KR20190027358A - 최적화된 미니-디스트로핀 유전자 및 발현 카세트 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 바이러스 벡터, 및 세포 또는 대상체에게 미니-디스트로핀을 전달하기 위해 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.
Description
정부 지원 연구 또는 개발에 관한 언급
본 발명은 국립 보건원(National Institutes of Health)이 수여한 승인 번호 AR050595, AR056394, 및 AR056953 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리가 있다.
발명의 분야
본 발명은 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 바이러스 벡터, 및 세포 또는 대상체에게 미니-디스트로핀을 전달하기 위해 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.
뒤시엔느 근육 디스트로피 (DMD)는 3,600 내지 9200명의 생존 출생 남아 중 약 1명에 영향을 미치는 중증의 x-연관 진행성 신경근 질환이다. 이러한 장애는 디스트로핀 단백질의 발현을 폐지시키는 디스트로핀 유전자에서의 프레임 이동 돌연변이에 의해 야기된다. 디스트로핀 단백질의 결여로 인해, 골격근, 및 궁극적으로는 심장 및 호흡 근육 (예를 들어, 늑간근 및 횡경막)이 변성되어 조기 사망을 야기한다. 진행성 약화 및 근육 위축이 아동기에 개시되어, 하지 및 골반에서 시작된 후, 상완으로 확산된다. 기타 증상은 특정 반사의 상실, 뒤뚱걸음, 빈번한 넘어짐, 앉아 있거나 누워있는 자세에서 일어나는 것이 어려움, 계단 오르기가 어려움, 전반적인 자세의 변화, 호흡 손상, 및 심근병증을 포함한다. 다수의 아동이 빠르게 달리거나 뛰어오를 수 없다. 위축된 근육, 특히 장딴지 근육 (그리고, 덜 통상적으로, 엉덩이, 어깨 및 팔의 근육)이 지방 및 결합 조직의 축적에 의해 확장될 수 있어, 이들을 실제보다 더 크게, 그리고 더 건강하게 보이도록 한다 (거짓비대로 칭해짐). 뼈 가늘어짐 및 척추측만이 통상적이다. 궁극적으로, 대부분의 경우에 12 내지 15세에, 독립적인 보행이 상실되고, 휠체어가 필수적이게 된다. 질환이 진행됨에 따라, 호흡 및 기침을 보조하는 횡경막의 근육이 더 약해진다. 병에 걸린 개체는 호흡 곤란, 호흡기 감염, 및 삼키기 문제를 겪는다. 거의 모든 DMD 환자에서 심근병증이 발달될 것이다. 심장 수반에 의해 심화되는 폐렴이 가장 빈번한 사망 원인이고, 이는 20대 이전에 빈번하게 발생한다.
베커 근육 디스트로피 (BMD)는 DMD보다는 증상이 덜 중증이지만, 여전히 조기 사망에 이른다. DMD에 비교하여, BMD는 후기에 발병하는 골격근 약화를 특징으로 한다. DMD 환자는 13세 이전에 휠체어에 의존적인 반면, BMD 환자는 16세 이후에 보행을 상실하고 휠체어를 필요로 한다. 또한 BMD 환자는 DMD 환자와 달리 경부 굽힘근 강도의 보존을 나타낸다. 골격근이 더 가볍게 수반됨에도 불구하고, DMD-연관 확장 심근병증 (DCM)으로부터의 심부전이 이환의 통상적인 원인이고, BMD에서의 가장 통상적인 사망 원인이며, 이는 평균적으로 40대 중반에 발생한다.
디스트로핀은 dmd 유전자가 코딩하는 세포질 단백질이고, 세포골격 액틴 필라멘트를 막 단백질에 연결하는 기능을 한다. 일반적으로, 주로 골격근 및 심장 근육 내에 위치하고 뇌에서 더 작은 양이 발현되는 디스트로핀 단백질은 수축성 기구의 액틴을 각각의 근육 섬유를 둘러싼 결합 조직의 층에 연결함으로써 근육 섬유 수축 동안 충격 흡수제로서 작용한다. 근육에서, 디스트로핀은 근초의 세포질 면에 위치한다.
1987년에 최초로 확인된 dmd 유전자는 약 2.5 Mb의 가장 큰 공지된 인간 유전자이다. 이러한 유전자는 X 염색체 상의 Xp21 위치에 있고, 79개의 엑손을 함유한다. DMD 또는 BMD를 야기하는 가장 통상적인 돌연변이는 하나 이상의 엑손의 대형 결실 돌연변이 (60-70％)이지만, 중복 돌연변이 (5-10％), 및 단일 뉴클레오티드 변이체 (DMD에 걸린 남성에서의 병원성 변이체의 약 25％-35％ 및 BMD에 걸린 남성의 약 10％-20％를 차지하는 소형 결실 또는 삽입, 단일-염기 변화, 및 스플라이스 부위 변화를 포함함) 또한 병원성 디스트로핀 변이체를 야기할 수 있다.
DMD에서, 돌연변이는 종종 프레임 이동에 도달하여 조기 정지 코돈 및 말단절단된 비-기능성이거나 불안정한 단백질을 초래한다. 논센스 점 돌연변이 또한 동일한 결과의 조기 종결 코돈을 초래할 수 있다. DMD를 야기하는 돌연변이는 임의의 엑손에 영향을 미칠 수 있지만, 엑손 2-20 및 45-55가 대형 결실 및 중복 돌연변이에 대한 통상적인 핫스팟이다. 프레임내 결실은 덜 중증인 베커 근육 디스트로피 (BMD)를 초래하고, 여기서 환자는 말단절단된 부분적으로 기능성인 디스트로핀을 발현한다.
전장 디스트로핀은 이의 기능에 기여하는 다수의 서브도메인을 포함하는 대형 (427 kDa) 단백질이다. 이러한 서브도메인들은, 아미노-말단에서 카르복시-말단의 순서로, N-말단 액틴-결합 도메인, 중앙의 소위 "로드" 도메인, 시스테인-풍부 도메인, 및 마지막으로 카르복시-말단 도메인 또는 영역을 포함한다. 로드 도메인은 하기 순서의 4개의 프롤린-풍부 힌지 도메인 (H로 약기됨), 및 24개의 스펙트린-유사 반복부 (R로 약기됨)로 구성된다: 제1 힌지 도메인 (H1), 3개의 스펙트린-유사 반복부 (R1, R2, R3), 제2 힌지 도메인 (H2), 16개의 추가 스펙트린-유사 반복부 (R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19), 제3 힌지 도메인 (H3), 5개의 추가 스펙트린-유사 반복부 (R20, R21, R22, R23, R24), 및 최종적으로 제4 힌지 도메인 (H4). 단백질의 카르복시-말단을 향한 서브도메인은 세포골격과 세포외 매트릭스 사이의 중요한 연결을 형성하는 대형 단백질 복합체인 디스트로핀-회합 당단백질 복합체 (DGC)에 연결하는데 수반된다.
어떠한 치료도 DMD의 진행을 확실하게 정지 또는 역전시키지 않는다. 코르티코스테로이드로의 치료가 현재의 치료 기준이지만, 이는 단지 진행을 1년 또는 2년만큼 느리게 할 뿐이다. 다수의 새로운 DMD용 약물이 규제청에 의해 최근 승인되었다. 이는 조기 정지 코돈의 리드-쓰루를 야기하는 아탈루렌(ataluren), 및 엑손 51의 건너뛰기를 야기하여 내부적으로 결실된 부분적으로 기능성인 디스트로핀을 야기하는 에테플러센(eteplirsen)을 포함한다. 그러나, 이러한 약물들의 작용 메커니즘은 모든 DMD 환자를 도울 것으로 예상되지 않고, DMD에서의 이들의 임상 효능을 확실하게 입증하기 위해 추가 증거가 요구된다.
아데노-연관 바이러스 (AAV) 매개 유전자 요법을 사용하여 다양한 희귀 질환을 잠재적으로 치료하는 것에서의 최근 10-15년에 걸친 발전으로, AAV가 DMD 및 덜 중증인 디스트로핀병증 (즉, dmd 유전자에서의 돌연변이와 연관된 다른 근육 질환)을 치료하는데 사용될 수 있다는 새로운 희망 및 관심이 있었다. AAV 벡터의 탑재물 크기에 대한 제한으로 인해, 전장 단백질의 적어도 일부 기능을 유지하면서 비-필수 서브도메인이 제거된 더 작은 버전의 디스트로핀인 마이크로- 또는 미니-디스트로핀을 생성시키는데 관심이 집중되었다. AAV-매개 미니-디스트로핀 유전자 요법은 근육에서의 광범위한 발현 및 근육 기능 개선의 증거와 함께 DMD에 대한 동물 모델인 mdx 마우스에서 전망을 나타냈다 (예를 들어, 문헌 [Wang et al., J. Orthop. Res. 27:421 (2009)] 참조). 그러나, 마이크로-디스트로핀 벡터를 사용한 관련 실험이 GRMD DMD 개 모델에서 시도되었을 때, 근육 세포의 유의한 형질도입을 달성하기 위해 강력한 면역억제제 약물이 요구되었다 (Yuasa et al., Gene Ther. 14:1249 (2007)). 유사하게, 인간 DMD 환자가 미니-디스트로핀을 발현하도록 디자인된 AAV 벡터로 치료되었을 때, 6명의 환자 중 2명에서만 최소 단백질이 검출된 반면, 미니-디스트로핀 단백질에 대한 T-세포 반응이 3명에서 자극되었다 (Bowles, et al., Mol Ther. 20(2):443-455 (2012)).
따라서, 미니-디스트로핀 단백질에 대한 면역 반응을 최소화하면서 DMD에 걸린 대상체의 형질도입된 세포에서 높은 수준으로 발현될 수 있는 미니-디스트로핀을 코딩하는 AAV 벡터가 관련 분야에서 요구된다.
미니-디스트로핀 단백질, 이러한 미니-디스트로핀 단백질을 발현시키기 위한 코돈-최적화 유전자, 세포에 이러한 유전자를 형질도입하기 위한 AAV 벡터, 및 이러한 AAV 벡터를 사용하는 예방 및 치료 방법, 특히 디스트로핀병증 예방 및 치료를 필요로 하는 대상체에서 디스트로핀병증을 예방 및 치료하기 위한 것이 본원에서 개시 및 예시된다. 이러한 실시양태 중 일부에서, 본 개시내용의 AAV 벡터는 미니-디스트로핀 단백질에 대한 면역 반응을 야기하지 않거나 약화된 면역 반응만을 야기하면서 형질도입된 세포에서 유의한 수준의 미니-디스트로핀의 생산을 유도할 수 있다.
본 개시내용의 발명의 특정한 비제한적 실시양태 (E)가 하기에 기재된다. 이러한 실시양태 및 관련 실시양태가 실시예 및 도면을 포함하여 상세한 설명에서 추가로 상세하게 기술된다.
E1. 야생형 인간 근육 디스트로핀 단백질 (서열식별번호(SEQ ID NO): 25)의 N-말단, 액틴 결합 도메인 (ABD), 힌지 H1, 로드 R1 및 R2, 힌지 H3, 로드 R22, R23, 및 R24, 힌지 H4, 시스테인-풍부 (CR) 도메인, 및 카르복시-말단 (CT) 도메인의 일부분을 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어지고, CT 도메인이 야생형 디스트로핀 단백질의 카르복시-말단의 마지막 3개의 아미노산 잔기를 포함하지 않는, 미니-디스트로핀 단백질.
E2. E1에 있어서, N-말단 및 액틴 결합 도메인 (ABD)이 함께 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 1-240을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지고; 힌지 H1이 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 253-327을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지고; 로드 R1이 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 337-447을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지고; 로드 R2가 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 448-556을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지고; 힌지 H3이 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 2424-2470을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지고; 로드 R22가 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 2687-2802를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지고; 로드 R23이 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 2803-2931을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지고; 로드 R24가 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 2932-3040을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지고; 힌지 H4가 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 3041-3112를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지고; CR 도메인이 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 3113-3299를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지고; CT 도메인의 일부분이 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 3300-3408을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지는 것인 미니-디스트로핀 단백질.
E3. E1 또는 E2에 있어서, 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지는 미니-디스트로핀 단백질.
E4. 야생형 인간 근육 디스트로핀 단백질 (서열식별번호: 25)의 N-말단, 액틴 결합 도메인 (ABD), 힌지 H1, 로드 R1, R2, R22, R23, 및 R24, 힌지 H4, 시스테인-풍부 (CR) 도메인, 및 카르복시-말단 (CT) 도메인의 일부분을 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어지고, CT 도메인이 야생형 디스트로핀 단백질의 카르복시-말단의 마지막 3개의 아미노산 잔기를 포함하지 않는, 미니-디스트로핀 단백질.
E5. E4에 있어서, N-말단 및 액틴 결합 도메인 (ABD)이 함께 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 1-240을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지고; 힌지 H1이 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 253-327을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지고; 로드 R1이 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 337-447을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지고; 로드 R2가 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 448-556을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지고; 로드 R22가 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 2687-2802를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지고; 로드 R23이 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 2803-2931을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지고; 로드 R24가 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 2932-3040을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지고; 힌지 H4가 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 3041-3112를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지고; CR 도메인이 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 3113-3299을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지며; CT 도메인의 일부분이 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 3300-3408을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지는 것인 미니-디스트로핀 단백질.
E6. E4 또는 E5에 있어서, 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지는 미니-디스트로핀 단백질.
E7. E1-E3의 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
E8. E4-E6의 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
E9. E7 또는 E8에 있어서, 이의 핵염기 서열이 NCBI 기준 서열 NM_004006.2에 의해 예가 제시되는 전장 인간 근육 디스트로핀을 코딩하는 천연 야생형 유전자의 코딩 서열로부터 어셈블리되는 것인 폴리뉴클레오티드.
E10. E9에 있어서, 이의 핵염기 서열이 서열식별번호: 26에 의해 제시되는 것인 폴리뉴클레오티드.
E11. E7-E10 중 어느 하나에 있어서, 핵염기 서열이 코돈-최적화된 것인 폴리뉴클레오티드.
E12. E11에 있어서, 코돈-최적화가 야생형 서열에 비교하여 GC 함량을 감소 또는 증가시키는 것인 폴리뉴클레오티드.
E13. E11에 있어서, 코돈-최적화가 야생형 서열에 비교하여 CpG 디뉴클레오티드의 개수를 감소 또는 증가시키는 것인 폴리뉴클레오티드.
E14. E11에 있어서, 코돈-최적화가 하나 이상의 잠적성 스플라이스 부위를 제거하는 것인 폴리뉴클레오티드.
E15. E11에 있어서, 코돈-최적화가 미니-디스트로핀 단백질에 대한 코딩 서열의 시작부에 있는 것 이외의 하나 이상의 리보솜 진입 부위를 제거하는 것인 폴리뉴클레오티드.
E16. E11에 있어서, 코돈-최적화가 하나 이상의 희귀 코돈을 미니-디스트로핀 유전자가 발현되도록 의도되는 세포의 유형 및/또는 종에서 더 높은 빈도로 발생하는 코돈으로 치환하는 것인 폴리뉴클레오티드.
E17. E12에 있어서, 코돈-최적화가 야생형 서열에 비교하여 GC 함량을 증가시키고, 유전자 발현 수준을 적어도 50％, 100％, 150％, 200％, 250％, 300％, 350％, 400％, 450％, 500％, 550％, 600％, 650％, 700％, 750％, 800％, 900％, 1000％ 이상만큼 증가시키는 것인 폴리뉴클레오티드.
E18. E12에 있어서, 코돈-최적화가 야생형에 비교하여 GC 함량을 적어도 5％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 100％ 이상만큼 증가시키는 것인 폴리뉴클레오티드.
E19. E12에 있어서, GC 함량이 약 또는 적어도 45％, 46％, 47％, 48％, 49％, 50％, 51％, 52％, 53％, 54％, 55％, 56％, 57％, 58％, 59％, 60％, 61％, 62％, 63％, 64％, 65％, 66％, 67％, 68％, 69％, 70％ 이상인 폴리뉴클레오티드.
E20. E13에 있어서, 코돈-최적화가 야생형에 비교하여 CpG 디뉴클레오티드의 개수를 약 또는 적어도 5％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％ 이상만큼 감소 또는 증가시키는 것인 폴리뉴클레오티드.
E21. E20에 있어서, CpG 디뉴클레오티드의 개수가, 감소되는 경우, CpG 모티프의 메틸화로 인한 유전자 발현의 침묵화를 완전히 또는 부분적으로 억제하는데 충분한 양으로 감소되는 것인 폴리뉴클레오티드.
E22. E11에 있어서, 코돈-최적화가 고도로 발현되는 인간 유전자에 관련된 미니-디스트로핀 유전자의 코돈 적응 지수 (CAI)를 적어도 0.70, 0.71, 0.72, 0.73, 0.74, 0.75, 0.76, 0.77, 0.78, 0.79, 0.80, 0.81, 0.82, 0.83, 0.84, 0.85, 0.86, 0.87, 0.88, 0.89, 0.90, 0.91, 0.92, 0.93, 0.94, 0.95, 0.96, 0.97, 0.98, 또는 0.99인 값으로 증가시키는 것인 폴리뉴클레오티드.
E23. E11-E22 중 어느 하나에 있어서, 핵염기 서열이 인간 코돈-최적화된 것인 폴리뉴클레오티드.
E24. E11-E22 중 어느 하나에 있어서, 핵염기 서열이 개 코돈-최적화된 것인 폴리뉴클레오티드.
E25. E23에 있어서, 인간 코돈-최적화 서열이 서열식별번호: 1, 또는 이에 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 99.5％ 동일한 핵염기 서열에 의해 제공되는 것인 폴리뉴클레오티드.
E26. E23에 있어서, 인간 코돈-최적화 서열이 서열식별번호: 2, 또는 이에 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 99.5％ 동일한 핵염기 서열에 의해 제공되는 것인 폴리뉴클레오티드.
E27. E24에 있어서, 개 코돈-최적화 서열이 서열식별번호: 3, 또는 이에 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 99.5％ 동일한 핵염기 서열에 의해 제공되는 것인 폴리뉴클레오티드.
E28. E7-E27 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
E29. E28에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 유전자 제어 영역에 작동가능하게 연결된 것인 벡터.
E30. E29에 있어서, 유전자 제어 영역이 프로모터인 벡터.
E31. E30에 있어서, 프로모터가 다른 유형의 세포, 예컨대 간세포에 비교하여 근육 세포에서 더욱 활성이라는 점에서 근육-특이적인 것인 벡터.
E32. E30 또는 E31에 있어서, 유전자 제어 영역이 인핸서를 추가로 포함하는 것인 벡터.
E33. E30-E32 중 어느 하나에 있어서, 프로모터, 및 존재하는 경우 인핸서가 근육 크레아틴 키나제 (CK) 유전자로부터의 것인 벡터.
E34. E33에 있어서, CK 유전자가 마우스 또는 인간으로부터의 것인 벡터.
E35. E33에 있어서, 유전자 제어 영역이 마우스 CK7 인핸서 및 프로모터인 벡터.
E36. E29-E36 중 어느 하나에 있어서, 유전자 제어 영역이 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 및 서열식별번호: 16의 군으로부터 핵염기 서열을 포함하는 것인 벡터.
E37. E28-E36 중 어느 하나에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 전사 종결인자 영역에 작동가능하게 연결된 것인 벡터.
E38. E37에 있어서, 전사 종결인자 영역이 서열식별번호: 6 또는 서열식별번호: 17의 핵염기 서열을 포함하는 것인 벡터.
E39. E28-E38 중 어느 하나에 있어서, AAV 바이러스 벡터 게놈이고, 플랭킹된 AAV 역전 말단 반복부 (ITR)를 포함하는 벡터.
E40. E39에 있어서, ITR이 양쪽 모두 AAV2 ITR인 벡터.
E41. E39 또는 E40에 있어서, 벡터의 핵염기 서열이 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 18의 군으로부터 선택된 핵염기 서열에 의해 제공되는 것인 벡터.
E42. AAV 캡시드 및 E39-E41 중 어느 하나의 벡터를 포함하는 재조합 AAV (rAAV) 입자.
E43. E42에 있어서, AAV 캡시드가 AAV9 캡시드인 rAAV 입자.
E44. 가로무늬근에 대한 향성이 있는 AAV 캡시드, 및 인간 미니-디스트로핀 단백질을 발현시키기 위한 벡터 게놈을 포함하는 rAAV 입자.
E45. E44에 있어서, AAV 캡시드가 AAV9 혈청형으로부터의 것인 rAAV 입자.
E46. E44 또는 E45에 있어서, 벡터 게놈이 인간 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 인간 코돈-최적화 핵산 서열을 포함하는 것인 rAAV 입자.
E47. E44-E46 중 어느 하나에 있어서, 인간 미니-디스트로핀 단백질이 N-말단에서 C-말단으로의 순서로 전장 인간 근육 디스트로핀 단백질로부터의 하기: N-말단 도메인, 액틴-결합 도메인 (ABD), 힌지 H1, 로드 R1, 로드 R2, 힌지 H3, 로드 R22, 로드 R23, 로드 R24, 힌지 H4, 시스테인-풍부 (CR) 도메인, 및 카르복시-말단 (CT) 도메인의 일부분의 서브도메인 또는 이의 일부분을 포함하고, 여기서 CT 도메인의 일부분이 디스트로핀으로부터의 마지막 3개의 아미노산을 포함하지 않는 것인 rAAV 입자.
E48. E44-E47 중 어느 하나에 있어서, 인간 미니-디스트로핀 단백질이 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 것인 rAAV 입자.
E49. E44-E46 중 어느 하나에 있어서, 인간 미니-디스트로핀 단백질이 N-말단에서 C-말단으로의 순서로 전장 인간 근육 디스트로핀 단백질로부터의 하기: N-말단 도메인, 액틴-결합 도메인 (ABD), 힌지 H1, 로드 R1, 로드 R2, 로드 R22, 로드 R23, 로드 R24, 힌지 H4, 시스테인-풍부 (CR) 도메인, 및 카르복시-말단 (CT) 도메인의 일부분의 서브도메인 또는 이의 일부분을 포함하고, 여기서 CT 도메인의 일부분이 디스트로핀으로부터의 마지막 3개의 아미노산을 포함하지 않는 것인 rAAV 입자.
E50. E44-E46, 및 E49 중 어느 하나에 있어서, 인간 미니-디스트로핀 단백질이 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 것인 rAAV 입자.
E51. E44-E47 중 어느 하나에 있어서, 인간 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 인간 코돈-최적화 핵산 서열이 서열식별번호: 1의 핵산 서열을 포함하는 것인 rAAV 입자.
E52. E44-E46, E49, 및 E50 중 어느 하나에 있어서, 인간 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 인간 코돈-최적화 핵산 서열이 서열식별번호: 3의 핵산 서열을 포함하는 것인 rAAV 입자.
E53. E44-E52 중 어느 하나에 있어서, 벡터 게놈이 코돈-최적화 핵산 서열에 플랭킹된 AAV 역전 말단 반복부 (ITR)를 추가로 포함하는 것인 rAAV 입자.
E54. E53에 있어서, AAV ITR이 AAV2 ITR인 rAAV 입자.
E55. E44-E54 중 어느 하나에 있어서, 벡터 게놈이 인간 코돈 최적화 핵산 서열과 작동가능하게 연결된 근육-특이적 전사 조절 요소를 추가로 포함하는 것인 rAAV 입자.
E56. E55에 있어서, 근육-특이적 전사 조절 요소가 5' AAV2 ITR과 인간 코돈-최적화 핵산 서열 사이에 위치하는 것인 rAAV 입자.
E57. E55 또는 E56에 있어서, 근육-특이적 전사 조절 요소가 인간 또는 마우스 크레아틴 키나제 (CK) 유전자로부터 유래되는 것인 rAAV 입자.
E58. E55-E57 중 어느 하나에 있어서, 근육-특이적 전사 조절 요소가 인핸서 및 프로모터를 포함하는 것인 rAAV 입자.
E59. E55-E58 중 어느 하나에 있어서, 근육-특이적 전사 조절 요소가 마우스 CK7 인핸서 및 프로모터인 rAAV 입자.
E60. E55-E59 중 어느 하나에 있어서, 근육-특이적 전사 조절 요소가 서열식별번호: 16의 핵산 서열을 포함하는 것인 rAAV 입자.
E61. E44-E60 중 어느 하나에 있어서, 벡터 게놈이 코돈-최적화 핵산 서열과 3' AAV2 ITR 사이에 위치하는 전사 종결 서열을 추가로 포함하는 것인 rAAV 입자.
E62. E61에 있어서, 전사 종결 서열이 폴리아데닐화 신호를 포함하는 것인 rAAV 입자.
E63. E44-E62 중 어느 하나에 있어서, 벡터 게놈이 5' → 3' 순서로 제1 AAV2 ITR, 인간 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 인간 코돈-최적화 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 근육-특이적 전사 조절 요소, 전사 종결 서열, 및 제2 AAV2 ITR을 포함하는 것인 rAAV 입자.
E64. E63에 있어서, 근육-특이적 전사 조절 요소가 서열식별번호: 16의 핵산 서열을 포함하는 것인 rAAV 입자.
E65. E63 또는 E64에 있어서, 인간 코돈-최적화 핵산 서열이 서열식별번호: 1의 핵산 서열을 포함하는 것인 rAAV 입자.
E66. E63-E65 중 어느 하나에 있어서, 전사 종결 서열이 서열식별번호: 17의 핵산 서열을 포함하는 것인 rAAV 입자.
E67. E44-E48, E51, 및 E53-E66 중 어느 하나에 있어서, 벡터 게놈이 서열식별번호: 18의 핵산 서열 또는 이의 역-상보체를 포함하는 것인 rAAV 입자.
E68. E44-E48, E51, 및 E53-E66 중 어느 하나에 있어서, 벡터 게놈이 서열식별번호: 18의 핵산 서열 또는 이의 역-상보체로 본질적으로 이루어지는 것인 rAAV 입자.
E69. E44-E48, E51, 및 E53-E66 중 어느 하나에 있어서, 벡터 게놈이 서열식별번호: 18의 핵산 서열 또는 이의 역-상보체로 이루어지는 것인 rAAV 입자.
E70. AAV9 캡시드, 및 서열식별번호: 18의 핵산 서열 또는 이의 역-상보체를 포함하는 벡터 게놈을 포함하는 재조합 AAV 입자.
E71. AAV9 캡시드, 및 서열식별번호: 18의 핵산 서열 또는 이의 역-상보체로 본질적으로 이루어지는 벡터 게놈을 포함하는 재조합 AAV 입자.
E72. AAV9 캡시드, 및 서열식별번호: 18의 핵산 서열 또는 이의 역-상보체로 이루어지는 벡터 게놈을 포함하는 재조합 AAV 입자.
E73. E42-E72 중 어느 하나의 rAAV 입자 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
E74. 디스트로핀병증 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량의 E73의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 디스트로핀병증을 치료하는 방법.
E75. 디스트로핀병증에 걸린 대상체를 치료하기 위한 의약의 제조에서의 E42-E72 중 어느 하나의 재조합 AAV (rAAV) 입자의 용도 또는 E73의 조성물의 용도.
E76. E42-E72 중 어느 하나에 있어서, 디스트로핀병증에 걸린 대상체의 치료에서 사용하기 위한 rAAV 입자 또는 E73의 조성물.
E77. E74-E76 중 어느 하나에 있어서, 디스트로핀병증이 뒤시엔느 근육 디스트로피 (DMD), 베커 근육 디스트로피 (BMD), 또는 DMD-연관 확장 심근병증인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
E78. E74-E77 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 남성 또는 여성 인간 대상체인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
E79. E74-E78 중 어느 하나에 있어서, 최초로 치료될 때 또는 조성물이 투여될 때 대상체가 보행성인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
E80. E74-E79 중 어느 하나에 있어서, 최초로 치료될 때 또는 조성물이 투여될 때 대상체가 약 또는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16세인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
E81. E74-E79 중 어느 하나에 있어서, 미처리 대조군에 비교하여 근육 세포의 근초에서 디스트로핀 회합 단백질 복합체를 복구시키는데 효과적인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
E82. E74-E79 중 어느 하나에 있어서, 미처리 대조군에 비교하여 심장에서 디스트로피 조직병리학을 개선하는데 효과적인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
E83. E74-E79 중 어느 하나에 있어서, 미처리 대조군에 비교하여 사지 근육 및 횡경막에서 섬유증을 저해하는데 효과적인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
E84. E74-E79 중 어느 하나에 있어서, 미처리 대조군에 비교하여 근육 병변 점수를 감소시키는데 효과적인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
E85. E74-E79 중 어느 하나에 있어서, 미처리 대조군에 비교하여 근육 피로를 감소시키는데 효과적인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
E86. E74-E79 중 어느 하나에 있어서, 미처리 대조군에 비교하여 Dmd mdx 래트의 절대적 또는 상대적 최대 앞다리 악력 강도를 증가시키는데 효과적인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
E87. E74-E79 중 어느 하나에 있어서, 골격근, 심장 근육 또는 횡경막 내의 미니-디스트로핀 mRNA 또는 단백질의 검출가능한 수준을 증가시키는데 효과적인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
E88. E74-E79 중 어느 하나에 있어서, 대상체의 혈액 내의 평균 MMP-9 수준을 건강한 대조군에서의 것보다 약 15-, 14-, 13-, 12-, 11-, 10-, 9-, 8-, 7-, 6-, 5-, 4-, 3-, 또는 2-배 더 큰 수준 이내로 감소시키는데 효과적인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
E89. E74-E79 중 어느 하나에 있어서, 대상체의 혈액 내의 평균 ALT, AST, 또는 LDH 수준을 건강한 대조군에서의 것보다 약 7-, 6-, 5-, 4-, 3-, 또는 2-배 더 큰 수준 이내로 감소시키는데 효과적인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
E90. E74-E79 중 어느 하나에 있어서, 대상체의 혈액 내의 평균 총 CK 수준을 건강한 대조군에서의 것보다 약 50-, 48-, 46-, 44-, 42-, 40-, 38-, 36-, 34-, 32-, 30-, 28-, 26-, 24-, 22-, 20-, 18-, 16-, 14-, 12-, 10-, 9-, 8-, 7-, 6-, 5-, 4-, 3-, 또는 2-배 더 큰 수준 이내로 감소시키는데 효과적인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
E91. E74-E79 중 어느 하나에 있어서, 벡터를 투여하고 나서 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 또는 36개월 후에 대상체의 평균 6분 보행 거리 (6MWD)를 미처리 대조군의 평균 6MWD에 비교하여 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100미터만큼 증가시키는데 효과적인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
E92. E74-E79 중 어느 하나에 있어서, 벡터를 투여하고 나서 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 또는 36개월 후에 4-계단 오르기 테스트를 수행하는데 요구되는 평균 시간을 미처리 대조군에 비교하여 적어도 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3.0, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 또는 4.0초만큼 감소시키는데 효과적인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
E93. E74-E79 중 어느 하나에 있어서, 벡터를 투여하고 나서 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 또는 36개월 후에 보행을 상실한 대상체의 평균 비율을 보행을 상실한 미처리 대조군의 평균 비율에 비교하여 적어도 5％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％ 또는 65％만큼 감소시키는데 효과적인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
E94. E74-E79 중 어느 하나에 있어서, 벡터를 투여하고 나서 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 또는 36개월 후에 대상체의 하지 내의 평균 지방 분율을 미처리 대조군의 하지 내의 평균 지방 분율에 비교하여 적어도 5％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％ 또는 75％만큼 감소시키는데 효과적인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
E95. E88-E94 중 어느 하나에 있어서, 대조군이 대상체에 대해 나이 및 성별이 매칭되는 것인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
E96. E91-E94 중 어느 하나에 있어서, 대상체 및 미처리 대조군이 나이, 이전 코르티코스테로이드 치료, 및/또는 6MWT 상에서의 기준선 수행에 따라 층상화되는 것인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물
E97. E74-E79 중 어느 하나에 있어서, 벡터를 투여하고 나서 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 또는 36개월 후에 대상체의 골격근 섬유의 적어도 5％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％ 또는 90％가 미니-디스트로핀 단백질을 발현하도록 야기하는데 효과적인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
E98. E97에 있어서, 골격근 섬유가 대상체의 두갈래근, 세모근 또는 네갈래근으로부터 수득된 생검 시료 내에 존재하는 것인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
E99. E74-E98 중 어느 하나에 있어서, 벡터를 투여하고 나서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개월 후에 대상체의 약 0％, 1％, 2％, 3％, 4％, 5％, 6％, 7％, 8％, 9％, 10％, 11％, 12％, 13％, 14％, 15％, 16％, 17％, 18％, 19％ 또는 20％ 이하에서 미니-디스트로핀 단백질에 대한 세포성 면역 반응 또는 근육 염증을 야기하는 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
E100. E74-E99 중 어느 하나에 있어서, 치료된 대상체에서의 동반 면역 억제를 필요로 하지 않으면서 효과적인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
E101. E74-E76 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 Dmd mdx 래트이고, 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물이 비히클만 투여된 나이-매칭 대조군에 비교하여 주사 3개월 또는 6개월 후에 혈청 AST, ALT, LDH, 또는 총 크레아틴 키나제 수준의 감소를 초래하는데 효과적인 것인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
E102. E74-E76 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 Dmd mdx 래트이고, 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물이 비히클만 투여된 나이-매칭 대조군에 비교하여 주사 3개월 또는 6개월 후에 넙다리두갈래근, 횡경막, 또는 심장 근육에서 섬유증 감소를 초래하는데 효과적인 것인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
E103. E74-E76 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 Dmd mdx 래트이고, 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물이 비히클만 투여된 나이-매칭 대조군에 비교하여 주사 3개월 또는 6개월 후에 앞다리 악력 증가를 초래하는데 효과적인 것인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
E104. E74-E76 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 Dmd mdx 래트이고, 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물이 비히클만 투여된 나이-매칭 대조군에 비교하여 주사 3개월 또는 6개월 후에 앞다리 악력을 테스트하는 5회의 가까운 간격의 시험에 걸쳐 측정된 바와 같이 근육 피로 감소를 초래하는데 효과적인 것인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
E105. E74-E76 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 Dmd mdx 래트이고, 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물이 비히클만 투여된 나이-매칭 대조군에 비교하여 주사 6개월 후에 심장초음파검사를 사용하여 측정된 바와 같이 좌심실 박출률 증가를 초래하는데 효과적인 것인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
E106. E74-E76 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 Dmd mdx 래트이고, 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물이 비히클만 투여된 나이-매칭 대조군에 비교하여 주사 3개월 또는 6개월 후에 심장초음파검사를 사용하여 측정된 바와 같이 초기 대 후기 좌심실 충만 속도의 비 (즉, E/A 비)의 증가를 초래하는데 효과적인 것인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
E107. E74-E76 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 Dmd mdx 래트이고, 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물이 비히클만 투여된 나이-매칭 대조군에 비교하여 주사 3개월 또는 6개월 후에 등용적 이완 시간 (IVRT) 또는 피크 E 속도와 이의 기준선으로의 복귀 사이의 밀리세컨드 단위의 시간의 감소를 초래하는데 효과적이고, E파 감속 시간 (DT)가 심장초음파검사를 사용하여 측정되는 것인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
E108. E74-E76 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 Dmd mdx 래트이고, 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물이 주사 3개월 또는 6개월 후까지 넙다리두갈래근, 횡경막, 심장 근육, 또는 기타 가로무늬근에 형질도입시키는데, 그리고 미니-디스트로핀 단백질에 대한 세포성 면역 반응을 유도하지 않으면서 opti-Dys3978 유전자가 코딩하는 미니-디스트로핀 단백질을 발현시키는데 효과적인 것인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
E109. E74-E76 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 Dmd mdx 래트이고, 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물이 비히클만 투여된 나이-매칭 대조군에 비교하여 주사 6개월 후에 좌심실 확장기말 직경의 증가를 부분적으로 또는 완전히 역전시키는데 효과적인 것인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
E110. E74-E100 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 디스트로핀병증을 치료하는데 효과적인 적어도 제2의 작용제로 또한 치료되거나 또는 조성물이 이를 또한 포함하고, 제2 작용제의 예가 DMD 유전자의 엑손 건너뛰기를 야기하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 항-마이오스타틴 항체, 논센스 돌연변이의 리보솜 리드-쓰루(read-through)를 촉진하는 작용제, 조기 정지 코돈을 억제하는 작용제, 동화성 스테로이드 및 코르티코스테로이드 (예컨대, 비제한적으로, 프레드니손, 데플라자코르트, 또는 프레드니솔론)을 포함하는 것인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
E111. E74-E110 중 어느 하나에 있어서, 조성물이 전신으로, 예컨대 정맥내 주사에 의해, 또는 국소적으로, 예컨대 직접적으로 근육 내로 투여되는 것인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
E112. E74-E111 중 어느 하나에 있어서, 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물에서 사용되는 rAAV 입자의 용량이 1×1012 vg/kg, 2×1012 vg/kg, 3×1012 vg/kg, 4×1012 vg/kg, 5×1012 vg/kg, 6×1012 vg/kg, 7×1012 vg/kg, 8×1012 vg/kg, 9×1012 vg/kg, 1×1013 vg/kg, 2×1013 vg/kg, 3×1013 vg/kg, 4×1013 vg/kg, 5×1013 vg/kg, 6×1013 vg/kg, 7×1013 vg/kg, 8×1013 vg/kg, 9×1013 vg/kg, 1×1014 vg/kg, 1.5×1014 vg/kg, 2×1014 vg/kg, 2.5×1014 vg/kg, 3×1014 vg/kg, 3.5×1014 vg/kg, 4×1014 vg/kg, 5×1014 vg/kg, 6×1014 vg/kg, 7×1014 vg/kg, 8×1014 vg/kg, 및 9×1014 vg/kg로 이루어진 용량 군으로부터 선택되고, 여기서 vg/kg는 대상체 체중 킬로그램 당 벡터 게놈을 나타내는 것인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
E113. E73에 있어서, rAAV 입자와 동일한 AAV 혈청형의 빈 캡시드를 추가로 포함하고, 빈 캡시드 대 rAAV 입자의 농도 비가 약 또는 적어도 0.5:1, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 이상인 조성물
E114. 세포를 E42-E72 중 어느 하나의 rAAV 입자와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 내의 미니-디스트로핀 단백질을 발현시키는 방법.
E115. E114에 있어서, 세포가 근육 세포인 방법.
E116. E115에 있어서, 근육 세포가 골격근, 횡경막, 또는 심장으로부터의 것인 방법.
E117. 생산자 세포 내로 E39-E41 중 어느 하나의 벡터, AAV rep 유전자, AAV cap 유전자, 및 헬퍼 기능용 유전자를 도입하는 단계, 세포를 인큐베이션하는 단계, 및 세포에 의해 생산된 rAAV 입자를 정제하는 단계를 포함하는, E42-E72 중 어느 하나의 rAAV 입자를 제조하는 방법.
E118. E117에 있어서, 생산자 세포가 부착성인 방법.
E119. E117에 있어서, 생산자 세포가 비-부착성인 방법.
E120. E117-E119 중 어느 하나에 있어서, 벡터가 하나의 플라스미드 내에 함유되고, AAV rep 및 cap 유전자가 제2 플라스미드 내에 함유되고, 헬퍼 기능 유전자가 제3 플라스미드 내에 함유되며, 3개의 플라스미드 모두가 패키징 세포 내로 도입되는 것인 방법.
E121. E117-E120 중 어느 하나에 있어서, 도입 단계가 형질감염에 의해 실행되는 것인 방법.
E122. E117-E121 중 어느 하나에 있어서, 생산자 세포가 HEK 293 세포인 방법.
E123. E117-E122 중 어느 하나에 있어서, 생산자 세포가 무혈청 배지에서 성장되는 것인 방법.
E124. E117-E123 중 어느 하나에 있어서, AAV cap 유전자가 AAV9 VP1, VP2 및 VP3 단백질을 코딩하는 것인 방법.
E125. E117-E124 중 어느 하나에 있어서, rAAV 입자가 밀도 구배 초원심분리, 또는 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 정제되는 것인 방법.
E126. E117-E125 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 rAAV 입자.
도 1은 고도로 말단절단된 미니-디스트로핀 유전자의 구축을 나타낸다. 야생형 근육 디스트로핀에는 4개의 주요 도메인이 있다: N-말단 도메인 (N); 24개의 로드 반복부 (R) 및 4개의 힌지 (H)를 함유하는, 중앙의 로드 도메인; 시스테인-풍부 (CR) 도메인, 및 카르복시-말단 (CT) 도메인. 다량의 중앙 로드 및 힌지, 및 대부분의 CT 도메인을 결실시킴으로써 미니-디스트로핀 유전자를 구축하였다. 미니-디스트로핀 유전자를 코돈-최적화하고, 완전히 합성하고, 이어서 유전자의 5' 끝부분의 CMV 프로모터 또는 근육-특이적 합성 하이브리드 프로모터와 유전자의 3' 끝부분의 소형 폴리(A) 서열 사이에 클로닝하였다. 그 후, 프로모터, 코돈-최적화 미니-디스트로핀 유전자, 및 폴리A 신호를 함유하는 이러한 유전자 절편을 왼쪽 및 오른쪽 AAV 역전 말단 반복부 (ITR)를 함유하는 플라스미드 내로 클로닝하여, 유전자 절편에 ITR을 플랭킹시켰다.
도 2는 코돈-최적화가 미니-디스트로핀 유전자 발현을 효과적으로 강화한다는 것을 나타낸다. 상부 패널은 (A) 형질감염되지 않은 293 세포에서의, 또는 원래의 최적화되지 않은 (B), 또는 최적화된 (C) 미니-디스트로핀 Dys3978 벡터 플라스미드의 형질감염 후의 미니-디스트로핀 단백질의 면역형광 (IF) 염색을 나타낸다. 하부 패널은 형질감염된 293 세포에서의 미니-디스트로핀의 웨스턴 블롯을 나타낸다. 왼쪽 블롯은 동일한 양의 세포 용해물을 사용하였고, 최적화된 cDNA에 의한 압도적인 발현을 나타낸다. 오른쪽 블롯은 최적화된 미니-디스트로핀 cDNA로 형질감염된 293 세포로부터의 세포 용해물의 100× 희석물을 사용한 한편, 최적화되지 않은 샘플은 희석되지 않았다. 100× 희석 후에도 최적화된 것의 신호가 여전히 더 강하다는 것을 주지한다.
도 3은 AAV9 벡터로 처리된 디스트로핀/유트로핀 이중 녹아웃(knockout) (dKO) 마우스에서의 인간 미니-디스트로핀 발현의 IF 염색을 나타낸다. 야생형 대조군 마우스 C57BL/10 (C57), 미처리 dKO 마우스, 및 AAV9-CMV-Hopti-Dys3978로 처리된 dKO 마우스 (T-dKO)로부터의 근육 및 심장 샘플을 얇게 절편화하고, 마우스 야생형 디스트로핀 및 인간 미니-디스트로핀 단백질 양쪽 모두를 또한 인식하는 항체로 염색하였다. 검사된 모든 샘플에서 고도로 효율적인 발현이 달성되었다.
도 4는 AAV9-CMV-Hopti-Dys3978 처리의 결과로서의 dKO 마우스의 체중의 정규화를 나타낸다. 야생형 대조군 B10 마우스 (C57BL/10), 미처리 mdx 마우스, 미처리 dKO 마우스, 및 벡터-처리 dKO 마우스로부터 4개월령에 데이터를 수득하였다.
도 5는 AAV9-CMV-Hopti-Dys3978 처리의 결과로서의 dKO 마우스의 악력 및 트레드밀 달리기의 개선을 나타낸다. 야생형 대조군 B10 마우스 (C57BL/10), 미처리 mdx 마우스, 미처리 dKO 마우스, 및 벡터-처리 dKO 마우스 (T-dKO)로부터 3개월령에 데이터를 수득하였다.
도 6a-6b는 AAV9-CMV-Hopti-Dys3978 처리의 결과로서의 dKO 마우스의 디스트로피 병리학의 호전을 나타낸다. (도 6a) 야생형 대조군 C57BL/10 마우스, 미처리 dKO 마우스, 및 벡터-처리 dKO (T-dKO) 마우스로부터의 앞정강근의 동결절편 (8 ㎛)을 조직병리학을 위해 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색에 적용하였다 (10× 확대). (도 6b) 근육 질량, 심장 질량, 중심에 위치하는 핵의 백분율, 및 혈청 크레아틴 키나제 활성의 정량적 분석.
도 7은 미처리 dKO 마우스 및 야생형 마우스에 비교된 인간 코돈-최적화 미니-디스트로핀 Dys3978 벡터 (AAV9-CMV-Hopti-Dys3978)로 처리된 dKO 마우스의 생존 곡선을 나타낸다. 처리된 dKO 마우스의 50％ 초과가 80주 (실험 기간)를 초과하여 생존하였다
도 8은 AAV9-CMV-Hopti-Dys3978 처리의 결과로서의 dKO 마우스의 심장 기능의 개선을 나타낸다. 야생형 대조군 C57BL/10 마우스, 미처리 mdx 마우스, 및 AAV9 벡터-처리 dKO 마우스 상에서 혈류역학 분석을 수행하였다. 미처리 dKO 마우스는 너무 아파서 절차를 견디지 못했다. 도부타민 챌린지의 존재 또는 부재 하에 3개의 마우스 군으로부터 데이터를 수집하였다.
도 9a-9b는 AAV9-CMV-Hopti-Dys3978 처리의 결과로서의 dKO 마우스의 심전도 (ECG)에서의 개선을 나타낸다. (도 9a) ECG의 PR 간격이 벡터-처리 dKO 마우스에서 개선되었다. (도 9b) 분석의 정량적 데이터. 3개의 군의 심박수를 주의깊게 모니터링하도록 실험을 수행하여, ECG가 심박수 변동에 영향을 받지 않았다. *p<0.05.
도 10은 CMV 또는 hCK 프로모터를 함유하는 AAV9-Hopti-Dys3978 벡터의 꼬리 정맥 주사 후 mdx 마우스에서 인간 코돈-최적화 미니-디스트로핀 Dys3978을 구동시키는 것에서의 비-조직 특이적 CMV 프로모터 및 근육-특이적 hCK 프로모터를 비교하는 것을 나타낸다. IF 염색을 사용하여, 인간 미니-디스트로핀 Dys3978은 사지 근육 및 심장 근육에서도 견고한 발현을 나타냈다. hCK 프로모터가 CMV 프로모터보다 더욱 효과적인 것으로 나타냈다.
도 11은 AAV9-CMV-Hopti-Dys3978 벡터의 단리된 사지 정맥 관류 후의 GRMD 개 "젤리(Jelly)"의 뒷다리의 자기 공명 영상화 (MRI) 영상을 나타낸다. 사타구니 구역에 단단한 지혈대가 놓인 오른쪽 뒷다리에 압력으로 벡터를 주입하였다. 흰색을 띠는 신호는 관류된 사지 내의 벡터 용액 정체를 나타냈다.
도 12는 GRMD 개 "젤리"에서의 벡터 주사 2개월 후의 인간 미니-디스트로핀 Dys3978 발현의 IF 염색을 나타낸다. 오른쪽 및 왼쪽 뒷다리 양쪽 모두에서의 5가지 상이한 근육 군으로부터의 생검 샘플을 검사하였다. 주사하지 않은 왼쪽 다리에도 검출가능한 Dys3978이 있었고, 이는 AAV9 벡터가 주사 부위로부터 반대쪽 다리로 이동하였음을 시사한다.
도 13은 GRMD 개 "젤리"에서의 벡터 주사 7개월 후의 인간 미니-디스트로핀 Dys3978 발현의 IF 염색을 나타낸다. 오른쪽 및 왼쪽 뒷다리 양쪽 모두에서의 4가지 상이한 근육 군으로부터의 생검 샘플을 검사하였다. 주사하지 않은 왼쪽 다리에도 검출가능한 Dys3978이 있었고, 이는 AAV9 벡터가 주사 부위로부터 반대쪽 다리로 이동하였음을 시사한다. Dys3978의 웨스턴 블롯 분석을 동일한 샘플 상에서 행하였다.
도 14는 GRMD 개 "젤리"에서의 벡터 주사 12개월 후의 인간 미니-디스트로핀 Dys3978 발현의 IF 염색을 나타낸다. 오른쪽 및 왼쪽 뒷다리 양쪽 모두에서의 4가지 상이한 근육 군으로부터의 생검 샘플, 및 앞다리에서의 1개의 샘플을 검사하였다. 주사하지 않은 왼쪽 다리에도 검출가능한 Dys3978이 있었고, 이는 AAV9 벡터가 주사 부위로부터 반대쪽 다리로 이동하였음을 시사한다.
도 15는 GRMD 개 "젤리"에서의 벡터 주사 2년 후의 인간 미니-디스트로핀 Dys3978 발현의 IF 염색을 나타낸다. 오른쪽 및 왼쪽 뒷다리 양쪽 모두에서의 2가지 상이한 근육 군으로부터의 생검 샘플을 검사하였다. 주사하지 않은 왼쪽 다리에 주사된 다리보다 더 많은 검출가능한 Dys3978이 있는 것으로 보였음을 주지한다.
도 16은 인간 미니-디스트로핀 Dys3978의 IF 염색을 나타낸다. 오른쪽 및 왼쪽 뒷다리 양쪽 모두에서의 (도 15와 비교하여) 2개의 추가적인 근육 군의 생검 샘플, 및 앞다리에서의 1개의 샘플을 GRMD 개 "젤리"로부터 검사하였다. 샘플을 또한 벡터 주사 2년 후에 수집하였다.
도 17은 GRMD 개 "젤리"로부터의 주사하지 않은 왼쪽 뒷다리에서의 벡터 주사 4년 후의 인간 미니-디스트로핀 Dys3978의 IF 염색을 나타낸다.
도 18은 GRMD 개 "젤리"에서의 벡터 주사 8년 초과 후의 인간 미니-디스트로핀 Dys3978의 IF 염색을 나타낸다. 5가지 상이한 근육 군 및 심장의 부검 근육 샘플을 검사하였다.
도 19는 GRMD 개 "젤리"에서의 벡터 주사 8년 초과 후의 인간 미니-디스트로핀 Dys3978 및 내인성 복귀변이체 디스트로핀의 IF 염색을 나타낸다. 3가지 상이한 근육 군의 부검 근육 샘플을 인간 및 개 디스트로핀 양쪽 모두를 인식한 항체 (상부 패널) 또는 개 복귀변이체 디스트로핀만 인식한 항체 (하부 패널)로 염색하였다. 복귀변이체 디스트로핀 양성 근섬유가 화살표로 강조되었다. 복귀변이체 섬유는 인간 DMD 환자, 뿐만 아니라 mdx 마우스 및 GRMD 개에서 발생하는 디스트로핀 단백질에 대해 양성으로 염색되는 희귀 근육 섬유이다. 복귀변이체 섬유가 발생하는 정확한 메커니즘은 완전히 이해되지 않지만, 항체 프로브가 인식하는 에피토프가 있는 짧아진 디스트로핀을 생산하는 희귀 근육 세포에서의 엑손 건너뛰기를 수반할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Lu, QL, et al., J Cell Biol 148:985-96 (2000)]을 참조한다.
도 20은 AAV9 벡터 주사 8년 초과 후의 부검 시에 GRMD 개 "젤리"의 근육 샘플 내에 존재하는 인간 미니-디스트로핀 Dys3978의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 웨스턴 블롯은 검사된 모든 골격근에 인간 미니-디스트로핀 Dys3978이 존재하였음을 나타냈다. 나이 및 성별이 매칭되는 "몰리(Molly)"라는 이름의 정상적인 개로부터의 근육을 디스트로핀 단백질의 정량을 지시하도록 단계적 2-배 희석으로 양성 대조군으로서 사용하였다. 야생형 전장 디스트로핀의 분자량은 약 400 kDa인 한편, 미니-디스트로핀 Dys3978 단백질은 약 150 kDa이다.
도 21은 AAV9-CMV-Hopti-Dys3978 벡터의 주사 후의 GRMD 개 "젤리에서의 근육 수축력 개선, 및 신체 전반에 걸친 유전자 발현을 나타낸다. 상부의 곡선은 정상적인 개의 근력을 나타내는 한편, 하부의 곡선은 미처리 GRMD 개의 근력을 나타낸다. 더 많은 시점 내로 연장된 2개의 곡선은 개 "젤리"의 근력을 나타낸다. AAV9-CMV-개-미니-디스트로핀 Dys3849 벡터 (Wang, et al., PNAS 97(25):13714-9 (2000))로 처리된 2마리의 추가적인 GRMD 개를 근력에 대해 또한 검사하였고, 개선을 나타냈다 ("재스퍼(Jasper)" 및 "페리도트(Peridot)").
도 22는 GRMD 개 "던킨(Dunkin)"에서의 AAV9-hCK-Copti-Dys3978 벡터 주사 4개월 후의 인간 미니-디스트로핀 발현의 근육 생검 IF 염색을 나타낸다. 신체 전반에 걸친 유전자 발현을 달성하도록 정맥내 주사에 의해 벡터를 전달하였다. 뒷다리 내의 4가지 상이한 근육 군의 생검 샘플을 검사하였다. 모든 근육 군에서 거의 균일한 미니-디스트로핀 Dys3978이 검출되었음을 주지한다.
도 23은 GRMD 개 "던킨"에서의 AAV9-hCK-Copti-Dys3978 벡터 주사 14개월 후의 인간 미니-디스트로핀 발현의 IF 염색을 나타낸다. 부검 샘플을 취하고 검사하였다. 광범위하고 견고한 수준의 미니-디스트로핀 Dys3978이 심장 및 모든 근육 군에서 검출되었음을 주지한다. 확대 4×.
도 24는 GRMD 개 "던킨"에서의 AAV9-hCK-Copti-Dys3978 벡터 주사 14개월 후의 견고한 수준의 인간 미니-디스트로핀이 검출된 횡경막 근육의 IF 염색을 나타낸다.
도 25는 GRMD 개 "던킨"에서의 AAV9-hCK-Copti-Dys3978 벡터 주사 14개월 후의 견고한 수준의 인간 미니-디스트로핀이 검출된 긴종아리근의 IF 염색을 나타낸다.
도 26은 GRMD 개 "던킨"에서의 AAV9-hCK-Copti-Dys3978 벡터 주사 14개월 후의 견고한 수준의 인간 미니-디스트로핀이 검출된 반막모양근의 IF 염색을 나타낸다.
도 27은 GRMD 개 "던킨"에서의 AAV9-hCK-Copti-Dys3978 벡터 주사 14개월 후의 견고한 수준의 인간 미니-디스트로핀이 검출된 심장 좌심실 (LV) 근육의 IF 염색을 나타낸다.
도 28은 벡터 주사 4개월 및 14개월 후의 GRMD 개 "던킨"의 근육 샘플에서의 인간 미니-디스트로핀 Dys3978의 웨스턴 블롯에 의한 검출을 나타낸다. 나이가 매칭되는 정상적인 개로부터의 근육을 디스트로핀 단백질의 정량을 지시하도록 단계적 2-배 희석으로 양성 대조군으로서 사용하였다. 야생형 전장 디스트로핀의 분자량은 약 400 kDa인 한편, 미니-디스트로핀 Dys3978은 약 150 kDa이다. 미니-디스트로핀 Dys3978이 간에서 검출되지 않았음을 주지한다.
도 29는 벡터 주사 14개월 후의 GRMD 개 "던킨"의 심장 (LV) 샘플에서의 인간 미니-디스트로핀 Dys3978 발현의 웨스턴 블롯에 의한 검출을 나타낸다. 나이가 매칭되는 정상적인 개로부터의 심장 샘플을 디스트로핀 단백질의 정량을 지시하도록 단계적 2-배 희석으로 양성 대조군으로서 사용하였다.
도 30은 다양한 근육 군의 인간 미니-디스트로핀 Dys 3978, 뿐만 아니라 감마-사르코글리칸 (r-SG)의 IF 염색에 의해 나타난 바와 같이 디스트로핀 회합 단백질 복합체의 복구를 나타낸다.
도 31은 다양한 근육 및 조직에서의 AAV9-CMV-Copti-Dys3978 벡터 DNA 카피의 분석을 나타낸다. 정량적 PCR (qPCR)을 수행하여 AAV 벡터 DNA 게놈 카피수를 결정하고, 이를 이배수체 세포 당 기준으로 정규화하였다.
도 32는 나이가 매칭되는 정상 개 및 미처리 GRMD 개에 비교된 AAV9-CMV-Copti-Dys3978 벡터 GRMD 개 "던킨"의 심장에서의 디스트로피 조직병리학의 개선을 나타낸다. HE 염색.
도 33은 나이가 매칭되는 정상 개 및 미처리 GRMD 개에 비교된 AAV9-CMV-Copti-Dys3978 벡터 GRMD 개 "던킨"의 횡경막 근육에서의 디스트로피 조직병리학의 개선을 나타낸다. HE 염색.
도 34는 나이가 매칭되는 미처리 GRMD 개에 비교된 AAV9-CMV-Copti-Dys3978 벡터 GRMD 개 "던킨"의 사지 근육에서의 디스트로피 조직병리학의 개선을 나타낸다. HE 염색.
도 35는 나이가 매칭되는 미처리 GRMD 개에 비교된 GRMD 개 "던킨"의 사지 근육 및 횡격막에서의 섬유증의 억제를 나타낸다. 메이슨 트리크롬 블루(Mason Trichrome blue) 염색.
도 36a는 PBS로 모의 처리된 WT 래트 (왼쪽 패널), 모의 처리된 DMD 래트 (가운데 패널), 및 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트 (오른쪽 패널)로부터 수득된 넙다리두갈래근의 항-디스트로핀 DYSB 항체로의 면역표지화를 나타내는 현미경사진을 제공한다. 섬유 주변의 진한 윤곽은 WT 래트에서의 디스트로핀 및 벡터 처리 Dmd mdx 래트에서의 미니-디스트로핀의 근초하 국소화를 나타낸다.
도 36b는 모의 처리된 WT 래트 (왼쪽 패널), 모의 처리된 Dmd mdx 래트 (가운데 패널) 및 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 DMD 래트 (오른쪽 패널)로부터 수득된 헤마톡실린 및 에오신 (HES)으로 염색된 넙다리두갈래근의 현미경사진을 제공한다. 괴사성 섬유의 클러스터 (*) 및 근내막 경도 섬유증 (검정 화살촉)이 나타난다.
도 36c는 모의 처리된 WT 래트 (왼쪽 패널), 모의 처리된 Dmd mdx 래트 (가운데 패널) 및 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트 (오른쪽 패널)로부터 수득된 심장 근육의 항-디스트로핀 DYSB 항체로의 면역표지화를 나타내는 현미경사진을 제공한다. 섬유 주변의 진한 윤곽은 WT 래트에서의 디스트로핀 및 벡터 처리 Dmd mdx 래트에서의 미니-디스트로핀의 근초하 국소화를 나타낸다.
도 36d는 모의 처리된 WT 래트 (왼쪽 패널), 모의 처리된 Dmd mdx 래트 (가운데 패널) 및 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트 (오른쪽 패널)로부터 수득된 HES로 염색된 심장 근육을 나타내는 현미경사진을 제공한다. 섬유증 병소 (백색 화살촉)가 가운데 패널에서 나타나고, 단핵 세포 침윤의 병소가 오른쪽 패널에서 도해된다.
도 37은 투약 후 25주까지의 시간에 걸친 비히클 (완충제)로 처리된 WT 래트 및 비히클 및 증가되는 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트의 그램 단위의 평균 체중을 나타낸다. "WT"는 야생형 래트를 지칭하고; "DMD"는 Dmd mdx 래트를 지칭하고; "n"은 샘플 크기를 지칭하고; "D"는 투약 이후의 일수를 지칭하고; "W"는 투약 이후의 주수를 지칭하고; "E"는 지정된 계수 곱하기 지정된 지수로 거듭제곱된 10에 대한 표기이고 (따라서, "1E13"은 1×1013을 나타내고, "3E13"은 3×1013을 나타내고, "1E14"는 1×1014를 나타내며, "3E14"는 3×1014를 나타낸다); "vg/kg"은 체중 킬로그램 당 벡터 게놈을 나타내며; "HAS 부재"는 벡터가 인간 혈청 알부민이 없는 PBS에서 투여되는 처리 아암을 지칭한다. 그래프의 우측에서, 25주에, 상부에서 하부까지의 평균 체중 데이터의 순서는 범례에서 열거된 처리 아암의 상부에서 하부까지의 순서와 동일하다 (데이터 수집이 연구 시작으로부터 13주에 종료된, Dmd mdx 래트를 HSA가 없는 비히클에서 투여된 1×1014 vg/kg 벡터로 처리하는 것은 제외한다). 이러한 동일한 약어들이 본원의 다른 도면에서 사용된다.
도 38a는 디스트로핀의 부재에 의해 야기된 근육 병변의 중증도의 정도를 추정하기 위해 사용된 반-정량적 채점 체계를 도해하는 조직학적 검사를 위해 염색된 Dmd mdx 래트로부터의 골격근의 예시적인 현미경사진을 제공한다. 골격근, 예컨대 도해된 것에서, 0점은 병변 부재에 상응하였고; 1점은 핵중심화(centronucleated) 섬유 및 소형 재생 병소에 의해 증명되는 바와 같은 약간의 재생 활성의 존재에 상응하였고; 2점은 단리된 또는 소형 클러스터 내에 있는 변성된 섬유의 존재에 상응하였으며; 3점은 조직 리모델링 및 섬유증 조직 또는 지방 조직에 의한 섬유 교체에 상응하였다. 심장 채점은 본문에서 설명된 바와 같은 상이한 기준을 사용하였다.
도 38b에서는 주사 3개월 후의 래트에 대한 총 DMD 병변 점수 (즉, 넙다리두갈래근, 가슴근, 횡경막 및 심장 근육에 대한 병변 하위점수의 평균)가 개별적으로, 뿐만 아니라 각각의 처리 아암 내의 모든 래트 사이의 평균으로 제시되고, 병변 점수에서의 벡터 용량-반응성 감소를 나타내도록 비교된다. "WT 모의"는 비히클로 처리된 WT 래트를 지칭하고, "KO 모의"는 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트를 지칭하고, "KO 1E13", "3E13", 및 "1E14"는 지시된 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터 (vg/kg)로 처리된 Dmd mdx 래트를 지칭한다. 막대 위의 문자는 그 아래의 데이터가 동일한 문자가 위에 나타난 다른 막대와 통계적으로 상이하지 않다는 것을 나타낸다. 반대로, 상이한 문자가 위에 나타난 막대들은 서로 통계적으로 상이하다. 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 및 던(Dunn) 검정을 사용하여 통계를 계산하였다.
도 39a는 증가되는 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트, 및 음성 대조군으로부터의 넙다리두갈래근 근육 샘플로부터의 대표적인 절편을 제공한다. 샘플을 전장 래트 디스트로핀 및 인간 미니-디스트로핀에 특이적으로 결합하는 항체, 및 결합 조직을 염색하는 밀 배아 응집소 접합체로 이중으로 표지하였다. 상부 패널은 주사 3개월 후에 희생된 동물로부터의 현미경사진이다. 하부 패널은 주사 6개월 후에 희생된 동물로부터의 현미경사진이다.
도 39b는 디스트로핀 단백질의 존재에 대해 양성으로 염색된, 증가되는 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트, 및 음성 대조군으로부터의 넙다리두갈래근 근육 샘플로부터의 무작위 절편 내의 퍼센트 섬유를 제공한다. 주사 3개월 및 6개월 후에 대한 데이터가 포함된다. 막대 위의 문자는 그 아래의 데이터가 동일한 문자가 위에 나타난 다른 막대와 통계적으로 상이하지 않다는 것을 나타낸다. 반대로, 상이한 문자가 위에 나타난 막대들은 서로 통계적으로 상이하다. ANOVA 분석 및 피셔(Fisher) 사후 양측 검정을 사용하여 통계를 계산하였다.
도 39c는 결합 조직의 존재에 대해 양성으로 염색된, 증가되는 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트, 및 음성 대조군으로부터의 넙다리두갈래근 근육 샘플의 무작위 절편 내의 퍼센트 면적을 제공한다. 주사 3개월 및 6개월 후에 대한 데이터가 포함된다. 막대 위의 문자는 그 아래의 데이터가 동일한 문자가 위에 나타난 다른 막대와 통계적으로 상이하지 않다는 것을 나타낸다. 반대로, 상이한 문자가 위에 나타난 막대들은 서로 통계적으로 상이하다. ANOVA 분석 및 피셔 사후 양측 검정을 사용하여 통계를 계산하였다.
도 40a는 주사 3개월 후에 희생된, 증가되는 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트, 및 음성 대조군으로부터의 횡경막 근육 샘플로부터의 대표적인 절편을 제공한다. 샘플을 전장 래트 디스트로핀 및 인간 미니-디스트로핀에 특이적으로 결합하는 항체, 및 결합 조직을 염색하는 밀 배아 응집소 접합체로 이중으로 표지하였다.
도 40b는 디스트로핀의 존재에 대해 양성으로 염색된, 증가되는 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트, 및 음성 대조군으로부터의 횡경막 근육 샘플로부터의 무작위 절편 내의 퍼센트 섬유를 제공한다. 주사 3개월 및 6개월 후에 대한 데이터가 포함된다. 막대 위의 문자는 그 아래의 데이터가 동일한 문자가 위에 나타난 다른 막대와 통계적으로 상이하지 않다는 것을 나타낸다. 반대로, 상이한 문자가 위에 나타난 막대들은 서로 통계적으로 상이하다. ANOVA 분석 및 피셔 사후 양측 검정을 사용하여 통계를 계산하였다.
도 40c는 결합 조직의 존재에 대해 양성으로 염색된, 증가되는 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트, 및 음성 대조군으로부터의 횡경막 근육 샘플로부터의 무작위 절편 내의 퍼센트 면적을 제공한다. 주사 3개월 및 6개월 후에 대한 데이터가 포함된다. 막대 위의 문자는 그 아래의 데이터가 동일한 문자가 위에 나타난 다른 막대와 통계적으로 상이하지 않다는 것을 나타낸다. 반대로, 상이한 문자가 위에 나타난 막대들은 서로 통계적으로 상이하다. ANOVA 분석 및 피셔 사후 양측 검정을 사용하여 통계를 계산하였다.
도 41a는 주사 3개월 및 6개월 후에 희생된, 증가되는 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트 (상부 패널), 및 음성 대조군 (하부 패널)로부터 취한 첨단부로부터 1/3의 심장의 대표적인 횡단 절편을 나타낸다. 조직학 절편을 피크로시리우스 레드(picrosirius red)로 염색하여 결합 조직의 가시화를 허용하였다. 가운데 패널은 전장 래트 디스트로핀 및 인간 미니-디스트로핀에 특이적으로 결합하는 항체, 및 결합 조직을 염색하는 밀 배아 응집소 접합체로 이중으로 표지된, 벡터 및 비히클 처리 Dmd mdx 래트로부터 취한 심장 근육의 대표적인 절편을 함유한다.
도 41b는 디스트로핀 단백질의 존재에 대해 염색된, 증가되는 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트, 및 음성 대조군으로부터의 심장 근육 샘플로부터의 무작위 절편 내의 퍼센트 섬유를 제공한다. 주사 3개월 및 6개월 후에 대한 데이터가 포함된다. 막대 위의 문자는 그 아래의 데이터가 동일한 문자가 위에 나타난 다른 막대와 통계적으로 상이하지 않다는 것을 나타낸다. 반대로, 상이한 문자가 위에 나타난 막대들은 서로 통계적으로 상이하다. ANOVA 분석 및 피셔 사후 양측 검정을 사용하여 통계를 계산하였다.
도 41c는 결합 조직의 존재에 대해 염색된, 증가되는 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트, 및 음성 대조군으로부터의 심장 근육 샘플의 무작위 절편 내의 퍼센트 면적을 제공한다. 주사 3개월 및 6개월 후에 대한 데이터가 포함된다. 막대 위의 문자는 그 아래의 데이터가 동일한 문자가 위에 나타난 다른 막대와 통계적으로 상이하지 않다는 것을 나타낸다. 반대로, 상이한 문자가 위에 나타난 막대들은 서로 통계적으로 상이하다. ANOVA 분석 및 피셔 사후 양측 검정을 사용하여 통계를 계산하였다.
도 42a는 5회의 가까운 간격의 악력 강도 테스트를 반복함으로써 측정된, 비히클로 처리된 Dmd mdx 및 WT 래트에 비교된 증가되는 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트에서의 근육 피로에 관한 데이터를 제공한다. 7-9주령에 주사한 래트에서 주사 3개월 후에 또는 래트가 약 4.5개월령일 때 테스트를 수행하였다. 그래프는 시험 1과 5 사이에 측정된 앞다리 악력 (시험 1 악력의 백분율로서 표현됨)에서의 감소를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 통계는 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트를 비히클이 제공된 WT 래트 (*p<0.05; ***p<0.001), 및 비히클이 제공된 Dmd mdx 래트 (¤¤p<0.01; ¤¤¤p<0.001) (양쪽 모두 음성 대조군)에 비교한다.
도 42b는 5회의 가까운 간격의 악력 강도 테스트를 반복함으로써 측정된, 비히클로 처리된 Dmd mdx 및 WT 래트에 비교된 증가되는 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트에서의 근육 피로에 관한 데이터를 제공한다. 7-9주령에 주사한 래트에서 주사 6개월 후에 또는 래트가 약 7.5개월령일 때 테스트를 수행하였다. 그래프는 시험 1과 5 사이에 측정된 앞다리 악력 (시험 1 악력의 백분율로서 표현됨)에서의 감소를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로서 표현된다.
도 43은 비히클 또는 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터가 투여된 WT 및 Dmd mdx 래트에서 주사 6개월 후에 M-모드 심장초음파검사에 의해 수득된 장축 영상으로부터 확장기 동안 측정된 좌심실 (LV) 확장기말 직경을 제공한다. 제시된 기술 통계는 평균 ± SEM이다.
도 44는 비히클 또는 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터가 투여된 WT 및 Dmd mdx 래트에서 주사 6개월 후에 M-모드 심장초음파검사에 의해 수득된 장축 영상으로부터 확장기 동안 측정된 박출률을 제공한다. 제시된 기술 통계는 평균 ± SEM이고, "$" 기호는 그 아래에 놓인 데이터와 비히클 (완충제)로 처리된 Dmd mdx 래트에 대한 데이터 사이의 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다 (p<0.05).
도 45a는 비히클 또는 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터가 투여된 WT 및 Dmd mdx 래트에서 주사 3개월 후에 첨단부 4-챔버 배향으로 펄스형 도플러를 사용하여 측정된 E/A 비를 제공한다. 제시된 기술 통계는 평균 ± SEM이고, "*" 기호는 그 아래에 놓인 데이터와 비히클 (완충제)로 처리된 WT 래트에 대한 데이터 사이의 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다 (p<0.05).
도 45b는 비히클 또는 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터가 투여된 WT 및 Dmd mdx 래트에서 주사 6개월 후에 첨단부 4-챔버 배향으로 펄스형 도플러를 사용하여 측정된 E/A 비를 제공한다. 제시된 기술 통계는 평균 ± SEM이고, "**" 기호는 그 아래에 놓인 데이터와 비히클 (완충제)로 처리된 WT 래트에 대한 데이터 사이의 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다 (p<0.01).
도 46a는 비히클 또는 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터가 투여된 WT 및 Dmd mdx 래트에서 주사 3개월 후에 첨단부 4-챔버 배향으로 펄스형 도플러를 사용하여 측정된 등용적 이완 시간을 제공한다. 제시된 기술 통계는 평균 ± SEM이다.
도 46b는 비히클 또는 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터가 투여된 WT 및 Dmd mdx 래트에서 주사 6개월 후에 첨단부 4-챔버 배향으로 펄스형 도플러를 사용하여 측정된 등용적 이완 시간을 제공한다. 제시된 기술 통계는 평균 ± SEM이고, "$" 기호는 그 아래에 놓인 데이터와 비히클 (완충제)로 처리된 Dmd mdx 래트에 대한 데이터 사이의 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다 (p<0.05).
도 47은 비히클 또는 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터가 투여된 WT 및 Dmd mdx 래트에서 주사 6개월 후에 첨단부 4-챔버 배향으로 펄스형 도플러를 사용하여 측정된 감속 시간을 제공한다. 제시된 기술 통계는 평균 ± SEM이고, "*" 기호는 그 아래에 놓인 데이터와 비히클 (완충제)로 처리된 WT 래트에 대한 데이터 사이의 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다 (p<0.05).
도 48a는 주사 3개월 후의 혈액 AST 수준에 대한 증가되는 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터의 Dmd mdx 래트에서의 효과를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 비-파라미터 크루스칼 왈리스 검정 및 사후 던 다중 비교 검정을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 통계는 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트를 음성 대조군으로서의 완충제 (비히클)가 제공된 WT 래트에 비교한다 (**p<0.01, *p<0.05).
도 48b는 주사 6개월 후의 혈액 AST 수준에 대한 상이한 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터의 Dmd mdx 래트에서의 효과를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 비-파라미터 크루스칼 왈리스 검정 및 사후 던 다중 비교 검정을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 통계는 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트를 음성 대조군으로서의 완충제 (비히클)가 제공된 WT 래트에 비교한다 (***p<0.001, **p<0.01).
도 49a는 주사 3개월 후의 혈액 ALT 수준에 대한 상이한 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터의 Dmd mdx 래트에서의 효과를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 비-파라미터 크루스칼 왈리스 검정 및 사후 던 다중 비교 검정을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 통계는 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트를 음성 대조군으로서의 완충제 (비히클)가 제공된 WT 래트 (***p<0.001, *p<0.05), 또는 완충제 (비히클)가 제공된 Dmd mdx 래트 (##p<0.01, #p<0.05)에 비교한다.
도 49b는 주사 6개월 후의 혈액 ALT 수준에 대한 상이한 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터의 Dmd mdx 래트에서의 효과를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 비-파라미터 크루스칼 왈리스 검정 및 사후 던 다중 비교 검정을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 통계는 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트를 음성 대조군으로서의 완충제 (비히클)가 제공된 WT 래트에 비교한다 (**p<0.01).
도 50a는 주사 3개월 후의 혈액 LDH 수준에 대한 상이한 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터의 Dmd mdx 래트에서의 효과를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 비-파라미터 크루스칼 왈리스 검정 및 사후 던 다중 비교 검정을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 통계는 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트를 음성 대조군으로서의 완충제 (비히클)가 제공된 WT 래트 (***p<0.001, **p<0.01), 또는 완충제 (비히클)가 제공된 Dmd mdx 래트 (#p<0.05)에 비교한다.
도 50b는 주사 6개월 후의 혈액 LDH 수준에 대한 상이한 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터의 Dmd mdx 래트에서의 효과를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 비-파라미터 크루스칼 왈리스 검정 및 사후 던 다중 비교 검정을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 통계는 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트를 음성 대조군으로서의 완충제 (비히클)가 제공된 WT 래트에 비교한다 (**p<0.01).
도 51a는 주사 3개월 후의 혈액 총 크레아틴 키나제 (CK) 수준에 대한 상이한 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터의 Dmd mdx 래트에서의 효과를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 비-파라미터 크루스칼 왈리스 검정 및 사후 던 다중 비교 검정을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 통계는 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트를 완충제 (비히클)가 제공된 WT 래트에 비교하거나 (**p<0.01), 또는 3×1014 vg/kg 벡터가 투약된 Dmd mdx 래트를 완충제 또는 1×1013 vg/kg 벡터가 제공된 Dmd mdx 래트에 비교한다 (##p<0.01).
도 51b는 주사 6개월 후의 혈액 총 크레아틴 키나제 (CK) 수준에 대한 상이한 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터의 Dmd mdx 래트에서의 효과를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 비-파라미터 크루스칼 왈리스 검정 및 사후 던 다중 비교 검정을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 통계는 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트를 음성 대조군으로서의 완충제 (비히클)가 제공된 WT 래트에 비교하거나 (***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05), 또는 3×1014 vg/kg 벡터가 투약된 Dmd mdx 래트를 1×1013 vg/kg 벡터가 제공된 Dmd mdx 래트에 비교한다 ($p<0.05).
도 52a는 비히클 또는 벡터 주사일 (D0)과 주사 3개월 후의 희생일 사이의 총 크레아틴 키나제 (CK) 전개를 제공한다. 단색 막대는 D0으로부터 데이터를 나타내는 반면, 빗금 막대는 3개월의 데이터를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로서 표현된다.
도 52b는 비히클 또는 벡터 주사일 (D0)과 주사 6개월 후의 희생일 사이의 총 크레아틴 키나제 (CK) 전개를 제공한다. 단색 막대는 D0으로부터 데이터를 나타내는 반면, 빗금 막대는 6개월의 데이터를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로서 표현된다.
도 53a는 비히클로 처리된 Dmd mdx 및 WT 래트에 비교된, 1×1014 vg/kg AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 더 나이든 Dmd mdx 래트의 평균 절대적 최대 앞다리 악력 강도를 제공한다. 4개월령에 주사한 래트에서 주사 3개월 후에 또는 래트가 약 7개월령일 때 테스트를 수행하였다. 결과는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 통계는 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트를 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트에 비교한다 (*p<0.01).
도 53b는 비히클로 처리된 Dmd mdx 및 WT 래트에 비교된, 1×1014 vg/kg AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 더 나이든 Dmd mdx 래트의 체중에 대해 상대적인 평균 최대 앞다리 악력 강도를 제공한다. 4개월령에 주사한 래트에서 주사 3개월 후에 또는 래트가 약 7개월령일 때 테스트를 수행하였다. 결과는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 통계는 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트를 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트에 비교한다 (*p<0.01).
도 53c는 비히클로 처리된 Dmd mdx 및 WT 래트에 비교된, 1×1014 vg/kg AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 더 나이든 Dmd mdx 래트에서의 근육 피로의 척도로서의 앞다리 악력의 전개를 나타낸다. 각각의 시험 사이의 간격을 짧게 하여 평균 최대 악력을 5회 측정함으로써 테스트를 수행하였다. 4개월령에 주사한 래트에서 주사 3개월 후에 또는 래트가 약 7개월령일 때 테스트를 수행하였다. 결과는 체중에 대해 상대적으로, 그리고 평균 ± SEM으로서 제공된다. 통계는 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트를 비히클이 제공된 WT 래트 (*p<0.05) 및 비히클이 제공된 Dmd mdx 래트 (¤¤p<0.01)에 비교하고, 이후의 시험들을 비히클 처리 Dmd mdx 래트에서의 시험 1에 비교한다 (§§p<0.01, §§§p<0.001).
도 54a는 비히클로 처리된 Dmd mdx 및 WT 래트에 비교된, 1×1014 vg/kg AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 더 나이든 Dmd mdx 래트의 평균 절대적 최대 앞다리 악력 강도를 제공한다. 6개월령에 주사한 래트에서 주사 3개월 후에 또는 래트가 약 9개월령일 때 테스트를 수행하였다. 결과는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 통계는 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트를 비히클로 처리된 WT 래트에 비교한다 (**p<0.01).
도 54b는 비히클로 처리된 Dmd mdx 및 WT 래트에 비교된, 1×1014 vg/kg AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 더 나이든 Dmd mdx 래트의 체중에 대해 상대적인 평균 최대 앞다리 악력 강도를 제공한다. 6개월령에 주사한 래트에서 주사 3개월 후에 또는 래트가 약 9개월령일 때 테스트를 수행하였다. 결과는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 통계는 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트를 비히클로 처리된 WT 래트에 비교하거나 (*p<0.05), 또는 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트를 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트에 비교한다 (¤p<0.05).
도 54c는 비히클로 처리된 Dmd mdx 및 WT 래트에 비교된, 1×1014 vg/kg AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 더 나이든 Dmd mdx 래트에서의 근육 피로의 척도로서의 앞다리 악력의 전개를 나타낸다. 각각의 시험 사이의 간격을 짧게 하여 평균 최대 악력을 5회 측정함으로써 테스트를 수행하였다. 6개월령에 주사한 래트에서 주사 3개월 후에 또는 래트가 약 9개월령일 때 테스트를 수행하였다. 결과는 체중에 대해 상대적으로, 그리고 평균 ± SEM으로서 제공된다. 통계는 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트를 비히클이 제공된 Dmd mdx 래트에 비교하고 (¤p<0.05), 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트를 비히클이 제공된 WT 래트에 비교하며 (**p<0.01, ***p<0.001), 시험 5를 비히클 처리 Dmd mdx 래트에서의 시험 1에 비교한다 (§§p<0.01).
도 55a-55c는 미니-디스트로핀 단백질 Δ3990 (서열식별번호: 27) 및 미니-디스트로핀 단백질 Dys3978 (서열식별번호: 7)의 아미노산 서열 사이의 정렬을 제공한다.
도 56a-56i는 인간 디스트로핀 단백질을 코딩하는 야생형 핵산 서열로부터 유래된, 미니-디스트로핀 Δ3990을 코딩하는 핵산 서열 (서열식별번호: 28)과 미니-디스트로핀 Dys3978을 코딩하는 인간 코돈-최적화 핵산 서열 (Hopti-Dys3978로 칭해짐; 서열식별번호: 1) 사이의 정렬을 제공한다.
도 2는 코돈-최적화가 미니-디스트로핀 유전자 발현을 효과적으로 강화한다는 것을 나타낸다. 상부 패널은 (A) 형질감염되지 않은 293 세포에서의, 또는 원래의 최적화되지 않은 (B), 또는 최적화된 (C) 미니-디스트로핀 Dys3978 벡터 플라스미드의 형질감염 후의 미니-디스트로핀 단백질의 면역형광 (IF) 염색을 나타낸다. 하부 패널은 형질감염된 293 세포에서의 미니-디스트로핀의 웨스턴 블롯을 나타낸다. 왼쪽 블롯은 동일한 양의 세포 용해물을 사용하였고, 최적화된 cDNA에 의한 압도적인 발현을 나타낸다. 오른쪽 블롯은 최적화된 미니-디스트로핀 cDNA로 형질감염된 293 세포로부터의 세포 용해물의 100× 희석물을 사용한 한편, 최적화되지 않은 샘플은 희석되지 않았다. 100× 희석 후에도 최적화된 것의 신호가 여전히 더 강하다는 것을 주지한다.
도 3은 AAV9 벡터로 처리된 디스트로핀/유트로핀 이중 녹아웃(knockout) (dKO) 마우스에서의 인간 미니-디스트로핀 발현의 IF 염색을 나타낸다. 야생형 대조군 마우스 C57BL/10 (C57), 미처리 dKO 마우스, 및 AAV9-CMV-Hopti-Dys3978로 처리된 dKO 마우스 (T-dKO)로부터의 근육 및 심장 샘플을 얇게 절편화하고, 마우스 야생형 디스트로핀 및 인간 미니-디스트로핀 단백질 양쪽 모두를 또한 인식하는 항체로 염색하였다. 검사된 모든 샘플에서 고도로 효율적인 발현이 달성되었다.
도 4는 AAV9-CMV-Hopti-Dys3978 처리의 결과로서의 dKO 마우스의 체중의 정규화를 나타낸다. 야생형 대조군 B10 마우스 (C57BL/10), 미처리 mdx 마우스, 미처리 dKO 마우스, 및 벡터-처리 dKO 마우스로부터 4개월령에 데이터를 수득하였다.
도 5는 AAV9-CMV-Hopti-Dys3978 처리의 결과로서의 dKO 마우스의 악력 및 트레드밀 달리기의 개선을 나타낸다. 야생형 대조군 B10 마우스 (C57BL/10), 미처리 mdx 마우스, 미처리 dKO 마우스, 및 벡터-처리 dKO 마우스 (T-dKO)로부터 3개월령에 데이터를 수득하였다.
도 6a-6b는 AAV9-CMV-Hopti-Dys3978 처리의 결과로서의 dKO 마우스의 디스트로피 병리학의 호전을 나타낸다. (도 6a) 야생형 대조군 C57BL/10 마우스, 미처리 dKO 마우스, 및 벡터-처리 dKO (T-dKO) 마우스로부터의 앞정강근의 동결절편 (8 ㎛)을 조직병리학을 위해 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색에 적용하였다 (10× 확대). (도 6b) 근육 질량, 심장 질량, 중심에 위치하는 핵의 백분율, 및 혈청 크레아틴 키나제 활성의 정량적 분석.
도 7은 미처리 dKO 마우스 및 야생형 마우스에 비교된 인간 코돈-최적화 미니-디스트로핀 Dys3978 벡터 (AAV9-CMV-Hopti-Dys3978)로 처리된 dKO 마우스의 생존 곡선을 나타낸다. 처리된 dKO 마우스의 50％ 초과가 80주 (실험 기간)를 초과하여 생존하였다
도 8은 AAV9-CMV-Hopti-Dys3978 처리의 결과로서의 dKO 마우스의 심장 기능의 개선을 나타낸다. 야생형 대조군 C57BL/10 마우스, 미처리 mdx 마우스, 및 AAV9 벡터-처리 dKO 마우스 상에서 혈류역학 분석을 수행하였다. 미처리 dKO 마우스는 너무 아파서 절차를 견디지 못했다. 도부타민 챌린지의 존재 또는 부재 하에 3개의 마우스 군으로부터 데이터를 수집하였다.
도 9a-9b는 AAV9-CMV-Hopti-Dys3978 처리의 결과로서의 dKO 마우스의 심전도 (ECG)에서의 개선을 나타낸다. (도 9a) ECG의 PR 간격이 벡터-처리 dKO 마우스에서 개선되었다. (도 9b) 분석의 정량적 데이터. 3개의 군의 심박수를 주의깊게 모니터링하도록 실험을 수행하여, ECG가 심박수 변동에 영향을 받지 않았다. *p<0.05.
도 10은 CMV 또는 hCK 프로모터를 함유하는 AAV9-Hopti-Dys3978 벡터의 꼬리 정맥 주사 후 mdx 마우스에서 인간 코돈-최적화 미니-디스트로핀 Dys3978을 구동시키는 것에서의 비-조직 특이적 CMV 프로모터 및 근육-특이적 hCK 프로모터를 비교하는 것을 나타낸다. IF 염색을 사용하여, 인간 미니-디스트로핀 Dys3978은 사지 근육 및 심장 근육에서도 견고한 발현을 나타냈다. hCK 프로모터가 CMV 프로모터보다 더욱 효과적인 것으로 나타냈다.
도 11은 AAV9-CMV-Hopti-Dys3978 벡터의 단리된 사지 정맥 관류 후의 GRMD 개 "젤리(Jelly)"의 뒷다리의 자기 공명 영상화 (MRI) 영상을 나타낸다. 사타구니 구역에 단단한 지혈대가 놓인 오른쪽 뒷다리에 압력으로 벡터를 주입하였다. 흰색을 띠는 신호는 관류된 사지 내의 벡터 용액 정체를 나타냈다.
도 12는 GRMD 개 "젤리"에서의 벡터 주사 2개월 후의 인간 미니-디스트로핀 Dys3978 발현의 IF 염색을 나타낸다. 오른쪽 및 왼쪽 뒷다리 양쪽 모두에서의 5가지 상이한 근육 군으로부터의 생검 샘플을 검사하였다. 주사하지 않은 왼쪽 다리에도 검출가능한 Dys3978이 있었고, 이는 AAV9 벡터가 주사 부위로부터 반대쪽 다리로 이동하였음을 시사한다.
도 13은 GRMD 개 "젤리"에서의 벡터 주사 7개월 후의 인간 미니-디스트로핀 Dys3978 발현의 IF 염색을 나타낸다. 오른쪽 및 왼쪽 뒷다리 양쪽 모두에서의 4가지 상이한 근육 군으로부터의 생검 샘플을 검사하였다. 주사하지 않은 왼쪽 다리에도 검출가능한 Dys3978이 있었고, 이는 AAV9 벡터가 주사 부위로부터 반대쪽 다리로 이동하였음을 시사한다. Dys3978의 웨스턴 블롯 분석을 동일한 샘플 상에서 행하였다.
도 14는 GRMD 개 "젤리"에서의 벡터 주사 12개월 후의 인간 미니-디스트로핀 Dys3978 발현의 IF 염색을 나타낸다. 오른쪽 및 왼쪽 뒷다리 양쪽 모두에서의 4가지 상이한 근육 군으로부터의 생검 샘플, 및 앞다리에서의 1개의 샘플을 검사하였다. 주사하지 않은 왼쪽 다리에도 검출가능한 Dys3978이 있었고, 이는 AAV9 벡터가 주사 부위로부터 반대쪽 다리로 이동하였음을 시사한다.
도 15는 GRMD 개 "젤리"에서의 벡터 주사 2년 후의 인간 미니-디스트로핀 Dys3978 발현의 IF 염색을 나타낸다. 오른쪽 및 왼쪽 뒷다리 양쪽 모두에서의 2가지 상이한 근육 군으로부터의 생검 샘플을 검사하였다. 주사하지 않은 왼쪽 다리에 주사된 다리보다 더 많은 검출가능한 Dys3978이 있는 것으로 보였음을 주지한다.
도 16은 인간 미니-디스트로핀 Dys3978의 IF 염색을 나타낸다. 오른쪽 및 왼쪽 뒷다리 양쪽 모두에서의 (도 15와 비교하여) 2개의 추가적인 근육 군의 생검 샘플, 및 앞다리에서의 1개의 샘플을 GRMD 개 "젤리"로부터 검사하였다. 샘플을 또한 벡터 주사 2년 후에 수집하였다.
도 17은 GRMD 개 "젤리"로부터의 주사하지 않은 왼쪽 뒷다리에서의 벡터 주사 4년 후의 인간 미니-디스트로핀 Dys3978의 IF 염색을 나타낸다.
도 18은 GRMD 개 "젤리"에서의 벡터 주사 8년 초과 후의 인간 미니-디스트로핀 Dys3978의 IF 염색을 나타낸다. 5가지 상이한 근육 군 및 심장의 부검 근육 샘플을 검사하였다.
도 19는 GRMD 개 "젤리"에서의 벡터 주사 8년 초과 후의 인간 미니-디스트로핀 Dys3978 및 내인성 복귀변이체 디스트로핀의 IF 염색을 나타낸다. 3가지 상이한 근육 군의 부검 근육 샘플을 인간 및 개 디스트로핀 양쪽 모두를 인식한 항체 (상부 패널) 또는 개 복귀변이체 디스트로핀만 인식한 항체 (하부 패널)로 염색하였다. 복귀변이체 디스트로핀 양성 근섬유가 화살표로 강조되었다. 복귀변이체 섬유는 인간 DMD 환자, 뿐만 아니라 mdx 마우스 및 GRMD 개에서 발생하는 디스트로핀 단백질에 대해 양성으로 염색되는 희귀 근육 섬유이다. 복귀변이체 섬유가 발생하는 정확한 메커니즘은 완전히 이해되지 않지만, 항체 프로브가 인식하는 에피토프가 있는 짧아진 디스트로핀을 생산하는 희귀 근육 세포에서의 엑손 건너뛰기를 수반할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Lu, QL, et al., J Cell Biol 148:985-96 (2000)]을 참조한다.
도 20은 AAV9 벡터 주사 8년 초과 후의 부검 시에 GRMD 개 "젤리"의 근육 샘플 내에 존재하는 인간 미니-디스트로핀 Dys3978의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 웨스턴 블롯은 검사된 모든 골격근에 인간 미니-디스트로핀 Dys3978이 존재하였음을 나타냈다. 나이 및 성별이 매칭되는 "몰리(Molly)"라는 이름의 정상적인 개로부터의 근육을 디스트로핀 단백질의 정량을 지시하도록 단계적 2-배 희석으로 양성 대조군으로서 사용하였다. 야생형 전장 디스트로핀의 분자량은 약 400 kDa인 한편, 미니-디스트로핀 Dys3978 단백질은 약 150 kDa이다.
도 21은 AAV9-CMV-Hopti-Dys3978 벡터의 주사 후의 GRMD 개 "젤리에서의 근육 수축력 개선, 및 신체 전반에 걸친 유전자 발현을 나타낸다. 상부의 곡선은 정상적인 개의 근력을 나타내는 한편, 하부의 곡선은 미처리 GRMD 개의 근력을 나타낸다. 더 많은 시점 내로 연장된 2개의 곡선은 개 "젤리"의 근력을 나타낸다. AAV9-CMV-개-미니-디스트로핀 Dys3849 벡터 (Wang, et al., PNAS 97(25):13714-9 (2000))로 처리된 2마리의 추가적인 GRMD 개를 근력에 대해 또한 검사하였고, 개선을 나타냈다 ("재스퍼(Jasper)" 및 "페리도트(Peridot)").
도 22는 GRMD 개 "던킨(Dunkin)"에서의 AAV9-hCK-Copti-Dys3978 벡터 주사 4개월 후의 인간 미니-디스트로핀 발현의 근육 생검 IF 염색을 나타낸다. 신체 전반에 걸친 유전자 발현을 달성하도록 정맥내 주사에 의해 벡터를 전달하였다. 뒷다리 내의 4가지 상이한 근육 군의 생검 샘플을 검사하였다. 모든 근육 군에서 거의 균일한 미니-디스트로핀 Dys3978이 검출되었음을 주지한다.
도 23은 GRMD 개 "던킨"에서의 AAV9-hCK-Copti-Dys3978 벡터 주사 14개월 후의 인간 미니-디스트로핀 발현의 IF 염색을 나타낸다. 부검 샘플을 취하고 검사하였다. 광범위하고 견고한 수준의 미니-디스트로핀 Dys3978이 심장 및 모든 근육 군에서 검출되었음을 주지한다. 확대 4×.
도 24는 GRMD 개 "던킨"에서의 AAV9-hCK-Copti-Dys3978 벡터 주사 14개월 후의 견고한 수준의 인간 미니-디스트로핀이 검출된 횡경막 근육의 IF 염색을 나타낸다.
도 25는 GRMD 개 "던킨"에서의 AAV9-hCK-Copti-Dys3978 벡터 주사 14개월 후의 견고한 수준의 인간 미니-디스트로핀이 검출된 긴종아리근의 IF 염색을 나타낸다.
도 26은 GRMD 개 "던킨"에서의 AAV9-hCK-Copti-Dys3978 벡터 주사 14개월 후의 견고한 수준의 인간 미니-디스트로핀이 검출된 반막모양근의 IF 염색을 나타낸다.
도 27은 GRMD 개 "던킨"에서의 AAV9-hCK-Copti-Dys3978 벡터 주사 14개월 후의 견고한 수준의 인간 미니-디스트로핀이 검출된 심장 좌심실 (LV) 근육의 IF 염색을 나타낸다.
도 28은 벡터 주사 4개월 및 14개월 후의 GRMD 개 "던킨"의 근육 샘플에서의 인간 미니-디스트로핀 Dys3978의 웨스턴 블롯에 의한 검출을 나타낸다. 나이가 매칭되는 정상적인 개로부터의 근육을 디스트로핀 단백질의 정량을 지시하도록 단계적 2-배 희석으로 양성 대조군으로서 사용하였다. 야생형 전장 디스트로핀의 분자량은 약 400 kDa인 한편, 미니-디스트로핀 Dys3978은 약 150 kDa이다. 미니-디스트로핀 Dys3978이 간에서 검출되지 않았음을 주지한다.
도 29는 벡터 주사 14개월 후의 GRMD 개 "던킨"의 심장 (LV) 샘플에서의 인간 미니-디스트로핀 Dys3978 발현의 웨스턴 블롯에 의한 검출을 나타낸다. 나이가 매칭되는 정상적인 개로부터의 심장 샘플을 디스트로핀 단백질의 정량을 지시하도록 단계적 2-배 희석으로 양성 대조군으로서 사용하였다.
도 30은 다양한 근육 군의 인간 미니-디스트로핀 Dys 3978, 뿐만 아니라 감마-사르코글리칸 (r-SG)의 IF 염색에 의해 나타난 바와 같이 디스트로핀 회합 단백질 복합체의 복구를 나타낸다.
도 31은 다양한 근육 및 조직에서의 AAV9-CMV-Copti-Dys3978 벡터 DNA 카피의 분석을 나타낸다. 정량적 PCR (qPCR)을 수행하여 AAV 벡터 DNA 게놈 카피수를 결정하고, 이를 이배수체 세포 당 기준으로 정규화하였다.
도 32는 나이가 매칭되는 정상 개 및 미처리 GRMD 개에 비교된 AAV9-CMV-Copti-Dys3978 벡터 GRMD 개 "던킨"의 심장에서의 디스트로피 조직병리학의 개선을 나타낸다. HE 염색.
도 33은 나이가 매칭되는 정상 개 및 미처리 GRMD 개에 비교된 AAV9-CMV-Copti-Dys3978 벡터 GRMD 개 "던킨"의 횡경막 근육에서의 디스트로피 조직병리학의 개선을 나타낸다. HE 염색.
도 34는 나이가 매칭되는 미처리 GRMD 개에 비교된 AAV9-CMV-Copti-Dys3978 벡터 GRMD 개 "던킨"의 사지 근육에서의 디스트로피 조직병리학의 개선을 나타낸다. HE 염색.
도 35는 나이가 매칭되는 미처리 GRMD 개에 비교된 GRMD 개 "던킨"의 사지 근육 및 횡격막에서의 섬유증의 억제를 나타낸다. 메이슨 트리크롬 블루(Mason Trichrome blue) 염색.
도 36a는 PBS로 모의 처리된 WT 래트 (왼쪽 패널), 모의 처리된 DMD 래트 (가운데 패널), 및 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트 (오른쪽 패널)로부터 수득된 넙다리두갈래근의 항-디스트로핀 DYSB 항체로의 면역표지화를 나타내는 현미경사진을 제공한다. 섬유 주변의 진한 윤곽은 WT 래트에서의 디스트로핀 및 벡터 처리 Dmd mdx 래트에서의 미니-디스트로핀의 근초하 국소화를 나타낸다.
도 36b는 모의 처리된 WT 래트 (왼쪽 패널), 모의 처리된 Dmd mdx 래트 (가운데 패널) 및 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 DMD 래트 (오른쪽 패널)로부터 수득된 헤마톡실린 및 에오신 (HES)으로 염색된 넙다리두갈래근의 현미경사진을 제공한다. 괴사성 섬유의 클러스터 (*) 및 근내막 경도 섬유증 (검정 화살촉)이 나타난다.
도 36c는 모의 처리된 WT 래트 (왼쪽 패널), 모의 처리된 Dmd mdx 래트 (가운데 패널) 및 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트 (오른쪽 패널)로부터 수득된 심장 근육의 항-디스트로핀 DYSB 항체로의 면역표지화를 나타내는 현미경사진을 제공한다. 섬유 주변의 진한 윤곽은 WT 래트에서의 디스트로핀 및 벡터 처리 Dmd mdx 래트에서의 미니-디스트로핀의 근초하 국소화를 나타낸다.
도 36d는 모의 처리된 WT 래트 (왼쪽 패널), 모의 처리된 Dmd mdx 래트 (가운데 패널) 및 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트 (오른쪽 패널)로부터 수득된 HES로 염색된 심장 근육을 나타내는 현미경사진을 제공한다. 섬유증 병소 (백색 화살촉)가 가운데 패널에서 나타나고, 단핵 세포 침윤의 병소가 오른쪽 패널에서 도해된다.
도 37은 투약 후 25주까지의 시간에 걸친 비히클 (완충제)로 처리된 WT 래트 및 비히클 및 증가되는 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트의 그램 단위의 평균 체중을 나타낸다. "WT"는 야생형 래트를 지칭하고; "DMD"는 Dmd mdx 래트를 지칭하고; "n"은 샘플 크기를 지칭하고; "D"는 투약 이후의 일수를 지칭하고; "W"는 투약 이후의 주수를 지칭하고; "E"는 지정된 계수 곱하기 지정된 지수로 거듭제곱된 10에 대한 표기이고 (따라서, "1E13"은 1×1013을 나타내고, "3E13"은 3×1013을 나타내고, "1E14"는 1×1014를 나타내며, "3E14"는 3×1014를 나타낸다); "vg/kg"은 체중 킬로그램 당 벡터 게놈을 나타내며; "HAS 부재"는 벡터가 인간 혈청 알부민이 없는 PBS에서 투여되는 처리 아암을 지칭한다. 그래프의 우측에서, 25주에, 상부에서 하부까지의 평균 체중 데이터의 순서는 범례에서 열거된 처리 아암의 상부에서 하부까지의 순서와 동일하다 (데이터 수집이 연구 시작으로부터 13주에 종료된, Dmd mdx 래트를 HSA가 없는 비히클에서 투여된 1×1014 vg/kg 벡터로 처리하는 것은 제외한다). 이러한 동일한 약어들이 본원의 다른 도면에서 사용된다.
도 38a는 디스트로핀의 부재에 의해 야기된 근육 병변의 중증도의 정도를 추정하기 위해 사용된 반-정량적 채점 체계를 도해하는 조직학적 검사를 위해 염색된 Dmd mdx 래트로부터의 골격근의 예시적인 현미경사진을 제공한다. 골격근, 예컨대 도해된 것에서, 0점은 병변 부재에 상응하였고; 1점은 핵중심화(centronucleated) 섬유 및 소형 재생 병소에 의해 증명되는 바와 같은 약간의 재생 활성의 존재에 상응하였고; 2점은 단리된 또는 소형 클러스터 내에 있는 변성된 섬유의 존재에 상응하였으며; 3점은 조직 리모델링 및 섬유증 조직 또는 지방 조직에 의한 섬유 교체에 상응하였다. 심장 채점은 본문에서 설명된 바와 같은 상이한 기준을 사용하였다.
도 38b에서는 주사 3개월 후의 래트에 대한 총 DMD 병변 점수 (즉, 넙다리두갈래근, 가슴근, 횡경막 및 심장 근육에 대한 병변 하위점수의 평균)가 개별적으로, 뿐만 아니라 각각의 처리 아암 내의 모든 래트 사이의 평균으로 제시되고, 병변 점수에서의 벡터 용량-반응성 감소를 나타내도록 비교된다. "WT 모의"는 비히클로 처리된 WT 래트를 지칭하고, "KO 모의"는 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트를 지칭하고, "KO 1E13", "3E13", 및 "1E14"는 지시된 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터 (vg/kg)로 처리된 Dmd mdx 래트를 지칭한다. 막대 위의 문자는 그 아래의 데이터가 동일한 문자가 위에 나타난 다른 막대와 통계적으로 상이하지 않다는 것을 나타낸다. 반대로, 상이한 문자가 위에 나타난 막대들은 서로 통계적으로 상이하다. 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 및 던(Dunn) 검정을 사용하여 통계를 계산하였다.
도 39a는 증가되는 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트, 및 음성 대조군으로부터의 넙다리두갈래근 근육 샘플로부터의 대표적인 절편을 제공한다. 샘플을 전장 래트 디스트로핀 및 인간 미니-디스트로핀에 특이적으로 결합하는 항체, 및 결합 조직을 염색하는 밀 배아 응집소 접합체로 이중으로 표지하였다. 상부 패널은 주사 3개월 후에 희생된 동물로부터의 현미경사진이다. 하부 패널은 주사 6개월 후에 희생된 동물로부터의 현미경사진이다.
도 39b는 디스트로핀 단백질의 존재에 대해 양성으로 염색된, 증가되는 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트, 및 음성 대조군으로부터의 넙다리두갈래근 근육 샘플로부터의 무작위 절편 내의 퍼센트 섬유를 제공한다. 주사 3개월 및 6개월 후에 대한 데이터가 포함된다. 막대 위의 문자는 그 아래의 데이터가 동일한 문자가 위에 나타난 다른 막대와 통계적으로 상이하지 않다는 것을 나타낸다. 반대로, 상이한 문자가 위에 나타난 막대들은 서로 통계적으로 상이하다. ANOVA 분석 및 피셔(Fisher) 사후 양측 검정을 사용하여 통계를 계산하였다.
도 39c는 결합 조직의 존재에 대해 양성으로 염색된, 증가되는 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트, 및 음성 대조군으로부터의 넙다리두갈래근 근육 샘플의 무작위 절편 내의 퍼센트 면적을 제공한다. 주사 3개월 및 6개월 후에 대한 데이터가 포함된다. 막대 위의 문자는 그 아래의 데이터가 동일한 문자가 위에 나타난 다른 막대와 통계적으로 상이하지 않다는 것을 나타낸다. 반대로, 상이한 문자가 위에 나타난 막대들은 서로 통계적으로 상이하다. ANOVA 분석 및 피셔 사후 양측 검정을 사용하여 통계를 계산하였다.
도 40a는 주사 3개월 후에 희생된, 증가되는 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트, 및 음성 대조군으로부터의 횡경막 근육 샘플로부터의 대표적인 절편을 제공한다. 샘플을 전장 래트 디스트로핀 및 인간 미니-디스트로핀에 특이적으로 결합하는 항체, 및 결합 조직을 염색하는 밀 배아 응집소 접합체로 이중으로 표지하였다.
도 40b는 디스트로핀의 존재에 대해 양성으로 염색된, 증가되는 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트, 및 음성 대조군으로부터의 횡경막 근육 샘플로부터의 무작위 절편 내의 퍼센트 섬유를 제공한다. 주사 3개월 및 6개월 후에 대한 데이터가 포함된다. 막대 위의 문자는 그 아래의 데이터가 동일한 문자가 위에 나타난 다른 막대와 통계적으로 상이하지 않다는 것을 나타낸다. 반대로, 상이한 문자가 위에 나타난 막대들은 서로 통계적으로 상이하다. ANOVA 분석 및 피셔 사후 양측 검정을 사용하여 통계를 계산하였다.
도 40c는 결합 조직의 존재에 대해 양성으로 염색된, 증가되는 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트, 및 음성 대조군으로부터의 횡경막 근육 샘플로부터의 무작위 절편 내의 퍼센트 면적을 제공한다. 주사 3개월 및 6개월 후에 대한 데이터가 포함된다. 막대 위의 문자는 그 아래의 데이터가 동일한 문자가 위에 나타난 다른 막대와 통계적으로 상이하지 않다는 것을 나타낸다. 반대로, 상이한 문자가 위에 나타난 막대들은 서로 통계적으로 상이하다. ANOVA 분석 및 피셔 사후 양측 검정을 사용하여 통계를 계산하였다.
도 41a는 주사 3개월 및 6개월 후에 희생된, 증가되는 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트 (상부 패널), 및 음성 대조군 (하부 패널)로부터 취한 첨단부로부터 1/3의 심장의 대표적인 횡단 절편을 나타낸다. 조직학 절편을 피크로시리우스 레드(picrosirius red)로 염색하여 결합 조직의 가시화를 허용하였다. 가운데 패널은 전장 래트 디스트로핀 및 인간 미니-디스트로핀에 특이적으로 결합하는 항체, 및 결합 조직을 염색하는 밀 배아 응집소 접합체로 이중으로 표지된, 벡터 및 비히클 처리 Dmd mdx 래트로부터 취한 심장 근육의 대표적인 절편을 함유한다.
도 41b는 디스트로핀 단백질의 존재에 대해 염색된, 증가되는 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트, 및 음성 대조군으로부터의 심장 근육 샘플로부터의 무작위 절편 내의 퍼센트 섬유를 제공한다. 주사 3개월 및 6개월 후에 대한 데이터가 포함된다. 막대 위의 문자는 그 아래의 데이터가 동일한 문자가 위에 나타난 다른 막대와 통계적으로 상이하지 않다는 것을 나타낸다. 반대로, 상이한 문자가 위에 나타난 막대들은 서로 통계적으로 상이하다. ANOVA 분석 및 피셔 사후 양측 검정을 사용하여 통계를 계산하였다.
도 41c는 결합 조직의 존재에 대해 염색된, 증가되는 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트, 및 음성 대조군으로부터의 심장 근육 샘플의 무작위 절편 내의 퍼센트 면적을 제공한다. 주사 3개월 및 6개월 후에 대한 데이터가 포함된다. 막대 위의 문자는 그 아래의 데이터가 동일한 문자가 위에 나타난 다른 막대와 통계적으로 상이하지 않다는 것을 나타낸다. 반대로, 상이한 문자가 위에 나타난 막대들은 서로 통계적으로 상이하다. ANOVA 분석 및 피셔 사후 양측 검정을 사용하여 통계를 계산하였다.
도 42a는 5회의 가까운 간격의 악력 강도 테스트를 반복함으로써 측정된, 비히클로 처리된 Dmd mdx 및 WT 래트에 비교된 증가되는 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트에서의 근육 피로에 관한 데이터를 제공한다. 7-9주령에 주사한 래트에서 주사 3개월 후에 또는 래트가 약 4.5개월령일 때 테스트를 수행하였다. 그래프는 시험 1과 5 사이에 측정된 앞다리 악력 (시험 1 악력의 백분율로서 표현됨)에서의 감소를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 통계는 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트를 비히클이 제공된 WT 래트 (*p<0.05; ***p<0.001), 및 비히클이 제공된 Dmd mdx 래트 (¤¤p<0.01; ¤¤¤p<0.001) (양쪽 모두 음성 대조군)에 비교한다.
도 42b는 5회의 가까운 간격의 악력 강도 테스트를 반복함으로써 측정된, 비히클로 처리된 Dmd mdx 및 WT 래트에 비교된 증가되는 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트에서의 근육 피로에 관한 데이터를 제공한다. 7-9주령에 주사한 래트에서 주사 6개월 후에 또는 래트가 약 7.5개월령일 때 테스트를 수행하였다. 그래프는 시험 1과 5 사이에 측정된 앞다리 악력 (시험 1 악력의 백분율로서 표현됨)에서의 감소를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로서 표현된다.
도 43은 비히클 또는 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터가 투여된 WT 및 Dmd mdx 래트에서 주사 6개월 후에 M-모드 심장초음파검사에 의해 수득된 장축 영상으로부터 확장기 동안 측정된 좌심실 (LV) 확장기말 직경을 제공한다. 제시된 기술 통계는 평균 ± SEM이다.
도 44는 비히클 또는 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터가 투여된 WT 및 Dmd mdx 래트에서 주사 6개월 후에 M-모드 심장초음파검사에 의해 수득된 장축 영상으로부터 확장기 동안 측정된 박출률을 제공한다. 제시된 기술 통계는 평균 ± SEM이고, "$" 기호는 그 아래에 놓인 데이터와 비히클 (완충제)로 처리된 Dmd mdx 래트에 대한 데이터 사이의 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다 (p<0.05).
도 45a는 비히클 또는 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터가 투여된 WT 및 Dmd mdx 래트에서 주사 3개월 후에 첨단부 4-챔버 배향으로 펄스형 도플러를 사용하여 측정된 E/A 비를 제공한다. 제시된 기술 통계는 평균 ± SEM이고, "*" 기호는 그 아래에 놓인 데이터와 비히클 (완충제)로 처리된 WT 래트에 대한 데이터 사이의 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다 (p<0.05).
도 45b는 비히클 또는 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터가 투여된 WT 및 Dmd mdx 래트에서 주사 6개월 후에 첨단부 4-챔버 배향으로 펄스형 도플러를 사용하여 측정된 E/A 비를 제공한다. 제시된 기술 통계는 평균 ± SEM이고, "**" 기호는 그 아래에 놓인 데이터와 비히클 (완충제)로 처리된 WT 래트에 대한 데이터 사이의 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다 (p<0.01).
도 46a는 비히클 또는 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터가 투여된 WT 및 Dmd mdx 래트에서 주사 3개월 후에 첨단부 4-챔버 배향으로 펄스형 도플러를 사용하여 측정된 등용적 이완 시간을 제공한다. 제시된 기술 통계는 평균 ± SEM이다.
도 46b는 비히클 또는 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터가 투여된 WT 및 Dmd mdx 래트에서 주사 6개월 후에 첨단부 4-챔버 배향으로 펄스형 도플러를 사용하여 측정된 등용적 이완 시간을 제공한다. 제시된 기술 통계는 평균 ± SEM이고, "$" 기호는 그 아래에 놓인 데이터와 비히클 (완충제)로 처리된 Dmd mdx 래트에 대한 데이터 사이의 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다 (p<0.05).
도 47은 비히클 또는 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터가 투여된 WT 및 Dmd mdx 래트에서 주사 6개월 후에 첨단부 4-챔버 배향으로 펄스형 도플러를 사용하여 측정된 감속 시간을 제공한다. 제시된 기술 통계는 평균 ± SEM이고, "*" 기호는 그 아래에 놓인 데이터와 비히클 (완충제)로 처리된 WT 래트에 대한 데이터 사이의 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다 (p<0.05).
도 48a는 주사 3개월 후의 혈액 AST 수준에 대한 증가되는 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터의 Dmd mdx 래트에서의 효과를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 비-파라미터 크루스칼 왈리스 검정 및 사후 던 다중 비교 검정을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 통계는 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트를 음성 대조군으로서의 완충제 (비히클)가 제공된 WT 래트에 비교한다 (**p<0.01, *p<0.05).
도 48b는 주사 6개월 후의 혈액 AST 수준에 대한 상이한 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터의 Dmd mdx 래트에서의 효과를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 비-파라미터 크루스칼 왈리스 검정 및 사후 던 다중 비교 검정을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 통계는 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트를 음성 대조군으로서의 완충제 (비히클)가 제공된 WT 래트에 비교한다 (***p<0.001, **p<0.01).
도 49a는 주사 3개월 후의 혈액 ALT 수준에 대한 상이한 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터의 Dmd mdx 래트에서의 효과를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 비-파라미터 크루스칼 왈리스 검정 및 사후 던 다중 비교 검정을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 통계는 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트를 음성 대조군으로서의 완충제 (비히클)가 제공된 WT 래트 (***p<0.001, *p<0.05), 또는 완충제 (비히클)가 제공된 Dmd mdx 래트 (##p<0.01, #p<0.05)에 비교한다.
도 49b는 주사 6개월 후의 혈액 ALT 수준에 대한 상이한 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터의 Dmd mdx 래트에서의 효과를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 비-파라미터 크루스칼 왈리스 검정 및 사후 던 다중 비교 검정을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 통계는 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트를 음성 대조군으로서의 완충제 (비히클)가 제공된 WT 래트에 비교한다 (**p<0.01).
도 50a는 주사 3개월 후의 혈액 LDH 수준에 대한 상이한 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터의 Dmd mdx 래트에서의 효과를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 비-파라미터 크루스칼 왈리스 검정 및 사후 던 다중 비교 검정을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 통계는 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트를 음성 대조군으로서의 완충제 (비히클)가 제공된 WT 래트 (***p<0.001, **p<0.01), 또는 완충제 (비히클)가 제공된 Dmd mdx 래트 (#p<0.05)에 비교한다.
도 50b는 주사 6개월 후의 혈액 LDH 수준에 대한 상이한 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터의 Dmd mdx 래트에서의 효과를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 비-파라미터 크루스칼 왈리스 검정 및 사후 던 다중 비교 검정을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 통계는 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트를 음성 대조군으로서의 완충제 (비히클)가 제공된 WT 래트에 비교한다 (**p<0.01).
도 51a는 주사 3개월 후의 혈액 총 크레아틴 키나제 (CK) 수준에 대한 상이한 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터의 Dmd mdx 래트에서의 효과를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 비-파라미터 크루스칼 왈리스 검정 및 사후 던 다중 비교 검정을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 통계는 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트를 완충제 (비히클)가 제공된 WT 래트에 비교하거나 (**p<0.01), 또는 3×1014 vg/kg 벡터가 투약된 Dmd mdx 래트를 완충제 또는 1×1013 vg/kg 벡터가 제공된 Dmd mdx 래트에 비교한다 (##p<0.01).
도 51b는 주사 6개월 후의 혈액 총 크레아틴 키나제 (CK) 수준에 대한 상이한 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터의 Dmd mdx 래트에서의 효과를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 비-파라미터 크루스칼 왈리스 검정 및 사후 던 다중 비교 검정을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 통계는 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트를 음성 대조군으로서의 완충제 (비히클)가 제공된 WT 래트에 비교하거나 (***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05), 또는 3×1014 vg/kg 벡터가 투약된 Dmd mdx 래트를 1×1013 vg/kg 벡터가 제공된 Dmd mdx 래트에 비교한다 ($p<0.05).
도 52a는 비히클 또는 벡터 주사일 (D0)과 주사 3개월 후의 희생일 사이의 총 크레아틴 키나제 (CK) 전개를 제공한다. 단색 막대는 D0으로부터 데이터를 나타내는 반면, 빗금 막대는 3개월의 데이터를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로서 표현된다.
도 52b는 비히클 또는 벡터 주사일 (D0)과 주사 6개월 후의 희생일 사이의 총 크레아틴 키나제 (CK) 전개를 제공한다. 단색 막대는 D0으로부터 데이터를 나타내는 반면, 빗금 막대는 6개월의 데이터를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로서 표현된다.
도 53a는 비히클로 처리된 Dmd mdx 및 WT 래트에 비교된, 1×1014 vg/kg AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 더 나이든 Dmd mdx 래트의 평균 절대적 최대 앞다리 악력 강도를 제공한다. 4개월령에 주사한 래트에서 주사 3개월 후에 또는 래트가 약 7개월령일 때 테스트를 수행하였다. 결과는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 통계는 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트를 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트에 비교한다 (*p<0.01).
도 53b는 비히클로 처리된 Dmd mdx 및 WT 래트에 비교된, 1×1014 vg/kg AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 더 나이든 Dmd mdx 래트의 체중에 대해 상대적인 평균 최대 앞다리 악력 강도를 제공한다. 4개월령에 주사한 래트에서 주사 3개월 후에 또는 래트가 약 7개월령일 때 테스트를 수행하였다. 결과는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 통계는 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트를 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트에 비교한다 (*p<0.01).
도 53c는 비히클로 처리된 Dmd mdx 및 WT 래트에 비교된, 1×1014 vg/kg AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 더 나이든 Dmd mdx 래트에서의 근육 피로의 척도로서의 앞다리 악력의 전개를 나타낸다. 각각의 시험 사이의 간격을 짧게 하여 평균 최대 악력을 5회 측정함으로써 테스트를 수행하였다. 4개월령에 주사한 래트에서 주사 3개월 후에 또는 래트가 약 7개월령일 때 테스트를 수행하였다. 결과는 체중에 대해 상대적으로, 그리고 평균 ± SEM으로서 제공된다. 통계는 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트를 비히클이 제공된 WT 래트 (*p<0.05) 및 비히클이 제공된 Dmd mdx 래트 (¤¤p<0.01)에 비교하고, 이후의 시험들을 비히클 처리 Dmd mdx 래트에서의 시험 1에 비교한다 (§§p<0.01, §§§p<0.001).
도 54a는 비히클로 처리된 Dmd mdx 및 WT 래트에 비교된, 1×1014 vg/kg AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 더 나이든 Dmd mdx 래트의 평균 절대적 최대 앞다리 악력 강도를 제공한다. 6개월령에 주사한 래트에서 주사 3개월 후에 또는 래트가 약 9개월령일 때 테스트를 수행하였다. 결과는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 통계는 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트를 비히클로 처리된 WT 래트에 비교한다 (**p<0.01).
도 54b는 비히클로 처리된 Dmd mdx 및 WT 래트에 비교된, 1×1014 vg/kg AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 더 나이든 Dmd mdx 래트의 체중에 대해 상대적인 평균 최대 앞다리 악력 강도를 제공한다. 6개월령에 주사한 래트에서 주사 3개월 후에 또는 래트가 약 9개월령일 때 테스트를 수행하였다. 결과는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 통계는 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트를 비히클로 처리된 WT 래트에 비교하거나 (*p<0.05), 또는 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트를 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트에 비교한다 (¤p<0.05).
도 54c는 비히클로 처리된 Dmd mdx 및 WT 래트에 비교된, 1×1014 vg/kg AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 더 나이든 Dmd mdx 래트에서의 근육 피로의 척도로서의 앞다리 악력의 전개를 나타낸다. 각각의 시험 사이의 간격을 짧게 하여 평균 최대 악력을 5회 측정함으로써 테스트를 수행하였다. 6개월령에 주사한 래트에서 주사 3개월 후에 또는 래트가 약 9개월령일 때 테스트를 수행하였다. 결과는 체중에 대해 상대적으로, 그리고 평균 ± SEM으로서 제공된다. 통계는 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트를 비히클이 제공된 Dmd mdx 래트에 비교하고 (¤p<0.05), 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트를 비히클이 제공된 WT 래트에 비교하며 (**p<0.01, ***p<0.001), 시험 5를 비히클 처리 Dmd mdx 래트에서의 시험 1에 비교한다 (§§p<0.01).
도 55a-55c는 미니-디스트로핀 단백질 Δ3990 (서열식별번호: 27) 및 미니-디스트로핀 단백질 Dys3978 (서열식별번호: 7)의 아미노산 서열 사이의 정렬을 제공한다.
도 56a-56i는 인간 디스트로핀 단백질을 코딩하는 야생형 핵산 서열로부터 유래된, 미니-디스트로핀 Δ3990을 코딩하는 핵산 서열 (서열식별번호: 28)과 미니-디스트로핀 Dys3978을 코딩하는 인간 코돈-최적화 핵산 서열 (Hopti-Dys3978로 칭해짐; 서열식별번호: 1) 사이의 정렬을 제공한다.
이제 본 발명이 본 발명의 바람직한 실시양태가 제시된 첨부 도면을 참조로 기술될 것이다. 그러나, 본 발명은 상이한 형태로 구현될 수 있고, 본원에 기재된 실시양태에 제한되는 것으로 해석되지 않아야 한다. 그보다는, 이러한 실시양태들은 본 개시내용이 철저하고 완전할 것이며, 본 발명의 범주를 관련 분야의 기술자에게 충분히 전달할 것이도록 제공된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명의 속하는 분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 본 발명을 기술하는데 사용된 용어법은 특정 실시양태를 기술하려는 목적뿐이고, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에서 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허, 및 기타 참고문헌은 전문이 참조로 포함된다.
달리 구체적으로 지시되지 않는 한, 뉴클레오티드 서열은 본원에서 단일 가닥에만 의해서 왼쪽에서 오른쪽으로 5' → 3'방향으로 제시된다. 뉴클레오티드 및 아미노산은 본원에서 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)가 권장하는 방식으로, 또는 (아미노산의 경우) 양쪽 모두 37 CFR §1.822 및 확립된 용법에 따르는 1-문자 코드 또는 3-문자 코드에 의해 표현된다. 예를 들어, 문헌 [PatentIn User Manual, 99-102 (Nov. 1990) (U.S. Patent and Trademark Office)]을 참조한다.
달리 지시되지 않는 한, 관련 분야의 기술자에게 공지된 표준 방법이 재조합 파르보바이러스 및 AAV (rAAV) 구축물, 파르보바이러스 Rep 및/또는 Cap 서열을 발현하는 패키징 벡터, 및 일시적으로 및 안정적으로 형질감염된 패키징 세포의 구축에 사용될 수 있다. 이러한 기술은 관련 분야의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [SAMBROOK et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2nd Ed. (Cold Spring Harbor, NY, 1989)]; [AUSUBEL et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York)]을 참조한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 특색 또는 특색들의 조합이 배제 또는 생략될 수 있다는 것도 구상한다.
추가로 설명하기 위해, 예를 들어, 명세서가 특정 아미노산이 A, G, I, L 및/또는 V로부터 선택될 수 있다고 나타내는 경우, 이러한 표현은 아미노산이 이러한 아미노산(들)의 임의의 부분집합, 예를 들어 A, G, I 또는 L; A, G, I 또는 V; A 또는 G; L 단독 등으로부터 선택될 수 있고, 각각의 이러한 하위조합이 본원에 명확하게 기재된 바와 같다는 것을 또한 나타낸다. 또한, 이러한 표현은 특정된 아미노산 중 하나 이상이 부인될 수 있다는 것을 또한 나타낸다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 아미노산은 A, G 또는 I가 아니거나; A가 아니거나; G 또는 V가 아니거나 하는 식이고, 각각의 이러한 가능한 부인이 본원에 명확하게 기재된 바와 같다.
정의
하기의 용어들이 본원에서의 설명 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된다.
문맥이 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 단수형 형태는 복수형 형태 또한 포함하도록 의도된다.
더욱이, 측정가능한 값 예컨대 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 길이의 양, 용량, 시간, 온도 등을 지칭할 때 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 상술된 양의 20％, 10％, 5％, 1％, 0.5％, 또는 심지어 0.1％의 변동을 포함하는 것을 의미한다.
또한 본원에서 사용된 바와 같이, "및/또는"은 연합되어 열거된 항목 중 하나 이상의 임의의 모든 가능한 조합, 뿐만 아니라 대안 ("또는")으로 해석되는 경우의 조합의 결여를 지칭하고 포괄한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "아데노-연관 바이러스" (AAV)는 제1형 AAV (AAV1), 제2형 AAV (AAV2), 제3형 AAV (AAV3, 3A 및 3B 유형을 포함함), 제4형 AAV (AAV4), 제5형 AAV (AAV5), 제6형 AAV (AAV6), 제7형 AAV (AAV7), 제8형 AAV (AAV8), 제9형 AAV (AAV9), 제10형 AAV (AAV10), 제11형 AAV (AAV11), 제12형 AAV (AAV12), 제13형 AAV (AAV13), 조류 AAV ATCC VR-865, 조류 AAV 계통 DA-1, Bb1, Bb2, Ch5, Cy2, Cy3, Cy4, Cy5, Cy6, Hu1, Hu10, Hu11, Hu13, Hu15, Hu16, Hu17, Hu18, Hu19, Hu2, Hu20, Hu21, Hu22, Hu23, Hu24, Hu25, Hu26, Hu27, Hu28, Hu29, Hu3, Hu31, Hu32, Hu34, Hu35, Hu37, Hu39, Hu4, Hu40, Hu41, Hu42, Hu43, Hu44, Hu45, Hu46, Hu47, Hu48, Hu49, Hu51, Hu52, Hu53, Hu54, Hu55, Hu56, Hu57, Hu58, Hu6, Hu60, Hu61, Hu63, Hu64, Hu66, Hu67, Hu7, Hu9, HuLG15, HuS17, HuT17, HuT32, HuT40, HuT41, HuT70, HuT71, HuT88, Pi1, Pi2, Pi3, Rh1, Rh10, Rh13, Rh2, Rh25, Rh32, Rh33, Rh34, Rh35, Rh36, Rh37, Rh38, Rh40, Rh43, Rh48, Rh49, Rh50, Rh51, Rh52, Rh53, Rh54, Rh55, Rh57, Rh58, Rh61, Rh62, Rh64, Rh74, Rh8, 뱀 AAV, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 양 AAV, 염소 AAV, 새우 AAV, AAV1.1, AAV2.5, AAV6.1, AAV6.3.1, AAV9.45, RHM4-1 (WO 2015/013313의 서열식별번호: 5), AAV2-TT, AAV2-TT-S312N, AAV3B-S312N, AAV-LK03, 및 공지되지 않았거나 추후에 발견되는 임의의 기타 AAV를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 문헌 [Fields et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)]을 참조한다. 캡시드는 미국 특허 번호 7,906,111; 문헌 [Gao et al., 2004, J. Virol. 78:6381]; [Moris et al., 2004, Virol. 33:375]; WO 2013/063379; WO 2014/194132에 개시된 다수의 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있고, WO 2015/121501에 개시된 진성 유형(true type) AAV (AAV-TT) 변이체, 및 WO 2015/013313에 개시된 RHM4-1, RHM15-1 내지 RHM15-6, 및 이의 변이체를 포함하며, 관련 분야의 기술자는 동일하거나 유사한 기능을 수행하거나 또는 2개 이상의 AAV 캡시드로부터의 성분을 포함할 수 있는 아직 확인되지 않은 다른 변이체가 있을 가능성이 있음을 알 것이다. 전량의 AAV cap 단백질은 VP1, VP2, 및 VP3을 포함한다. AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 오픈 리딩 프레임은 전량 AAV cap 단백질보다 더 적게 포함할 수 있거나, 또는 전량의 AAV cap 단백질이 제공될 수 있다.
공지되지 않았거나 추후에 발견되는 임의의 기타 AAV. 예를 들어, 문헌 [FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)]을 참조한다. 다수의 비교적 새로운 AAV 혈청형 및 클레이드가 확인되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Gao et al., (2004) J. Virol. 78:6381]; [Moris et al., (2004) Virol. 33-:375]을 참조한다).
AAV는 직경이 약 20-30 nm인 정이십면체 캡시드가 있는, 외피가 없는 소형 바이러스이다. AAV는 다른 바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 우두 바이러스 및 인간 유두종바이러스)로부터의 소위 헬퍼 단백질의 기여 없이 복제될 수 없고, 따라서 파르보비리다에(parvoviridae) 과 내의 (복제를 위해 다른 바이러스에 의존하기 때문에) 디펜도바이러스(dependovirus)로 칭해지는 특정 속 내에 놓였다. AAV의 다수의 상이한 혈청형들이 발견되었고, 다수의 인간이 하나 이상의 AAV 혈청형에 대한 항체를 생산하지만 (AAV 감염의 광범위한 역사를 시사함), AAV에 의해 야기되는 것으로 공지된 질환이 없고, 이는 AAV가 인간에서 비-병원성임을 시사한다.
다수의 상이한 AAV 혈청형들이 발견되었지만, 가장 특성화된 것 중 하나는 AAV2이고, AAV 생물학에 관한 하기의 논의는 AAV2에 관하여 학습된 것 중 일부에 중점을 둔다. 다른 AAV 혈청형의 생활 주기는 유사한 것으로 여겨지지만, 세부사항은 상이할 수 있다. AAV2 또는 임의의 다른 AAV 혈청형이 세포를 감염시켜 세포 내부에서 복제되는 특정 세부사항은 단지 본원에 개시된 발명의 이해를 돕기 위해서 제공되고, 어떠한 방식으로도 이의 범주를 제한하도록 의도되지 않는다. 이러한 정보 중 일부가 추후에 부정확하거나 불완전한 것으로 밝혀지더라도, 이는 본원에서 개시되고 청구된 발명의 유용성 또는 실행가능성을 손상시키는 것으로 해석되지 않아야 한다. AAV 생활주기에 관한 추가 정보를 문헌 [M. Goncalves, Virol J 2:43 (2005)], [MD Weitzman and RM Linden, Adeno-Associated Virus Biology, Ch. 1, pp. 1-23], [Adeno-Associated Virus Methods and Protocols, Ed. RO Snyder and P Moullier, Humana Press (2011)], [GE Berry and A Asokan, Curr Opin Virol 21:54-60 (2016)], 및 이에 인용된 참조문헌에서 확인할 수 있다.
AAV2의 야생형 게놈은 길이가 약 4.7 킬로베이스인 선형 DNA이다. 대부분 단일 가닥이지만, 게놈의 5' 및 3' 끝부분은 각각 염기쌍 145개의 길이이고 고전적인 왓슨-크릭 염기쌍 형성을 통해 자가-어닐링(annealing)되어 T-형상 헤어핀 구조를 형성하는 회문식 서열을 함유하는 소위 역전 말단 반복부 (ITR)로 이루어진다. 이러한 구조 중 하나는 유리 3' 히드록실 기를 함유하고, 이는 세포 DNA 중합효소에 의존적으로, 자가-프라이밍 가닥-배치 메커니즘을 통해 바이러스 DNA 복제의 개시를 허용한다. 예를 들어, 문헌 [M. Goncalves, Adeno-associated virus: from defective virus to effective vector, Virology J 2:43 (2005)]을 참조한다. 감염된 세포에서 단일-가닥 바이러스 게놈이 복제된 후 캡시드 내로 패키징되는 메커니즘으로 인해, 플러스 (센스 또는 코딩) 및 마이너스 (안티센스 또는 비-코딩) 가닥이 동일한 효율로 별개의 입자 내로 패키징된다.
플랭킹된 ITR에 더하여, 야생형 AAV2 게놈은 2개의 유전자 rep 및 cap을 함유하고, 이들은 대안적인 프로모터 및 스플라이싱의 효율적인 사용을 통해 4개의 복제 단백질 (Rep 78, Rep 68, Rep 52, 및 Rep 40) 및 3개의 캡시드 단백질 (VP1, VP2, 및 VP3)을 각각 코딩한다. 대형 복제 단백질인 Rep 78 및 68은 다기능성이고, AAV 전사, 바이러스 DNA 복제, 및 바이러스 게놈의 인간 19번 염색체 내로의 부위-특이적 통합에서 역할을 한다. 더 작은 Rep 단백질들은 감염된 세포 핵에서 바이러스 게놈을 바이러스 캡시드 내로 패킹하는 것에 관련되었다. 3개의 캡시드 단백질은 대안적인 스플라이싱 및 대안적인 번역 시작 부위의 조합을 통해 생산되어, 3개의 단백질 모두가 이들의 카르복시-말단을 향하는 서열을 공유하지만, VP2는 VP3에 부재하는 추가적인 아미노-말단 서열을 포함하고, VP1은 VP2 및 VP3 양쪽 모두에 부재하는 추가적인 아미노-말단 서열을 포함한다. 캡시드는 1:1:10의 대략적인 VP1:VP2:VP3 화학량론으로 총 60개의 캡시드 단백질을 함유하는 것으로 추정되지만, 이러한 비는 분명히 변할 수 있다.
크기가 비교적 작고, 따라서 이종 유전자를 보유하는 용량이 작음에도 불구하고, AAV는 유전자 요법을 위한 선도적인 바이러스 벡터로서 확인되었다. 유전자 요법 벡터로서 제안된 다른 바이러스에 비교하여 AAV를 사용하는 것의 장점은 형질도입된 세포에서 장기 유전자 발현을 지지하고, 분열 중인 세포 및 분열 중이 아닌 세포 양쪽 모두에 형질도입되며, 혈청형에 따라 광범위한 상이한 유형의 세포에 형질도입되는 AAV의 능력, 헬퍼 바이러스 없이 복제되지 못하는 것, 및 야생형 감염과 연관된 병원성이 명백하게 결여되는 것을 포함한다.
이의 작은 크기로 인해, 물리적으로 AAV 캡시드는 최대 약 4.7-5.0 킬로베이스 길이의 단일 가닥 DNA 게놈을 수용할 수 있다. 게놈 변형 없이는, 이종 유전자, 예컨대 치료용 단백질에 대한 코딩 서열, 및 유전자 조절 요소, 예컨대 프로모터 및 임의적으로 인핸서를 포함할 공간이 충분하지 않을 것이다. 더 많은 공간을 생성시키기 위해, 플랭킹된 ITR이 유지되는 한, rep 및 cap 유전자를 제거하고 원하는 이종 서열로 교체할 수 있다. rep 및 cap 유전자의 기능은 상이한 DNA 조각 상에서 트랜스로 제공될 수 있다. 대조적으로, ITR은 이종 서열과 시스로 남아 있어야 하는 유일한 AAV 바이러스 요소이다. ITR과 이종 유전자를 조합하고 rep 및 cap 유전자를 ITR이 결여된 상이한 플라스미드로 제거하는 것은 유전자 요법용 AAV 벡터가 생산되는 것과 동시에 또한 감염성 야생형 AAV의 생산을 방지한다. rep 및 cap을 제거하는 것은 유전자 요법용 AAV 벡터가 이들이 형질도입된 세포에서 복제될 수 없다는 것을 또한 의미한다.
일부 실시양태에서, AAV 벡터의 게놈은 AAV ITR이 플랭킹된 선형 단일 가닥 DNA이다. 이종 유전자의 전사 및 번역을 지지할 수 있기 전에, 이러한 단일 가닥 DNA 게놈이 자가-프라이밍 ITR 중 하나의 유리 3'-OH를 이용하여 제2 가닥 합성을 개시시키는 세포 DNA 중합효소에 의해 이중-가닥 형태로 전환되어야 한다. 대안적 실시양태에서, 반대 극성의 전장-단일 가닥 게놈들이 어닐링되어 전장 이중 가닥 게놈이 생성될 수 있고, 반대 극성의 게놈을 보유하는 다수의 AAV 벡터가 동일한 세포에 동시에 형질도입될 때 초래될 수 있다. 어떤 메커니즘에 의해서든 이중 가닥 벡터 게놈이 형성된 후, 세포 유전자 전사 기구가 이중 가닥 DNA 상에 작용하여 이종 유전자를 발현시킬 수 있다.
다른 실시양태에서, 각각의 끝부분에 야생형 ITR이 있고 중간에 돌연변이된 ITR이 있는 자가-상보적이도록 벡터 게놈이 디자인될 수 있다 (scAAV). 예를 들어, 문헌 [McCarty, DM, et al., Adeno-associated virus terminal repeat (TR) mutant generates self-complementary vectors to overcome the rate-limiting step to transduction in vivo. Gene Ther. 10:2112-18 (2003)]을 참조한다. 세포에 진입한 후, 자가-상보적 AAV 게놈이 디-노보(de novo) DNA 복제를 필요로 하지 않으면서 이중 가닥 게놈을 형성하도록 중간의 ITR로 시작하여 자가-어닐링될 수 있는 것으로 제안되었다. 이러한 접근법은 더욱 효율적인 형질도입 및 이종 유전자의 더욱 빠른 발현을 초래하는 것으로 나타났지만, 사용될 수 있는 이종 유전자의 크기를 약 절반만큼 감소시킨다.
유전자 요법용 AAV 벡터를 생산하기 위한 상이한 전략들이 개발되었지만, 가장 통상적인 것 중 하나는 3개의 상이한 플라스미드가 생산자 세포 내로 형질감염되는 삼중 형질감염 기술이다. 예를 들어, 문헌 [N. Clement and J. Grieger, Mol Ther Methds Clin Dev, 3:16002 (2016)], [Grieger, JC, et al., Mol Ther 24(2):287-97 (2016)], 및 이에 인용된 참고문헌을 참조한다. 이러한 기술에서, 이종 프로모터 및 임의적으로 인핸서, 및 원하는 RNA 또는 단백질을 발현하는 이종 유전자에 왼쪽 및 오른쪽 ITR이 플랭킹되어 있는 것을 예를 들어 포함하는 벡터 게놈의 서열을 포함하는 플라스미드가 생성된다. 이러한 벡터 플라스미드가 rep 및 cap 유전자를 함유하는 제2 플라스미드, 및 벡터 게놈이 복제되어 AAV 캡시드 내로 패키징되는데 요구되는 아데노바이러스 (또는 기타 바이러스) 헬퍼 유전자를 함유하는 제3 플라스미드와 함께 생산자 세포, 예컨대 HEK293 세포 내로 공동-형질감염될 것이다. 이러한 기술의 대안적 실시양태에서는, rep, cap 및 아데노바이러스 헬퍼 유전자 모두가 동일한 플라스미드 상에 있고, 2개의 플라스미드가 생산자 세포 내로 공동-형질감염된다. 아데노바이러스 헬퍼 유전자의 예는 E1a, E1b, E2a, E4orf6, 및 VA RNA 유전자를 포함한다. 다수의 AAV 혈청형에 대해, 벡터 게놈이 복제되어 비-AAV2 캡시드 내로 패키징되는 능력을 유의하게 손상시키지 않으면서 AAV2 ITR이 천연 ITR을 치환할 수 있다. 슈도-타이핑(pseudo-typing)으로 공지된 이러한 접근법은 다른 혈청형으로부터의 rep 및 cap 유전자를 함유하는 rep/cap 플라스미드를 사용하는 것을 요구할 뿐이다. 따라서, 예를 들어, AAV 유전자 요법 벡터는 AAV9 캡시드, 및 이종 유전자, 예컨대 미니-디스트로핀에 플랭킹된 AAV2 ITR을 함유하는 벡터 게놈을 이용할 수 있다 (이는 "AAV2/9"로 지정될 수 있다). AAV 입자가 세포에 의해 생산된 후, 관련 분야에 공지된 표준 기술, 예컨대 CsCl 구배에서의 초원심분리를 사용하여, 또는 다양한 유형의 크로마토그래피 칼럼을 사용하여 이를 수집 및 정제할 수 있다.
본 발명의 파르보바이러스 입자 및 게놈은 AAV로부터의 것일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 다양한 혈청형의 AAV 및 자율성 파르보바이러스의 게놈 서열, 뿐만 아니라 천연 ITR, Rep 단백질, 및 캡시드 서브유닛의 서열이 관련 분야에 공지되어 있다. 이러한 서열을 문헌에서 또는 공공 데이터베이스 예컨대 진뱅크(GenBank)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 진뱅크 등록 번호 NC_002077, NC_001401, NC_001729, NC_001863, NC_001829, NC_001862, NC_000883, NC_001701, NC_001510, NC_006152, NC_006261, AF063497, U89790, AF043303, AF028705, AF028704, J02275, J01901, J02275, X01457, AF288061, AH009962, AY028226, AY028223, AY631966, AX753250, EU285562, NC_001358, NC_001540, AF513851, AF513852 및 AY530579를 참조하고; 이의 개시내용은 파르보바이러스 및 AAV 핵산 및 아미노산 서열의 교시를 위해 본원에 참조로 포함된다. 예를 들어, 문헌 [Bantel-Schaal et al., (1999) J. Virol. 73: 939]; [Chiorini et al., (1997) J. Virol. 71:6823]; [Chiorini et al., (1999) J. Virol. 73:1309]; [Gao et al., (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:11854]; [Moris et al., (2004) Virol. 33-:375-383]; [Mori et al., (2004) Virol. 330:375]; [Muramatsu et al., (1996) Virol. 221:208]; [Ruffing et al., (1994) J. Gen. Virol. 75:3385]; [Rutledge et al., (1998) J. Virol. 72:309]; [Schmidt et al., (2008) J. Virol. 82:8911]; [Shade et al., (1986) J. Virol. 58:921]; [Srivastava et al., (1983) J. Virol. 45:555]; [Xiao et al., (1999) J. Virol. 73:3994]; 국제 특허 공보 WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; 및 미국 특허 번호 6,156,303을 또한 참조하고, 이의 개시내용은 파르보바이러스 및 AAV 핵산 및 아미노산 서열의 교시를 위해 본원에 참조로 포함된다. AAV1, AAV2 및 AAV3으로부터의 ITR 서열이 문헌 [Xiao, X., (1996), "Characterization of Adeno-associated virus (AAV) DNA replication and integration," Ph.D. Dissertation, University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA] (본원에 전문이 포함됨)에서 제공된다.
본원에서 사용된 바와 같이, AAV에 의한 세포의 "형질도입"은 세포 내로의 유전 물질의 AAV-매개 전달을 지칭한다. 예를 들어, 문헌 [FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (3d ed., Lippincott-Raven Publishers)]을 참조한다.
용어 "5' 부분" 및 "3' 부분"은 2개 이상의 요소 사이의 공간적 관계를 정의하는 상대적인 용어이다. 따라서, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드의 "3' 부분"은 또 다른 절편의 하류에 있는 폴리뉴클레오티드의 절편을 나타낸다. 용어 "3' 부분"은 그럴 수는 있지만 절편이 반드시 폴리뉴클레오티드의 3' 끝부분에 있거나 또는 심지어 반드시 폴리뉴클레오티드의 3' 절반에 있다는 것을 나타내도록 의도되지 않는다. 유사하게, 폴리뉴클레오티드의 "5' 부분"은 또 다른 절편의 상류에 있는 폴리뉴클레오티드의 절편을 나타낸다. 용어 "5' 부분"은 그럴 수는 있지만 절편이 반드시 폴리뉴클레오티드의 5' 끝부분에 있거나 또는 심지어 반드시 폴리뉴클레오티드의 5' 절반에 있다는 것을 나타내도록 의도되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 달리 지시되지 않는 한 펩티드 및 단백질 양쪽 모두를 포괄한다.
"폴리뉴클레오티드"는 각각의 단량체 단위의 3'-위치가 포스페이트 기를 통해 이웃 단량체 단위의 5'-위치에 연결된 뉴클레오티드들의 선형 서열이다. 폴리뉴클레오티드는 RNA (RNA 뉴클레오티드만 함유함), DNA (DNA 뉴클레오티드만 함유함), RNA 및 DNA 하이브리드 (RNA 및 DNA 뉴클레오티드를 함유함), 뿐만 아니라 천연 발생 및/또는 비-천연 발생 뉴클레오티드를 함유하는 기타 하이브리드일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드의 염기의 선형 순서가 폴리뉴클레오티드의 "뉴클레오티드 서열", "핵산 서열", "핵염기 서열", 또는 때로는 그냥 "서열"로 칭해진다. 전형적으로, 염기 순서는 폴리뉴클레오티드의 5' 끝부분에서 시작하여 폴리뉴클레오티드 3' 끝부분에서 끝나게 제공된다. 관련 분야에 공지된 바와 같이, 폴리뉴클레오티드는 2차 구조, 예컨대 자가-상보성 영역을 채택할 수 있다. 또한 폴리뉴클레오티드는 고전적인 왓슨-크릭 염기 쌍형성, 또는 통상의 기술자에게 친숙한 기타 메커니즘을 통해 완전히 또는 부분적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드와 혼성화할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자"는 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 절편이고, 필수적이지는 않지만 전형적으로는 DNA이다. 일부 실시양태에서, 유전자는 인트론에 의해 중단될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 대안적 스플라이싱, 교대되는 시작 코돈의 사용, 또는 관련 분야의 통상의 기술자에게 친숙한 기타 생물학적 메커니즘과 같은 메커니즘으로 인해 1개를 초과하는 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩할 수 있다. 용어 "오픈 리딩 프레임" ("ORF"로 약기됨)은 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 부분을 지칭한다.
용어 "코돈-최적화된"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 코딩 서열 (예를 들어, 디스트로핀 또는 미니-디스트로핀에 대한 코딩 서열을 예를 들어 포함하는 야생형 서열)에 정상적으로 존재하는 하나 이상의 코돈을 동일한 (동의성) 아미노산에 대한 코돈으로 치환함으로써 발현을 증가시키도록 최적화된 유전자 코딩 서열을 지칭한다. 이러한 방식으로, 유전자가 코딩하는 단백질은 동일하지만, 유전자 또는 상응하는 mRNA의 기저 핵염기 서열은 상이하다. 일부 실시양태에서, 최적화는 하나 이상의 희귀 코돈 (즉, 특정 종으로부터의 세포에서 비교적 드물게 발생하는 tRNA에 대한 코돈)을 더욱 빈번하게 발생하는 동의성 코돈으로 치환하여, 번역 효율을 개선시킨다. 예를 들어, 인간 코돈-최적화에서, 코딩 서열 내의 하나 이상의 코돈이 동일한 아미노산에 대해 인간 세포에서 더욱 빈번하게 발생하는 코돈에 의해 교체된다. 코돈 최적화는 전사 및/또는 번역 효율을 개선시킬 수 있는 다른 메커니즘을 통해 유전자 발현을 또한 증가시킬 수 있다. 전략은, 비제한적으로, 총 GC 함량 (즉, 전체 코딩 서열 내의 구아닌 및 시토신의 퍼센트)을 증가시키는 것, CpG 함량 (즉, 코딩 서열 내의 CG 또는 GC 디뉴클레오티드의 개수)를 감소시키는 것, 잠적성 스플라이스 도너 또는 어셉터 부위를 제거하는 것, 및/또는 리보솜 진입 부위, 예컨대 코작(Kozak) 서열을 부가 또는 제거하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 코돈-최적화된 유전자는 개선된 단백질 발현을 나타내고, 예를 들어, 이에 의해 코딩되는 단백질이 세포에서 다른 면에서는 유사한 세포에서 야생형 유전자가 제공하는 단백질의 발현 수준과 비교하여 검출가능하게 더 큰 수준으로 발현된다.
용어 "서열 동일성"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 관련 분야에서의 표준 의미를 갖는다. 관련 분야에 공지된 바와 같이, 다수의 상이한 프로그램을 사용하여 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 공지된 서열에 대한 서열 동일성 또는 유사성이 있는지 여부를 확인할 수 있다. 문헌 [Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)의 국소적 서열 동일성 알고리듬, 문헌 [Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 서열 동일성 정렬 알고리듬, 문헌 [Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]의 유사성 검색 방법, 이러한 알고리듬들의 컴퓨터 실행 (위스컨신주 매디슨 사이언스 드라이브 575의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 위스컨신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package) 내의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA), 문헌 [Devereux et al., Nucl. Acid Res. 12:387 (1984)]에 기술된 베스트-핏(Best Fit) 서열 프로그램 (바람직하게는 디폴트 설정을 사용함), 또는 검사를 포함하지만 이에 제한되지 않는 관련 분야에 공지된 표준 기술을 사용하여 서열 동일성 또는 유사성을 결정할 수 있다.
유용한 알고리듬의 예는 PILEUP이다. PILEUP은 일군의 관련된 서열들로부터 점진적인 쌍-형식 정렬을 사용하여 다중 서열 정렬을 생성시킨다. 이는 정렬을 생성시키는데 사용된 클러스터링 관계를 나타내는 나무를 플롯팅할 수도 있다. PILEUP은 문헌 [Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351 (1987)]의 점진적 정렬 방법의 단순화를 사용한다; 이러한 방법은 문헌 [Higgins & Sharp, CABIOS 5:151 (1989)]에 기술된 것과 유사하다.
유용한 알고리듬의 또다른 예는 문헌 [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990)] 및 [Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873 (1993)]에 기술된 BLAST 알고리듬이다. 특히 유용한 BLAST 프로그램은 문헌 [Altschul et al., Meth. Enzymol., 266:460 (1996)]으로부터 수득된 WU-BLAST-2 프로그램이다; blast.wustl/edu/blast/README.html. WU-BLAST-2는 여러 검색 파라미터를 사용하고, 이는 바람직하게는 디폴트 값으로 설정된다. 파라미터들은 동적 값이고, 관심 서열이 이에 대해 검색되는 특정 데이터베이스의 조성 및 특정 서열의 조성에 따라 프로그램 자체에 의해 확립된다; 그러나, 감도를 증가시키도록 값이 조정될 수 있다.
추가적인 유용한 알고리듬은 문헌 [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389 (1997)]에서 보고된 바와 같은 갭 BLAST이다.
백분율 아미노산 서열 동일성 값은 매칭되는 동일한 잔기의 개수를 정렬된 영역 내의 "더 긴" 서열의 잔기의 총 개수로 나눔으로써 결정된다. "더 긴" 서열은 정렬된 영역 내에 가장 많은 실제 잔기가 있는 것이다 (정렬 점수를 최대화하기 위해 WU-Blast-2에 의해 도입된 갭은 무시한다).
유사한 방식으로, 퍼센트 핵산 서열 동일성은 본원에 구체적으로 개시된 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드와 동일한 후보 서열 내의 뉴클레오티드 잔기의 백분율로서 정의된다.
정렬은 정렬될 서열들 내에 갭을 도입하는 것을 포함할 수 있다. 추가적으로, 본원에 구체적으로 개시된 폴리뉴클레오티드보다 더 많은 또는 더 적은 뉴클레오티드를 함유하는 서열의 경우, 한 실시양태에서, 서열 동일성의 백분율은 뉴클레오티드의 총 개수에 상대적인 동일한 뉴클레오티드의 개수를 기초로 결정될 것으로 이해된다. 따라서, 예를 들어, 한 실시양태에서, 본원에 구체적으로 개시된 서열보다 더 짧은 서열의 서열 동일성은 더 짧은 서열 내의 뉴클레오티드의 개수를 사용하여 결정될 것이다. 퍼센트 동일성 계산에서, 다양한 표현의 서열 변경, 예컨대 삽입, 결실, 치환 등에 상대적 가중치가 할당되지 않는다.
한 실시양태에서, 동일성만 양으로 채점되고 (+1), 갭을 포함하는 모든 형태의 서열 변경에는 "0"의 값이 할당되며, 이는 서열 유사성 계산에 대해 하기에 기술된 바와 같은 가중 스케일 또는 파라미터에 대한 필요성을 제거한다. 예를 들어, 매칭되는 동일한 잔기의 개수를 정렬된 영역 내의 "더 짧은" 서열의 잔기의 총 개수로 나누고 100을 곱함으로써, 퍼센트 서열 동일성을 계산할 수 있다. "더 긴" 서열은 정렬된 영역 내의 가장 많은 실제 잔기가 있는 것이다.
"실질적 상동성" 또는 "실질적 유사성"은, 핵산 또는 이의 단편을 지칭하는 경우에, 적합한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실이 있으면서 또 다른 핵산 (또는 이의 상보적 가닥)과 최적으로 정렬되었을 때, 서열의 적어도 약 95 내지 99％에 뉴클레오티드 서열 동일성이 있다는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "단리된" 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, "단리된 DNA" 또는 "단리된 RNA")는 천연 발생 생물 또는 바이러스의 다른 성분들, 예를 들어, 통상적으로 이러한 폴리뉴클레오티드와 회합되어 발견되는 세포 또는 바이러스 구조 성분 또는 다른 폴리펩티드 또는 핵산 중 적어도 일부가 분리되거나 또는 실질적으로 없는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
유사하게, "단리된" 폴리펩티드는 천연 발생 생물 또는 바이러스의 다른 성분들, 예를 들어, 통상적으로 이러한 폴리펩티드와 회합되어 발견되는 세포 또는 바이러스 구조 성분 또는 다른 폴리펩티드 또는 핵산 중 적어도 일부가 분리되거나 또는 실질적으로 없는 폴리펩티드를 의미한다.
"치료용 폴리펩티드"는 세포 또는 대상체 내의 단백질의 부재 또는 결함으로부터 초래되는 증상을 경감 또는 감소시킬 수 있는 폴리펩티드이다. 대안적으로, "치료용 폴리펩티드"는 다른 방식으로 대상체에게 이점, 예를 들어, 항암 효과 또는 이식 생존가능성의 개선을 부여하는 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "변형된"은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열에 적용되는 경우에, 하나 이상의 결실, 부가, 치환, 또는 이의 임의의 조합으로 인해 야생형 서열과 상이한 서열을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 바이러스 벡터를 "단리하다" 또는 "정제하다" (또는 문법적 등가물)는 바이러스 벡터가 출발 물질 내의 다른 성분들 중 적어도 일부로부터 적어도 부분적으로 분리된다는 것을 의미한다.
용어 "치료하다", "치료하는", 또는 "~의 치료" (및 이의 문법적 변형)은 대상체의 상태의 중증도가 감소되고/되거나, 적어도 부분적으로 개선 또는 안정화되고/되거나, 적어도 하나의 임상 증상에서의 약간의 경감, 완화, 감소 또는 안정화가 달성되고/되거나, 질환 또는 장애의 진행에서의 지연이 있는 것을 의미한다.
용어 "예방한다", "예방하는", 및 "예방" (및 이의 문법적 변형)은 대상체에서의 질환, 장애 및/또는 임상 증상(들)의 발병을 예방 및/또는 지연하는 것, 및/또는 본 발명의 방법의 부재하에 발생할 것에 비교하여 질환, 장애 및/또는 임상 증상(들)의 발병의 중증도가 감소되는 것을 지칭한다. 예방은 완전할 수 있고, 예를 들어, 질환, 장애 및/또는 임상 증상(들)의 완전한 부재일 수 있다. 또한 예방은 대상체에서의 질환, 장애 및/또는 임상 증상(들)의 발생 및/또는 발병의 중증도가 본 발명의 부재 하에 발생할 것보다 덜하도록 부분적일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "치료 유효량"은 대상체에게 약간의 개선 또는 이점을 제공하는데 충분한 양이다. 달리 말하면, "치료 유효량"은 대상체에서 적어도 하나의 증상의 약간의 경감, 완화, 감소 또는 안정화를 제공할 양이다. 관련 분야의 기술자는 대상체에게 어떤 이익이 제공되는 한 치료 효과가 완전하거나 또는 치유적일 필요가 없다는 것을 이해할 것이다.
본원에서 사용된 바와 같은 "예방 유효량"은 대상체에서 질환, 장애, 및/또는 임상 증상의 발병을 예방 및/또는 지연시키는데, 및/또는 본 발명의 방법의 부재하에 발생할 것에 비교하여 대상체에서 질환, 장애 및/또는 임상 증상의 발병의 중증도를 감소 및/또는 지연시키는데 충분한 양이다. 관련 분야의 기술자는 대상체에게 어떤 이익이 제공되는 한 예방 수준이 완전할 필요가 없다는 것을 이해할 것이다.
용어 "이종" 또는 "외인성" 뉴클레오티드 또는 핵산 서열은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 바이러스 또는 세포에서 천연적으로 발생하지 않는 핵산 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이종 핵산은 (예를 들어, 세포 또는 대상체에 전달하기 위한) 관심 대상인 폴리펩티드 또는 번역되지 않는 RNA를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "바이러스 벡터", "바이러스성 벡터", "유전자 전달 벡터", 또는 때때로 그냥 "벡터"는 핵산 전달 비히클로서의 기능을 하고 비리온 또는 바이러스 입자 내로 패키징된 벡터 게놈을 포함하는 비리온 또는 바이러스 입자를 지칭한다. 벡터는 감염성 또는 비-감염성일 수 있다. 비-감염성 벡터는 외인성으로 첨가된 인자 없이는 스스로 복제될 수 없다. 벡터는 AAV 벡터 게놈이 패키징되어 있는 AAV 캡시드를 포함하는 AAV 입자 또는 비리온일 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 AAV" ("rAAV"로 약기됨) 벡터, 입자 또는 비리온으로도 지칭될 수 있다.
벡터 게놈은 세포 (이러한 세포는 "표적 세포"로 지칭될 수 있다) 내로의 전달을 위해 벡터 입자 또는 비리온 내에 패키징하기 위한 폴리뉴클레오티드이다. 전형적으로, 벡터 게놈은 표적 세포 내로의 전달하기 위한 이종 핵산 서열, 예컨대 유전자를 함유하도록 조작된다. 벡터 게놈은 표적 세포에서 이종 유전자의 발현을 제어하는 조절 요소로서 기능하는 하나 이상의 핵산 서열을 또한 함유할 수 있다. 벡터 게놈은 벡터의 생산 및/또는 기능 예컨대 비제한적으로 숙주에서의 벡터 게놈의 복제 및 벡터 입자 내로의 패키징에 요구되는 야생형 또는 변형 바이러스 핵산 서열(들)을 또한 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터 게놈은 AAV 캡시드 내로 패키징될 수 있는 "AAV 벡터 게놈"이다. 일부 실시양태에서, AAV 벡터 게놈은 복제 및 패키징을 지지하기 위해 1 또는 2개의 역전 말단 반복부 (ITR)를 이종 유전자와 시스로 포함한다. AAV 벡터 생산에 요구되는 모든 다른 구조적 및 비-구조적 단백질 코딩 서열이 트랜스로 (예를 들어, 플라스미드로부터, 또는 이러한 서열을 숙주 세포 내로 안정적으로 통합시킴으로써) 제공될 수 있다. 특정 실시양태에서, AAV 벡터 게놈은 적어도 하나의 ITR (예를 들어, AAV ITR), 임의적으로는 2개의 ITR (예를 들어, 2개의 AAV ITR)을 포함하고, 이는 전형적으로 벡터 게놈의 5' 및 3' 끝부분에 있고, 이종 핵산 서열에 플랭킹될 것이지만, 이에 연속적일 필요는 없다. ITR은 서로 동일하거나 상이할 수 있고, 동일하거나 상이한 AAV 혈청형으로부터의 것일 수 있다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주", 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환가능하게 사용되고, 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭하며, 이러한 세포의 자손을 포함한다. 숙주 세포는 "형질전환체", "형질전환된 세포", 및 "형질도입된 세포"를 포함하고, 이는 1차 형질전환 세포, 및 계대 횟수와 관계 없이 이로부터 유래된 자손을 포함한다. AAV 벡터를 생산하기 위한 목적으로, 특정 숙주 세포가 캡시드 및 벡터 게놈을 포함하는 기능성 바이러스 입자를 어셈블리하는데 요구되는 모든 유전자를 함유하는 "생산자" 또는 "패키징" 세포로서 사용될 수 있다. 관련 분야의 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 상이한 숙주 세포들, 예컨대 HEK293 세포, 또는 Pro10 세포주가 유용하게 생산자 세포로서의 역할을 할 수 있지만, 다른 것들도 가능하다. 비리온 어셈블리를 위한 요구되는 유전자는 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같은 벡터 게놈, AAV rep 및 cap 유전자, 및 비제한적으로 아데노바이러스를 포함하는 다른 바이러스로부터의 특정 헬퍼 유전자를 포함한다. 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, AAV 생산을 위한 필수 유전자가 하나 이상의 플라스미드의 형질감염을 비제한적으로 포함하는 다양한 방식으로 생산자 세포 내로 도입될 수 있지만, 특정 유전자는 게놈 내로 통합되어 또는 에피솜 상에 보유되어 생산자 세포 내에 이미 존재할 수 있다.
용어 "역전 말단 반복부" 또는 "ITR"은 헤어핀 구조를 형성하고 역전 말단 반복부로서 기능하는 (즉, 특정 바이러스 기능 예컨대 복제, 바이러스 패키징, 통합 및/또는 프로바이러스 구제 등을 매개하는) 임의의 회문식 바이러스 말단 반복부 또는 합성 서열을 포함한다. ITR은 AAV ITR 또는 비-AAV ITR일 수 있다. 예를 들어, 비-AAV ITR 서열 예컨대 기타 파르보바이러스 (예를 들어, 개 파르보바이러스, 소 파르보바이러스, 마우스 파르보바이러스, 돼지 파르보바이러스, 인간 파르보바이러스 B-19)의 것 또는 SV40 복제 기원으로서의 역할을 하는 SV40 헤어핀이 ITR로서 사용될 수 있고, 이는 말단절단, 치환, 결실, 삽입 및/또는 결실에 의해 추가로 변형될 수 있다. 추가로, ITR은 부분적으로 또는 완전히 합성일 수 있고, 예컨대 사물스키(Samulski) 등의 미국 특허 번호 5,478,745에 기술된 바와 같은 "이중-D 서열"일 수 있다. 문헌 [FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapters 69 & 70 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)]을 또한 참조한다.
"AAV 역전 말단 반복부" 또는 "AAV ITR"은 혈청형 1, 2, 3a, 3b, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 13, 뱀 AAV, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 양 AAV, 염소 AAV, 새우 AAV, 또는 공지되지 않았거나 추후에 발견되는 임의의 기타 AAV를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 AAV로부터의 것일 수 있다. 말단 반복부가 원하는 기능, 예를 들어, 복제, 바이러스 패키징, 지속 및/또는 프로바이러스 구제 등을 매개하는 한, AAV ITR은 천연 말단 반복부 서열을 가질 필요가 없다 (예를 들어, 천연 AAV ITR 서열이 삽입, 결실, 말단절단 및/또는 미스센스 돌연변이에 의해 변경될 수 있다). AAV2 ITR의 서열은 염기쌍 145개의 길이이고, 본원에서 서열식별번호: 14 및 서열식별번호: 15로서 제공된다.
"시스-모티프"는 게놈 서열의 말단에서 또는 이에 인접하여 발견되고 복제 개시를 위해 인식되는 것과 같은 보존된 서열을 포함한다; 내부 위치의 잠적성 프로모터 또는 서열이 전사 개시, 스플라이싱 또는 종결에 유사하게 사용될 것이다.
다른 요소가 플랭킹된 서열과 관련된 "플랭킹된"은 이러한 서열에 대해 상대적으로 상류 및/또는 하류, 즉, 5' 및/또는 3'에 하나 이상의 플랭킹 요소가 존재하는 것을 나타낸다. 용어 "플랭킹된"은 서열들이 반드시 연속적이어야 한다는 것을 나타내도록 의도되지 않는다. 예를 들어, 트랜스진을 코딩하는 핵산과 플랭킹 요소 사이에 개재 서열이 있을 수 있다. 2개의 다른 요소 (예를 들어, TR)가 "플랭킹된" 서열 (예를 들어, 트랜스진)은 한 요소는 서열의 5'에 위치하고, 다른 요소는 서열의 3'에 위치한다는 것을 나타낸다; 그러나, 그 사이에 개재 서열이 있을 수 있다.
세포의 "형질감염"은 세포를 유전적으로 변형시키려는 목적으로 유전 물질이 세포 내로 도입되는 것을 의미한다. 관련 분야에 공지된 다양한 수단, 예컨대 인산칼슘, 폴리에틸렌이민, 전기천공 등에 의해 형질감염이 달성될 수 있다.
"유전자 전달" 또는 "유전자 배달"은 외래 DNA를 숙주 세포 내로 신뢰할 수 있게 삽입하기 위한 방법 또는 시스템을 지칭한다. 이러한 방법은 통합되지 않은 전달된 DNA의 일시적인 발현, 전달된 레플리콘 (예를 들어 에피솜)의 염색체외 복제 및 발현, 또는 전달된 유전 물질이 숙주 세포의 게놈 DNA 내로 통합되는 것을 초래할 수 있다.
"트랜스진"은 표적 세포 (본원에서 "숙주 세포"로도 지칭됨)로 전달하고 이러한 세포에서의 발현을 포함하기 위해 바이러스 벡터를 포함하는 벡터 내로 혼입된 임의의 이종 뉴클레오티드 서열, 및 연관된 발현 제어 서열, 예컨대 프로모터를 의미하도록 사용된다. 관련 분야의 기술자는 발현 제어 서열이 표적 세포에서 트랜스진의 발현을 촉진하는 능력을 기초로 선택될 것임을 이해한다. 트랜스진의 예는 치료용 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이다.
추가로 본 발명의 바이러스 벡터는 국제 특허 공보 WO 00/28004 및 문헌 [Chao et al., (2000) Mol. Therapy 2:619]에 기술된 바와 같은 "표적화된" 바이러스 벡터 (예를 들어, 지향성 향성이 있음) 및/또는 "하이브리드" 파르보바이러스 (즉, 바이러스 ITR 및 바이러스 캡시드가 상이한 파르보바이러스들로부터의 것임)일 수 있다.
추가로, 바이러스 캡시드 또는 게놈 요소는 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함하는 다른 변형을 함유할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 파르보바이러스 또는 AAV "Rep 코딩 서열"은 바이러스 복제 및 신규 바이러스 입자 생산을 매개하는 파르보바이러스 또는 AAV 비-구조 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 나타낸다. 예를 들어, 문헌 [Fields et al., Virology, volume 2, chapters 69 & 70 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)]에 파르보바이러스 및 AAV 복제 유전자 및 단백질이 기술되어 있다.
"Rep 코딩 서열"은 모든 파르보바이러스 또는 AAV Rep 단백질을 코딩할 필요가 없다. 예를 들어, AAV와 관련하여, Rep 코딩 서열은 4개 모두의 AAV Rep 단백질 (Rep78, Rep 68, Rep52 및 Rep40)을 코딩할 필요가 없고, 실제로, AAV5는 스플라이싱된 Rep68 및 Rep40 단백질만 발현하는 것으로 여겨진다. 대표적인 실시양태에서, 적어도 Rep 코딩 서열은 바이러스 또는 벡터 게놈 복제 및 신규 비리온 내로의 패키징에 필수적인 복제 단백질을 코딩한다. Rep 코딩 서열은 일반적으로 적어도 1개의 대형 Rep 단백질 (즉, Rep78/68) 및 1개의 소형 Rep 단백질 (즉, Rep52/40)을 코딩할 것이다. 특정 실시양태에서, Rep 코딩 서열은 AAV Rep78 단백질 및 AAV Rep52 및/또는 Rep40 단백질을 코딩한다. 다른 실시양태에서, Rep 코딩 서열은 Rep68 및 Rep52 및/또는 Rep40 단백질을 코딩한다. 추가 실시양태에서, Rep 코딩 서열은 Rep68 및 Rep52 단백질, Rep68 및 Rep40 단백질, Rep78 및 Rep52 단백질, 또는 Rep78 및 Rep40 단백질을 코딩한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대형 Rep 단백질"은 Rep68 및/또는 Rep78을 지칭한다. 청구된 발명의 대형 Rep 단백질은 야생형 또는 합성일 수 있다. 야생형 대형 Rep 단백질은 혈청형 1, 2, 3a, 3b, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 13, 또는 공지되지 않았거나 추후에 발견되는 임의의 기타 AAV를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 임의의 파르보바이러스 또는 AAV로부터의 것일 수 있다. 합성 대형 Rep 단백질은 삽입, 결실, 말단절단 및/또는 미스센스 돌연변이에 의해 변경될 수 있다.
천연 AAV 게놈에서, 상이한 Rep 단백질들이 2개의 상이한 프로모터의 사용 및 대안적 스플라이싱을 통해 단일 유전자에 의해 코딩된다. 그러나, AAV 벡터 생산의 목적을 위해, 단일 유전자로부터, 또는 별개의 폴리뉴클레오티드들로부터, 각각의 Rep 단백질에 대한 하나의 서열이 발현되어, Rep 단백질들이 생산자 세포에서 발현될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 각각의 변형된 유전자로부터 소형 Rep 단백질만 또는 대형 Rep 단백질만 발현되도록 p5 또는 p19 프로모터를 불활성화시키기 위해 Rep 코딩 유전자가 조작될 수 있다. 바이러스 프로모터 중 하나가 숙주 세포에서 불활성일 때 (이러한 경우 구성적으로 활성인 프로모터가 대신 사용될 수 있다), 또는 별개의 전사 및/또는 번역 제어 요소의 제어 하여 상이한 수준으로 Rep 단백질을 발현시키는 것을 원하는 경우에, 상이한 유전자들로부터의 대형 및 소형 Rep 단백질의 발현이 유리할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 숙주 세포에 대한 독성을 피하기 위해 소형 Rep 단백질 (예를 들어, Rep78/68)에 비교하여 대형 Rep 단백질의 발현을 하향-조절하는 것이 유리할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Urabe et al., (2002) Human Gene Therapy 13:1935]을 참조한다).
본원에서 사용된 바와 같이, 파르보바이러스 또는 AAV "cap 코딩 서열"은 기능성 파르보바이러스 또는 AAV 캡시드를 형성하는 (즉, DNA를 패키징할 수 있고 표적 세포를 감염시킬 수 있는) 구조 단백질을 코딩한다. 전형적으로, cap 코딩 서열은 모든 파르보바이러스 또는 AAV 캡시드 서브유닛을 코딩할 것이지만, 기능성 캡시드가 생산되는 한 전체보다 적은 캡시드 서브유닛이 코딩될 수 있다. 필수적이지는 않지만, 전형적으로, cap 코딩 서열은 단일 핵산 분자 상에 존재할 것이다.
자율성 파르보바이러스 및 AAV의 캡시드 구조가 문헌 [BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapters 69 & 70 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)]에 더욱 상세하게 기술되어 있다.
"마이크로-디스트로핀" 또는 "미니-디스트로핀"은 근육 세포에서 발현될 때의 디스트로핀의 기능성 중 적어도 일부를 보유하는 전장 근육 디스트로핀 또는 이의 아이소형에 존재하는 특정 서브도메인 또는 서브도메인의 일부분을 포함하는 조작된 단백질이다. 마이크로-디스트로핀 및 미니-디스트로핀은 전장 근육 디스트로핀 (Dp427m)보다 더 작다. 전장 근육 디스트로핀에 비교하여, 마이크로-디스트로핀 및 미니-디스트로핀은 N-말단에, C-말단에, 내부적으로, 또는 이의 임의의 조합으로 결실을 함유할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "디스트로핀병증"은 단백질 디스트로핀을 코딩하는 유전자인 DMD에서의 병원성 변이체에 의해 야기되는 근육 질환이다. 디스트로핀병증은 기저를 이루는 유전적 병변의 성질에 따라 광범위한 스펙트럼의 표현형으로 나타난다. 이러한 스펙트럼의 경도 종점은 크레아틴 포스포키나제 (CK)의 혈청 농도의 무증상성 증가 및 근육 경련 + 미오글로빈뇨의 표현형을 비제한적으로 포함한다. 이러한 스펙트럼의 중증 종점은 진행성 근육 질환인 뒤시엔느 근육 디스트로피 (DMD) 및 베커 근육 디스트로피 (BMD) (골격근이 주로 영향을 받고 심장은 더 적은 정도로 영향을 받음), 및 DMD-연관 확장 심근병증 (DCM) (심장이 주로 영향을 받음)을 비제한적으로 포함한다.
미니-디스트로핀 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트 및 벡터
본 개시내용은 코돈-최적화된 미니-디스트로핀 유전자 서열 및 이를 함유하는 발현 카세트를 제공한다. 이러한 유전자 및 발현 카세트는, 다른 용도도 있지만 그 중에서도, 디스트로핀병증, 예컨대 DMD의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 예방 또는 치료하기 위한 유전자 요법에 유용하다. 형질도입된 근육 세포에서의 미니-디스트로핀 단백질의 발현은 정상적으로 전장 디스트로핀에 기인하는 기능 중 적어도 일부, 예컨대 세포외 매트릭스와 세포골격 사이의 기계적으로 강력한 연결을 지지하는 것을 모사 및 교체할 수 있다.
코돈-최적화 서열은 파르보바이러스 벡터, 예를 들어, AAV 벡터의 크기 제한 내에 맞도록, 뿐만 아니라 최적화되지 않은 서열에 비교하여 미니-디스트로핀의 발현 강화를 제공하도록 디자인된다. 일부 실시양태에서, 최적화된 미니-디스트로핀 서열은 동물 내의 근육 세포 또는 근육에서 코돈-최적화되지 않은 디스트로핀 서열의 발현보다 적어도 약 5％, 예를 들어, 적어도 약 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 또는 500％ 이상만큼 더 크게 미니-디스트로핀 단백질의 발현 증가를 제공하고, 여기서 코돈-최적화되지 않은 서열은 참조로 포함된 NCBI 기준 서열 NM_004006.2에 의해 예시되는 바와 같은, 야생형 인간 전장 근육 디스트로핀을 코딩하는 mRNA를 기초로 한다.
따라서, 본 발명의 한 측면은 (a) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 적어도 약 90％ 동일한 서열; (b) 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 적어도 약 90％ 동일한 서열; 또는 (c) 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 적어도 약 90％ 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지는, 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 1-3 중 하나의 뉴클레오티드 서열에 적어도 약 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 동일하다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터, 예를 들어, 파르보바이러스 벡터, 예를 들어, AAV 벡터의 용량 이내인 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 약 5000, 4900, 4800, 4700, 4600, 4500, 4400, 4300, 4200, 4100, 또는 약 4000개 이하이다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 미니-디스트로핀 단백질은 야생형 디스트로핀 단백질의 N-말단, 힌지 H1, 로드 R1 및 R2, 힌지 H3, 로드 R22, R23, 및 R24, 힌지 H4, 시스테인-풍부 도메인 (CR 도메인), 및 일부 실시양태에서의 카르복시-말단 도메인 (CT 도메인) 전체 또는 이의 일부분을 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어진다. 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 미니-디스트로핀 단백질은 야생형 디스트로핀 단백질의 N-말단, 액틴-결합 도메인 (ABD), 힌지 H1, 로드 R1 및 R2, 로드 R22, R23, 및 R24, 힌지 H4, CR 도메인, 및 일부 실시양태에서의 CT 도메인 전체 또는 이의 일부분을 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어진다. 추가 실시양태에서, 미니-디스트로핀 단백질은 야생형 디스트로핀 단백질 (서열식별번호: 25)의 C-말단의 마지막 3개의 아미노산을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 8의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 서열에 적어도 약 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지는 미니-디스트로핀 단백질을 코딩한다.
디스트로핀의 뉴클레오티드 서열은 관련 분야에 널리 공지되어 있고, 서열 데이터베이스 예컨대 진뱅크에서 확인될 수 있다. 예를 들어, 인간 디스트로핀 mRNA 서열을 진뱅크 등록 번호 M18533 또는 NCBI 기준 서열 NM_004006.2에서 확인할 수 있고, 이들은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 디스트로핀 단백질의 생산을 위한 발현 카세트의 일부분이다. 발현 카세트는 디스트로핀의 발현을 증가시키는데 유용한 발현 요소를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 프로모터는 구성적 프로모터, 또는 조직-특이적 또는 조직-선호형 프로모터 예컨대 근육-특이적 또는 근육-선호형 프로모터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 크레아티닌 키나제 프로모터, 예를 들어, 서열식별번호: 4 또는 서열식별번호: 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지는 프로모터이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 폴리아데닐화 요소에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 폴리아데닐화 요소는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 프로모터 및 폴리아데닐화 요소에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지는 발현 카세트의 일부분이다. 특정 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 서열식별번호: 9-12 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 적어도 약 90％ 동일한, 예를 들어, 적어도 약 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 적절한 벡터는 플라스미드, 파지, 파지미드, 바이러스 벡터 (예를 들어, AAV 벡터, 아데노바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 알파바이러스, 또는 배큘로바이러스 벡터), 박테리아 인공 염색체 (BAC), 또는 효모 인공 염색체 (YAC)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 핵산은 5' 및/또는 3' 말단 반복부 (예를 들어, 5' 및/또는 3' AAV 말단 반복부)를 포함하는 AAV 벡터를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들어, 파르보바이러스 벡터, 예를 들어, AAV 벡터, 예를 들어, AAV9 벡터이다. 바이러스 벡터는 재조합 바이러스 주형을 포함하는 핵산을 추가로 포함할 수 있고, 여기서 핵산은 파르보바이러스 캡시드에 의해 캡시드화된다. 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 파르보바이러스 입자 (예를 들어, 재조합 AAV 입자)를 추가로 제공한다. 바이러스 벡터 및 바이러스 입자가 하기에서 추가로 논의된다.
특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 변형된 벡터가 유래되는 벡터에 비교하여 변형된 조직 향성을 나타낸다. 한 실시양태에서, 파르보바이러스 벡터는 골격근, 심장 근육, 및/또는 횡경막 근육에 대한 전신성 향성을 나타낸다. 다른 실시양태에서, 파르보바이러스 벡터는 야생형 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 벡터에 비교하여 간에 대한 향성이 감소되었다. 관련 분야의 통상의 기술자의 지식에 따라 특정 바이러스 캡시드 아미노산, 예를 들어, AAV 캡시드 VP1, VP2, 및/또는 VP3 단백질 내에 존재하는 것을 변경시킴으로써 조직 향성이 변형될 수 있다.
일부 실시양태에서, 벡터 게놈은 자가-상보적이거나 또는 듀플렉스화되고, 이러한 벡터 게놈을 함유하는 AAV 비리온은 scAAV 벡터로 공지된다. 국제 특허 공보 WO 01/92551 (이의 개시내용은 전문이 본원에 참조로 포함된다)에 scAAV 벡터가 기술되어 있다. scAAV를 사용하여 미니-디스트로핀을 발현시키는 것은 형질도입되는 세포의 개수, 형질도입되는 세포 당 카피수, 또는 양쪽 모두의 증가를 제공할 수 있다.
본 발명의 추가적인 측면은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터를 포함하는 형질전환된 세포에 관한 것이다. 세포는 시험관내, 생체외, 또는 생체내 세포일 수 있다.
본 발명의 추가 측면은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터 및/또는 형질전환된 세포를 포함하는 비-인간 트랜스제닉 동물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 트랜스제닉 동물은 실험실 동물, 예를 들어, 질환의 동물 모델, 에를 들어, 근육 디스트로피의 동물 모델이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 미니-디스트로핀 단백질에 관한 것이다. 이러한 미니-디스트로핀 단백질은 기능성 디스트로핀 단백질에 필수적인 서열을 모두 함유한다. 디스트로핀의 도메인이 관련 분야에 널리 공지되어 있고, 서열 데이터베이스 예컨대 진뱅크에서 서열을 확인할 수 있다. 예를 들어, 인간 디스트로핀 아미노산 서열을 NCBI 기준 서열: NP_003997.1 및 진뱅크 등록 번호 AAA53189에서 확인할 수 있고, 이들은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 미니-디스트로핀 단백질은 N-말단, 힌지 H1, 로드 R1 및 R2, 힌지 H3, 로드 R22, R23, 및 R24, 힌지 H4, CR 도메인, 및 일부 실시양태에서의 CT 도메인 전체 또는 이의 일부분을 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고, 여기서 미니-디스트로핀 단백질은 야생형 디스트로핀 단백질 (서열식별번호: 25)의 C-말단의 마지막 3개의 아미노산을 포함하지 않는다. 이러한 실시양태 중 일부에 따르면, N-말단 액틴 결합 도메인은 전장 인간 디스트로핀 단백질의 아미노산 서열인 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 1-240을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고; H1은 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 253-327을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고; R1은 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 337-447을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고; R2는 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 448-556을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고; H3은 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 2424-2470을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고; R22는 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 2687-2802를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고; R23은 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 2803-2931을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고; R24는 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 2932-3040을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고; H4는 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 3041-3112를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고; CR 도메인은 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 3113-3299를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지며; CT 도메인은 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 3300-3408을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 미니-디스트로핀 단백질은 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 이러한 구축물 및 관련 구축물의 추가 설명이 본원의 실시예 1에 포함된다.
일부 실시양태에서, 미니-디스트로핀 단백질은 N-말단, 힌지 H1, 로드 R1 및 R2, 로드 R22, R23, 및 R24, 힌지 H4, CR 도메인, 및 일부 실시양태에서의 CT 도메인 전체 또는 이의 일부분을 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 미니-디스트로핀 단백질은 야생형 디스트로핀 단백질의 C-말단의 마지막 3개의 아미노산을 포함하지 않는다. 이러한 실시양태 중 일부에 따르면, N-말단 액틴 결합 도메인은 전장 인간 디스트로핀 단백질의 아미노산 서열인 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 1-240을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고; H1은 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 253-327을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고; R1은 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 337-447을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고; R2는 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 448-556을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고; R22는 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 2687-2802를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고; R23은 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 2803-2931을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고; R24는 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 2932-3040을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고; H4는 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 3041-3112를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고; 시스테인 풍부 도메인은 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 3113-3299를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지며; 카르복시-말단 도메인은 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 3300-3408을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 미니-디스트로핀 단백질은 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다.
본 발명의 추가 측면은 세포를 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터와 접촉시키고, 이에 의해 세포에서 미니-디스트로핀을 생산하는 것을 포함하는, 세포에서 미니-디스트로핀 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 세포는 시험관내, 세포외, 또는 생체내 세포, 예를 들어, 세포주 또는 1차 세포일 수 있다. 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 도입에 의해 세포에서 단백질을 생산하는 방법은 관련 분야에 널리 공지되어 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터 및/또는 형질전환된 세포를 대상체에게 전달하고, 이에 의해 대상체에서 미니-디스트로핀 단백질을 생산하는 것을 포함하는, 대상체에서 미니-디스트로핀 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가적인 측면은 치료적 유효량의 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터 및/또는 형질전환된 세포를 대상체에게 전달하고, 이에 의해 대상체에서 근육 디스트로피를 치료하는 것을 포함하는, 근육 디스트로피 치료를 필요로 하는 대상체에서 근육 디스트로피를 치료하는 방법에 관한 것이다. 근육 디스트로피는 임의 형태의 근육 디스트로피, 예를 들어, 뒤시엔느 근육 디스트로피 또는 베커 근육 디스트로피일 수 있다.
재조합 바이러스 벡터
본 발명의 바이러스 벡터는 미니-디스트로핀을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 시험관 내에서, 생체 외에서 및 생체 내에서 세포에 전달하는데 유용하다. 특히, 이러한 바이러스 벡터는 미니-디스트로핀을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포유동물 세포를 포함하는 동물 세포에 배달 또는 전달하는데 유용하게 사용될 수 있다.
바이러스 벡터는 숙주 염색체 상의 유전자좌와 상동성을 공유하고 이와 재조합되는 이종 핵산을 또한 포함할 수 있다. 이러한 접근법은, 예를 들어, 숙주 세포 내의 유전적 결함을 수정하는데 활용될 수 있다.
추가적 대안으로서, 미니-디스트로핀을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 시험관 내에서, 생체 외에서 또는 생체 내에서 세포에서 미니-디스트로핀 단백질을 생산하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터를 배양된 세포 내로 도입할 수 있고, 발현된 미니-디스트로핀 단백질을 이로부터 단리할 수 있다.
관련 분야의 기술자는 미니-디스트로핀을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 적합한 제어 서열과 작동가능하게 회합될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드가 발현 제어 요소, 예컨대 전사/번역 제어 신호, 복제 기원, 폴리아데닐화 신호, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 프로모터, 및/또는 인핸서 등과 작동가능하게 회합될 수 있다.
관련 분야의 기술자는 다양한 프로모터 및 임의적으로는 인핸서 요소가 원하는 수준 및 조직-특이적 발현에 따라 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 프로모터/인핸서는 원하는 발현 패턴에 따라 구성적 또는 유도성일 수 있다. 프로모터/인핸서는 선천적 또는 외래성일 수 있고, 천연 또는 합성 서열일 수 있다. 외래는 전사 개시 영역이 도입되는 야생형 숙주에서 이러한 전사 개시 영역이 발견되지 않는다는 것을 의도한다. 인핸서는, 사용되는 경우, 프로모터와 동일한 유전자 및 종으로부터, 프로모터와 상이한 종의 오르토로그(orthologous) 유전자로부터, 프로모터와 동일한 종의 상이한 유전자로부터, 또는 프로모터와 상이한 종의 상이한 유전자로부터 선택될 수 있다.
특정 실시양태에서, 프로모터/인핸서 요소는 치료될 표적 세포 또는 대상체에 대해 선천적일 수 있다. 대표적인 실시양태에서, 프로모터/인핸서 요소는 이종 핵산 서열에 대해 선천적일 수 있다. 일반적으로 프로모터/인핸서 요소는 관심 표적 세포(들)에서 기능하도록 선택된다. 추가로, 특정 실시양태에서, 프로모터/인핸서 요소는 포유동물 프로모터/인핸서 요소이다. 프로모터/인핸서 요소는 구성적 또는 유도성일 수 있다.
이종 핵산 서열(들)의 발현에 대한 조절을 제공하는 것이 바람직한 용도에서 전형적으로 유도성 발현 제어 요소가 유리하다. 유전자 전달을 위한 유도성 프로모터/인핸서 요소는 조직-특이적 또는 -선호형 프로모터/인핸서 요소일 수 있고, 근육 특이적 또는 선호형 (심장 근육, 골격근 및/또는 평활근 특이적 또는 선호형을 포함함) 프로모터/인핸서 요소를 포함한다. 기타 유도성 프로모터/인핸서 요소는 호르모-유도성 및 금속-유도성 요소를 포함한다. 예시적인 유도성 프로모터/인핸서 요소는 Tet 온(on)/오프(off) 요소, RU486-유도성 프로모터, 엑디손-유도성 프로모터, 라파마이신-유도성 프로모터, 및 메탈로티오네인 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
미니-디스트로핀을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 표적 세포에서 전사된 후 번역되는 실시양태에서, 삽입된 단백질 코딩 서열의 효율적인 번역을 위해 특이적인 개시 신호가 일반적으로 포함된다. ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함할 수 있는 이러한 외인성 번역 제어 서열은 천연 및 합성 양쪽 모두로 기원이 다양할 수 있다.
본 발명에 따른 바이러스 벡터는 미니-디스트로핀을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 분열 중인 세포 및 분열 중이지 않은 세포를 포함하여 광범위한 세포 내로 전달하는 수단을 제공한다. 바이러스 벡터는 폴리뉴클레오티드를 시험관 내에서 세포에 전달하는데, 예를 들어, 시험관 내에서 또는 생체외 유전자 요법을 위해 미니-디스트로핀을 생산하는데 사용될 수 있다. 추가적으로 바이러스 벡터는, 예를 들어, 미니-디스트로핀을 발현시키기 위해, 폴리뉴클레오티드를 필요로 하는 대상체에게 폴리뉴클레오티드를 전달하는 방법에서 유용할 수 있다. 이러한 방식으로, 단백질이 대상체에서 생체 내에서 생산될 수 있다. 대상체는 대상체에 기능성 디스트로핀의 결핍이 있기 때문에 미니-디스트로핀을 필요로 할 수 있다. 추가로, 대상체에서의 미니-디스트로핀 생산이 어떤 이로운 효과를 부여할 수 있기 때문에 이러한 방법이 실행될 수 있다.
바이러스 벡터는 배양된 세포에서 또는 대상체에서 미니-디스트로핀을 생산하는데 사용될 수도 있다 (예를 들어, 대상체를 단백질을 생산하거나 대상체에 대한 단백질을 효과를 관찰하기 위한 생물반응기로서, 예를 들어, 스크리닝 방법과 함께, 사용함).
일반적으로, 본 발명의 바이러스 벡터는 미니-디스트로핀을 전달하는 것이 이로운 임의의 질환 상태를 치료 및/또는 예방하기 위해 미니-디스트로핀을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 전달하는데 이용될 수 있다. 예시적인 질환 상태는 뒤시엔느 및 베커를 포함하는 근육 디스트로피를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 바이러스 벡터는 진단 및 스크리닝 방법에서 용도가 확인되고, 이에 의해 미니-디스트로핀을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포 배양 시스템에서 또는 별법적으로 트랜스제닉 동물 모델에서 일시적으로 또는 안정적으로 발현된다.
본 발명의 바이러스 벡터는 관련 분야의 기술자에게 명백할 바와 같이, 유전자 표적화, 소거, 전사, 번역 등을 평가하기 위한 프로토콜에서의 용도를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 비-치료 목적으로 또한 사용될 수 있다. 이러한 바이러스 벡터는 안전성 (확산, 독성, 면역원성 등)을 평가하는 목적으로도 사용될 수 있다. 이러한 데이터는, 예를 들어, 미국 식품의약국에 의해 임상 효능 평가 전의 규제 승인 과정의 일부로서 간주된다.
디스트로핀병증, 예컨대 DMD를 치료하기 위한 본 개시내용의 AAV 벡터 또는 입자의 특정 실시양태에 따르면, 본 개시내용은 횡경막을 포함하는 골격근, 및 심장 근육을 포함하지만 이에 제한되지 않는 가로무늬근에 대한 향성이 있는 AAV 혈청형으로부터의 AAV 캡시드를 포함하는 AAV 벡터 또는 입자를 제공한다. 가로무늬근에 대한 향성이 있는 천연 발생 AAV 캡시드의 비제한적인 예는 AAV1, AAV6, AAV7, AAV8, 및 AAV9이다. 그러나, 다른 실시양태는 천연적으로 발생하는 것으로 공지되지 않았지만, 그보다는 다른 조직에 비교하여 가로무늬근에 우선적으로 형질도입되는 신규 AAV 캡시드를 생성시키려는 명확한 목적을 위해 조작된 AAV 캡시드를 포함한다. 이러한 조작된 캡시드는 관련 분야에 공지되어 있지만, 본 개시내용은 아직 개발되지 않은 새로운 근육-특이적 AAV 캡시드를 포괄한다. 조작된 근육-특이적 AAV 캡시드의 비제한적인 예가 문헌 [Yu, CY, et al., Gene Ther 16(8):953-62 (2009)], [Asokan, A, et al., Nat Biotech 28(1):79-82 (2010)] (AAV2i8을 기술함), [Bowles, DE, et al., Mol Therapy 20(2):443-455 (2012)] (AAV 2.5를 기술함), 및 [Asokan, A, et al., Mol Ther 20(4):699-708 (2012)]에서 보고되었다. 다수의 천연 및 비-천연 발생 AAV 혈청형에 대한, VP1, VP2, 및 VP3 단백질을 포함하는 캡시드 단백질의 아미노산 서열이 관련 분야에 공지되어 있다. 한 비제한적인 예에서, AAV9 혈청형에 대한 아미노산 서열이 서열식별번호: 13의 아미노산 서열로서 제공된다.
디스트로핀병증, 예컨대 DMD를 치료하기 위한 본 개시내용의 AAV 입자는 형질도입된 근육 세포에서 결손 전장 디스트로핀 단백질이 공급하는 기능을 적어도 부분적으로 복구하도록 선택된 디스트로핀 서브도메인이 있는 미니-디스트로핀 단백질을 발현시키기 위한 벡터 게놈을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 전장 야생형 인간 디스트로핀 단백질의 서브도메인으로부터 미니-디스트로핀 단백질이 구축된다. 일부 실시양태에서, 미니-디스트로핀 단백질은 N-말단에서 C-말단까지 하기 순서로 인간 디스트로핀 단백질으로부터의 하기의 서브도메인을 포함한다: N-말단 액틴 결합 도메인 (ABD); H1 힌지 도메인; R1 및 R2 스펙트린-유사 반복 도메인; H3 힌지 도메인; R22, R23 및 R24 스펙트린-유사 반복 도메인; H4 힌지 도메인; 시스테인 풍부 (CR) 도메인; 및 카르복시-말단 (CT) 도메인. 이러한 실시양태 중 일부에 따르면, N-말단 액틴 결합 도메인은 전장 인간 디스트로핀 단백질의 아미노산 서열인 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 1-240을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고; H1은 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 253-327을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고; R1은 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 337-447을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고; R2는 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 448-556을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고; H3은 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 2424-2470을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고; R22는 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 2687-2802를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고; R23은 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 2803-2931을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고; R24는 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 2932-3040을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고; H4는 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 3041-3112를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고; CR 도메인은 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 3113-3299를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지며; CT 도메인은 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 3300-3408을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 특정 실시양태에 따르면, 미니-디스트로핀 단백질은 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 갖는다.
디스트로핀병증, 예컨대 DMD를 치료하기 위한 본 개시내용의 AAV 입자의 벡터 게놈은 미니-디스트로핀을 발현시키기 위한 유전자를 포함한다. 전형적으로, 벡터 게놈은 미니-디스트로핀을 발현하는 유전자에 공간을 제공하기 위해 정상적으로는 야생형 AAV에 존재하는 rep 및 cap 유전자가 결여될 것이다. 일부 실시양태에서, 유전자는 전장 인간 디스트로핀 단백질로부터의 하기의 서브도메인이 있는 미니-디스트로핀 단백질을 코딩한다: ABD-H1-R1-R2-H3-R22-R23-R24-H4-CRD-CTD. 일부 실시양태에서, CTD는 야생형 근육 디스트로핀에서 발견되는 CTD의 일부분일 뿐이고, 일부 실시양태에서 야생형 근육 디스트로핀 (서열식별번호: 25)에 존재하는 마지막 3개의 아미노산을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 유전자는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 인간 미니-디스트로핀 단백질을 코딩한다.
일부 실시양태에 따르면, 인간 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 유전자는 본 개시내용의 AAV 입자가 유전자 요법을 실시하기 위해 투여될 대상체의 종과 관련하여 코돈-최적화된다. 이론에 의해 제한되기를 원치 않으면서, 코돈-최적화가 형질도입된 세포가 유전자를 mRNA로 전사시키고/시키거나 mRNA를 단백질로 번역시킬 수 있는 효율을 개선시킴으로써, 코돈-최적화되지 않은 미니-디스트로핀 코딩 유전자의 발현에 비교하여 생산되는 미니-디스트로핀 단백질의 양을 증가시키는 것으로 여겨진다. 일부 비제한적 실시양태에서, 코돈-최적화는 인간 코돈-최적화이지만, 개를 포함하는 다른 종에 관하여 코돈-최적화가 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 코돈-최적화는 종, 예컨대 인간에 존재하는 비교적 희귀한 tRNA와 쌍을 이루는 하나 이상의 코돈을 동일한 아미노산에 대한 더욱 만연한 tRNA와 쌍을 이루는 동의성 코돈으로 치환한다. 이러한 접근법은 번역 효율을 증가시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 코돈-최적화는 전사 또는 번역 효율에 영향을 미칠 수 있는 특정한 시스-작용 모티프를 제거한다. 코돈-최적화의 비제한적 예는 코딩 서열의 의도되는 시작부에 강력한 코작 서열을 부가하는 것, 또는 의도되는 시작 코돈 하류의 내부 리보솜 진입 부위를 제거하는 것을 포함한다. 코돈-최적화를 통해 제거될 수 있는 기타 시스-작용 모티프는 내부 TATA-박스; 카이(chi)-부위; ARE, INS, 및/또는 CRS 서열 요소; 반복 서열 및/또는 RNA 2차 구조; 잠적성 스플라이스 도너 및/또는 어셉터 부위, 분지점; 및 SalI 부위를 포함한다.
특정 실시양태에서, 코돈-최적화는 미니-디스트로핀 유전자가 이로부터 어셈블리된 야생형 서열에 비교하여 GC 함량 (즉, 핵산 서열 내에 존재하는 G 및 C 핵염기의 개수이고, 일반적으로 백분율로 표현됨)을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, GC 함량은 상응하는 야생형 유전자의 GC 함량보다 적어도 5％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 100％ 이상이다. 관련 실시양태에서, 코돈-최적화된 유전자의 GC 함량은 약 또는 적어도 45％, 46％, 47％, 48％, 49％, 50％, 51％, 52％, 53％, 54％, 55％, 56％, 57％, 58％, 59％, 60％, 61％, 62％, 63％, 64％, 65％, 66％, 67％, 68％, 69％, 70％ 이상이다.
일부 실시양태에서, 코돈-최적화는 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 유전자의 코돈 적응 지수 (CAI)를 증가시킨다. CAI는 특정 종에서의 동의성 코돈 용법 편향의 척도이다. 특정 종에서의 CAI 값 (0 내지 1의 범위)은 유전자 발현 수준과 양으로 상관된다. 예를 들어, 문헌 [Sharp, PM and W-H Lie, Nuc Acids Res 15(3):1281-95 (1987)]을 참조한다. 특정 실시양태에 따르면, 코돈-최적화는 고도로 발현된 인간 유전자와 관련된 미니-디스트로핀 유전자의 CAI를 적어도 0.70, 0.71, 0.72, 0.73, 0.74, 0.75, 0.76, 0.77, 0.78, 0.79, 0.80, 0.81, 0.82, 0.83, 0.84, 0.85, 0.86, 0.87, 0.88, 0.89, 0.90, 0.91, 0.92, 0.93, 0.94, 0.95, 0.96, 0.97, 0.98, 또는 0.99인 값으로 증가시킨다.
다른 실시양태에서, 코돈-최적화는 미니-디스트로핀의 코딩 서열 내의 CpG 디뉴클레오티드의 개수를 감소시킨다. 임의의 특정한 작동 이론에 의해 제한되기를 원치 않으면서, CpG 디뉴클레오티드에서의 메틸화가 유전자 전사를 침묵화시킬 수 있어서, 유전자 서열 내의 CpG 디뉴클레오티드의 개수를 감소시키는 것은 메틸화 수준을 감소시킴으로써 전사 효율 강화를 초래할 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서, 코돈 최적화된 미니-디스트로핀 유전자의 일부 실시양태에서, CpG 디뉴클레오티드의 개수가 미니-디스트로핀 유전자가 이로부터 어셈블리된 야생형 서열에 비교하여 약 또는 적어도 5％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％ 이상만큼 감소된다.
인간 코돈-최적화된 인간 미니-디스트로핀 유전자의 비제한적인 예가 서열식별번호: 1의 DNA 서열에 의해 제공된다. 핵염기 3978개의 길이 (정지 코돈 포함)인 이러한 DNA 서열이 본원에서 Hopti-Dys3978로 지칭되지만, 이러한 특정한 용어법은 편의를 위해서만 사용될 뿐이고, 제한적인 것으로 의도되지 않는다. Dys3978로 칭해지는, 서열식별번호: 1이 코딩하는 미니-디스트로핀 단백질 서열이 서열식별번호: 7에 의해 제공된다. 개 코돈-최적화된 인간 미니-디스트로핀 유전자의 예가 서열식별번호: 3에 의해 제공되고, 이 또한 Dys3978을 코딩한다. 본원에서의 추가적인 상세사항에서 기술된 바와 같이, 서열식별번호: 7의 미니-디스트로핀에 대한 코딩 서열은 디스트로핀 단백질 (서열식별번호: 25) 내에 존재하는 특정 서브도메인들에 상응하는 야생형 전장 인간 근육 디스트로핀 유전자 (참조로 포함된 NCBI 기준 서열 NM_004006.2에 의해 예시되는 바와 같음)의 하위서열들로부터 어셈블리되었다. 생성된 유전자 서열이 본원에서 서열식별번호: 26으로서 제공되고, 이는 그후 인간 코돈-최적화되어 서열식별번호: 1의 DNA 서열을 초래하였다. 비제한적으로, 코돈-최적화 전의 유전자 서열에 비교하여, 코돈-최적화는 GC 함량을 증가시켰고, 드문 코돈의 사용을 감소시켰으며 (즉, 코돈-적응 지수 (CAI)를 증가시킴), 강력한 번역 개시 부위 (코작 컨센서스 서열 또는 유사물)을 포함하였다.
디스트로핀병증, 예컨대 DMD를 치료하기 위한 본 개시내용의 AAV 입자의 벡터 게놈은 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 코돈-최적화 유전자에 플랭킹된 AAV 역전 말단 반복부 (ITR)를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, ITR은 캡시드와 동일한 AAV 혈청형으로부터의 것이지만 (예를 들어, 비제한적으로, AAV9 ITR이 AAV9 캡시드와 함께 사용됨), 다른 실시양태에서, 상이한 혈청형으로부터의 AAV ITR이 사용될 수 있다. 예를 들어, AAV2 혈청형으로부터의 ITR이 상이한 비-AAV2 혈청형으로부터의 AAV 캡시드와 조합되어 벡터 게놈에서 사용될 수 있다. 비제한적인 예는 AAV2 ITR을 AAV1, AAV6, AAV7, AAV8, 또는 AAV9 혈청형, 또는 상이한 천연 또는 비-천연 발생 AAV 혈청형으로부터의 캡시드와 함께 사용하는 것을 포함한다. 특정한 비제한적 예에서, AAV2 ITR이 AAV9 혈청형으로부터의 캡시드와 조합되어 사용될 수 있다. 벡터 게놈의 플러스 또는 센스 DNA 가닥의 관점에서, 왼쪽, 5', 또는 상류의 AAV2 ITR의 서열이 서열식별번호: 14의 DNA 서열로서 제공되고, 오른쪽, 3', 또는 하류의 AAV2 ITR의 서열이 서열식별번호: 15의 DNA 서열로서 제공된다.
디스트로핀병증, 예컨대 DMD를 치료하기 위한 본 개시내용의 AAV 입자의 벡터 게놈은 벡터 게놈이, 이의 이중 가닥 형태로 전환되면, 형질도입된 세포에서 미니-디스트로핀 유전자를 발현할 수 있도록, 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 유전자와 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소를 추가로 포함한다. 전형적으로 전사 조절 요소는 프로모터를 포함하지만, 임의적으로는, 프로모터로부터의 전사 개시 속도를 증대시키는 작용을 할 수 있는 하나 이상의 인핸서 요소를 포함한다.
미니-디스트로핀 코딩 서열에 관한 전사 조절 요소의 작동가능한 연결은 전사 조절 요소가 유전자의 전사 및 발현을 제어하는 기능을 할 수 있는 것을 의미하지만, 임의의 특정한 구조적 또는 공간적 관계를 필수적으로 요구하지는 않는다. 전형적으로 본 개시내용의 벡터 게놈은 단일-가닥 DNA 분자로서 AAV 캡시드 내로 패키징되기 때문에, 벡터 게놈이 이중 가닥 형태로 전환되기까지는 작동가능한 연결이 기능성이지 않을 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 일반적으로, 프로모터는 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 유전자 서열의 5' 또는 상류에 위치할 것이지만, 다른 전사 조절 요소, 예컨대 인핸서는 유전자의 5' 또는 다른 곳, 예컨대 3'에 위치할 수 있다.
일부 실시양태에서, 전사 조절 요소는 강력한 구성적으로 활성인 프로모터, 예컨대 진핵생물 세포를 감염시키는 특정 바이러스에서 확인되는 것일 수 있다. 관련 분야로부터의 널리 공지된 예는 사이토메갈로바이러스 (CMV)로부터의 프로모터를 포함하지만, 라우스 육종 바이러스 (RSV)로부터의 프로모터와 같은 다른 것들 또한 공지되어 있다. 강력한 바이러스 프로모터 예컨대 CMV 또는 RSV는 전형적으로 조직-특이적이지 않아서, 사용되는 경우, 미니-디스트로핀 단백질이 근육 세포뿐만 아니라 본 개시내용의 AAV 입자가 형질도입된 임의의 다른 세포 유형, 예컨대 간에서도 발현될 것이다. 따라서, 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 AAV 입자가 또한 형질도입될 수 있는 비-근육 세포, 예컨대 간 세포에서 발현되는 미니-디스트로핀 단백질의 양을 감소시키기 위해 근육-특이적 전사 조절 요소가 사용될 수 있다.
근육-특이적 전사 조절 요소는 포유동물 종을 포함하는 임의의 종으로부터의 근육-특이적 유전자, 예컨대 비제한적으로 인간 또는 마우스 근육 유전자로부터 유래될 수 있다. 전형적으로 근육-특이적 전사 조절 요소는 최소한 근육-특이적 유전자로부터의 프로모터, 뿐만 아니라 동일하거나 상이한 근육 특이적 유전자로부터의 하나 이상의 인핸서를 포함할 것이다. 이러한 인핸서는 선천적 유전자의 많은 부분, 예컨대 유전자의 5' 또는 3'에 위치한 인핸서로부터 유래될 수 있거나, 또는 심지어 인트론에 있을 수 있다. 근육-특이적 전사 조절 요소는 본 개시내용의 AAV 벡터 게놈을 생산하기 위해 근육-특이적 유전자로부터 총괄적으로 제거되어 플라스미드 내로 삽입될 수 있거나, 또는 이의 활성을 맞추고 가능한 한 이의 크기를 감소시키도록 조작될 수 있다.
근육-특이적 전사 조절 요소가 유래될 수 있는 근육-특이적 유전자의 비제한적인 예는 근육 크레아틴 키나제 유전자, 미오신 중쇄 유전자, 또는 미오신 경쇄 유전자, 또는 골격근으로부터의 알파 1 액틴 유전자를 포함하지만, 다른 것들 또한 가능하다. 이러한 유전자는 인간, 마우스, 또는 기타 종으로부터의 것일 수 있다.
유전자 요법 용도에서 사용하기 위해 생성된 근육-특이적 전사 조절 요소가 관련 분야에 기술되어 있고, 근육 디스트로피를 치료하기 위한 본 개시내용의 AAV 벡터에서 사용될 수 있다. 비제한적인 예에서, 하우저(Hauser)는 마우스 크레아틴 키나제 (MCK) 유전자로부터 유래된 CK4, CK5, 및 CK6로 공지된 근육-특이적 전사 조절 요소를 기술하였고 (Hauser, MA, et al., Mol Therapy 2(1):16-25 (2000)), 살바(Salva)는 MCK 유전자로부터 유래된 CK1 및 CK7, 및 마우스 α-MHC 유전자로부터의 인핸서를 추가적으로 포함하는 MHCK1 및 MHCK7로 공지된 근육-특이적 전사 조절 요소를 기술하였으며 (Salva, MZ, et al., Mol Therapy 15(2):320-9 (2007)), 왕(Wang)은 enh358MCK, dMCK 및 tMCK로 공지된 근육-특이적 전사 조절 요소를 기술하였다 (Wang, B, et al., Gene Therapy 15:1489-9 (2008)). 근육 디스트로피를 치료하기 위한 본 개시내용의 AAV 벡터에서 기타 근육-특이적 전사 조절 요소를 사용하는 것이 또한 가능하다.
근육 디스트로피를 치료하기 위한 본 개시내용의 AAV 벡터에서 사용될 수 있는 근육-특이적 전사 조절 요소의 비제한적 예는 각각 관련 분야에 기술된 바와 같은 CK4, CK5, CK6, CK1, CK7, MHCK1, MHCK7, enh358MCK, dMCK 및 tMCK, 또는 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 및 서열식별번호: 16의 DNA 서열을 갖는 것으로 본원에 개시된 것들을 포함한다. 다른 근육-특이적 전사 조절 요소 또한 사용될 수 있다.
디스트로핀병증, 예컨대 DMD를 치료하기 위한 본 개시내용의 AAV 벡터의 벡터 게놈은 미니-디스트로핀 유전자에 대한 코딩 서열의 3'에 위치하는 전사 종결 서열을 추가로 포함한다. 전사 종결 서열을 포함하는 것은 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 mRNA 전사체가 형질도입된 세포에 의해 적합하게 폴리아데닐화될 것임을 확실하게 함으로써 메세지가 단백질로 효율적으로 번역되는 것을 확실하게 한다. 임의의 특정한 작동 이론에 제한되는 것을 원치 않으면서, 포유동물 전사 종결 서열의 연구에서, 성장 중인 전사체의 전사를 종결시키고 폴리아데닐화를 신호하는 역할을 하는 유전자의 3' UTR 내의 컨센서스 서열이 확인되었다. 구체적으로, 이러한 서열은 모티프 AATAAA에 15-30개의 뉴클레오티드, 및 그 후의 CA가 이어지는 것을 전형적으로 포함한다. 예를 들어, 문헌 [N. Proudfoot, Genes Dev 25:1770-82 (2011)]을 참조한다. 기타 모티프, 예컨대 상류 요소 (USE) 및 하류 요소 (DSE)가 일부 유전자에서 전사 종결에 기여할 수 있다. 다수의 전사 종결 서열이 관련 분야에 공지되어 있고, 본 개시내용의 AAV 벡터에서 사용될 수 있다. 비제한적인 예는 SV40 바이러스 초기 또는 후기 유전자로부터의 폴리아데닐화 신호 (SV40 초기 또는 후기 폴리A) 또는 소 성장 호르몬 유전자로부터의 폴리아데닐화 신호 (bGH 폴리A)를 포함한다. 임의의 종의 다른 유전자로부터의 전사 종결 서열이 본 개시내용의 AAV 벡터에서 사용될 수 있다. 대안적으로, 합성 전사 종결 서열이 디자인되어, 전사 종결 및 폴리아데닐화를 신호하는데 사용될 수 있다. 본 개시내용의 AAV 벡터에서 사용될 수 있는 전사 종결 서열의 추가적인 비제한적 예는 서열식별번호: 6 및 서열식별번호: 17의 DNA 서열을 갖는 것으로 본원에 개시된 것들을 포함한다.
특정한 비제한적 실시양태에 따르면, 본 개시내용은 AAV 캡시드 및 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 벡터 게놈을 포함하는, 디스트로핀병증, 예컨대 DMD를 치료하기 위한 AAV 바이러스 입자 또는 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 미니-디스트로핀 단백질은 전장 인간 디스트로핀 단백질로부터의 하기의 서브도메인을 포함한다: ABD-H1-R1-R2-H3-R22-R23-R24-H4-CRD-CTD. 일부 실시양태에서, CTD는 야생형 근육 디스트로핀에서 발견되는 CTD의 일부분일 뿐이고, 일부 실시양태에서는 야생형 근육 디스트로핀 (서열식별번호: 25)에 존재하는 마지막 3개의 아미노산을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에 따르면, 서열식별번호: 7의 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 유전자는 인간 코돈-최적화되고, 서열식별번호: 1의 DNA 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, AAV 캡시드는 AAV9 혈청형으로부터의 것이다.
본원의 다른 곳에서 언급된 바와 같이, 단일-가닥 AAV 벡터 게놈은 거의 동일한 비율의 플러스 가닥 또는 마이너스 가닥으로서 캡시드 내로 패키징된다. 결과적으로, 벡터 또는 입자의 실시양태는 벡터 게놈이 플러스 가닥 극성인 (즉, 센스 또는 코딩 DNA 가닥의 핵염기 서열을 갖는) AAV 입자, 뿐만 아니라 벡터 게놈이 마이너스 가닥 극성인 (즉, 안티센스 또는 주형 DNA 가닥의 핵염기 서열을 갖는) AAV 입자를 포함한다. 이의 정규 5' → 3' 순서의 플러스 가닥의 핵염기 서열을 고려하여, 이의 5' → 3' 순서의 마이너스 가닥의 핵염기 서열을 플러스 가닥의 핵염기 서열의 역-상보체로서 결정할 수 있다.
벡터의 일부 실시양태에서, 벡터 게놈은, 플러스 극성인 경우, 서열식별번호: 16의 DNA 서열을 갖는 크레아틴 키나제 유전자로부터 유래된 근육-특이적 전사 조절 요소가 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 인간 코돈-최적화 유전자의 DNA 서열인 서열식별번호: 1의 5'에 위치하고 이와 작동가능하게 연결된 것을 포함한다. 상응하는 마이너스 가닥을 포함하는 입자 또한 가능하고, 여기서 이의 5' 끝부분으로부터의 핵염기의 서열은 상기 언급된 플러스 가닥의 서열의 역-상보체일 것이다. 다른 실시양태에서, 벡터 게놈은, 플러스 극성인 경우, 제1 AAV2 ITR, 이어서 서열식별번호: 16의 DNA 서열이 서열식별번호: 1의 DNA 서열의 5'에 위치하고 이와 작동가능하게 연결된 것, 및 미니-디스트로핀 유전자의 3'에 위치하는 서열식별번호: 17의 DNA 서열을 포함하는 전사 종결 서열, 이어서 제2 AAV2 ITR을 포함한다. 상응하는 마이너스 가닥을 포함하는 입자 또한 가능하고, 여기서 이의 5' 끝부분으로부터의 핵염기의 서열은 상기 언급된 플러스 가닥의 서열의 역-상보체일 것이다.
벡터의 특정한 다른 실시양태에서, 벡터 게놈은, 플러스 극성인 경우, 5' → 3' 순서로 제1 AAV2 ITR, 서열식별번호: 16의 DNA 서열에 의해 정의되는 전사 조절 요소, 미니-디스트로핀을 발현시키기 위한 인간 코돈 최적화 유전자 서열인, 전사 조절 요소와 작동가능하게 연결된 서열식별번호: 1의 DNA 서열에 의해 정의되는 유전자 서열, 서열식별번호: 17의 DNA 서열에 의해 정의되는 전사 종결 서열, 및 제2 AAV2 ITR을 포함한다. 상응하는 마이너스 가닥을 포함하는 입자 또한 가능하고, 여기서 이의 5' 끝부분으로부터의 핵염기의 서열은 상기 언급된 플러스 가닥의 서열의 역-상보체일 것이다.
특정한 비제한적 실시양태에 따르면, 본원에서 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA로 지칭될 수 있는, 디스트로핀병증, 예컨대 DMD를 치료하기 위한 AAV 벡터는 AAV9 혈청형으로부터의 캡시드, 및 게놈이 플러스 극성인 경우 서열식별번호: 18의 DNA 서열 또는 게놈이 마이너스 극성인 경우 서열식별번호: 18의 DNA 서열 (즉, 벡터 게놈 서열이 5' → 3'으로 판독될 때)의 역-상보체를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지는, 본원에서 hCK.Hopti-Dys3978.spA로 지칭될 수 있는 벡터 게놈을 포함한다.
바이러스 벡터를 생산하는 방법
본 개시내용은 AAV 벡터를 생산하는 방법을 추가로 제공한다. 한 특정한 실시양태에서, 본 개시내용은 AAV 복제 및 패키징에 대해 허용성인 세포에 미니-디스트로핀 유전자, 회합된 유전자 제어 요소 및 플랭킹된 AAV ITR을 포함하는 재조합 AAV 벡터 게놈, 및 AAV 복제 및 패키징 기능, 예컨대 AAV rep 및 cap 유전자가 제공하는 것을 재조합 AAV 입자의 복제 및 패키징에 충분한 조건 하에 제공함으로써 rAAV 입자가 세포에 의해 생산되는 단계를 포함하는, 재조합 파르보바이러스 입자를 생산하는 방법을 제공한다. rAAV 입자의 복제 및 패키징에 충분한 조건은, 비제한적으로, 헬퍼 기능, 예컨대 아데노바이러스 및/또는 헤르페스바이러스로부터의 것을 포함한다. AAV 복제 및 패키징에 대해 허용성인 세포는 본원에서 패키징 세포 또는 생산자 세포로서 공지되고, 이러한 용어는 더 넓은 용어인 숙주 세포에 포괄된다. rAAV 입자 벡터 게놈, 복제 및 패키징 기능, 및 필요한 경우의 헬퍼 기능은 바이러스 또는 비-바이러스 벡터, 예컨대 플라스미드를 통해 제공될 수 있고, 패키징 세포 내에 안정적으로 또는 일시적으로, 세포의 게놈 내로 통합되어 또는 에피솜 내에서 존재할 수 있다.
본 개시내용의 재조합 AAV 벡터는 관련 분야의 기술자에게 공지된 여러 방법에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, WO 2013/063379를 참조한다). 예시적인 방법이 문헌 [Grieger, et al. 2015, Molecular Therapy 24(2):287-297]에 기술되어 있고, 이의 내용은 참조로 포함된다. 간략하게, 적격한 임상 마스터 세포 은행으로부터의 부착성 HEK293 세포주가 사용되어, 신속하고 확장성인 rAAV 입자 생산을 허용하는 WAVE 생물반응기 및 진탕 플라스크에서 동물 성분이 없는 현탁 조건으로 성장되는, HEK293 세포의 효율적인 형질감염이 출발점으로서 사용된다. 삼중 형질감염 방법 (예를 들어, WO 96/40240)을 사용하여, 일부 실시양태에서, 현탁 HEK293 세포주는 형질감염 48시간 후에 수확했을 때 세포 당 1×105 초과의 벡터 게놈 (vg) 함유 입자, 또는 1×1014 vg/세포 배양물 L 초과를 생성시킬 수 있다. 삼중 형질감염은 패키징 세포가 3개의 플라스미드로 형질감염된다는 사실을 지칭한다: 1개의 플라스미드는 AAV rep 및 cap 유전자를 코딩하고, 또 다른 플라스미드는 다양한 헬퍼 기능 (예를 들어, 아데노바이러스 또는 HSV 단백질 예컨대 E1a, E1b, E2a, E4, 및 VA RNA)을 코딩하며, 또 다른 플라스미드는 벡터 게놈, 즉, 미니-디스트로핀 유전자 및 이의 다양한 제어 요소에 AAV ITR이 플랭킹된 것을 코딩한다. 원하는 수율을 달성하기 위해, 다수의 변수 예컨대 성장 및 형질감염 양쪽 모두를 지지하는 상용성 무혈청 현탁 배지의 선택, 형질감염 시약의 선택, 형질감염 조건 및 세포 밀도가 최적화될 수 있다. 벡터를 배지로부터 및/또는 세포를 용해시킴으로써 수집한 후, 고전적인 밀도 구배 초원심분리 기술을 사용하여, 또는 칼럼 크로마토그래피 또는 기타 기술을 사용하여 정제할 수 있다.
패키징 기능은 바이러스 벡터 복제 및 패키징을 위한 유전자를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 패키징 기능은, 필요한 경우, 바이러스 유전자 발현, 바이러스 벡터 복제, 통합된 상태로부터의 바이러스 벡터의 구제, 바이러스 유전자 발현, 및 바이러스 벡터가 바이러스 입자 내로 패키징되는 것에 필수적인 기능을 포함할 수 있다. 패키징 기능들은 유전자 구축물 예컨대 플라스미드 또는 앰플리콘, 배큘로바이러스, 또는 HSV 헬퍼 구축물을 사용하여 패키징 세포에 함께 또는 개별적으로 공급될 수 있다. 패키징 기능은 패키징 세포 내에서 염색체외적으로 존재할 수 있지만, 세포의 염색체 DNA 내로 통합될 수도 있다. 예는 AAV Rep 및 Cap 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다. rep 및 cap 유전자는 패키징 세포에 동일한 바이러스 또는 비-바이러스 벡터의 일부분으로서 함께 제공될 수 있다. 예를 들어, rep 및 cap 서열이 하이브리드 아데노바이러스 벡터 (예를 들어, 결실된 아데노바이러스 벡터의 E1a 또는 E3 영역 내로 삽입됨) 또는 헤르페스바이러스 벡터, 예컨대 EBV 벡터에 의해 제공될 수 있다. 대안적으로, AAV rep 및 cap 유전자가 개별적으로 제공될 수 있다. 또한 rep 및 cap 유전자는 패키징 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합될 수 있거나, 또는 에피솜 상에 존재할 수 있다. 전형적으로, rep 및 cap 유전자는 이러한 서열들이 rAAV 벡터 입자 내로 패키징되는 것을 피하기 위해 ITR에 의해 플랭킹되지 않을 것이다.
헬퍼 기능은 바이러스 벡터의 패키징을 개시시키는데 요구되는 패키징 세포의 활성 감염을 확립하는데 필요한 헬퍼 바이러스 요소를 포함한다. 예는 바이러스 벡터의 패키징을 초래하는데 충분한 아데노바이러스, 배큘로바이러스 및/또는 헤르페스 바이러스로부터 유래된 기능을 포함한다. 예를 들어, 아데노바이러스 헬퍼 기능은 전형적으로 아데노바이러스 성분 E1a, E1b, E2a, E4, 및 VA RNA를 포함한다. 패키징 세포를 요구되는 바이러스로 감염시킴으로써 패키징 기능이 공급될 수 있다. 대안적으로, 감염성 바이러스의 사용을 피할 수 있고, 이에 의해 비-바이러스 벡터 예컨대 플라스미드 또는 앰플리콘을 사용하여 패키지 기능들이 패키징 세포에 함께 또는 개별적으로 공급될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Rabinowitz et al., 2002, J. Virol. 76:791]에 기술된 바와 같은 pXR 헬퍼 플라스미드, 및 문헌 [Grimm et al., 1998, Human Gene Therapy 9:2745-2760]에 기술된 pDG 플라스미드를 참조한다. 패키징 기능은 패키징 세포 내에서 염색체외적으로 존재할 수 있지만, 세포의 염색체 DNA 내로 통합될 수도 있다 (예를 들어, HEK 293 세포에서의 E1 또는 E3).
전기천공, 인산칼슘 침전, 미세주입, 양이온성 또는 음이온성 리포솜, 및 핵 국소화 신호와 조합된 리포솜을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 헬퍼 기능을 보유하는 뉴클레오티드 서열을 복제 및 패키징을 위한 세포성 숙주 내로 도입하는 임의의 방법을 사용할 수 있다. 바이러스 벡터를 사용하는 형질감염 또는 헬퍼 바이러스를 사용하는 감염에 의해 헬퍼 기능이 제공되는 실시양태에서, 바이러스 감염을 일으키는 표준 방법을 사용할 수 있다.
관련 분야에 공지된 임의의 적절한 허용성 또는 패키징 세포를 패키징된 바이러스 벡터의 생산에 이용할 수 있다. 포유동물 세포 또는 곤충 세포가 바람직하다. 본 발명의 실행에서 패키징 세포의 생산에 유용한 세포의 예는, 예를 들어, 인간 세포주, 예컨대 VERO, WI38, MRC5, A549, HEK 293 세포 (구성적 프로모터의 제어 하에 기능성 아데노바이러스 E1을 발현함), B-50 또는 임의의 기타 HeLa 세포, HepG2, Saos-2, HuH7, 및 HT1080 세포주를 포함한다. 한 측면에서, 패키징 세포는 현탁 배양에서, 특히 무혈청 성장 배지에서 성장할 수 있다. 한 실시양태에서, 패키징 세포는 무혈청 배지에서 현탁되어 성장하는 HEK293이다. 또 다른 실시양태에서, 패키징 세포는 미국 특허 번호 9,441,206에 기술되고 ATCC 번호 PTA 13274로서 기탁된 HEK293 세포이다. WO 2002/46359에 개시된 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 rAAV 입자 패키징 세포주가 관련 분야에 공지되어 있다.
패키징 세포로서 사용하기 위한 세포주는 곤충 세포주를 포함하고, 특히 배큘로바이러스 벡터가 본원에 기술된 바와 같이 rAAV 입자 생산에 요구되는 유전자를 도입하는데 사용되는 경우에 그러하다. AAV의 복제를 허용하고 배양에서 유지될 수 있는 임의의 곤충 세포가 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다. 예는 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda), 예컨대 Sf9 또는 Sf21 세포주, 드로소필라(Drosophila) 종 세포주, 또는 모기 세포주, 예를 들어, 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus)-유래 세포주를 포함한다.
본 개시내용의 AAV 벡터 입자를 생산 및 정제한 후, 이를 근육 디스트로피에 걸린 대상체, 예컨대 인간 대상체에 투여하기 위한 조성물을 제조하기 위해 적정할 수 있다. 관련 분야에 공지된 방법을 사용하여 AAV 벡터 적정을 달성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 벡터 게놈 내의 서열, 예를 들어, 존재하는 경우의 AAV2 ITR 서열, 또는 벡터 게놈 내의 기타 서열에 대한 프라이머를 사용하는 정량적 PCR (qPCR)을 사용하여 AAV 벡터 입자를 적정할 수 있다. 공지된 농도의 표준물질, 예컨대 벡터 게놈의 서열을 함유하는 플라스미드의 희석물 상에서 qPCR을 병행하여 수행함으로써, AAV 벡터의 농도가 단위 부피, 예컨대 마이크로리터 또는 밀리리터 당 벡터 게놈 (vg)의 개수로서 계산되도록 허용하는 표준 곡선을 생성시킬 수 있다. 대안적으로, 게놈을 함유하는 AAV 벡터 입자의 개수를 벡터 게놈에 대한 적절한 프로브를 사용하는 도트 블롯(dot blot)을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 기술들은 문헌 [Gray, SJ, et al., Production of recombinant adeno-associated viral vectors and use in in vitro and in vivo administration, Curr Protoc Neurosci (2011)] 및 [Werling NJ, et al., Gene Ther Meth 26:82-92 (2015)]에 추가로 기술되어 있다. 모액 내의 AAV 벡터 게놈의 농도가 결정되었으면, 이를 대상체에게 투여하기 위한 조성물을 제조하는데 사용하기 위해 적절한 완충제 내로 희석하거나 또는 적절한 완충제에 대해 투석할 수 있다.
치료 방법
본 개시내용은 디스트로핀병증 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효 용량 또는 유효량의 본 개시내용의 AAV 벡터, 예컨대, 비제한적으로, AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA로 공지된 벡터를 투여하는 것에 의해 디스트로핀병증을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 디스트로핀병증은 뒤시엔느 근육 디스트로피 (DMD), 베커 근육 디스트로피 (BMD), DMD-연관 확장 심근병증 (DCM), 및 여성에서의 증상 보인자 상태를 비제한적으로 포함하는 근육 디스트로피이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 근육 디스트로피 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효 용량 또는 유효량의 본 개시내용의 AAV 벡터, 예컨대, 비제한적으로, AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA로 공지된 벡터를 투여하는 것에 의해 근육 디스트로피를 치료하는 방법을 제공한다. 관련된 실시양태에서, 본 개시내용은 뒤시엔느 근육 디스트로피 (DMD), 베커 근육 디스트로피 (BMD), DMD-연관 확장 심근병증 (DCM), 및 여성에서의 증상 보인자 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법을 제공한다.
본원에 개시된 치료 방법에서 사용하기 위한 의약의 제작에서의 본 개시내용의 AAV 벡터 또는 제약 조성물의 용도가 또한 제공된다. 추가적으로, 본원에 개시된 치료 방법에서 사용하기 위한 본 개시내용의 AAV 벡터 또는 제약 조성물이 제공된다.
디스트로핀병증, 예컨대 DMD에 걸린 대상체의 치료는 효과적인 것으로 간주되기 위해 치유를 초래할 필요가 없고, 여기서 치유는 질환 진행을 정지시키는 것, 또는 대상체의 근육 기능을 부분적으로 또는 완전하게 복구하는 것으로 정의된다. 그보다는, 본 개시내용의 AAV 벡터의 치료적 유효 용량 또는 유효량은 디스트로핀병증, 예컨대 DMD에 걸린 대상체의 증상을 감소 또는 호전시키거나, 이의 진행을 느리게 하거나, 또는 이러한 대상체의 삶의 질을 개선하는 역할을 하는 양이다. 특정한 비제한적 실시양태에 따르면, 디스트로핀병증에 걸린 대상체의 치료는 이의 이동성을 개선할 수 있고, 이의 보행 또는 다른 이동성 상실까지의 시간을 지연시킬 수 있으며, 중증 디스트로핀병증, 예컨대 DMD의 경우에는, 장애에 걸린 대상체의 삶을 연장시킬 수 있다.
본 개시내용의 치료 방법은 디스트로핀병증, 예컨대 DMD에 걸린 남성 또는 여성 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. 여성의 경우, 치료는 증상 보인자, 또는 질환이 완연한 희귀한 여성 대상체에게 제공될 수 있다. 또한 본 개시내용의 방법은 1세 미만, 또는 약 또는 적어도 1세, 또는 약 또는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30세 이상인 대상체를 포함하여, 디스트로핀병증에 걸린 임의 나이의 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. 치료될 때, 대상체는 보행성 또는 비-보행성일 수 있다.
본 개시내용의 치료 방법은 병변이 선천적 인간 디스트로핀 유전자의 기능의 감소 또는 상실을 초래하는 한, 기저를 이루는 유전적 병변 (예를 들어, 디스트로핀 유전자에서의 결실, 중복, 스플라이스 부위 변이체, 또는 논센스 돌연변이)과 관계 없이 디스트로핀병증에 걸린 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다.
본 개시내용의 특정 실시양태에서, 대상체를 치료적 유효 용량 또는 유효량의 AAV 미니-디스트로핀 벡터로 치료하는 것은 근육 디스트로피의 존재 또는 진행과 연관된 하나 이상의 바이오마커 중 하나의 조직 농도를 감소시킬 것이다.
특정 실시양태에 따르면, 바이오마커는 손상된 골격근 또는 심장 근육 세포로부터 혈액 (혈청 또는 혈장을 포함함) 내로 방출되는 특정 효소이다. 비제한적인 예는 크레아티닌 키나제 (CK), 트랜스아미나제 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST), 및 락트산 데히드로게나제 (LDH)를 포함하고, 이들의 평균 수준은 모두 DMD에 걸린 대상체에서 상승되는 것으로 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, 치료적 유효 용량 또는 유효량의 본 개시내용의 AAV 미니-디스트로핀 벡터는 DMD 환자의 혈액 내의 상승된 ALT 수준을 유사한 나이 및 성별의 건강한 대상체에서 전형적으로 발견되는 것보다 약 7-, 6-, 5-, 4-, 3-, 또는 2-배 더 큰 값 이내로 감소시키는데 효과적이다. 다른 실시양태에서, 치료적 유효 용량 또는 유효량의 본 개시내용의 AAV 미니-디스트로핀 벡터는 DMD 환자의 혈액 내의 상승된 AST 수준을 유사한 나이 및 성별의 건강한 대상체에서 전형적으로 발견되는 것보다 약 7-, 6-, 5-, 4-, 3-, 또는 2-배 더 큰 값 이내로 감소시키는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 치료적 유효 용량 또는 유효량의 본 개시내용의 AAV 미니-디스트로핀 벡터는 DMD 환자의 혈액 내의 상승된 LDH 수준을 유사한 나이 및 성별의 건강한 대상체에서 전형적으로 발견되는 것보다 약 7-, 6-, 5-, 4-, 3-, 또는 2-배 더 큰 값 이내로 감소시키는데 효과적이다. 일부 다른 실시양태에서, 치료적 유효 용량 또는 유효량의 본 개시내용의 AAV 미니-디스트로핀 벡터는 DMD 환자의 혈액 내의 상승된 총 CK 수준을 유사한 나이 및 성별의 건강한 대상체에서 전형적으로 발견되는 것보다 약 50-, 48-, 46-, 44-, 42-, 40-, 38-, 36-, 34-, 32-, 30-, 28-, 26-, 24-, 22-, 20-, 18-, 16-, 14-, 12-, 10-, 9-, 8-, 7-, 6-, 5-, 4-, 3-, 또는 2-배 더 큰 값 이내로 감소시키는데 효과적이다. 세포외 매트릭스의 분해 또는 리모델링과 연관된 효소인 매트릭스 메탈로프로테이나제-9 (MMP-9)가 DMD 환자의 혈액에서 상승된다는 것이 또한 밝혀졌다. 예를 들어, 문헌 [Nadaraja, VD, et al., Neuromusc. Disorders 21:569-578 (2011)]을 참조한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 치료적 유효 용량 또는 유효량의 본 개시내용의 AAV 미니-디스트로핀 벡터는 DMD 환자의 혈액 내의 상승된 총 MMP-9 수준을 유사한 나이 및 성별의 건강한 대상체에서 전형적으로 발견되는 것보다 약 15-, 14-, 13-, 12-, 11-, 10-, 9-, 8-, 7-, 6-, 5-, 4-, 3-, 또는 2-배 더 큰 값 이내로 감소시키는데 효과적이다.
다른 실시양태에서, 치료적 유효 용량 또는 유효량의 본 개시내용의 AAV 미니-디스트로핀 벡터는 상기 지시된 바와 같은 ALT, AST, LDH, CK 및 MMP-9의 수준을 단독으로 또는 이와 동일한 바이오마커 또는 다른 바이오마커 중 하나 이상과 조합하여 변경시키는데 효과적이다. 따라서, 예시적인 비제한적 실시양태에서, 치료적 유효 용량 또는 유효량의 본 개시내용의 AAV 미니-디스트로핀 벡터는 ALT 및 AST, ALT 및 LDH, AST 및 CK, 또는 AST 및 MMP-9 등을 감소시키는데 효과적이다.
본 개시내용의 일부 치료 방법에서, AAV 벡터의 유효 용량 또는 유효량은 6분 보행 테스트 (6MWT)에서 평균 대상체 수행을 개선시키는 양이다. 6MWT는 근육 디스트로피, 특히 DMD에 걸린 인간 대상체의 근육 기능 및 이동성의 재현가능하고 타당한 척도로서 확립되었다. 예를 들어, 문헌 [McDonald, CM, et al., Muscle Nerve 41(4):500-10 (2010)]; [Henricson, E, et al., PLOS Currents Musc Dys, 8 July 2013]; [McDonald, CM, et al., Muscle Nerve 48:343-56 (2013)]을 참조한다. 이러한 테스트에서, 대상체가 휴지에서 시작하여 6분 기간 동안 지속적으로 도움없이 걸을 수 있는 미터 단위의 거리가 기록된다. 이러한 거리는 6분 보행 거리 (6MWD)로 또한 공지되어 있다. 이러한 테스트의 일부 적용에서, 개별적인 대상체를 수일 기간에 걸쳐 1회를 초과하여 테스트할 수 있고, 결과를 평균할 수 있다. 이의 장점으로 인해, 6MWT는 보행성 DMD 환자를 수반하는 약물 시험에서 1차 임상 종점으로서 채택되었다. 예를 들어, 문헌 [Bushby, K, et al., Muscle Nerve 50:477-87 (2014)]; [Mendell, JR, et al., Ann Neurol 79:257-71 (2016)]; [Campbell, C, et al., Muscle Nerve 55(4):458-64 (2017)]을 참조한다. 일반적으로, 이러한 시험에서, 치료 효과가 존재하는지를 결정하기 위해 치료군 내의 각각의 대상체의 보행을 수개월 또는 수년의 기간에 걸쳐 6MWT를 사용하여 테스트한다.
본 개시내용의 치료 방법의 일부 실시양태에 따르면, 동일한 유형의 디스트로핀병증, 예컨대 DMD에 걸린 미처리 대조군 대상체의 평균 6MWT 수행과 비교하여 치료된 대상체, 예컨대 DMD에 걸린 대상체의 평균 6MWT 수행에 대한 본 개시내용의 AAV 벡터의 치료 효과를 비교함으로써 치료 효능이 통계적으로 결정된다. 이러한 대조군은 본 개시내용의 AAV 벡터의 치료 효능을 평가하는데 사용된 것과 동일한 연구에 포함되었을 수 있거나, 또는 DMD 또는 기타 디스트로핀병증의 진행의 자연사 연구로부터 뽑힌 유사한 대상체일 수 있다. 대조군은 나이가 매칭될 수 있거나 (또는, 예를 들어, 그리고 비제한적으로, 일부 역치 나이, 예컨대 6, 7, 8, 9, 또는 10세보다 더 어리거나 또는 더 나이든 대상체로 계층화될 수 있거나), 이전 코르티코스테로이드 치료의 상태 (즉, 이전 치료를 받음 또는 받지 않음, 또는 이전 치료 시간의 길이)에 대해 매칭될 수 있거나, 임의의 치료 (아마도 코르티코스테로이드 치료는 제외될 것이다) 전의 6MWT에서의 기준선 수행에 대해 매칭될 수 있거나 (또는, 예를 들어, 그리고 비제한적으로, 기준선 수행이 일부 역치, 예컨대 200 m, 250 m, 300 m, 350 m, 400 m, 450 m, 또는 500 m 미만 및 초과인 대상체로 계층화될 수 있거나), 또는 임상적으로 관련된 것으로 결정된 일부 다른 속성에 대해 매칭될 수 있다 .
본 개시내용의 치료 방법의 특정 실시양태에 따르면, 치료적 유효 용량 또는 유효량의 본 개시내용의 AAV 벡터는 벡터를 투여하고 나서 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 또는 36개월 후에 디스트로핀병증, 예컨대 DMD에 걸린 대상체의 평균 6MWD를 유사한 매칭되거나 계층화된 대조군에 비교하여 약 또는 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 미터 이상만큼 증가시키는데 효과적이다. 이러한 실시양태 중 일부에서, AAV 벡터는 AAV9 캡시드 및 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 인간 코돈-최적화 유전자를 포함하는 게놈, 예컨대 비제한적으로 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA로 지정된 벡터를 포함한다.
본 개시내용의 치료 방법의 특정 실시양태에 따르면, 치료적 유효 용량 또는 유효량의 본 개시내용의 AAV 벡터는 벡터를 투여하고 나서 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330, 360, 390, 420, 450, 480, 510, 540, 570, 600, 630, 660, 690 또는 720일 후에 디스트로핀병증, 예컨대 DMD에 걸린 대상체의 평균 6MWD를 유사한 매칭되거나 계층화된 대조군에 비교하여 약 또는 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 미터 이상 증가시키는데 효과적이다. 이러한 실시양태 중 일부에서, AAV 벡터는 AAV9 캡시드 및 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 인간 코돈-최적화 유전자를 포함하는 게놈, 예컨대 비제한적으로 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA로 지정된 벡터를 포함한다.
6MWT에 대한 대안으로서, 4-계단 오르기 테스트로 공지된 테스트인 대상체가 4개의 표준 크기의 계단을 오르는데 걸리는 시간의 감소로서 치료 효능이 표현될 수 있다. 이러한 테스트는 DMD 환자에서 코르티코스테로이드 치료의 유효성을 평가하는데 사용되었다. 문헌 [Griggs, RC, et al., Arch Neurol 48(4):383-8 (1991)]. 따라서, 본 개시내용의 치료 방법의 특정 실시양태에 따르면, 치료적 유효 용량 또는 유효량의 본 개시내용의 AAV 벡터는 벡터를 투여하고 나서 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 또는 36개월 후에 디스트로핀병증, 예컨대 DMD에 걸린 대상체가 4-계단 오르기 테스트를 수행하는데 걸리는 평균 시간을 유사한 매칭되거나 계층화된 대조군에 비교하여 약 또는 적어도 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3.0, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 또는 4.0초 이상만큼 감소시키는데 효과적이다. 이러한 실시양태 중 일부에서, AAV 벡터는 AAV9 캡시드 및 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 인간 코돈-최적화 유전자를 포함하는 게놈, 예컨대 비제한적으로 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA로 지정된 벡터를 포함한다.
본 개시내용의 치료 방법의 관련된 실시양태에서, 치료적 유효 용량 또는 유효량의 본 개시내용의 AAV 벡터는 벡터를 투여하고 나서 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330, 360, 390, 420, 450, 480, 510, 540, 570, 600, 630, 660, 690 또는 720일 후에 디스트로핀병증, 예컨대 DMD에 걸린 대상체가 4-계단 오르기 테스트를 수행하는데 걸리는 평균 시간을 유사한 매칭되거나 계층화된 대조군에 비교하여 약 또는 적어도 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3.0, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 또는 4.0초 이상만큼 감소시키는데 효과적이다. 이러한 실시양태 중 일부에서, AAV 벡터는 AAV9 캡시드 및 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 인간 코돈-최적화 유전자를 포함하는 게놈, 예컨대 비제한적으로 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA로 지정된 벡터를 포함한다.
치료 효능은 대조군에 비교하여 치료하고 나서 특정 시간 후에 보행 상실을 경험하는 대상체의 백분율의 경시적 감소로서 표현될 수도 있다. 보행 상실은 휠체어 사용에 지속적으로 의존하는 것의 시작으로서 정의된다. 따라서, 본 개시내용의 치료 방법의 다른 실시양태에 따르면, 치료적 유효 용량 또는 유효량의 본 개시내용의 AAV 벡터는 디스트로핀병증, 예컨대 DMD에 걸린 대상체에게 투여하고 나서 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 또는 36개월 후에 보행을 상실한 대상체의 평균 명수를 유사한 매칭되거나 계층화된 대조군에 비교하여 적어도 5％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％ 이상만큼 감소시킨다. 이러한 실시양태 중 일부에서, AAV 벡터는 AAV9 캡시드 및 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 인간 코돈-최적화 유전자를 포함하는 게놈, 예컨대 비제한적으로 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA로 지정된 벡터를 포함한다.
본 개시내용의 치료 방법의 일부 실시양태에서, 치료적 유효 용량 또는 유효량의 본 개시내용의 AAV 벡터는 디스트로핀병증, 예컨대 DMD에 걸린 대상체에서 하나 이상의 증상의 발병을 지연시키는데 효과적이다. 증상 발병 전의 진단을 DMD 유전자에서의 돌연변이에 대한 출생전, 주산기 또는 출생후 유전 검사를 통해 달성할 수 있다. 특정 실시양태에 따르면, 본 개시내용의 AAV 벡터로의 치료는 DMD의 하나 이상의 증상의 발병을 유사한 매칭되거나 계층화된 대조군에 비교하여 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 24, 25, 26, 28, 30, 32, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 45, 46, 48, 50, 52, 54, 55, 56, 28, 60, 62, 64, 65, 66, 68, 70, 72, 74, 75, 76, 78, 또는 80개월 이상만큼 지연시키는데 효과적이다. 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, DMD의 초기 증상은 보행 능력의 지연 (DMD에 걸리지 않은 아기의 평균 12-15개월에 비교하여, 약 18개월의 평균 나이까지 지연됨); 뛰어오르기, 달리기 또는 계단 오르기 곤란; 잘 넘어짐; 예를 들어, 바닥에서 일어날 때 가워스 수기(Gowers' maneuver)를 나타내는 것에 의해 증명되는, 근위근 약화; 거짓비대로 인한 장딴지 비대; 대상체가 발가락 및/또는 발바닥 앞쪽의 볼록한 부분으로 걷는 것에 기인하는 뒤뚱걸음; 배를 내밀고 어깨를 뒤로 당겨서 균형을 유지하려는 경향; 및 인지 손상, 예컨대 수용 언어, 표현 언어, 시각공간능, 미세 운동 기술, 주의력 및 기억 기능 감소를 비제한적으로 포함한다. 이러한 실시양태 중 일부에서, AAV 벡터는 AAV9 캡시드 및 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 인간 코돈-최적화 유전자를 포함하는 게놈, 예컨대 비제한적으로 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA로 지정된 벡터를 포함한다.
치료 효능은 미처리 대조군에 비교하여 제지방 근육 조직을 교체하는 지방 조직의 양의 증가를 경험하는 벡터 처리 대상체의 백분율의 경시적 감소로서 표현될 수도 있다. 일부 실시양태에서, 문헌 [Willcocks, RJ, et al., Multicenter prospective longitudinal study of magnetic resonance biomarkers in a large Duchenne muscular dystrophy cohort, Ann Neurol 79:535-47 (2016)]에 추가로 설명된 바와 같이, 지방증 증가를 향한 이러한 진행은 DMD 환자의 다리 근육의 MRI 분석을 사용하여 결정될 수 있고, 지방 분율 (FF)로서 표현될 수 있다. 관련된 실시양태에서, DMD 대상체를 본 개시내용의 AAV 벡터로 치료하는 것은 치료하고 나서 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 또는 36개월 후에 MRI에 의해 결정된 바와 같은 대상체의 하지에서의 평균 FF를 매칭되는 대조군에 비교하여 약 또는 적어도 5％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％ 이상만큼 감소시키는데 효과적이다. 이러한 실시양태 중 일부에서, AAV 벡터는 AAV9 캡시드 및 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 인간 코돈-최적화 유전자를 포함하는 게놈, 예컨대 비제한적으로 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA로 지정된 벡터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 AAV 벡터는 치료적 유효 용량 또는 유효량은 치료하고 나서 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 또는 36개월 후에 적어도 5％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％ 이상의 골격근 섬유가 미니-디스트로핀 단백질을 발현하는 것을 초래하는 양이다. 치료된 대상체로부터의 생검 근육의 절편을 미니-디스트로핀 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항-디스트로핀 항체로 면역표지함으로써 미니-디스트로핀 단백질 발현에 대해 양성인 근육 섬유의 백분율을 결정할 수 있다. 적절한 면역표지화 기술이 실시예에서 기술되고, 관련 분야의 통상의 기술자에게 친숙하다. 생검을 취할 수 있는 치료된 대상체의 예시적인 근육은 두갈래근, 세모근, 및 네갈래근을 포함하지만, 다른 근육 또한 생검될 수 있다. 이러한 실시양태 중 일부에서, AAV 벡터는 AAV9 캡시드 및 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 인간 코돈-최적화 유전자를 포함하는 게놈, 예컨대 비제한적으로 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA로 지정된 벡터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 디스트로핀병증, 예컨대 근육 디스트로피, 예컨대 DMD를 치료하기 위한 본 개시내용의 AAV 벡터의 용량 또는 양은 치료적으로 효과적인 것으로 결정되고, 동시에, 치료된 대상체에서 미니-디스트로핀 단백질에 대해 특이적인 세포성 (T 세포) 면역 반응을 야기하지 않거나, 또는 이러한 대상체 중 낮은 백분율에서만 이러한 반응을 야기한다. 미니-디스트로핀 단백질 아미노산 서열을 포함하는 중첩 펩티드 라이브러리에 대한 노출에 반응하여 감마 인터페론 (IFNγ)을 생산하는 대상체 혈액으로부터 단리된 말초혈 단핵 세포 (PBMC)을 검출하는 ELISPOT 검정법을 사용하여 미니-디스트로핀 단백질에 대한 T 세포 반응의 존재 또는 정도를 결정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 양성 IFNγ 반응에 대한 역치는 백만개의 테스트된 PBMC 당 50개를 초과하는 스폿-형성 세포로서 설정될 수 있다. 벡터 처리 대상체로부터 수득된 미니-디스트로핀 단백질을 발현하는 근육 또는 다른 조직의 생검 내의 T 세포 침윤물의 검출을 비제한적으로 포함하는, 미니-디스트로핀 단백질에 대한 T 세포 반응을 검출하는 다른 검정법을 사용하는 것이 또한 가능하다. 대상체는 인간 대상체 또는 동물 대상체, 예컨대 DMD의 동물 모델, 예컨대 mdx 마우스, mdx 래트, 또는 GRMD 개 모델일 수 있다. 다른 실시양태에서, 디스트로핀병증, 예컨대 근육 디스트로피, 예컨대 DMD를 치료하기 위한 본 개시내용의 AAV 벡터의 용량 또는 양은 치료적으로 효과적인 것으로 결정되고, 동시에, 형질도입된 세포에 의해 발현되는 캡시드, 벡터 게놈 (또는 이의 임의의 성분), 또는 미니-디스트로핀 단백질에 대한 염증 반응을 야기하지 않거나, 또는 이러한 대상체 중 낮은 백분율에서만 이러한 반응을 야기한다. 임의의 특정한 작동 이론에 제한되는 것을 원치 않으면서, AAV 벡터에 반응한 염증은 선천 면역 반응에 의해 야기될 수 있다. 벡터 처리 대상체의 근육 내의 염증은, 존재하는 경우, 자기 공명 영상화를 사용하여 검출할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [J Garcia, Skeletal Radiol 29:425-38 (2000)] 및 [Schulze, M, et al., Am J Radiol 192:1708-16 (2009)]을 참조한다. 대상체는 인간 대상체 또는 동물 대상체, 예컨대 DMD의 동물 모델, 예컨대 mdx 마우스, mdx 래트, 또는 GRMD 개 모델일 수 있다. 상기 기술된 실시양태 중 일부에서, 세포성 면역 반응 또는 염증의 존재 또는 부재는 처리하고 나서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 또는 36개월 후에, 또는 처리 후의 다른 시간에 결정된다. 관련된 실시양태에서, 미니-디스트로핀 단백질에 대한 세포성 면역 반응을 나타내는 대상체의 낮은 백분율은 벡터가 투여된 대상체의 약 0％, 1％, 2％, 3％, 4％, 5％, 6％, 7％, 8％, 9％, 10％, 11％, 12％, 13％, 14％, 15％, 16％, 17％, 18％, 19％ 또는 20％ 이하일 것이다. 이러한 실시양태 중 일부에서, AAV 벡터는 AAV9 캡시드 및 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 인간 코돈-최적화 유전자를 포함하는 게놈, 예컨대 비제한적으로 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA로 지정된 벡터를 포함한다.
관련된 실시양태에서, 디스트로핀병증, 예컨대 근육 디스트로피, 예컨대 DMD를 치료하기 위한 본 개시내용의 AAV 벡터의 용량 또는 양은 치료된 대상체에서 동반 면역 억제를 필요로 하지 않으면서 치료적으로 효과적이다. 따라서, 특정 실시양태에서, 디스트로핀병증, 예컨대 DMD에 걸린 대상체의 치료는 AAV 벡터로 치료하기 전, 치료하는 동안, 또는 치료한 후에 하나 이상의 면역-억제 약물 (현재의 표준 치료인 스테로이드 치료 제외)을 대상체에게 투여하는 것을 필요로 하지 않으면서 효과적이다. 예시적인 면역-억제 약물은 칼시뉴린 억제제, 예컨대 타크롤리무스 및 시클로스포린, 항증식제, 예컨대 미소페놀레이트, 레플루노미드, 및 아자티오프린, 또는 mTOR 억제제, 예컨대 시롤리무스 및 에베롤리무스를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
실시예에서 더욱 상세하게 탐구된 바와 같이, AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA로 지정된 벡터를 비제한적으로 포함하는 본 개시내용의 AAV 벡터의 효능을 뒤시엔느 근육 디스트로피의 동물 모델에서 테스트할 수 있고, 결과를 사용하여 인간 DMD 환자에서의 이러한 벡터의 효과적인 용량을 예측할 수 있다. mdx 마우스 모델, 골든 리트리버 근육 디스트로피 모델, 및 실시예에서 더욱 상세하게 설명된 더욱 최근의 Dmd mdx 래트 모델을 포함하여, 다양한 동물 모델이 관련 분야에 공지되어 있다.
Dmd mdx 래트 모델을 기초로, AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA로 지정된 벡터를 포함하는 본 개시내용의 AAV 벡터의 유효 용량을 래트에서의 질환 경과의 다양한 생물학적 파라미터 및 측면과 관련하여 확립할 수 있다.
따라서, 본 개시내용의 특정 실시양태에 따르면, Dmd mdx 래트를 적어도 1×1014 vg/kg 또는 3×1014 vg/kg의 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA로 처리하는 것은 대조군에 비교하여 주사 3개월 또는 6개월 후에 혈청 AST, ALT, LDH, 또는 총 크레아틴 키나제 수준을 감소시키는데 효과적이다.
다른 실시양태에서, Dmd mdx 래트를 적어도 1×1014 vg/kg 또는 3×1014 vg/kg의 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA로 처리하는 것은 대조군에 비교하여 주사 3개월 또는 6개월 후에 넙다리두갈래근, 횡경막, 또는 심장 근육에서 섬유증을 감소시키는데 효과적이다.
다른 실시양태에서, Dmd mdx 래트를 적어도 1×1014 vg/kg 또는 3×1014 vg/kg의 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA로 처리하는 것은 대조군에 비교하여 주사 3개월 또는 6개월 후에 앞다리 악력을 증가시키는데 효과적이다.
다른 실시양태에 따르면, Dmd mdx 래트를 적어도 1×1014 vg/kg 또는 3×1014 vg/kg의 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA로 처리하는 것은 대조군에 비교하여 주사 3개월 또는 6개월 후에 앞다리 악력을 테스트하는 5회의 가까운 간격의 시험에 걸쳐 측정된 바와 같이 근육 피로를 감소시키는데 효과적이다.
일부 다른 실시양태에서, Dmd mdx 래트를 적어도 1×1014 vg/kg 또는 3×1014 vg/kg의 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA로 처리하는 것은 대조군에 비교하여 주사 6개월 후에 심장초음파검사를 사용하여 측정된 바와 같이 좌심실 박출률을 증가시키는데 효과적이다.
다른 실시양태에서, Dmd mdx 래트를 적어도 1×1014 vg/kg 또는 3×1014 vg/kg의 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA로 처리하는 것은 대조군에 비교하여 주사 3개월 또는 6개월 후에 심장초음파검사를 사용하여 측정된 바와 같이 초기 대 후기 좌심실 충만 속도의 비 (즉, E/A 비)를 증가시키는데 효과적이다.
일부 실시양태에 따르면, Dmd mdx 래트를 적어도 1×1014 vg/kg 또는 3×1014 vg/kg의 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA로 처리하는 것은 대조군에 비교하여 주사 3개월 또는 6개월 후에 심장초음파검사를 사용하여 측정된 바와 같이 등용적 이완 시간 (IVRT) 또는 피크 E 속도와 이의 기준선으로의 복귀 사이의 밀리세컨드 단위의 시간 (즉, E파 감속 시간 (DT))을 감소시키는데 효과적이다.
각각의 상기 실시양태에서, 대조군 동물에 비교된 벡터-처리 동물에서의 생리학적 측정치의 증가 또는 감소를, 일부 실시양태에서, 통계적 유의성에 대해 테스트할 수 있다. 어떤 통계 테스트를 적용할지의 선택은 관련 분야의 통상의 기술자의 지식 내에 속한다. p-값이 통계적 유의성을 평가하기 위한 방식으로 채택된 경우, 이러한 p-값이, 일단 계산되었으면, 미리 정해진 유의성 수준에 비교될 수 있고, p-값이 유의성 수준보다 작으면, 치료 효과가 통계적으로 유의한 것으로 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유의성 수준은 0.25, 0.20, 0.15, 0.10, 0.05, 0.04, 0.03, 0.02, 0.01, 0.005, 또는 기타 유의성 수준으로 미리 정의될 수 있다. 따라서, 예시적인 비제한적 실시양태에서, 유의성 수준이 0.05로 미리 정의되면, p-값 < 0.05의 계산이 벡터 처리군과 대조군 사이의 통계적으로 유의한 차이를 나타내는 것으로 해석될 것이다.
각각의 상기 실시양태에서, 대조군은 미처리되었거나 또는 비히클로만 처리되고 벡터로는 처리되지 않은, 동일한 성별 및 유전적 배경의 나이가 매칭되는 동물일 수있다. 그러나, 다른 대조군 또한 가능하다.
일부 다른 실시양태에서, Dmd mdx 래트를 적어도 3×1014 vg/kg의 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA로 처리하는 것은 주사 3개월 또는 6개월 후까지 넙다리두갈래근, 횡경막, 심장 근육, 또는 기타 가로무늬근에 형질도입하는데, 그리고 미니-디스트로핀 단백질에 대한 세포성 면역 반응을 유도하지 않으면서 opti-Dys3978 유전자가 코딩하는 미니-디스트로핀 단백질을 발현시키는데 효과적이다. 비장세포, 또는 혈액 림프구, 예컨대 말초혈 단핵 세포 (PBMC)를 테스트 동물로부터 단리하고, 세포를 미니-디스트로핀 단백질 아미노산 서열을 포함하는 중첩 펩티드 라이브러리로부터의 펩티드 (예를 들어, 각각 아미노산 10개만큼 중첩되는 아미노산 15개 길이의 펩티드)와 함께 풀(pool) (예를 들어, 5개의 풀)로 인큐베이션하고, 세포가 펩티드에 노출되는 것에 반응하여 감마 인터페론 (IFNγ)을 생산하는지 여부를 결정함으로써 미니-디스트로핀 단백질에 대한 세포성 면역 반응을 평가할 수 있다. 관련 분야의 통상의 기술자의 지식에 따라 ELISPOT 검정법을 사용하여 IFNγ 생산을 결정할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Smith, JG, et al., Clin Vaccine Immunol 8(5):871-9 (2001)], [Schmittel A, et al., J Immunol Methods 247:17-24 (2001)], 및 [Marino, AT, et al., Measuring immune responses to recombinant AAV gene transfer, Ch. 11, pp. 259-72, Adeno-Associated Virus Methods and Protocols, Ed. RO Snyder and P Moullier, Humana Press (2011)]을 참조한다. 특정 실시양태에서, 양성 IFNγ 반응에 대한 역치는 백만개의 테스트된 세포 당 50개를 초과하는 스폿-형성 세포로서 설정될 수 있거나, 또는 다른 실시양태에서는 음성 대조군 (예를 들어, 펩티드가 첨가되지 않은 배지 단독)을 사용하여 검출된 스폿-형성 세포의 개수의 적어도 3-배로서 설정될 수 있고, 따라서 음성 반응은 이러한 역치 미만인 것으로 간주될 것이다.
본 개시내용의 치료 방법의 일부 실시양태에서, 디스트로핀병증, 예컨대 DMD를 치료하기 위한 AAV 벡터는 디스트로핀병증, 예컨대 DMD를 치료하는데 효과적인 것으로 확립되었거나 여겨지는 적어도 제2의 작용제와 공동으로 디스트로핀병증, 예컨대 DMD 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. AAV 벡터의 공동 투여는 제2 작용제 치료 이전에, 제2 작용제 치료와 동시에, 또는 제2 작용제 치료 후에 대상체를 치료하는 것을 의미한다. 특정 실시양태에 따르면, AAV 벡터는 DMD 유전자, 예를 들어 디스트로핀 유전자의 엑손 51, 또는 디스트로핀 유전자의 일부 다른 엑손의 엑손 건너뛰기를 야기하는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 공동으로 투여된다. 디스트로핀 유전자의 엑손 51의 건너뛰기를 야기하는 작용제는 드리사페르센 및 에테플러센을 포함하지만, 다른 것들도 가능하다. 다른 실시양태에서, AAV 벡터는 대상체에서 미오스타틴 기능을 저해하는 작용제, 예컨대 항-미오스타틴 항체와 공동으로 투여되고, 이의 예는 미국 특허 번호 7,888,486, 8,992,913, 및 8,415,459에서 제공된다. 다른 실시양태에서, 대상체의 디스트로핀병증이 디스트로핀 유전자에서의 논센스 돌연변이에 기인할 수 있는 경우, AAV 벡터는 논센스 돌연변이의 리보솜 리드-쓰루를 촉진하는 작용제, 예컨대 아탈루렌, 또는 조기 정지 코돈을 억제하는 작용제, 예컨대 아미노글리코시드, 예컨대 젠타마이신과 공동으로 투여된다. 다른 실시양태에서, AAV 벡터는 동화성 스테로이드, 예컨대 옥산드롤론과 공동으로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, AAV 벡터는 코르티코스테로이드, 예컨대 비제한적으로 프레드니손, 데플라자코르트, 또는 프레드니솔론과 공동으로 투여된다. 이러한 방법의 일부 실시양태에서, AAV 벡터는 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 인간 코돈-최적화 유전자를 포함하는 게놈을 포함하는 AAV9 벡터, 예컨대 비제한적으로 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA로 지정된 벡터이다.
제약 제형 및 투여 방식
본 발명에 따른 바이러스 벡터 및 캡시드는 수의학 및 인간 의학 용도 양쪽 모두에서 용도가 확인된다. 적절한 대상체는 조류 및 포유동물 양쪽 모두를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "조류"는 닭, 오리, 거위, 메추라기, 칠면조, 꿩, 앵무새, 잉꼬 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "포유동물"은 인간, 비-인간 영장류, 소, 양, 염소, 말, 고양이, 개, 토끼목 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 인간 대상체는 신생아, 영아, 청소년 및 성인을 포함한다. 임의적으로, 예를 들어, 대상체가 본원에 기술된 장애 또는 본원에 기술된 것들을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 전달이 이로울 장애를 포함하는 장애에 걸렸거나 또는 이러한 장애의 위험에 처한 것으로 여겨지기 때문에, 대상체는 본 발명의 방법을 "필요로 한다". 추가 옵션으로서, 대상체는 실험실 동물 및/또는 질환의 동물 모델일 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 제약상 허용되는 담체 내의 본 발명의 바이러스 벡터 (예컨대 rAAV 입자) 및/또는 캡시드를 포함하고, 임의적으로, 다른 의약품, 약제, 안정화제, 완충제, 담체, 아주반트, 희석제 등을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 주사의 경우, 담체는 전형적으로 액체일 것이다. 다른 투여 방법의 경우, 담체는 고체 또는 액체일 수 있다. 흡입 투여의 경우, 담체는 호흡성일 것이고, 임의적으로는 고체 또는 액체 입상물질 형태일 수 있다.
"제약상 허용되는"은 독성이거나 다른 방식으로 바람직하지 않은 물질을 의미하고, 즉, 이러한 물질은 어떠한 바람직하지 않은 생물학적 효과도 야기하지 않으면서 대상체에게 투여될 수 있다.
본 발명의 한 측면은 미니-디스트로핀을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 시험관 내에서 세포에 전달하는 방법이다. 특정 표적 세포에 적절한 표준 형질도입 방법에 따라 바이러스 벡터가 적합한 감염 다중도로 세포 내로 도입될 수 있다. 투여되는 바이러스 벡터의 역가는 표적 세포 유형 및 개수, 및 특정 바이러스 벡터에 따라 변할 수 있고, 과도한 실험 없이 관련 분야의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 대표적인 실시양태에서, 적어도 약 103개의 감염 단위, 더욱 바람직하게는 적어도 약 105개의 감염 단위가 세포에 도입된다.
바이러스 벡터가 도입되는 세포(들)는 근육 세포 (예를 들어, 골격근 세포, 심장 근육 세포, 평활근 세포 및/또는 횡경막 근육 세포), 줄기세포, 생식 세포 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의 유형의 것일 수 있다. 대표적인 실시양태에서, 세포는 임의의 전구체 세포일 수 있다. 추가적인 가능성으로, 세포는 줄기 세포 (예를 들어, 근육 줄기 세포)일 수 있다. 또한, 세포는 상기 지시된 바와 같이 임의의 기원 종으로부터의 것일 수 있다.
변형된 세포를 대상체에게 투여하기 위한 목적으로 시험관 내에서 세포 내로 바이러스 벡터를 도입할 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포는 대상체로부터 제거되었고, 바이러스 벡터를 그 안에 도입한 후, 세포를 다시 대상체 내로 투여한다. 생체 외에서의 조작을 위해 대상체로부터 세포를 제거한 후 다시 대상체 내로 도입하는 방법이 관련 분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,399,346을 참조한다). 대안적으로, 재조합 바이러스 벡터를 도너 대상체로부터의 세포 내로, 배양된 세포 내로 또는 임의의 다른 적절한 공급원으로부터의 세포 내로 도입할 수 있고, 이러한 세포를 이를 필요로 하는 대상체 (즉, "수용자" 대상체)에 투여한다.
생체외 유전자 전달을 위한 적절한 세포는 상기 기술된 바와 같다. 대상체에게 투여할 세포의 투여량은 대상체의 나이, 상태 및 종, 세포의 유형, 세포가 발현하는 핵산, 투여 방식 등에 따라 다를 것이다. 전형적으로, 용량 당 적어도 약 102 내지 약 108개의 세포 또는 적어도 약 103 내지 약 106개의 세포가 제약상 허용되는 담체 내에서 투여될 것이다. 특정 실시양태에서, 바이러스 벡터가 형질도입된 세포는 제약 담체와 조합되어 치료 유효량 또는 예방 유효량으로 대상체에게 투여된다.
본 발명의 추가 측면은 바이러스 벡터를 대상체에게 투여하는 방법이다. 본 발명에 따른 바이러스 벡터 및/또는 캡시드를 이를 필요로 하는 인간 대상체 또는 동물에게 투여하는 것은 관련 분야에 공지된 임의의 수단에 의해서 행해질 수 있다. 임의적으로, 바이러스 벡터 및/또는 캡시드는 제약상 허용되는 담체 내에서 치료 유효 용량 또는 예방 유효 용량으로 전달된다.
대상체에게 투여될 바이러스 벡터 및/또는 캡시드의 투여량은 투여 방식, 치료 및/또는 예방될 질환 또는 병태, 개별적인 대상체의 상태, 특정 바이러스 벡터 또는 캡시드, 및 전달될 핵산 등에 의존적이고, 일상적인 방식으로 결정될 수 있다. 치료 효과를 달성하기 위한 예시적인 용량은 적어도 약 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015개의 형질도입 단위, 임의적으로는 약 108 - 1013개의 형질도입 단위의 역가이다.
특정 실시양태에서, 1회를 초과하는 투여 (예를 들어, 2회, 3회, 4회 이상의 투여)가 다양한 간격의 기간에 걸쳐, 예를 들어, 매일, 매주, 매월, 매년 등으로 원하는 수준의 유전자 발현을 달성하는데 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 AAV 벡터 또는 입자는 동일하거나 상이한 혈청형의 빈 AAV 캡시드를 포함하는 조성물 내에서 대상체에 투여될 수 있다. 빈 캡시드는 전형적인 배열 및 비의 VP1, VP2 및 VP3 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 캡시드이지만, 벡터 게놈을 함유하지 않는다. 임의의 특정한 작동 이론에 제한되는 것을 원치 않으면서, 빈 캡시드의 존재가 AAV 벡터의 캡시드에 대한 면역 반응을 감소시킴으로써 형질도입 효율을 증가시킬 수 있는 것으로 가정된다. 빈 캡시드는 AAV 벡터의 제제에서 천연적으로 발생할 수 있거나, 또는 공지된 비의 빈 캡시드 대 AAV 벡터 (즉, 벡터 게놈을 함유하는 캡시드)의 비를 달성하기 위해 공지된 양으로 첨가될 수 있다. 빈 캡시드의 제조, 정제 및 정량은 관련 분야의 통상의 기술자의 지식 내에 속한다. 본 개시내용의 AAV 벡터 및 빈 캡시드를 포함하는 조성물은 AAV 벡터에 비교하여 과량의 빈 캡시드로, 또는 빈 캡시드에 비교하여 과량의 게놈 함유 AAV 벡터로 제형될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 본 개시내용의 AAV 벡터 및 동일하거나 상이한 혈청형의 빈 캡시드를 포함하고, 여기서 빈 캡시드 대 AAV 벡터의 비는 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10 대 1, 또는 기타 비이다.
다른 실시양태에서, 본 개시내용은 대상체 체중 (kg) 당 벡터 게놈 (vg)으로 정량되고, vg/kg로 약기되는, 디스트로핀병증, 예컨대 근육 디스트로피, 예컨대 DMD를 치료하기 위한 AAV 벡터 입자의 예시적인 유효 용량을 제공한다. 특정 실시양태에 따르면, AAV9 캡시드 및 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 인간 코돈-최적화 유전자를 포함하는 게놈을 포함하는 것, 예컨대 비제한적으로 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA로 지정된 벡터를 포함하는 본 개시내용의 AAV 벡터의 유효 용량은 약 1×1012 vg/kg, 2×1012 vg/kg, 3×1012 vg/kg, 4×1012 vg/kg, 5×1012 vg/kg, 6×1012 vg/kg, 7×1012 vg/kg, 8×1012 vg/kg, 9×1012 vg/kg, 1×1013 vg/kg, 2×1013 vg/kg, 3×1013 vg/kg, 4×1013 vg/kg, 5×1013 vg/kg, 6×1013 vg/kg, 7×1013 vg/kg, 8×1013 vg/kg, 9×1013 vg/kg, 1×1014 vg/kg, 1.5×1014 vg/kg, 2×1014 vg/kg, 2.5×1014 vg/kg, 3×1014 vg/kg, 3.5×1014 vg/kg, 4×1014 vg/kg, 5×1014 vg/kg, 6×1014 vg/kg, 7×1014 vg/kg, 8×1014 vg/kg, 또는 9×1014 vg/kg, 또는 기타 용량이다. 이러한 실시양태 중 임의의 것에서, AAV 벡터는 제약상 허용되는 조성물에서 단독으로 또는 약 0.5:1, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 또는 기타 비의 빈 캡시드 대 벡터 비로 동일한 캡시드 혈청형의 빈 캡시드와 함께 대상체에게 투여될 수 있다.
예시적인 투여 방식은 경구, 직장, 경점막, 비강내, 흡입 (예를 들어, 에어로졸을 통한 흡입), 구강 (예를 들어, 설하), 질, 수막강내, 안내, 경피, 내피내, 자궁내 (또는 난자내), 비경구 (예를 들어, 정맥내, 피하, 피내, 두개내, 근육내 (골격근, 횡경막 근육 및/또는 심장 근육으로의 투여를 포함함), 흉막내, 뇌내, 및 관절내), 국소 (예를 들어, 기도 표면을 포함하는 피부 및 점막 표면 양쪽 모두로의 투여, 및 경피 투여), 림프내 등, 뿐만 아니라 직접적인 조직 또는 기관 주사 (예를 들어, 골격근, 심장 근육, 또는 횡경막 근육으로의 주사)를 포함한다.
투여는 골격근, 평활근, 심장, 및 횡경막으로 이루어진 군으로부터 선택된 부위를 비제한적으로 포함하여 대상체 내의 임의의 부위로의 투여일 수 있다.
본 발명에 따른 골격근으로의 투여는 사지 (예를 들어, 위팔, 아래팔, 윗다리 및/또는 아랫다리), 등, 목, 머리 (예를 들어, 혀), 흉부, 복부, 골반/회음부, 및/또는 손발가락 내의 골격근으로의 투여를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 적절한 골격근은 새끼벌림근 (손), 새끼벌림근 (발), 엄지발가락벌림근, 5번중족골벌림근, 짧은엄지손가락벌림근, 긴엄지손가락벌림근, 짧은모음근, 엄지발가락모음근, 긴모음근, 큰모음근, 엄지손가락모음근, 팔꿈치근, 전사각근, 무릎관절근, 위팔두갈래근, 넙다리두갈래근, 위팔근, 위팔노근, 협근, 부리위팔근, 눈썹주름근, 세모근, 입꼬리내림근, 아래입술내림근, 두힘살근, 등쪽뼈사이근 (손), 등쪽뼈사이근 (발), 짧은노쪽손목폄근, 긴노쪽손목폄근, 자쪽손목폄근, 새끼폄근, 손발가락폄근, 짧은손발가락폄근, 긴손발가락폄근, 짧은엄지발가락폄근, 긴엄지발가락폄근, 집게폄근, 짧은엄지손가락폄근, 긴엄지손가락폄근, 노쪽손목굽힘근, 자쪽손목굽힘근, 짧은새끼굽힘근 (손), 짧은새끼굽힘근 (발), 짧은손발가락굽힘근, 긴손발가락굽힘근, 깊은손발가락굽힘근, 얕은손발가락굽힘근, 짧은엄지발가락굽힘근, 긴엄지발가락굽힘근, 짧은엄지손가락굽힘근, 긴엄지손가락굽힘근, 전두근, 장딴지근, 턱끝목뿔근, 큰볼기근, 중간볼기근, 작은볼기근, 두덩정강근, 목엉덩갈비근, 허리엉덩갈비근, 등엉덩갈비근, 엉덩근, 아래쌍둥이근, 아래빗근, 아래곧은근, 가시아래근, 가시사이근, 가로돌기사이근, 가쪽날개근, 가쪽곧은근, 넓은등근, 입꼬리올림근, 윗입술올림근, 윗입술콧방울올림근, 눈꺼풀올림근, 어깨올림근, 긴돌림근, 머리가장긴근, 목가장긴근, 등가장긴근, 긴머리근, 긴목근, 벌레모양근 (손), 벌레모양근 (발), 깨물근, 안쪽날개근, 안쪽곧은근, 중간사각근, 뭇갈래근, 턱목뿔근, 아래머리빗근, 윗머리빗근, 바깥폐쇄근, 속폐쇄근, 후두근, 어깨목뿔근, 새끼맞섬근, 엄지손가락맞섬근, 눈둘레근, 입둘레근, 손바닥쪽뼈사이근, 짧은손바닥근, 긴손바닥근, 두덩근, 큰가슴근, 작은가슴근, 짧은종아리근, 긴종아리근, 셋째종아리근, 궁둥구멍근, 발바닥쪽뼈사이근, 장딴지빗근, 넓은목근, 오금근, 뒤목갈비근, 네모엎침근, 원엎침근, 큰허리근, 넙다리네모근, 발바닥네모근, 앞머리곧은근, 가쪽머리곧은근, 큰뒷머리곧은근, 작은뒷머리곧은근, 넙다리곧은근, 큰마름근, 작은마름근, 입꼬리당김근, 넙다리빗근, 최소목갈비근, 반막모양근, 머리반가시근, 목반가시근, 등반가시근, 반힘줄모양근, 앞톱니근, 짧은돌림근, 가자미근, 머리가시근, 목가시근, 등가시근, 머리널판근, 목널판근, 목빗근, 복장목뿔근, 복장방패근, 붓목뿔근, 빗장밑근, 어깨밑근, 위쌍둥이근, 위빗근, 위곧은근, 손뒤침근, 가시위근, 관자근, 넙다리근막긴장근, 큰원근, 작은원근, 흉부근, 방패목뿔근, 앞정강근, 뒤정강근, 등세모근, 위팔세갈래근, 중간넓은근, 가쪽넓은근, 안쪽넓은근, 큰광대근, 및 작은광대근, 및 관련 분야에 공지된 바와 같은 임의의 다른 적절한 골격근을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
바이러스 벡터는 정맥내 투여, 동맥내 투여, 복막내 투여, 사지 관류 (임의적으로는, 다리 및/또는 팔의 단리된 사지 관류; 예를 들어 문헌 [Arruda et al., (2005) Blood 105: 3458-3464]을 참조한다), 및/또는 직접적인 근육내 주사에 의해 골격근으로 전달될 수 있다. 특정 실시양태에서, 바이러스 벡터 및/또는 캡시드는 대상체 (예를 들어, 근육 디스트로피 예컨대 DMD에 걸린 대상체)의 사지 (팔 및/또는 다리)에 사지 관류, 임의적으로는 단리된 사지 관류에 의해 (예를 들어, 정맥내 또는 동맥내 투여에 의해) 투여된다. 본 발명의 실시양태에서, 본 발명의 바이러스 벡터 및/또는 캡시드는 유리하게는 "유체역학" 기술을 사용하지 않으면서 투여될 수 있다. 종래 기술 벡터의 조직 전달 (예를 들어, 근육으로의 전달)은 종종 유체역학 기술 (예를 들어, 대형 부피의 정맥내/정맥내 투여)에 의해 강화되는데, 이는 혈관구조 내의 압력을 증가시키고, 벡터가 내피 세포 장벽을 가로지르는 능력을 용이하게 한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 바이러스 벡터 및/또는 캡시드는 유체역학 기술 예컨대 대량 주입 및/또는 혈관내 압력 상승 (예를 들어, 정상 수축기압보다 높음, 예를 들어, 정상 수축기압에 비해 혈관내 압력의 5％, 10％, 15％, 20％, 25％ 이하의 증가)의 부재 하에 투여될 수 있다. 이러한 방법은 유체역학 기술과 연관된 부작용 예컨대 부종, 신경 손상 및/또는 구획 증후군을 감소시키거나 피할 수 있다.
심장 근육으로의 투여는 좌심방, 우심방, 좌심실, 우심실 및/또는 중격으로의 투여를 포함한다. 바이러스 벡터 및/또는 캡시드는 정맥내 투여, 동맥내 투여 예컨대 대동맥내 투여, 직접적인 심장 주사 (예를 들어, 좌심방, 우심방, 좌심실, 우심실 내로의 주사) 및/또는 관상 동맥 관류에 의해 심장 근육에 전달될 수 있다.
횡경막 근육으로의 투여는 정맥내 투여, 동맥내 투여, 및/또는 복막내 투여를 포함하는 임의의 적절한 방법에 의한 것일 수 있다.
평활근으로의 투여는 정맥내 투여, 동맥내 투여, 및/또는 복막내 투여를 포함하는 임의의 적절한 방법에 의한 것일 수 있다. 한 실시양태에서, 투여는 평활근 내, 근처 및/또는 상에 존재하는 내피 세포로의 투여일 수 있다.
표적 조직으로의 전달은 바이러스 벡터 및/또는 캡시드를 포함하는 저장소를 전달하는 것에 의해 달성될 수도 있다. 대표적인 실시양태에서, 바이러스 벡터 및/또는 캡시드를 포함하는 저장소가 골격근, 평활근, 심장 근육 및/또는 횡경막 근육 조직 내로 이식되거나, 또는 이러한 조직이 바이러스 벡터 및/또는 캡시드를 포함하는 필름 또는 기타 매트릭스와 접촉될 수 있다. 이러한 이식가능한 매트릭스 또는 기판이 미국 특허 번호 7,201,898에 기술되어 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 바이러스 벡터는 (예를 들어, 근육 디스트로피를 치료 및/또는 예방하기 위해) 골격근, 횡경막 근육 및/또는 심장 근육에 투여된다.
대표적인 실시양태에서, 본 발명은 골격근, 심장 근육 및/또는 횡경막 근육의 장애를 치료 및/또는 예방하는데 사용된다.
대표적인 실시양태에서, 본 발명은 치료 또는 예방 유효량의 본 발명의 바이러스 벡터를 포유동물 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 바이러스 벡터가 디스트로핀, 미니-디스트로핀, 또는 마이크로-디스트로핀을 코딩하는 이종 핵산을 포함하는, 근육 디스트로피의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같이 골격근, 횡경막 근육 및/또는 심장 근육에 투여될 수 있다.
주사가능물질은 액체 용액 또는 현탁액, 주사 전에 액체 내에 용해 또는 현탁시키는데 적절한 고체 형태, 또는 에멀션으로서 통상적인 형태로 제조될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 바이러스 벡터 및/또는 바이러스 캡시드를, 예를 들어, 저장소 또는 지속 방출 제형에서, 전신보다는 국소적인 방식으로 투여할 수 있다. 추가로, 바이러스 벡터 및/또는 바이러스 캡시드가 수술에 의해 이식할 수 있는 매트릭스에 부착되어 전달될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2004-0013645에 기술된 바와 같음).
본 발명이 기술되었지만, 하기 실시예에서 본 발명이 더욱 상세하게 설명될 것이고, 이는 설명의 목적을 위해서만 본원에 포함되고, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1
코돈-최적화된 인간 미니-디스트로핀 유전자의 합성
기존에, 본 발명가들은 인간 근육 디스트로핀 cDNA의 PCR 클로닝에 의해 인간 디스트로핀 유전자의 다수의 미니어처 버전을 생성시켜, 중앙의 로드 도메인에서의 큰 결실 및 디스트로핀 코딩 서열의 C-말단 영역의 거의 완전한 결실이 있는 미니-디스트로핀 유전자를 생성시켰다 (문헌 [Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 97:13714 (2000)]; 미국 특허 번호 7,001,761 및 7,510,867). 이러한 미니-디스트로핀 유전자들은 DMD mdx 마우스 모델에서 고도로 기능성인 것으로 테스트되었다 (Watchko et al., Human Gene Therapy 13:1451 (2002)). Δ3990으로 명명된, 이러한 미니-디스트로핀 단백질 중 하나가 미국 특허 번호 7,510,867에서 서열식별번호: 6 하에 기술되었다. Δ3990의 단백질 서열 및 이를 코딩하는 DNA가 본원에서 각각 서열식별번호: 27 및 서열식별번호: 28에 의해 제공된다.
Δ3990 미니-디스트로핀의 변형이 또한 디자인되었고, 코돈-최적화되었으며, 활성에 대해 테스트되었다. Dys3978로 칭해지는 이러한 새로운 인간 미니-디스트로핀은 아미노산 1325개의 길이이고, 야생형 전장 인간 근육 디스트로핀 (서열식별번호: 25)으로부터의 하기의 부분 또는 서브도메인을 포함한다: N-말단 및 액틴-결합 도메인 (ABD), 힌지 H1, 로드 R1 및 R2, 힌지 H3, 로드 R22, R23 및 R24, 힌지 H4, 시스테인-풍부 도메인 (CR 도메인), 및 카르복시-말단 도메인 (CT 도메인)의 일부분. 이러한 단백질의 아미노산 서열이 서열식별번호: 7에 의해 제공되고, 도 1에 개략적으로 도해된다. 잠재적인 면역원성을 감소시키기 위해, Δ3990 단백질의 C-말단의 마지막 4개의 아미노산이 결실되었다. Δ3990의 생성에서, 이러한 서열은 디스트로핀 카르복시-말단 도메인의 아미노-말단 끝부분의 일부분 (P3409에서 종결됨)을 디스트로핀의 마지막 3개의 아미노산 (3683-3685, 또는 DTM)과 연결시킴으로서 형성되었다. 아미노산 4개의 이러한 신장물은 공지된 기능이 없고, 새로운 에피토프로서 기능할 수 있는데, 이러한 서열이 야생형 디스트로핀에서는 발생하지 않기 때문이다. 추가적으로, 야생형 디스트로핀에는 존재하지 않지만 Δ3990의 출발 코돈 주변의 컨센서스 코작 개시 서열의 생성으로부터 초래된, Δ3990 내의 아미노산 위치 2의 발린이 디스트로핀 내에 일반적으로 존재하는 류신으로 변화되었다. 따라서, Δ3990과 Dys3978 사이에는 아미노산 5개의 차이가 있다. Δ3990과 Dys3978 사이의 아미노산 서열 정렬이 도 55a-55c에서 제공된다.
상기 기술된 단백질 서브도메인에 상응하는 야생형 디스트로핀 코딩 서열으로부터의 하위서열을 조합함으로써 Dys3978을 코딩하는 유전자가 구축되었다. 생성된 유전자가 서열식별번호: 26에 의해 제공된다. Dys3978의 발현을 증가시키기 위해, 인간 코돈 알고리듬을 사용하여 유전자 서열을 코돈-최적화하였다. Hopti-Dys3978로 칭해지는, 생성된 인간 코돈-최적화 유전자가 서열식별번호: 1로서 제공된다. Copti-Dys3978로 칭해지는, Dys3978을 코딩하는 개 코돈-최적화 유전자가 또한 생성되었고, 이의 서열이 서열식별번호: 3으로서 제공된다. Hopti-Dys3978의 DNA 서열과 Δ3990을 코딩하는 비-코돈-최적화 유전자를 비교하는 정렬이 도 56a-56i에서 제공된다.
여러 변화 중에서도 특히, Dys3978을 코딩하는 유전자의 코돈-최적화는 총 GC 함량을 비-코돈-최적화 유전자에서의 약 46％에서 인간 코돈-최적화 유전자 (즉, Hopti-Dys3978)에서의 약 61％로 증가시켰다. GC 함량 증가는 포유동물 세포에서 mRNA 수준 증가를 초래할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Grzegorz, K, et al., PLoS Biol, 4(6):e180 (2006)]; 및 [Newman, ZR, et al., PNAS, E1362-71 (2016)]을 참조한다. 코돈-최적화는 또한 코돈 적응 지수 (CAI)를 증가시켰고, 코딩 서열의 시작부에서의 코작 컨센서스 전사 개시 인식 부위의 부가를 포함하였다.
인간 코돈 최적화가 유전자 발현을 강화할 수 있는지를 검사하기 위해, Hopti-Dys3978 유전자를 구성적으로 활성인 CMV 프로모터 및 소형 합성 폴리아데닐화 (폴리A) 신호 서열 (서열식별번호: 6)을 함유하는 AAV 벡터 발현 카세트 내로 클로닝하였다. 디스트로핀 단백질에 대한 면역형광 염색 및 웨스턴 블롯을 사용하여 정량적으로 결정된 바와 같이 (도 2), 인간 HEK 293 세포 내로의 형질감염 후에, Hopti-Dys3978 유전자를 함유하는 벡터 플라스미드는 Dys3978을 코딩하는 비-최적화 유전자보다 놀랄만큼 더 큰 단백질 발현을 나타냈다.
힌지 H3이 부재하는 것을 제외하고는 Dys3978과 구조적으로 유사한 인간 미니-디스트로핀을 코딩하는 유전자가 또한 생성되었고, 코돈-최적화되었다. Hopti-Dys3837로 칭해지는 이러한 유전자 (서열식별번호: 2)는 Dys3837로 칭해지는 아미노산 1278개의 인간 미니-디스트로핀 단백질 (서열식별번호: 8)을 코딩하고, 이 또한 도 1에 개략적으로 도해된다.
본원에 기술된 다른 실험을 위해, 인간 및 개 코돈-최적화 Dys3978 유전자를 하기에서 확인되는 근육 크레아틴 키나제 유전자로부터 유래된 2가지 상이한 합성 근육-특이적 프로모터 및 인핸서 조합 중 하나의 제어 하에 놓았다:
1) 합성 하이브리드 근육-특이적 프로모터 (hCK) (서열식별번호: 4); 및
2) 합성 하이브리드 근육-특이적 프로모터 플러스 (hCKplus) (서열식별번호: 5);
실험에서 사용하기 위해, 하기의 벡터를 표준 분자 클로닝 기술을 사용하여 구축하였다. 특정 프로모터, 미니-디스트로핀 유전자 및 폴리A 서열의 유전자 발현 카세트를 발현 카세트에 플랭킹되는 AAV2 역전 말단 반복부 (ITR)를 함유하는 AAV 벡터 플라스미드 백본 내로 클로닝하였다.
1) AAV-CMV-Hopti-Dys3978
2) AAV-hCK-Hopti-Dys3978 (서열식별번호: 9)
3) AAV-hCK-Hopti-Dys3837 (서열식별번호: 10)
4) AAV-hCKplus-Hopti-Dys3837 (서열식별번호: 11)
5) AAV-hCK-Copti-Dys3978 (서열식별번호: 12)
실시예 2
디스트로핀/유트로핀 이중 녹아웃 마우스에서의 CMV-Hopti-Dys3978
뒤시엔느 근육 디스트로피 (DMD) 환자에서의 디스트로핀 상실은 파괴적인 골격근 변성 및 심근병증을 초래한다. 디스트로핀만 결여된 Mdx 마우스는 훨씬 더 경도의 표현형을 갖는 반면, 디스트로핀 및 이의 상동체인 유트로핀 양쪽 모두가 결여된 이중 녹아웃 (dKO) 마우스는 DMD 환자에서 보이는 것과 유사하게 중증인 디스트로피 임상 징후를 나타낸다. 신생 동종접합성 dKO 마우스에 3×1011 vg/마우스의 AAV1-CMV-Δ3990 (코돈-최적화되지 않음)를 복막내 주사하는 것이 부분적으로 성장, 기능을 복구하고 수개월 동안 수명 (22주의 50％ 생존율)을 연장할 수 있었음이 기존에 입증되었다 (문헌 [Wang et al., J. Orthop. Res, 27:421 (2009)]의 도 6b 참조). 여기에서, 인간 코돈-최적화 Hopti-Dys3978 유전자의 전신 전달의 치료 효과를 AAV9를 캡시드로 사용하여 평가하였다. 결과는 1주령 신생 dKO 마우스 내로의 약 2×1013 vg/kg의 AAV9-CMV-Hopti-Dys3978의 단일 전신 투여 (IP)가 골격근 및 전체 심장 근육에서의 미니-디스트로핀 유전자의 광범위한 발현에 이르렀음을 입증한다 (도 3). AAV9-처리 dKO 마우스는 거의 정상적인 성장 곡선 및 체중 (도 4) 및 악력 및 트레드밀 달리기 테스트에 의해 평가된 바와 같이 유의하게 개선된 근육 기능(도 5)을 나타냈다. 처리된 dKO 마우스는 디스트로피 병리학의 호전 (도 6a-6b) 및 전반적인 건강의 큰 개선을 또한 나타냈다. 비-코돈-최적화 Δ3990를 발현하는 AAV1 벡터로 처리된 dKO 마우스에 비교했을 때, Hopti-Dys3978 유전자로 처리된 dKO 마우스는 더 많이 연장된 수명 (50％ 생존율: 22 주 대 80주 초과)을 나타냈다 (도 7). 예상밖으로, 수컷 및 암컷 dKO 마우스 양쪽 모두의 생식능력이 복구되었고 (표 1), 이는 전반적인 기능 개선 및 가능하게는 평활근 기능에서의 개선을 또한 시사한다.
<표 1>
미니-디스트로핀이 dKO 마우스의 생식능력을 복구한다
육종 쌍:
쌍 #1: T-dKO 수컷 × T-dKO 암컷
5마리의 새끼
쌍 #2: T-dKO 수컷 × T-dKO 암컷
4마리의 새끼
쌍 #3: T-dKO 수컷 × T-dKO 암컷
0마리의 새끼
쌍 #4: mdx 수컷 × T-dKO 암컷
5마리의 새끼
쌍 #5: mdx 수컷 × T-dKO 암컷
6마리의 새끼
미처리 dKO 마우스는 완전히 불임이다. 그러나, 처리된 dKO (T-dKO) 마우스의 수컷 및 암컷 양쪽 모두에서 AAV-CMV-Hopti-Dys3978에 의해 생식능력이 복구되었다.
상기 기술된 결과는 코돈-최적화된 Hopti-Dys3978 유전자의 전신 전달이 비-코돈-최적화 Δ3990 유전자보다 더욱 효과적이었음을 입증한다.
중요하게, 심장 기능에서의 큰 개선이 또한 관찰되었다. 심장에서의 치료 효과를 밀라(Millar) 압력-부피 시스템을 사용하여 혈류역학 분석에 의해 4개월령에 평가하였다. 미처리 dKO 마우스는 4개월에 걸쳐 거의 생존하지 않았다. 매우 작은 체격, 척추후만증, 및 중증 근육 및 심장 기능장애가 dKO 마우스를 너무 아파서 혈류역학 분석 절차를 견디지 못하게 하였다. 따라서, AAV9-처리 dKO 마우스를 이러한 모델에서의 디스트로핀 결여에 대해 보상하는 것으로 공지되어 있는 무손상 유트로핀 유전자로 인해 표현형이 훨씬 더 가벼운 미처리 나이-매칭 mdx 마우스와 비교하였다. 심장초음파검사에 의한 측정에서 mdx 마우스는 C57/B10 야생형 마우스에 비교했을 때 기준선 조건 하에 명백한 심장 결손이 없는 것으로 나타났지만, 기준선에서 혈류역학에 의해 측정했을 때는 명백한 결손을 나타냈다 (도 8, 흰색 막대). 본원에서의 결과는 AAV9-처리 dKO 마우스가 수축기말 압력, 확장기말 부피, 등용적 수축의 최대 속도 (dp/dtmax) 및 등용적 이완의 최대 속도 (dp/dtmin)를 포함하여, mdx 마우스의 것과 유사한 기준선 심장 혈류역학을 나타냈음을 나타낸다. 그러나, 도부타민 챌린지 후, 처리된 dKO 마우스가 수축기말 압력, 확장기말 부피, 등용적 수축의 최대 속도 (dp/dtmax 및 dp/dtmin)를 포함하여 mdx 마우스의 것과 유사한 기준선 심장 혈류역학을 나타낸 반면, 검사된 모든 파라미터에서 AAV9-처리 dKO 마우스의 수행이 mdx 마우스보다 유의하게 더 양호하였다 (도 8, 빗금 막대). 추가로, 본 발명가들의 기존의 보고 (Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:14814 (2008))와 일관되게, 50％를 초과하는 mdx 마우스가 도부타민 챌린지 창에서 30분 이내에 사망하였다. 현저하게 대조적으로, AAV9-처리 dKO 마우스에서의 미니-디스트로핀 트랜스진의 심장 발현으로 인해, 도부타민-유도 심부전이 크게 예방되었다. 90％를 초과하는 AAV9-처리 dKO 마우스가 도부타민 스트레스 테스트에서 30분 창에서 생존하였다. 마지막으로, 심전도 (ECG)에서 나타내는 통상적으로 보이는 PR 간격 결손 또한 개선되었다 (도 9a-9b). PR 간격은 P파 개시부터 QRS 복합 시작까지의 시간이다. 총괄적으로, 이러한 결과들은 중증 DMD 마우스 모델에서의 심근병증에 대한 AAV9-CMV-Hopti-Dys3978 유전자 요법의 유효성을 입증한다.
실시예 3
mdx 마우스에서의 hCK-Hopti-Dys3978
하이브리드 합성 근육-특이적 프로모터 hCK가 Dys3978 유전자 발현을 효과적으로 구동시킬 수 있었는지를 검사하기 위해, 이를 강력한 비-특이적 CMV 프로모터에 의해 구동되는 동일한 구축물과 비교하였다. 각각의 벡터의 꼬리 정맥 주사 후의 mdx 마우스에서의 미니-디스트로핀 발현의 면역형광 염색은 2개의 프로모터, 즉, hCK 및 CMV가 근육 및 심장에서 등가의 발현 수준을 전달하였음을 나타냈다 (도 10).
실시예 4
DMD 개 모델인 골드 리트리버 근육 디스트로피 (GRMD) 개에서의 CMV-Hopti-Dys3978
mdx 마우스 및 디스트로핀/유트로핀 이중 KO (dKO) 마우스에서의 연구를 기초로, 동일한 벡터인 AAV9-CMV-Hopti-Dys3978을 대형 동물 DMD 모델인 골든 리트리버 근육 디스트로피 (GRMD) 개에서 테스트하였다. 구체적으로, 벡터를 2.5개월령 GRMD 개 "젤리"에 투여한 후, 주사 8년 초과 후 동안 추적하였다.
실험 절차: GRMD 개 "젤리" (2.5개월령 암컷; 6.3 kg; 혈청 CK: 처리 전 20262 유닛/L)에 오른쪽 뒷다리를 통해 AAV9-CMV-Hopti-Dys3978 벡터를 1×1013 vg/kg의 용량으로 주사하였다. 일반적인 마취 하에, 고무 지혈대를 몸쪽 골반 말단부 (사타구니 구역)에 놓아 오른쪽 뒷다리의 대부분의 근육을 덮었다. 주사 속도 1 ml/초로 설정된 하버드(Harvard) 펌프를 사용하여 AAV9 벡터를 대복재정맥을 통해 주사하였다. 벡터 부피는 20 ml/kg 체중 (총 130 ml)이었다. 주사 시작으로부터 계산하여 10분 후에 지혈대를 풀렀다. 촉진에 의해 나타난 바와 같이, 주사맞은 사지 내의 근육이 더 단단해졌다. 뒷다리의 MRI 영상을 주사 약 1시간 후에 수집하고, 주사맞은 사지 내의 벡터 유체를 확인하였다 (도 11). 8년을 초과하는 관찰 전반에 걸쳐 어떠한 시점에서도 면역억제제 예컨대 스테로이드가 사용되지 않았다. 벡터 주사 4년 후까지 5회의 시점에 근육 생검 절차를 수행하였다. 8년 4개월의 나이에 최종 부검을 행하였고, 이 시점에 "젤리"는 여전히 보행성이었지만, 전보다 훨씬 덜 활동적이었다.
결과: 면역형광 (IF) 염색은 최종 부검까지 검사된 대부분의 근육 샘플에서 장기적인 미니-디스트로핀 발현을 나타냈다. 흥미롭게, 주사맞은 사지가 초기에 (주사 2개월 후의 생검에서) 주사맞지 않은 사지보다 발현이 더 낮았고, 이는 절차-관련 염증 및 CMV 프로모터의 부분적인 불활성화를 시사한다 (도 12). 그러나, 주사맞은 사지에서의 초기 염증에도 불구하고 인간 미니-디스트로핀 발현이 "젤리"에서 8년 동안 지속되었다. 후속 시점 (벡터 주사 7개월, 1년, 2년, 및 4년 후)에서의 근육 생검 및 인간 미니-디스트로핀의 면역형광 염색 및 웨스턴 블롯은 지속적인 유전자 발현을 나타냈다 (도 13-17). 미니-디스트로핀-양성 근섬유의 백분율이 상이한 근육들 사이에서 다양했지만, 특정 근육은 90％ 초과의 근섬유가 부검 시 양성이였다 (도 18). 미니-디스트로핀 및 복귀변이체 근섬유 (항-C-말단 항체)의 공동-염색은 양쪽의 공존을 나타냈다 (도 19). 미니-디스트로핀은 약 20％의 심근세포에서 또한 관찰되었다 (도 18). 전체적인 유전자 발현이 대부분 안정적이었다. 예를 들어, 머리쪽넙다리빗근 내의 양성 근섬유가 2 및 7개월부터 1, 4 및 8년까지의 6회의 시점에 걸쳐 유사하게 유지되었다 (도 12, 13, 14, 17 및 18을 비교한다). 웨스턴 블롯에서 IF 염색 결과가 확증되었다 (도 20).
수축력 측정은 미처리 개에 비교했을 때 부분적인 개선을 나타냈다 (도 21). "젤리"는 처리 후 8년을 초과하는 관찰 기간 전반에 걸쳐 여전히 보행성이었고, 마지막해에 심근병증으로 인해 안락사되었다. 부검 및 병리학자의 검사 시 어떤 조직에서도 종양이 발견되지 않았다. DNA 시퀀싱은 "젤리"가 최근에 보고 (Vieira et al., Cell163:1204 (2015))된 바와 같은 2마리의 표현형적으로 경도인 GRMD 개에서 발견된 질환-변형 재기드(Jagged) 1 돌연변이를 보유하지 않았음을 나타냈다.
실시예 5
GRMD 개에서의 hCK-Copti-Dys3978
이러한 연구에서, AAV9-hCK-Copti-Dys3978 벡터 (변형된 크레아틴 키나제 프로모터가 개 코돈-최적화된 인간 미니-디스트로핀 3978을 구동시킴)를 "던킨"으로 명명된 GRMD 개에서 사용하였다. 이러한 유전자는 다른 연구에서 사용된 것과 동일한 인간 미니-디스트로핀 Dys3978 단백질을 코딩하지만, 개 코돈-최적화되었다. DNA 서열은 인간 코돈-최적화 유전자와 94％ 동일하다. CK-Copti-Dys3978 (개 코돈-최적화) 및 CK-Hopti-Dys3978 (인간 코돈-최적화)을 비교하는 인간 HEK 293 세포에서의 형질감염 실험에서, 동일한 수준의 발현이 밝혀졌다. mdx 마우스에서 양쪽 구축물을 비교하는 다중 실험 또한 본질적으로 동일한 발현 수준을 나타냈다.
실험 절차: GRMD 개 "던킨" (암컷, 2.5개월령, 6.5 kg)에 대복재정맥을 통해 4×1013 vg/kg의 용량으로 AAV9-hCK-Copti-Dys3978 벡터를 정맥내 주사하였다. 주사 동안 개가 진정되지 않았다. 주목할 만한 유해 반응 또는 거동 변화가 없었다. 벡터 주사 4개월 후에 근육 생검을 행하였고, 주사 14개월 후에 부검했다.
결과: 매우 높은 수준의 거의 균일한 미니-디스트로핀 발현이 주사 4개월 후 생검 (도 22)부터 주사 14개월 후 부검 (부검에 대한 도 23-26)까지 골격근 샘플 상에서 미니-디스트로핀 3978의 면역형광 염색에 의해 관찰되었다.
심장 근육 내의 유의하게 높은 수준의 미니-디스트로핀이 IF 염색에 의해 또한 관찰되었다 (도 27). CK 프로모터로부터의 발현이 CMV 프로모터로부터의 것보다 더 강하고 더 균일한 것으로 보였다.
웨스턴 블롯 분석에서 IF 염색 결과가 확증되었다. 골격근에서, 미니-디스트로핀 수준이 정상 개 대조군으로부터의 야생형 디스트로핀의 정상적인 수준보다 대부분 더 높았다 (도 28). 심장에서의 Dys3978 수준은 야생형 디스트로핀 수준의 거의 절반이었다 (도 29).
코돈-최적화된 유전자 Copti-Dys3978로부터의 Dys3978의 발현이 감마-사르코글리칸을 포함하는 디스트로핀 회합 단백질 복합체를 효과적으로 복구하였다 (도 30).
벡터 DNA 카피수의 정량적 PCR은 미니-디스트로핀 단백질 발현 수준에 대한 일관적인 경향을 나타냈다 (도 31).
검사된 모든 샘플에서 선천적 또는 세포성 면역 반응이 발견되지 않았다. 이는 AAV9-CMV-opH-dys3978의 결과와 매우 상이하고, 근육-특이적 hCK 프로모터가 CMV 프로모터보다 강력할 뿐만 아니라 또한 더 안전하였음을 시사한다.
심장 (도 32), 횡경막 (도 33) 및 사지 근육 (도 34)의 조직학에 대한 H&E 염색에 의해 나타나는 바와 같이 디스트로피 병리학이 대부분 호전되었다. 트리크롬 메이슨 블루 염색 또한 사지 근육 및 횡경막에서의 섬유증의 유의한 감소를 나타냈다 (도 35).
실시예 6
생체내 실험을 위한 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터의 제조
실시예 7, 8 및 9에서 추가로 기술되는 Dmd mdx 래트 연구에서 사용된 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터는 AAV9 캡시드, 및 기능에 최소한도로 요구되는 도메인들인 전장 인간 Dp427m 디스트로핀 단백질 (서열식별번호: 25)로부터의 N-말단 영역, 힌지 1 (H1), 로드 1 (R1), 로드 2 (R2), 힌지 3 (H3), 로드 22 (R22), 로드 23 (R23), 로드 24 (R24), 힌지 4 (H4), 시스테인-풍부 (CR) 도메인, 및 카르복시-말단 (CT) 도메인의 일부분을 포함하는 인간 디스트로핀 단백질의 미니어처 버전을 발현하도록 디자인된 발현 카세트를 포함한다. 이러한 미니-디스트로핀 단백질의 단백질 서열이 서열식별번호: 7의 아미노산 서열로서 제공되고, 이는 서열식별번호: 1의 핵산 서열로서 제공되는 인간 코돈-최적화 DNA 서열에 의해 코딩된다. AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터의 벡터 게놈이 서열식별번호: 18의 핵산 서열로서, 또는 단일-가닥 게놈이 이의 마이너스 극성으로 패키징되는 경우에는 이의 역-상보체로서 제공된다.
이러한 벡터 게놈은 5' 및 3' 플랭킹 AAV2 역전 말단 반복부 (ITR) (각각 서열식별번호: 14 또는 서열식별번호: 15의 DNA 서열을 가짐), 근육 특이적 전사 조절 요소로서의 역할을 하는 크레아틴 키나제 (CK) 유전자로부터 유래된 합성 하이브리드 인핸서 및 프로모터 (hCK; 서열식별번호: 16의 DNA 서열을 가짐), 상기 기술된 인간 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 염기쌍 3978개 길이의 인간 코돈-최적화 유전자 (즉, Hopti-Dys3978 유전자), 및 폴리아데닐화 (폴리A) 신호를 포함하는 소형 합성 전사 종결 서열 (spA; 서열식별번호: 17의 DNA 서열을 가짐)을 포함한다.
삼중 형질감염 기술 및 HEK 293 세포로부터 유래된 무혈청 비-부착성 세포주를 사용하여 벡터를 제작하였다. 사용된 플라스미드는 벡터의 효율적인 복제 및 패키징에 요구되는 아데노바이러스 헬퍼 단백질을 발현시키기 위한 헬퍼 플라스미드, AAV2 rep 유전자 및 AAV9 캡시드 단백질을 발현하는 패키징 플라스미드, 및 상기 미술된 발현 카세트의 서열을 함유하는 제3 플라스미드를 포함하였다.
작업 세포 은행 샘플로부터 세포를 성장 및 확장시키고, 충분한 부피 및 세포 밀도에 도달하였으면, 형질감염 시약을 사용하여 세포를 형질감염시켰다. 형질감염된 세포로부터의 벡터 생산을 허용하는 인큐베이션 후, 세포를 용해시켜 벡터를 방출시키고, 용해물을 정화하고, 오염 핵산을 제거하는 뉴클레아제 처리 단계를 사용하여 벡터를 정제한 후, 요오딕사놀 단계 구배 원심분리, 음이온 교환 크로마토그래피, 제형 완충제에 대한 투석, 멸균 여과, 및 그 후의 2-8℃에서의 보관이 이어졌다.
실시예 7
DMD의 래트 모델에서의 단일 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA의 효과
이러한 실시예는 고전적인 mdx 마우스 및 GRMD 개 모델에 비교하여 특정한 장점이 있는 최근에 개발된 Dmd mdx 래트 모델에서 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA를 테스트하는 것을 기술한다. 문헌 [Larcher, T., et al., Characterization of dystrophin deficient rats: a new model for Duchenne muscular dystrophy. PLoS One. 2014; 9(10):e110371]. 특히, Dmd mdx 래트 모델에서, 골격 및 심장 질환이 양쪽 모두 초기 단계에 존재하고, 인간에서 나타나는 질환 진행과 유사한 순차적 방식으로 발달된다.
이러한 연구에서, PBS 내에 현탁된 단일 용량 (1×1014 벡터 게놈/체중 킬로그램, 또는 vg/kg)의 Dys3978 벡터를 IV 주사에 의해 꼬리 정맥 내로 5-6주령의 수컷 Dmd mdx 래트에게 전신 투여하였다. 대조군으로서, 동일한 유전적 배경 (스프라그 돌리(Sprague Dawley))으로부터의 야생형 ("WT") 래트도 이러한 방식으로 처리하였다. 모든 절차는 편중을 피하기 위해 래트 유전자형 또는 처리 코호트에 대해 맹검으로 수행되었다. 3마리의 Dmd mdx 래트 및 4마리의 WT 래트를 벡터로 처리한 반면, 3마리의 Dmd mdx 래트 및 2마리의 WT 래트는 음성 대조군으로서 PBS만 투여하였다 (모의 처리). 주사 3개월 후, 동물을 안락사시키고, 조직학에 의한 조직 분석을 위한 부검 및 디스트로핀 단백질 발현에 대한 면역세포화학을 진행하였다.
조직병리학적 평가를 위해, 조직 샘플을 10％ 중성 완충 포르말린에 고정시키고, 파라핀 왁스에 매립하고, 5-㎛ 두께로 절편화한 후, 헤마톡실린 에오신 사프론 (HES)으로 염색하였다. 디스트로핀 면역표지화를 위해, 추가적인 샘플 (간, 심장, 넙다리두갈래근, 가슴근 및 횡경막 근육)을 냉동하고, 8-㎛ 두께로 절편화하였다. 디스트로핀에 대한 마우스 모노클로날 항체 NCL-DYSB (노보카스트라 래버러토리즈(Novocastra Laboratories), 영국 뉴캐슬 온 타인)를 디스트로핀 및 미니-디스트로핀 단백질 검출 양쪽 모두에 사용하였는데 (1:50), 이러한 항체가 전장 야생형 디스트로핀과 조작된 미니-디스트로핀을 구별하지 않기 때문이다. 모든 부검 및 조직학적 관찰을 맹검 방식으로 수행하였다.
조직학적 검사에 의해, PBS 및 벡터 처리 WT 래트의 골격 또는 심장 근육에서 병변이 관찰되지 않았다. 모든 Dmd mdx 래트에서, 개별적인 괴사, 재생성 소형 섬유의 클러스터, 산재된 초대형 유리질 섬유, 적혈구부동증, 핵중심화, 근내막 섬유증 및 산발성 지방증을 나타내는 골격근 섬유 병변이 존재하였고, 이는 DMD 골격근의 특징이었다. 이러한 병변들의 발생 및 강도가 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트에서 PBS로만 처리된 것들에 비교하여 전반적으로 감소되었다. 심장에서, 다병소성 괴사, 단핵 세포 국소 침윤 및 경도의 국소적인 광범위 섬유증의 병변이 PBS로 처리된 Dmd mdx 래트 중 한마리 (래트 49)에서 존재하였고, 이는 DMD 심장 근육의 특징이다. 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트 모두에서, 심장 근육 표현이 유사하였고, PBS가 제공된 Dmd mdx 래트에서 나타난 바와 같은 경도의 단핵 세포 국소 침윤을 나타냈지만, 대조적으로, 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트의 심장에서 섬유증 병소가 관찰되지 않았다.
면역세포화학을 사용하여, WT 래트는 골격근, 횡경막 근육 및 심장 근육 섬유에서 검출된 근초하 디스트로핀을 나타냈고, 검출된 디스트로핀의 국소화가 벡터로 처리된 래트와 PBS로만 처리된 래트 사이에서 상이하지 않았다. 그러나, 사용된 항-디스트로핀 항체가 야생형 디스트로핀과 미니-디스트로핀 단백질을 구별할 수 없었기 때문에, 벡터로 처리된 WT 래트에서의 미니-디스트로핀 검출이 이러한 검정법을 사용하여 확증될 수 없었다. 대조적으로, Dmd mdx 래트 중 한마리 (래트 49)는 검출가능한 근초하 디스트로핀이 있는 골격근 섬유를 드물게 나타냈고 (약 5％ 내지 10％), 이는 이러한 모델에서 산재성 복귀변이체 섬유가 약 5％의 빈도로 존재한다는 기존의 설명과 일치한다 (Larcher et al., PlosOne, 2014). 그러나, 이러한 래트로부터의 횡경막 또는 심장 근육 섬유에서는 디스트로핀이 검출되지 않았다. Dys3978 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트 모두에서, 근초하 디스트로핀이 골격근 섬유의 약 80％ 내지 95％, 횡경막 근육 섬유에서의 약 30％ 내지 50％, 및 심장 근육 섬유에서의 약 70％ 내지 80％에서 또한 검출되었지만, 전신 카운팅은 수행되지 않았다. 이러한 래트에서, 매우 드문 골격근 섬유 (근육 절편 당 1 또는 2개)가 약간의 세포질 원섬유사이 디스트로핀을 나타냈다. 벡터 처리 WT 및 Dmd mdx 래트 양쪽 모두에서는, 벡터 형질도입 또는 미니-디스트로핀 생산에 의해 세포성 면역 반응이 자극되었음을 나타낼 수 있는 괴사 증가 또는 염증성 세포 침윤물의 증거가 없었다.
요약하면, 1×1014 vg/kg의 AAV9.hCK.opti-Dys3978.spA 벡터의 전신 투여 3개월 후에, 근육 조직의 조직학적 변경이 PBS에 비교하여 벡터로 처리된 WT 래트에서 관찰되지 않았고, 이는 건강한 동물에서 미니-디스트로핀 단백질의 발현이 잘 허용되었음을 시사한다. 추가로, Dmd mdx 래트의 벡터 처리가 연구된 모든 근육 (넙다리두갈래근, 가슴근, 횡경막 및 심장)의 섬유에서 WT 래트 근육에서의 것과 유사한 근초하 국소화의 패턴으로 미니-디스트로핀의 유의하고 일반화된 검출을 초래하였다. 벡터로부터의 미니-디스트로핀 Dys3978의 발현이 섬유증 및 괴사의 감소와 연관되었다 (도 36a-36d).
실시예 8
주사 3개월 및 6개월 후에 결정된
Dmd
mdx
래트에서의 증가되는 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA의 효과
이러한 실시예는 뒤시엔느 근육 디스트로피에 대한 동물 모델인 Dmd mdx 래트를 증가되는 용량의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA로 처리하고, 투여하고 나서 3개월 및 6개월 후에 효과를 측정하는 것의 결과를 기술한다.
래트에게 7-8주령에 등쪽 음경 정맥 내로의 IV 주사에 의해 투약하였고, 이는 테스트 물품의 전신 투여를 초래하였다. 4가지 상이한 벡터 용량을 10-12마리의 Dmd mdx 래트에서 테스트하였다: 1×1013 vg/kg (3개월 시점의 래트 5마리 및 6개월 시점의 래트 6마리), 3×1013 vg/kg (3개월 시점의 래트 6마리 및 6개월 시점의 래트 5마리), 1×1014 vg/kg (3개월 시점의 래트 7마리 및 6개월 시점의 래트 6마리), 및 3×1014 vg/kg (3개월 시점의 래트 5마리 및 6개월 시점의 래트 5마리). 추가적으로, Dmd mdx 래트 및 WT 래트 각각에게 비히클 단독 (1× PBS, 215 mM NaCl, 1.25％ 인간 혈청 알부민, 5％ (w/v) 소르비톨)을 음성 대조군으로서 제공하였다 (3개월 시점의 Dmd mdx 래트 6마리, 6개월 시점의 Dmd mdx 래트 4마리, 3개월 시점의 WT 래트 5마리, 및 6개월 시점의 WT 래트 7마리). 5마리의 미처리 (즉, 벡터 없음 및 비히클 없음) Dmd mdx 래트가 추가적인 음성 대조군으로서 또한 포함되었다. 주사 3개월 및 6개월 후에, 각각의 테스트 아암으로부터의 래트를 안락사시키고 부검하여, 추가 분석을 위한 조직 샘플을 취했다. 희생 전에, 테스트 동물에서 심장 기능 및 악력 강도 테스트를 수행하여, DMD 질환 진행에 대한 벡터 처리의 효과를 평가하였다.
본문 및 도면에서 벡터 용량이 수치적으로 등가인 2가지 상이한 방식으로 표현될 수 있음을 주지한다. 따라서, "1×1013"은 "1E13"과 등가이고, "3×1013"은 "3E13"과 등가이며, "1×1014"는 "1E14"와 등가이고, "3×1014"는 "3E14"와 등가이다.
체중
처리 후 및 희생 전에, 각각의 처리 아암의 래트를 첫주 동안에는 매일, 그 후에는 희생시킬 때까지 매주 칭량하였다. 각각의 처리 아암의 모든 래트의 평균 중량이 표 2 (주사 전에서 주사 9주 후까지) 및 표 3 (주사 10-25주 후)에서 열거되고, 도 37에서 시간에 대해 그래프화된다. 그래프에서, 오차 막대는 평균의 표준 오차 (SEM)를 나타내고, 이는 표에서도 보고된다. 모든 시간에, 벡터로 처리된 것들을 포함하여, WT 래트의 평균 중량이 Dmd mdx 래트의 것을 초과하였다. Dmd mdx 래트들 사이의 나이 차이 및 체질량에서의 자연적인 가변성으로 인해, 최고 용량 아암에서를 제외한 모든 벡터-처리 Dmd mdx 래트의 체중이 미처리 Dmd mdx 래트보다 더 높았지만, WT 래트보다 더 낮았던 때인 주사 4주 후까지는 용량과 체중 사이에 일관적인 상관관계가 없었다. 주사 12주 후까지는, 연구 종료까지 테스트된 모든 용량에서 체중에 벡터 용량에 비례하면서, 모든 처리 아암에서의 용량 효과가 명백하였다.
<표 2>
<표 3>
AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된
Dmd
mdx
래트에서의 벡터 형질도입 및 RNA 및 단백질 발현의 정량
물질 및 방법
표준 분자 생물학 기술을 사용하여, 정량적 PCR (qPCR)에 의해 트랜스진 카피수를, 역전사효소 qPCR (RT-qPCR)에 의해 미니-디스트로핀 mRNA 전사체의 상대적인 발현 수준을, 그리고 웨스턴 블롯 분석에 의해 정량적으로 미니-디스트로핀 단백질 발현의 양을 정량하였다.
qPCR의 경우, 게놈 DNA (gDNA)를 퀴아젠(Qiagen)으로부터의 젠트라 퓨어진(Gentra Puregene) 키트를 사용하여 조직으로부터 정제하였다. 그 후, 스텝원 플러스(StepOne Plus)™ 실시간 PCR 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)®, 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))을 사용하여 샘플을 50 ng gDNA를 이중으로 사용하여 분석하였다. 모든 반응을 주형 DNA, 프리믹스 엑스 택(Premix Ex taq) (오자임(Ozyme)), 0.3 ㎕의 ROX 기준 염료 (오자임), 0.2 μmol/L의 각각의 프라이머 및 0.1 μmol/L의 택맨(Taqman)® 프로브를 함유하는 20 ㎕의 최종 부피로 이중으로 수행하였다.
미니-디스트로핀 트랜스진의 영역을 증폭시키도록 디자인된 프라이머 및 프로브를 사용하여 벡터 카피수를 결정하였다:
정방향: 5'-CCAACAAAGTGCCCTACTACATC-3' 서열식별번호: 19
역방향: 5'-GGTTGTGCTGGTCCAGGGCGT-3' 서열식별번호: 20
프로브: 5'-FAM-CCGAGCTGTATCAGAGCCTGGCC-TAMRA-3' 서열식별번호: 21
래트 HPRT1 유전자를 증폭시키도록 디자인된 프라이머 및 프로브를 사용하여 내인성 gDNA 카피수를 결정하였다:
정방향: 5'-GCGAAAGTGGAAAAGCCAAGT-3' 서열식별번호: 22
역방향: 5'-GCCACATCAACAGGACTCTTGTAG-3' 서열식별번호: 23
프로브: 5'-JOE-CAAAGCCTAAAAGACAGCGGCAAGTTGAAT-TAMRA-3' 서열식별번호: 24
각각의 샘플에 대해, 역치 사이클 (Ct) 값을 선형화된 표준 플라스미드 (미니-디스트로핀 발현 카세트 또는 래트 HPRT1 유전자를 함유함)의 상이한 희석물들로 수득된 것과 비교하였다. 표준 플라스미드의 상이한 희석물들이 스파이킹된, 대조군 동물로부터의 조직 샘플로부터 추출된 50 ng의 gDNA를 사용함으로써 gDNA 존재 하의 qPCR 억제의 부재를 점검하였다. 듀플렉스 qPCR (동일한 반응에서의 2개의 서열의 증폭)을 사용하였고, 결과는 이배수체 게놈 당 벡터 게놈 (vg/dg)으로 표현되었다. 테스트 감도는 0.003 vg/dg이었다.
RT-qPCR의 경우, 총 RNA를 트리졸(TRIzol)® 시약 (써모 피셔 사이언티픽)으로 조직 샘플로부터 추출한 후, TURBO DNA-프리 키트 (써모 피셔 사이언티픽)로부터의 RNAse가 없는 DNAse I로 처리하였다. 총 RNA (500 ng)를 25 ㎕의 최종 부피로 무작위 프라이머 (써모 피셔 사이언티픽) 및 M-MLV 역전사효소 (써모 피셔 사이언티픽)를 사용하여 역전사시켰다. 그 후, qPCR에 의한 트랜스진 카피수의 정량에 대한 것과 동일한 미니-디스트로핀 및 래트 HPRT1 특이적 프라이머 및 프로브를 사용하여 1/15-희석 cDNA에서 듀플렉스 qPCR 분석을 수행하였다. 표준 플라스미드의 상이한 희석물들이 스파이킹된 대조군 동물로부터의 조직 샘플로부터 수득된 cDNA를 분석함으로써 cDNA 존재 하의 qPCR 억제의 부재를 점검하였다. 각각의 RNA 샘플에 대해, Ct 값을 표준 플라스미드 (미니-디스트로핀 발현 카세트 또는 래트 HPRT1 유전자를 함유함)의 상이한 희석물들로 수득된 것과 비교하였다. 결과는 상대적인 양 (RQ)으로 표현되었다:
RQ = 2-ΔCt = 2-(Ct 표적 - Ct 내인성 대조군)
각각의 RNA 샘플에 대해, 반응 혼합물에 역전사효소를 첨가하지 않고 수득된 "cDNA-유사 샘플"의 분석에 의해 DNA 오염의 부재를 또한 확인하였다.
발현된 단백질 수준의 웨스턴 블롯 분석의 경우, 프로테아제 억제제 칵테일 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))을 함유하는 RIPA 완충제를 사용하여 조직 샘플로부터 총 단백질을 추출하였다. 넙다리두갈래근, 심장 및 횡경막의 경우 50 ㎍, 또는 간의 경우 100 ㎍의 단백질 추출물을 NuPAGE® 노벡스(Novex) 3-8％ 트리스 아세테이트 겔 상에 로딩하고, NuPAGE® 대형 단백질 블롯팅 키트 (써모 피셔 사이언티픽)를 사용하여 분석하였다. 최종 농도 200 mM의 DTT를 사용하여, 로딩 전에 단백질을 환원시켰다. 그 후, 막을 5％ 탈지유, TBST (트리스-완충 염수, 0.1％ 트윈(Tween( 20) 내의 1％ NP40 (시그마-알드리치)로 차단하고, 디스트로핀 단백질의 엑손 10 및 11에 대해 특이적인 항-디스트로핀 항체 (1:100, MANEX 1011C 모노클로날 항체) 및 2차 항-마우스 IgG HRP-접합 항체 (1:2000, 다코(Dako))와 혼성화시켰다. 단백질 로딩 대조군의 경우, 동일한 막을 항-래트 알파-튜불린 항체 (1:10000, 시그마(Sigma)) 및 2차 항-마우스 IgG HRP-접합 항체 (1:2000, 다코)와 혼성화시켰다. ECL 화학발광 분석 시스템 (써모 피셔 사이언티픽)에 의해면역블롯을 가시화하였다.
주사 3 및 6개월 후의 인간 미니-디스트로핀 트랜스진 카피수
벡터 및 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트, 및 비히클만 투여된 WT 래트에서의 전혈, 비장, 심장, 넙다리두갈래근, 가슴근, 횡경막, 및 간 내의 트랜스진 카피수 (이배체수 게놈 당 벡터 게놈 (vg/dg))에 대한 테스트의 결과가 하기 표에서 기술된다. 주사 3개월 후의 데이터가 표 4에서 제공되고, 주사 6개월 후의 데이터가 표 5에서 제공된다. 데이터는 개별적인 테스트 동물들로부터의 결과의 평균이다.
<표 4>
주사 3개월 후
<표 5>
주사 6개월 후
비히클만 주사된 Dmd mdx 또는 WT 래트에서 qPCR 신호가 검출되지 않았고, 이는 이러한 동물들이 어떠한 벡터도 받지 않았음을 확증하며, 주사 3 및 6개월 후에 전혈에서 qPCR 신호가 검출되지 않았다.
주사 3 및 6개월 후 양쪽 모두에 벡터가 주사된 Dmd mdx 래트에서 미니-디스트로핀 DNA가 검출되었다. 연구 중인 조직 내의 트랜스진 카피수는 간 > 심장 > 넙다리두갈래근 
횡경막 
가슴근 > 비장의 우세 패턴을 따랐다. 분석된 조직들 중에서, 3×1014 vg/kg 벡터가 투여된 래트에서 벡터 카피수가 평균 80-110 vg/dg까지 도달하면서, 간이 월등하게 가장 효율적으로 형질도입되었다. 간에서의 벡터 카피수는 심장에서보다 7-45배 더 높았고, 넙다리두갈래근, 횡경막 근육, 또는 가슴근에서보다 40-300배 더 높았다. 심장에서는, 벡터 카피수가 1×1014 vg/kg 벡터가 투약된 래트에서는 약 1.0 vg/dg, 3×1014 vg/kg 벡터가 투약된 래트에서는 약 5.0 vg/dg으로 평균화되었다. 1 ×1014 vg/kg의 용량에서, 넙다리두갈래근 및 가슴근에서의 트랜스진 카피수가 유사하였고, 결코 약 0.5 vg/dg를 초과하지 않았다. 벡터 용량이 3×1014 vg/kg로 증가했을 때, 평균 트랜스진 카피수가 약 1.2 vg/dg로 증가하였다. 2가지 최고 용량 수준의 벡터가 제공된 4마리의 동물들 사이에서의 특정한 비정상적으로 높은 결과로 인해 횡경막에서 데이터가 특히 가변적이었는데, 여기서 트랜스진 카피수는 약 9-15 vg/dg 범위였다. 이러한 벗어난 데이터 포인트들을 배제하면, 트랜스진 카피수가 1×1014 vg/kg 용량에서는 약 0.2-0.4 vg/dg, 3×1014 vg/kg 용량에서는 약 1.05-1.3 vg/dg로 평균화되면서, 횡경막의 형질도입 효율은 3 및 6개월 시점 양쪽 모두에 비교적 낮다.
주사 3 및 6개월 후의 인간 미니-디스트로핀 mRNA 발현
처리 아암 당 2 내지 4마리의 동물을 RT-qPCR에 의한 분석용으로 무작위로 선택하여, 희생 시에 수득된 넙다리두갈래근, 횡경막, 심장, 비장, 및 간 샘플 내의 인간 미니-디스트로핀 mRNA 전사체의 수준을 정량하였다. 주사 3개월 및 6개월 후에 희생된 테스트 동물로부터 수득된 결과가 각각 표 6 및 표 7에서 제공된다. 데이터는 래트 HPRT1 유전자로부터의 mRNA에 대해 상대적인 미니-디스트로핀 mRNA의 상대적인 양 (RQ)로 표현된다.
용량과 관계 없이, 음성 대조군 아암의 동물 (비히클로 처리된 WT 래트 및 Dmd mdx 래트)로부터의 어떠한 조직에서도, 또는 벡터로 처리된 동물의 비장에서 전사체가 검출되지 않았다. 검사된 모든 다른 조직에서, 벡터-유래 전사체가 검출되었고, 데이터에 약간의 가변성이 있었지만, 이의 수준은 용량-반응성 방식으로 증가하는 경향이 있었다. 조직 내의 전사체 수준은 넙다리두갈래근 > 심장 
횡경막 > 간의 패턴을 따랐다. 상기 논의된 바와 같이, 샘플링된 조직들 사이에서 간이 가장 형질도입된 조직이었고, 벡터 카피수가 넙다리두갈래근에서보다 약 60-130배 더 높게 다양하였다. 그럼에도 불구하고, 간에서의 미니-디스트로핀 mRNA의 수준은 넙다리두갈래근에서보다 약 5-15배 더 낮았고, 이는 벡터에서 사용된 프로모터의 고도로 근육-특이적인 활성의 증거이다.
<표 6>
주사 3개월 후
<표 7>
주사 6개월 후
주사 3 및 6개월 후의 인간 미니-디스트로핀 단백질 발현
인간 미니-디스트로핀 mRNA 수를 결정하기 위한 분석용으로 무작위로 선택된 것과 동일한 동물을 웨스턴 블롯을 사용하여 미니-디스트로핀 단백질 수준을 결정하기 위해 또한 분석하였다. 음성 대조군 아암의 동물 (비히클로 처리된 WT 래트 및 Dmd mdx 래트)로부터의 어떠한 조직에서도 미니-디스트로핀 단백질이 검출되지 않았다. 3 및 6개월 시점 양쪽 모두에, 미니-디스트로핀 단백질이 벡터가 투약된 Dmd mdx 래트의 넙다리두갈래근, 심장 및 횡경막에서 검출되었다. 테스트된 최저 용량 (1×1013 vg/kg)에서, 더 높은 수준의 벡터가 투약된 래트에 비교하여 조직 샘플에서 미니-디스트로핀 단백질이 덜 빈번하게 검출되었다. 이러한 결과들이 표 8에서 정성적으로 요약된다.
<표 8>
웨스턴 블롯에 의해 검출된 단백질의 양과 벡터 용량, 뿐만 아니라 동일한 조직 샘플 내의 미니-디스트로핀 mRNA의 양 사이에 양성 상관관계가 있었다. 약 1.5의 미니-디스트로핀 mRNA RQ가 단백질 검출을 허용하는데 요구되었다. 간에서 측정된 미니-디스트로핀 전사체의 낮은 수준과 일관되게, 사용된 최고 벡터 용량에서조차도, 이러한 조직에서는 미니-디스트로핀 단백질이 검출되지 않았다.
조직병리학적 평가
WT 및 Dmd mdx 래트의 희생 직후에, 조직병리학적 및 면역세포화학적 분석을 위해 조직 샘플을 수득하였다.
물질 및 방법
비히클-처리 WT 래트, 비히클 및 벡터-처리 Dmd mdx 래트로부터의 조직 샘플을 주사 3 및 6개월 후 전체 부검 평가 동안 수득하였다. 기준선 비교물로서의 역할을 하도록 7-9주령에 희생된 미처리 Dmd mdx 래트로부터 샘플을 또한 수득하였다. 조직을 즉각적으로 조직병리학을 위해 포르말린에 고정시키거나 또는 면역조직화학 (면역표지화)을 위해 급속 냉동시키고, 프로세싱할 때까지 보관하였다. 조직병리학의 경우, 조직 샘플을 10％ 중성 완충 포르말린에 고정시키고, 파라핀 왁스에 매립하고, 절편화한 후 (5 ㎛), 헤마톡실린 에오신 사프론 (HES) 염색으로 염색하였다. 파라핀에 매립된 심장 조직의 추가적인 절편을 콜라겐을 가시화하기 위해 피크로시리우스 레드 F3B (시그마-알드리치 쉬미 에스아에르엘(Sigma-Aldrich Chimie SARL), 프랑스 리용)로 염색하였다. 면역표지화에 의해 디스트로핀 및 결합 조직을 확인하기 위해, 샘플을 냉동시키고 절편화하였다 (8 ㎛). 래트 디스트로핀, 뿐만 아니라 인간 미니-디스트로핀 opti-Dys3978에 특이적으로 결합하는 마우스 모노클로날 항체인 NCL-DYSB (1:50, 노보카스트라 래버러토리즈, 영국 뉴캐슬 온 타인)를 디스트로핀 단백질을 가시화하는 면역표지 연구에서 사용하였다. 결합 조직을 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 555 밀 배아 응집소 (WGA) 접합체 (1:500, 몰레큘러 프로브즈(Molecular Probes), 오리건주 유진)를 사용하여 가시화하였다. 핵을 DRAQ5 (1:1000, 바이오스테이터스 엘티디(BioStatus Ltd), 영국 쉐프쉐드)로 염색하였다. 부검 및 조직학적 검사를 맹검으로 수행하였다.
심장 절편 내의 피크로시리우스 양성 면적을 니콘 이미징 소프트웨어(Nikon Imaging Software) (니콘(Nikon), 프랑스 샹피니쉬르마른)를 사용하여 정량하였다. DYSB 양성 섬유 및 WGA 양성 면적을 이미지제이(ImageJ) 오픈 소스 영상 프로세싱 소프트웨어 (v 2.0.0-rc-49/1.51a)를 사용하여 정량하였다.
결과
주사 3개월 및 6개월 후의 근육 내의 DMD 병변의 조직병리학적 분석
조직학용으로 염색된 조직 샘플을 현미경으로 검사하고, 전신적으로 DMD 표현형에 관련된 병변을 기록하였다. 도 38a에 도해된 바와 같이 골격근 및 심장 근육 내의 병변을 반-정량적으로 채점하였다. 골격근 (넙다리두갈래근, 가슴근 및 횡경막)에서, 0점은 유의한 병변의 부재에 상응하였고; 1점은 핵중심화 섬유 및 재생성 병소에 의해 증명되는 바와 같은 약간의 재생 활성의 존재에 상응하였고; 2점은 단리된 또는 소형 클러스터 내에 있는 퇴행성 섬유에 상응하였으며; 3점은 조직 리모델링 및 섬유증 조직 또는 지방 조직에 의한 섬유 교체에 상응하였다. 심장에서는, 채점이 섬유증의 강도 (저급에 대해 1점, 고급에 대해 2점) 및 퇴행성 섬유의 존재 (3점)를 기초로 하였다. 각각의 래트에 대한 총 병변 점수를 넙다리두갈래근, 가슴근, 횡경막 근육 및 심장 근육에 대한 동물 점수의 평균으로서 계산하였다. 각각의 처리 아암 내의 개별적인 래트들에 대한 병변 점수를 또한 평균화하였다.
주사 3개월 후의 개별적인 래트 및 처리 아암에 의해 그룹화된 평균의 총 병변 점수가 도 38b에서 제시되고, 여기서 WT 모의는 비히클로 처리된 WT 래트를 지칭하고, 이에 대한 병변 점수는 0점이었다. KO 모의는 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트를 지칭하는 한편, KO 1E13, 3E13, 및 1E14는 vg/kg 단위의 지시된 용량 (즉, 각각 1×1013, 3×1013, 및 1×1014)의 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트를 지칭한다. 도면에서 볼 수 있듯이, Dmd mdx 래트에서의 디스트로피 표현형과 연관된 근육 병변의 유병률이 용량-반응성 방식으로 벡터 처리에 의해 감소되었다.
병변 점수의 통계 분석 (던 검정을 사용한 다중 쌍 비교에 의한 분석)에서 처리 아암들 사이의 하기의 차이가 밝혀졌다. 주사 3개월 후의 넙다리두갈래근의 샘플에서는, 비히클로 처리된 WT 래트와 2가지 최고 용량 (1×1014 및 3×1014 vg/kg)의 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트 사이에 병변 점수의 유의한 차이가 없었고, 주사 6개월 후에, 비히클로 처리된 WT와 테스트된 4가지 용량 중 임의의 것의 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트 사이에 유의한 차이가 없었다. 주사 3개월 후의 가슴근 및 횡경막의 샘플에서는 비히클로 처리된 WT 래트와 테스트된 3가지 최고 벡터 용량 (3×1013, 1 ×1014 및 3×1014 vg/kg)으로 처리된 Dmd mdx 래트 사이에 병변 점수의 유의한 차이가 없었고, 주사 6개월 후에, 비히클로 처리된 WT 래트와 4가지 모두의 벡터 용량으로 처리된 Dmd mdx 래트 사이에 점수의 유의한 차이가 없었다. 마지막으로, 심장 근육에서는, 양쪽 모두의 시점에, 비히클-처리 WT 래트와 4가지 모두의 벡터 용량으로 처리된 Dmd mdx 래트 사이에 병변 점수의 유의한 차이가 없었다.
주사 3 및 6개월 후의 조직형태계측
벡터로부터 발현된 인간 미니-디스트로핀 및 래트 디스트로핀 양쪽 모두에 특이적으로 결합하는 DYSB 항체로 조직 샘플을 표지한 후, 각각의 래트로부터의 3개의 무작위로 선택된 현미경 시야 내의 양성으로 염색된 근육 섬유의 백분율을 넙다리두갈래근, 횡경막 및 심장 근육에 대해 계산하였다. 추가적으로, WGA 접합체로 양성으로 염색된 3개의 무작위로 선택된 현미경 시야 내의 면적을 계산하여 넙다리두갈래근 및 횡경막으로부터의 냉동 조직 샘플 내의 결합 조직 섬유증의 정도를 결정하였다. 관련된 분석에서, 조직학적 표본 내의 피크로시리우스 레드로 양성으로 염색된 면적을 정량함으로써 심장의 횡단면 내의 결합 조직 (콜라겐)의 양을 결정하였다. 이러한 연구들로부터의 결과가 도 39a-39c, 도 40a-40c, 및 도 41a-41c에서 제공된다.
도 39a는 비히클로 처리된 WT 래트 (WT + 완충제), 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트 (DMD + 완충제), 및 1×1013, 3×1013, 1×1014 및 3×1014 vg/kg의 증가되는 용량의 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트 (각각 DMD + 1E13, 3E13, 1E14, 및 3E14)로부터의 넙다리두갈래근 근육 샘플로부터의 염색된 조직 절편의 대표적인 현미경사진을 나타낸다. 상부 패널의 사진은 주사 3개월 후에 취한 샘플로부터의 사진이고, 하부 패널은 주사 6개월 후에 취한 샘플로부터의 것이다. 도 39b는 3 및 6개월 시점의 각각 비히클로 처리된 WT 래트 및 Dmd mdx 래트, 및 증가된 용량의 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트로부터의 넙다리두갈래근 근육 샘플 내의 디스트로핀 양성 섬유의 백분율을 나타내는 그래프이다. 7-9주령의 미처리 Dmd mdx 래트 ("DMD 병리 상태")로부터의 결과 또한 포함된다. 도 39c는 3 및 6개월 시점의 유사하게 처리된 WT 및 Dmd mdx 래트, 및 7-9주령의 미처리 Dmd mdx 래트로부터의 넙다리두갈래근 근육 샘플 내의 결합 조직이 차지한 백분율 면적 (섬유증의 척도)을 나타내는 그래프이다. 이러한 그래프에서, 오차 막대 위의 동일한 문자는 데이터 사이에 통계적으로 유의한 차이가 없다는 것을 나타내는 반면, 공통 문자가 없는 것은 유의한 차이가 있다는 것을 나타낸다 (예를 들어, 양쪽 모두 그 위에 "a"가 있는 2개의 막대는 서로 통계적으로 상이하지 않을 것이다).
도 40a는 모두 주사 3개월 후에 취해진, 비히클로 처리된 WT 래트 (WT + 완충제), 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트 (DMD + 완충제), 및 1×1013, 3×1013, 1×1014 및 3×1014 vg/kg의 증가되는 용량의 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트 (각각 DMD + 1E13, 3E13, 1E14, 및 3E14)로부터의 횡경막 샘플로부터의 염색된 조직 절편의 대표적인 현미경사진을 나타낸다. 도 40b는 3 및 6개월 시점의 각각 비히클로 처리된 WT 래트 및 Dmd mdx 래트, 및 증가된 용량의 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트로부터의 횡경막 샘플 내의 디스트로핀 양성 섬유의 백분율을 나타내는 그래프이다. 7-9주령의 미처리 Dmd mdx 래트 ("DMD 병리 상태")로부터의 결과 또한 포함된다. 도 40c는 3 및 6개월 시점의 유사하게 처리된 WT 및 Dmd mdx 래트, 및 7-9주령의 미처리 Dmd mdx 래트로부터의 횡경막 샘플 내의 결합 조직이 차지한 백분율 면적 (섬유증의 척도)을 나타내는 그래프이다. 이러한 그래프에서, 오차 막대 위의 동일한 문자는 데이터 사이에 통계적으로 유의한 차이가 없다는 것을 나타내는 반면, 공통 문자가 없는 것은 유의한 차이가 있다는 것을 나타낸다 (예를 들어, 양쪽 모두 그 위에 "a"가 있는 2개의 막대는 서로 통계적으로 상이하지 않을 것이다).
도 41a는 비히클로 처리된 WT 래트 (WT + 완충제), 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트 (DMD + 완충제), 및 1×1013, 3×1013, 1×1014 및 3×1014 vg/kg의 증가되는 용량의 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트 (각각 DMD + 1E13, 3E13, 1E14, 및 3E14)로부터의 심장 근육 샘플로부터의 염색된 조직 절편의 대표적인 현미경사진을 나타낸다. 상부 및 하부 패널은 각각 주사 3 및 6개월 후에 희생된 테스트 동물로부터 취한, 조직학적으로 제조되고 피크로시리우스 레드로 염색된 첨단부의 1/3로부터의 심장의 횡단면을 나타낸다. 검정색 막대는 2 mm의 길이를 나타낸다. 가운데 패널은 3개월 시점에 취한 심장 근육 샘플에서의 항-디스트로핀 항체 및 WGA 접합체로의 면역표지화를 나타낸다. 도 41b는 3 및 6개월 시점의 각각 비히클로 처리된 WT 래트 및 Dmd mdx 래트, 및 증가된 용량의 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트로부터의 심장 근육 샘플 내의 디스트로핀 양성 섬유의 백분율을 나타내는 그래프이다. 7-9주령의 미처리 Dmd mdx 래트 ("DMD 병리 상태")로부터의 결과 또한 포함된다. 도 41c는 3 및 6개월 시점의 유사하게 처리된 WT 및 Dmd mdx 래트, 및 7-9주령의 미처리 Dmd mdx 래트로부터의 심장 근육 샘플 내의 결합 조직이 차지한 백분율 면적 (섬유증의 척도)을 나타내는 그래프이다. 이러한 그래프에서, 오차 막대 위의 동일한 문자는 데이터 사이에 통계적으로 유의한 차이가 없다는 것을 나타내는 반면, 공통 문자가 없는 것은 유의한 차이가 있다는 것을 나타낸다 (예를 들어, 양쪽 모두 그 위에 "a"가 있는 2개의 막대는 서로 통계적으로 상이하지 않을 것이다).
데이터의 통계 분석 (ANOVA 분석 및 피셔 사후 양측 검정)은 주사 3 및 6개월 후 양쪽 모두에, 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트와 모든 벡터 용량으로 처리된 Dmd mdx 래트 사이에 넙다리두갈래근 및 심장에서의 디스트로핀 표지화의 유의한 차이가 있었음을 입증하였다. 횡경막에서는, 주사 3개월 후의 차이가 테스트된 2가지 최고 용량에서 유의했던 반면, 주사 6개월 후에는 테스트된 3가지 최고 용량에서 차이가 유의하였다. 비히클로 처리된 WT 래트와 3×1014 vg/kg으로 처리된 Dmd mdx 래트 사이의 비교에서, 주사 3개월 후의 넙다리두갈래근에서 또는 주사 6개월 후의 심장 근육에서 유의한 차이가 밝혀지지 않았다.
비히클로 처리된 WT 래트로부터의 근육에서, 모든 근육 섬유가 DYSB 항체로의 강한 균질한 근초하 표지화를 나타냈다. 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트로부터의 근육에서, 작은 백분율의 산재된 복귀변이체 섬유가 유사한 표지화를 나타냈다 (각각 주사 3 및 6개월 후: 넙다리두갈래근, 3.7 ± 2.4％ 및 7.3 ± 2.3％; 횡경막, 0.7 ± 1.5％ 및 5.8 ± 1.3％; 심장 근육, 0.0 ± 0.0％ 및 0.1 ± 0.1％). 벡터가 투여된 Dmd mdx 래트에서, 디스트로핀에 대해 양성으로 염색된 섬유의 백분율이 모든 관찰된 근육에서 증가하였고, 이때 섬유는 약한 근초하 표지화 내지 강한 근초하 표지화를 나타냈다. 섬유의 2/3가 표지되는 것이 양성으로 간주되는데 요구되었다. 3 및 6개월 시점 양쪽 모두에, 디스트로핀-양성 섬유의 백분율이 넙다리두갈래근과 심장 근육 사이에서 유사하였고, 이는 횡경막에서보다 더 높았다. 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트에서, 결합 조직이 차지한 면적에 의해 측정된 섬유증 병소의 개수 및 크기가 골격근에서 감소되었고, 심장 근육에서 섬유증의 강도가 감소되었다.
7-9주령에 희생된 미처리 Dmd mdx 래트에서는, 넙다리두갈래근 또는 심장 근육에서 섬유증이 명백하지 않았지만, 횡경막에는 이미 유의한 결합 조직 확장이 있었다. WT 래트에 비교하여, 비히클-처리 Dmd mdx 래트는 골격근 내의 근내막 및 근육다발막 공간의 국소적인 또는 일반화된 비대를 나타냈고, 이는 섬유증을 나타낸다. 심장에서는, 이러한 래트들이 심실 및 중격 심외막하 영역에서 산재되고 광범위한 섬유증 병소를 나타냈다. 중증 사례에서는, 심장의 형상을 변경시킨 경벽 섬유증이 관찰되었다. 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트에 비교하여, 3×1013 vg/kg 벡터 및 더 높은 용량으로 처리된 Dmd mdx 래트의 넙다리두갈래근에서 주사 3개월 후에, 그리고 3×1014 vg/kg 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트의 횡경막에서 주사 6개월 후에, 섬유증 병소의 개수 및 크기에서의 유의한 감소가 있었다. 심장에서는, 양쪽 시점에 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트와 모든 벡터 용량으로 처리된 Dmd mdx 래트 사이에서 섬유증의 유의한 차이가 확인되었다. 주사 3개월 후에, 비히클로 처리된 WT 래트와 3×1013 vg/kg 이상의 용량의 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트 사이에서 섬유증의 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 관찰된 섬유증의 양 및 벡터 용량이 음으로 상관되었다 (넙다리두갈래근의 경우 p=0.019; 횡경막의 경우 p=0.004; 및 심장 근육의 경우 p=0.003이고, 모두 선형 회귀에 의함).
Dmd mdx 래트에서, 분석된 모든 근육 (넙다리두갈래근, 횡경막, 및 심장)에서 벡터 처리가 미니-디스트로핀 발현을 유도하였고, 미니-디스트로핀을 발현하는 섬유의 백분율이 벡터 용량과 양으로 상관되었다 (선형 회귀에 의해 p<0.001). 벡터-처리 Dmd mdx 래트 내의 미니-디스트로핀-양성 섬유의 개수가 횡경막에서보다 넙다리두갈래근 및 심장에서 더 높았고, 이는 생체분포 또는 발현 효능에서의 약간의 비균질성을 시사한다. 미니-디스트로핀 발현은 이의 근초하 국소화 관점에서 용량과 관계 없이 유사하였고, 분석된 최고 용량인 3×1014 vg/kg에서조차도 비정상적인 국소화가 검출되지 않았다. 일부 섬유에서는, 근초를 따라 불연속적인 디스트로핀 염색이 검출되었지만, 벡터 용량이 증가하면서 이러한 관찰의 빈도가 감소하였다.
주사 3개월 후와 6개월 후 사이의 미니-디스트로핀 양성 근육 섬유의 비교에서, 넙다리두갈래근의 경우 처리 아암들 사이의 유의한 차이가 드러나지 않았다. 횡경막에서는, 1×1014 vg/kg 용량에서 주사 3개월 후와 6개월 후 사이에 유의한 증가가 있었던 반면에, 심장 근육에서는, 1×1013, 3×1013, 및 1×1014 vg/kg 용량에서 2개의 시점 사이에 유의한 증가가 있었다.
특정한 고전적 DMD 관련 근육 병변의 발생률 및 정도가 처리군들 사이에서 다양하였다. 예를 들어, 벡터-처리 Dmd mdx 래트에서 비히클만 제공된 것에 비교하여 더 적은 괴사성 또는 퇴행성 섬유가 있었고, 새롭게 재생된 섬유가 모든 Dmd mdx 래트에서 관찰되었지만, 이의 개수는 벡터 용량이 증가함에 따라 감소하는 경향이 있었다.
악력 및 근육 피로 측정
비히클 또는 증가되는 용량의 벡터가 주사된 Dmd mdx 래트의 앞다리 악력을 주사 3 및 6개월 후에 테스트하였다. 비히클이 주사된 WT 래트가 음성 대조군으로서 포함되었다. 래트가 7-9주령일 때 주사하였고, 따라서 래트가 약 4.5 및 7.5개월령일 때 악력 테스트를 수행하였다. 최대 악력 및 피로 지표로서의 반복 시험 후의 악력 양쪽 모두를 측정하였다.
물질 및 방법
힘 변환기에 부착된 악력 측정기 (Bio-GT3, 프랑스의 바이오셉(BIOSEB))를 사용하여, T자형 막대기에 래트의 앞발을 놓고 래트가 잡은 것을 놓을 때까지 부드럽게 뒤로 잡아당길 때 생성된 최대 힘을 측정하였다. 각각의 테스트 사이의 짧은 대기 시간 (20-40초)으로 5회의 테스트를 순차적으로 수행하였고, 1차 결정과 최종 결정 사이의 강도 감소를 피로 지수로 취하였다. 결과는 그램 (g)으로 표현되고, 체중에 대해 정규화되었다 (g/g BW). 유전자형 및 처리 아암에 대해 맹검인 실험자에 의해 악력 테스트 측정을 수행하였다. 데이터는 평균 ± SEM로서 표시되고, 이를 비-파라미터 크루스칼-왈리스 테스트를 사용하여 통계적으로 평가하여, 군들 사이의 차이를 분석하였다. 유의한 전반적인 효과가 관찰된 경우, 군들 사이의 차이를 던 사후 검정을 사용하여 평가하였다. 프리드먼 검정에 이어서 던 사후 검정을 사용하여 악력 전개를 분석하였다. 모든 데이터 분석을 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 5 (그래프패드 소프트웨어 인크(GraphPad Software Inc.), 캘리포니아 라호야)를 사용하여 수행하였다. 도면에서, 95％, 99％, 및 99.9％의 신뢰 수준에서의 유의한 차이가 각각 1개, 2개 및 3개의 기호로 표현된다.
결과
주사 3개월 후에 희생된 래트에 대한 악력 테스트의 결과가 표 9 및 표 10에서 제공된다. 표 9에 나타난 바와 같이, 비히클-처리 Dmd mdx 래트는 비히클-처리 WT 래트에 비교하여 절대적 악력 강도 (즉, 체질량 차이에 대해 보정되지 않음)의 감소를 나타냈다 (24±2％의 감소). 대조적으로, 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트는 비히클-처리 Dmd mdx 래트 대조군에 비교하여 절대적 악력 강도의 용량-의존적 증가를 나타냈다. 2가지 최저 용량인 1×1013 및 3×1013 vg/kg에서는, 악력이 각각 13±7％ 및 24±8％만큼 증가하였지만, 통계적 유의성에는 도달하지 않은 한편, 2가지 최고 용량인 1×1014 및 3×1014 vg/kg에서는, 악력이 각각 40±9％ 및 55±6％만큼 증가하였고, 이는 통계적 유의성에 도달하였다 (각각 p<0.01 및 p<0.001). 표 9에 또한 나타난 바와 같이, 앞다리 악력이 체질량 차이에 대해 수정되었을 때, 양쪽 모두 비히클로 처리된 경우에 WT 래트와 Dmd mdx 래트의 악력 사이에 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 그러나, 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트와 비교하여 벡터-처리 Dmd mdx 래트의 상대적 악력에서의 용량-반응성 증가가 있었고, 이는 테스트된 2가지 최고 용량인 1×1014 및 3×1014 vg/kg에서 통계적 유의성에 도달하였다 (각각 27±8％ 증가, p<0.05, 및 39±6％ 증가, p<0.001).
5회의 가까운 간격의 반복 시험 동안 앞다리 악력을 또한 측정하여, Dmd mdx 래트 모델에서 발생하는 것으로 공지된 근육 피로에 벡터 처리가 영향을 미칠 수 있는 정도를 결정하였다. 도 42a에 나타난 바와 같이, 비히클-처리 Dmd mdx 래트는 1차 시험과 5차 시험 사이에 앞다리 강도의 현저한 감소를 나타낸 반면 (63±5％의 감소), 비히클로 처리된 WT 래트는 5차 시험 후에도 1차 시험 후만큼 강했고, 이는 이러한 모델에서 이전에 나타난 효과였다 (Larcher, et al., 2014).
대조적으로, 비히클로만 처리된 유사한 래트에 비교하여 벡터-처리 Dmd mdx 래트에서 용량-의존적 개선이 관찰되었다. 표 10에 지시된 바와 같이, 테스트된 2가지 최저 용량 (1×1013 및 3×1013 vg/kg)에서, 악력 강도의 감소가 나타나기 전에 지연이 있었고, 이는, 적어도 시험 초기에, 피로 감소를 시사한다. 그러나, 더 낮은 용량에서는, 5차 시험까지, 벡터-처리 Dmd mdx 래트와 비히클로만 처리된 Dmd mdx 래트의 악력 강도 사이에 통계적으로 유의한 차이가 여전히 없었다. 그럼에도 불구하고, 약해지는 악력 강도 감소를 향한 강한 경향이 이러한 더 낮은 용량에서도 명백하였다. 2가지 최고 용량인 1×1014 및 3×1014 vg/kg에서, Dmd mdx 래트는 비히클로 처리된 WT 래트에 비교하여 피로 정도에서 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않았다. 달리 말하면, 5회의 시험 후에, 이러한 벡터-처리 Dmd mdx 래트는 야생형과 구별가능하지 않았다. 실제로, 모든 시험에서, 최고 벡터 용량으로 처리된 Dmd mdx 래트의 평균 악력이 WT 대조군의 것보다 더 높았지만, 차이가 통계적으로 유의하지 않았다.
주사 6개월 후에 희생된 래트에 대한 악력 테스트의 결과가 표 11 및 표 12에서 제공된다. 표 11에 나타난 바와 같이, 비히클-처리 Dmd mdx 래트는 비히클-처리 WT 래트에 비교하여 악력 강도 (즉, 체질량 차이에 대해 보정되지 않음)의 감소를 나타냈다 (절대적 악력에서의 38±3％의 감소). 이러한 차이는 절대적 관점에서 측정했을 때는 통계적으로 유의하였지만, 상대적 관점에서 측정했을 때는 그렇지 않았다. 대조적으로, 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트는 비히클-처리 Dmd mdx 래트 대조군에 비교하여 절대적 악력 강도의 용량-의존적 증가를 나타냈다. 2가지 최저 용량인 1×1013 및 3×1013 vg/kg에서는, 악력이 각각 20±5％ 및 21±6％만큼 증가하였지만, 통계적 유의성에는 도달하지 않은 한편, 2가지 최고 용량인 1×1014 및 3×1014 vg/kg에서는, 악력이 각각 39±9％ 및 41±5％만큼 증가하였고, 이는 통계적 유의성에 도달하였다 (각각 p<0.05 및 p<0.01).
주사 3개월 후에 희생된 Dmd mdx 래트와 유사하게, 주사 6개월 후에 희생된 비히클-처리 Dmd mdx 래트 또한 1차 시험과 5차 시험 사이에 앞다리 강도의 실질적인 감소를 나타냈지만 (57±3％의 감소) (도 42b), 이러한 감소는 비히클로 처리된 WT 래트에서 나타난 5회의 시험에 걸친 약간의 악력 감소에 비교하여 통계적으로 유의하지 않았고, 이는 이러한 연구에서 수반된 작은 샘플 크기 때문일 가능성이 크다.
대조적으로, 비히클로만 처리된 유사한 래트에 비교하여 벡터-처리 Dmd mdx 래트에서 용량-의존적 개선이 관찰되었다. 표 12에 지시된 바와 같이, 2가지 최저 용량 (1×1013 및 3×1013 vg/kg)은 다회 시험에 걸친 악력 강도 감퇴에 유의하게 영향을 미치지 않은 한편, 2가지 최고 용량 (1×1014 및 3×1014 vg/kg)에서는, Dmd mdx 래트가 비히클로 처리된 WT 래트에 비교하여 피로 정도에서 통계적으로 유의한 차이를 나타냈다. 추가로, 최고 용량에서, 벡터-처리 Dmd mdx 래트의 악력이 모든 시험에서 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트보다 통계적으로 유의하게 더 높았다. 달리 말하면, 5회의 시험 후에, 이러한 벡터-처리 Dmd mdx 래트는 야생형과 구별가능하지 않았다. 실제로, 모든 시험에서, 최고 벡터 용량으로 처리된 Dmd mdx 래트의 평균 악력이 WT 대조군의 것보다 더 높았지만, 차이가 통계적으로 유의하지 않았다.
이러한 연구를 기초로, 주사 3 및 6개월 후 양쪽 모두에, 1×1014 vg/kg의 벡터 용량이 Dmd mdx 래트가 나타내는 악력 감소 및 가까운 간격의 다회 악력 테스트에 의해 야기된 근육 피로를 역전시키는데 충분하였음이 명백하다. 추가로, 3×1014 vg/kg의 벡터 용량은 실제로 Dmd mdx 래트에서의 악력 및 피로 저항성을 동일한 유전 배경의 WT 래트를 초과한 수준으로 개선시켰다.
<표 9>
4.5개월령 (주사 3개월 후)의 악력
<표 10>
4.5개월령 (주사 3개월 후)의 악력 피로
<표 11>
7.5개월령 (주사 6개월 후)의 악력
<표 12>
7.5개월령 (주사 6개월 후)의 악력 피로
심장 기능
Dmd mdx 래트 및 WT 대조군의 심장 기능을 주사 3 및 6개월 후 (각각 약 5 및 8개월령)에 테스트하여, 벡터 처리가 래트 DMD 모델에서의 근육 디스트로피 질환 진행의 심장에 대한 구조적 또는 기능적 효과를 개선시킬 수 있는지를 결정하였다. 2차원 심장초음파검사를 사용하여, 자유벽 확장기 두께, LV 확장기말 직경, LV 박출률, 및 E/A 비를 주사 3 및 6개월 후에 측정하였다.
물질 및 방법
심장초음파검사 측정을 유전자형 및 처리 아암에 대해 맹검인 실험자에에 의해 수행하였다. 비비드 7 디멘션(Vivid 7 Dimension) 초음파 (지이 헬스케어(GE Healthcare))와 14-MHz 변환기를 사용하여 테스트 동물에서 2차원 (2D) 심장초음파검사를 수행하였다. 가능한 리모델링을 관찰하기 위해, 좌심실 확장기말 직경 및 자유벽 확장기말 두께를 M-모드 심장초음파검사로 수득된 장축 및 단축 영상으로부터 확장기 동안 측정하였다. 박출률에 의해 수축기 기능을 평가하였고, 첨단부 4-챔버 배향으로 펄스형 도플러를 사용하여 심실 충만 속도의 경승모판 혈류를 측정함으로써 확장기 기능을 결정하여, E/A 비, 등용적 이완 시간, 및 E파 감속 시간 (하기에 추가로 설명되는 확장기 기능장애의 지표)을 결정하였다.
E/A 비는 심방 비우기 및 심실 충만의 2개의 단계 동안의 좌심방에서 좌심실로의 혈액 이동의 피크 속도의 비이다. 혈액은 2개의 단계로 좌심방에서 좌심실로 전달된다. 제1 단계에서, 이완성 심실에 의해 생성된 음성 압력으로 인해 승모판막이 개방될 때 좌심방 내의 혈액이 아래의 심실 내로 수동적으로 이동한다. 이러한 초기 작용 동안 혈액이 이동하는 속도가 "E" (초기) 심실 충만 속도로 칭해진다. 이후에, 좌심방이 수축하여 심방 내의 임의의 잔존 혈액을 박출하고, 이러한 단계에 혈액이 이동하는 속도가 "A" (심방) 심실 충만 속도로 칭해진다. E/A 비는 초기 (E) 대 후기 (A) 심실 충만 속도의 비이다. 건강한 심장에서는, E/A 비가 1을 초과한다. 그러나, 뒤시엔느 근육병증에서는, 좌심실 벽이 강직되어, 심실 이완을 감소시키고 심방혈을 잡아당김으로써, 초기 (E) 충만 속도를 느리게 하고 E/A 비를 저하시킨다. 등용적 이완 시간 (IVRT)은 대동맥 판막의 폐쇄와 승모판막 개방에 의한 심실 충만의 개시까지 사이의 간격, 또는 이완이 시작된 후 심실 충만이 시작할 때까지의 시간이다. 정상보다 긴 IVRT은 불량한 심실 이완을 나타내고, 이는 인간 DMD 환자 (RC Bahler et al., J Am Soc Echocardiogr 18(6), 666-73 (2005); LW Markham et al., J Am Soc Echocardiogr 19(7), 865-71 (2006)) 및 DMD 개 모델 (V Chetboul et al., Eur Heart J 25(21), 1934-39 (2004); V Chetboul et al., Am J Vet Res 65(10), 1335-41 (2004)) 양쪽 모두에서 기술되었으며, DMD와 연관된 확장 심근병증에 선행한다. 마지막으로, E파 감속 시간 (DT)은 피크 E 속도와 이의 기준선으로의 복귀 사이의 밀리세컨드 단위의 시간에 상응하고, 이의 증가는 확장기 기능장애의 지표이다.
결과
주사 3 및 6개월 후 양쪽 모두에, 양쪽 모두 비히클로 처리된 WT 래트와 Dmd mdx 래트 사이에 자유벽 확장기 두께의 유의한 차이가 없었고, 이는 이러한 측정이 이러한 모델에서의 검사된 나이에서의 질환 경과에 관하여 정보성이지 않았음을 나타낸다. 그러나, 주사 3개월 후는 아니지만, 주사 6개월 후에, WT 대조군에 비교하여 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트에서 증가되는 좌심실 확장기말 직경을 향한 경향이 있었고, 이는 Dmd mdx 래트가 벡터로 처리되었을 때 역전되었지만, 통계적 유의성에 도달하지 않았다 (도 43).
수축기 기능을 평가하기 위해, 좌심실 (LV) 박출률을 평가하였다. 주사 3개월 후에 Dmd mdx 래트에서 차이가 발견되지 않았지만, 주사 6개월 후에는, 비히클만 투여된 Dmd mdx 래트가 LV 박출률 감소를 나타냈고, 이는 벡터 처리에 의해 예방되었지만, 더 낮은 용량들 중 하나인 3×1013 vg/kg에서만 차이가 통계적으로 유의하였다 (도 44).
확장기 기능장애를 평가하기 위해, 도플러 심장초음파검사를 사용하여 초기 (E) 및 후기 확장기 (A) 속도, E/A 비, 등용적 이완 시간 (IVRT), 및 감속 시간 (DT)을 측정하였다. 주사 3개월 후, WT 대조군에 비교하여 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트에 대해 E/A 비의 통계적으로 유의한 감소가 있었고, 최고 벡터 용량인 3×1014 vg/kg로 처리된 Dmd mdx 래트에서 정상 E/A 비로의 회복을 시사하는 경향이 있었지만, 차이가 통계적 유의성에 도달하지 않았다 (도 45a). 주사 6개월 후, WT 대조군에 비교하여 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트의 E/A 비가 또한 유의하게 감소되었고, 이전 시점과 같이, 벡터의 약간의 치료 효과를 시사하는 경향이 있었지만, 데이터가 꽤 가변적이었고, 통계적 유의성에 도달하지 않았다 (도 45b).
주사 3개월 후, WT 대조군에 비교하여 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트에서 IVRT가 상승되었고, 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트에서 IVRT의 용량 반응성 감소를 시사하는 경향이 약간 있었지만, 데이터에서의 차이 중 어느 것도 통계적 유의성에 도달하지 않았다 (도 46a). 주사 6개월 후, 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트는 WT 대조군에 비교하여 IVRT가 유의하게 더 높았던 반면, 벡터 처리는 정상 수준으로의 IVRT 회복을 시사하는 경향을 강하게 초래하였고, 이는 최저 벡터 용량인 1×1013 vg/kg에서 통계적 유의성에 도달하였다 (도 46b).
마지막으로, 마취 프로토콜의 기술적 어려움으로 인해 나이든 래트에서만 DT를 측정할 수 있었다. 그러나, 주사 6개월 후에 검사했을 때, WT 대조군에 비교하여 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트에서 DT가 유의하게 상승되었고, 테스트된 모든 용량에서 벡터 처리 후 정상값으로의 복구를 향한 경향이 강하게 있었다 (도 47).
데이터 가변성에도 불구하고, 이러한 연구의 결과들은 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로의 처리에 의해 적어도 부분적으로 역전될 수 있는, 5 및 8개월령 Dmd mdx 래트의 심장에서의 확장기 기능장애의 존재를 강하게 시사한다.
혈액 화학
처리 전 및 희생 시점에, 래트로부터의 혈액 샘플을 취하고, 최후 분석용으로 저장하였다. 테스트를 수행하여, 요소, 크레아티닌, 알칼리성 포스파타제 (ALK), 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST), 락테이트 데히드로게나제 (LDH), 크레아틴 키나제 (CK), 트로포닌 I, 및 미니-디스트로핀 단백질 및 AAV9 캡시드에 대한 항체의 혈청 농도를 결정하였다. ALT, AST, CK, 및 LDH는 모두 손상된 근육 세포로부터 혈액 내로 방출되는 효소이고, 인간 DMD 환자에서 상승되는 것으로 공지되어 있다.
3개월 및 주사 6개월 후, 상이한 실험군들 사이에서 요소, 크레아티닌, ALK, 총혈청 단백질, 총 빌리루빈 및 트로포닌 I의 수준이 유의하게 상이하지 않았다. 대조적으로, AST, ALT, LDH 및 총 CK 수준은 WT 래트에 비교하여 비히클-처리 Dmd mdx 래트에서 모두 상승되었고, 다양한 정도로 벡터 처리에 반응하였다.
주사 3 및 6개월 후 양쪽 모두에, WT 래트에 비교하여 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트에서 AST 수준이 상승되었지만, 데이터 가변성으로 인해, 6개월 시점에만 유의성이 존재하였다. Dmd mdx 래트가 벡터로 처리되었을 때, (광범위한 개체간 가변성에도 불구하고) 더 낮은 AST 수준을 향한 경향이 주사 3개월 후에 1×1014 및 3×1014 vg/kg 용량 군에서, 그리고 주사 6개월 후에 3×1014 vg/kg 용량 군에서 관찰되었다. 또다시, 데이터 가변성으로 인해, 이러한 차이는 통계적 유의성에 도달하지 않았다. 이러한 결과가 주사 3개월 후 및 6개월 후 시점에 대한 데이터를 각각 보고하는 도 48a 및 도 48b에서 제시된다.
ALT, LDH, 및 총 CK 수준의 패턴 모두가 유사한 방식으로 나이 및 벡터 처리에 반응하였다. 주사 3개월 후, WT 래트에 비교하여 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트에서 ALT, LDH 및 총 CK 수준이 모두 유의하게 상승되었다. Dmd mdx 래트를 미니-디스트로핀 벡터로 처리하는 것이 비히클-처리 Dmd mdx 래트에 비교하여 ALT, LDH 및 총 CK 수준의 용량 반응성 감소를 시사하는 경향을 초래하였고, 이는 일부 경우에 통계적 유의성을 달성하였다. 이러한 결과들이 도 49a, 도 50a, 및 도 51a에서 각각 제시된다. 주사 6개월 후, WT 래트에 비교하여 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트에서 ALT 및 LDH의 수준 상승을 시사하는 데이터 경향이 있었고, 이는 테스트된 최고 벡터 용량에서 역전되었지만, 차이 중 어느 것도 통계적으로 유의하지 않았다. 이러한 결과들이 도 49b 및 도 50b에서 각각 제시된다. 대조적으로, 주사 3개월 후에 나타난 패턴과 유사하게, 주사 6개월 후에 WT 래트에 비교하여 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트에서 총 CK가 유의하게 상승되었고, 벡터 처리가 수준 감소를 향한 경향을 초래하였으며, 이는 테스트된 최고 벡터 용량에서 통계적 유의성을 달성하였다 (도 51b).
처리 아암에서의 총 CK 수준을 주사일 및 3 및 6개월 후에 또한 비교하였다. 도 52a 및 도 52b에 나타난 바와 같이, 비히클이 투여된 WT 래트에서는 혈액 총 CK 수준이 일관적으로 낮았던 한편, 비히클로만 처리된 것 및 최저 벡터 용량을 포함하여 모든 Dmd mdx 래트에서 CK 수준이 하락하였다. 대조적으로, 3 및 6개월 후의 CK 수준 감소가 3가지 최고 용량의 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트에 대해 훨씬 더 컸다. 이러한 관찰들은 대조군에 비교하여 상승된 CK 수준이 근육이 지방 및 섬유증 조직으로 교체되는 것으로 인해 질환이 진행됨에 따라 하락하는 인간에서의 DMD의 자연적인 경과와 일관되고, 테스트된 더 높은 벡터 용량에서의 용량-반응성 치료 효과와도 일관된다.
CK 동종효소의 차이가 또한 관찰되었다. 투약 전에, Dmd mdx 래트에서는 CK-MM 아이소형이 우세한 반면 (평균 >90％), WT 래트에서는 CK-MM 및 CK-BB 아이소형이 유사하였고 (평균 40-60％), CK-MB 수준이 WT에서 Dmd mdx 래트에서보다 더 높았다 (4-6％ 대 
1％). 주사 3 및 6개월 후, 1×1013 vg/kg을 초과하는 벡터 용량으로 처리된 Dmd mdx 래트가 CK-BB 아이소형의 비율의 약간의 증가 및 CK-MM 아이소형의 비율의 약간의 감소를 나타냈고, 용량-관련 효과를 향한 경향이 있었다. CK-MB 아이소형의 비율의 명확한 변경은 벡터-처리 Dmd mdx 래트에서 관찰되지 않았다.
면역학
AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트에서의 체액성 및 세포성 면역 반응을 처리 전 및 주사 3 및 6개월 후에 측정하였고, 음성 및 양성 대조군에 비교하였다. 비히클 또는 벡터 주사 전에, 그리고 주사 3개월 후의 안락사 시에 혈청 샘플을 수득하였다. T 세포 반응 분석용 비장세포를 주사 3 및 6개월 후의 안락사 시에 수확하였다.
미니-디스트로핀 단백질의 발현에 대한 체액성 반응을 테스트 동물로부터 수득되고 1:500 희석된 혈청의 웨스턴 블롯 분석에 의해 정량적으로 평가하였다. 비히클이 투여되었을 때, 또는 벡터가 제공되기 전에, WT든 또는 Dmd mdx 든 모든 래트로부터의 혈청이 미니-디스트로핀 단백질에 대한 항체에 대해 음성이었다. 대조적으로, 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트 대부분이, 심지어 1×1013 vg/kg의 최저 용량에서도, 웨스턴 블롯에서 미니-디스트로핀에 결합한 IgG 항체를 생산하였다. 주사 3개월 후에 희생된 Dmd mdx 래트의 80％-100％, 및 주사 6개월 후에 희생된 Dmd mdx 래트의 60％-100％가 용량에 의존적으로 미니-디스트로핀 단백질에 대해 특이적인 IgG를 생산하였다.
AAV9 벡터 캡시드에 대한 항체의 존재를 ELISA에 의해 테스트하였다. 비히클로 처리된 WT 및 Dmd mdx 래트로부터의 혈청은 AAV9와 반응한 검출가능한 IgG가 없었다. 대조적으로, 용량 또는 주사 3개월 후에 희생되었는지 또는 주사 6개월 후에 희생되었는지 여부와 관계 없이, 벡터로 처리된 모든 래트가 테스트된 최고 희석인 1:10240을 초과하는 역가로 항-AAV9 IgG를 생산하였다. 조도계를 사용하여 검출되는 LacZ 리포터 유전자를 발현하는 재조합 AAV9 벡터를 사용하는 세포 형질도입 억제 검정법으로 AAV9에 대한 중화 항체를 또한 테스트하였다. 역가는 형질도입을 >50％ 억제한 최저 희석으로서 정의되었다. 용량 또는 주사 3개월 후에 희생되었는지 또는 주사 6개월 후에 희생되었는지 여부와 관계 없이 벡터가 제공된 모든 Dmd mdx 래트로부터의 혈청에서 AAV9에 대한 중화 항체가 검출되었지만, 주사 전의 동일한 동물 또는 비히클만 제공된 WT 및 Dmd mdx 래트에서는 그렇지 않았다. 역가는 1:5000 내지 ≥ 1:500000 범위였고, 명확한 용량 효과는 없었다.
벡터에 대한 세포성 면역 반응의 존재를 비히클-처리 WT 및 Dmd mdx 래트, 및 벡터가 제공된 Dmd mdx 래트로부터 단리된 비장세포 상에서의 IFNγ ELISpot 검정법을 사용하여 평가하였다. 벡터 게놈에 의해 발현된 인간 미니-디스트로핀 단백질에 대한 T 세포 반응을 opti-dys3978 단백질의 전체 서열을 포괄하는 중첩 펩티드 은행 (아미노산 15개의 길이, 아미노산 10개의 중첩, 총 263개의 펩티드) 및 래트 특이적 IFNγ-ELISpotBASIC 키트 (맵텍(Mabtech)를 사용하여 테스트하였다. 음성 대조군은 미자극 비장세포로 이루어졌고, 양성 대조군은 미토겐 콘카나발린 A로 자극된 세포로 이루어졌다. IFNγ 분비를 106개의 세포 당 스폿-형성 세포 (SFC)의 개수로서 정량하였고, 양성 반응은 >50 SFC/106개의 세포 또는 음성 대조군에 대해 수득된 값의 적어도 3배로서 정의되었다. 3×1014 vg/kg의 최고 벡터 용량으로 처리된 Dmd mdx 래트로부터의 것을 포함하여 주사 3개월 또는 6개월 후에 임의의 테스트 동물로부터 수득된 비장 세포에서 미니-디스트로핀 단백질로부터 유래된 임의의 펩티드 서열에 대한 특이적 T 세포 반응이 확인되지 않았다.
AAV9 캡시드에 대한 T 세포 반응을 AAV9로부터 유래된 펩티드 서열 (3개의 풀로 분할된 아미노산 10개씩 중첩되는 15량체)에 대해 스크리닝된 IFNγ ELISpot 검정법을 사용하여 또한 테스트하였다. 주사 3개월 후에 희생된 벡터-처리 Dmd mdx 래트의 16％-60％, 및 주사 6개월 후에 희생된 벡터-처리 Dmd mdx 래트의 16％-66％에서 양성 IFNγ 반응이 있었고, 이는 벡터 용량과 양성으로 상관되었다. 대조적으로, 비히클로 처리된 모든 WT 및 Dmd mdx 래트는 AAV9 캡시드에 대한 T 세포 반응에 대해 음성이었다.
실시예 9
AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA로 처리된 더 나이든
Dmd
mdx
래트에서의 악력 강도
상기 실시예 8에 기술된 연구는 어린 7-9주령 래트에서 시작되었다. 이러한 실시예는 각각 4개월령 및 6개월령일 때 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 최초로 처리된 더 나이든 Dmd mdx 래트의 근육 기능 분석을 기술한다. 스프라그 돌리 래트의 평균 수명은 24-36개월이다. 이러한 실험의 목표는 Dmd mdx 래트 일생의 후기에 벡터로 처리하는 것이 효과적일 수 있는지를 결정하는 것이었다. 양성 결과는 더 나이든 인간 DMD 환자, 예컨대 나이가 많은 아동, 청소년, 또는 심지어 젊은 성인을 벡터로 치료하는 것이 이들의 근육 기능을 또한 개선시킬 수 있음을 시사할 것이다.
이러한 실시예에 기술된 실험은 실시예 8에 기술된 것과 유사한 물질 및 방법을 사용하여 수행되었다. 더욱 구체적으로, 4 및 6개월령의 Dmd mdx 래트 (각각의 나이 군에 대해 n=6)를 1×1014 vg/kg의 AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA 벡터로 따로따로 처리하였다. 음성 대조군으로서, 4개월 및 6개월령의 WT 래트 및 Dmd mdx 래트 (각각의 나이 군에 대해 n=6)를 비히클만으로 따로따로 처리하였다. 주사 3개월 후, 이전에 기술된 바와 같이 악력 강도에 대해 래트를 테스트하였다. 더 어린 래트와 같이, 최대 앞다리 악력 강도, 및 각각의 시험 사이의 대기시간 기간이 짧은 다회 반복 시험에 걸친 악력 강도를 테스트하였다. 후자의 테스트는 근육 피로를 측정하도록 의도되었다.
도 53a에 나타난 바와 같이, 주사 3개월 후, 4개월령에 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트의 최대 앞다리 악력 강도가 비히클로 처리된 4개월령의 WT 래트에 비교하여 평균적으로 약간 더 낮았지만, 차이가 통계적 유의성에 도달하지 않았다. 대조적으로, 4개월령에 1×1014 vg/kg 벡터를 주사한 Dmd mdx 래트는 동일한 나이에 비히클로만 처리된 Dmd mdx 래트보다 평균 최대 앞다리 악력 강도가 더 컸고, 차이가 통계적 유의성에 도달하였다. 벡터-처리 래트의 강도가 WT 래트보다도 더 컸지만, 차이가 통계적으로 유의하지 않았다. 도 53b에 나타난 바와 같이, 데이터가 체중에 대해 정규화되었을 때 결과가 유사하였다. 도 53a 및 도 53b에서, 기호 "¤¤"는 벡터 대 비히클-처리 Dmd mdx 래트 사이의 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다 (p<0.01).
근육 피로에 관하여, 도 53c에 나타난 바와 같이, 4개월에 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트는 2차 악력 테스트 후에 피로를 나타낸 반면, WT 래트는 4회의 테스트 후에도 피로를 나타내지 않았다. 대조적으로, 벡터로 처리된 4개월령의 Dmd mdx 래트는 1차와 5차 악력 테스트 사이에 최소 (존재하는 경우)의 근육 피로를 나타냈다. 또한 벡터-처리 Dmd mdx 래트는 비히클로 처리된 WT 래트에 비교하여 전반적으로 더 강한 것으로 보였다. 도 53c에서, 기호 "*"는 벡터-처리 Dmd mdx 래트와 비히클로 처리된 WT 래트 사이의 통계적으로 유의한 차이를 나타내고 (p<0.05); "¤¤"는 벡터 대 비히클-처리 Dmd mdx 래트 사이의 통계적으로 유의한 차이를 나타내며 (p<0.01); 및 "§§" 및 "§§§"는 1차 악력 테스트에 비교된 각각 4차 및 5차 악력 테스트의 비히클-처리 Dmd mdx 래트 사이의 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다 (각각 p<0.01 및 p<0.001).
도 54a에 나타난 바와 같이, 주사 3개월 후, 6개월령에 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트의 최대 앞다리 악력 강도가 비히클로 처리된 6개월령의 WT 래트에 비교하여 유의하게 더 낮았다. 도 54b에 나타난 바와 같이, 이러한 효과는 결과가 체중에 대해 정규화되었을 때에도 유지되었다. Dmd mdx 래트를 6개월령에 1×1014 vg/kg 벡터로 처리하는 것이 비히클로만 처리된 Dmd mdx 래트에 비교하여 평균 최대 앞다리 악력 강도를 증가시켰고, 체중에 대해 정규화되었을 때 차이가 통계적 유의성에 도달하였다 (도 54b). 도 54a 및 도 54b에서, 기초 "*" 및 "**"는 비히클-처리 Dmd mdx 래트와 WT 래트 사이의 통계적으로 유의한 차이를 나타내고 (각각 p<0.05 및 p<0.01); 및 "¤"는 벡터 대 비히클-처리 Dmd mdx 래트 사이의 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다 (p<0.05).
근육 피로에 관하여, 도 54c에 나타난 바와 같이, 6개월에 비히클로 처리된 Dmd mdx 래트는 2차 악력 테스트 후에 피로를 나타낸 반면, WT 래트는 4회의 테스트 후에도 피로를 나타내지 않았다. 4개월에 처리된 래트와 대조적으로, 벡터로 처리된 6개월령의 Dmd mdx 래트는 다회 악력 테스트에 걸쳐 약간의 강도 감소를 나타냈지만, 비히클-처리 대조군 Dmd mdx 래트로 나타난 것과 동일한 정도까지는 아니였다. 또한 4개월령에 처리된 래트로 수행된 테스트에 대조적으로, 실험 과정에 걸쳐 6개월에 벡터로 처리된 Dmd mdx 래트의 것보다 WT 래트의 강도가 더 큰 것으로 보였다. 도 54c에서, 기호 "**" 및 "***"는 벡터-처리 Dmd mdx 래트와 비히클로 처리된 WT 래트 사이의 통계적으로 유의한 차이를 나타내고 (각각 p<0.01 및 p<0.001); "¤"는 벡터 대 비히클-처리 Dmd mdx 래트 사이의 통계적으로 유의한 차이를 나타내며 (p<0.05); "§§"는 1차 악력 테스트에 비교된 5차 악력 테스트의 비히클-처리 Dmd mdx 래트 사이의 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다 (p<0.01).
<표 13>
서열표
상기는 본 발명을 예시하고, 이를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본 발명은 하기의 청구범위에 의해 정의되며, 청구범위의 등가물은 이에 포함된다.
SEQUENCE LISTING
<110> The University of North Carolina at Chapel Hill
Bamboo Therapeutics, Inc.
<120> Optimized Mini-dystrophin Genes and Expression Cassettes and
Their Use
<130> 5470-784
<150> US 62/352,675
<151> 2016-06-21
<150> US 62/516,449
<151> 2017-06-07
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3978
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hopti-Dys3978 gene
<400> 1
atgctttggt gggaggaagt ggaggactgc tacgagagag aggacgtgca gaagaaaacc 60
ttcaccaagt gggtgaacgc ccagttcagc aagttcggca agcagcacat cgagaacctg 120
ttcagcgacc tgcaggatgg caggagactg ctggacctgc tggagggcct gaccggccag 180
aagctgccca aggagaaggg cagcaccaga gtgcacgccc tgaacaacgt gaacaaggcc 240
ctgagagtgc tgcagaacaa caacgtggac ctggtgaaca tcggcagcac cgacatcgtg 300
gacggcaacc acaagctgac cctgggcctg atctggaaca tcatcctgca ctggcaggtg 360
aagaacgtga tgaagaacat catggccggc ctgcagcaga ccaacagcga gaagatcctg 420
ctgagctggg tgaggcagag caccagaaac tacccccagg tgaacgtgat caacttcacc 480
acctcctgga gcgacggcct ggccctgaac gccctgatcc acagccacag acccgacctg 540
ttcgactgga acagcgtggt gtgtcagcag agcgccaccc agagactgga gcacgccttc 600
aacatcgcca gataccagct gggcatcgag aagctgctgg accccgagga cgtggacacc 660
acctaccccg acaagaaaag catcctcatg tacattacca gcctgttcca ggtgctgccc 720
cagcaggtgt ccatcgaggc catccaggaa gtggaaatgc tgcccaggcc ccccaaagtg 780
accaaggagg agcacttcca gctgcaccac cagatgcact acagccagca gatcacagtg 840
agcctggccc agggctatga gagaaccagc agccccaagc ccagattcaa gagctacgcc 900
tacacccagg ccgcctacgt gaccacctcc gaccccacca gaagcccctt ccccagccag 960
cacctggagg cccccgagga caagagcttc ggcagcagcc tgatggagag cgaagtgaac 1020
ctggacagat accagaccgc cctggaggaa gtgctgtcct ggctgctgag cgccgaggac 1080
accctgcagg cccagggcga gatcagcaac gacgtggaag tggtgaagga ccagttccac 1140
acccacgagg gctacatgat ggatctgacc gcccaccagg gcagagtggg caatatcctg 1200
cagctgggca gcaagctgat cggcaccggc aagctgagcg aggacgagga gaccgaagtg 1260
caggagcaga tgaacctgct gaacagcaga tgggagtgcc tgagagtggc cagcatggag 1320
aagcagagca acctgcacag agtgctgatg gacctgcaga accagaagct gaaggagctg 1380
aacgactggc tgaccaagac cgaggagcgg accagaaaga tggaggagga gcccctgggc 1440
cccgacctgg aggacctgaa gagacaggtg cagcagcaca aagtgctgca ggaggacctg 1500
gagcaggagc aggtgcgcgt gaacagcctg acccacatgg tggtggtcgt ggacgagagc 1560
agcggcgacc acgccacagc cgccctggaa gagcagctga aagtgctggg cgacagatgg 1620
gccaatattt gtaggtggac cgaggacaga tgggtgctgc tgcaggacca gcccgacctg 1680
gcccctggcc tgaccaccat cggcgccagc cccacccaga ccgtgaccct ggtgacccag 1740
cccgtggtga caaaggagac cgccatcagc aagctggaga tgcccagctc cctgatgctg 1800
gaagtgccca cccaccgcct gctccagcag ttccccctgg acctggagaa gttcctggcc 1860
tggctgaccg aggccgaaac caccgccaat gtgctccagg acgccactag aaaggagagg 1920
ctgctggagg acagcaaggg cgtgaaagag ctgatgaagc agtggcagga tctgcagggc 1980
gaaatcgagg cccacaccga cgtgtaccac aacctggacg agaacagcca gaagattctg 2040
aggagcctgg agggcagcga cgacgccgtc ctgctccaga ggaggctgga caacatgaac 2100
ttcaagtgga gcgagctgcg gaagaagagc ctgaacatcc ggagccacct ggaagccagc 2160
agcgaccagt ggaagagact gcacctgagc ctgcaggagc tgctggtgtg gctgcagctg 2220
aaggacgacg agctgagcag acaggccccc atcggcggcg acttccccgc cgtgcagaag 2280
cagaacgacg tgcaccgggc cttcaagagg gagctgaaaa ccaaggaacc cgtgatcatg 2340
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gaccacccta agatgaccga gctgtatcag agcctggccg acctgaacaa tgtgcggttc 3060
agcgcctaca gaaccgccat gaagctgcgg agactgcaga aggccctgtg cctggatctg 3120
ctgagcctga gcgccgcctg cgacgccctg gaccagcaca acctgaagca gaatgaccag 3180
cccatggaca tcctgcagat catcaactgc ctgaccacaa tctacgaccg gctggaacag 3240
gagcacaaca acctggtgaa tgtgcccctg tgcgtggaca tgtgcctgaa ttggctgctg 3300
aacgtgtacg acaccggcag gaccggcaga atccgcgtgc tgagcttcaa gaccggcatc 3360
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tggatgaggc tggagcctca gagcatggtg tggctgcctg tgctgcacag agtggccgcc 3660
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ttccggtaca ggagcctgaa gcacttcaac tacgacatct gccagagctg ctttttcagc 3780
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<210> 2
<211> 3837
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hopti-Dys3837 gene
<400> 2
atgctttggt gggaggaagt ggaggactgc tacgagagag aggacgtgca gaagaaaacc 60
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aagaacgtga tgaagaacat catggccggc ctgcagcaga ccaacagcga gaagatcctg 420
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gccaatattt gtaggtggac cgaggacaga tgggtgctgc tgcaggacac ccaccgcctg 1680
ctccagcagt tccccctgga cctggagaag ttcctggcct ggctgaccga ggccgaaacc 1740
accgccaatg tgctccagga cgccactaga aaggagaggc tgctggagga cagcaagggc 1800
gtgaaagagc tgatgaagca gtggcaggat ctgcagggcg aaatcgaggc ccacaccgac 1860
gtgtaccaca acctggacga gaacagccag aagattctga ggagcctgga gggcagcgac 1920
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caggccccca tcggcggcga cttccccgcc gtgcagaagc agaacgacgt gcaccgggcc 2160
ttcaagaggg agctgaaaac caaggaaccc gtgatcatga gcaccctgga gacagtgcgg 2220
atcttcctga ccgagcagcc cctggaggga ctggagaagc tgtaccagga gcccagagag 2280
ctgccccccg aggagagagc ccagaacgtg accaggctgc tgagaaagca ggccgaggaa 2340
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gagaccctgg agagactcca ggaactgcag gaagccaccg acgagctgga cctgaagctg 2460
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gtgcccctgt gcgtggacat gtgcctgaat tggctgctga acgtgtacga caccggcagg 3180
accggcagaa tccgcgtgct gagcttcaag accggcatca tcagcctgtg caaggcccac 3240
ctggaggata agtaccgcta cctgttcaag caggtggcca gcagcaccgg cttctgcgat 3300
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gacttcgcca aagtgctgaa gaataagttc cggaccaagc ggtactttgc caagcacccc 3780
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<211> 3978
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Copti-Dys3978 gene
<400> 3
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ctgtcctggg tgcggcagag caccaggaac tacccccagg tcaacgtgat caacttcacc 480
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aaagacgacg agctgtccag gcaggccccc atcggcggcg acttccccgc cgtgcagaaa 2280
cagaacgacg tgcacagggc cttcaagcgg gagctgaaaa ccaaagagcc cgtgatcatg 2340
agcaccctgg aaaccgtgag gatcttcctg accgagcagc ccctggaagg actggaaaag 2400
ctgtaccagg aacccagaga gctgcccccc gaggaacggg cccagaacgt gaccaggctg 2460
ctgagaaagc aggccgagga agtgaacacc gagtgggaga agctgaacct gcactccgcc 2520
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acctccggcg aggacgtgag ggacttcgcc aaggtgctga agaataagtt ccggaccaag 3900
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<213> Artificial Sequence
<220>
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ccagtgagca agtcagccct tggggcagcc catacaaggc catggggctg ggcaagctgc 540
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<213> Artificial Sequence
<220>
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Gln Lys Lys Thr Phe Thr Lys Trp Val Asn Ala Gln Phe Ser Lys Phe
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Gly Lys Gln His Ile Glu Asn Leu Phe Ser Asp Leu Gln Asp Gly Arg
35 40 45
Arg Leu Leu Asp Leu Leu Glu Gly Leu Thr Gly Gln Lys Leu Pro Lys
50 55 60
Glu Lys Gly Ser Thr Arg Val His Ala Leu Asn Asn Val Asn Lys Ala
65 70 75 80
Leu Arg Val Leu Gln Asn Asn Asn Val Asp Leu Val Asn Ile Gly Ser
85 90 95
Thr Asp Ile Val Asp Gly Asn His Lys Leu Thr Leu Gly Leu Ile Trp
100 105 110
Asn Ile Ile Leu His Trp Gln Val Lys Asn Val Met Lys Asn Ile Met
115 120 125
Ala Gly Leu Gln Gln Thr Asn Ser Glu Lys Ile Leu Leu Ser Trp Val
130 135 140
Arg Gln Ser Thr Arg Asn Tyr Pro Gln Val Asn Val Ile Asn Phe Thr
145 150 155 160
Thr Ser Trp Ser Asp Gly Leu Ala Leu Asn Ala Leu Ile His Ser His
165 170 175
Arg Pro Asp Leu Phe Asp Trp Asn Ser Val Val Cys Gln Gln Ser Ala
180 185 190
Thr Gln Arg Leu Glu His Ala Phe Asn Ile Ala Arg Tyr Gln Leu Gly
195 200 205
Ile Glu Lys Leu Leu Asp Pro Glu Asp Val Asp Thr Thr Tyr Pro Asp
210 215 220
Lys Lys Ser Ile Leu Met Tyr Ile Thr Ser Leu Phe Gln Val Leu Pro
225 230 235 240
Gln Gln Val Ser Ile Glu Ala Ile Gln Glu Val Glu Met Leu Pro Arg
245 250 255
Pro Pro Lys Val Thr Lys Glu Glu His Phe Gln Leu His His Gln Met
260 265 270
His Tyr Ser Gln Gln Ile Thr Val Ser Leu Ala Gln Gly Tyr Glu Arg
275 280 285
Thr Ser Ser Pro Lys Pro Arg Phe Lys Ser Tyr Ala Tyr Thr Gln Ala
290 295 300
Ala Tyr Val Thr Thr Ser Asp Pro Thr Arg Ser Pro Phe Pro Ser Gln
305 310 315 320
His Leu Glu Ala Pro Glu Asp Lys Ser Phe Gly Ser Ser Leu Met Glu
325 330 335
Ser Glu Val Asn Leu Asp Arg Tyr Gln Thr Ala Leu Glu Glu Val Leu
340 345 350
Ser Trp Leu Leu Ser Ala Glu Asp Thr Leu Gln Ala Gln Gly Glu Ile
355 360 365
Ser Asn Asp Val Glu Val Val Lys Asp Gln Phe His Thr His Glu Gly
370 375 380
Tyr Met Met Asp Leu Thr Ala His Gln Gly Arg Val Gly Asn Ile Leu
385 390 395 400
Gln Leu Gly Ser Lys Leu Ile Gly Thr Gly Lys Leu Ser Glu Asp Glu
405 410 415
Glu Thr Glu Val Gln Glu Gln Met Asn Leu Leu Asn Ser Arg Trp Glu
420 425 430
Cys Leu Arg Val Ala Ser Met Glu Lys Gln Ser Asn Leu His Arg Val
435 440 445
Leu Met Asp Leu Gln Asn Gln Lys Leu Lys Glu Leu Asn Asp Trp Leu
450 455 460
Thr Lys Thr Glu Glu Arg Thr Arg Lys Met Glu Glu Glu Pro Leu Gly
465 470 475 480
Pro Asp Leu Glu Asp Leu Lys Arg Gln Val Gln Gln His Lys Val Leu
485 490 495
Gln Glu Asp Leu Glu Gln Glu Gln Val Arg Val Asn Ser Leu Thr His
500 505 510
Met Val Val Val Val Asp Glu Ser Ser Gly Asp His Ala Thr Ala Ala
515 520 525
Leu Glu Glu Gln Leu Lys Val Leu Gly Asp Arg Trp Ala Asn Ile Cys
530 535 540
Arg Trp Thr Glu Asp Arg Trp Val Leu Leu Gln Asp Gln Pro Asp Leu
545 550 555 560
Ala Pro Gly Leu Thr Thr Ile Gly Ala Ser Pro Thr Gln Thr Val Thr
565 570 575
Leu Val Thr Gln Pro Val Val Thr Lys Glu Thr Ala Ile Ser Lys Leu
580 585 590
Glu Met Pro Ser Ser Leu Met Leu Glu Val Pro Thr His Arg Leu Leu
595 600 605
Gln Gln Phe Pro Leu Asp Leu Glu Lys Phe Leu Ala Trp Leu Thr Glu
610 615 620
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Leu Leu Glu Asp Ser Lys Gly Val Lys Glu Leu Met Lys Gln Trp Gln
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Asp Leu Gln Gly Glu Ile Glu Ala His Thr Asp Val Tyr His Asn Leu
660 665 670
Asp Glu Asn Ser Gln Lys Ile Leu Arg Ser Leu Glu Gly Ser Asp Asp
675 680 685
Ala Val Leu Leu Gln Arg Arg Leu Asp Asn Met Asn Phe Lys Trp Ser
690 695 700
Glu Leu Arg Lys Lys Ser Leu Asn Ile Arg Ser His Leu Glu Ala Ser
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Ser Asp Gln Trp Lys Arg Leu His Leu Ser Leu Gln Glu Leu Leu Val
725 730 735
Trp Leu Gln Leu Lys Asp Asp Glu Leu Ser Arg Gln Ala Pro Ile Gly
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Gly Asp Phe Pro Ala Val Gln Lys Gln Asn Asp Val His Arg Ala Phe
755 760 765
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Thr Val Arg Ile Phe Leu Thr Glu Gln Pro Leu Glu Gly Leu Glu Lys
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<213> Artificial Sequence
<220>
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625 630 635 640
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645 650 655
Ser Glu Leu Arg Lys Lys Ser Leu Asn Ile Arg Ser His Leu Glu Ala
660 665 670
Ser Ser Asp Gln Trp Lys Arg Leu His Leu Ser Leu Gln Glu Leu Leu
675 680 685
Val Trp Leu Gln Leu Lys Asp Asp Glu Leu Ser Arg Gln Ala Pro Ile
690 695 700
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Phe Lys Arg Glu Leu Lys Thr Lys Glu Pro Val Ile Met Ser Thr Leu
725 730 735
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740 745 750
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755 760 765
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835 840 845
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850 855 860
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV vector genome with Hopti-Dys3978 gene
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ggccggcctg cagcagacca acagcgagaa gatcctgctg agctgggtga ggcagagcac 1200
cagaaactac ccccaggtga acgtgatcaa cttcaccacc tcctggagcg acggcctggc 1260
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cacctccgac cccaccagaa gccccttccc cagccagcac ctggaggccc ccgaggacaa 1740
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caccggcaag ctgagcgagg acgaggagac cgaagtgcag gagcagatga acctgctgaa 2040
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cctggaagag cagctgaaag tgctgggcga cagatgggcc aatatttgta ggtggaccga 2400
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gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caa 4953
<210> 10
<211> 4812
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV vector genome with Hopti-Dys3837 gene
<400> 10
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcctagatc tgaattcggt accccactac gggtttaggc 180
tgcccatgta aggaggcaag gcctggggac acccgagatg cctggttata attaacccag 240
acatgtggct gccccccccc cccccaacac ctgctgcctc taaaaataac cctgtccctg 300
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acccaggggc acaggggctg ccctcattct accaccacct ccacagcaca gacagacact 720
caggagccag ccagcgtcga gcggccgatc cgccaccatg ctttggtggg aggaagtgga 780
ggactgctac gagagagagg acgtgcagaa gaaaaccttc accaagtggg tgaacgccca 840
gttcagcaag ttcggcaagc agcacatcga gaacctgttc agcgacctgc aggatggcag 900
gagactgctg gacctgctgg agggcctgac cggccagaag ctgcccaagg agaagggcag 960
caccagagtg cacgccctga acaacgtgaa caaggccctg agagtgctgc agaacaacaa 1020
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gggcctgatc tggaacatca tcctgcactg gcaggtgaag aacgtgatga agaacatcat 1140
ggccggcctg cagcagacca acagcgagaa gatcctgctg agctgggtga ggcagagcac 1200
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catcgagaag ctgctggacc ccgaggacgt ggacaccacc taccccgaca agaaaagcat 1440
cctcatgtac attaccagcc tgttccaggt gctgccccag caggtgtcca tcgaggccat 1500
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gcaccaccag atgcactaca gccagcagat cacagtgagc ctggcccagg gctatgagag 1620
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cacctccgac cccaccagaa gccccttccc cagccagcac ctggaggccc ccgaggacaa 1740
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cagcaacgac gtggaagtgg tgaaggacca gttccacacc cacgagggct acatgatgga 1920
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caccggcaag ctgagcgagg acgaggagac cgaagtgcag gagcagatga acctgctgaa 2040
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<210> 11
<211> 4965
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV vector genome with Hopti-Dys3837 gene
<400> 11
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
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cgacagatgg gccaatattt gtaggtggac cgaggacaga tgggtgctgc tgcaggacac 2580
ccaccgcctg ctccagcagt tccccctgga cctggagaag ttcctggcct ggctgaccga 2640
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ggagcctcag agcatggtgt ggctgcctgt gctgcacaga gtggccgccg ccgagaccgc 4440
caagcaccag gccaagtgca atatctgcaa ggagtgcccc atcatcggct tccggtacag 4500
gagcctgaag cacttcaact acgacatctg ccagagctgc tttttcagcg gcagagtggc 4560
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ggatgtgaga gacttcgcca aagtgctgaa gaataagttc cggaccaagc ggtactttgc 4680
caagcacccc aggatgggct acctgcccgt gcagaccgtg ctggaaggcg acaacatgga 4740
gacctgatga ggagctcgag aggcctaata aagagctcag atgcatcgat cagagtgtgt 4800
tggttttttg tgtgagatct aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg 4860
cgctcgctcg ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg 4920
cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaa 4965
<210> 12
<211> 4955
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV vector genome with Copti-Dys3978 gene
<400> 12
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcctcagat ctgaattcgg taccccacta cgggtttagg 180
ctgcccatgt aaggaggcaa ggcctgggga cacccgagat gcctggttat aattaaccca 240
gacatgtggc tgcccccccc ccccccaaca cctgctgcct ctaaaaataa ccctgtccct 300
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gagctgatga agcagtggca ggacctgcag ggggagattg aggcccacac cgacgtgtac 2760
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cggatcaggg tgctgtcctt caagaccggc atcatcagcc tgtgcaaggc ccacctggaa 4140
gataagtacc gctacctgtt caagcaggtg gccagctcta ccggcttctg cgaccagcgg 4200
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tccttcggcg gcagcaacat cgagcccagc gtgcggagct gcttccagtt cgccaacaac 4320
aagcccgaga tcgaggccgc cctgttcctg gactggatgc ggctggaacc ccagagcatg 4380
gtctggctgc ccgtgctgca cagagtggct gccgccgaga ccgccaagca ccaggccaag 4440
tgcaacatct gcaaagagtg ccccatcatc ggcttcaggt acagaagcct gaagcacttc 4500
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cactacccca tggtggagta ctgcaccccc accacctccg gcgaggacgt gagggacttc 4620
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ggctacctgc ccgtgcagac cgtgctggaa ggcgacaaca tggaaacctg ataacacgcg 4740
tcgactcgag aggcctaata aagagctcag atgcatcgat cagagtgtgt tggttttttg 4800
tgtgagatct aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg 4860
ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca 4920
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<210> 13
<211> 736
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<213> adeno-associated virus 9
<400> 13
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1 5 10 15
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20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
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Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
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Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195 200 205
Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn
260 265 270
Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg
275 280 285
Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn
290 295 300
Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile
305 310 315 320
Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn
325 330 335
Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu
340 345 350
Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro
355 360 365
Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp
370 375 380
Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe
385 390 395 400
Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu
405 410 415
Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu
420 425 430
Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser
435 440 445
Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser
450 455 460
Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro
465 470 475 480
Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn
485 490 495
Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn
500 505 510
Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys
515 520 525
Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly
530 535 540
Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile
545 550 555 560
Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser
565 570 575
Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln
580 585 590
Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln
595 600 605
Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His
610 615 620
Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met
625 630 635 640
Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala
645 650 655
Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr
660 665 670
Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln
675 680 685
Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn
690 695 700
Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val
705 710 715 720
Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
725 730 735
<210> 14
<211> 145
<212> DNA
<213> adeno-associated virus 2
<400> 14
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcct 145
<210> 15
<211> 145
<212> DNA
<213> adeno-associated virus 2
<400> 15
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag agagggagtg gccaa 145
<210> 16
<211> 577
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic enhancer and promoter
<400> 16
ccactacggg tctaggctgc ccatgtaagg aggcaaggcc tggggacacc cgagatgcct 60
ggttataatt aacccagaca tgtggctgcc cccccccccc ccaacacctg ctgcctctaa 120
aaataaccct gtccctggtg gatcccctgc atgcgaagat cttcgaacaa ggctgtgggg 180
gactgagggc aggctgtaac aggcttgggg gccagggctt atacgtgcct gggactccca 240
aagtattact gttccatgtt cccggcgaag ggccagctgt cccccgccag ctagactcag 300
cacttagttt aggaaccagt gagcaagtca gcccttgggg cagcccatac aaggccatgg 360
ggctgggcaa gctgcacgcc tgggtccggg gtgggcacgg tgcccgggca acgagctgaa 420
agctcatctg ctctcagggg cccctccctg gggacagccc ctcctggcta gtcacaccct 480
gtaggctcct ctatataacc caggggcaca ggggctgccc tcattctacc accacctcca 540
cagcacagac agacactcag gagccagcca gcgtcga 577
<210> 17
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic transcription terminator
<400> 17
aggcctaata aagagctcag atgcatcgat cagagtgtgt tggttttttg tgtg 54
<210> 18
<211> 4955
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV vector genome with Hopti-Dys3978 gene
<400> 18
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcctcagat ctgaattcgg taccccacta cgggtctagg 180
ctgcccatgt aaggaggcaa ggcctgggga cacccgagat gcctggttat aattaaccca 240
gacatgtggc tgcccccccc ccccccaaca cctgctgcct ctaaaaataa ccctgtccct 300
ggtggatccc ctgcatgcga agatcttcga acaaggctgt gggggactga gggcaggctg 360
taacaggctt gggggccagg gcttatacgt gcctgggact cccaaagtat tactgttcca 420
tgttcccggc gaagggccag ctgtcccccg ccagctagac tcagcactta gtttaggaac 480
cagtgagcaa gtcagccctt ggggcagccc atacaaggcc atggggctgg gcaagctgca 540
cgcctgggtc cggggtgggc acggtgcccg ggcaacgagc tgaaagctca tctgctctca 600
ggggcccctc cctggggaca gcccctcctg gctagtcaca ccctgtaggc tcctctatat 660
aacccagggg cacaggggct gccctcattc taccaccacc tccacagcac agacagacac 720
tcaggagcca gccagcgtcg agcggccgat ccgccaccat gctttggtgg gaggaagtgg 780
aggactgcta cgagagagag gacgtgcaga agaaaacctt caccaagtgg gtgaacgccc 840
agttcagcaa gttcggcaag cagcacatcg agaacctgtt cagcgacctg caggatggca 900
ggagactgct ggacctgctg gagggcctga ccggccagaa gctgcccaag gagaagggca 960
gcaccagagt gcacgccctg aacaacgtga acaaggccct gagagtgctg cagaacaaca 1020
acgtggacct ggtgaacatc ggcagcaccg acatcgtgga cggcaaccac aagctgaccc 1080
tgggcctgat ctggaacatc atcctgcact ggcaggtgaa gaacgtgatg aagaacatca 1140
tggccggcct gcagcagacc aacagcgaga agatcctgct gagctgggtg aggcagagca 1200
ccagaaacta cccccaggtg aacgtgatca acttcaccac ctcctggagc gacggcctgg 1260
ccctgaacgc cctgatccac agccacagac ccgacctgtt cgactggaac agcgtggtgt 1320
gtcagcagag cgccacccag agactggagc acgccttcaa catcgccaga taccagctgg 1380
gcatcgagaa gctgctggac cccgaggacg tggacaccac ctaccccgac aagaaaagca 1440
tcctcatgta cattaccagc ctgttccagg tgctgcccca gcaggtgtcc atcgaggcca 1500
tccaggaagt ggaaatgctg cccaggcccc ccaaagtgac caaggaggag cacttccagc 1560
tgcaccacca gatgcactac agccagcaga tcacagtgag cctggcccag ggctatgaga 1620
gaaccagcag ccccaagccc agattcaaga gctacgccta cacccaggcc gcctacgtga 1680
ccacctccga ccccaccaga agccccttcc ccagccagca cctggaggcc cccgaggaca 1740
agagcttcgg cagcagcctg atggagagcg aagtgaacct ggacagatac cagaccgccc 1800
tggaggaagt gctgtcctgg ctgctgagcg ccgaggacac cctgcaggcc cagggcgaga 1860
tcagcaacga cgtggaagtg gtgaaggacc agttccacac ccacgagggc tacatgatgg 1920
atctgaccgc ccaccagggc agagtgggca atatcctgca gctgggcagc aagctgatcg 1980
gcaccggcaa gctgagcgag gacgaggaga ccgaagtgca ggagcagatg aacctgctga 2040
acagcagatg ggagtgcctg agagtggcca gcatggagaa gcagagcaac ctgcacagag 2100
tgctgatgga cctgcagaac cagaagctga aggagctgaa cgactggctg accaagaccg 2160
aggagcggac cagaaagatg gaggaggagc ccctgggccc cgacctggag gacctgaaga 2220
gacaggtgca gcagcacaaa gtgctgcagg aggacctgga gcaggagcag gtgcgcgtga 2280
acagcctgac ccacatggtg gtggtcgtgg acgagagcag cggcgaccac gccacagccg 2340
ccctggaaga gcagctgaaa gtgctgggcg acagatgggc caatatttgt aggtggaccg 2400
aggacagatg ggtgctgctg caggaccagc ccgacctggc ccctggcctg accaccatcg 2460
gcgccagccc cacccagacc gtgaccctgg tgacccagcc cgtggtgaca aaggagaccg 2520
ccatcagcaa gctggagatg cccagctccc tgatgctgga agtgcccacc caccgcctgc 2580
tccagcagtt ccccctggac ctggagaagt tcctggcctg gctgaccgag gccgaaacca 2640
ccgccaatgt gctccaggac gccactagaa aggagaggct gctggaggac agcaagggcg 2700
tgaaagagct gatgaagcag tggcaggatc tgcagggcga aatcgaggcc cacaccgacg 2760
tgtaccacaa cctggacgag aacagccaga agattctgag gagcctggag ggcagcgacg 2820
acgccgtcct gctccagagg aggctggaca acatgaactt caagtggagc gagctgcgga 2880
agaagagcct gaacatccgg agccacctgg aagccagcag cgaccagtgg aagagactgc 2940
acctgagcct gcaggagctg ctggtgtggc tgcagctgaa ggacgacgag ctgagcagac 3000
aggcccccat cggcggcgac ttccccgccg tgcagaagca gaacgacgtg caccgggcct 3060
tcaagaggga gctgaaaacc aaggaacccg tgatcatgag caccctggag acagtgcgga 3120
tcttcctgac cgagcagccc ctggagggac tggagaagct gtaccaggag cccagagagc 3180
tgccccccga ggagagagcc cagaacgtga ccaggctgct gagaaagcag gccgaggaag 3240
tgaataccga gtgggagaag ctgaatctgc acagcgccga ctggcagaga aagatcgacg 3300
agaccctgga gagactccag gaactgcagg aagccaccga cgagctggac ctgaagctga 3360
gacaggccga agtgatcaag ggcagctggc agcctgtggg cgatctgctg atcgactccc 3420
tgcaggatca cctggagaaa gtgaaggccc tgcggggcga gatcgccccc ctgaaggaga 3480
atgtgagcca cgtgaacgac ctggccagac agctgaccac cctgggcatc cagctgagcc 3540
cctacaacct gagcacactg gaggatctga acacccggtg gaaactgctg caggtggccg 3600
tggaggatag agtgaggcag ctgcacgaag cccacagaga cttcggccct gcctcccagc 3660
acttcctgag caccagcgtg cagggcccct gggagagagc catctccccc aacaaagtgc 3720
cctactacat caaccacgag acccagacca cctgctggga ccaccctaag atgaccgagc 3780
tgtatcagag cctggccgac ctgaacaatg tgcggttcag cgcctacaga accgccatga 3840
agctgcggag actgcagaag gccctgtgcc tggatctgct gagcctgagc gccgcctgcg 3900
acgccctgga ccagcacaac ctgaagcaga atgaccagcc catggacatc ctgcagatca 3960
tcaactgcct gaccacaatc tacgaccggc tggaacagga gcacaacaac ctggtgaatg 4020
tgcccctgtg cgtggacatg tgcctgaatt ggctgctgaa cgtgtacgac accggcagga 4080
ccggcagaat ccgcgtgctg agcttcaaga ccggcatcat cagcctgtgc aaggcccacc 4140
tggaggataa gtaccgctac ctgttcaagc aggtggccag cagcaccggc ttctgcgatc 4200
agaggagact gggcctgctg ctgcacgata gcatccagat ccctaggcag ctgggcgaag 4260
tggccagctt tggcggcagc aacatcgagc cctctgtgag gagctgcttc cagttcgcca 4320
acaacaagcc cgagatcgag gccgccctgt tcctggactg gatgaggctg gagcctcaga 4380
gcatggtgtg gctgcctgtg ctgcacagag tggccgccgc cgagaccgcc aagcaccagg 4440
ccaagtgcaa tatctgcaag gagtgcccca tcatcggctt ccggtacagg agcctgaagc 4500
acttcaacta cgacatctgc cagagctgct ttttcagcgg cagagtggcc aagggccaca 4560
aaatgcacta ccccatggtg gagtactgca cccccaccac ctccggcgag gatgtgagag 4620
acttcgccaa agtgctgaag aataagttcc ggaccaagcg gtactttgcc aagcacccca 4680
ggatgggcta cctgcccgtg cagaccgtgc tggaaggcga caacatggag acctgatgag 4740
gagctcgaga ggcctaataa agagctcaga tgcatcgatc agagtgtgtt ggttttttgt 4800
gtgagatctg aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg 4860
ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca 4920
gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaa 4955
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 19
ccaacaaagt gccctactac atc 23
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 20
ggttgtgctg gtccagggcg t 21
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 21
ccgagctgta tcagagcctg gcc 23
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 22
gcgaaagtgg aaaagccaag t 21
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 23
gccacatcaa caggactctt gtag 24
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 24
caaagcctaa aagacagcgg caagttgaat 30
<210> 25
<211> 3685
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
Met Leu Trp Trp Glu Glu Val Glu Asp Cys Tyr Glu Arg Glu Asp Val
1 5 10 15
Gln Lys Lys Thr Phe Thr Lys Trp Val Asn Ala Gln Phe Ser Lys Phe
20 25 30
Gly Lys Gln His Ile Glu Asn Leu Phe Ser Asp Leu Gln Asp Gly Arg
35 40 45
Arg Leu Leu Asp Leu Leu Glu Gly Leu Thr Gly Gln Lys Leu Pro Lys
50 55 60
Glu Lys Gly Ser Thr Arg Val His Ala Leu Asn Asn Val Asn Lys Ala
65 70 75 80
Leu Arg Val Leu Gln Asn Asn Asn Val Asp Leu Val Asn Ile Gly Ser
85 90 95
Thr Asp Ile Val Asp Gly Asn His Lys Leu Thr Leu Gly Leu Ile Trp
100 105 110
Asn Ile Ile Leu His Trp Gln Val Lys Asn Val Met Lys Asn Ile Met
115 120 125
Ala Gly Leu Gln Gln Thr Asn Ser Glu Lys Ile Leu Leu Ser Trp Val
130 135 140
Arg Gln Ser Thr Arg Asn Tyr Pro Gln Val Asn Val Ile Asn Phe Thr
145 150 155 160
Thr Ser Trp Ser Asp Gly Leu Ala Leu Asn Ala Leu Ile His Ser His
165 170 175
Arg Pro Asp Leu Phe Asp Trp Asn Ser Val Val Cys Gln Gln Ser Ala
180 185 190
Thr Gln Arg Leu Glu His Ala Phe Asn Ile Ala Arg Tyr Gln Leu Gly
195 200 205
Ile Glu Lys Leu Leu Asp Pro Glu Asp Val Asp Thr Thr Tyr Pro Asp
210 215 220
Lys Lys Ser Ile Leu Met Tyr Ile Thr Ser Leu Phe Gln Val Leu Pro
225 230 235 240
Gln Gln Val Ser Ile Glu Ala Ile Gln Glu Val Glu Met Leu Pro Arg
245 250 255
Pro Pro Lys Val Thr Lys Glu Glu His Phe Gln Leu His His Gln Met
260 265 270
His Tyr Ser Gln Gln Ile Thr Val Ser Leu Ala Gln Gly Tyr Glu Arg
275 280 285
Thr Ser Ser Pro Lys Pro Arg Phe Lys Ser Tyr Ala Tyr Thr Gln Ala
290 295 300
Ala Tyr Val Thr Thr Ser Asp Pro Thr Arg Ser Pro Phe Pro Ser Gln
305 310 315 320
His Leu Glu Ala Pro Glu Asp Lys Ser Phe Gly Ser Ser Leu Met Glu
325 330 335
Ser Glu Val Asn Leu Asp Arg Tyr Gln Thr Ala Leu Glu Glu Val Leu
340 345 350
Ser Trp Leu Leu Ser Ala Glu Asp Thr Leu Gln Ala Gln Gly Glu Ile
355 360 365
Ser Asn Asp Val Glu Val Val Lys Asp Gln Phe His Thr His Glu Gly
370 375 380
Tyr Met Met Asp Leu Thr Ala His Gln Gly Arg Val Gly Asn Ile Leu
385 390 395 400
Gln Leu Gly Ser Lys Leu Ile Gly Thr Gly Lys Leu Ser Glu Asp Glu
405 410 415
Glu Thr Glu Val Gln Glu Gln Met Asn Leu Leu Asn Ser Arg Trp Glu
420 425 430
Cys Leu Arg Val Ala Ser Met Glu Lys Gln Ser Asn Leu His Arg Val
435 440 445
Leu Met Asp Leu Gln Asn Gln Lys Leu Lys Glu Leu Asn Asp Trp Leu
450 455 460
Thr Lys Thr Glu Glu Arg Thr Arg Lys Met Glu Glu Glu Pro Leu Gly
465 470 475 480
Pro Asp Leu Glu Asp Leu Lys Arg Gln Val Gln Gln His Lys Val Leu
485 490 495
Gln Glu Asp Leu Glu Gln Glu Gln Val Arg Val Asn Ser Leu Thr His
500 505 510
Met Val Val Val Val Asp Glu Ser Ser Gly Asp His Ala Thr Ala Ala
515 520 525
Leu Glu Glu Gln Leu Lys Val Leu Gly Asp Arg Trp Ala Asn Ile Cys
530 535 540
Arg Trp Thr Glu Asp Arg Trp Val Leu Leu Gln Asp Ile Leu Leu Lys
545 550 555 560
Trp Gln Arg Leu Thr Glu Glu Gln Cys Leu Phe Ser Ala Trp Leu Ser
565 570 575
Glu Lys Glu Asp Ala Val Asn Lys Ile His Thr Thr Gly Phe Lys Asp
580 585 590
Gln Asn Glu Met Leu Ser Ser Leu Gln Lys Leu Ala Val Leu Lys Ala
595 600 605
Asp Leu Glu Lys Lys Lys Gln Ser Met Gly Lys Leu Tyr Ser Leu Lys
610 615 620
Gln Asp Leu Leu Ser Thr Leu Lys Asn Lys Ser Val Thr Gln Lys Thr
625 630 635 640
Glu Ala Trp Leu Asp Asn Phe Ala Arg Cys Trp Asp Asn Leu Val Gln
645 650 655
Lys Leu Glu Lys Ser Thr Ala Gln Ile Ser Gln Ala Val Thr Thr Thr
660 665 670
Gln Pro Ser Leu Thr Gln Thr Thr Val Met Glu Thr Val Thr Thr Val
675 680 685
Thr Thr Arg Glu Gln Ile Leu Val Lys His Ala Gln Glu Glu Leu Pro
690 695 700
Pro Pro Pro Pro Gln Lys Lys Arg Gln Ile Thr Val Asp Ser Glu Ile
705 710 715 720
Arg Lys Arg Leu Asp Val Asp Ile Thr Glu Leu His Ser Trp Ile Thr
725 730 735
Arg Ser Glu Ala Val Leu Gln Ser Pro Glu Phe Ala Ile Phe Arg Lys
740 745 750
Glu Gly Asn Phe Ser Asp Leu Lys Glu Lys Val Asn Ala Ile Glu Arg
755 760 765
Glu Lys Ala Glu Lys Phe Arg Lys Leu Gln Asp Ala Ser Arg Ser Ala
770 775 780
Gln Ala Leu Val Glu Gln Met Val Asn Glu Gly Val Asn Ala Asp Ser
785 790 795 800
Ile Lys Gln Ala Ser Glu Gln Leu Asn Ser Arg Trp Ile Glu Phe Cys
805 810 815
Gln Leu Leu Ser Glu Arg Leu Asn Trp Leu Glu Tyr Gln Asn Asn Ile
820 825 830
Ile Ala Phe Tyr Asn Gln Leu Gln Gln Leu Glu Gln Met Thr Thr Thr
835 840 845
Ala Glu Asn Trp Leu Lys Ile Gln Pro Thr Thr Pro Ser Glu Pro Thr
850 855 860
Ala Ile Lys Ser Gln Leu Lys Ile Cys Lys Asp Glu Val Asn Arg Leu
865 870 875 880
Ser Gly Leu Gln Pro Gln Ile Glu Arg Leu Lys Ile Gln Ser Ile Ala
885 890 895
Leu Lys Glu Lys Gly Gln Gly Pro Met Phe Leu Asp Ala Asp Phe Val
900 905 910
Ala Phe Thr Asn His Phe Lys Gln Val Phe Ser Asp Val Gln Ala Arg
915 920 925
Glu Lys Glu Leu Gln Thr Ile Phe Asp Thr Leu Pro Pro Met Arg Tyr
930 935 940
Gln Glu Thr Met Ser Ala Ile Arg Thr Trp Val Gln Gln Ser Glu Thr
945 950 955 960
Lys Leu Ser Ile Pro Gln Leu Ser Val Thr Asp Tyr Glu Ile Met Glu
965 970 975
Gln Arg Leu Gly Glu Leu Gln Ala Leu Gln Ser Ser Leu Gln Glu Gln
980 985 990
Gln Ser Gly Leu Tyr Tyr Leu Ser Thr Thr Val Lys Glu Met Ser Lys
995 1000 1005
Lys Ala Pro Ser Glu Ile Ser Arg Lys Tyr Gln Ser Glu Phe Glu
1010 1015 1020
Glu Ile Glu Gly Arg Trp Lys Lys Leu Ser Ser Gln Leu Val Glu
1025 1030 1035
His Cys Gln Lys Leu Glu Glu Gln Met Asn Lys Leu Arg Lys Ile
1040 1045 1050
Gln Asn His Ile Gln Thr Leu Lys Lys Trp Met Ala Glu Val Asp
1055 1060 1065
Val Phe Leu Lys Glu Glu Trp Pro Ala Leu Gly Asp Ser Glu Ile
1070 1075 1080
Leu Lys Lys Gln Leu Lys Gln Cys Arg Leu Leu Val Ser Asp Ile
1085 1090 1095
Gln Thr Ile Gln Pro Ser Leu Asn Ser Val Asn Glu Gly Gly Gln
1100 1105 1110
Lys Ile Lys Asn Glu Ala Glu Pro Glu Phe Ala Ser Arg Leu Glu
1115 1120 1125
Thr Glu Leu Lys Glu Leu Asn Thr Gln Trp Asp His Met Cys Gln
1130 1135 1140
Gln Val Tyr Ala Arg Lys Glu Ala Leu Lys Gly Gly Leu Glu Lys
1145 1150 1155
Thr Val Ser Leu Gln Lys Asp Leu Ser Glu Met His Glu Trp Met
1160 1165 1170
Thr Gln Ala Glu Glu Glu Tyr Leu Glu Arg Asp Phe Glu Tyr Lys
1175 1180 1185
Thr Pro Asp Glu Leu Gln Lys Ala Val Glu Glu Met Lys Arg Ala
1190 1195 1200
Lys Glu Glu Ala Gln Gln Lys Glu Ala Lys Val Lys Leu Leu Thr
1205 1210 1215
Glu Ser Val Asn Ser Val Ile Ala Gln Ala Pro Pro Val Ala Gln
1220 1225 1230
Glu Ala Leu Lys Lys Glu Leu Glu Thr Leu Thr Thr Asn Tyr Gln
1235 1240 1245
Trp Leu Cys Thr Arg Leu Asn Gly Lys Cys Lys Thr Leu Glu Glu
1250 1255 1260
Val Trp Ala Cys Trp His Glu Leu Leu Ser Tyr Leu Glu Lys Ala
1265 1270 1275
Asn Lys Trp Leu Asn Glu Val Glu Phe Lys Leu Lys Thr Thr Glu
1280 1285 1290
Asn Ile Pro Gly Gly Ala Glu Glu Ile Ser Glu Val Leu Asp Ser
1295 1300 1305
Leu Glu Asn Leu Met Arg His Ser Glu Asp Asn Pro Asn Gln Ile
1310 1315 1320
Arg Ile Leu Ala Gln Thr Leu Thr Asp Gly Gly Val Met Asp Glu
1325 1330 1335
Leu Ile Asn Glu Glu Leu Glu Thr Phe Asn Ser Arg Trp Arg Glu
1340 1345 1350
Leu His Glu Glu Ala Val Arg Arg Gln Lys Leu Leu Glu Gln Ser
1355 1360 1365
Ile Gln Ser Ala Gln Glu Thr Glu Lys Ser Leu His Leu Ile Gln
1370 1375 1380
Glu Ser Leu Thr Phe Ile Asp Lys Gln Leu Ala Ala Tyr Ile Ala
1385 1390 1395
Asp Lys Val Asp Ala Ala Gln Met Pro Gln Glu Ala Gln Lys Ile
1400 1405 1410
Gln Ser Asp Leu Thr Ser His Glu Ile Ser Leu Glu Glu Met Lys
1415 1420 1425
Lys His Asn Gln Gly Lys Glu Ala Ala Gln Arg Val Leu Ser Gln
1430 1435 1440
Ile Asp Val Ala Gln Lys Lys Leu Gln Asp Val Ser Met Lys Phe
1445 1450 1455
Arg Leu Phe Gln Lys Pro Ala Asn Phe Glu Gln Arg Leu Gln Glu
1460 1465 1470
Ser Lys Met Ile Leu Asp Glu Val Lys Met His Leu Pro Ala Leu
1475 1480 1485
Glu Thr Lys Ser Val Glu Gln Glu Val Val Gln Ser Gln Leu Asn
1490 1495 1500
His Cys Val Asn Leu Tyr Lys Ser Leu Ser Glu Val Lys Ser Glu
1505 1510 1515
Val Glu Met Val Ile Lys Thr Gly Arg Gln Ile Val Gln Lys Lys
1520 1525 1530
Gln Thr Glu Asn Pro Lys Glu Leu Asp Glu Arg Val Thr Ala Leu
1535 1540 1545
Lys Leu His Tyr Asn Glu Leu Gly Ala Lys Val Thr Glu Arg Lys
1550 1555 1560
Gln Gln Leu Glu Lys Cys Leu Lys Leu Ser Arg Lys Met Arg Lys
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Glu Met Asn Val Leu Thr Glu Trp Leu Ala Ala Thr Asp Met Glu
1580 1585 1590
Leu Thr Lys Arg Ser Ala Val Glu Gly Met Pro Ser Asn Leu Asp
1595 1600 1605
Ser Glu Val Ala Trp Gly Lys Ala Thr Gln Lys Glu Ile Glu Lys
1610 1615 1620
Gln Lys Val His Leu Lys Ser Ile Thr Glu Val Gly Glu Ala Leu
1625 1630 1635
Lys Thr Val Leu Gly Lys Lys Glu Thr Leu Val Glu Asp Lys Leu
1640 1645 1650
Ser Leu Leu Asn Ser Asn Trp Ile Ala Val Thr Ser Arg Ala Glu
1655 1660 1665
Glu Trp Leu Asn Leu Leu Leu Glu Tyr Gln Lys His Met Glu Thr
1670 1675 1680
Phe Asp Gln Asn Val Asp His Ile Thr Lys Trp Ile Ile Gln Ala
1685 1690 1695
Asp Thr Leu Leu Asp Glu Ser Glu Lys Lys Lys Pro Gln Gln Lys
1700 1705 1710
Glu Asp Val Leu Lys Arg Leu Lys Ala Glu Leu Asn Asp Ile Arg
1715 1720 1725
Pro Lys Val Asp Ser Thr Arg Asp Gln Ala Ala Asn Leu Met Ala
1730 1735 1740
Asn Arg Gly Asp His Cys Arg Lys Leu Val Glu Pro Gln Ile Ser
1745 1750 1755
Glu Leu Asn His Arg Phe Ala Ala Ile Ser His Arg Ile Lys Thr
1760 1765 1770
Gly Lys Ala Ser Ile Pro Leu Lys Glu Leu Glu Gln Phe Asn Ser
1775 1780 1785
Asp Ile Gln Lys Leu Leu Glu Pro Leu Glu Ala Glu Ile Gln Gln
1790 1795 1800
Gly Val Asn Leu Lys Glu Glu Asp Phe Asn Lys Asp Met Asn Glu
1805 1810 1815
Asp Asn Glu Gly Thr Val Lys Glu Leu Leu Gln Arg Gly Asp Asn
1820 1825 1830
Leu Gln Gln Arg Ile Thr Asp Glu Arg Lys Arg Glu Glu Ile Lys
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Ile Lys Gln Gln Leu Leu Gln Thr Lys His Asn Ala Leu Lys Asp
1850 1855 1860
Leu Arg Ser Gln Arg Arg Lys Lys Ala Leu Glu Ile Ser His Gln
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Trp Tyr Gln Tyr Lys Arg Gln Ala Asp Asp Leu Leu Lys Cys Leu
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Glu Arg Lys Ile Lys Glu Ile Asp Arg Glu Leu Gln Lys Lys Lys
1910 1915 1920
Glu Glu Leu Asn Ala Val Arg Arg Gln Ala Glu Gly Leu Ser Glu
1925 1930 1935
Asp Gly Ala Ala Met Ala Val Glu Pro Thr Gln Ile Gln Leu Ser
1940 1945 1950
Lys Arg Trp Arg Glu Ile Glu Ser Lys Phe Ala Gln Phe Arg Arg
1955 1960 1965
Leu Asn Phe Ala Gln Ile His Thr Val Arg Glu Glu Thr Met Met
1970 1975 1980
Val Met Thr Glu Asp Met Pro Leu Glu Ile Ser Tyr Val Pro Ser
1985 1990 1995
Thr Tyr Leu Thr Glu Ile Thr His Val Ser Gln Ala Leu Leu Glu
2000 2005 2010
Val Glu Gln Leu Leu Asn Ala Pro Asp Leu Cys Ala Lys Asp Phe
2015 2020 2025
Glu Asp Leu Phe Lys Gln Glu Glu Ser Leu Lys Asn Ile Lys Asp
2030 2035 2040
Ser Leu Gln Gln Ser Ser Gly Arg Ile Asp Ile Ile His Ser Lys
2045 2050 2055
Lys Thr Ala Ala Leu Gln Ser Ala Thr Pro Val Glu Arg Val Lys
2060 2065 2070
Leu Gln Glu Ala Leu Ser Gln Leu Asp Phe Gln Trp Glu Lys Val
2075 2080 2085
Asn Lys Met Tyr Lys Asp Arg Gln Gly Arg Phe Asp Arg Ser Val
2090 2095 2100
Glu Lys Trp Arg Arg Phe His Tyr Asp Ile Lys Ile Phe Asn Gln
2105 2110 2115
Trp Leu Thr Glu Ala Glu Gln Phe Leu Arg Lys Thr Gln Ile Pro
2120 2125 2130
Glu Asn Trp Glu His Ala Lys Tyr Lys Trp Tyr Leu Lys Glu Leu
2135 2140 2145
Gln Asp Gly Ile Gly Gln Arg Gln Thr Val Val Arg Thr Leu Asn
2150 2155 2160
Ala Thr Gly Glu Glu Ile Ile Gln Gln Ser Ser Lys Thr Asp Ala
2165 2170 2175
Ser Ile Leu Gln Glu Lys Leu Gly Ser Leu Asn Leu Arg Trp Gln
2180 2185 2190
Glu Val Cys Lys Gln Leu Ser Asp Arg Lys Lys Arg Leu Glu Glu
2195 2200 2205
Gln Lys Asn Ile Leu Ser Glu Phe Gln Arg Asp Leu Asn Glu Phe
2210 2215 2220
Val Leu Trp Leu Glu Glu Ala Asp Asn Ile Ala Ser Ile Pro Leu
2225 2230 2235
Glu Pro Gly Lys Glu Gln Gln Leu Lys Glu Lys Leu Glu Gln Val
2240 2245 2250
Lys Leu Leu Val Glu Glu Leu Pro Leu Arg Gln Gly Ile Leu Lys
2255 2260 2265
Gln Leu Asn Glu Thr Gly Gly Pro Val Leu Val Ser Ala Pro Ile
2270 2275 2280
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2300 2305 2310
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Leu Ser Pro Ile Arg Asn Gln Leu Glu Ile Tyr Asn Gln Pro Asn
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2405 2410 2415
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2420 2425 2430
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2450 2455 2460
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2465 2470 2475
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2480 2485 2490
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2495 2500 2505
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2510 2515 2520
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2960 2965 2970
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Glu Glu Glu Asn Arg Asn Leu Gln Ala Glu Tyr Asp Arg Leu Lys
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3530 3535 3540
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Gln Leu His Arg Leu Arg Gln Leu Leu Glu Gln Pro Gln Ala Glu
3590 3595 3600
Ala Lys Val Asn Gly Thr Thr Val Ser Ser Pro Ser Thr Ser Leu
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Pro Gln Asp Thr Ser Thr Gly Leu Glu Glu Val Met Glu Gln Leu
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Pro Met Arg Glu Asp Thr Met
3680 3685
<210> 26
<211> 3978
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Non-codon optimized Dys3978 gene
<400> 26
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ttcacaaaat gggtaaatgc acaattttct aagtttggga agcagcatat tgagaacctc 120
ttcagtgacc tacaggatgg gaggcgcctc ctagacctcc tcgaaggcct gacagggcaa 180
aaactgccaa aagaaaaagg atccacaaga gttcatgccc tgaacaatgt caacaaggca 240
ctgcgggttt tgcagaacaa taatgttgat ttagtgaata ttggaagtac tgacatcgta 300
gatggaaatc ataaactgac tcttggtttg atttggaata taatcctcca ctggcaggtc 360
aaaaatgtaa tgaaaaatat catggctgga ttgcaacaaa ccaacagtga aaagattctc 420
ctgagctggg tccgacaatc aactcgtaat tatccacagg ttaatgtaat caacttcacc 480
accagctggt ctgatggcct ggctttgaat gctctcatcc atagtcatag gccagaccta 540
tttgactgga atagtgtggt ttgccagcag tcagccacac aacgactgga acatgcattc 600
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caacaagtga gcattgaagc catccaggaa gtggaaatgt tgccaaggcc acctaaagtg 780
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agtctagcac agggatatga gagaacttct tcccctaagc ctcgattcaa gagctatgcc 900
tacacacagg ctgcttatgt caccacctct gaccctacac ggagcccatt tccttcacag 960
catttggaag ctcctgaaga caagtcattt ggcagttcat tgatggagag tgaagtaaac 1020
ctggaccgtt atcaaacagc tttagaagaa gtattatcgt ggcttctttc tgctgaggac 1080
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caattgggaa gtaagctgat tggaacagga aaattatcag aagatgaaga aactgaagta 1260
caagagcaga tgaatctcct aaattcaaga tgggaatgcc tcagggtagc tagcatggaa 1320
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gaacaagaac aagtcagggt caattctctc actcacatgg tggtggtagt tgatgaatct 1560
agtggagatc acgcaactgc tgctttggaa gaacaactta aggtattggg agatcgatgg 1620
gcaaacatct gtagatggac agaagaccgc tgggttcttt tacaagacca gcctgaccta 1680
gctcctggac tgaccactat tggagcctct cctactcaga ctgttactct ggtgacacaa 1740
cctgtggtta ctaaggaaac tgccatctcc aaactagaaa tgccatcttc cttgatgttg 1800
gaggtaccta ctcatagatt actgcaacag ttccccctgg acctggaaaa gtttcttgcc 1860
tggcttacag aagctgaaac aactgccaat gtcctacagg atgctacccg taaggaaagg 1920
ctcctagaag actccaaggg agtaaaagag ctgatgaaac aatggcaaga cctccaaggt 1980
gaaattgaag ctcacacaga tgtttatcac aacctggatg aaaacagcca aaaaatcctg 2040
agatccctgg aaggttccga tgatgcagtc ctgttacaaa gacgtttgga taacatgaac 2100
ttcaagtgga gtgaacttcg gaaaaagtct ctcaacatta ggtcccattt ggaagccagt 2160
tctgaccagt ggaagcgtct gcacctttct ctgcaggaac ttctggtgtg gctacagctg 2220
aaagatgatg aattaagccg gcaggcacct attggaggcg actttccagc agttcagaag 2280
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agtactcttg agactgtacg aatatttctg acagagcagc ctttggaagg actagagaaa 2400
ctctaccagg agcccagaga gctgcctcct gaggagagag cccagaatgt cactcggctt 2460
ctacgaaagc aggctgagga ggtcaatact gagtgggaaa aattgaacct gcactccgct 2520
gactggcaga gaaaaataga tgagaccctt gaaagactcc aggaacttca agaggccacg 2580
gatgagctgg acctcaagct gcgccaagct gaggtgatca agggatcctg gcagcccgtg 2640
ggcgatctcc tcattgactc tctccaagat cacctcgaga aagtcaaggc acttcgagga 2700
gaaattgcgc ctctgaaaga gaacgtgagc cacgtcaatg accttgctcg ccagcttacc 2760
actttgggca ttcagctctc accgtataac ctcagcactc tggaagacct gaacaccaga 2820
tggaagcttc tgcaggtggc cgtcgaggac cgagtcaggc agctgcatga agcccacagg 2880
gactttggtc cagcatctca gcactttctt tccacgtctg tccagggtcc ctgggagaga 2940
gccatctcgc caaacaaagt gccctactat atcaaccacg agactcaaac aacttgctgg 3000
gaccatccca aaatgacaga gctctaccag tctttagctg acctgaataa tgtcagattc 3060
tcagcttata ggactgccat gaaactccga agactgcaga aggccctttg cttggatctc 3120
ttgagcctgt cagctgcatg tgatgccttg gaccagcaca acctcaagca aaatgaccag 3180
cccatggata tcctgcagat tattaattgt ttgaccacta tttatgaccg cctggagcaa 3240
gagcacaaca atttggtcaa cgtccctctc tgcgtggata tgtgtctgaa ctggctgctg 3300
aatgtttatg atacgggacg aacagggagg atccgtgtcc tgtcttttaa aactggcatc 3360
atttccctgt gtaaagcaca tttggaagac aagtacagat accttttcaa gcaagtggca 3420
agttcaacag gattttgtga ccagcgcagg ctgggcctcc ttctgcatga ttctatccaa 3480
attccaagac agttgggtga agttgcatcc tttgggggca gtaacattga gccaagtgtc 3540
cggagctgct tccaatttgc taataataag ccagagatcg aagcggccct cttcctagac 3600
tggatgagac tggaacccca gtccatggtg tggctgcccg tcctgcacag agtggctgct 3660
gcagaaactg ccaagcatca ggccaaatgt aacatctgca aagagtgtcc aatcattgga 3720
ttcaggtaca ggagtctaaa gcactttaat tatgacatct gccaaagctg ctttttttct 3780
ggtcgagttg caaaaggcca taaaatgcac tatcccatgg tggaatattg cactccgact 3840
acatcaggag aagatgttcg agactttgcc aaggtactaa aaaacaaatt tcgaaccaaa 3900
aggtattttg cgaagcatcc ccgaatgggc tacctgccag tgcagactgt cttagagggg 3960
gacaacatgg aaacttag 3978
<210> 27
<211> 1329
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Delta3990 protein
<400> 27
Met Val Trp Trp Glu Glu Val Glu Asp Cys Tyr Glu Arg Glu Asp Val
1 5 10 15
Gln Lys Lys Thr Phe Thr Lys Trp Val Asn Ala Gln Phe Ser Lys Phe
20 25 30
Gly Lys Gln His Ile Glu Asn Leu Phe Ser Asp Leu Gln Asp Gly Arg
35 40 45
Arg Leu Leu Asp Leu Leu Glu Gly Leu Thr Gly Gln Lys Leu Pro Lys
50 55 60
Glu Lys Gly Ser Thr Arg Val His Ala Leu Asn Asn Val Asn Lys Ala
65 70 75 80
Leu Arg Val Leu Gln Asn Asn Asn Val Asp Leu Val Asn Ile Gly Ser
85 90 95
Thr Asp Ile Val Asp Gly Asn His Lys Leu Thr Leu Gly Leu Ile Trp
100 105 110
Asn Ile Ile Leu His Trp Gln Val Lys Asn Val Met Lys Asn Ile Met
115 120 125
Ala Gly Leu Gln Gln Thr Asn Ser Glu Lys Ile Leu Leu Ser Trp Val
130 135 140
Arg Gln Ser Thr Arg Asn Tyr Pro Gln Val Asn Val Ile Asn Phe Thr
145 150 155 160
Thr Ser Trp Ser Asp Gly Leu Ala Leu Asn Ala Leu Ile His Ser His
165 170 175
Arg Pro Asp Leu Phe Asp Trp Asn Ser Val Val Cys Gln Gln Ser Ala
180 185 190
Thr Gln Arg Leu Glu His Ala Phe Asn Ile Ala Arg Tyr Gln Leu Gly
195 200 205
Ile Glu Lys Leu Leu Asp Pro Glu Asp Val Asp Thr Thr Tyr Pro Asp
210 215 220
Lys Lys Ser Ile Leu Met Tyr Ile Thr Ser Leu Phe Gln Val Leu Pro
225 230 235 240
Gln Gln Val Ser Ile Glu Ala Ile Gln Glu Val Glu Met Leu Pro Arg
245 250 255
Pro Pro Lys Val Thr Lys Glu Glu His Phe Gln Leu His His Gln Met
260 265 270
His Tyr Ser Gln Gln Ile Thr Val Ser Leu Ala Gln Gly Tyr Glu Arg
275 280 285
Thr Ser Ser Pro Lys Pro Arg Phe Lys Ser Tyr Ala Tyr Thr Gln Ala
290 295 300
Ala Tyr Val Thr Thr Ser Asp Pro Thr Arg Ser Pro Phe Pro Ser Gln
305 310 315 320
His Leu Glu Ala Pro Glu Asp Lys Ser Phe Gly Ser Ser Leu Met Glu
325 330 335
Ser Glu Val Asn Leu Asp Arg Tyr Gln Thr Ala Leu Glu Glu Val Leu
340 345 350
Ser Trp Leu Leu Ser Ala Glu Asp Thr Leu Gln Ala Gln Gly Glu Ile
355 360 365
Ser Asn Asp Val Glu Val Val Lys Asp Gln Phe His Thr His Glu Gly
370 375 380
Tyr Met Met Asp Leu Thr Ala His Gln Gly Arg Val Gly Asn Ile Leu
385 390 395 400
Gln Leu Gly Ser Lys Leu Ile Gly Thr Gly Lys Leu Ser Glu Asp Glu
405 410 415
Glu Thr Glu Val Gln Glu Gln Met Asn Leu Leu Asn Ser Arg Trp Glu
420 425 430
Cys Leu Arg Val Ala Ser Met Glu Lys Gln Ser Asn Leu His Arg Val
435 440 445
Leu Met Asp Leu Gln Asn Gln Lys Leu Lys Glu Leu Asn Asp Trp Leu
450 455 460
Thr Lys Thr Glu Glu Arg Thr Arg Lys Met Glu Glu Glu Pro Leu Gly
465 470 475 480
Pro Asp Leu Glu Asp Leu Lys Arg Gln Val Gln Gln His Lys Val Leu
485 490 495
Gln Glu Asp Leu Glu Gln Glu Gln Val Arg Val Asn Ser Leu Thr His
500 505 510
Met Val Val Val Val Asp Glu Ser Ser Gly Asp His Ala Thr Ala Ala
515 520 525
Leu Glu Glu Gln Leu Lys Val Leu Gly Asp Arg Trp Ala Asn Ile Cys
530 535 540
Arg Trp Thr Glu Asp Arg Trp Val Leu Leu Gln Asp Gln Pro Asp Leu
545 550 555 560
Ala Pro Gly Leu Thr Thr Ile Gly Ala Ser Pro Thr Gln Thr Val Thr
565 570 575
Leu Val Thr Gln Pro Val Val Thr Lys Glu Thr Ala Ile Ser Lys Leu
580 585 590
Glu Met Pro Ser Ser Leu Met Leu Glu Val Pro Thr His Arg Leu Leu
595 600 605
Gln Gln Phe Pro Leu Asp Leu Glu Lys Phe Leu Ala Trp Leu Thr Glu
610 615 620
Ala Glu Thr Thr Ala Asn Val Leu Gln Asp Ala Thr Arg Lys Glu Arg
625 630 635 640
Leu Leu Glu Asp Ser Lys Gly Val Lys Glu Leu Met Lys Gln Trp Gln
645 650 655
Asp Leu Gln Gly Glu Ile Glu Ala His Thr Asp Val Tyr His Asn Leu
660 665 670
Asp Glu Asn Ser Gln Lys Ile Leu Arg Ser Leu Glu Gly Ser Asp Asp
675 680 685
Ala Val Leu Leu Gln Arg Arg Leu Asp Asn Met Asn Phe Lys Trp Ser
690 695 700
Glu Leu Arg Lys Lys Ser Leu Asn Ile Arg Ser His Leu Glu Ala Ser
705 710 715 720
Ser Asp Gln Trp Lys Arg Leu His Leu Ser Leu Gln Glu Leu Leu Val
725 730 735
Trp Leu Gln Leu Lys Asp Asp Glu Leu Ser Arg Gln Ala Pro Ile Gly
740 745 750
Gly Asp Phe Pro Ala Val Gln Lys Gln Asn Asp Val His Arg Ala Phe
755 760 765
Lys Arg Glu Leu Lys Thr Lys Glu Pro Val Ile Met Ser Thr Leu Glu
770 775 780
Thr Val Arg Ile Phe Leu Thr Glu Gln Pro Leu Glu Gly Leu Glu Lys
785 790 795 800
Leu Tyr Gln Glu Pro Arg Glu Leu Pro Pro Glu Glu Arg Ala Gln Asn
805 810 815
Val Thr Arg Leu Leu Arg Lys Gln Ala Glu Glu Val Asn Thr Glu Trp
820 825 830
Glu Lys Leu Asn Leu His Ser Ala Asp Trp Gln Arg Lys Ile Asp Glu
835 840 845
Thr Leu Glu Arg Leu Gln Glu Leu Gln Glu Ala Thr Asp Glu Leu Asp
850 855 860
Leu Lys Leu Arg Gln Ala Glu Val Ile Lys Gly Ser Trp Gln Pro Val
865 870 875 880
Gly Asp Leu Leu Ile Asp Ser Leu Gln Asp His Leu Glu Lys Val Lys
885 890 895
Ala Leu Arg Gly Glu Ile Ala Pro Leu Lys Glu Asn Val Ser His Val
900 905 910
Asn Asp Leu Ala Arg Gln Leu Thr Thr Leu Gly Ile Gln Leu Ser Pro
915 920 925
Tyr Asn Leu Ser Thr Leu Glu Asp Leu Asn Thr Arg Trp Lys Leu Leu
930 935 940
Gln Val Ala Val Glu Asp Arg Val Arg Gln Leu His Glu Ala His Arg
945 950 955 960
Asp Phe Gly Pro Ala Ser Gln His Phe Leu Ser Thr Ser Val Gln Gly
965 970 975
Pro Trp Glu Arg Ala Ile Ser Pro Asn Lys Val Pro Tyr Tyr Ile Asn
980 985 990
His Glu Thr Gln Thr Thr Cys Trp Asp His Pro Lys Met Thr Glu Leu
995 1000 1005
Tyr Gln Ser Leu Ala Asp Leu Asn Asn Val Arg Phe Ser Ala Tyr
1010 1015 1020
Arg Thr Ala Met Lys Leu Arg Arg Leu Gln Lys Ala Leu Cys Leu
1025 1030 1035
Asp Leu Leu Ser Leu Ser Ala Ala Cys Asp Ala Leu Asp Gln His
1040 1045 1050
Asn Leu Lys Gln Asn Asp Gln Pro Met Asp Ile Leu Gln Ile Ile
1055 1060 1065
Asn Cys Leu Thr Thr Ile Tyr Asp Arg Leu Glu Gln Glu His Asn
1070 1075 1080
Asn Leu Val Asn Val Pro Leu Cys Val Asp Met Cys Leu Asn Trp
1085 1090 1095
Leu Leu Asn Val Tyr Asp Thr Gly Arg Thr Gly Arg Ile Arg Val
1100 1105 1110
Leu Ser Phe Lys Thr Gly Ile Ile Ser Leu Cys Lys Ala His Leu
1115 1120 1125
Glu Asp Lys Tyr Arg Tyr Leu Phe Lys Gln Val Ala Ser Ser Thr
1130 1135 1140
Gly Phe Cys Asp Gln Arg Arg Leu Gly Leu Leu Leu His Asp Ser
1145 1150 1155
Ile Gln Ile Pro Arg Gln Leu Gly Glu Val Ala Ser Phe Gly Gly
1160 1165 1170
Ser Asn Ile Glu Pro Ser Val Arg Ser Cys Phe Gln Phe Ala Asn
1175 1180 1185
Asn Lys Pro Glu Ile Glu Ala Ala Leu Phe Leu Asp Trp Met Arg
1190 1195 1200
Leu Glu Pro Gln Ser Met Val Trp Leu Pro Val Leu His Arg Val
1205 1210 1215
Ala Ala Ala Glu Thr Ala Lys His Gln Ala Lys Cys Asn Ile Cys
1220 1225 1230
Lys Glu Cys Pro Ile Ile Gly Phe Arg Tyr Arg Ser Leu Lys His
1235 1240 1245
Phe Asn Tyr Asp Ile Cys Gln Ser Cys Phe Phe Ser Gly Arg Val
1250 1255 1260
Ala Lys Gly His Lys Met His Tyr Pro Met Val Glu Tyr Cys Thr
1265 1270 1275
Pro Thr Thr Ser Gly Glu Asp Val Arg Asp Phe Ala Lys Val Leu
1280 1285 1290
Lys Asn Lys Phe Arg Thr Lys Arg Tyr Phe Ala Lys His Pro Arg
1295 1300 1305
Met Gly Tyr Leu Pro Val Gln Thr Val Leu Glu Gly Asp Asn Met
1310 1315 1320
Glu Thr Pro Asp Thr Met
1325
<210> 28
<211> 3990
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Delta3990 gene
<400> 28
atggtttggt gggaagaagt agaggactgt tatgaaagag aagatgttca aaagaaaaca 60
ttcacaaaat gggtaaatgc acaattttct aagtttggga agcagcatat tgagaacctc 120
ttcagtgacc tacaggatgg gaggcgcctc ctagacctcc tcgaaggcct gacagggcaa 180
aaactgccaa aagaaaaagg atccacaaga gttcatgccc tgaacaatgt caacaaggca 240
ctgcgggttt tgcagaacaa taatgttgat ttagtgaata ttggaagtac tgacatcgta 300
gatggaaatc ataaactgac tcttggtttg atttggaata taatcctcca ctggcaggtc 360
aaaaatgtaa tgaaaaatat catggctgga ttgcaacaaa ccaacagtga aaagattctc 420
ctgagctggg tccgacaatc aactcgtaat tatccacagg ttaatgtaat caacttcacc 480
accagctggt ctgatggcct ggctttgaat gctctcatcc atagtcatag gccagaccta 540
tttgactgga atagtgtggt ttgccagcag tcagccacac aacgactgga acatgcattc 600
aacatcgcca gatatcaatt aggcatagag aaactactcg atcctgaaga tgttgatacc 660
acctatccag ataagaagtc catcttaatg tacatcacat cactcttcca agttttgcct 720
caacaagtga gcattgaagc catccaggaa gtggaaatgt tgccaaggcc acctaaagtg 780
actaaagaag aacattttca gttacatcat caaatgcact attctcaaca gatcacggtc 840
agtctagcac agggatatga gagaacttct tcccctaagc ctcgattcaa gagctatgcc 900
tacacacagg ctgcttatgt caccacctct gaccctacac ggagcccatt tccttcacag 960
catttggaag ctcctgaaga caagtcattt ggcagttcat tgatggagag tgaagtaaac 1020
ctggaccgtt atcaaacagc tttagaagaa gtattatcgt ggcttctttc tgctgaggac 1080
acattgcaag cacaaggaga gatttctaat gatgtggaag tggtgaaaga ccagtttcat 1140
actcatgagg ggtacatgat ggatttgaca gcccatcagg gccgggttgg taatattcta 1200
caattgggaa gtaagctgat tggaacagga aaattatcag aagatgaaga aactgaagta 1260
caagagcaga tgaatctcct aaattcaaga tgggaatgcc tcagggtagc tagcatggaa 1320
aaacaaagca atttacatag agttttaatg gatctccaga atcagaaact gaaagagttg 1380
aatgactggc taacaaaaac agaagaaaga acaaggaaaa tggaggaaga gcctcttgga 1440
cctgatcttg aagacctaaa acgccaagta caacaacata aggtgcttca agaagatcta 1500
gaacaagaac aagtcagggt caattctctc actcacatgg tggtggtagt tgatgaatct 1560
agtggagatc acgcaactgc tgctttggaa gaacaactta aggtattggg agatcgatgg 1620
gcaaacatct gtagatggac agaagaccgc tgggttcttt tacaagacca gcctgaccta 1680
gctcctggac tgaccactat tggagcctct cctactcaga ctgttactct ggtgacacaa 1740
cctgtggtta ctaaggaaac tgccatctcc aaactagaaa tgccatcttc cttgatgttg 1800
gaggtaccta ctcatagatt actgcaacag ttccccctgg acctggaaaa gtttcttgcc 1860
tggcttacag aagctgaaac aactgccaat gtcctacagg atgctacccg taaggaaagg 1920
ctcctagaag actccaaggg agtaaaagag ctgatgaaac aatggcaaga cctccaaggt 1980
gaaattgaag ctcacacaga tgtttatcac aacctggatg aaaacagcca aaaaatcctg 2040
agatccctgg aaggttccga tgatgcagtc ctgttacaaa gacgtttgga taacatgaac 2100
ttcaagtgga gtgaacttcg gaaaaagtct ctcaacatta ggtcccattt ggaagccagt 2160
tctgaccagt ggaagcgtct gcacctttct ctgcaggaac ttctggtgtg gctacagctg 2220
aaagatgatg aattaagccg gcaggcacct attggaggcg actttccagc agttcagaag 2280
cagaacgatg tacatagggc cttcaagagg gaattgaaaa ctaaagaacc tgtaatcatg 2340
agtactcttg agactgtacg aatatttctg acagagcagc ctttggaagg actagagaaa 2400
ctctaccagg agcccagaga gctgcctcct gaggagagag cccagaatgt cactcggctt 2460
ctacgaaagc aggctgagga ggtcaatact gagtgggaaa aattgaacct gcactccgct 2520
gactggcaga gaaaaataga tgagaccctt gaaagactcc aggaacttca agaggccacg 2580
gatgagctgg acctcaagct gcgccaagct gaggtgatca agggatcctg gcagcccgtg 2640
ggcgatctcc tcattgactc tctccaagat cacctcgaga aagtcaaggc acttcgagga 2700
gaaattgcgc ctctgaaaga gaacgtgagc cacgtcaatg accttgctcg ccagcttacc 2760
actttgggca ttcagctctc accgtataac ctcagcactc tggaagacct gaacaccaga 2820
tggaagcttc tgcaggtggc cgtcgaggac cgagtcaggc agctgcatga agcccacagg 2880
gactttggtc cagcatctca gcactttctt tccacgtctg tccagggtcc ctgggagaga 2940
gccatctcgc caaacaaagt gccctactat atcaaccacg agactcaaac aacttgctgg 3000
gaccatccca aaatgacaga gctctaccag tctttagctg acctgaataa tgtcagattc 3060
tcagcttata ggactgccat gaaactccga agactgcaga aggccctttg cttggatctc 3120
ttgagcctgt cagctgcatg tgatgccttg gaccagcaca acctcaagca aaatgaccag 3180
cccatggata tcctgcagat tattaattgt ttgaccacta tttatgaccg cctggagcaa 3240
gagcacaaca atttggtcaa cgtccctctc tgcgtggata tgtgtctgaa ctggctgctg 3300
aatgtttatg atacgggacg aacagggagg atccgtgtcc tgtcttttaa aactggcatc 3360
atttccctgt gtaaagcaca tttggaagac aagtacagat accttttcaa gcaagtggca 3420
agttcaacag gattttgtga ccagcgcagg ctgggcctcc ttctgcatga ttctatccaa 3480
attccaagac agttgggtga agttgcatcc tttgggggca gtaacattga gccaagtgtc 3540
cggagctgct tccaatttgc taataataag ccagagatcg aagcggccct cttcctagac 3600
tggatgagac tggaacccca gtccatggtg tggctgcccg tcctgcacag agtggctgct 3660
gcagaaactg ccaagcatca ggccaaatgt aacatctgca aagagtgtcc aatcattgga 3720
ttcaggtaca ggagtctaaa gcactttaat tatgacatct gccaaagctg ctttttttct 3780
ggtcgagttg caaaaggcca taaaatgcac tatcccatgg tggaatattg cactccgact 3840
acatcaggag aagatgttcg agactttgcc aaggtactaa aaaacaaatt tcgaaccaaa 3900
aggtattttg cgaagcatcc ccgaatgggc tacctgccag tgcagactgt cttagagggg 3960
gacaacatgg aaactcccga cacaatgtag 3990
Claims (93)
- (a) 서열식별번호(SEQ ID NO): 1의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 적어도 약 90％ 동일한 뉴클레오티드 서열;
(b) 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 적어도 약 90％ 동일한 뉴클레오티드 서열; 또는
(c) 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 적어도 약 90％ 동일한 뉴클레오티드 서열
을 포함하는, 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드. - 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 미니-디스트로핀 단백질이 야생형 인간 근육 디스트로핀 단백질의 N-말단, 액틴-결합 도메인 (ABD), 힌지 H1, 로드 R1 및 R2, 힌지 H3, 로드 R22, R23, 및 R24, 힌지 H4, CR 도메인, 및 CT 도메인의 일부분으로 본질적으로 이루어지는 것인 폴리뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 미니-디스트로핀 단백질이 야생형 인간 근육 디스트로핀 단백질의 N-말단, ABD, 힌지 H1, 로드 R1 및 R2, 로드 R22, R23, 및 R24, 힌지 H4, CR 도메인, 및 CT 도메인의 일부분으로 본질적으로 이루어지는 것인 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 미니-디스트로핀 단백질이 야생형 인간 근육 디스트로핀 단백질의 C-말단의 마지막 3개의 아미노산 잔기를 포함하지 않는 것인 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 7의 아미노산 서열 또는 이에 적어도 약 90％ 동일한 아미노산 서열을 포함하는 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 8의 아미노산 서열 또는 이에 적어도 약 90％ 동일한 아미노산 서열을 포함하는 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드.
- 제7항에 있어서, 프로모터가 근육-특이적 프로모터인 폴리뉴클레오티드.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 프로모터가 크레아티닌 키나제 프로모터인 폴리뉴클레오티드.
- 제9항에 있어서, 프로모터가 서열식별번호: 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
- 제9항에 있어서, 프로모터가 서열식별번호: 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리아데닐화 요소에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드.
- 제12항에 있어서, 폴리아데닐화 요소가 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터 및 폴리아데닐화 요소를 포함하는 유전자 발현 카세트의 일부분인 폴리뉴클레오티드.
- 제14항에 있어서, 유전자 발현 카세트가 서열식별번호: 9-12 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 적어도 약 90％ 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
- 제16항에 있어서, 바이러스 벡터인 벡터.
- 제17항에 있어서, 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터인 벡터.
- 제18항에 있어서, AAV 벡터가 AAV9 벡터인 벡터.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 및/또는 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 형질전환된 세포.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항의 벡터, 및/또는 제20항의 형질전환된 세포를 포함하는 트랜스제닉 동물.
- 야생형 인간 근육 디스트로핀 단백질의 N-말단, ABD, 힌지 H1, 로드 R1 및 R2, 힌지 H3, 로드 R22, R23, 및 R24, 힌지 H4, CR 도메인, 및 CT 도메인의 일부분으로 본질적으로 이루어지고, 야생형 인간 근육 디스트로핀 단백질의 C-말단의 마지막 3개의 아미노산 잔기를 포함하지 않는 미니-디스트로핀 단백질.
- 제22항에 있어서, 서열식별번호: 7의 아미노산 서열 또는 이에 적어도 약 90％ 동일한 아미노산 서열을 포함하는 미니-디스트로핀 단백질.
- 야생형 인간 근육 디스트로핀 단백질의 N-말단, ABD, 힌지 H1, 로드 R1, R2, R22, R23, 및 R24, 힌지 H4, CR 도메인, 및 CT 도메인의 일부분으로 본질적으로 이루어지는 미니-디스트로핀 단백질.
- 제24항에 있어서, 야생형 인간 근육 디스트로핀 단백질의 C-말단의 마지막 3개의 아미노산 잔기를 포함하지 않는 미니-디스트로핀 단백질.
- 제24항 또는 제25항에 있어서, 서열식별번호: 8의 아미노산 서열 또는 이에 적어도 약 90％ 동일한 아미노산 서열을 포함하는 미니-디스트로핀 단백질.
- 세포를 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 또는 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항의 벡터와 접촉시키고, 이에 의해 세포에서 미니-디스트로핀을 생산하는 것을 포함하는, 세포에서 미니-디스트로핀 단백질을 생산하는 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항의 벡터, 및/또는 제20항의 형질전환된 세포를 대상체에게 전달하고, 이에 의해 대상체에서 미니-디스트로핀 단백질을 생산하는 것을 포함하는, 대상체에서 미니-디스트로핀 단백질을 생산하는 방법.
- 치료적 유효량의 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항의 벡터, 및/또는 제20항의 형질전환된 세포를 대상체에게 전달하고, 이에 의해 근육 디스트로피 치료를 필요로 하는 대상체에서 근육 디스트로피를 치료하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 근육 디스트로피를 치료하는 방법.
- 제29항에 있어서, 근육 디스트로피가 뒤시엔느 근육 디스트로피 또는 베커 근육 디스트로피인 방법.
- AAV 캡시드, 및 인간 미니-디스트로핀 단백질을 발현시키기 위한 벡터 게놈을 포함하는 재조합 AAV 입자.
- 제31항에 있어서, 상기 AAV 캡시드가 AAV9로부터의 것인 재조합 AAV 입자.
- 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 벡터 게놈이 상기 인간 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 인간 코돈-최적화 핵산 서열을 포함하는 것인 재조합 AAV 입자.
- 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 미니-디스트로핀 단백질이 아미노-말단에서 카르복시-말단의 순서로 전장 인간 디스트로핀 단백질의 하기의 서브도메인: N-말단 액틴-결합 도메인, H1, R1, R2, H3, R22, R23, R24, H4, 시스테인 풍부 도메인, 및 야생형 인간 근육 디스트로핀에서의 마지막 3개의 아미노산을 포함하지 않는 카르복시-말단 도메인의 일부분을 포함하는 것인 재조합 AAV 입자.
- 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단 액틴-결합 도메인이 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 1-240으로 이루어지고; H1이 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 253-327로 이루어지고; R1이 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 337-447로 이루어지고; R2가 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 448-556으로 이루어지고; H3이 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 2424-2470으로 이루어지고; R22가 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 2687-2802로 이루어지고; R23이 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 2803-2931로 이루어지고; R24가 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 2932-3040으로 이루어지고; H4가 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 3041-3112로 이루어지고; CR 도메인이 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 3113-3299로 이루어지며; CT 도메인의 일부분이 서열식별번호: 25로부터의 아미노산 번호 3300-3408로 이루어지는 것인 재조합 AAV 입자.
- 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 미니-디스트로핀 단백질이 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 것인 재조합 AAV 입자.
- 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 상기 인간 코돈-최적화 핵산이 서열식별번호: 1의 핵산 서열을 포함하는 것인 재조합 AAV 입자.
- 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 게놈이 상기 인간 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 상기 코돈 최적화 핵산에 플랭킹된 5' AAV 역전 말단 반복부 (ITR) 및 3' AAV ITR을 추가로 포함하는 것인 재조합 AAV 입자.
- 제38항에 있어서, 상기 AAV ITR이 AAV2 ITR인 재조합 AAV 입자.
- 제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 게놈이 상기 인간 코돈 최적화 핵산 서열과 작동가능하게 연결된 근육-특이적 전사 조절 요소를 추가로 포함하는 것인 재조합 AAV 입자.
- 제40항에 있어서, 상기 근육-특이적 전사 조절 요소가 5' AAV2 ITR과 인간 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 인간 코돈-최적화 핵산 사이에 위치하는 것인 재조합 AAV 입자.
- 제40항 또는 제41항에 있어서, 상기 근육-특이적 전사 조절 요소가 인간 또는 마우스 크레아틴 키나제 유전자로부터 유래되는 것인 재조합 AAV 입자.
- 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 근육-특이적 전사 조절 요소가 인핸서 및 프로모터를 포함하는 것인 재조합 AAV 입자.
- 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 근육-특이적 전사 조절 요소가 서열식별번호: 16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 재조합 AAV 입자.
- 제38항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 게놈이 인간 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 코돈 최적화 핵산의 5' 끝부분과 3' ITR 사이에 전사 종결 서열을 추가로 포함하는 것인 재조합 AAV 입자.
- 제45항에 있어서, 상기 전사 종결 서열이 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하는 것인 재조합 AAV 입자.
- 제31항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 게놈이 5' → 3' 순서로 제1 AAV2 ITR, 인간 미니-디스트로핀 단백질을 코딩하는 인간 코돈-최적화 핵산에 작동가능하게 연결된 근육-특이적 전사 조절 요소, 전사 종결 서열, 및 제2 AAV2 ITR을 포함하는 것인 재조합 AAV 입자.
- 제47항에 있어서, 상기 근육-특이적 전사 조절 요소가 서열식별번호: 16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 재조합 AAV 입자.
- 제47항 또는 제48항에 있어서, 상기 인간 코돈-최적화 핵산 서열이 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 적어도 95％ 동일한 서열을 포함하는 것인 재조합 AAV 입자.
- 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전사 종결 서열이 서열식별번호: 17의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 재조합 AAV 입자.
- 제31항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 게놈이 서열식별번호: 18의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 역-상보체를 포함하는 것인 재조합 AAV 입자.
- 제31항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 게놈이 서열식별번호: 18의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 역-상보체로 본질적으로 이루어지는 것인 재조합 AAV 입자.
- 제31항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 게놈이 서열식별번호: 18의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 역-상보체로 이루어지는 것인 재조합 AAV 입자.
- AAV9 캡시드, 및 서열식별번호: 18의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 역-상보체를 포함하는 벡터 게놈을 포함하는 재조합 AAV 입자.
- AAV9 캡시드, 및 서열식별번호: 18의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 역-상보체로 본질적으로 이루어지는 벡터 게놈을 포함하는 재조합 AAV 입자.
- AAV9 캡시드, 및 서열식별번호: 18의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 역-상보체로 이루어지는 벡터 게놈을 포함하는 재조합 AAV 입자.
- 제31항 내지 제56항 중 어느 한 항의 재조합 AAV 입자 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
- 디스트로핀병증 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량의 제57항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 디스트로핀병증을 치료하는 방법.
- 디스트로핀병증에 걸린 대상체를 치료하기 위한 의약의 제조에서의 제31항 내지 제56항 중 어느 한 항의 재조합 AAV (rAAV) 입자의 용도 또는 제57항의 조성물의 용도.
- 제31항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 디스트로핀병증에 걸린 대상체의 치료에서 사용하기 위한 rAAV 입자 또는 조성물.
- 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디스트로핀병증이 뒤시엔느 근육 디스트로피 (DMD), 베커 근육 디스트로피 (BMD), 또는 DMD-연관 확장 심근병증인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
- 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 남성 또는 여성 인간 대상체인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
- 제58항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 최초로 치료될 때 상기 대상체가 보행성인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
- 제58항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 최초로 치료될 때 상기 대상체가 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16세인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
- 제58항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 입자의 용량이 1×1012 vg/kg, 2×1012 vg/kg, 3×1012 vg/kg, 4×1012 vg/kg, 5×1012 vg/kg, 6×1012 vg/kg, 7×1012 vg/kg, 8×1012 vg/kg, 9×1012 vg/kg, 1×1013 vg/kg, 2×1013 vg/kg, 3×1013 vg/kg, 4×1013 vg/kg, 5×1013 vg/kg, 6×1013 vg/kg, 7×1013 vg/kg, 8×1013 vg/kg, 9×1013 vg/kg, 1×1014 vg/kg, 1.5×1014 vg/kg, 2×1014 vg/kg, 2.5×1014 vg/kg, 3×1014 vg/kg, 3.5×1014 vg/kg, 4×1014 vg/kg, 4.5×1014 vg/kg, 5×1014 vg/kg, 5.5×1014 vg/kg, 6×1014 vg/kg, 6.5×1014 vg/kg, 7×1014 vg/kg, 7.5×1014 vg/kg, 8×1014 vg/kg, 8.5×1014 vg/kg, 및 9×1014 vg/kg로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
- 제58항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 혈액 내의 평균 ALT, AST, 또는 LDH 수준을 건강한 대조군의 혈액 내의 ALT, AST, 또는 LDH의 수준보다 약 7-, 6-, 5-, 4-, 3-, 또는 2-배 더 큰 수준 이내로 감소시키는데 효과적인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
- 제58항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 혈액 내의 평균 총 CK 수준을 건강한 대조군의 혈액 내의 평균 총 CK 수준보다 약 50-, 48-, 46-, 44-, 42-, 40-, 38-, 36-, 34-, 32-, 30-, 28-, 26-, 24-, 22-, 20-, 18-, 16-, 14-, 12-, 10-, 9-, 8-, 7-, 6-, 5-, 4-, 3-, 또는 2-배 더 큰 수준 이내로 감소시키는데 효과적인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
- 제58항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 평균 6분 보행 거리 (6MWD)를 미치료 대조군의 평균 6MWD에 비교하여 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100미터만큼 증가시키는데 효과적인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
- 제68항에 있어서, 대상체의 6MWD가 벡터를 투여하고 나서 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 또는 36개월 후에 결정되는 것인 방법.
- 제58항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 4-계단 오르기 테스트를 수행하는데 요구되는 평균 시간을 미처리 대조군의 평균 시간에 비교하여 적어도 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3.0, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 또는 4.0초만큼 감소시키는데 효과적인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
- 제70항에 있어서, 대상체의 4-계단 오르기 시간이 벡터를 투여하고 나서 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 또는 36개월 후에 결정되는 것인 방법.
- 제58항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 보행을 상실한 대상체의 평균 비율을 보행을 상실한 미처리 대조군의 평균 비율에 비교하여 적어도 5％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％ 또는 65％만큼 감소시키는데 효과적인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
- 제72항에 있어서, 대상체의 보행이 벡터를 투여하고 나서 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 또는 36개월 후에 결정되는 것인 방법.
- 제58항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 하지 내의 지방 분율을 미처리 대조군의 하지 내의 평균 지방 분율에 비교하여 적어도 5％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％ 또는 75％만큼 감소시키는데 효과적인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
- 제74항에 있어서, 대상체의 하지 내의 지방 분율이 벡터를 투여하고 나서 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 또는 36개월 후에 결정되는 것인 방법.
- 제58항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 골격근 섬유의 적어도 5％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％ 또는 90％가 상기 미니-디스트로핀 단백질을 발현하도록 야기하는데 효과적인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
- 제76항에 있어서, 대상체의 근육 섬유 내의 미니-디스트로핀 단백질의 발현이 벡터를 투여하고 나서 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 또는 36개월 후에 결정되는 것인 방법.
- 제76항 또는 제77항에 있어서, 상기 골격근 섬유가 상기 대상체의 두갈래근, 세모근 또는 네갈래근으로부터 수득된 생검 시료 내에 존재하는 것인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
- 제58항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 약 0％, 1％, 2％, 3％, 4％, 5％, 6％, 7％, 8％, 9％, 10％, 11％, 12％, 13％, 14％, 15％, 16％, 17％, 18％, 19％ 또는 20％ 이하에서 상기 미니-디스트로핀 단백질에 대한 세포성 면역 반응 또는 근육 염증을 야기하는 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
- 제79항에 있어서, 미니-디스트로핀 단백질에 대한 세포성 면역 반응 또는 근육 염증의 존재가 벡터를 투여하고 나서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개월 후에 결정되는 것인 방법.
- 제58항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 디스트로핀병증을 치료하는데 효과적인 적어도 제2의 작용제와 함께 공동으로 투여되는 것인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
- 제81항에 있어서, 상기 제2 작용제가 DMD 유전자의 엑손 건너뛰기를 야기하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 항-마이오스타틴 항체, 논센스 돌연변이의 리보솜 리드-쓰루(read-through)를 촉진하는 작용제, 조기 정지 코돈을 억제하는 작용제, 동화성 스테로이드 및 코르티코스테로이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법, 용도, rAAV 입자, 또는 조성물.
- 근육 질량 또는 강도의 증가를 필요로 하는 대상체에게 대상체에서 근육 질량 또는 강도를 증가시키는데 충분한 양의 제57항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 근육 질량 또는 강도를 증가시키는 방법.
- 근육 질량 또는 강도 손실의 예방을 필요로 하는 대상체에게 대상체에서 근육 질량 또는 강도 손실을 예방하는데 충분한 양의 제57항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 근육 질량 또는 강도 손실을 예방하는 방법.
- 디스트로핀병증의 예방을 필요로 하는 대상체에게 예방적 유효량의 제57항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 디스트로핀병증을 예방하는 방법.
- 생산자 세포 내로 AAV 벡터 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드, AAV rep 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드, AAV cap 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 하나 이상의 바이러스 헬퍼 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계,
상기 세포를 인큐베이션하는 단계; 및
이에 의해 생산된 AAV 입자를 정제하는 단계
를 포함하는, 제31항 내지 제56항 중 어느 한 항의 AAV 입자를 제조하는 방법. - 제86항에 있어서, 상기 벡터 게놈은 제1 플라스미드에 의해 포함되고, 상기 rep, cap, 및 바이러스 헬퍼 유전자는 1개 또는 2개의 추가적인 플라스미드에 의해 포함되는 것인 방법.
- 생산자 세포 내로 AAV 벡터 게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드, AAV rep 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 AAV cap 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계,
상기 세포를 인큐베이션하는 단계; 및
이에 의해 생산된 AAV 입자를 정제하는 단계
를 포함하고,
여기서 상기 생산자 세포가 내인성 바이러스 헬퍼 유전자를 포함하고 이를 발현하는 것인,
제31항 내지 제56항 중 어느 한 항의 AAV 입자를 제조하는 방법. - 제88항에 있어서, 상기 벡터 게놈은 제1 플라스미드에 의해 포함되고, 상기 rep 및 cap 유전자는 1개 또는 2개의 추가적인 플라스미드에 의해 포함되는 것인 방법.
- 제86항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도입 단계가 형질감염에 의해 실행되는 것인 방법.
- 제86항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생산자 세포가 HEK293 세포인 방법.
- 제86항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 cap 유전자가 AAV9 cap 유전자인 방법.
- 제86항 내지 제92항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 AAV 입자.
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