况下，术语“启动子”或“复合启动子”在本文中用于指如本文别处定义的“串联启动子”。
如本文所使用的，术语“合成的启动子”是指自然界中不存在的启动子。在该上下文中，它通常包含可操作地连接至最小(或核心)启动子或心脏特异性近端启动子(启动子元件)的本发明的CRE和/或CRM。本发明的CRE和/或CRM用于增强与合成的启动子可操作地连接的基因的心脏特异性转录。合成的启动子的部分可以是天然存在的(例如最小启动子或启动子中的一个或多个CRE)，但作为实体的合成的启动子不是天然存在的。或者，合成的启动子可以是自然界中存在的启动子的较短的截短版本。
如本文所使用的，“最小启动子”(也称为“核心启动子”)是指自身无活性或很大程度上无活性，但在与其它转录调控元件组合时可以介导转录的典型的短DNA区段。最小启动子序列可以源自各种不同的来源，包括原核基因和真核基因。最小启动子的实例包括多巴胺β-羟化酶基因最小启动子、巨细胞病毒(CMV)即刻早期基因最小启动子(CMV-MP)和疱疹胸苷激酶最小启动子(MinTK)。最小启动子通常包含转录起始位点(TSS)和直接在上游的元件、RNA聚合酶II的结合位点和一般转录因子结合位点(通常是TATA盒)。最小启动子还可以包括TSS下游的一些元件，但这些元件在不存在额外调控元件的情况下通常几乎没有功能。
如本文所使用的，“近端启动子”是指最小启动子加上至少一些额外的调节序列，通常趋向于包含主要调控元件的基因上游的近端序列。它通常在TSS的上游延伸大约250个碱基对，并包含特定的TFBS。近端启动子还可以包括TSS下游的一个或多个调控元件，例如UTR或内含子。在本案中，近端启动子可以适当地是天然存在的心脏特异性近端启动子的较短的截短版本。本发明的近端启动子可以与本发明的一种或多种CRE或CRM组合。然而，近端启动子也可以是合成的。
如本文所使用的，“启动子元件”是指如上所定义的最小启动子或近端启动子。在本发明的上下文中，启动子元件可以与一个或多个CRE组合以提供本发明的合成的心脏特异性启动子。
在本发明的上下文中，CRE、CRM、启动子元件、启动子或其它调节核酸的“功能变体”是参考序列的变体，该变体保留了以与参考序列相同的方式(例如作为心脏特异性CRE、心脏特异性CRM或心脏特异性启动子)发挥功能的能力。此类功能变体的替代术语包括“生物等同物”或“等同物”。
将理解的是，给定的CRE、CRM、启动子或其它调节序列作为心脏特异性增强子发挥功能的能力很大程度上由序列结合至与参考序列结合的相同的心脏特异性TF的能力确定。因此，在大多数情况下，CRE或CRM的功能变体将包含与参考CRE、CRM或启动子的大部分或全部相同的TF的TFBS。优选但非必需的，功能变体的TFBS与参考CRE、CRM或启动子处于相同的相对位置(即顺序和一般位置)。也优选但非必需的，功能变体的TFBS与参考序列的方向相同(将注意的是，TFBS在某些情况下可以以相反的方向存在，例如作为相对于参考序列中的序列的反向互补体)。也优选但非必需的，功能变体的TFBS与参考序列位于相同的链上。因此，在优选的实施方式中，功能变体包含以相同的顺序、相同的位置、相同的方向和位于与参考序列相同的链上的用于相同TF的TFBS。还将理解的是，位于TFBS之间的序列(在某些情况下称为间隔区序列等)对CRE或CRM的功能影响较小。此类序列通常可以有相当大的不同，并且它们的长度可以改变。然而，在优选的实施方式中，间距(即相邻TFBS之间的距离)在功能变体中与它在参考序列中基本相同(例如，其差异不超过20％，优选不超过10％，且更优选大致相同)。明显的是，在某些情况下，CRE的功能变体可以以相反的方向存在，例如它可以是如上所述的CRE的反向互补体、或其变体。
功能变体和参考序列之间的序列同一性水平也可以是指示物或保留的功能。CRE、CRM或启动子的TFBS中的高水平的序列同一性通常比间隔区序列(其中很少或不需要序列的任何保守性)中的序列同一性更重要。然而，将理解的是，考虑到功能性TFBS的序列不需要与共有序列完全匹配，即使在TFBS内，也可以容许相当程度的序列变异。
一种或多种TF结合至给定功能变体中的TFBS的能力可以通过本领域已知的任何相关手段来确定，包括但不限于电泳迁移测定(EMSA)、结合测定、染色质免疫沉淀(ChIP)和ChIP测序(ChIP-seq)。在优选的实施方式中，一种或多种TF结合给定的功能变体的能力由EMSA确定。进行EMSA的方法在本领域中是众所周知的。上文引用的Sambrook等中描述了合适的方法。描述此过程的许多相关文章都可用，例如Hellman和Fried，Nat Protoc.2007；2(8):1849-1861。
“肌肉特异性”或“肌肉特异性表达”是指与其它组织(例如脾脏、肝、肺和脑)相比，顺式调控元件、顺式调控模块或启动子增强或驱动基因在肌肉中(或在源自肌肉的细胞中)以优先或主导的方式表达的能力。所述基因的表达可以处于mRNA或蛋白质的形式。在优选的实施方式中，肌肉特异性表达使得在其它(即非肌肉)组织或细胞中的表达可忽略不计，即表达是高度肌肉特异性的。
“心肌特异性”或“心肌特异性表达”是指与其它组织(例如脾脏、肝、肺和脑)相比以及与骨骼肌组织相比，顺式调控元件、顺式调控模块或启动子增强或驱动基因在心肌中以优先或主导的方式表达的能力。可以鉴别心脏特异性，其中的基因(例如治疗性或报告基因)的表达优先或主要发生在肌肉细胞中，包括心脏中的平滑肌细胞以及心肌细胞。可以定义优先或主要的表达，例如，其中源自心脏的细胞中的表达水平显著高于在其它类型的细胞(即非心脏来源的细胞)中的表达水平。例如，源自心脏的细胞中的表达适当地比非心脏细胞高至少5倍，优选比非心脏细胞高至少10倍，并且在一些情况下它可以高50倍或更多。为方便起见，可以通过比较肝肌肉细胞系(例如源自肌肉的细胞系，如C2C12或H2K细胞(骨骼肌)或H9C2细胞(心脏))中的表达水平相较于源自肝脏的细胞系(例如Huh7或HepG2)、源自肾脏的细胞系(例如HEK-293)、源自宫颈组织的细胞系(例如HeLa)和/或源自肺的细胞系(例如A549)的表达水平，来适当地证实肌肉特异性的表达。可以通过比较心肌细胞系(例如源自心肌的细胞系，如H9C2)或原代心肌细胞中的表达水平相较于源自肝脏的细胞系(例如Huh7或HepG2)、源自肾脏的细胞系(例如HEK-293)、源自宫颈组织的细胞系(例如HeLa)、源自肺的细胞系(例如A549)和/或源自骨骼肌的细胞(例如C2C12或H2K)的表达水平，来适当地证实心肌特异性的表达。可以通过比较源自骨骼肌的细胞(例如C2C12或H2K)或原代骨骼肌细胞中的表达水平相较于源自肝脏的细胞系(例如Huh7或HepG2)、源自肾脏的细胞系(例如HEK-293)、源自宫颈组织的细胞系(例如HeLa)、源自肺的细胞系(例如A549)和/或心肌细胞系(例如H9C2)的表达水平，来适当地证实骨骼肌特异性的表达。
当与非组织特异性启动子(如CMV-IE)相比时，本发明的合成的肌肉特异性、心肌特异性或骨骼肌特异性启动子优选地在非源自肌肉的细胞中，适当地在Huh7、HEK-293、HeLa和/或A549细胞中表现出降低的表达。本发明的合成的肌肉特异性、心肌特异性或骨骼肌特异性启动子在非源自肌肉的细胞(适当地在Huh7、HEK-293、HeLa和/或A549细胞)中优选地相对于CMV-IE启动子具有50％以下的活性，适当地为25％以下、20％以下、15％以下、10％以下、5％以下或1％以下。通常，优选将非源自肌肉的细胞中的表达最小化，但在某些情况下，这可能不是必需的。即使本发明的合成的启动子在例如一个或两个非肌肉细胞中具有更高的表达，只要它通常在一系列肌肉细胞中相对于非肌肉细胞大体上具有更高的表达，它仍然可以是肌肉特异性启动子。在一些实施方式中，肌肉特异性启动子在肌肉细胞中表达的基因比非肌肉细胞高至少25％、或至少35％、或至少45％、或至少55％、或至少65％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或介于25％-95％之间的任意整数。
本发明的合成的肌肉特异性启动子优选地适用于促进受试者肌肉中的表达，例如驱动转基因的肌肉特异性表达，优选治疗性转基因。本发明的合成的心肌特异性启动子优选地适用于促进受试者心脏中的表达，例如驱动转基因(优选治疗性转基因)的心肌特异性表达。本发明的合成的骨骼肌特异性启动子优选地适用于促进受试者骨骼肌中的表达，例如驱动转基因(优选治疗性转基因)的骨骼肌特异性表达。本发明优选的合成的肌肉特异性启动子适用于促进肌肉特异性转基因表达并且在肌肉细胞中具有CBA启动子的活性的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％或400％的活性。在一些实施方式中，本发明的合成的肌肉特异性启动子适用于以CBA启动子活性的至少100％(优选CBA或spc5-12启动子活性的150％、200％、300％或500％)的水平促进肌肉特异性转基因表达。在一些实施方式中，本发明的合成的心肌特异性启动子适用于以Tnnt2或Myl2启动子活性的至少100％(优选Tnnt2或Myl2启动子活性的150％、200％、300％或500％)的水平促进心肌特异性转基因表达。在一些实施方式中，本发明的合成的骨骼肌特异性启动子适用于以Tnnt2或Myl2启动子活性的至少100％(优选spc5-12启动子活性的150％、200％、300％或500％)的水平促进骨骼肌特异性转基因表达。这种肌肉特异性表达在源自肌肉的细胞(例如作为C2C12或H2K细胞(骨骼肌)或H9C2细胞(心脏)或原代肌细胞(适当的原代人肌细胞))中适当地确定。
与源自肌肉的细胞(例如c2c12或H2K细胞(骨骼肌)或h9C2细胞(心脏))中的CMV-IE相比，本发明的合成的肌肉特异性、心肌特异性或骨骼肌特异性启动子也可能能够以至少50％、100％、150％或200％的水平促进基因的肌肉特异性、心肌特异性或骨骼肌特异性表达。
“增强子元件”意指如下的核酸序列：当将其放置在启动子附近时，相对于在增强子结构域不存在的情况下从启动子获得的转录活性，该序列赋予转录活性增加。因此，“增强子”包括促进可操作地连接的基因或编码序列的转录的多核苷酸序列。许多来自各种不同来源的增强子在本领域中是众所周知的。一些具有启动子序列的多核苷酸(如常用的CMV启动子)也具有增强子序列。
技术人员可以容易地评估CRE、CRM或启动子作为心脏特异性CRE、CRM或启动子发挥功能的能力。因此，技术人员可以容易地确定以上列举的特异性CRE、CRM或启动子的任何变体是否保持功能(即，它是如上定义的功能变体)。例如，待评估的任何给定的CRM可以可操作地连接至最小启动子(例如，位于CMV-MP上游)并且测量了顺式调控元件驱动基因(通常是报告基因)的心脏特异性表达的能力。或者，可以将CRE或CRM的变体置换入合成的心脏特异性启动子来取代参考CRE或CRM，并且可以确定由所述经修饰的启动子驱动的对心脏特异性表达的作用并与未经修饰的形式经比较。类似地，技术人员可以容易地评估启动子驱动心脏特异性表达的能力(例如，如以下实例中所述)。可以将由参考启动子的变体驱动的基因的表达水平与由参考启动子驱动的表达水平进行比较。在一些实施方式中，当由变体启动子驱动的心脏特异性表达水平是由参考启动子驱动的表达水平的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％时，可以说所述变体保持了功能。可以容易地构建用于评估心脏特异性表达增强的合适的核酸构建体和报告基因测定，并且下面列出的实例给出了合适的方法。
技术人员可以容易地评估CRE、CRM或启动子作为肌肉特异性或心肌特异性CRE、CRM或启动子发挥功能的能力。因此，技术人员可以容易地确定以上列举的特异性CRE、CRM或启动子的任何变体是否保持功能(即，它是如上定义的功能变体)。例如，待评估的任何给定的CRM可以可操作地连接至最小启动子(例如，位于CMV-MP上游)并且测量了顺式调控元件驱动基因(通常是报告基因)的肌肉特异性或心肌特异性表达的能力。或者，可以将CRE的变体置换入合成的心肌特异性启动子来取代参考CRE，并且可以确定由所述经修饰的启动子驱动的对心肌特异性表达的作用并与未经修饰的形式进行比较。类似地，技术人员可以容易地评估CRM或启动子驱动肌肉特异性或心肌特异性表达的能力(例如，如以下实例中所述)。可以将由参考启动子的变体驱动的基因的表达水平与由参考序列驱动的表达水平进行比较。在一些实施方式中，当由变体启动子驱动的心肌特异性表达水平是由参考启动子驱动的表达水平的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％时，可以说所述变体保持了功能。可以容易地构建用于评估肌肉或心肌特异性表达增强的合适的核酸构建体和报告基因测定。
可以鉴别肌肉特异性或心肌特异性，其中的基因(例如治疗性或报告基因)的表达优先或主要发生在源自肌肉的细胞或源自心肌的细胞中。可以定义优先或主要的表达，例如，其中源自肌肉或源自心肌的细胞中的表达水平显著高于在其它类型的细胞(即非肌肉来源或非心肌来源的细胞)中的表达水平。例如，源自肌肉或源自心肌的细胞中的表达适当地比非肌肉细胞高至少5倍，优选比非肌肉细胞高至少10倍，并且在一些情况下它可以高50倍或更多。为方便起见，可以通过比较心肌细胞系(例如源自心肌的细胞系，如H9C2)或原代心肌细胞中的表达水平相较于源自肝脏的细胞系(例如Huh7或HepG2)、源自肾脏的细胞系(例如HEK-293)、源自宫颈组织的细胞系(例如HeLa)和/或源自肺的细胞系(例如A549)的表达水平，来适当地证实心肌特异性的表达。可以通过比较心肌细胞系(例如源自心肌的细胞系，如H9C2)或原代心肌细胞中的表达水平相较于源自肝脏的细胞系(例如Huh7或HepG2)、源自肾脏的细胞系(例如HEK-293)、源自宫颈组织的细胞系(例如HeLa)、源自肺的细胞系(例如A549)和/或源自骨骼肌的细胞系(例如C2C12或H2K)的表达水平，来适当地证实心肌特异性的表达。可以通过比较源自骨骼肌的细胞(例如C2C12或H2K)或原代骨骼肌细胞中的表达水平相较于源自肝脏的细胞系(例如Huh7或HepG2)、源自肾脏的细胞系(例如HEK-293)、源自宫颈组织的细胞系(例如HeLa)、源自肺的细胞系(例如A549)和/或心肌细胞系(例如H9C2)的表达水平，来适当地证实骨骼肌特异性的表达。
当与非组织特异性启动子(如CMV-IE)相比时，本发明的合成的心肌特异性启动子优选地在非肌肉来源的细胞中，适当地在Huh7、HEK-293、HeLa和/或A549细胞中表现出降低的表达。本发明的合成的心肌特异性启动子在非肌肉来源的细胞(适当地在HEK-293、HeLa和/或A549细胞)中优选地相对于CMV-IE启动子具有50％以下的活性，适当地为25％以下、20％以下、15％以下、10％以下、5％以下或1％以下。通常，优选将非肌肉来源的细胞中的表达zuixiaohua，但在一些情况下，这可能不是必需的。在一些实施方式中，本发明的合成的心肌特异性启动子适用于在非肝脏来源的细胞(例如HEK-293、HeLa和/或A549细胞)中以比起LP1或CMV-IE启动子的50％以下的水平促进基因表达。即使本发明的合成的启动子在例如一个或两个非心肌细胞中具有更高的表达，只要它通常在一系列心肌细胞中相对于非心肌细胞大体上具有更高的表达，它仍然可以被认为是心肌特异性启动子。
本发明的合成的心肌特异性启动子优选地适用于促进受试者心脏中的表达，例如驱动转基因(优选治疗性转基因)的心肌特异性表达。本发明的合成的心肌特异性启动子优选地适用于促进受试者心脏中的表达，例如驱动转基因(优选治疗性转基因)的心肌特异性表达。本发明的合成的骨骼肌特异性启动子优选地适用于促进受试者骨骼肌中的表达，例如驱动转基因(优选治疗性转基因)的骨骼肌特异性表达。本发明优选的合成的心肌特异性启动子适用于促进心肌特异性转基因表达并且在心肌细胞中具有CBA启动子或spc5-12启动子的活性的至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％或400％的活性。在一些实施方式中，本发明的合成的心肌特异性启动子适用于以CBA、Tnnt2、Myl2或spc5-12启动子活性的至少50％(优选CBA、Tnnt2、Myl2或spc5-12启动子活性的100％、150％、200％、300％或500％)的水平促进心肌特异性转基因表达。这种心肌特异性表达在源自心肌的细胞(例如H9C2细胞或原代心肌细胞(适当的原代人心肌细胞))中适当地确定。
与源自心肌的细胞(例如H9C2心脏细胞)或C12C12或H2K细胞(骨骼肌细胞)中的CMV-IE相比，本发明的合成的心肌特异性启动子也可能能够以至少50％、100％、150％或200％的水平促进基因的心肌特异性表达。
如本文所使用的术语“核酸”通常是指基本上由核苷酸组成的任何长度的寡聚物或聚合物(优选线性聚合物)。核苷酸单元通常包括杂环碱基、糖基和至少一个(例如一个、两个或三个)磷酸基团，包括修饰的或取代的磷酸基团。杂环碱基除其它外可以包括嘌呤和嘧啶碱基，例如腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)，它们广泛存在于天然存在的核酸中，其他天然存在的碱基(例如黄嘌呤、肌苷、次黄嘌呤)以及化学或生物化学修饰(例如甲基化)、非天然或衍生的碱基。糖基除其他外可以包括戊糖(戊呋喃糖)基团，例如优选天然存在的核酸中常见的核糖和/或2-脱氧核糖，或阿拉伯糖、2-脱氧阿拉伯糖、苏糖或己糖糖基，以及经修饰的或取代的糖基。如本文所指的核酸可包括天然存在的核苷酸、经修饰的核苷酸或其混合物。经修饰的核苷酸可包括经修饰的杂环碱基、经修饰的糖部分、经修饰的磷酸基团或其组合。可以引入磷酸基团或糖的修饰以提高稳定性、对酶降解的抗性或一些其他有用的性质。术语“核酸”进一步优选地包括DNA、RNA和DNA RNA杂交分子，特别包括hnRNA、pre-mRNA、mRNA、cDNA、基因组DNA、扩增产物、寡核苷酸和合成的(例如，化学合成的)DNA、RNA或DNA RNA杂交物。核酸可以是天然存在的，例如存在于自然界中或从自然界中分离出来的；或者可以是非天然存在的，例如重组的，即通过重组DNA技术产生的，和/或部分或全部化学或生物化学合成的。“核酸”可以是双链的、部分双链的或单链的。在单链的情况下，核酸可以是有义链或反义链。此外，核酸可以是环状的或线状的。
“分离的”意指：当提及核酸时，指的是完全或部分缺乏自然界中通常与其相关的序列的核酸分子或核酸序列；或者存在于自然界中但具有与其相关的异源序列的序列；或者与染色体分离的分子。
术语“同一性”和“相同的”等是指两个聚合分子之间的序列相似性，例如两个核酸分子之间(例如两个DNA分子之间)。可以使用如下完成序列比对和序列同一性的确定：例如最初由Altschul等于1990年(J Mol Biol 215:403-10)描述的基本局部比对搜索工具(BLAST)，例如由Tatusova和Madden于1999年(FEMS Microbiol Lett174:247-250)描述的“Blast 2序列”算法。
用于比较的序列比对方法在本领域中是众所周知的。各种程序和比对算法描述于例如：Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444；Higgins和Sharp(1988)Gene 73:237-44；Higgins和Sharp(1989)CABIOS 5:151-3；Corpet等(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90；Huang等(1992)Comp.Appl.Biosci.8:155-65；Pearson等(1994)Methods Mol.Biol.24:307-31；Tatiana等(1999)FEMSMicrobiol.Lett.174:247-50。关于序列比对方法和同源计算的详细考量可见于例如Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-10。
美国国家生物技术信息中心(NCBI)基本局部比对搜索工具(BLASTTM；Altschul等(1990))可以从多个来源获得，包括美国国家生物技术信息中心(Bethesda,MD)和在互联网上，用于与多个序列分析程序结合。如何使用该程序确定序列同一性的描述在互联网上的BLASTTM的“帮助”部分可得。对于核酸序列的比较，可以使用默认参数利用BLASTTM(Blastn)程序的“Blast 2序列”功能。当通过这种方法评估时，与参考序列具有更大相似性的核酸序列将显示出增加的百分比同一性。通常，在序列的整个长度上计算百分比序列同一性。
例如，通过Needleman-Wunsch算法适当地找到全局最优比对，所述Needleman-Wunsch算法具有以下评分参数：匹配得分：+2，错配得分：-3；空位罚分：空位开放5，空位扩展2。通过经比对的碱基数与比对总长度(其中比对长度包括匹配和错配两者)的比率来适当地计算得到的最优全局比对的百分比同一性，乘以100。
术语“转录因子结合位点”(TFBS)在本领域中是众所周知的。对于技术人员显而易见的是，只要TFBS序列被预期的转录因子(TF)结合，TFBS序列就可以被修饰。本文公开的各种TFBS的共有序列是本领域已知的，并且技术人员可以容易地使用该信息来确定替代的TFBS。此外，技术人员通过实验可以容易地确定TF结合至给定的推定序列的能力(例如通过EMSA和本领域熟知和本文讨论的其他方法)。
“共有序列”的含义在本领域中是众所周知的。在本申请中，共有序列使用以下符号，除非上下文另有规定。考虑以下的示例性DNA序列：
A[CT]N{A}YR
A意指在该位置总是发现A；[CT]代表该位置的C或T；N代表该位置的任何碱基；并且{A}意指在该位置发现的除A之外的任何碱基。Y代表任何嘧啶，并且R代表任何嘌呤。
本申请中的术语“合成的”意指自然界中不存在的核酸分子。本发明的合成的核酸是人工生产的，通常是通过重组技术或从头合成。此类合成的核酸可能包含天然存在的序列(例如启动子、增强子、内含子和其他此类调节序列)，但这些存在于非天然存在的环境中。例如，合成的基因(或基因的一部分)通常包含一个或多个在自然界中不连续的核酸序列(嵌合序列)，和/或可以包含替换、插入和缺失及其组合。
如本文所使用的“互补的”或“互补性”是指两个核酸序列的沃森-克里克碱基配对。例如，对于序列5′-AGT-3′与互补序列3′-TCA-5′结合。两个核酸序列之间的互补性可以是“部分的”，其中只有一些碱基与其互补碱基结合，或者它可以是完整的，当序列中的每个碱基都与其互补碱基结合时。
如本文所使用的术语“施用”是指将外来物质引入人体或动物体内。施用可以是例如静脉施用、动脉施用或颅内施用。
本申请中的“转染”泛指有意将核酸引入细胞的任何过程，并且涵盖病毒和非病毒载体的引入，并且包括或等同于转化、转导等术语和过程。实例包括但不限于：用病毒载体转染；用质粒载体转化；电穿孔(Fromm等(1986)Nature 319:791-3)；脂质转染(Feigner等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7)；显微注射(Mueller等(1978)Cell 15:579-85)；农杆菌介导的转移(Fraley等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803-7)；直接的DNA摄取；晶须介导的转化；和微粒轰击(Klein等(1987)Nature 327:70)。
如本文所使用的，短语“转基因”是指外源核酸序列。在一个实例中，转基因是编码工业上或药学上有用的化合物的基因，或编码期望性状的基因。在另一个实例中，转基因编码有用的核酸，例如反义核酸序列，其中反义核酸序列的表达抑制靶核酸序列的表达。转基因优选地编码治疗性产物，例如蛋白质。
术语“载体”在本领域中是众所周知的，并且本文所使用的“载体”是指核酸分子，例如双链DNA，其可能已经插入了根据本发明的核酸序列。载体适合用于将插入的核酸分子转运到合适的宿主细胞中。载体通常包含允许转录所述插入核酸分子并且优选地将转录物翻译成多肽的所有必需元件。载体通常包含所有必需元件，使得一旦载体进入宿主细胞中，载体就可以独立于宿主染色体DNA复制，或与宿主染色体DNA同时复制；可以产生载体及其插入的核酸分子的数个拷贝。
如本文所使用的，术语“病毒载体”、“载体”或“基因递送载体”是指起核酸递送媒介作用的病毒(例如，AAV)颗粒，并且所述病毒颗粒包含包装在病毒粒子内的载体基因组(例如，病毒DNA[vDNA])。或者，在某些情况下，术语“载体”可单独用于指代载体基因组/vDNA。
“rAAV载体基因组”或“rAAV基因组”是包含一个或多个异源核酸序列的AAV基因组(即，vDNA)。rAAV载体通常只需要处于顺式的反向末端重复序列(TR(s))来生成病毒。所有其他病毒序列都是可有可无的，并且可以反式提供(Muzyczka,(1992)Curr.TopicsMicrobial.Immunol.158:97)。通常，rAAV载体基因组将仅保留一个或多个TR序列，以便最大化可被载体有效包装的转基因的大小。可以以反式提供结构和非结构蛋白编码序列(例如，从载体(例如质粒)，或通过将序列稳定地整合到包装细胞中)。在本发明的实施方式中，rAAV载体基因组包含至少一个ITR序列(例如，AAV TR序列)，任选地两个ITR(例如，两个AAVTR)，它们通常位于载体基因组的5′和3′端并侧接于于异源核酸，但不必与其相邻。TR可以彼此相同或不同。
术语“末端重复序列”或“TR”包括形成发夹结构并起反向末端重复序列作用的任何病毒末端重复序列或合成的序列(即介导期望的功能(如复制、病毒包装、整合和/或原病毒拯救等)的ITR)。TR可以是AAV TR或非AAV TR。例如，如其他细小病毒(例如，犬细小病毒(CPV)、小鼠细小病毒(MVM)、人细小病毒B-19)或任何其它合适的病毒序列(例如，充当SV40复制的起点的SV40发夹)的非AAV TR序列可被用作TR，其可以通过截短、替换、缺失、插入和/或添加而被进一步修改。此外，TR可以是部分或完全合成的，例如Samulski等在美国专利号5,478,745中描述的“双D序列”。
包括“AAV反向末端重复序列”或“AAV ITR”的“AAV末端重复序列”或“AAV TR”可以来自任何AAV，包括但不限于血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12或现在已知或以后发现的任何其它AAV。AAV末端重复序列不需要具有天然的末端重复序列(例如，天然的AAV TR或AAV ITR序列可以通过插入、缺失、截短和/或错义突变来改变)，只要末端重复序列介导期望的功能，例如复制、病毒包装、整合和/或原病毒拯救等。
AAV蛋白VP1、VP2和VP3是衣壳蛋白，它们一起相互作用以形成二十面体对称的AAV衣壳。VP1.5是美国公开号2014/0037585中描述的AAV衣壳蛋白。
如国际专利公开WO 00/28004和Chao等,(2000)Molecular Therapy 2:619中所述的，本发明的病毒载体还可以是“靶向的”病毒载体(例如，具有定向向性)和/或“杂交的”细小病毒(即，其中病毒TR和病毒衣壳来自不同的细小病毒)。
如国际专利公开WO 01/92551(通过引用的方式将其公开内容以其整体并入本文)中所述的，本发明的病毒载体还可以是双链细小病毒颗粒。因此，在一些实施方式中，双链(双链体)基因组可以被包装到本发明的病毒衣壳中。
此外，病毒衣壳或基因组元件可以包含其它修饰，包括插入、缺失和/或替换。
如本文所使用的“嵌合”衣壳蛋白意指，相对于野生型，已通过在衣壳蛋白的氨基酸序列中的一个或多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个等)氨基酸残基的取代而被修饰的AAV衣壳蛋白，以及相对于野生型，已通过在氨基酸序列中的一个或多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个等)氨基酸残基的插入和/或缺失而被修饰的AAV衣壳蛋白。在一些实施方式中，来自一种AAV血清型的完整或部分结构域、功能区、表位等可以以任意组合替换不同AAV血清型的相应的野生型结构域、功能区、表位等，以产生本发明的嵌合的衣壳蛋白。嵌合的衣壳蛋白的产生可以根据本领域熟知的方案进行，并且文献和本文中描述了大量的可包含在本发明的衣壳中的嵌合衣壳蛋白。
如本文所使用的，术语“单倍体AAV”应意指如PCT/US18/22725中所述的AAV，将其并入本文。
术语“杂交的”AAV载体或细小病毒是指rAAV载体，其中病毒TR或ITR和病毒衣壳来自不同的细小病毒。杂交载体在国际专利公开WO 00/28004和Chao等，(2000)MolecularTherapy 2：619中描述。例如，杂交的AAV载体通常包含足以进行腺病毒复制和包装的腺病毒5′端和3′端的顺式ITR序列(即，腺病毒末端重复序列和PAC序列)。在一些实施方式中，AAV是杂交的AAV2ITR/AAV，如美国专利7,172,893中所公开的，以引用的方式将其整体并入本文。
术语“多倍体AAV”是指AAV载体，所述AAV载体由来自两种以上的AAV血清型的衣壳组成，例如，可以利用个体血清型进行更高的转导，但在某些实施例中不会消除来自亲本的向性。
如本文所使用的，“磷酸酶抑制剂-1蛋白”或“I-1蛋白”是蛋白质，例如，通过GenBank登录号NM_006741所描述的通过抑制蛋白磷酸酶-1的活性来调节心肌收缩力的蛋白质。在磷酸酶抑制剂-1蛋白或I-1蛋白的上下文中，术语“野生型”是指编码磷酸酶抑制剂蛋白-1(I-1)、亚基1A和SEQ ID NO：1的多肽序列的SEQ ID NO：2的核苷酸序列以及编码I-1蛋白(具有与上述多肽序列相同的功能特性和结合亲和力)的任何其它核苷酸序列，例如等位基因变体。
野生型I-1包括蛋白质的所谓“功能性衍生物”。“功能性衍生物”意指本发明的多肽或核酸的“化学衍生物”、“片段”、“多形体”或“变体”。功能性衍生物保留了蛋白质的至少一部分功能，这允许其根据本发明的效用。本领域众所周知的是，由于遗传密码的简并性，许多不同的核酸序列可以编码相同的氨基酸序列。本领域还众所周知的是，可以对氨基酸进行保守性改变以获得保留原始功能的蛋白质或多肽。在这两种情况下，本公开均旨在涵盖所有排列组合。
本发明的范围内包括的是本文描述的分离的核酸分子的功能等同物。遗传密码的简并性允许某些密码子被指定相同氨基酸的其它密码子替换，并因此会产生相同的蛋白质。核酸序列可以有很大的不同，因为除了甲硫氨酸和色氨酸外，已知的氨基酸可以由多于一个的密码子编码。然而，所述经编码的氨基酸序列将被保留。
此外，核酸序列可以包含由至少一个核苷酸添加、缺失或替换至5′端和/或3′端的核苷酸序列，前提是其添加、缺失或替换不改变本文所述的由核苷酸序列编码的氨基酸序列。例如，本发明的核酸分子可以在其5′端和/或3′端添加限制性核酸内切酶识别位点。
此外，可能删除密码子或用简并密码子以外的密码子替换一个或多个密码子以产生结构修饰的多肽，但其效用或活性基本上与由未修饰的核酸分子产生的多肽相同。正如本领域所认识到的，这两种多肽在功能上是等同的，引起它们的产生的两种核酸分子也是等同的，尽管核酸分子之间的差异与遗传密码的简并性无关。
I-1的“化学衍生物”包含额外的化学部分，通常不是蛋白质的一部分。通过使肽的靶向氨基酸残基和能够与选定的侧链或末端残基反应的有机衍生剂反应，可以将蛋白质或肽的共价修饰引入分子中。
如本文所使用的“血管生成蛋白或肽”是指能够促进血管生成或血管生成活性(即血管发育)的任何蛋白或肽。
单独的术语“血管生成”或与其他试剂组合诱导血管生成，其它试剂包括但不限于成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子、血管生成素、转化生长因子(TGF)、组织坏死因子(TNF如TNF-α)、血小板诱导生长因子(PDGF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、胎盘GF、IL-8，意指包括血管生成素(如增殖素、血管生成素-1和血管生成素2、血小板反应蛋白、肾上腺素-A1、E-选择素、瘦素、肝素亲和调节肽)的试剂。
“生长因子”意指至少促进细胞生长或诱导表达变化的试剂。
“脉管系统”或“血管”是指在整个哺乳动物体内携带血液(以及淋巴液)的血管系统的术语。
“血管”是指哺乳动物血管系统的任何血管，包括动脉、小动脉、毛细血管、小静脉、静脉、窦和血管滋养管。在本发明用于治疗心血管病症、心脏疾病的优选方面，将包含血管生成转基因的载体直接引入向心肌供血的血管导管中。这种血管导管包括冠状动脉以及诸如隐静脉或乳内动脉移植物的血管。
“动脉”是指血液通过其离开心脏的血管。冠状动脉供应心脏本身的组织，而其它动脉供应身体的其余器官。动脉的一般结构由被多层动脉壁包围的管腔组成。
术语“片段”用于表示源自I-1的氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列的长度小于其所源自的全长多肽。这种片段可以例如通过全长蛋白质的蛋白水解切割产生。这种片段也可以通过适当地修饰编码蛋白质的DNA序列以在C-末端、N-末端和/或天然序列内的一个或多个位点处删除一个或多个氨基酸来重组获得。这些片段保留了天然I-1的功能部分。
旨在本发明范围内的另一种功能衍生物是“变体”多肽，所述“变体”多肽缺少一个或多个氨基酸或包含相对于天然多肽的额外的或替换的氨基酸。具有添加、替换和/或附加氨基酸的这种变体保留了天然I-1的功能部分。可以使用本领域普通技术人员熟知的标准技术(例如，使用定点诱变(Adelman等，1983，DNA 2:183))来制备具有缺失、插入和/或替换的氨基酸残基的蛋白质的功能衍生物。或者，可以使用本领域熟知的方法，通过直接化学合成方便地制备具有氨基酸缺失、插入和/或替换的蛋白质。
如本文所使用的，术语“突变体”是指从含有基因突变的基因翻译的I-1多肽，所述基因突变引起氨基酸序列与野生型序列相比发生改变，并引起I-1多肽的功能发生改变。
如本文所使用的，术语“磷酸酶活性”是指磷酸酶对常用的模型蛋白底物MyBP的活性。在此，使用髓磷脂碱性蛋白(MyBP)(用32P标记)作为底物(结合伴侣)来测量蛋白磷酸酶活性的变化。
如本文所使用的术语“可操作地连接的”、“可操作地结合的”或等同表达是指各种核酸元件相对于彼此的排列，使得元件在功能上连接并且能够以预期的方式相互作用。此类元件可以包括但不限于启动子、CRE(例如增强子或其他调控元件)、启动子元件、聚腺苷酸化序列、一个或多个内含子和/或外显子以及待表达的感兴趣的基因的编码序列。当正确定向或可操作地连接时，核酸序列元件一起作用以调节彼此的活性，并最终可能影响表达产物的表达水平。调节意指增加、减少或维持特定元件的活性水平。每个元件相对于其它元件的位置可以根据每个元件的5′末端和3′末端或它们在另一个元件或位置(例如TSS或启动子元件)的上游或下游的位置来表示，并且任何特定元件之间的距离可以通过元件之间插入的核苷酸或碱基对的数量来参考。如技术人员所理解的，可操作地连接意味着功能活性，而不一定与自然位置连接相关。实际上，当用于核酸表达盒时，CRE通常紧邻地位于启动子元件的上游(尽管通常是这种情况，但绝对不应解释为限制或排除核酸表达盒内的位置)，但这不一定是体内的情况，例如，当位于启动子上游时，天然存在于基因下游的、该基因的转录受其影响的调控元件序列能够以相同的方式发挥作用。因此，根据具体实施方式，调控元件的调节或增强作用可以是位置独立的。
如本文所使用的“间隔区序列”或“间隔区”是分隔两个功能性核酸序列(例如TFBS、CRE、CRM、启动子元件等)的核酸序列。它基本上可以具有任何序列，前提是它不阻止功能性核酸序列(例如顺式调控元件)按所期望的发挥作用(例如，如果它包含沉默子序列，阻止期望的转录因子的结合等，则可能发生这种情况)。通常，它是非功能性的，因为它的存在只是为了将相邻的功能性核酸序列彼此间隔开。在一些实施方式中，间隔区的长度可以为75个、50个、40个、30个、30个或10个核苷酸或更少。在一些实施方式中，间隔区的长度可以大于75个核苷酸，例如75-100个、100-200个、200-250个、250-300个或多于300个核苷酸。
如本文所使用的术语“药学上可接受的”与本领域一致，并且意指与药物组合物的其它成分相容并且对其接受者无害。
短语“治疗有效量”和类似短语意指在受试者中的提供期望的特定药理作用的剂量或血浆浓度，例如在心脏组织或心脏中表达治疗性基因、和/或分泌到血浆中。将强调的是，治疗有效量在治疗本文所述的病症方面可能并不总是有效的，即使这样的剂量被本领域技术人员认为是治疗有效量。治疗有效量可根据施用途径和剂型、受试者的年龄和体重、和/或所治疗的疾病或病症而变化。治疗有效量在治疗本文所述的病症方面可能并不总是有效的，即使这样的剂量被本领域技术人员认为是治疗有效量。
术语“治疗(treat、treating或treatment)”(及其语法变体)意指受试者病症的严重程度降低、至少部分改善或稳定和/或至少一种临床症状得到一些缓解、减轻、减少或稳定和/或疾病或病症的进展延迟。
术语“预防(prevent、preventing和prevention)”(及其语法变体)是指相对于不存在本发明的方法的情况下发生的那些，受试者的疾病、疾患和/或临床症状发作的预防和/或延迟，和/或疾病、疾患和/或临床症状发作的严重程度的降低。可以是完全预防，例如完全没有疾病、疾患和/或临床症状。也可以是部分预防，使得受试者中的疾病、疾患和/或临床症状的发生和/或发作的严重程度实质上低于在不存在本发明的情况下发生的那些。
如本文所使用的，“治疗有效”量是足以为受试者提供一些改善或益处的量。换句话说，“治疗有效”量是在受试者的至少一种临床症状方面提供一些缓和、减轻、减少或稳定的量。本领域技术人员将理解的是，治疗效果不需要是完全的或治愈的，只要为受试者提供一些益处即可。
如本文所使用的“预防有效”量是相对于在不存在本发明方法的情况下发生的那些，足以预防和/或延迟受试者的疾病、疾患和/或临床症状的发作，和/或减轻和/或延迟受试者的疾病、疾患和/或临床症状的发作的严重程度的量。本领域技术人员将理解的是，预防水平不需要是完全的，只要为受试者提供一些预防益处即可。
如本文所使用的，术语“心脏疾患”是指损害其正常机能的心脏结构或功能异常。例如，心脏疾患可以是心力衰竭、缺血、心肌梗塞、充血性心力衰竭(CHF)、心律不齐、心肌病、心肌收缩力缺陷、移植排斥等。所述术语包括以收缩异常、Ca2+代谢异常为特征的疾患和以心律不齐为特征的疾患。
术语“心脏疾病”是指急性和/或慢性心脏功能障碍。心脏疾病通常与心脏收缩功能下降有关，并且可能与可观察到的向心肌的血流减少有关(例如，作为冠状动脉疾病的结果)。心脏疾病的表现包括心肌缺血，这可能导致心绞痛、心脏病发作和/或充血性心力衰竭。所述术语涉及适于通过将活性化合物施用至心脏、特别是心脏细胞或心肌细胞来治疗和/或预防的疾病。在一些实施方式中，心脏疾患是心力衰竭或充血性心力衰竭(CHF)。
术语“心肌病”是指引起充血性心力衰竭的一组疾病。心肌病是与机械和/或电学功能障碍相关的一组异质性心肌疾病，通常表现出不适当的心室肥大或扩张，并且归因于包括遗传原因在内的多种原因。
如本文所使用的，术语“心肌病”是指心肌(即心脏肌肉)功能的退化。心肌病可以是外源性的(例如，主要病理存在于心肌本身之外，例如，由缺血引起)或内源性的(例如，心肌无力不是由可识别的外部原因引起的)。
术语“充血性心力衰竭”或“CHF”也可与作为影响心脏的病理状况的表现的“心力衰竭”或“慢性心力衰竭”互换，并且指的是心脏无法以恰当的速度泵血来满足身体的代谢需求。
术语“心力衰竭”在临床上被定义为心脏不能向身体提供恰当的血流以满足代谢需求的病症。症状包括呼吸困难、疲劳、虚弱、腿部肿胀和运动不耐受。在体检中，心力衰竭患者倾向于具有心率和呼吸频率升高、啰音(肺部积液的迹象)、水肿、颈静脉扩张，并且在许多情况下使心脏扩大。患有严重心力衰竭的患者遭受高的死亡率；通常50％的患者会在发展出病症后两年内死亡。在一些情况下，心力衰竭与严重的冠状动脉疾病(“CAD”)相关，通常产生如本文和本领域所述的心肌梗塞和进行性慢性心力衰竭或急性低输出状态。在其它情况下，心力衰竭与扩张型心肌病相关，但不会伴有严重的冠状动脉疾病。换句话说，术语“心力衰竭”是指其中心脏在恰当泵血以满足身体需要的能力方面存在缺陷的多种疾患中的任何一种。在许多情况下，心力衰竭是心肌细胞的兴奋-收缩偶联的各个步骤中的在细胞水平的一种或多种异常的结果。一种此类异常是SR功能缺陷。心力衰竭最常见的原因是心肌收缩缺陷，其发生的原因有很多，其中最常见的包括：心肌缺血损伤、血液从心脏流出的机械阻力过大，由于瓣膜功能缺陷、心肌感染或炎症导致的心腔超负荷，或先天性心肌收缩功能差(Braunwald,E.2001Harrison′s Principles of Internal Medicine，第15版，pp1318-29)。
术语“外周血管疾病”是指外周(即非心脏)脉管系统和/或由此供应的组织的急性或慢性功能障碍。与心脏疾病一样，外周血管疾病通常产生自由脉管系统供应的流向组织的不恰当的血流，例如在缺血或者严重的情况下，缺血可能导致组织细胞死亡。外周血管疾病的方面包括但不限于外周动脉闭塞病(PAOD)和外周肌肉缺血。通常，外周血管疾病的症状表现在患者的四肢、尤其是腿部。
术语“心血管病症”包括但不限于冠状动脉疾病/缺血、冠状动脉疾病(CAD)、缺血、心绞痛(胸痛)、血栓形成、冠状动脉血栓形成、心肌梗塞(MI)、无症状缺血、狭窄/再狭窄、短暂性脑缺血发作(TIA)、动脉粥样硬化、周围血管疾病如缓慢性心律失常、心动过缓、病态窦性心律(窦性功能障碍综合征)、窦性心动过缓、窦房传导阻滞、心搏停止、窦性停搏、晕厥、一度房室(AV)传导阻滞、二度房室(AV)传导阻滞、三度房室(AV)传导阻滞、功能失调的异常缓慢性心律失常如快速性心律失常、心动过速、颤动、扑动、心房颤动、心房扑动、家族性房颤、阵发性房颤、永久性房颤、持续性房颤、上心室快速性心律失常、窦性心动过速、折返(折返性心律失常)、AV连接折返、局灶性心律失常、易位、心室颤动(VF)、室性心动过速(VT)、Wolf-Parkinson-White综合征(WPW)、心源性猝死、快速性心律失常如心力衰竭、心肌病、充血性心力衰竭、肥厚性心肌病、重构、非缺血性心肌病、舒张性心肌病、限制性心肌病、舒张性心力衰竭、收缩性心力衰竭、作为慢性心力衰竭的心力衰竭例如房室(AV)阻滞、束支传导阻滞(BBB)、左束支传导阻滞(LBBB)、右束支传导阻滞(RBBB)、长期QT综合征(LQTS)、室性早搏(PVC)、电重构、心室内传导缺陷、半阻滞某些心脏传导阻滞/电紊乱如高血压、低血压、左心室功能障碍、低射血分数、低心输出量、低心输出量血流动力学缺陷、心源性猝死、心脏骤停突发性心脏(SCD)、心室颤动、泵衰竭、细菌性心内膜炎、病毒性心肌炎、心包炎、风湿性心脏病、还有晕厥。具体地，心血管病症包括但不限于与如下不相关的增生性心律不齐：例如心房颤动、心室颤动或心动过缓、缺血、心力衰竭、肿瘤疾病、心室重构、舒张功能障碍、异常体温，如静脉、左心室或左心房压力改变、压力异常或变化、心跳或心音异常或变化；电图异常或变化，例如血液pH值、葡萄糖、pO 2、pCO 2、每分钟通气量、肌酸、CRP、MEF2A、肌酸激酶或肌酸激酶MB水平异常或改变的心脏代谢；异常或改变的肺阻抗或胸阻抗、异常或改变的每搏输出量、异常或改变的神经激素水平、异常或改变的电活动、异常或改变的敏感神经活动，异常或改变的肾输出量；异常或改变的滤过率，可能与此类异常或改变的血管紧张素II水平有关，或异常或改变的呼吸音。
术语“心肌缺血”或“MI”是心肌不能收到足够水平的氧气和营养的病症，这通常归因于向心肌的供血不足(例如，作为冠状动脉疾病的结果)。
在本文中可互换使用的术语“冠状动脉疾病”和“急性冠脉综合征”是指心肌梗塞，指的是心血管病症、疾病或疾患，包括特征为心功能不足、不期望或异常的所有疾患，例如缺血性心脏疾病、高血压性心脏疾病和肺动脉高压性心脏疾病、瓣膜疾病、先天性心脏疾病和导致受试者特别是人类受试者中的充血性心力衰竭的任何病症。心脏功能不足或异常可能是疾病、损伤和/或衰老的结果。作为背景，对心肌损伤的应答遵循明确定义的路径，其中一些细胞死亡，而另一些细胞进入休眠状态，在这种状态下它们尚未死亡但功能失调。随后是炎症细胞浸润，胶原蛋白沉积作为疤痕的一部分，所有这些都与新血管的内生长和一定程度的持续的细胞死亡并行发生。
如本文所使用的，术语“缺血”是指由于血液流入减少而导致的任何局部组织的缺血。术语“心肌缺血”是指由冠状动脉粥样硬化和/或向心肌的供氧不足引起的循环障碍。例如，急性心肌梗塞代表对心肌组织的不可逆的缺血损伤。这种损伤导致冠状循环中的闭塞(例如，血栓形成或栓塞)事件，并产生其中心肌代谢需求超过对心肌组织的氧气供应的环境。
如本文所使用的，术语“心脏细胞”是指下述细胞，其可为(a)存在于受试者中的心脏的部分，(b)在体外维持的心脏的部分，(c)心脏组织的部分，或(d)从受试者心脏分离的细胞。例如，细胞可以是肌肉细胞，例如心肌细胞或平滑肌细胞。本发明的心脏细胞还可以包括心脏内的内皮细胞，例如毛细血管、动脉或其他血管的细胞。心脏细胞包括起搏细胞等。
如本文所使用的，术语“心脏”是指存在于受试者中的心脏或在受试者体外离体维持的心脏。
如本文所使用的，术语“心脏组织”是指源自受试者心脏的组织。
如本文所使用的，术语“收缩力”(如心肌收缩力)是指心肌的性能。它通常被定义为：心肌纤维在给定纤维长度下收缩的内在能力。
如本文所使用的，术语“限制血流”是指基本上阻断血液流过血管，例如，血液流入远端主动脉及其分支。例如，至少50％的血液流出心脏受到限制，优选75％并且更优选80％、90％或100％的血液被限制流出心脏。血流可以通过阻塞主动脉和肺动脉来限制，例如，用夹子。
如本文所使用的术语“AAV载体”是本领域众所周知的，并且通常是指包括各种核酸序列的AAV载体核酸序列。如本文所使用的AAV载体通常包含非AAV来源的异源核酸序列作为载体的一部分。这种异源核酸序列通常包含本文公开的启动子以及用于细胞遗传转化的感兴趣的其他序列。一般而言，异源核酸序列侧接有至少一个、通常侧接有两个AAV反向末端重复序列(ITR)。“AAV病毒粒子”或“AAV病毒”或“AAV病毒颗粒”或“AAV载体颗粒”是指由至少一种AAV衣壳多肽(包括变体AAV衣壳多肽和非变体亲本衣壳多肽)和经包裹的多核苷酸AAV载体组成的病毒颗粒。如果颗粒包含异源核酸(即野生型AAV基因组以外的多核苷酸，例如待递送至哺乳动物细胞的转基因)，则它可以称为“AAV载体颗粒”或简称为“AAV载体”。因此，AAV病毒粒子或AAV颗粒的产生必然包括AAV载体的产生，因为这种载体包含在AAV病毒粒子或AAV颗粒内。ITR可源自与衣壳相同的血清型，选自表11中所列的任何血清型，或可来自与衣壳不同的血清型。两个ITR不必相同。此外，可以使用合成的ITR。AAV载体通常具有多于一个的ITR。在非限制性实例中，AAV载体具有包含两个ITR的病毒基因组。在一个实施方式中，ITR彼此具有相同的血清型。在一些实施方式中，ITR具有不同的血清型。非限制性实例包括零个、一个或两个具有与衣壳相同的血清型的ITR。独立地，每个ITR可为约100至约150个核苷酸的长度。ITR可以是约100-105个核苷酸的长度、106-110个核苷酸的长度、111-115个核苷酸的长度、116-120个核苷酸的长度、121-125个核苷酸的长度、126-130个核苷酸的长度、131-135个核苷酸的长度、136-140个核苷酸的长度、141-145个核苷酸的长度或146-150个核苷酸的长度。在一个实施方式中，ITR为140-142个核苷酸的长度。ITR长度的非限制性实例是102个、105个、130个、140个、141个、142个、145个核苷酸的长度。
如本文所使用的，术语“微小RNA”是指任何类型的干扰RNA，包括但不限于内源性微小RNA和人工微小RNA(例如，合成的miRNA)。内源性微小RNA是基因组中天然编码的小RNA，能够调节mRNA的生产利用。人工微小RNA可以是除了内源性微小RNA之外，能够调节mRNA的活性的任何类型的RNA序列。微小RNA序列可以是由这些序列中的任何一个或多个组成的RNA分子。微小RNA(或“miRNA”)序列已描述于下述公开中：Lim等,2003,Genes&Development,17,991-1008,Lim et al,2003,Science,299,1540,Lee和Ambrose,2001,Science,294,862,Lau等,2001,Science,294,858-861,Lagos-Quintana等,2002,CurrentBiology,12,735-739,Lagos-Quintana等,2001,Science,294,853-857和Lagos-Quintana等,2003,RNA,9,175-179。微小RNA的实例包括较大RNA的任何RNA片段，或者是miRNA、siRNA、stRNA、sncRNA、tncRNA、snoRNA、smRNA、shRNA、snRNA或其它小的非编码RNA。参见例如，美国专利申请20050272923、20050266552、20050142581和20050075492。“微小RNA前体”(或“pre-miRNA”)是指具有并入其中的微小RNA序列的茎环结构的核酸。“成熟微小RNA”(或“成熟miRNA”)包括从微小RNA前体(“pre-miRNA”)切割或合成(例如，通过无细胞合成在实验室中合成)的微小RNA，并且具有从约19个核苷酸到约27个核苷酸的长度，例如，成熟的微小RNA可以具有19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt或27nt的长度。成熟的微小RNA可以与靶mRNA结合并抑制靶mRNA的翻译。
术语“治疗(treatment或treating)”是指减少、改善或消除疾病或病症的一种或多种体征、症状或影响。因此，本文所使用的“治疗”包括对哺乳动物、特别是人类中的疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防该疾病发生在易患该疾病或处于患该疾病的风险但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中；(b)抑制疾病，即阻止其发展；以及(c)缓解疾病，即引起疾病消退。
在一些实施方式中，术语“治疗(treat或treatment或treating)”是指治疗性处理，其中目的是预防或减缓疾病的发展，例如减慢心脏疾患的发展，或减少心血管病症、疾病或疾患的至少一种副作用或症状，即以心功能不足或不期望为特征的任何疾患。心脏疾患的副作用或症状是本领域众所周知的，包括但不限于呼吸困难、胸痛、心悸、头晕、晕厥、水肿、发绀、苍白、疲劳和死亡。如果一种或多种症状或临床标志物如本文所定义的术语那样减少，则治疗通常是“有效的”。或者，如果疾病的进展减少或停止，则治疗是“有效的”。也就是说，“治疗”不仅包括症状的改善或疾病标志物的减少，还包括在不存在治疗的情况下预期的症状的停止或进展减缓或恶化。有益或期望的临床结果包括但不限于减轻一种或多种症状、减弱疾病程度、稳定(即不恶化)的疾病状态、延迟或减缓疾病进展、改善或缓解疾病状态以及缓和(部分或全部)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可以意指与不接受治疗的预期存活相比延长的存活。需要治疗的人包括那些已经被诊断出患有心脏病症的人，以及那些可能由于遗传易感性或其他因素(例如体重、饮食和健康)而发展出心脏病症的人。在一些实施方式中，术语治疗还涵盖预防性措施和/或预防性治疗，其包括施用本文公开的药物组合物以预防疾病或疾患的发作。
如本文所使用的术语“有效量”是指药物组合物的治疗剂的量，例如，表达足够量的蛋白质以减少至少一种或多种疾病或疾患的症状的合成的经修饰的RNA的量，并且涉及足以提供期望效果的药物组合物的量。例如，关于如本文所公开的合成的经修饰的RNA的本文中使用的短语“治疗有效量”意指在适用于任何医学治疗的合理的收益/风险比的情况下，足以治疗疾患的组合物的量。因此，术语“治疗有效量”是指，当施用至患有心血管病症、疾病或疾患的典型受试者时，例如在治疗上或预防上足以显著降低与心脏功能障碍或疾患相关的症状或临床标志物的本文公开的组合物的量。
症状在治疗上显著减轻是例如与对照或未治疗的受试者相比，测量参数降低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约125％、至少约150％或更多。经测量的或可测量的参数包括临床上可检测的疾病标志物，例如生物标志物的升高或降低的水平，以及与疾病或疾患的临床上可接受的症状或标志物等级相关的参数。将理解的是，本文公开的组合物和制剂的总的日用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。所需的确切量将根据所治疗疾病的类型等因素而有所不同。
关于受试者中的例如心血管病症或疾病的治疗，术语“治疗有效量”是指安全且足以预防或延缓心血管疾病或疾患的发展的量。因此，所述量可以治愈或病症或使心血管疾病或疾患得到缓解、减缓心血管疾病进展的进程、减缓或抑制心血管疾病或疾患的症状、减缓或抑制心血管疾病或疾患的继发症状的形成、或抑制心血管疾病或疾患的继发症状的发展。治疗心血管疾病或疾患的有效量取决于待治疗的心血管疾病的类型、症状的严重程度、被治疗的受试者、受试者的年龄和一般状况、施用方式等。因此，不可能指定确切的“有效量”。然而，对于任何给定的情况，本领域普通技术人员可以仅使用常规实验来确定合适的“有效量”。治疗的功效可由普通技术人员判断，例如，可在本文讨论的心血管疾病或疾患的动物模型中评估功效(例如患有急性心肌梗塞或缺血-再灌注损伤的啮齿动物的治疗)，以及引起如本文公开的心血管疾病或疾患的至少一种症状减轻的组合物或制剂的任何治疗或施用表明治疗有效(例如增加的心脏射血分数、降低的心力衰竭率、减小的梗塞面积、降低的相关发病率(肺水肿、肾功能衰竭、心律不齐)、运动耐量或其它生活质量量度的改善以及死亡率的降低)。在组合物用于治疗心血管疾病或疾患的实施方式中，组合物的功效可以使用心血管疾病的实验动物模型来判断，例如，缺血再灌注损伤的动物模型(Headrick JP,Am J Physiol Heart circ Physiol 285；H1797；2003)和急性心肌梗塞的动物模型(YangZ,Am J Physiol Heart Circ.Physiol 282:H949:2002；Guo Y,J Mol Cell Cardiol 33；825-830,2001)，或心力衰竭的模型(公开于Mann,Douglas L.和G.Michael Felker.“Mechanisms and models in heart failure:a translational approach”Circulationresearch 128.10(2021):1435-1450)，例如，α-肌动蛋白转基因小鼠(mActin-Tg小鼠)，它是心肌病的模型。
当使用实验动物模型时，与未经治疗的动物相比，当在经治疗的动物中较早发生心血管疾病或疾患的症状减轻时(例如呼吸困难、胸痛、心悸、头晕、晕厥、水肿、发绀、苍白、疲劳和高血压的一种或多种症状的减轻)，则证明了治疗的功效。“更早”意指例如肿瘤大小的减小至少提前5％发生，但优选更早，例如提前一天、提前两天、提前3天或更早。
如本文所使用的，术语“治疗”在用于指心血管疾病或疾患的治疗时，用于指心血管疾病或疾患的症状和/或生化标志物的减少，例如将心血管疾病的至少一种生化标志物减少至少约10％将被认为是有效的治疗。此类心血管疾病的生化标志物的实例包括例如血液中的肌酸磷酸激酶(CPK)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)的减少、和/或心血管疾病症状的减少和/或本领域普通技术人员通过心电图(ECG或EKG)或超声心动图(心脏超声)、多普勒超声和核医学成像测量确定的血流和心脏功能的改善。通过本文公开的方法，心血管疾病的症状减少至少约10％也将被认为是有效的治疗。作为备选实例，通过本文公开的方法，心血管疾病的症状的减轻(例如以下的至少一种症状的减轻：呼吸困难、胸痛、心悸、头晕、晕厥、水肿、发绀等至少减少约10％或此类系统停止，或心血管疾病的一种此类症状的规模减少至少约10％)被认为是有效的治疗。在一些实施方式中，优选但不要求治疗剂实际上消除心血管疾病或病症，而只是将症状减轻到可控制的程度。
如本文所使用的，术语“具有治疗效果”和“成功治疗”具有基本上相同的含义。具体而言，如果根据本发明的方法，患者在接受如本文所公开的rAAV载体后表现出可观察到的和/或可测量的一种或多种心脏疾病症状的减轻或不存在，则患有心血管疾病或心脏疾病的患者被成功地“治疗”了病症。患者也可感觉到这些体征或症状的减轻。因此，心脏疾病状况的成功治疗的指标包括患者表现出或感觉到心绞痛、疲劳、虚弱、呼吸困难、腿部肿胀、啰音、心率或呼吸频率、水肿或颈静脉扩张的任何一种症状的减轻。患者还可能表现出更高的运动耐受性，心脏更小，心室和心脏功能得到改善，并且通常与心脏病症相关的医院就诊需求更少。心血管功能的改善可能足以满足患者的代谢需要，并且患者在轻度运动或休息时可能不会表现出症状。许多这些体征和症状很容易通过眼睛观察到和/或通过医生熟悉的常规程序测量。改善的心血管功能的指标包括经治疗的组织中增加的血流量和/或收缩功能。如下所述，患者中的血流可通过铊成像(如Braunwald在Heart Disease,第4版,第276-311页(Saunders,Philadelphia,1992)中所描述的)或超声心动图(描述于实施例1和实施例5以及Sahn,D J.等,Circulation.58:1072-1083,1978)测量。根据本文公开的施用方法的用如本文公开的rAAV载体进行的治疗前、后的血流可以使用这些方法进行比较。如上所述，改善的心脏功能与减少的体征和症状有关。除了超声心动图之外，还可以通过本领域已知的核(非侵入性)技术测量射血分数(LV)。同样可以在根据本发明处理的外周组织中测量血流量和收缩功能。
向受试者“施用”药剂包括向受试者引入或递送药剂以执行其预期功能的任何途径。施用可以通过任何合适的途径进行，包括口服、鼻内、眼内、眼科、肠胃外(血管内、肌肉内、腹膜内或皮下)或局部。施用包括自我施用和他人施用。静脉内或动脉内施用在本发明中特别令人感兴趣。
术语“个体”、“受试者”和“患者”可互换使用，并且指的是患有需要治疗的疾病或病症的任何个体受试者。出于本公开的目的，受试者可以是灵长类动物，优选人，或另一种哺乳动物，例如狗、猫、马、猪、山羊或牛等。
术语“在区域或组织中特异地活化”是指启动子在该区域或组织中被显著地活化，即在该区域或组织中比在其他区域或组织中更加活化。
除非另有指明，否则“有效转导”或“有效向性”或类似术语可以通过参考合适的对照来确定(例如，分别为对照的至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、500％或更多的转导或向性)。在特定的实施方式中，病毒载体有效地转导或具有对神经元细胞和心肌细胞的有效向性。合适的对照将取决于多种因素，包括期望的向性和/或转导谱。
“治疗性多肽”是可以减轻、减少、预防、延迟和/或稳定由细胞或受试者中的蛋白质的缺乏或缺陷引起的症状的多肽，和/或以其它方式使受试者受益的多肽，例如酶替代以减少或消除疾病症状，或提高移植存活率或诱导免疫应答。
术语“异源核苷酸序列”和“异源核酸分子”在本文中可互换使用，并且是指非天然存在于病毒中的核酸序列。通常，异源核酸分子或异源核苷酸序列包含编码感兴趣的多肽和/或非翻译RNA(例如，用于递送至细胞和/或受试者)的开放阅读框，例如PP1抑制剂。
此外，本文所使用的术语“约”，当针对可测量的值(例如多核苷酸或多肽序列的长度、剂量、时间、温度等的量)时，意在涵盖确切的规定量和该规定量的±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化。
同样如本文所使用的，“和/或”是指并涵盖一个或多个相关的所列出的项目的任何和所有可能的组合，以及当以可替代(“或”)解释时缺乏组合。
如本文所使用的，过渡短语“基本上由...组成”意指权利要求的范围应被解释为涵盖权利要求中所述的特定材料或步骤，以及那些不会对所要求保护的发明的基本和新颖特征产生实质性影响的材料或步骤。参见In re Herz,537F.2d 549,551-52,190USPQ 461,463(CCPA1976)(原文强调)；另参见MPEP§2111.03。因此，术语“基本上由...组成”当用在本发明的权利要求中时，不会被解释为等同于“包含”。除非上下文另有指明，否则具体旨在本文所描述的发明的各种特征可以以任何组合使用。
此外，本发明还预期在本发明的一些实施方式中，可以排除或省略本文中阐述的任何特征或特征的组合。
实施例
材料和方法
将DNA制剂转染到H9C2(大鼠BDIX心脏成肌细胞系，可从ATCC获得)、C2C12(永生化的小鼠成肌细胞系，可从ATCC获得)或H2K 2B4(永生化卫星细胞衍生的细胞系，参见PLoSOne.2011；6(9):e24826)中，以评估转录活性。
H9C2细胞培养和转染
H9C2是大鼠BDIX心脏成肌细胞系(大鼠心肌细胞)。它们具有骨骼肌特性，例如汇合处形成的肌管对乙酰胆碱应答。
H9C2细胞维持：将H9C2细胞在T-75烧瓶中在具有1％FBS(热灭活的-Gibco 10270-106，批号42G2076K)、1％Glutamax(35050-038，Gibco)、1％青霉素-链霉素溶液(15140-122，Gibco)的DMEM(高葡萄糖，D6546，Sigma)中培养。细胞在亚汇合阶段(70％-80％)传代以避免细胞汇合和融合形成肌管的风险。
为了在细胞维持期间进行传代，去除培养基，用不含CaCl2、不含MgCl2(14190-094，Gibco)的5mL DPBS洗涤细胞两次。通过用1mL胰蛋白酶EDTA(25200-056，Gibco)孵育大约5分钟，将细胞从烧瓶中分离出来。然后，将4mL培养基加入烧瓶，并轻轻地将混合物上下移液，以帮助细胞从烧瓶表面分离。将细胞以100g沉淀3分钟。处理上清液并将细胞重悬于3mL培养基中。将细胞在Countess自动细胞计数器上计数，以1:3至1:10接种，即每平方厘米接种1-3×10,000个细胞，并在37℃、5％CO2下孵育。
H9C2细胞转染和分化：如上所述，通过用DPBS洗涤、使用1mL胰蛋白酶EDTA从烧瓶分离、用4mL培养基清洗烧瓶表面并以100g沉淀3分钟，从约70％-80％汇合度的两个T-75烧瓶中收集H9C2细胞。将细胞重新悬浮在45mL培养基中，并以每孔40,000个细胞的密度接种在48孔平底板(每孔300μL)(353230，Corning)中。将48孔板中的细胞在37℃、5％CO2下孵育。
二十四小时后，将细胞上的培养基更换为300μL无抗生素培养基(即，具有1％FBS(热灭活的-Gibco 10270-106，批号42G2076K)、1％Glutamax(35050-038,Gibco)的DMEM(高葡萄糖,D6546,Sigma))。每孔的300ng DNA以每孔30μL的总复合物体积用viafect(E4981，Promega)转染。转染后将板轻轻混合，并在37℃、5％CO2下孵育。
二十四小时后，从经转染的细胞中去除培养基并替换为300μL分化培养基，所述分化培养基由DMEM(高葡萄糖，D6546，Sigma)、1％Glutamax(35050-038，Gibco)、1％FBS(热灭活的-Gibco10270-106，批号42G2076K)、1％青霉素/链霉素溶液(15140-122，Gibco)和0.1％维甲酸(Sigma-R2625)组成。将板在37℃、5％CO2下孵育7天以诱导分化。分化后，观察细胞形态以确认分化成肌管。
然后用500μL DPBS洗涤细胞，并用100μL荧光素酶细胞培养裂解5×试剂(E1531，Promega)进行裂解，所述试剂使用Milli-Q水稀释至1×。将细胞裂解试剂上下移液十次，然后将板以中等功率涡旋振荡30分钟以促进细胞裂解。在完成荧光素酶测定之前，将板密封并储存在-80℃下。在H9C2细胞的转染后从荧光素酶测定中收集的所有数据均基于三个技术重复和三个生物学重复。
H2K 2B4(H2K)细胞培养和转染
H2K细胞维持：H2K细胞是小鼠骨骼肌细胞，并在T-75烧瓶中在DMEM(高葡萄糖，D6546，Sigma)中进行培养，所述DMEM具有20％FBS(热灭活的-Gibco 10500-064，批号08Q2771K)、1％Glutamax(35050-038，Gibco)、1％青霉素-链霉素溶液(15140-122，Gibco)、0.5％鸡胚提取物(MD-OO4E-UK，LSP，批号A20418)、0.2％小鼠IFN-γ(315-05，Peprotech，批号061798C2918)。当细胞达到4-6.7×104个细胞/cm2的汇合度时，细胞每3-4天传代一次。为了传代，除去培养基，用不含CaCl2、不含MgCl2(14190-094，Gibco)的5mL DPBS洗涤细胞两次，并使用1mL胰蛋白酶EDTA(25200-056，Gibco)将细胞从烧瓶中分离出来。将细胞用胰蛋白酶EDTA孵育大约2分钟，然后将4mL培养基添加到烧瓶中并轻轻上下移液以从烧瓶表面清洗细胞。细胞以100g沉淀3分钟。处理上清液并将细胞重悬于6mL培养基中。将细胞在Countess自动细胞计数器上计数，以4000、2700、2000或1300个细胞/cm2的4种密度接种，并在33℃、10％CO2下孵育。
H2K细胞转染和分化：从约20％-40％汇合度的三个T-75烧瓶中收集H2K细胞，通过用DPBS洗涤，使用1mL胰蛋白酶EDTA从烧瓶分离约2分钟，用4mL培养基清洗烧瓶表面并以100g沉淀3分钟。将细胞以8000个细胞/100μL培养基的密度重悬于45mL培养基中。然后使用BioFill Solo试剂分配器(Brooks Automation Ltd，目录号34-1000)将100μL细胞悬浮液分配到96孔Matrigel包被的板(Corning，参考号354234，批号8085009)的每个孔中。将96孔板中的细胞在33℃、10％CO2下孵育。
二十四小时后，将细胞上的培养基替换为100μL不含抗生素的培养基(即，具有20％FBS(热灭活的-Gibco 10500-064，批号08Q2771K)、1％Glutamax(35050-038，Gibco)、0.5％鸡胚提取物(MD-OO4E-UK，LSP，批号A20418)、0.2％小鼠IFN-γ(315-05，Peprotech，批号061798C2918)的DMEM(高葡萄糖，D6546，Sigma))。将每孔150ng DNA用0.3μLLipofectamine 3000以每孔10μL的总复合物体积进行转染。转染后将板轻轻混合，并在33℃、10％CO2下孵育。24小时后，从经转染的细胞中取出培养基并替换为200μL分化培养基，所述分化培养基由DMEM(高葡萄糖，D6546，Sigma)、0.1％Glutamax(35050-038，Gibco)、0.2％马血清(GIBCO，参考16050-122，批号1671317)、0.02％鸡胚提取物(MD-OO4E-UK，LSP，批号A20418)、0.1％青霉素/链霉素溶液(15140-122，Gibco)组成。在37℃、5％CO2下孵育板72小时以诱导分化。分化后，观察细胞形态以确认分化成肌管。然后用250μL DPBS洗涤细胞，接着用50μL荧光素酶细胞培养裂解5×试剂(E1531，Promega)进行裂解，所述试剂使用Milli-Q水稀释至1×。将细胞裂解试剂上下移液十次，然后将板以中等功率涡旋振荡10分钟以促进细胞裂解。在完成荧光素酶测定之前，将板密封并储存在-80℃下。
荧光素酶测定制备
将含有裂解细胞的96孔板在室温下解冻，以中等功率涡旋10分钟并以2250g离心1分钟。将10μL裂解液从每个孔中转移到白色微孔板FluoroNunc96孔平底中(FisherScientific，10346331)。如下所述，荧光素酶读数是在BMG Labtech FLUOstar Omega读板器上使用LAR(Promega，目录号E4550)注射产生。在H2K细胞的转染后从荧光素酶测定中收集的所有数据均基于四个技术重复和三个生物学重复。
C2C12细胞培养和转染
C2C12细胞维持：将C2C12细胞在T-75烧瓶中在DMEM(高葡萄糖，D6546，Sigma)中进行培养，所述DMEM具有10％FBS(热灭活的-Gibco 10500-064)、1％Glutamax(35050-038，Gibco)、1％青霉素-链霉素溶液(15140-122，Gibco)。将细胞每2-3天用新鲜培养基喂养一次，并在它们达到70％汇合度时传代。为了传代，去除培养基，用不含CaCl2、不含MgCl2(14190-094，Gibco)的5mL DPBS洗涤细胞两次，并使用1mL胰蛋白酶EDTA(25200-056，Gibco)将细胞从烧瓶(T-75)中分离出来。将细胞在37℃(在CO2培养箱中)下孵育3至5分钟，直到在显微镜下确定细胞分离。向烧瓶中加入4mL完全培养基以灭活胰蛋白酶，并将细胞悬液转移至15mL试管。细胞以250g沉淀3分钟。去除上清液并将细胞重悬于6mL培养基中。将细胞在Countess自动细胞计数器上计数，按1:10稀释接种，并在37℃、5％CO2下孵育。
C2C12细胞转染和分化：一旦C2C12细胞达到80％汇合度后，通过用DPBS洗涤从T-75烧瓶中收集C2C12细胞，使用1mL胰蛋白酶EDTA从烧瓶分离约3-5分钟，用4mL培养基清洗烧瓶表面，并以250g沉淀3分钟。根据传代数以特定密度重悬细胞(详见表12)。
表12
Figure BDA0004161819920003011
Figure BDA0004161819920003021
然后将300μl适当的细胞悬浮液(基于传代数)分配到48孔板的每个孔中。将48孔板中的细胞在37℃、5％CO2下孵育。
二十四小时后，将细胞上的培养基替换为含有DMEM(高葡萄糖，D6546，Sigma)和1％Glutamax的300μL预热转染培养基。用0.9μL Viafect(E4981，Promega)以每孔30μL的总复合物体积转染300ng DNA。转染后将板轻轻混合，并在37℃、5％CO2下孵育。
二十四小时后，从经转染的细胞中去除培养基并替换为由DMEM(高葡萄糖，无丙酮酸钠，11960-044，Gibco)、1％Glutamax、2％马血清(热灭活的，16050-122，Gibco)组成的分化培养基。将板在37℃、5％CO2下再孵育5.5天以诱导分化。分化后，观察细胞形态以确认分化成肌管。然后用300μl DPBS洗涤细胞，接着用100μL荧光素酶细胞培养裂解5×试剂(E1531，Promega)进行裂解，所述试剂使用Milli-Q水稀释至1×。在完成荧光素酶测定之前，将板密封并储存在-80℃下。
C2C12荧光素酶测定制备：将含有经裂解的细胞的48孔板在室温下解冻，以中等功率涡旋10分钟并离心1分钟(2250xg)。将10μL裂解液从每个孔转移到白色微孔板FluoroNunc 96孔平底中(Fisher Scientific，10346331)。如下所述，在BMG LabtechFLUOstar Omega读板器上使用LAR(Promega，目录号E4550)注射产生荧光素酶读数。在C2C12细胞的转染后从荧光素酶测定中收集的所有数据均基于三个技术重复和三个生物学重复。
荧光素酶活性的测量
使用LARII(双重荧光素酶报告子1000测定系统，Promega，E1980)测量荧光素酶活性。转染后24小时，从细胞中去除培养基。将细胞在300μL DPBS中洗涤一次。使用100μL被动裂解缓冲液裂解细胞，并摇动孵育15分钟。通过在台式离心机中以最大速度离心板1分钟来沉淀细胞碎片。根据制造说明，将10μL样品转移到白色96孔板中，并通过在BMG LabtechFLUOstar Omega读板器上注入50μL的LARII底物来测量发光。
示例性的制剂药物组合物：
在本发明的各个方面，药物组合物在如下中包含重组AAV载体，所述载体包含rAAV-I1c(例如AAV2i8sc.CMV.I1c)：10mM磷酸盐pH 7.4、200mM NaCl、5mM KCl、1％(w/v)甘露醇、0.0005％(w/v)
Figure BDA0004161819920003031
CA 720(聚氧乙烯(12)异辛基苯基醚)，至填充体积为5mL。在一些实施方式中，填充体积为1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL或10mL。
在本发明的一个方面，药物组合物在如下中包含重组AAV载体，所述载体包含rAAV-I1c(例如AAV2i8sc.CMV.I1c)：20mM磷酸盐pH 7.4、300mM NaCl、3mM KCl、3％(w/v)甘露醇、0.001％(w/v)Brij S20，至填充体积为5mL。在一些实施方式中，填充体积为1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL或10mL。
在本发明的多个方面，药物组合物在如下中包含重组AAV载体，所述重组AAV载体包含rAAV-I1c(例如AAV2i8sc.CMV.I1c)：20mM磷酸盐pH 7.4、300mM NaCl、3mM KCl、3％(w/v)山梨糖醇、0.001％(w/v)Ecosurf SA-15，至填充体积为5ml。在一些实施方式中，填充体积为1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL或10mL。
在本发明的各个方面，药物组合物在如下中包含重组AAV载体，所述载体包含rAAV-I1c(例如AAV2i8sc.CMV.I1c)：10mM磷酸盐pH 7.4、350mM NaCl、2.7mM KCl、5％(w/v)山梨糖醇、0.001％(w/v)泊洛沙姆188，至填充体积为5mL。在一些实施方式中，填充体积为1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL或10mL。
在本文提供的本发明的多个方面，药物组合物在如下中包含重组AAV载体，所述载体包含rAAV-I1c(例如AAV2i8sc.CMV.I1c)：15mM磷酸盐pH 7.4、375mM NaCl、3.5mM KCl、5％(w/v)山梨糖醇、0.0005％(w/v)Tergitol NP-10，至填充体积为5mL。在一些实施方式中，填充体积为1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL或10mL。
在本发明的一个方面，药物组合物在如下中包含重组AAV载体，所述载体包含rAAV-I1c(例如AAV2i8sc.CMV.I1c)，15mM磷酸盐pH 7.4、375mM NaCl、3.5mM KCl、3％(w/v)甘油、0.0005％(w/v)吐温80，至填充体积为5mL。在一些实施方式中，填充体积为1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL或10mL。
实施例1
肌肉特异性启动子的体内评估：创建包含驱动荧光素酶基因的SP0067或对照启动子CBA、CK8的表达盒，并通过高效液相色谱法(HPLC)纯化包含这些表达盒的rAAV2/9载体。将rAAV在0.9％盐水中稀释，并通过尾静脉以1e+12vg/小鼠的剂量以200μL/小鼠输送到8只8周龄的雄性Balb/c(野生型)小鼠中。6周后处死小鼠，收集膈(骨骼肌)、心脏(心肌)、肠(骨骼肌)、肾脏(特异性对照组织)、肝脏(特异性对照组织)、肺(特异性对照组织)、四头肌(骨骼肌)、脾脏(特异性对照组织)和胫骨前肌(骨骼肌)，并分成3部分。解剖后立即将样品快速冷冻在液氮中，并储存在-80℃下。通过蛋白质定量(使用BCA Pierce蛋白质测定试剂盒；Promega 23225)和荧光素酶定量(使用ONE-Glo荧光素酶测定系统；Promega E6120)创建膈、心脏、肠、肝脏、四头肌和胫骨前肌(TA)的读数。将RLU值计算为pg/mg提取的蛋白质。
图1-图3显示出心脏特异性启动子SP0067在心脏中在体内活化，但在骨骼肌(膈、四头肌、胫骨前肌、肠)中在体内不是很活跃。虽然在该实施方式中，SP0067在心肌中的活性低于CBA和CK8.内含子(CK8.intron)对照启动子，但与这些通用对照启动子不同，与骨骼肌相比，SP0067对体内心肌而言是高度特异性的。SP0067在肝脏中在体内也具有一些活性。图4A-图4B显示出来自与SP0067和其他合成的心脏特异性启动子可操作地连接的rAAV2/9的荧光素酶在心脏肌管和骨骼肌肌管中的体外表达。
将H9C2细胞用于评估在心肌和骨骼肌中活化的示例性肌肉特异性启动子的缩短的核酸序列的体外活性。图8显示出与CBA和CK8对照启动子相比，合成的短的肌肉特异性启动子SP0521和SP4169在分化成心脏肌管的肌肉细胞系H9C2中的体外活性。图8显示出合成的启动子SP0521和SP4169在肌肉细胞系H9C2中表现出良好的活性。在心肌和骨骼肌中活化的额外的肌肉特异性启动子SP0502、SP0515、SP0522、SP0523和SP524也在H9C2细胞系中进行了实验测试，但显示出较低的活性(数据未显示)。
实施例2
体内测试
创建了包含驱动荧光素酶基因的SP0173、SP0270、SP0268、SP0320、SP0134、SP0279、SP0057、SP0229、SP0310、SP0067和SP0267或对照启动子CBA和CK8中的每一个的表达盒，并且包含这些表达盒的AAV2/9通过高效液相色谱法(HPLC)进行纯化。将AAV在0.9％盐水中稀释，并通过尾静脉以1e+12vg/小鼠的剂量以200μL/小鼠递送到8只8周龄的雄性Balb/c(野生型)小鼠中。6周后处死小鼠，并收集膈(骨骼肌)、心脏(心肌)、肠(骨骼肌)、肾脏(特异性对照组织)、肝脏(特异性对照组织)、肺(特异性对照组织)、四头肌(骨骼肌)、脾脏(特异性对照组织)和胫骨前肌(骨骼肌)，并分成3部分。解剖后立即将样品快速冷冻在液氮中，并储存在-80℃下。通过蛋白质定量(使用BCA Pierce蛋白质测定试剂盒；Promega23225)和荧光素酶定量(使用ONE-Glo荧光素酶测定系统；Promega E6120)创建膈、心脏、肠、肝脏、四头肌和胫骨前肌的读数。将RLU值计算为pg/mL。
图5A-图5F中的x轴是对数刻度。为了以对数刻度(log10)绘制数据，在转换为对数刻度之前，将经归一化的RLU值乘以109。x轴代表经归一化的RLU值的log10乘以109。图1、图2和图6A-图6F中的x轴代表RLU值(pg/mL)。
如图6A-图6F所示，在体内测试的合成的启动子在心脏、膈、四头肌和胫骨前肌中的活性比在肝脏和肠中的活性高得多。
一些启动子如SP0270和SP0268(图6B和图6C)在骨骼肌(膈和胫骨前肌)中的活性比在心肌(心脏)中的活性高。其他启动子如SP0057、SP0229和SP0067(图6G、图6H和图6I)在心肌(心脏)中的活性比在骨骼肌(膈和胫骨前肌)中的活性高。
图1和图6I显示出心肌特异性启动子SP0067在骨骼肌(膈、四头肌、胫骨前肌、肠)中不活化，但在心脏中活化。SP0067在心肌中的活性低于对照启动子CBA和CK8，但与这些通用对照启动子不同，与骨骼肌相比，它对心肌具有高度特异性。SP0067在肝脏中也具有一些活性。
实施例3
心脏特异性启动子的体内评估：
如实施例2中所公开的，创建包含驱动荧光素酶基因的心脏特异性启动子SP0067、SP0451、SP0452、SP0430、SP0450、SP0429、SP0424、SP0435、SP0436、SP0433、SP0449、SP0344、SP0475的每一个或对照启动子(CK8--作为肌肉启动子对照；或心脏特异性启动子对照1(SEQ ID NO：288)和对照2(SEQ ID NO：289)，作为心脏特异性阳性对照的启动子)的表达盒，并产生包含这些表达盒的AAV2/9。心脏特异性对照启动子1和2先前已在Bezzerides等,“Gene therapy for catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia byinhibition of Ca2+/calmodulin-dependent kinase II”Circulation 140.5(2019)：405-419中进行了描述。将rAAV通过碘克沙醇梯度纯化。对小鼠施用实施例2中公开的rAAV，并在6周后处死小鼠，然后收集膈(骨骼肌)、心脏(心肌)、肝脏(特异性对照组织)、四头肌(骨骼肌)、比目鱼肌(慢肌)和胫骨前肌(骨骼肌)，并分为3部分。解剖后立即将样品快速冷冻在液氮中，并储存在-80℃下。通过蛋白质定量(使用BCA Pierce蛋白质测定试剂盒；Promega 23225)和荧光素酶定量(使用ONE-Glo荧光素酶测定系统；Promega E6120)创建膈、心脏、肝脏、四头肌和胫骨前肌的读数。将RLU值计算为提取的蛋白质的RLU/mg(图7A-图7M)。
如图7A-图7M所示，在体内测试的合成的启动子在心脏、膈、四头肌和胫骨前肌中的活性比在肝脏中的活性高得多。
一些心脏特异性启动子如SP0424(图7C)、SP0429(图7E)、SP0430(图7F)、SP0435(图7I)、SP0450(图7M)、SP0451(图7N))和SP0452(图7O)均在心脏中表现出特异性表达，而在其他肌肉组织中表达水平较低。启动子在肝脏中表现出显著低的表达，这使得使用包含这些启动子的rAAV具有肝脏去靶向作用。此外，这些具有除AAV2i8或BNP116之外的任何AAV血清型的rAAV包含这些具有肝脏去靶向作用的心脏特异性启动子，可用于重复施用，其中，将AAV2i8用于一次施用，并且具有除AAV2i8或BNP116之外的任何AAV血清型的rAAV包含这些心脏特异性启动子，可用于其他施用。
对照1(图7H)和对照2(图7K)心脏特异性启动子先前公开于Bezzerides等,“Genetherapy for catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia byinhibition of Ca2+/calmodulin-dependent kinase II”Circulation 140.5(2019):405-419中，并在本研究中与CK8对照一起用作对照。
实施例4
rAAV载体制造：本文描述的是从Pro10/HEK293细胞制造rAAV病毒载体的方法，所述细胞已经被工程化以稳定表达I-1基因。
如美国专利号9,441,206中所述的，稳定细胞系Pro10/HEK293是AAV载体的大规模生产的理想选择。该细胞系可以与用于表达I-1基因的表达载体接触，所述I-1基因可操作地连接至心脏特异性启动子SP0067(SEQ ID NO：3)。使用本领域众所周知的方法选择具有整合到其基因组中的I-1表达的克隆群。I-1基因的表达通过蛋白质印迹得到证实。
用编码Rep2和血清型特异性Cap2的包装质粒转染稳定表达I-1的Pro10/HEK293细胞：AAV-Rep/Cap和Ad-Helper质粒(XX680：编码腺病毒辅助序列)。
转染。在转染当天，使用ViCell XR Viability Analyzer(Beckman Coulter)对细胞进行计数并稀释以进行转染。为了混合转染混合物，将以下试剂按此顺序添加到锥形管中：质粒DNA、
Figure BDA0004161819920003071
I(Gibco)或OptiPro SFM(Gibco)、或其它无血清的兼容的转染培养基，然后是处于与质粒DNA的特定比例的转染试剂。在室温下孵育前，将混合物倒置混合。将转染混合物移液入烧瓶中并放回摇床/培养箱中。所有优化研究均在30mL的培养体积下进行，然后在更大的培养体积下进行验证。转染48小时后收获细胞。
使用Wave生物反应器系统生产rAAV。Wave袋在转染前2天接种。接种所述Wave袋两天后，对细胞培养物进行计数，然后在该转染前扩增/稀释细胞培养物。然后转染wave生物反应器细胞培养物。至少转染48小时后，从wave生物反应器袋中收获细胞培养物。
滴度：使用针对标准曲线(AAV ITR特异性的)和I-1基因特异性的引物的qPCR在DNase消化后计算AAV滴度。
从摇瓶和60Wave生物反应器袋中收集悬浮细胞。转染48小时后，通过从摇瓶中倒出或从wave生物反应器袋中泵出，将细胞培养物收集到500mL聚丙烯锥形管(Corning)中。然后使用Sorvall RC3C plus离心机和H6000A转子将细胞培养物以655xg离心10分钟。丢弃上清液，并将细胞重悬在1×PBS中，转移到50mL锥形管，并以655xg离心10mM。此时，沉淀可以储存在NLT-60℃或继续纯化。
使用qPCR滴定来自细胞裂解物的rAAV。取出10mL细胞培养物并使用Sorvall RC3Cplus离心机和H6000A转子以655xg离心10分钟。从细胞沉淀中倒出上清液。然后将细胞沉淀重悬于5mL DNase缓冲液(5mM CaCl2、5mM MgCl2、50mM Tris-HCl pH 8.0)中，随后进行超声处理以有效裂解细胞。然后取出300μL并放入1.5mL微量离心管中。然后将140单位的DNaseI加入到每个样品中并在37℃下孵育1小时。为确定DNase消化的有效性，将4-5mg的I-1质粒掺入到添加或未添加DNase的未转染的细胞裂解物中。将50μL的EDTA/Sarkosyl溶液(6.3％sarkosyl，62.5mM EDTA pH 8.0)加入到每个试管中并在70℃下孵育20分钟。然后加入50μL蛋白酶K(10mg/mL)并在55℃下孵育至少2小时。将样品煮沸15分钟以使蛋白酶K失活。从每个样品中取出等分试样以通过qPCR进行分析。为了有效地确定每个细胞产生多少rAAV载体，进行了两个qPCR反应。一个qPCR反应是使用一组引物2s建立的，所述引物2s被设计为结合至质粒XX680、pXR2和I-1主链上的同源序列。第二个qPCR反应是使用一组引物建立的，以结合和扩增I-1基因内的区域。使用来自30Roche的Sybr green试剂和Light cycler 480进行qPCR。将样品在95℃下变性10分钟，然后进行45个循环(90℃持续10秒、62℃持续10秒和72℃持续10秒)和熔融曲线(1个循环99℃持续30秒，65℃持续1分钟)。
从粗裂解物中纯化rAAV。将每个细胞沉淀调整至最终体积10mL。将沉淀物短暂涡旋并以30％的产率超声处理4分钟(一秒开启，一秒关闭)。超声处理后，加入550U DNase并在37℃下孵育45分钟。然后使用Sorvall RCSB离心机和HS-4转子以9400xg对沉淀物进行离心以沉淀细胞碎片，并将澄清的裂解物转移到Type70Ti离心管(Beckman361625)。对于分离rAAV的悬浮HEK293细胞的收获和裂解，本领域的技术人员可以使用机械方法如微射流或化学方法如去污剂等，然后使用深度过滤或切向流过滤的澄清步骤(TFF)。
AAV载体纯化。将经澄清的AAV裂解物通过柱层析法进行纯化，所述柱层析法如本领域技术人员所知的以及描述于以下手稿(Allay等，Davidoff等，Kaludov等，Zolotukhin等，Zolotukin等，等)中的，通过引用的方式将其整体并入本文。
实施例5
表达I-1c的rAAV治疗人类中的心力衰竭的疗效：
本文的实施例5中描述了根据本文公开的方法将表达I-1c基因的rAAV病毒载体施用至人类患者以治疗心力衰竭的方法。实施例5显示了对患有心力衰竭(非缺血性心肌病)的人类患者施用AAV2i8.sc-CMV.I1c的结果，所述AAV2i8.sc-CMV.I1c由SEQ ID NO：441的质粒产生(本实施例和其它实施例中的AAV2i8sc是指具有自身互补基因组的AAv2i8)。实施例5中使用的AAV载体AAV2i8.sc-CMV.I1c仅使用示例性rAAV，并且本文公开的任何rAAV均可用于本文公开的治疗心力衰竭的方法中。例如，本领域的普通技术人员可以容易地将实施例5中使用的AAV2i8.sc-CMV.I1c中的CMV启动子替换为心脏特异性启动子，例如，任何心脏特异性启动子，或在表2A或5A中公开的在心肌中活化的肌肉特异性启动子，或如图7B-图7O所示。类似地，实施例5中使用的AAV2i8.sc-CMV.I1c可以被很容易地替换为包含经密码子优化的编码I-1c的核酸序列的rAAV，例如但不限于SEQ ID NO：385-412的核酸序列。类似地，实施例5中使用的AAV2i8.sc-CMV.I1c可被容易地替换为包含核酸的rAAV，所述核酸包含经密码子优化的编码I-1c的核酸序列，例如但不限于SEQ ID NO：385-412的核酸序列；并且所述核酸进一步包含poly A，例如HGH poly A或SV40 poly A和来自α2珠蛋白基因的RNA聚合酶II转录暂停信号。类似地，实施例5中使用的AAV2i8.sc-CMV.I1c可被容易地替换为包含SEQ ID NO：413-440的核酸序列或其经修饰的版本的rAAV。缺乏细菌序列并包含实施例5中使用的AAV2i8.sc-CMV.I1c的rAAV可以从SEQ ID NO：357-384的任何线性双链体DNA制造。
具有症状性充血性心力衰竭的7名患者接受了AAV2i8.sc-CMV.I1c的输注，其中rAAV载体是AAV2i8，并且其在CMV启动子下表达I-1c蛋白(具有T35D修饰的氨基酸1-65)。对具有NYHA III级心力衰竭的7名患者施用AAV2i8.sc-CMV.I1c的单次冠状动脉内输注，其中施用作为选自如下的总剂量的单次施用发生：(i)3×1013vg(n＝3)，(ii)1×1014vg(n＝4)。该研究中的所有患者都患有非缺血性心肌病。总剂量以一系列的5个子剂量施用至患者，每个子剂量从单独的注射器施用，并且其中在约25-30分钟的时间段内将5个子剂量施用至受试者。在这种情况下，将总的rAAV剂量稀释在50mL盐水中，并在5个注射器中作为5个子剂量施用，每个注射器中的容积为10mL。五个注射器中的每一个注射器在约5分钟的时间段内进行施用，一个注射器接着另一个注射器，伴随着经常性的停止以使用造影剂注射检查导管在每个冠状动脉中的位置。随访所有患者直至治疗干预12个月后，然后每6个月通过半结构化电话问卷进行长期随访，持续另外的24个月(+/-30天)。在rAAV施用前约25分钟，患者同时服用血管扩张剂，例如硝酸甘油。
在施用前(即筛查时)和施用后4周(+/-3天)、6个月和12个月后，使用各种生理评估和临床参数对患者进行评估。例如，评估了LVEF、LVEVD、LVEDVI、VLESV、LVEVI、SpI和GLS的超声心动图评估和二尖瓣反流程度，以及血清NT-proBNP水平，以及所评估的次级效应以确定AAV2i8.sc-CMV.I1c rAAV载体的施用的功效。次级效应包括例如但不限于：(i)通过心肺运动测试评估的峰值VO2，(ii)6分钟步行测试(6MWT)，(iii)纽约心脏协会(NYHA)分级，(iv)出院总生存天数(以及出院总天数占研究干预后总生存天数的％)，(v)与基线相比，6个月和12个月时的生活质量，(vi)由明尼苏达心力衰竭生活质量问卷(MLWHFQ)评估的健康相关生活质量。在12个月和长期随访期间(直到干预后第36个月)还评估了患者是否需要心脏移植或左心室辅助装置(LVAD)植入。下面讨论了这些临床参数中的每一个：
NYHA：NYHA等级是临床医生评估的患者功能状态的量度，并且
由于其简单性和预后价值，广泛用于临床试验。
LVEF：LVEF指示出心脏收缩功能并且测量为每次收缩时泵出左心室的血量的百分比。EF的降低与心脏重构有关。治疗引起的LVEF变化可能预示着对死亡率的影响。从基线到第12个月，每位患者的LVEF都有改善。患者1的绝对百分比增加为+10.5％，患者2为+22％，并且患者3为+6％。在一些患者中，LVEF的改善与左心室收缩末期容积和左心室舒张末期容积的减少有关。此外，注意到，从筛查的时间到第12个月，所有患者的左心室壁运动异常都有改善。
6MW测试：6MWT是用于评估次最大运动能力的标准方法，并且被定义为在6分钟内步行的以米计的距离。6MWT被认为是生活质量的替代指标，并且其表现与随后的临床结果密切相关。
VO2Max：最大运动期间测量的心肺测试和峰值VO2测量值已经用于评估有氧能力、确立心力衰竭患者的预后以及评估各种干预形式的益处。最近，与基线相比，EXPLORER-HCM试验在第30周使用主要复合功能终点，评估了Mavacamten在患有梗阻性心肌病患者中的功效，所述基线被定义为：(1)峰值耗氧量增加≥1.5mL/kg/min，并且减少至少一个纽约心脏协会级别；或(2)峰值耗氧量改善≥3.0mL/kg/min，且纽约心脏协会等级没有恶化。
MLWHFQ：生活质量最通常使用经过充分验证的问卷进行评估，例如明尼苏达心力衰竭生活质量问卷(MLWHFQ)，其已被示出比临床医生评估的症状更具可重复性。
BNP：诸如脑利尿钠肽(BNP)和NTpro-BNP的生物标志物已被用作心力衰竭患者的纳入标准并追踪HF患者中的治疗效果。一些患者的BNP水平到第12个月时从基线有所下降(-38和-60)，表明了改善。
评估了主要结果测量值，包括峰值VO2和LVEF水平的变化。为确定峰值VO2变化，将在施用后6个月和12个月测量的峰值VO2与施用前或施用时的峰值VO2相比(即，与基线相比)，所述峰值VO2通过使用改良的Bruce方案的心肺运动测试来确定。评估的其他主要结果测量值是，与施用前或施用时测量的LVEF(例如，基线LVEF水平)相比，在施用或筛查时、施用后18-24小时、施用后4周、6个月和12个月时测量的左心室射血分数(LVEF)的超声心动图评估的变化。
还评估了次要结果测量值，其包括与在施用时或施用前测量的6MWT的结果相比(即与基线相比)，施用后6个月和12个月测量的6MWT(6分钟步行测试)的结果的变化。还确定了与正常受试者相比，心力衰竭受试者中预测的百分比分析的次要结果测量值。
表19A显示了接受3×1013vg表达I-1c(n＝3)的rAAV的患者使用NYHA分类的临床改善结果，其中NYHA分类系统在施用后1个月、2个月、3个月、6个月、9个月和12个月时进行评估。
Figure BDA0004161819920003121
表19B显示了接受1×1014vg表达I-1c(n＝3)的rAAV的患者使用NYHA分类的临床改善结果，其中NYHA分类系统在施用后1个月、2个月、3个月和6个月时进行评估。
Figure BDA0004161819920003131
结果(参见表19A)显示出具有NYHA分类系统的至少一个级别的患者(接受3×1013vg rAAV)的改善的分类，并且在一些情况下，受试者在6个月内改进了NYHA分类的两个级别。例如，2号患者在6个月内从III级改善到II级，并且3号患者在6个月内从III级改善到I级，表明在施用的6个月内的NYHA分类系统中的两个级别的出乎预料且显著的改善。换句话说，3号患者在施用编码I-1c的rAAV后13个月内在NYHA分类系统中具有2级下降。类似于3×1013剂量，接受1×1014vg rAAV的患者(表19B)也显示出NYHA分类的改善，例如，如3个月和6个月时NYHA分类值所示出的，患者11改善了一级。
也在筛查时和多次施用后(例如，施用后1个月、2个月、3个月、6个月、9个月和12个月)评估了射血分数(EF％)，并且结果如表19A-表19B所示。大多数经治疗的患者的EF增加5％或大于5％，例如，3号和5号患者在施用3×1013vg表达I-1c的rAAV后，在6个月内，EF％分别从基线时的27％增加到高达41％、从基线时的29％增加到高达41％。
其它参数的汇总结果：
在6分钟步行测试(6MWT)中，所有患者的6分钟步行距离(6MWD)在12个月内增加了至少50米，并且一些患者在6个月内增加了50米。关于MWHF问卷，所有患者均显示在12个月内下降了多于10分。所有患者在12个月内pVO2max或MVO2增加1.5mL/kg/min或更多。
各项功能测试的临床意义变化如表19C所示。表19C显示出向患者施用AAV2i8.sc-CMV.I1c rAAV达到了一个或多个终点。
参数 相对于基线的变化
左心室射血分数 增加≥5％
左心室收缩末期容积 >20mL或减少10％
纽约心脏协会分级 减少1级
生活质量(明尼苏达心力衰竭生活质量问卷) 减少10分
6分钟步行测试 增加50米
BNP(pg/mL) 减少40％
NT-pro-BNP(pg/mL) 减少35％
MVO2 增加1.5mL/kg/min
因此，结果显示出，与施用前在患者中测量的临床参数(例如血清NT-proBNP的变化、峰值VO2的变化、LVEF变化)相比，在以单次施用选自(i)3×1013vg(n＝3)、(ii)1×1014vg(n＝4)的总剂量来施用AAV2i8.sc-CMV.I1c的患者中，临床参数(例如血清NT-proBNP降低、峰值VO2增加(数据未显示)、LVEF增加等)得到改善。
在猪的研究(数据未显示)中，与用两个注射器在10分钟的时间段内施用相同总剂量的AAV2i8.sc-CMV.I1c rAAV载体(其中每个注射器具有10mL盐水)时相比，当用5个注射器在约25分钟的时间段内施用总剂量的AAV2i8.sc-CMV.I1c rAAV载体(其中每个注射器有10ml生理盐水)时，观察到rAAV在猪心脏中的转导增强。
基于在施用AAV2i8.sc-CMV.I1c后6个月或12个月时检测到的本实施例中的非缺血性心肌病患者的HF临床参数的显著改善(其中患者表现出临床参数的显著改善，如改善的NYHA分级、增加的EF％、增加的6MWT步行距离、增加的峰值VO2(pVO2或MVO2)、增加的LVEF(或EF)、改善的MWHFQ(或KCCQ)评分等)，预期患有因一系列原因或疾病引起的非缺血性心肌病的患者在施用后至少12个月也将具有类似的HR临床参数改善，包括因感染导致心肌炎症的非缺血性心肌病患者(例如由各种病毒引起的感染，可能包括以前感染过SARS-Cov2的患者，或具有COVID-19感染、细菌感染和其它寄生虫的受试者)、非感染性炎症(例如归因于自身免疫性疾病、围产期心肌病、超敏反应或移植排斥反应的那些)、引起心肌炎的代谢紊乱(包括营养、内分泌和电解质异常)和引起心肌炎的对有毒物质(包括酒精、以及某些化疗药物和儿茶酚胺)的暴露。因此，实施例5证明本文公开的方法可用于治疗患有疾病原因仍然未知的HF的受试者，并因此可用于治疗患有“特发性扩张型心肌病”(或“IDCM”)的患者。
实施例6
患有非缺血性遗传性心肌病的人类受试者的体内治疗。
实施例5中描述的是患有归因于非缺血性心肌病心力衰竭的受试者的治疗。本文的实施例6描述了根据本文公开的方法，将表达I-1c基因的rAAV病毒载体施用至人类患者以治疗遗传性心肌病病因和/或与基因突变相关的心肌病的方法。实施例6讨论了作为示例性rAAV的AAV2i8.sc-CMV.I1c的施用，其由SEQ ID NO：441的质粒产生。实施例6中讨论的rAAV载体AAV2i8.sc-CMV.I1c是示例性rAAV，并且如本文所公开的，本文公开的任何rAAV均可用于治疗归因于各种不同原因的各种非缺血性心肌病引起的心力衰竭的方法中。例如，本领域的普通技术人员可以容易地将实施例6中讨论的AAV2i8.sc-CMV.I1c中的CMV启动子替换为心脏特异性启动子，例如表2A或表5A中公开的或图7B-图7O中显示的任何心脏特异性启动子。类似地，实施例中讨论的AAV2i8.sc-CMV.I1c可以被容易地替换为包含经密码子优化的编码I-1c的核酸序列的rAAV，例如但不限于SEQ ID NO：385-412的核酸序列。类似地，实施例6中讨论的AAV2i8.sc-CMV.I1c可以被容易地替换为包含SEQ ID NO：413-440的核酸序列的rAAV或其经修饰的版本。缺乏细菌序列并包含实施例6中使用的AAV2i8.sc-CMV.I1c的rAAV可以从SEQ ID NO：357-384的任何线性双链体DNA制造，并用于治疗由于各种不同原因引起的各种非缺血性心肌病，包括治疗本实施例中讨论的具有受磷蛋白突变的患者的心肌病。
由于受磷蛋白(PLN)在钙稳态中的作用，受磷蛋白(PLN)的致病性突变引起遗传性心肌病。已经鉴定了多种PLN突变，其中R14del突变是荷兰最普遍的心肌病相关突变。PLN基因中的R14del突变存在于被诊断患有致心律失常性心肌病和扩张型心肌病的患者中。具有R14del突变的患者的特点是发病年龄大、心电图电压低和高频率的室性心律失常。此外，这些患者的预后较差，通常伴有左心室功能障碍和早发性心力衰竭(Hof等,Prevalence andcardiac phenotype of patients with a phospholamban mutation.Neth Heart J.2019年2月；27(2):64-69；Hof IE等,Prevalence and cardiac phenotype of patients witha phospholamban mutation.Neth Heart J.2019年2月；27(2):64-69)。
被鉴定为在PLN基因中具有R14del突变的人类患者可以施用如本文公开的AAV2i8.sc-CMV.I1c。例如，来自荷兰的患有致心律失常性心肌病和/或扩张型心肌病的患者和/或PLN基因中存在R14del突变的患者可以接受AAV2i8.sc-CMV.I1c的输注，其中rAAV载体是AAV2i8，并且在CMV启动子下表达I-1c蛋白(具有T35D修饰的氨基酸1-65)。AAV2i8.sc-CMV.I1c的单次冠状动脉内输注将被施用至具有至少NYHA III级心力衰竭的人类患者，其中施用可以作为总剂量的单次施用发生，所述总剂量选自以下的任何一种：3×1013vg、1×1014vg、3×1014vg、1×1015vg或1×1015vg。该研究中的所有患者都将被鉴定为在PLN基因中具有R14del突变，并且患有非缺血性心肌病。在一些患者中，总剂量将以一系列的5个子剂量施用，每个子剂量从单独的注射器施用，并且其中在约25-30分钟的时间段内将5个子剂量施用至受试者。在这种情况下，将总的rAAV剂量稀释在50mL盐水中，并在5个注射器中作为5个子剂量施用，每个注射器中的容积为10mL。五个注射器中的每一个注射器都将在大约5分钟的时间段内进行施用，一个注射器接着另一个注射器，伴随着经常性的停止以使用造影剂注射检查导管在每个冠状动脉中的位置。所有患者将被随访至治疗干预后12个月，然后每6个月通过半结构化电话问卷进行长期随访，持续另外的24个月(+/-30天)。
在施用前、以及施用后4周(+/-3天)、6个月和12个月后，将使用各种生理评估来评估患者。例如，可以评估LVEF、LVEVD、LVEDVI、VLESV、LVEVI、SpI和GLS的超声心动图评估和二尖瓣反流程度，以及血清NT-proBNP水平，以及所评估的次级效应以确定AAV2i8.sc-CMV.I1c rAAV载体的施用的功效。次级效应包括例如但不限于：(i)通过心肺运动测试评估的峰值VO2，(ii)6分钟步行测试(6MWT)，(iii)纽约心脏协会(NYHA)分级，(iv)出院总生存天数(以及出院总天数占研究干预后总生存天数的％)，(v)与基线相比，6个月和12个月时的生活质量，(vi)由明尼苏达心力衰竭生活质量问卷(MLWHFQ)评估的健康相关生活质量。还可以在12个月时和长期随访期间(直到干预后的第36个月)对患者进行评估，或者评估是否需要心脏移植或左心室辅助装置(LVAD)植入。
将评估主要结果测量值，包括峰值VO2和LVEF水平的变化。为确定峰值VO2变化，将在施用后6个月和12个月测量的峰值VO2与施用前或施用时的峰值VO2相比(即，与基线相比)，所述峰值VO2通过使用改良的Bruce方案的心肺运动测试确定。将要评估的其它主要结果测量值是，与在施用或筛查时测量的LVEF相比，左心室射血分数(LVEF)的超声心动图评估的变化或与施用前或施用时测量的LVEF(例如，基线LVEF水平)相比，施用后18-24小时、或施用后4周、6个月和12个月的变化。
还可以评估次要结果测量值，其包括与施用时或施用前测量的6MWT的结果相比(即，与基线相比)，在施用后6个月和12个月测量的6MWT(6分钟步行测试)的结果的变化。还确定了与正常受试者相比心力衰竭受试者中预测的百分比分析的次要结果测量值。
基于在施用AAV2i8.sc-CMV.Ilc后6个月或12个月时检测的实施例5中的非缺血性心肌病患者的HF临床参数的显著改善(例如，改善的临床参数，例如改善的NYHA分级、增加的EF％、增加的6MWT步行距离、降低的血清NT-pro BNP、增加的峰值VO2、增加的LVEF、改善的MWHF评分等)，预期患有非缺血性遗传性心肌病(包括由PLN基因中的R14del突变引起的非缺血性心肌病)的患者，在施用后至少12个月也将具有类似的HR临床参数的改善。因此，实施例5和实施例6表明本文公开的方法可用于治疗患有病因不明的HF的受试者，并因此可用于治疗患有由于具有心脏表现的遗传性疾患或家族性心肌病(例如本文公开的与进行性肌营养不良症、强直性肌营养不良症、Freidrich共济失调和遗传性扩张型心肌病等有关的)而导致的非缺血性心肌病的患者。
实施例7
患有缺血性心肌病的人类受试者的体内治疗。
实施例7中描述的是患有归因于缺血性心肌病的心力衰竭的受试者的治疗。这里实施例7描述了根据本文公开的方法，将表达I-1c基因的rAAV病毒载体施用至人类患者以治疗由缺血性心肌病引起的心力衰竭的方法。实施例7讨论了作为示例性rAAV的AAV2i8.sc-CMV.I1c的施用，其由SEQ ID NO：441的质粒产生。实施例7中讨论的rAAV载体AAV2i8.sc-CMV.I1c是示例性rAAV，并且如本文所公开的，本文公开的任何rAAV均可用于治疗归因于各种不同原因的各种非缺血性心肌病引起的心力衰竭的方法中。例如，本领域的普通技术人员可以容易地将实施例7中讨论的AAV2i8.sc-CMV.I1c中的CMV启动子替换为心脏特异性启动子，例如表2A或表5A中公开的或图7B-图7O中显示的任何心脏特异性启动子。类似地，实施例中讨论的AAV2i8.sc-CMV.I1c可以被很容易地替换为包含经密码子优化的编码I-1c的核酸序列的rAAV，例如但不限于SEQ ID NO：385-412的核酸序列。类似地，实施例7中讨论的AAV2i8.sc-CMV.I1c可以被容易地替换为包含SEQ ID NO：413-440的核酸序列的rAAV或其经修饰的版本。缺乏细菌序列并包含实施例5中使用的AAV2i8.sc-CMV.I1c的rAAV可以从SEQ ID NO：357-384的任何线性双链体DNA制造，并用于治疗如本实施例中讨论的缺血性心肌病。
被施用本文公开的AAV2i8.sc-CMV.I1c的所有患者在左心室壁运动异常方面均具有改善(如通过LVEF的改善所检测到的)。特别地，被施用如本文所公开的AAV2i8.sc-CMV.I1c的一名人类患者患有归因于壁运动左心室心脏异常的心力衰竭。在施用前和施用后1个月、2个月、3个月、6个月、9个月和12个月获取中心超声心动图读数，包括LVEF、LVEVD、LVEDVI、VLESV、LVEVI、SpI和GLS的超声心动图评估以及二尖瓣反流程度评估。超声心动图读数存在显著改善，并且尤其是LVEF存在显著改善。
基于在施用AAV2i8.sc-CMV.I1c后6个月或12个月时检测到的实施例5中的所有患者的LVEF的显著改善以及具有左心室壁运动异常的一名患者的LVEF的显著改善，预期患有缺血性心肌病的患者在施用后至少12个月，在LVEF和其它HR临床参数方面也将具有类似的改善。因此，实施例7表明本文公开的方法可用于患有缺血性心肌病的受试者的治疗，并因此可用于治疗患有缺血性心肌病的患者，包括在出现心力衰竭症状或CHF症状之前患有缺血性心肌病的患者。因此，预期患有缺血性心肌病的患者在施用后至少12个月，在HR临床参数方面也将有类似的改善，包括患有归因于心肌梗塞(MI)、梗塞、组织缺血、心肌缺血、动脉粥样硬化或冠状动脉疾病(CAD)的缺血性心肌病的患者。
就其而言，患有缺血性心肌病的患者可以接受AAV2i8.sc-CMV.I1c的输注，其中rAAV载体是AAV2i8，并且其在CMV启动子下表达I-1c蛋白(具有T35D修饰的氨基酸1-65)。AAV2i8.sc-CMV.I1c的单次冠状动脉内输注将被施用至具有至少NYHA III级心力衰竭的人类患者，其中施用可以作为总剂量的单次施用发生，所述总剂量选自以下的任何一种：3×1013vg、1×1014vg、3×1014vg、1×1015vg或1×1015vg。该研究中的所有患者都将被鉴定为患有缺血性心肌病。在一些患者中，总剂量将以一系列的5个子剂量施用，每个子剂量从单独的注射器施用，并且其中在约25-30分钟的时间段内将5个子剂量施用至受试者。在这种情况下，将总的rAAV剂量稀释在50mL盐水中，并在5个注射器中作为5个子剂量施用，每个注射器中的容积为10mL。五个注射器中的每一个注射器都将在大约5分钟的时间段内进行施用，一个注射器接着另一个注射器，伴随着经常性的停止以使用造影剂注射检查导管在每个冠状动脉中的位置。所有患者将被随访至治疗干预后12个月，然后每6个月通过半结构化电话问卷进行长期随访，持续另外的24个月(+/-30天)。在一些情况下，与向被鉴定为患有非缺血性心肌病的受试者施用的rAAV剂量相比，可以向受试者施用更大剂量的rAAV。在一些情况下，对患有缺血性心肌病的受试者施用rAAV将通过冠状动脉内注射或直接注射到心肌组织中，包括但不限于左心室的肌肉和/或心肌梗塞(MI)的位置。在一些情况下，还可以向受试者施用另外的治疗剂以增加流向梗塞区域的血流。
在施用前和施用后4周(+/-3天)、6个月和12个月后，将使用各种生理评估来评估患者。例如，可以评估LVEF、LVEVD、LVEDVI、VLESV、LVEVI、SpI和GLS的超声心动图评估和二尖瓣反流程度，以及血清NT-proBNP水平，以及所评估的次级效应以确定AAV2i8.sc-CMV.I1c rAAV载体的施用的功效。次级效应包括例如但不限于：(i)通过心肺运动测试评估的峰值VO2，(ii)6分钟步行测试(6MWT)，(iii)纽约心脏协会(NYHA)分级，(iv)出院总生存天数(以及出院总天数占研究干预后总生存天数的％)，(v)与基线相比，6个月和12个月时的生活质量，(vi)由明尼苏达心力衰竭生活质量问卷(MLWHFQ)评估的健康相关生活质量。还可以在12个月时和长期随访期间(直到干预后的第36个月)对患者进行评估，或评估是否需要心脏移植或左心室辅助装置(LVAD)植入。
将评估主要结果测量值，包括峰值VO2和LVEF水平的变化。为确定峰值VO2变化，将在施用后6个月和12个月测量的峰值VO2与施用前或施用时的峰值VO2相比(即，与基线相比)，所述峰值VO2通过使用改良的Bruce方案的心肺运动测试确定。将要评估的其它主要结果测量值是，与在施用或筛查时测量的LVEF相比，左心室射血分数(LVEF)的超声心动图评估的变化，或与施用前或施用时测量的LVEF(例如，基线LVEF水平)相比，施用后18-24小时、或使用后4周、6个月和12个月的变化。
还可以评估次要结果测量值，其包括与施用时或施用前测量的6MWT的结果相比(即，与基线相比)，在施用后6个月和12个月测量的6MWT(6分钟步行测试)的结果的变化。还确定了与正常受试者相比心力衰竭受试者中预测的百分比分析的次要结果测量值。
在向的，基于在患者(患有归因于低运动性左心室心脏异常的心力衰竭)中施用AAV2i8.sc-CMV.I1c后通过超声心动图评估确定的左心室射血分数(LVEF)的改善，预期患有缺血性心肌病的患者在施用后至少12个月也将具有改善的左心室射血分数(LVEF)。
参考文献
说明书和实施例中引用的所有参考文献均通过引用的方式将其整体并入。
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Claims (128)

1.一种治疗患有心力衰竭的患者的方法，包括：
向具有充血性心力衰竭(CHF)分类的患者的心脏细胞中施用至少一个总剂量的rAAV载体，所述载体包含编码抑制磷酸酶活性的磷酸酶抑制剂(I-1)蛋白的核酸序列，
其中，所述rAAV的至少一个剂量选自约1013vg至约1015vg的总剂量范围，并且
其中，施用后至少十二个月，所述充血性心力衰竭的分类有改善。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述分类基于以下所使用的分类系统：美国心脏协会(AHA)、美国心脏病学会(ACC)、明尼苏达心力衰竭生活质量问卷(MLHFQ)、堪萨斯城心肌病问卷(KCCQ)、或2016欧洲心脏病学会指南(ESCG)、日本心力衰竭学会(JHFS)指南、日本循环学会(JCS)指南、或纽约心脏协会(NYHA)。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，在施用所述rAAV后12个月，所述分类具有至少一个等级的改善。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中，在施用所述rAAV后6个月内，所述分类具有至少一个等级的改善。
5.如权利要求1所述的方法，其中，在施用后12个月，所述分类具有至少2个等级的改善。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述分类系统是NYHA，并且分类的等级选自于由以下所组成的组：I级、II级、III级和IV级。
7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述分类系统是美国心脏病学会/美国心脏协会(ACC/AHA)的补充分期系统，并且分类的等级选自于由以下所组成的组：A期、B期、C期、D期。
8.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述分类系统是KCCQ，并且分类的等级是KQQC总体汇总得分范围，所述得分范围选自于由以下所组成的组：KCCQ一般到优秀的分数为50到100，非常差到一般的分数为0到49，良好到优秀的分数为75到100，并且非常差到良好的分数为0到74。
9.一种治疗患有心肌病的患者的方法，包括：
向所述患者的心脏细胞中施用至少一个总剂量的rAAV载体，所述载体包含编码抑制磷酸酶活性的磷酸酶抑制剂(I-1)蛋白的核酸序列，
其中，所述rAAV的至少一个剂量选自约1013vg至约1015vg的总剂量范围，并且
其中，在施用后至少12个月，在所述患者中至少一个参数比基线水平有改善，其中所述至少一个参数选自基本上由以下所组成的组：
a.射血分数(EF)，
b.收缩末期容积(ESV)，
c.心脏收缩力，选自射血分数(EF)和短轴缩短率(FS)；
d.心脏容积，选自舒张末期容积(DV)和收缩末期容积(ESV)中的任一项，
e.功能性标准，选自6分钟步行测试(6MWT)、锻炼和VO2max中的任一项；
f.BNP水平，
g.Pro-BNP水平，
h.生物标志物水平，其中所述生物标志物水平选自肌钙蛋白、血清肌酐、胱抑素C或肝脏转氨酶的组，
i.患者报告的结果(PRO)，例如减少的症状、健康相关的生活质量(HRQOL)或患者感知的健康状况，以及
j.因心力衰竭导致的死亡风险、减少的因心力衰竭症状导致的住院治疗、或用于治疗心力衰竭的治疗性干预中的任一项的减少。
10.如权利要求9所述的方法，其中，在施用后至少12个月，具有至少2个参数的改善。
11.如权利要求10所述的方法，其中，在施用后至少12个月，具有至少3个参数的改善。
12.如权利要求11所述的方法，其中，在施用后至少12个月，具有至少4个参数的改善。
13.如权利要求12所述的方法，其中，在施用后至少12个月，具有至少5个参数的改善。
14.如权利要求9所述的方法，其中，所述改善选自以下的任何一项：
a.射血分数比基线增加至少5％以上，
b.收缩末期容积比基线减少至少10％、或减少至少20mL，
c.6分钟步行测试比基线增加至少50米，
d.血液中的BNP水平(pg/mL)比基线减少至少40％，
e.血液中的pro-BNP水平(pg/mL)比基线减少至少35％，
f.相比于同一生物标志物的基线水平，选自肌钙蛋白、血清肌酐、胱抑素C或肝脏转氨酶的生物标志物减少至少10％，
g.心肌耗氧量(MVO2)比基线增加至少1.5mL/kg/min，或者
h.由于HF症状改善而出院，或者由于受试者中的改善的HF症状而减少的干预，所述减少的干预选自正性肌力药、血管扩张剂、利尿剂中的任何一种的使用减少。
15.如权利要求1或14所述的方法，其中，所述rAAV载体进一步包含CMV启动子或合成启动子，所述启动子可操作地连接至所述磷酸酶抑制剂蛋白。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中，按以下的施用方法中的任何一种施用所述总剂量：
a.在约20分钟至约30分钟的时间段内，
b.以一系列子剂量施用，其中每个子剂量在约1分钟至约5分钟的时间段内施用，
c.以一系列五个子剂量施用，每个子剂量在约1分钟至约5分钟的时间段内施用，并且其中所述五个子剂量在约20分钟至约30分钟的时间段内施用。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述rAAV载体包含非靶向肝脏的衣壳。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中，所述rAAV选自于由以下所组成的组：AAV1、AAV2、AAV6、AAV8、AAV9、AAV2i8、rh10、AAV2.5和AAV2G9。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中，所述rAAV载体是AAV2i8。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中，所述rAAV的至少一个总剂量是1013vg、3×1013vg、1014vg、3×1014vg或1015vg。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中，所述磷酸酶抑制剂(I-1)蛋白是组成型活化的蛋白(I-1c)。
22.如权利要求21所述的方法，其中，所述I-1c选自以下的任何一种：
a.包含至少SEQ ID NO：1的氨基酸残基1-54的多肽，其中SEQ ID NO：1在C端第70、67、66、65或61或54位氨基酸处截短，并且其中在第35位有天冬氨酸(T35D)，
b.包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-54或其功能片段的多肽，其中所述功能片段与SEQ IDNO：1的氨基酸残基1-54具有至少85％的序列同一性，或在C端第70、67、66、65或61或54位氨基酸处截短，并且其中在第35位有天冬氨酸(T35D)。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中，所述rAAV基因组包含选自于由SEQ IDNO：413-441所组成的组中的核酸序列。
24.如权利要求21所述的方法，其中，所述编码I-1多肽的核酸序列选自：
a.编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65的多肽的核酸序列，其中在SEQ ID NO：1第35位处的苏氨酸(T)被替换成非T的氨基酸，
b.编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65的多肽的核酸序列，其中在SEQ ID NO：1第35位处的苏氨酸(T)被选自天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)中的任一氨基酸取代，
c.编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65的多肽的核酸序列，其中在SEQ ID NO：1第35位处的苏氨酸(T)被天冬氨酸(D)或天冬氨酸的保守氨基酸取代。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中，所述编码I-1蛋白的核酸序列是经密码子优化的核酸序列。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中，所述编码I-1蛋白的核酸序列选自SEQID NO：385-412中的任何一个、或与SEQ ID NO：385-412具有至少80％序列同一性的核酸序列。
27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中，所述患有心肌病的受试者患有非缺血性心力衰竭和/或非缺血性心肌病。
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中，所述患有心肌病的受试者患有先天性心肌病或具有心脏表现的遗传性疾患。
29.如权利要求29所述的方法，其中，所述患有先天性心肌病或具有心脏表现的遗传性疾患的受试者具有选自于由以下所组成的组中的疾病或疾患：致心律失常性右心室心肌病、家族性心房粘液瘤、原发孔型房间隔缺损、静脉窦型房间隔缺损、巴氏综合征、肌营养不良症、Buerger病、心脑肌病、染色体1p36缺失综合征、先天性全身脂质营养不良4型、先天性心脏传导阻滞、扩张型心肌病、杜氏肌营养不良症(DMD)、Fabry病、家族性心房颤动、家族性扩张型心肌病、家族性肥厚型心肌病、家族性进行性心脏传导缺陷、家族性胸主动脉瘤和主动脉夹层、纤维肌发育不良、Friedreich共济失调、戈谢病，糖原贮积病2、3或4型，His束性心动过速、Hurler综合征、左心发育不良综合征、婴儿组织细胞样心肌病、颅内动静脉畸形、异丁酰-辅酶A脱氢酶缺乏症、激肽释放酶高血压、川崎病、Kearns-Sayre综合征、左心室致密化不全，肢带型肌营养不良症1B、2E、2F、2M、2C、2D型，局限性系统性硬化症、长QT综合征1、淋巴水肿和脑动静脉异常、淋巴细胞性血管炎、小头症-心肌病、线粒体脑肌病乳酸酸中毒和卒中样发作、线粒体三功能蛋白缺乏症、强直性肌营养不良症1型、新生儿卒中，Noonan综合征1-、2-、3-、4-、5-和6，围产期心肌病、Peters plus综合征、PGM1-CDG、PHACE综合征、受磷蛋白Arg 14缺失、体位性心动过速综合征、原发性肉碱缺乏症，进行性家族性心脏传导阻滞1A、1B和2型，假性醛固酮减少症2型、肺动脉高压、肺动脉闭锁伴完整室间隔、肺动脉闭锁伴室间隔缺损、肺动脉瓣狭窄、肺静脉狭窄、肺动脉狭窄、肾功能缺乏性高血压、视网膜动脉大动脉瘤伴肺动脉瓣上狭窄、右心室发育不全、结节病、Sengers综合征、内脏反位、突发性心律失常死亡综合征、主动脉瓣上狭窄、Swyer综合征、TANGO2相关代谢性脑病和心律不齐、TARP综合征、法洛四联症、Timothy综合征、三尖瓣闭锁、Vici综合征、VLCAD缺乏症和Williams综合征。
30.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中，所述患有心肌病的受试者患有缺血性心肌病。
31.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其中，所述患有心肌病的受试者患有心力衰竭。
32.如权利要求31所述的方法，其中，所述患有心力衰竭的受试者的分类相当于纽约心脏协会(NYHA)分类系统中的III级以上。
33.如权利要求30-32中任一项所述的方法，其中，所述患有心力衰竭的受试者患有心血管疾病或心脏疾病，所述疾病选自以下的任何一种：充血性心力衰竭(CHF)、左心室重构、外周动脉闭塞性疾病(PAOD)、扩张型心肌病(DCM)包括特发性扩张型心肌病(IDCM)、冠状动脉疾病、缺血、心律不齐、心肌梗塞(MI)、心脏收缩力异常、急性(失代偿性)心力衰竭(AHF)、Ca2+代谢异常、心肌缺血、动脉粥样硬化、心肌病、特发性心肌病、遗传性疾患诱发的心肌病、心律失常、肌营养不良症、肌肉质量异常、肌肉退化、感染性心肌炎、药物或毒素诱发的肌肉异常、过敏性心肌炎、自身免疫性心内膜炎和先天性心脏疾病和肺心病高血压。
34.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中，所述患有心肌病的受试者具有降低的射血分数(rEF或HFrEF)或者保留的射血分数(HFpEF)。
35.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其中，在施用所述rAAV后至少12个月，心力衰竭的分类比基线水平改善至少一个等级，其中心力衰竭的分类通过以下的至少一个来评价：
a.美国心脏协会(AHA)、美国心脏病学会(ACC)、2016欧洲心脏病学会指南(ESCG)、日本心力衰竭学会(JHFS)指南、日本循环学会(JCS)指南或纽约心脏协会(NYHA)所使用的分类系统；或其等同物，或
b.选自于由以下的任一者所组成的组中的健康相关生活质量(HRQL)问卷：明尼苏达心力衰竭生活质量问卷(MLHFQ)、或堪萨斯城心肌病问卷(KCCQ)、慢性心力衰竭问卷(CHFQ)、重度心力衰竭生活质量问卷(QLQ-SHF)、左心室功能障碍(LVD-36)问卷、和左心室疾病问卷(LVDQ)。
36.如权利要求35所述的方法，其中，在施用所述rAAV后6个月内，所述分类具有至少一个等级的改善。
37.如权利要求35所述的方法，其中，在施用所述rAAV后12个月内，所述分类具有至少两个等级的改善。
38.如权利要求35所述的方法，其中，比起所述基线水平，在生活质量MLWHFQ或KCCQ中具有减少至少10分的改善。
39.如权利要求1-38中任一项所述的方法，其中，在施用所述至少一个总剂量的rAAV载体的同时、和/或之前、和/或之后向所述受试者施用血管扩张剂。
40.如权利要求1-39中任一项所述的方法，其中，在施用所述至少一个总剂量的rAAV载体的同时、或之前、或之后向所述受试者施用免疫调节剂。
41.一种药物组合物，所述药物组合物包含AAV载体，所述载体包含选自SEQ ID NO：385-412中任何一个的经密码子优化的I-Ic核酸序列，或与SEQ ID NO：385-412具有至少80％序列同一性的核酸序列。
42.如权利要求41所述的药物组合物，其中，所述经密码子优化的核酸序列可操作地连接至CMV启动子或合成启动子。
43.如权利要求41所述的药物组合物，所述药物组合物包含选自于由以下所组成的组中的核酸序列：SEQ ID NO：41-42，或与SEQ ID NO：385-412具有至少80％序列同一性的核酸序列。
44.如权利要求41-43中任一项所述的药物组合物，用于如权利要求1-40中任一项所述的方法。
45.一种腺相关病毒(AAV)载体，所述载体包含编码磷酸酶抑制剂(I-1)多肽的核酸序列，所述核酸序列可操作地连接至选自以下任何一种的启动子：
选自表2A的心脏特异性启动子或其变体，
在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子或其变体，或
当存在心脏组织特异性增强子时的任何启动子。
46.如权利要求45所述的AAV载体，其中，在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子选自表5A或表13A或其变体。
47.如权利要求45-46中任一项所述的AAV载体，其中，所述AAV选自于由以下所组成的组：腺相关病毒-1(AAV1)、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAV2i8。
48.如权利要求45-47中任一项所述的AAV载体，其中，所述AAV包含非靶向肝脏的衣壳。
49.如权利要求45-48中任一项所述的AAV载体，其中，所述AAV载体是AAV2i8。
50.如权利要求45-49中任一项所述的AAV载体，其中，所述磷酸酶抑制剂(I-1)多肽是组成型活化的蛋白(I-1c)。
51.如权利要求45-50中任一项所述的AAV载体，其中，所述I-1c选自以下的任何一种：
a.包含至少SEQ ID NO：1的氨基酸残基1-65的多肽或其功能等同物；
b.包含至少SEQ ID NO：1的氨基酸1-54的多肽，其中所述多肽在C端选自残基70、67、66、65或61或54的氨基酸处截短，并且在第35位有天冬氨酸(T35D)，
c.包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65的多肽或其功能等同物，所述功能等同物与SEQ IDNO：1的氨基酸残基1-65具有至少85％的序列同一性，或者
d.选自以下任何一种的多肽：SEQ ID NO：507或527-532或其功能等同物，所述功能等同物与SEQ ID NO：507或527-532中任何一个的氨基酸残基具有至少85％的序列同一性。
52.如权利要求45-51中任一项所述的AAV载体，其中，所述编码I-1多肽的核酸序列选自：
a.编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65的多肽的核酸序列，其中，在SEQ ID NO：1第35位的苏氨酸(T)被替换成非T的氨基酸，
b.编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65的多肽的核酸序列，其中，在SEQ ID NO：1第35位的苏氨酸(T)被选自天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)中的任一氨基酸替换，
c.编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65的多肽的核酸序列，其中，在SEQ ID NO：1第35位的苏氨酸(T)被替换为天冬氨酸(D)、或天冬氨酸的保守氨基酸。
53.如权利要求45-52中任一项所述的AAV载体，其中，所述多肽选自：SEQ ID NO：1的氨基酸1-54、SEQ ID NO：1的氨基酸1-61、SEQ ID NO：1的氨基酸1-65、SEQ ID NO：1的氨基酸1-66、SEQ ID NO：1的氨基酸1-67或SEQ ID NO：2的氨基酸1-77、或其功能变体，其中在SEQID NO：1第35位的苏氨酸被天冬氨酸(T35D)或天冬氨酸的保守氨基酸替换。
54.如权利要求45-50中任一项所述的AAV载体，其中，所述编码I-1多肽的核酸序列是经密码子优化的核酸序列。
55.如权利要求45-54中任一项所述的AAV载体，其中，与SEQ ID NO：1的野生型参考序列或其片段相比，所述经密码子优化的核酸序列具有减少的CpG含量或减少的CpG岛。
56.如权利要求45-54中任一项所述的AAV载体，其中，所述编码I-1多肽的核酸序列是选自以下的任何一种的经密码子优化的核酸序列：SEQ ID NO：385-412，或与SEQ ID NO：385-412具有至少80％序列同一性的核酸序列。
57.如权利要求45-56中任一项所述的AAV载体，所述载体进一步包含位于编码磷酸酶抑制剂(I-1)多肽的核酸序列的5’的至少一个ITR，所述ITR可操作地连接至所述心脏特异性启动子或肌肉特异性启动子。
58.如权利要求45-57中任一项所述的AAV载体，所述载体进一步包含侧接于编码磷酸酶抑制剂(I-1)多肽的核酸序列的至少两个ITR，所述ITR可操作地连接至所述心脏特异性启动子或肌肉特异性启动子。
59.如权利要求45-58中任一项所述的AAV载体，其中，所述ITR序列选自以下的任何一个或多个：SEQ ID NO：70-78，或与SEQ ID NO：70-78具有至少85％序列同一性的核酸。
60.如权利要求45-59中任一项所述的AAV载体，所述载体进一步包含反向poly A序列或双链RNA终止元件，其中所述反向polyA序列或双链终止元件位于编码磷酸酶抑制剂(I-1)多肽的核酸序列的3’。
61.如权利要求60所述的AAV载体，其中，所述反向poly A序列或双链RNA终止元件位于编码磷酸酶抑制剂(I-1)多肽的核酸序列的3’和右侧ITR的5’之间。
62.如权利要求45-61中任一项所述的AAV载体，其中，所述核酸序列可进一步包含编码至少一种免疫调节剂的核酸序列。
63.如权利要求45-61中任一项所述的AAV载体，所述载体存在于组合物或溶液中，进一步包括免疫调节剂。
64.如权利要求45-63中任一项所述的AAV载体，所述载体进一步包含选自以下任一种的polyA序列：SV40 polyA(SEQ ID NO：334)、HGH poly A(SEQ ID NO：66)、SEQ ID NO：284-287、SEQ ID NO：331-335，其中，所述polyA序列位于编码磷酸酶抑制剂(I-1)多肽的核酸序列的3’。
65.一种药物组合物，所述药物组合物包含：
(i)腺相关病毒(AAV)载体，所述载体包含编码磷酸酶抑制剂(I-1)多肽的核酸序列，所述核酸序列可操作地连接至以下任何一个：a.选自表2A的心脏特异性启动子或其变体，b.在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子，或c.当存在心脏组织特异性增强子时的任何启动子或其变体；以及
(ii)药学上可接受的运载体。
66.如权利要求65所述的药物组合物，其中，在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子选自表5A或表13A、或其变体。
67.如权利要求65-66中任一项所述的药物组合物，其中，所述AAV选自于由以下所组成的组：腺相关病毒-1(AAV1)、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAV2i8。
68.如权利要求65-67中任一项所述的药物组合物，其中，所述AAV包含非靶向肝脏的衣壳。
69.如权利要求65-68中任一项所述的药物组合物，其中，所述AAV是AAV2i8。
70.如权利要求65-69中任一项所述的药物组合物，其中，所述AAV包含选自于由以下所组成的组中的核酸：SEQ ID NO：413-440，或与选自SEQ ID NO：413-440的序列具有至少80％序列同一性的核酸序列；其中，以SEQ ID NO：413-440示出的核酸包含SEQ ID NO：330的CMV启动子，其中，所述SEQ ID NO：330的CMV启动子被以下的任一种取代：
a.选自表2A的心脏特异性启动子或其变体，
b.在心肌和骨骼肌中活化的肌肉特异性启动子，或
c.当存在心脏组织特异性增强子时的任何启动子或其变体。
71.如权利要求64-69中任一项所述的药物组合物，所述组合物进一步包含血管扩张剂。
72.如权利要求64-69中任一项所述的药物组合物，所述组合物进一步包含免疫调节剂。
73.如权利要求65所述的药物组合物，其中，所述磷酸酶抑制剂(I-1)多肽是组成型活化的蛋白(I-1c)。
74.如权利要求73所述的药物组合物，其中，所述I-1c选自以下的任何一种：
a.包含至少SEQ ID NO：1的氨基酸残基1-65的多肽或其功能等同物；
b.包含至少SEQ ID NO：1的氨基酸1-54的多肽，其中所述多肽在C端的第70、67、66、65或61或54位氨基酸处截短，并且在第35位有天冬氨酸(T35D)，
c.包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65的多肽或其功能等同物，所述功能等同物与SEQ IDNO：1的氨基酸残基1-65具有至少85％的序列同一性，或者
d.选自以下任何一种的多肽：SEQ ID NO：507或527-532或其功能等同物，所述功能等同物与SEQ ID NO：507或527-532中任何一个的氨基酸残基具有至少85％的序列同一性。
75.如权利要求65-74中任一项所述的药物组合物，其中，所述编码I-1多肽的核酸序列选自：
a.编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65的多肽的核酸序列，其中SEQ ID NO：1第35位的苏氨酸(T)被替换为非T的氨基酸，
b.编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65的多肽的核酸序列，其中SEQ ID NO：1第35位的苏氨酸(T)被选自天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)中的任一氨基酸替换，
c.编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-65的多肽的核酸序列，其中SEQ ID NO：1第35位的苏氨酸(T)被天冬氨酸(D)或天冬氨酸的保守氨基酸替换。
76.如权利要求65-745中任一项所述的药物组合物，其中，所述编码I-1蛋白的核酸序列是经密码子优化的核酸序列。
77.如权利要求76所述的药物组合物，其中，与参考野生型序列相比，所述经密码子优化的核酸序列具有减少的CpG含量。
78.如权利要求65-77中任一项所述的药物组合物，其中，所述编码I-1多肽的经密码子优化的核酸序列选自SEQ ID NO：385-412中的任何一个，或是与选自SEQ ID NO：385-412中的任何一个序列具有至少80％序列同一性的核酸序列。
79.如权利要求45-64中任一项所述的AAV载体用于制造治疗患有心肌病的受试者的药物组合物的用途。
80.如权利要求79所述的AAV载体的用途，其中，所述患有心肌病的受试者患有非缺血性心力衰竭和/或非缺血性心肌病。
81.如权利要求79所述的AAV载体的用途，其中，所述患有心肌病的受试者患有先天性心肌病或具有心脏表现的遗传性疾患。
82.如权利要求80所述的AAV载体的用途，其中，所述患有先天性心肌病或具有心脏表现的遗传性疾患的受试者具有选自于由以下所组成的组中的疾病或疾患：致心律失常性右心室心肌病、家族性心房粘液瘤、原发孔型房间隔缺损、静脉窦型房间隔缺损、巴氏综合征、肌营养不良症、Buerger病、心脑肌病、染色体1p36缺失综合征、先天性全身脂质营养不良4型、先天性心脏传导阻滞、扩张型心肌病、杜氏营养不良症(DMD)、Fabry病、家族性心房颤动、家族性扩张型心肌病、家族性肥厚型心肌病、家族性进行性心脏传导缺陷、家族性胸主动脉瘤和主动脉夹层、纤维肌发育不良、Friedreich共济失调、戈谢病，糖原贮积病2、3或4型，His束性心动过速、Hurler综合征、左心发育不良综合征、婴儿组织细胞样心肌病、颅内动静脉畸形、异丁酰-辅酶A脱氢酶缺乏症、激肽释放酶高血压、川崎病、Kearns-Sayre综合征、左心室致密化不全，肢带型肌营养不良症1B、2E、2F、2M、2C、2D型，局限性系统性硬化症、长QT综合征1、淋巴水肿和脑动静脉异常、淋巴细胞性血管炎、小头症-心肌病、线粒体脑肌病乳酸酸中毒和卒中样发作、线粒体三功能蛋白缺乏症、强直性肌营养不良症1型、新生儿卒中，Noonan综合征1-、2-、3-、4-、5-和6，围产期心肌病、Peters plus综合征、PGM1-CDG、PHACE综合征、受磷蛋白Arg 14缺失、体位性心动过速综合征、原发性肉碱缺乏症，进行性家族性心脏传导阻滞1A、1B和2型，假性醛固酮减少症2型、肺动脉高压、肺动脉闭锁伴完整室间隔、肺动脉闭锁伴室间隔缺损、肺动脉瓣狭窄、肺静脉狭窄、肺动脉狭窄、肾功能缺乏性高血压、视网膜动脉大动脉瘤伴肺动脉瓣上狭窄、右心室发育不全、结节病、Sengers综合征、内脏反位、突发性心律失常死亡综合征、主动脉瓣上狭窄、Swyer综合征、TANGO2相关代谢性脑病和心律不齐、TARP综合征、法洛四联症、Timothy综合征、三尖瓣闭锁、Vici综合征、VLCAD缺乏症和Williams综合征。
83.如权利要求79所述的AAV载体的用途，其中，所述患有心肌病的受试者患有缺血性心肌病。
84.如权利要求79所述的AAV载体的用途，其中，所述患有心肌病的受试者患有心力衰竭。
85.如权利要求84所述的AAV载体的用途，其中，所述患有心力衰竭的受试者具有基于以下所使用的分类系统的心力衰竭分类：美国心脏协会(AHA)、美国心脏病学会(ACC)或纽约心脏协会(NYHA)。
86.如权利要求85所述的AAV载体的用途，其中，所述患有心力衰竭的受试者在纽约心脏协会(NYHA)分类系统中的分级为III级或高于III级。
87.如权利要求45-64中任一项所述的AAV载体用于制造用来治疗患有与心力衰竭关联的病症或疾病的受试者的药物组合物的用途。
88.如权利要求87所述的用途，其中，所述受试者具有充血性心力衰竭(CHF)的分类。
89.如权利要求87所述的用途，其中，所述分类是基于以下所使用的分类系统：美国心脏协会(AHA)、美国心脏病学会(ACC)或纽约心脏协会(NYHA)。
90.如权利要求87所述的用途，其中，所述受试者患有非缺血性心力衰竭或非缺血性心肌病。
91.如权利要求87所述的用途，其中，所述受试者患有缺血性心力衰竭或缺血性心肌病。
92.如权利要求79或87所述的用途，其中，所述受试者具有降低的射血分数(rEF或HFrEF)。
93.一种细胞，所述细胞包含如权利要求45-64中任一项所述的AAV载体。
94.如权利要求93所述的细胞，其中，所述细胞是心脏细胞或肌肉细胞。
95.如权利要求93-94中任一项所述的细胞，其中，所述细胞处于细胞培养物中或者为存在于受试者中的细胞。
96.用于治疗患有心肌病的受试者的如权利要求45-64所述的AAV载体、如权利要求65-78中任一项所述的药物制剂、或者如权利要求93-95中任一项所述的细胞。
97.如权利要求96所述的AAV载体，其中，所述患有心肌病的受试者患有非缺血性心力衰竭和/或非缺血性心肌病。
98.如权利要求96所述的AAV载体，其中，所述患有心肌病的受试者患有先天性心肌病或具有心脏表现的遗传性疾患。
99.如权利要求98所述的AAV载体，其中，所述患有先天性心肌病或具有心脏表现的遗传性疾患的受试者具有选自于由以下所组成的组中的疾病或疾患：致心律失常性右心室心肌病、家族性心房粘液瘤、原发孔型房间隔缺损、静脉窦型房间隔缺损、巴氏综合征、肌营养不良症、Buerger病、心脑肌病、染色体1p36缺失综合征、先天性全身脂质营养不良4型、先天性心脏传导阻滞、扩张型心肌病、杜氏营养不良症(DMD)、Fabry病、家族性心房颤动、家族性扩张型心肌病、家族性肥厚型心肌病、家族性进行性心脏传导缺陷、家族性胸主动脉瘤和主动脉夹层、纤维肌发育不良、Friedreich共济失调、戈谢病，糖原贮积病2、3或4型，His束性心动过速、Hurler综合征、左心发育不良综合征、婴儿组织细胞样心肌病、颅内动静脉畸形、异丁酰-辅酶A脱氢酶缺乏症、激肽释放酶高血压、川崎病、Kearns-Sayre综合征、左心室致密化不全，肢带型肌营养不良症1B、2E、2F、2M、2C、2D型，局限性系统性硬化症、长QT综合征1、淋巴水肿和脑动静脉异常、淋巴细胞性血管炎、小头症-心肌病、线粒体脑肌病乳酸酸中毒和卒中样发作、线粒体三功能蛋白缺乏症、强直性肌营养不良症1型、新生儿卒中，Noonan综合征1-、2-、3-、4-、5-和6，围产期心肌病、Peters plus综合征、PGM1-CDG、PHACE综合征、受磷蛋白Arg 14缺失、体位性心动过速综合征、原发性肉碱缺乏症，进行性家族性心脏传导阻滞1A、1B和2型，假性醛固酮减少症2型、肺动脉高压、肺动脉闭锁伴完整室间隔、肺动脉闭锁伴室间隔缺损、肺动脉瓣狭窄、肺静脉狭窄、肺动脉狭窄、肾功能缺乏性高血压、视网膜动脉大动脉瘤伴肺动脉瓣上狭窄、右心室发育不全、结节病、Sengers综合征、内脏反位、突发性心律失常死亡综合征、主动脉瓣上狭窄、Swyer综合征、TANGO2相关代谢性脑病和心律不齐、TARP综合征、法洛四联症、Timothy综合征、三尖瓣闭锁、Vici综合征、VLCAD缺乏症和Williams综合征。
100.如权利要求96所述的AAV载体，其中，所述患有心肌病的受试者患有缺血性心肌病。
101.如权利要求96所述的AAV载体，其中，所述患有心肌病的受试者患有心力衰竭。
102.如权利要求101所述的AAV载体，其中，所述患有心力衰竭的受试者具有基于以下所使用的分类系统的心力衰竭分类：美国心脏协会(AHA)、美国心脏病学会(ACC)或纽约心脏协会(NYHA)。
103.如权利要求102所述的AAV载体，其中，所述患有心力衰竭的受试者在纽约心脏协会(NYHA)分类系统中的分级为III级或高于III级。
104.用于治疗患有心力衰竭的患者的如权利要求45-64所述的AAV载体、如权利要求65-78中任一项所述的药物制剂、或者如权利要求93-95中任一项所述的细胞。
105.如权利要求104所述的AAV载体，其中，所述受试者具有充血性心力衰竭(CHF)的分类。
106.如权利要求105所述的AAV载体，其中，所述分类是基于以下所使用的分类系统：美国心脏协会(AHA)、美国心脏病学会(ACC)或纽约心脏协会(NYHA)。
107.如权利要求104所述的AAV载体，其中，所述受试者患有非缺血性心力衰竭或非缺血性心肌病。
108.如权利要求104所述的AAV载体，其中，所述受试者患有缺血性心力衰竭或缺血性心肌病。
109.如权利要求96或104所述的AAV载体，其中，所述受试者具有降低的射血分数(rEF或HFrEF)。
110.如权利要求104所述的AAV载体，其中，所述患有心力衰竭的受试者患有心血管疾病或心脏疾病，所述疾病选自以下的任何一种：充血性心力衰竭(CHF)、左心室重构、外周动脉闭塞性疾病(PAOD)、扩张型心肌病(DCM)包括特发性扩张型心肌病(IDCM)、冠状动脉疾病、缺血、心律不齐、心肌梗塞(MI)、心脏收缩力异常、急性(失代偿性)心力衰竭(AHF)、Ca2+代谢异常、心肌缺血、动脉粥样硬化、心肌病、特发性心肌病、遗传性疾患诱发的心肌病、心律失常、肌营养不良症、肌肉质量异常、肌肉退化、感染性心肌炎、药物或毒素诱发的肌肉异常、过敏性心肌炎、自身免疫性心内膜炎和先天性心脏疾病以及肺心病高血压。
111.如权利要求104所述的AAV载体，其中，所述受试者具有以下的一项或多项：
a.非缺血性心力衰竭；
b.非缺血性心肌病，
c.充血性心力衰竭(CHF)的分类，所述分类基于以下所使用的分类系统：美国心脏协会(AH)、美国心脏病学会(ACC)或纽约心脏协会(NYHA)；或
d.降低的射血分数(rEF或HFrEF)。
112.一种在患有心肌病的受试者中表达磷酸酶抑制剂(I-1)多肽的方法，所述方法包括将至少一个剂量的如权利要求45-63中任一项所述的AAV载体引入患有心肌病的受试者中，
其中，所述患有心肌病的受试者具有心力衰竭的分类，
其中，所述rAAV的至少一个剂量选自约1013vg至约1015vg的总剂量范围，并且
其中，在施用后至少12个月，所述心力衰竭的分类有改善。
113.如权利要求112所述的方法，其中，所述心力衰竭的分类基于以下所使用的分类系统：美国心脏协会(AH)、美国心脏病学会(ACC)或纽约心脏协会(NYHA)。
114.如权利要求112所述的方法，其中，在施用所述rAAV后12个月，分类具有至少一个等级的改善。
115.如权利要求112所述的方法，其中，在施用所述rAAV后6个月内，分类具有至少一个等级的改善。
116.如权利要求112所述的方法，其中，施用后12个月，在以下的任何一个或多个中的分类具有至少2个等级的改善：
美国心脏协会(AH)，
美国心脏病学会(ACC)，或
纽约心脏协会(NYHA)。
117.如权利要求112-116中任一项所述的方法，所述方法进一步包含在施用所述至少一个总剂量的rAAV载体的同时、或之前、或之后，施用免疫调节剂。
118.如权利要求112-116中任一项所述的方法，所述方法进一步包含在施用所述至少一个总剂量的rAAV载体的同时、和/或之前、和/或之后，施用血管扩张剂。
119.如权利要求112-118中任一项所述的方法，其中，所述受试者患有非缺血性心力衰竭或非缺血性心肌病。
120.如权利要求112-119中任一项所述的方法，其中，所述患有非缺血性心力衰竭或非缺血性心肌病的受试者患有先天性心肌病或具有心脏表现的遗传性疾患。
121.如权利要求120所述的方法，其中，所述患有先天性心肌病或具有心脏表现的遗传性疾患的受试者具有选自于由以下所组成的组中的疾病或疾患：致心律失常性右心室心肌病、家族性心房粘液瘤、原发孔型房间隔缺损、静脉窦型房间隔缺损、巴氏综合征、肌营养不良症、Buerger病、心脑肌病、染色体1p36缺失综合征、先天性全身脂质营养不良4型、先天性心脏传导阻滞、扩张型心肌病、杜氏营养不良症(DMD)、Fabry病、家族性心房颤动、家族性扩张型心肌病、家族性肥厚型心肌病、家族性进行性心脏传导缺陷、家族性胸主动脉瘤和主动脉夹层、纤维肌发育不良、Friedreich共济失调、戈谢病，糖原贮积病2、3或4型，His束性心动过速、Hurler综合征、左心发育不良综合征、婴儿组织细胞样心肌病、颅内动静脉畸形、异丁酰-辅酶A脱氢酶缺乏症、激肽释放酶高血压、川崎病、Kearns-Sayre综合征、左心室致密化不全，肢带型肌营养不良症1B、2E、2F、2M、2C、2D型，局限性系统性硬化症、长QT综合征1、淋巴水肿和脑动静脉异常、淋巴细胞性血管炎、小头症-心肌病、线粒体脑肌病乳酸酸中毒和卒中样发作、线粒体三功能蛋白缺乏症、强直性肌营养不良症1型、新生儿卒中，Noonan综合征1-、2-、3-、4-、5-和6，围产期心肌病、Peters plus综合征、PGM1-CDG、PHACE综合征、受磷蛋白Arg 14缺失、体位性心动过速综合征、原发性肉碱缺乏症，进行性家族性心脏传导阻滞1A、1B和2型，假性醛固酮减少症2型、肺动脉高压、肺动脉闭锁伴完整室间隔、肺动脉闭锁伴室间隔缺损、肺动脉瓣狭窄、肺静脉狭窄、肺动脉狭窄、肾功能缺乏性高血压、视网膜动脉大动脉瘤伴肺动脉瓣上狭窄、右心室发育不全、结节病、Sengers综合征、内脏反位、突发性心律失常死亡综合征、主动脉瓣上狭窄、Swyer综合征、TANGO2相关代谢性脑病和心律不齐、TARP综合征、法洛四联症、Timothy综合征、三尖瓣闭锁、Vici综合征、VLCAD缺乏症和Williams综合征。
122.如权利要求111-117中任一项所述的方法，其中，所述患有心力衰竭的受试者患有缺血性心肌病。
123.如权利要求111-120中任一项所述的方法，其中，所述患有心力衰竭的受试者具有心血管疾病或心脏疾病，所述疾病选自以下的任何一种：充血性心力衰竭(CHF)、左心室重构、外周动脉闭塞性疾病(PAOD)、扩张型心肌病(DCM)包括特发性扩张型心肌病(IDCM)、冠状动脉疾病、缺血、心律不齐、心肌梗塞(MI)、心脏收缩力异常、急性(失代偿性)心力衰竭(AHF)、Ca2+代谢异常、心肌缺血、动脉粥样硬化、心肌病、特发性心肌病、遗传性疾患诱发的心肌病、心律失常、肌营养不良症、肌肉质量异常、肌肉退化、感染性心肌炎、药物或毒素诱发的肌肉异常、过敏性心肌炎、自身免疫性心内膜炎和先天性心脏疾病以及肺心病高血压。
124.如权利要求111-122中任一项所述的方法，其中，所述受试者具有降低的射血分数(rEF或HFrEF)。
125.如权利要求111-123中任一项所述的方法，其中，所述心力衰竭包括缺血、心律不齐、心肌梗塞、心脏收缩力异常或Ca2+代谢异常。
126.如权利要求111-124中任一项所述的方法，其中，所述施用是进入患者心脏的冠状动脉的腔内。
127.如权利要求111-125中任一项所述的方法，其中，所述至少一个剂量为约1013vg至约1015vg的总剂量范围，以一个剂量或2至5个子剂量施用。
128.如权利要求111-126中任一项所述的方法，其中，所述总剂量以如下的施用方法中的任何一种施用：
a.在约20分钟至约30分钟的时间段内，
b.以一系列子剂量施用，其中，每个子剂量在约1分钟至约5分钟的时间段内施用，
c.以一系列的五个子剂量施用，每个子剂量在约1分钟至约5分钟的时间段内施用，并且其中，所述五个子剂量在约20分钟至约30分钟的时间段内施用。
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